NL8500424A - Verbeterde nucleinezuurreagentia en werkwijzen voor de bereiding daarvan. - Google Patents

Description

— κ— ' * · ι Korte aanduiding: Verbeterde nuclelnezuurreagentia en werkwijzen voor de . \ bereiding daarvan ι ' \ \ ·. \ De uitvinding heeft betrekking op verbeterde nuclelnezuurreagentia die een reeks van nuclelnezuurfragmenten bevatten, en op combinaties van '“dergelijke verbeterde reagentia. De uitvinding heeft tevens betrekking op werkwijzen voor de bereiding van nuclelnezuurreagentia omvattende een 5 reeks van klonen’ en combinaties van zulke nuclelnezuurreagentia door recombinant-DNA-technieken, en op de toepassing daarvan voor het identificeren van nucleïnézuren door hybridisatiewerkwijzen.

Verschillende hybridisatiemethoden zijn doorgaans toegepast voor het identificeren en bestuderen van nucleïnezuren. Enkele voorbeelden zijn de 10 directe hybridisatiewerkwijzen, waarin het monster het te identificeren nucleinezuur bevat hetzij een oplossing is (Brautigam e.a., J. Clin. Microbiol., 1980, _1_2, 226-234 en de Britse octrooipublikatie 2 019 408) hetzij gebonden is aan een vaste drager (Amerikaanse octrooischriften 4 139 346, 4 302 204, 4 358 535 en 4 395 486, Britse octrooipublikaties .· 15 2 034 323 en 2 095 833, en Europese octrooipublikaties 62 286., 62 237 en 71 740), en gedetecteerd wordt onder toepassing van een gelabeld nucle-inezuurreagens dat hybridiseert met het te identificeren nucleinezuur.

Andere bekende hybridisatiemethoden zijn de tweetratps-sandwich-hybridisatiemethode, gegeven door Dunn en Hassel in Cell, J_2, 23-36, 20 1977, en de eentraps-sandwich-hybridisatiemethoden, gegeven in de Europese octrooipublikatie 79 139» Voor het identificeren van de nucleïnezuren door de sandwich-methoden zijn twee gescheiden nuclelnezuurreagentia nodig voor het detecteren van de nucleïnezuren die in de monsteroplossing aanwezig zijn. Eén van deze reagentia is gebonden aan 25 een vaste drager en het andere is gelabeld.

Nuclelnezuurreagentia, zowel die welke gebonden zijn aan een vaste drager als die welke gelabeld zijn, worden gekenmerkt doordat de base-sequentie ervan^complementair, of nagenoeg complementair, is aan het te identificeren nucleinezuur, d.w.z. homoloog. De toegepaste nuclelnezuur-30 reagentia zijn hetzij natuurlijke nucleïnezuren als zodanig hetzij fragmenten daarvan. De fragmenten worden bijvoorbeeld geproduceerd door het gebruik van restrictie-enzymen. Nuclelnezuurreagentia zijn ook synthetisch of met behulp van recombinant-DNA-technieken bereid. Natuurlij-ke BAD (Amerikaans octrooischrift 4 358 535), nucleïnezuren van o κ η n /. o / - 2 - bacteriofagen (Amerikaans octrooischrift 4 543 535), ribosomaal RNA en boodschapper-RNA (Amerikaans octrooischrift 4 302 204) of nucleïnezuren van verschillende virussen (Stalhandske e.a., Curr. Top. Microbiol.

Virol. 104, 1983) zijn gebruikt als'nucleïnezuürreagentia. Het gehele 5 virus-genoom is gebruikt om bijvoorbeeld gedeelten behorende tot de verschillende virussen in het boodschapper-RNA van een hybride virus te identificeren (Dunn en Hassel, Cell, 1_2, 23-36, 1977). Nucleïnezuur-reagentia zijn ook bereid onder toepassing van recombinant-DNA-technieken (Amerikaanse octrobischriften 4 395 486 en 4 359 535, Europese octrooi-10 aanvrage 79 139, Britse octrooipublikatie 2 034 323 en Europese octrooiaanvrage 62 286). De door recombinant-DNA-technieken geproduceerde nuclelnezuurreagentia zijn hetzij op een zodanige wijze toegepast dat het afgegrensde gerepliceerde DNA-fragment gezuiverd wordt uit het DNA van de vector, hetzij toegepast als recombinant-DNA-moleculen, gebonden aan 15 verschillende vectoren. De vroeger gebruikte door recombinant-DNA- technieken geproduceerde nuclelnezuurreagentia bestaan uit een continu identificerend nucleïnezuurfragment of uit enkele afzonderlijke klonen.

Aanvraagster heeft nieuwe, gevoeligere nuclelnezuurreagentia ontwikkeld die ten minste twee series van alternerende reeksen nuclelnezuur-20 fragmenten bevatten die bereid zijn uit één of enkele segmenten die homoloog zijn met het te identificeren nucleïnezuur.

Nuclelnezuurreagentia die dergelijke reeksen van nucléïnezuur-fragmenten bevatten zijn in sandwich-hybridisatietests ten minste tweemaal zo gevoelig als de vroeger toegepaste nuclelnezuurreagentia. Door 25 toepassing van nuclelnezuurreagentia volgens de uitvinding of combinaties daarvan is het mogelijk kleinere hoeveelheden nucleïnezuren dan vroeger / te identificeren, en zij zijn in het bijzonder goed toepasbaar bij sandwich-hybridisatiemethoden.

De hogere gevoeligheid van de nuclelnezuurreagentia volgens de uit-30 vinding in sandwich-hybridisatiemethoden is gedeeltelijk gebaseerd op het feit dat het gebruik van verschillende sondes de hoeveelheid gelabelde hybriden op de vaste drager verhoogt. Er kan gelabeld, van de vector afgeleid nucleïnezuur zijn naast iedere hybridisatiesonde (Fign. 1 en 2). In de Fign. 1 en 2 stelt v het van de vector afgeleide DNA voor, x het te 35 identificeren nucleïnezuur, b de gelabelde sonde„ a het identificerende nuclelnezuurreagens dat gebonden is aan de vaste drager, en F het filter. Wanneer verschillende sondes worden toegepast neemt de hoëveelhèid ge- BAD1ORl^fi'lXt.n de vector ^geleide nuclelnezuurdelen toe, en wordt er meer label gebonden aan de gevormd wordende hybriden. Op deze wijze zijn de · · - 3 - hybriden makkelijker te detecteren.

Wanneer de reeks van nucleïnezuur-fragmenten volgens de uitvinding gebruikt wordt in sandwich-hybridisatie-methoden, zijn minstens twee, of zoals Fig. 1 laat zien, drie, identificerende nucleïnezuur-fragmenten ge-5 bonden aan de vaste drager. In dit geval kunnen de verschillende gebieden van de nucleïnezuur-streng x, die gedetecteerd moet worden, hybridiseren met de nucleïnezuur-fragmenten die gebonden zijn aan de vaste drager, bijvoorbeeld a^, en a^, op één of enkele plaatsen, afhankelijk van de graal van de reactie. Wanneer de reactie de laatste fase bereikt, kan een situa-10 tie zoals in Fig. 1 geproduceerd worden, waarin de monster streng een lus of lussen vormt, waarmee de sonde of sondes, bijvoorbeeld b^ en b^ in Fig; 1, hybridiseren. Op dit tijdstip neemt de afstand van de van de vector afgeleide nucleïnezuur-gedeelten tot het hybridisatie-verbindingspunt (1) af (Fig. 1), en de hybride is stabieler dan de hybride gevormd door één 1'5 reagens-paar (stand van de techniek), zoals Fig. 2 laat zien, daar deze hybride van dezelfde grootte is als het totale gebied van de reeks van nucleïnezuur-fragmenten. De van de vector afgeleide gedeelten van een hybride gevormd uit één reagens-paar, worden gemakkelijk gebroken door bijvoorbeeld mechanische spanning, zoals schudden. In een dergelijk geval 20 ontsnapt het label dat al gebonden was aan de hybride.

