HU194938B - Process for preparing improved nucleinic acid reagents - Google Patents
Process for preparing improved nucleinic acid reagents Download PDFInfo
- Publication number
- HU194938B HU194938B HU85570A HU57085A HU194938B HU 194938 B HU194938 B HU 194938B HU 85570 A HU85570 A HU 85570A HU 57085 A HU57085 A HU 57085A HU 194938 B HU194938 B HU 194938B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- nucleic acid
- series
- fragments
- dna
- reagents
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/682—Signal amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
Description
A találmány tárgyai javított nukleinsav-reagensek, amelyek nukleinsav-fragmensek sorozatát tartalmazzák, valamint az ilyen javított reagensek kombinációi. A találmány tárgyai még a kiónok sorozatát tartalmazó nukleinsav-reagenseknek és az ilyen nukleinsav-reagensek kombinációinak előállítási módszerei rekombináns DNS technikákkal, valamint ezek alkalmazása a nukleinsavak azonosítására hibridizálási módszerekkel.
Különböző hibridizálási módszereket alkalmaznak általában a nukleinsavak azonosítására és tanulmányozására. Ilyenre példák a direkt hibridizálási módszerek, amelyben az azonosítandó nukleinsavat tartalmazó minta vagy oldatban van (Brautigam és munkatársai: J. Clin. Microbiol. 12, 226—234 (1980), és 2, 019, 408 lájstromszámú brit szabadalmi leírás), vagy szilárd hordozóra van rögzítve (4, 139, 346; 4, 302, 204; 4, 358, 535; 4, 395, 486 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások, 2, 034, 323; 2, 095, 833 lajstromszámú brit szabadalmi leírások, 62, 286; 62, 237; 61, 740 lajstromszámú európai szabadalmi leírások), és egy jelzett nukleinsav reagens alkalmazásával van kimutatva, amely reagens hibrídizálódík az azonosítandó nukleinsavval.
Más ismert hibridizálási módszerek közt találjuk a kétlépcsős szendvics-hibridizálási módszert, amelyet Dunn és Hassell mutatott be (Cell, 12, 23—36 (1977)),és az egylépcsős szendvics-hibridizálási módszert, amelyet a 79, 139 lajstromszámú európai szabadalmi leírás ismertet. A nukleinsavak azonosításához szendvics-módszerekkel két külön nukleinsav-reagens szükséges, hogy kimutassák a minta-oldatban jelen levő nukleinsavakat. A két reagens egyikét szilárd hordozóra rögzítik, és a másikat jelzéssel látják el.
A nukleinsav-reagensekre, mind arra, amely a szilárd hordozóra van rögzítve, mind arra, amely jelezve van, az jellemző, hogy bázis szekvenciájuk komplementer, vagy közel komplementer az azonosítandó nukleinsavakra, vagyis homológ. Az alkalmazott nukleinsav-reagensek vagy természetes nukleinsavak, mint olyanok, vagy ezek fragmensei. A fragmenseket pl. restrikciós enzimeket alkalmazva lehet előállítani. Nukleinsav-reagenseket lehet előállítani szintetikusan is, vagy rekombináns DNS-technikával. Természetes plazmidokat (4, 358, 535 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), bakterofágokból származó nukleinsavakat (4, 543, 535 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), riboszomális RNS-t és messenger (hírvivő) RNS-t (4, 302, 204 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), vagy különböző vírusokból származó nukleinsavakat (Stalhandske és munkatársai: Curr. Top. Microbiol. Virol 104, (1983)) alkalmaztak nukleinsav-reagensként. A teljes vírus-genomot alkalmazták pl. egy hibrid vírus messen2 ger RNS-ében levő különböző vírusokhoz tartozó részek azonosításához (Dunn és Hassell, Cell, 12, 23—26 (1977)). Nukleinsav-reagenseket állítottak elő rekombináns DNS-technikákat alkalmazva is (4, 395, 486 és 4, 359, 535 lajstromszámú amerikai egyesült állafriokbeli szabadalmi leírások, a 79, 139 és 62, 286 lajstromszámú európai szabadalmi leírások és a 2, 034, 323 lajstromszámú brit szabadalmi leírás). A rekombináns DNS technikákkal előállított nukleinsav-reagenseket vagy olyan módon alkalmazzák, hogy a replikáit, meghatározott DNS fragmenst megtisztítják a vektor DNS-étől, vagy rekombináns DNS molekulák formájában, amelyek különböző vektorokhoz vannak kötve. A korábban használt, rekombináns DNS technikákkal előállított nukleinsav reagensek vagy egy folytonos azonosító nukleinsav-fragmensből, vagy számos elkülönített klónból állnak.
Mi új, érzékenyebb nukleinsav-reagenseket fejlesztettünk ki, amelyek nukleinsav-fragmensek váltakozó sorozatának legalább két szériájából állnak, amely sorozatok vagy egy, vagy több, az azonosítandó nukleinsavra homológ szegmensekből készültek.