Daar de verbeterde nucleïnezuur-reagentia volgens de uitvinding gevoeliger zijn dan vroeger gebruikte nucleïnezuur-reagentia, zijn ze geschikt om chromosomale herrangschikkingen en erfelijke ziekten te demonstreren.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op nucleïnezuur-reagentia 25 die een reeks van nucleïnezuur-fragmenten bevatten, op combinaties daarvan, op de bereiding ervan en op de toepassing ervan voor de detectie van nucleïnezuren in hybridisatie-methoden.

De kenmerken van de uitvinding worden aangegeven in de kenmerkende delen van de conclusies, en de uitvinding wordt meer in detail beschreven 30 in de volgende beschrijving en in de bijgaande tekeningen, waarin Fig. 1 een reeks sandwich-hybriden laat zien,

Fig. 2 een sandwich-hybride volgens de stand van.de techniek afbeeldt,

Fig. 3 de plaatsen van twee alternerende series van nucleïnezuur-fragmenten laat zien in een nucleïnezuur dat gekozen is voor de bereiding van een 35 reeks nucleïnezuur-reagentia volgens de uitvinding,

Fig. 1 de corresponderende plaatsen van drie alternerende series van nucleïnezuur-fragmenten laat zien,

Fig. 5 een reeks nucleïnezuur-fragmenten volgens Fig. 3 laat zien, geschei-BADOfóeifaha me"k elkaar verbonden (b) en zowel gescheiden als met elkaar ver-λ c λ rt / o r.

- k - bonden (c),

Fig. 6 een reeks sandwich-hybri den laat zien,

Fig. 6a een reeks sandwich-hybriden laat zien, die gevormd wordt wanneer gescheiden fragmenten worden gebruikt", 5 Fig. 6b een reeks sandwich-hybriden laat zien, die gevormd wordt wanneer verbonden b-fragmenten worden gebruikt,

Fig. 6c een reeks sandwich-hybriden laat zien, die gevormd wordt wanneer zowel gescheiden als verbonden b-fragmenten worden gebruikt,

Fig. T een reeks nucleïnezuur-reagentia laat zien, die verschillende 10 nuclelnezuren identificeren,

Fig. 8 een reeks sandwich-hybriden laat zien, die gevormd worden wanneer de reeks nucleïnezuur-reagentia volgens Fig J, die de-verschillende nuclelnezuren indentificeert, gebruikt wordt,

Fig. 9 een reeks hybriden laat zien, die gevormd wordt met een directe 15 hybridisatie-methode,

Fig. 10 de recombinant-plasmide pKTH 1220 laat zien,

Fig. 11 een reeks sandwich-hybriden laat zien, die gevormd wordt wanneer een reeks van nucleinezuur-fragmenten bereid uit de recombinant-plasmide pKTH 1220 wordt gebruikt, 20 Fig. 12 de recombinant-plasmide pKTH 1271 laat zien,

Fig. 13 een reeks sandwich-hybriden laat zien, wanneer reeksen van nucleine zuur-fr agment en, bereid uit de recombinant piasmi de,- pKTH 1271, worden gebruikt.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op nucleïnezuur-reagen-25 tia die een reeks"nucleïnezuur-fragmenten bevatten. Deze reeksen van nucleïnezuur-reagentia bevatten tenminste twee, maar bij voorkeur enkele, alternerende nucleinezuur-fragmenten, tot 20 fragmenten, die afgeleid worden van êên of enkele nuclelnezuren die voldoende homoloog zijn met het nucleïnezuur dat geïdentificeerd moet worden. Hierdoor worden-min-30 stens twee_series van alternerende reeksen van nucleïnezuur-fragmenten verkregen, die niet homoloog met elkaar mogen zijn.

De reeksen van nucleïnezuur-reagentia kunnen synthetisch bereid worden. In dit geval' mogen de fragmenten van de twee alternerende series van reeksen nucleïnezuur-fragmenten niet homoloog met elkaar zijn. Maar 35 zij moeten voldoende homoloog zijn met de alternerende plaatsen in de te identificeren nuclelnezuren. Deze fragmenten kunnen makkelijk bereid worden door volledig geautomatiseerde apparaten na karakterisering van BAD^R?ö1l^&eZU^”Se^‘Uen'*;^e Van identificeren nucleïnezuur.

' De nucleïnezuur-reagentia volgens de uitvinding bestaan uit een -5-.

gescheiden, of verbonden', of zovel gescheiden als verbonden reeks nucleïnezuur-fragmenten.

De reeksen nucleïnezuur-fragmenten kunnen verbonden zijn met een vector, gedeelten van vectoren bevatten, of geheel zonder vector-gedeel-5 ten zijn.

;De gebruikte nucleïnezuur-fragmenten hebben een minimum-lengte van 15 nucleotiden. Er is geen feitelijke bovengrens vat betreft lengte, maar het is gunstig fragmenten te gebruiken die een lengte van 20-5000 nucleotiden hebben. De nucleïnezuur-fragmenten volgens de uitvinding vor-10 den afgeleid hetzij van het te identificeren genoom hetzij van een gedeelte van het genoom, bijvoorbeeld van een relatief grote kloon, die een bepaald gedeelte van het genoom representeert. De reeksen nucleïnezuur-fragmenten volgens de uitvinding kunnen op deze vijze bereid vorden uit enkele onafhankelijke, genoom-gebieden die niet direct aangrenzend 15 zijn. De zo bereide reeksen nucleïnezuur-fragmenten vorden gecombineerd en gebruikt voor hetzelfde reagens. De reeksen van nucleïnezuur-fragmenten kunnen ook geïsoleerd.vorden uit een DM dat niet identiek is met het te identificeren nucleïnezuur, maar voldoende homoloog, zodat een stabiele hybride gevormd vordt tussen het reagens en het te identificeren 20 nucleïnezuur. De bereiding van geschikte reeksen van nucleïnezuur-frag-menten is geenszins beperkt tot de isolatie van geschikte nucleïnezuur- fragmenten uit het genoom. Er zijn vele even bruikbare methoden beschik- ! baar om dergelijke reeksen fragmenten te bereiden. De deskundige kan reeksen nucleïnezuur-fragmenten bereiden door synthetische of semisyn-25 thetische methoden.

De reagentia vorden zodanig geïsoleerd, dat tenminste tvee series van alternerende nucleïnezuur-fragmenten a^, a^, a^, etc., en b^, b2, b^, etc., verkregen vorden. De nucleïnezuur-fragmenten behorende tot de serie a^, a^, a^, etc., bestaan uit fragmenten die dicht bij elkaar.liggen, 30 maar niet aan elkaar grenzen. De nucleïnezuur-fragmenten behorende tot de serie b^, b^, b^, etc., bestaan eveneens uit nucleïnezuur-fragmenten die dicht bij elkaar liggen, maar niet aan elkaar grenzen. De nucleïnezuur-fragmenten behorende tot de serie a^, a2, a^, etc., en die behorende tot de serie b^·, b^, b^, etc., mogen niet homoloog met elkaar zijn. Het 35 verdient de voorkeur dat de nucle ïne zuren behorende tot de serie a.^, a2, a^, etc., en die behorende tot de serie b^, b^, b^, etc., geïsoleerd vorden op een zodanige vijze, dat ieder eerste fragment tot de a-serie behoort en.i.eder tveede tot de b-serie, zoals Fig. 3 laat zien. In Fig. 3 BADOBiGftNA|l, a2, a^, en b^, b2, b^, reeksen nucleïnezuur-fragmenten die vol- - 6 - doende homoloog zijn met het te identificeren nucleïnezuur. Het is natuurlijk, mogelijk dat zelfs een derde nucleïnezuur-fragment-serie c ,

Cg, c^» etc., geïsoleerd wordt uit hetzelfde nucleïnezuur, zoals Fig. U laat zien. Het verdient de voorkeur-dat de alternerende twee nucleïnezuur-5 reagentia elkaar direct volgen, maar dit is geen absoluut vereiste voor de uitvinding.

De hierboven beschreven nucleïnezuur-fragment-series kunnen gebruikt worden hetzij als gescheiden fragmenten , a^, a^, etc., en b^, bg, b^> etc. (Fig. 5a) hetzij met elkaar verbonden tot langere ketens a^-ag-a^, 10 etc., en b^-bg-b^, etc. (Fig. 5b). Het is natuurlijk mogelijk om allerlei soorten van intermediaire vormen te bereiden, zoals bijvoorbeeld een a-serie waarin a^ een gescheiden fragment is en ag-a^ met elkaar verbonden zijn, en in de b-serie zijn bijvoorbeeld b^-bg met elkaar verbonden en is b^ gescheiden, etc., zoals Fig 5c laat zien.

15 Fig. 6 beeldt verschillende reeksen sandwich-hybriden uit. Fig 6a laat een reeks sandwich-hybriden zien waarin de reeksen nucleïnezuur-fragmenteh gescheiden zijn. Fig. 6b laat een reeks hybriden zien, waarin de gelabelde reeks nucleïnezuur-fragmenten met elkaar verbonden zijn.

Fig. 6c beeldt een geval uit waarin een reeks sandwich-hybriden gevormd 20 is uit zowel gebonden als gescheiden gelabelde reeksen nucleïnezuur-fragmenten. In Fig. 6 stelt x het te identificeren nucleïnezuur voor, stellen b^, bg, en b^, de gelabelde sonde voor, en stellen a^, ag, en a^ de reeksen nucleïnezuur-fragmenten voor die aan een vaste drager gebonden zijn. Nucleïnezuur-fragmenten behorende tot de b-serie kunnen 25 bijvoorbeeld zodanig gelabeld zijn dat een gelabeld nucleïnezuur-reagens wordt verkregen, d.i. de sonde B. De nucleïnezuur-reagentia behorende tot de a-serie kunnen zodanig aan een vaste drager gebonden worden dat een nucleïnezuur-reagens A, gebonden aan een vaste drager, verkregen wordt.

Het is natuurlijk als alternatief mogelijk een gelabeld nucleïnezuur-30 reagens A te bereiden, en een corresponderend nucleïnezuur-reagens B gebonden aan een vaste drager.

Dergelijke nucleïnezuur-paren A en B, of B en'A, respectievelijk gelabeld en gebonden aan een vaste drager, kunnen bereid worden voor enkele verschillende te identificeren nucleïnezuren. Ze kunnen gecombi-35 neerd worden tot geschikte nucleïnezuurreagens-combinaties, die bestaan o» •uit verschillende nucleïnezuurreagens-paren A^ en B^, Ag en Bg, A^ en B^, etc., of B1 en A1, Bg en Ag, B^ en A^> etc. Reagentia die reeksen nucleïnezuur-fragmenten bevatten die verschillende nucleïnezuren identi-

BAD 9fi}^^kamen ook zodanig gecombineerd worden, dat een sonde A -A -A

x y z - 7 - verkregen wordt, die "bijvoorbeeld een reeks nuclelnezuur-fragmenten - (al-a2-a3)x-(al-a2-a3)y-(a1-a2-a2)z omvat, als weergegeven in Fig. 7, waarin a1x, a^ en a^x reeksen nuclelnezuur-fragmenten Αχ zijn d.ie nucleinezuur x identificeren; , a2y en a^ reeksen nucleïnezuur-frag- 5 menten A zijn die nucleinezuur y identificeren; a, ·, a_ en a_„ reeksen γ 1z 2z 3z nuclelnezuur-fragmenten zijn die nucleinezuur z identificeren, en v een van een vector afgeleid nuclelnezuur-gedeelte is. Gebonden reeksen nuclelnezuur-fragmenten kunnen natuurlijk ook gebruikt worden als gescheiden fragmenten, in de vorm van geschikte mengsels.

10 De reeksen sandwich-hybriden volgens Fig. 8 worden verkregen door gebruik van de reagentia die in Fig. 7 zijn weergegeven. Wanneer gelijktijdige identificatie van enkele verschillende nuclelnezuren verlangd wordt, is het natuurlijk noodzskelijk gescheiden filters te gebruiken, zoals weergegeven in Fig. 8. Fig. 8a laat een vaste drager zien die 15 nucleinezuur x identificeert, Fig. 8b een vaste drager die nucleinezuur y identificeert, en Fig. 8c een vaste drager die nucleinezuur z identificeert. In de Fign. 8a, 8b en 8c zijn b^x en b2x reeksen nuclelnezuur-fragmenten die gebonden zijn aan een vaste drager en die het nucleinezuur x identificeren; b^ en b2y zijn reeksen nuclelnezuur-fragmenten die 20 gebonden zijn aan een vaste drager en die nucleinezuur y identificeren; en b^z en b2z zijn reeksen nuclelnezuur-fragmenten die gebonden zijn aan een vaste drager en die nucleinezuur z identificeren; en x, y en z zijn de te identificeren nuclelnezuren. F^, Fy en Fz zijn de respectieve vaste dragers of filters, A -A -A is een sonde die alle drie nuclexne-25 zuren gelijktijdig indentificeert, indien gescheiden vaste dragers gebruikt worden.

De hierboven beschreven nuclelnezuurfragment-series, reagentia en reagens-cambinaties kunnen bereid worden door op zichzelf bekende recom-binant-DNA-technieken. Een aantal nuclelnezuur-fragmenten van verschil-30 lende lengten worden voortgebracht door gebruik van restrictie-enzymen, uit het-te identificeren nucleinezuur of uit een dit representerend gedeelte. Indien de restrictie-kaart van het te -identificeren genoom bekend is, is het mogelijk van het genoom de geschikte aan elkaar gren-zende fragmenten te scheiden, ontwikkeld door gebruik van restrictie-35 enzymen, en de fragmenten worden geïsoleerd en versterkt door gebruik van recombinant-DNA-technieken.

Wanneer het een onbekend genoom betreft, kan een tussenstap worden toegepa&t in de bereiding van de reagentia, zodanig dat een relatief BAD ORKHNAfcestrictie-fragment gekloond wordt, waarna dit fragment in kaart a c η Λ / n t - 8 - wordt gebracht, en de reeksen nucleinezuur-fragmenten serie a^, , a^ * etc., en b^., b^, b^, etc., geproduceerd worden op basis van de zo verkregen informatie.

Het is natuurlijk mogelijk combinaties van de hierboven vermelde 5 methoden te gebruiken en enkele grote gescheiden gekloonde restrictie-fragmenten als uitgangsmateriaal te gebruiken, en enkele gescheiden series te bereiden, die gecombineerd worden tot geschikte combinaties.

Het is gunstig nucleïnezuurfragment-serie a1, a^, a^, etc., en b^, bg, b^, etc., volgens de uitvinding te bereiden door gebruik van recom-10 binant-DNA-technieken zodanig dat de serie a gekloond wordt in een vector, bijvoorbeeld in de plasmide pBR322, terwijl de serie b gekloond wordt in een andere geschikte vector, die geen sequenties gemeen heeft met de vorige vector. De bacteriofaag M13 is een voorbeeld van een dergelijke tweede gunstige vector. De fragmenten behorende tot de serie a 15 kunnen met elkaar verbonden worden, en de verbonden series kunnen gekloond worden in een vector. Bijvoorbeeld a^-a^, met elkaar verbonden, kunnen gekloond worden als een continue insertie in dezelfde pBR322 vector. Op een overeenkomstige wijze is het mogelijk een reagens-serie b^-bg te bereiden. Bij het klonen verdient het de voorkeur vectoren toe 20 te passen waaraan zeer grote inserties van vreemd DNA gebonden kunnen worden. Lambdafaag en eosmide-veetoren zijn bijvoorbeeld geschikt voor dit doel.

Zo zijn twee reagensparen die reeksen nucleinezuur-fragmenten bevatten nodig in de sandwich-hybridisatie-methode volgens de uitvinding, een 25 reagens gelabeld'met de te identificeren label-substantie, d.i. een sonde, en een zogenoemde filterreagens, gebonden aan een vaste drager.

Meestal worden radioactieve isotopen gebruikt voor het labelen van de sondes. Bijvoorbeeld worden in de Britse octrooipublicatie 2 03^ 323 en de Amerikaanse octrooischriften U 358 535 en h 302 2Qk de volgende 30 isotopen gebruikt: 32p> 125It 131j en ^H. In de Europese octrooipublica- 125 tie 79 139 wordt de isotoop I gebruikt. Nucleïnezuur-sondes zijn ook op verschillende manieren gemodificeerd en gelabeld met bijvoorbeeld fluorescerende labels (Franse octrooipublicatie 2 518 755)· Ook worden enzymatische of enzymatisch meetbare labels gebruikt (Britse octrooi-35 publicatie 2 019 ^08, Europese octrooipublicatie 63 879 en Franse octrooipublicatie 2 519 005). De Europese octrooipublicaties 70 685 en 70 687 beschrijven een lichtuitzendende label en label-methode, en de gjange^j^trooipublicatie 2 518 75.5 beschrijft een immunologisch meetbare label. De lanthanide-chelaten beschreven in het Amerikaanse octrooi- I * - 9 - t schrift U 37U 120, in het bijzonder europium, hunnen gebruikt worden als label-substanties. Ook de biotine-avidine-labelsubstantie beschreven door Leary e.a. (PNAS 80, 1*01*5-^01+9, 19Ö3) is geschikt als label. Enkele voorbeelden van labels die gebruikt kunnen worden voor het labelen van 5 nuclexnezuur-reagentia volgens de uitvinding worden boven genoemd, maar het is duidelijk dat er nieuwe, verbeterde labelsubstanties ontwikkeld zullen worden, die ook geschikt zijn voor het labelen van reeksen nucle-inezuur-fragmenten volgens de uitvinding.

De dragers die geschikt zijn als filterreagentia omvatten verschil-10 lende nitrocellulose-filters (Amerikaans octrooischrift 1+ 358 535 en Britse octrooipublicatie 2 095 833). De DDR-octrooipublicatie 11*8 955 beschrijft eén methode om nucleïnezuren chemisch te binden aan de drager (papier). De Amerikaanse octrooischriften U 359 535 en U 302 20k beschrijven chemisch gemodificeerde papieren die als vaste dragers gebruikt 15 kunnen worden. Andere alternatieven omvatten nylon-membranen en gemodificeerde nitrocellulose-filters. Maar het is duidelijk dat er nieuwe materialen ontwikkeld zullen worden, die zelfs nog beter geschikt zullen zijn om te worden gebruikt als vaste dragers volgens de uitvinding. Het is natuurlijk mogelijk ook andere vaste dragers te gebruiken, zoals ver-20 schillende chromatografie-matrixen zoals triazine- of epoxy-geactiveerd cellulose, latex, etc. In principe zijn er geen andere beperkingen met-, betrekking tot de keuze van de vaste drager dan dié welige hieronder zullen worden beschreven. Het moet mogelijk zijn nucleïnezuur in enkel-strengs vorm te binden aan de vaste drager, op zodanige wijze dat deze 25 enkelstrengs nucleïne zuren kunnen hybridiseren met het complementaire nucleïnezuur. De vaste drager moet ook gemakkelijk te verwijderen zijn van de hybridisatie-oplossing, of de hybridisatie-oplossing moet gemakkelijk te verwijderen zijn van de vaste drager. Tevens mag de sonde niet blijven vastzitten atan het dragermateriaal zelf, zodat het niet uit-30 gewassen kan worden.

Hierboven zijn combinaties van de reeksen nucleïnezuurreagens-paren.

A en B, of B en A, respectievelijk gelabeld of gebonden aan een vaste drager beschreven* en uit dergelijke nucleïnezuur-paren, gemaakt voor de identificatie van verschillende nucleïnezuren, is het mogelijk een combi- 35 natie A en B , A en B , A en B samen te stellen. Deze combinaties x x y y z z kunnen gebruikt worden voor de gelijktijdige identificatie van de nucle-inezuren x, y en z met sandwich hybridisatie-methoden. ·

Het‘monster wordt op zodanige wijze behandeld dat de nucleïnezuren bad o^^ten worden in de hybridisatie-oplossing, en dat ze enkelstrengs . μ λ Λ 1 Λ r - 10 - gemaakt worden. De hybridisatie wordt uitgevoerd in een hybridisatie-oplossing, waaraan zowel de nucleïnezuur-reagentia gebonden aan de vaste drager, als de gelabelde zijn toegevoegd. Wanneer hybridisatie heeft plaatsgevonden, worden de filters uit de hybridisatie-oplossing getild, 5 indien filters als vaste dragers gebruikt zijn. Indien chromatografie-matrixen', latex of iets dergelijks is gebruikt, wordt de hybridisatie-oplossing verwijderd. De vaste dragers worden met een geschikte wasoplossing gespoeld. De reeksen gevormde sandwich-hybriden (Fign. 8a, 8b, 8c) worden gedetecteerd· door op zichzelf bekende methoden. De radioactieve 10 label wordt gemeten door, bijvoorbeeld, autoradiografie, met een scintil-latie-teller of met een gamma-teller. Bijvoorbeeld wordt een enzymatisch label geïdentificeerd na, bijvoorbeeld, een kleurreactie, door fotometrie of op basis van precipitaat. Lanthanide-chelaten kunnen gedetecteerd worden door een zogenoemde "tijd opgeloste fluorescentie" methode. Een 15 immunologisch label wordt gedetecteerd door immunologische methoden die geschikt zijn voor het doel.

Enkele verschillende mengsels kunnen gebruikt worden als hybridisatie-oplossing; de alternatieven gepresenteerd in de Europese octrooi-publicatie 79 139 en het Amerikaanse octrooischrift b 302 20U worden als 20 voorbeelden genoemd. Het is natuurlijk ook mogelijk andere hybridisatie-mengsels te gebruiken. De hybridisatie vindt plaats bij een temperatuur . van 0-80°C, maar het is gunstig een temperatuur van bijvoorbeeld 65°C te gebruiken. Voldoende hybridisatie kan optreden in een zeer korte periode, maar het is gunstig hybridisatie-perioden van bijvoorbeeld 12-20 uren te 25 gebruiken.

De twee-traps-sandwich-hybridisatie-methode wordt in principe op dezelfde manier uitgevoerd, maar in dit geval wordt het nucleïnezuur-reagens, gebonden aan een vaste drager, eerst toegevoegd aan de hybridisatie-oplossing. Wanneer de hybridisatie heeft plaatsgevonden wordt de 30 vaste drager gewassen en wordt een tweede hybridisatie uitgevoerd waarbij het gelabelde nucleïnezuur-reagens aanwezig is.

De hierboven beschreven gelabelde nucleïnezuur-reagentia of reagens combinaties A , A , A , etc., en B , B , B , etc., kunnen natuurlijk ook x J3T z x y z gebruikt worden in directe hybridisatie-methoden. In een dergelijk geval 35 moet het nucleïnezuur-monster in een oplossing verdeeld worden voor ieder te identificeren nucleïnezuur x, y en z, of, wanneer het monster gebonden is aan een vaste drager, moet een gescheiden monster dat gebonden is aan een dragef * bereid worden voor ieder monster. De gevormde reeks hybriden BAOffiffWtordt gedetecteerd door op zichzelf bekende methoden. In Fig. 9 — m s* Λ 0 A # * - 11 - stelt F de vaste drager, d.i. het filter, voor, x het te identificeren nuclelnezuur, en v de van de vector afgeleide gedeelten. De gebruikte gelabelde sondes zijn a^, a^ en a^ (Fig. 9a), b1 en b^ (Fig. 9b), en a1# b1, a2, bg, a3 (Fig. 9c).

5 Zoals reeds hierboven beschreven, kunnen verschillende combinaties van nucleïnezuur-reagentia gemaakt worden uit de reeksen nucleïnezuur-fragmenten volgens de uitvinding. Het is mogelijk door gebruik van deze combinaties enkele verschillende nucleïnezuren gelijktijdig te identificeren. Reeksen nucleïnezuur-fragmenten homoloog met de verschillende te 10 identificeren nucleïnezuren kunnen gebruikt worden als gescheiden fragmenten in de mengsels of aan elkaar gebonden op een zodanige wijze dat een sonde die enkele verschillende nucleïnezuren identificeert, verkregen wordt. Nucleïnezuur-reagentia gebonden aan een vaste drager moeten natuurlijk gescheiden gehouden worden om de identificatie succesvol te 15 laten zijn.

Hybridisatie onder toepassing van reeksen nucleïnezuur-fragmenten kan worden toegepast voor.het identificeren van diverse menselijke, dierlijke en plantaardige pathogene microörganismen. Door de methode is het mogelijk microörganismen te identificeren die aanwezig zijn in etenswaren, 20 zoals Clostridia, salmonellae, staphylococci, die voedselvergiftigingen veroorzaken. De methode is geschikt voor de identificatie van besmettingen die aanwezig zijn in water, zoals enterobacteria en enterovirussen. .

/

Aangezien de sandwich-hybridisatie-test, die gebruik maakt van reeksen nucleïnezuur-fragmenten, een kwantitatieve methode is, is deze toepasbaar 25 voor, bijvoorbeeld, de detectie en meting van genamplificatie. Dit kenmerk is belangrijk bij, bijvoorbeeld, de detectie en behandeling van kanker. De vorming van een stabiele reeks hybriden vereist dat de homologe segmenten van het sonde-reagens ert het filter-reagens gelocaliseerd zijn· binnen een gematigde afstand, bij voorkeur minder dan 5 kilobasen 30 (kb), van elkaar op de monster-streng. Wanneer veranderingen optreden met betrekking tot de afstand tussen deze twee gebieden, dan is de verandering duidelijk observeerbaar met deze methode. Derhalve is de methode ook geschikt voor . de detectie van veranderd mRNA, chromosomale herrang-schikking, de herrangschikking van immunoglobuline-gehen voor expressie, 35 en erfelijke ziekten. Het is zo ‘mogelijk verschillende reagens-combina-ties te construeren uit de reeksen nucleïnezuur-fragmenten. Bijvoorbeeld is het mogelijk voor de identificatie van de oorzakelijke agentia van geslachtsziekten uitrustingen te construeren, die een sonde bevatten, BADOEMSiyAforrhoe, syphilis, herpes en chlamydiae identificeren. De identifi-λ c A Λ /. O /.

.

- 12 - catie is in dit geval mogelijk door toepassing van gescheidenfilters voor gonorrhoe, syphilis, herpes en chlamydiae.

De uitvinding heeft in het bijzonder betrekking op reeksen nucleïne-

'V

zuur-fragmenten die de recombinant-plasmiden pKTH 1220 en pKTÏÏ 1271 5 bevatten.. De recombinant-plasmide pKTH 1220 bevat, in de plasmide-vector pBR322, DNA van Chlamydia trachomatis L2, dat specifiek is voor de chlamydiae. Deze recombinant-plasmide wordt gekloond in de gastheer Escherichia coli K12 HB 101. De recombinant-plasmide 1271 bevat, in de. plasmide-vector pBR325, DNA van het cytomegalovirus AD 169- Deze recom-10 binant-plasmide wordt gekloond in de gastheer Escherichia coli K12' HB101. De'gastheren die de recombinant-plasmiden pKTH 1220 en pKTH 1271 bevatten zijn gedeponeerd bij de cultuurcollectie Deutsche- Sammlung von Mikro-organismen (DSM), Griessebachstrasse .8, D-3^-00 Gottingen, West-Duitsland. Het nummer van het depot dat de recombinant-plasmide pKTH 1220 bevat is 15 DSM 2825 en het nummer van het depot dat de recombinant-plasmide pKTH 1271 bevat is DSM 2826. De depots zullen.vrij beschikbaar zijn na publicatie van dé octrooiaanvrage.

De uitvinding wordt meer in detail in de volgende voorbeelden beschreven. Deze voorbeelden dienen echter niet te worden opgevat als 20 beperkend voor de beschermingsomvang van de onderhavige uitvinding. De structuur van het nucleïnezuur (DNA en RNA) is gelijk ongeacht of het nuclelnezuur verkregen uit een eucaryotische of een procaryotische cel betreft. Om deze reden zijn de in de voorbeelden getoonde principes evenzogoed toepasbaar op de nucleïnezuren van dieren (inclusief de mens), 25 planten en microben of virussen. Zo kunnen de reagentia volgens de uitvinding gebruikt worden om nucleïnezuren te detecteren van de mens, van dieren, planten, microben en virussen. De reeksen nucleïnezuur-fragmen-ten kunnen ook synthetisch bereid worden. De sequentie van te identificeren nuclexnezuren kan gekarakteriseerd worden en homologe reeksen 30 fragmenten, kunnen bereid worden door automatische nucleïnezuur-bereidings-machines.

Voorbeeld I

a) Reeksen nucleïne zuur-fragmenten uit Chlamydia trachomatis en de bereiding daarvan 35 DNA-fragmenten geschikt voor de diagnose van de Chlamydia trachoma tis groep werden bereid uit het DNA van Chlamydia trachomatis serotype L2. Het DNA werd geïsoleerd en gefragmenteerd door bekende methoden, en de BAD DKA-"fra©aei:rfcei:L eerden gekloond in de plasmide pBR322 en .overgebracht naar het gastheer-organisme Escherichia coli K12 HB 101, - 13 - door bekende methoden. Een gen-bank van de Chlamydia trachomatis L2 bacterie werd verkregen als resultaat van het klonen, d.i. een groot aantal recombinant-plasmiden, die ieder een gescheiden BamHI-restrictie-fragment hebben, afgeleid van DNA. uit chlamydiae. Voor de productie van 5 het reagens werden recombinant-plasmiden die maximaal grote DNA-inserties hebben, afgeleid van chamydiaal DNA, gekozen uit de gen-bank. Een zo'n plasmide is die, welke pKTH 1220 genoemd is, die bij de cultuurcollectie Deutsche Saramlung von Mikroorganismen is gedeponeerd onder nummer DSM 2825 en waarvan de geschiktheid voor gebruik als reagens gedemonstreerd 10 werd door een directe-hybridisatie-test. De test liet zien dat pKTH 1220 alle nucleinezuren, afgeleid van verschillende Chlamydia trachomatis sero-typen, identificeert, maar geen andere nucleïnezuren.

De toepasbare fragmenten, verkrijgbaar door toepassing van verschillende restrictie-enzymen, werden gekozen uit het pKTH 1220-plasmide-DNA, 15 en enkele van deze fragmenten werden door verder klonen overgebracht in de pAT 153-plasmide (Maniatis e.a., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold String Harbor Laboratory, biz. 6, 1982) en enkele in de M13 faag. Fig. 10 laat de recombinant-plasmide pKTH 1220 zien, die een molu-culaire lengte van 14 . kb heeft. In Fig. 10 stellen BamHI, Sal I en Cla I 20 de gebruikte restrictie-enzymen voor, en illustreren a^, a^, b^, bg en b^ de grootte en onderlinge locaties van de met behulp van deze restrictie-enzymen geproduceerde fragmenten. Tabel A geeft de grootte van de *· fragmenten en vectoren gebruikt voor verder klonen, de namen van de recombinant-plasmiden en de toepassing ervan.

25 Tabel A

Fragment Grootte Vector Recombinant- Toepassing plasmide a1 . Clal-Sall 3,0kb pAT153 pKTH1252 Filter a2 Sall-Clal 2,9kb pAT153 pKTH1250 Filter 30 b1 Sall-BamHI 0,7kb M13mp8 mKTH12U2 Gelabelde sonde b2 BamHI-Sall 1,Ukb M13mp8 mKTH1239 . Gelabelde sonde b3 Clal-Clal 1,7kb M13mp8 mKTH12U8 Gelabelde sonde . . b^-bg BamHI-BamHI 2,1kb M13mp8 mKTH12l+5 Gelabelde sonde

De fragmenten gegeven in Tabel A werden geïsoleerd uit een agarose-35 gel door electroëlutie en werden gekloond in de passende restrictie- enzym—indentificatie—plaatsen van de in Tabel A genoemde vectoren, onder “wn2* x - 14 - toepassing van tekende methoden.

Het fragment BamHI-BamHI 2,1kb werd als volgt geproduceerd: de fragmenten BamHI-Sall 1 ,4kb en Sall-BamHI 0,7kb van de plasmide pKTH122Q werden gescheiden door gel-electroforese in agarose-gel, -waaruit ze ge-5 isoleerd werden. De gezuiverde fragmenten werden aan elkaar gebonden met behulp van T4 ligase-enzym, en van de in de reactie geproduceerde 2,1kb DNA-fragmenten wérden die welke vrije uiteinden hadden, geïdentificeerd door het BamHI-enzym, verder verbonden aan de BamHI-restrictie-plaats van de dubbele-strengs-vorm van het M13mp8-faag-DNA. Zo werd een recombi-10 nant-faag-DNA (mKTH1245) gemaakt, dat Chlamydia trachomatis DNA bevat, dat twee gescheiden DNA-fragmenten bevat, die niet aan elkaar grenzend ' gesitueerd zijn 'in het genoom. Echter, in het genoom zijn zij gelocali-seerd grenzend aan de DNA-reagentia pKTH1250 en pKTH1252, die aan het filter gebonden moeten worden (Fig. 11). Fig. 11 laat een reeks sandwich-15 hybriden zien, die gevormd wordt wanneer dé recombinant-plasmiden en re-combinant-fagen gegeven in Tabel A worden toegepast als reeksen nucleïne-zuur-reagentia.

b) Demonstratie van de gevoeligheid van een reeks nucleïnezuur-reagentia van Chlamydia trachomatis onder toepassing van de sandwich-hybridisa-20 tie-méthode

De gevoeligheid van een reeks nucleïnezuur-reagentia vergeleken met *- een enkel continu reagens-paar werd bestudeerd met de sandyich-hybridisa- · tie-methode. De test werd uitgevoerd met. gebruik van filters die alle 1-1 10 moleculen van zowel pKTH1250 (a2) als pKTHl252 (a^) enkelstrengs 25 gemaakt DNA bevatten. Het te bestuderen monster was de plasmide pKTH1220, die voor de test enkelstrengs gemaakt werd door koken gedurende 5 minuten in 0,17 M NaOH, waarna het werd overgebracht naar 0°C en geneutraliseerd met een equimolaire hoeveelheid azijnzuur. De volgende sondes, gelabeld iptr _ met gegeven in Tabel B, werden gebruikt in de testen; mKTHÏ242 30 (b1), mKTHI239 (b2), mKTHi248 (b^ en mKTH1245 (b^^).

De. hybridisatie werd uitgevoerd bij +65°C gedurende 17 uren in een hybridisatie-oplossing met de volgende samenstelling: 4 x SSC, 0,02 % Ficoll, 0,02 % polyvinylpyrrolidon, 0,2 % SDS en 200 ug/xnl haringsperma-DNA. De filters werden gedurende 2 uren gewassen bij 50°C met een wasop-35 lossing met de volgende samenstelling; 0,1x 330,.0,2 % SDS, en werden geteld onder toepassing van een gamma-teller. De resultaten worden getoond in Tabel B en zijn de gemiddelden van vijf parallelle testen.

BAD ORIGINAL

' — — λ » η I

--15-

Tabel B

Gehybridiseerde radioactiviteit,

Specimen met (b) als de sonde_____ moleculen/test b^ bg b^ ^1*^2 (b^-bg),^ 5 0 37 37 33 49 39 52 g -1-- 10 48 44 48 193 68 1U0 10T 226 236 232 396 4i6 686 108 1475 1415 1456 2912 2637 3580 7

b. 38Ο.ΟΟΟ cpm/test; 5x10 cpm/ug DNA

* 7

10 bg 340.000 cpm/test; 4x10 cpm/ug DNA

d . — ,

b 350.000 cpm/test; 5x10 cpm/ug DNA

3 7

b^b^ 310.000 cpm/test; 7x10 cpm/ug DNA

b^bg 700.000 cpm/test; (b'^-bg)^ 7OO.OOO cpm/test; 15 Statistisch berekend, werd de 95% zékerheidslimiet van de tests uitge-voerd zonder monsters (= negatieve controles) beschouwd als de ondergrens voor positiviteit. Deze waarden waren 52-54 cpm wanneer de sonde b1, b^ of b^ was, 58 cpm wanneer de sonde b^ ,b^ was, 56 cpm wanneer de sonde bi~bg was, en 65 cpm wanneer de sonde b^-b^jb^ was.

20 c) Chlamydia-diagnostiek onder toepassing van sandwich-hybridisatie met reeksen nucleïnezuur-fragmenten

Specimina genomen van drie mannen lijdend aan urethritis en van drie vrouwen lijdend aan cervicitis werden gekozen voor test. Chlamydia trachomatis was geïsoleerd uit de mannelijke urethrale specimina en de vrou-25 welijke specimina genomen van de cervix. Hiernaast werd een overeenkomstig-aantal soortgelijke patiënt-specimina, waaruit geen chlamydia was geïsoleerd, bestudeerd. De te onderzoeken specimina werden genomen met katoenen_ gaasjes, die gedoopt waren in een chlamydia monster-opnemende buffer, die 0,2 M saccharose, 20 mM fosfaat-buffer, 3 % feutaal kalver-30 serum, 10 ug/jnl gentamicine, 100 ug/ml vancomycine en 25 IU/ml nystatine bevatte.

Chlamydia werd gecultiveerd uit de specimina. De oorspronkelijke specimina werden ook getoetst met sandwich-hybsidisatie onder toepassing van een reeks nucleïne zuur-fr agmenten. De specimina werden geconcentreerd 35 onder toepassing van 2-butanol om daaruit vloeistof te verwijderen op zo-BADΖβ ongeveer 80 ul was, zodat de concentra- 8500424 - j 6.- tie voor het testen ongeveer 3-7-voudig was. Hierna werd 70 mM EDTA, 0,7 % SDS, 200 ug/ml proteinase K enzym toegevoegd aan het specimen, en het werd gedurende 15 minuten op 55°C en gedurende b5 minuten op 37°C behandeld. Hierna werd het specimen'gedurende 5 minuten gekookt in 0,175 5 M NaOH. Het gekookte specimen werd op 0°C gebracht en geneutraliseerd met een equimolaire hoeveelheid azijnzuur en getest. De filters en hybri-disatie-omstandigheden beschreven in Voorbeeld Ib werden gebruikt in de test. De gebruikte sonde was mKTH12U5 (b^-b^), 300.000 cpm/U00 μΐ hybri·-disatie-reactie. Tabel C laat de resultaten zien.

10 Tabel C

Specimen Gehybridiseerde Resultaat van radioactiviteit chlamydia-cultuur

Man 1' .151 +

Man 2 16^ + 15 Man 3 15^ +

Man l+ 61 -

Man 5 .76 -

Man 6 55

Vrouw 1 3^3 + 20 Vrouw 2 509 + . ' /

Vrouw 3 3β2 +

Vrouw U 57 -

Vrouw 5 '58 -

Vrouw 6 . 81 - 25 Buffer X^ 30-55

Chi. trachomatis L2 bacterie, 10^ U-19 +

De grens voor positiviteit in de tests was 104 cpm.

Het resultaat in Tabel C laat zien dat sandwich-hybridisatie onder 30 toepassing van een reeks nucle Ine zuur-fragment en geschikt is voor de diagnose van geslachtsziekten. De monsters die negatief waren in de cul-tuur-tests waren ook negatief in de sandwich-bybridisatie-test.

Voorbeeld II

a) Een reeks nuclèïnezuur-reagentia uit Cytomegalovirus en de bereiding 35 daarvan"· BADORiqi^Lde dianostiek van Cytomegalovirus geschikte DNA-fragmenten o k η Λ /. o * -17-.

. werden "bereid uit Cytomegalovirus (AD169, ATCC VR-538)-(CMV). DNA werd geïsoleerd en gefragmenteerd volgens bekende methoden. EcoRI-fragment I van ongeveer 9kb, gedefinieerd in Spector e.a., <J. Virol. b2t 550-582, 1982, werd geïsoleerd uit agarosè^gel door electro-elutie nadat de 5 EcoRI-restrictie-fragmenten gescheiden waren op basis van hun grootte. Het geëlueerde DNA werd geëxtraheerd met fenol, waarna het geprecipiteerd werd met ethanol. Het zo gezuiverde DNA werd door middel van TU-ligase gebonden aan de pBR325-plasmide-vector, geopend door gebruik van het EcoRI-enzym, en het geproduceerde recombinant-DNA werd overgebracht naar 10 E. coli K12 HB1Q1 gastheer-bacteria. Uit ampicilline- en tetracycline-resistente maar chlooramphenicol-gevoelige klonen werd er één gekozen die een cytomegalovirus-specifieke DNA-insertie van de juiste grootte bevatte. Het karakter van het gekloonde cytomegalovirus-DNA werd verzekerd door de Southern vlek-methode. Deze test verzekerde dat het beschreven 15 9kb EcoRI-DNA-fragment was- afgeleid van het DNA van Cytomegalovirus en, meer specifiek, opgenomen was in het HindIII-D-fragment daarvan (Oran e.a., J". Gen. Virol., 59, 111-129, 1982). De zo beschreven recombinant-plasmide werd pETH1271 benoemd, en werd gedeponeerd bij de cultuurcollec-tie Deutsche Sammlung von Mikroorganismen onder nummer DSM 2826. De re-20 combinant-plasmide werd gekweekt en gezuiverd met bekende technieken.

Het verdere klonen werd uitgevoerd door bekende technieken waarbij, als vectors de pBR322-plasmide en de M13mp7- en MT3mp8-fagen werden toegepast. Fig. 12 laat de hybride-plasmide pKTH1271 zien, die een moleculaire lengte van ongeveer 9kb heeft. De reeks nucleïnezuur-fragmenten 25 getoond in Fig.12 werden bereid onder toepassing van de restrictie-enzy-men EcoRI, BamHI, Clal en Pstl. Fig. 12 laat de fragmenten zien die verkregen werden onder toepassing van restrictie-enzymen evenals de relatieve grootte en localisatie daarvan. Tabel D geeft de grootten van de' betreffende fragmenten en de voor verder klonen gebruikte vectoren, de 30 namen van de zo verkregen recombinant plasmiden, en de toepassing daarvan hetzij als filter-reagentia hetzij als gelabelde sondes. Fig. 13 laat een reeks sandwich-hybriden zien, die gevormd wordt wanneer de reeks nucleïnezuur-fragmenten gegeven in Tabel D worden toegepast.

BAD ORIGINAL

o c η A /. o / - 18 -

Tabel D

Restrictie-fragment Vector Benoeming Gebruik.

a1 EcoRI-PstI (3,3kb) pBR322 “ pKTH12T3 Filter a2 Clal-Bamïïl (3,0kb) pBR322 pKTH1274 Filter 5 b^ Pstl-PstI (0,6kb) M13mp7 mEIH12TT Gelabelde sonde b2 Pstl-Clal (l,.0kb) M13mp3 mKTH1278 Gelabelde sonde b^ BamHI-EcoRI (l,Okb) M13mp8 mKTH1279 Gelabelde sonde.

b) Demonstratie van de gevoeligheid van een reeks nucleïnezuur-reagentia uit cytomegalovirus met de sandwich-hybridisatie methode 10 De gèvoeligheid van een reeks nucleïnezuur-reagentia vergeleken met iên continu reagens-paar werd getoetst met de sandwich-hybridisatie- methode. Het specimen in de tests was CMV-DNA, dat 5 min. gekookt was in 0,1T M ïïaOH en daarna geneutraliseerd als in voorbeeld Ib. Filters die alle 10^ moleculen van zowel pKTH1273 (a1) DNA als pKTH1274 (ap) DNA, 1 ^125 15 enkelstrengs gemaakt, bevatten, en de volgende sondes gelabeld met J gegeven in Tabel E: mKTH1277 (b.), mKTH1278 (b„) en mKEH1279 (b_), 1 c g werden gebruikt in de test. Iedere sonde bevatte 10 cpm/yg DNA. De hybridisatie werd uitgevoerd zoals beschreven in voorbeeld Ib. Tabel E laat de resultaten zien.

20 Tabel E /

Gehybridiseerde radioactiviteit,

Specimen met (b) als de sonde.

moleculen/test b1 b2 b3 ,b2 b^b^b^ 0 ^ 35 33 38 45 53 25 106 38 44 46 95 : Ï25 g __l 4x10 . 85 135 142 205 292 1,6x1ο"7 ' 203 254 265 4t5 645 b1 310.000 cpm/test b2 320.000 cpm/test 30 b^ 300.000 cpm/test b^,b2 300.000 van ieder/test b^,b2,b3 300.000 van ieder/test

In da. .test was de waarde van de ondergrens voor positiviteit 51-55 BAD<$BIGifclAfcr de sonde b^ ,b2 of b^ was, 59 cpm wanneer de sonde b^ ,b2 was, e»; n ft l ? l ·.

-19-.

. en 63 cpm wanneer de sonde was.

De- resultaten in Tabel E laten zien dat. de sandwich-hybridisatie waarin een individueel sonde-reagens wordt gebruikt (bi,b0 of b_) in 6 \ d 5 ' alle gevallen UxlO CMV-DM-moleculen detecteert. Anderzijds detecteert 6 5 hybridisatie met een reagens van b^ of b^b^b^ zo weinig als 10 •moleculen CMV-DNA. De resultaten laten zien dat de reeks nucleïnezuur-reagentia 1*· maal zo gevoelig ^zijn als individuele nucleïnezuur-reagentia.

c) CMV-diagnostiek onder toepassing van sandwich-hybridisatie mét een reeks nucleïnèzuur-reagentia 10 Klinische specimina werden getoetst onder toepassing van sandwich- hybridisatie met een reeks reagentia. Deze monsters bevatten twee urine-specimina van kinderen onder de 1 jaar. Van deze kinderen vermoedde men dat zij leden aan congenitale cytomegalo-ziekte. Een long-biopsie-speci-men van een patiënt met CMV-longinfectie werd eveneens getoetst met de onderhavige sandwich-hybridisatie. Zowel cytomegalovirus-geïnfecteerde als ongeïnfecteerde menselijk feutale.cellen werden eveneens gebruikt als specimina in de test.

Een oplossing die 1 % sarcosyl en 5 nM EDTA en 200 yg kalver-thymus-DNA bevatte» werd toegevoegd aan een 10 ml urine, specimen, waarna het 20 door het virus af gegeven DBA, samen met de drager, werd neergeslagen onder toepassing van 10 ml isopropanol bij kamertemperatuur. Het DNA-neerslag werd opgelost in 200 pg TE-buffer en werd tot eèn enkelstrengs-vorm gebracht door het gedurende 5 minuten te koken, waarna de DNA-oplossing werd gekoeld tot 0°C en toegevoegd aan de hybridisatie oplos-25 sing.

3

Het long-biopsie-specimen (enkele mm ) werd mechanisch fijngehakt, met een mes, 200 μΐ TE-buffer, die 1 % SDS oplossing en 1 mg/ml proteinase K-enzym bevatte, werd eraan, toegevoegd. Een digestie werd uitge-voerd bij +37°C gedurende 1 uur, waarna het specimen tweemaal in een 30 injectiespuit werd getrokken door een dunne hypodermale naald. Het zo gehomogeniseerde specimen werd gekookt, waarna het werd toegevoegd aan de test-oplossing.

De met cytomegalovirus geïnfecteerde cellen en de ongeïnfecteerde cellen werden stuk gebroken door een SDS, proteinase K behandeling, 35 gehomogeniseerd en gekookt, zoals hierboven.

De reagentia in de hybridisatie-test waren pKTH1273 (a^) en pKTH12T^' (a2) op filters en mKTH1277 ), mKTH1278 (hgl, en mKTH1279 (b_) als"sondes, ieder 200.00 cpm/reactie. In andere opzichten werd

BAD ORDINAL

O R Π Π L 0 A

- 20 - . · de· hybridisatie, het wassen van de filters en het tellen van de resultaten uitgevoerd zoals beschreven in voorbeeld Ib. Tabel F laat de resultaten van de onderhavige hybridisatie zien.

Tabel F

,5 ; Gehybridiseerde Virus-isolatie

Specimen radioactiviteit

Geïnfecteerde cellen (10^) 3521 Niet uitgevoerd

Urine T (10 ml) 2^3 CMV

Urine 2 (10 ml) 321-5 CMV

10 Urine van een gezonde persoon (10 ml) 52 Niet uitgevoerd

Long-biopsie-specimen 535 CMV

Controle-cellen 10^ 68 . Niet uitgevoerd

Geen specimen 65 Niet uitgevoerd 1-5 De resultaten in tabel 6 laten zien dat het mogelijk is, onder toepassing van een reeks nuclelnezuur-reagentia, CMV te demonstreren in verschil-. lende klinische specimina zoals urine, long-biopsie-specimina en cellen.

De test is specifiek voor cytomegalovirus; het identificeert menselijk DNA niet, d.w.z. de test wordt niet verstoord door het menselijk 20 DNA da.t in het monster aanwezig is.. In feite wordt de specificiteit van de test op geen enkele wijze verstoord door het type specimen.

BAD ORIGINAL

ö K fi Π I. 0 h

Claims (13)

1. Nuclelnezuurreagentia, met het kenmerk dat deze reeksen alternerende nuclelnezuurfragmenten omvatten.

2. Nuclelnezuurreagentia volgens conclusie 1, met het kenmerk dat 5 deze twee of meer series van ten minste twee maar bij voorkeur meer reeksen alternerende nuclelnezuurfragmenten die voldoende homoloog zijn met het te identiferen nucleïnezuur, maar niet homoloog met elkaar, omvatten.

3. Nuclelnezuurreagentia volgens conclusie 1 en 2, met het kenmerk 10 dat deze hetzij gescheiden hetzij verbonden reeksen alternerende nucleïnezuurfragmenten omvatten^

4. Nuclelnezuurreagentia volgens conclusie 1,2 of 3, met het kenmerk dat deze reeksen nucleïnezuurfragmenten met of zonder van vector afgeleide delen omvatten.

5. Nuclelnezuurreagentia volgens conclusie 1, 2, 3 of 4, met het kenmerk dat deze gelabelde reeksen nucleïnezuurfragmenten omvatten.

6. Nuclelnezuurreagentia volgens conclusie 1, 2, 3 of 4, met het kenmerk dat deze reeksen nucleïnezuurfragmenten die gebonden zijn aan een vaste drager omvatten.

7. Nuclelnezuurreagentia volgens conclusie 1, 2, 3 of 4, met het kenmerk dat deze de recombinant-plasmide pKTH1220 of derivaten daarvan ·· omvatten, welke recombinant-plasmide het DNA van Chlamydia trachomatis L2 bacterie bevat en gekloond is in de gastheer Escherichia coli K12 HB101, waarbij het depotnummer van deze gastheer die de recombinant-plasmide 25 pKTH1220 bevat DSM 2825 ïs.

8. Nuclelnezuurreagentia volgens conclusie 1, 2, 3, 4, 5 of 6, met het kenmerk dat deze de recombinant-plasmide pKTH1271 of derivaten daarvan omvatten, welke recombinant-plasmide het DNA van Cytomegalovirus ADI 69’bevat en gekloond is in de gastheer Escherichia coli KI2 ΉΒ101, 30 waarbij het depotnummer van deze gastheer die de recombinant-plasmide PKTH1271 'bevat DSM 2826 is.

9. De toepassing van nuclelnezuurreagentia vólgens één van de voorgaande conclusies voor het identificeren van meerdere verschillende nucleïnezuren, met het kenmerk dat geschikte combinaties van nucleïne- 35 zuurreagentia worden samengesteld uit reeksen nucleïnezuurfragmenten die voldoende homoloog zijn met deze verschillende nucleïnezuren.

10. De toepassing van nuclelnezuurreagentia volgens- één van de conclusies 1-8 in hybridisatiewerkwijzen, met het kenmerk dat de reeksen BADQaqj^en, gevormd in de hybridisatiewerkwijzen, worden gedemonstreerd O C A Λ / Λ . .- 2 - volgens op zichzelf bekende methoden.

11. De toepassing van nucleïnezuurreagentia: volgens één van de conclusies 1-8 in sandwich-hybridisatiewerkwijzen, met het kenmerk dat de reeksen van sandwich-hybriden, gevo'rmd in de sandwich-hybridisatie- 5 werkwijzen, worden gedemonstreerd volgens op zichzel-f bekende methoden.

12. ;Werkwijze voor de bereiding van nucleïnezuurreagentia volgens één van de conclusies 1-8, met het kenmerk dat men de reeksen van nucleïnezuurfragmenten bereidt door middel van recombinant-DNA-technieken, synthetisch of. semisynthetisch.

13. Werkwijze volgens conclusie 12, met het kenmerk dat de bereiding van de reeksen nucleïnezuurfragmenten omvat; a) isoleren van een gekozen nucleïnezuur van geschikte lengte; b) klonen van het gekozen nucleïnezuur in geschikte vectoren; c) fragmenteren van de nucleïnezuren onder toepassing van 15 restrictie-enzymen; - · dj combineren van de geschikte reeksen fragmenten in series onder toepassing van geschikte ligasen; e) klonen van de reeksen fragmenten in geschikte vectoren, bij voorkeur fragmenten die tot verschillende series behoren in verschillende 20 vectorenï f) labelen van de hetzij gescheiden hetzij gebonden nucleïnezuurfragmenten die tot één serie behoren; I - g) fixeren aan een vaste drager van de hetzij gescheiden hetzij .gebonden nucleïnezuurfragmenten die tot de andere serie behoren. i ·· BAD ORIGINAL sünoin