Azok a nukleinsav-reagensek, amelyek a nukleinsav-fragmenseknek ilyen sorozatát tartalmazzák, szendvics-hibridizálási vizsgálatokban legalább kétszer olyan érzékenyek, mint a korábban alkalmazott nukleinsav-reagensek. A találmány szerinti nukleinsav reagenseket vagy azok kombinációit alkalmazva kisebb mennyiségű nukleinsavat is azonosítani lehet, mint korábban, és ezek különösen jól alkalmazhatók szendvics-hibridizálási módszerekhez.
A találmány szerinti nukleinsav-reagensek nagyobb érzékenysége a szendvics-hibridizálási módszerekben részben azon a tényen alapszik, hogy különböző vizsgáló minták alkalmazása növeli a jelzett hibridek mennyiségét a szilárd hordozón. Itt lehetnek jelzett, vektorokból származó nukleinsavak minden hibridizálási minta mentén (1. és 2. ábra). Az 1. és 2. ábrában v jelzi a vektorból származó DNS-t, x az azonosítandó nukleinsavat, b a jelzett vizsgáló mintát, a a szilárd hordozóra rögzített azonosító nukleinsavat, és F a szűrőt. Amikor különböző vizsgáló mintákat alkalmazunk, a jelzett, vektorból származó nukleinsav részek mennyisége nő, és több jelzés kötődik a képződő hibridekre. A hibridek így könnyebben mutathatók ki.
Amikor a találmány szerinti nukleinsav-fragmens sorozatot alkalmazzuk a szendvics-hibridizálási módszerben, legalább két, vagy, amint ez az 1. ábrában látható, három azonosító nukleinsav-fragmenst rögzítünk a szilárd hordozóhoz, pl. a,, a2, és a3, egy vagy több ponton a reakció mértékétől függően. Amikor a reakció eléri végső stádiumát, egy 1. ábra szerinti helyzet állhat elő, amelyben a minta-szál hurkot vagy hurkokat képez, amelyekhez a vizsgáló minta vagy minták,pl. az 1. ábrában b, és b2> hibridizálódnak. Ugyanakkor a vektorból származó nukleinsav részek távolsága a hibridizáló kapcsolódási pontoktól (1) csökken (1. ábra) és a hibrid stabilabb, mint az a hibrid, amely egy reagens párral képződik (vagyis a technika állása szerinti módszerrel), amint ezt a 2. ábra bemutatja, ahol ez a hibrid azonos méretű, mint a nukleinsav-fragmensek sorozatának teljes területe. Az egy reagens-párból képződött hibrid vektorból származó részei könnyen törnek, pl. mechanikai feszítésre, pl. rázásra. Ilyen esetben a már hibridhez kötött jelzés elszabadul.
Mivel a találmány szerinti javított nukleinsav-reagensek érzékenyebbek, mint a korábban alkalmazott nukleinsav reagensek, ezek alkalmasak a kromoszomális átrendeződések és öröklődési betegségek kimutatására.
A találmány jellemzőit az igénypontok megkülönböztető vonásaiban mutatjuk be, és a találmányt nagyobb részletességgel mutatjuk be az ez után következő leírásban és a mellékelt ábrákban, amelyekben az 1. ábra mutatja be á szendvics-hibridek egy sorozatát;
a 2. ábra ábrázol jegy technika eddigi állása szerinti szendvics-hibridet; a 3. ábra mutatja be nukleinsav-fragmensek két váltakozó szériájának helyeit egy olyan nukleinsavban, amelyet a találmány szerinti nukleinsav-reagensek sorozata készítéséhez választottunk ki;
a 4. ábra mutatja be nukleinsav-fragmensek sorozata három váltakozó szériájának megfelelő helyeit;
az 5. ábra a 3. ábra szerinti nukleinsav-fragmensek egy sorozatát mutatja be külön (a), egymással egyesítve (b) és mind külön, mind egymással egyesítve (c);
a 6. ábra mutatja be szendvics-hibridek egy sorozatát, amelyen belül a 6a. ábra olyan szendvics-hibridek egy sorozatát mutatja be, amely akkor képződik, amikor elkülönített fragmenseket alkalmazunk, a 6b. ábra olyan szendvics-hibridek egy sorozatát mutatja be, amely akkor keletkezik, amikor egyesített b-fragmenseket alkalmazunk, és a 6c. ábra olyan szendvics-hibridek egy sorozatát mutatja be, amely akkor keletkezik, amikor mind elkülönített, mind egyesített b-fragmenseket alkalmazunk;
a 7. ábra olyan nukleinsav-reagensek egy sorozatát mutatja be, amely különböző nukleinsavakat azonosít;
a 8. ábra olyan szendvics-hibridek egy sorozatát mutatja be, amely akkor keletkezik, amikor a 7. ábra szerinti különböző nukleinsavakat azonosító nukleinsav-reagensek egy sorozatát alkalmazzuk;
a 9. ábra közvetlen hibridizálási módszerrel képzett hibridek egy sorozatát mutatja be; a 10. ábra a pKTH 1220 rekombináns plazmidot mutatja be;
a 11 ábra olyan szendvics-hibridek egy sorozatát mutatja be, amelyek akkor képződnek, amikor a pKTH 1220 rekombináns plazmidból készült nukleinsav-fragmensek egy sorozatát alkalmazzuk;
a 12. ábra a pKTH 1271 rekombináns plazmidot mutatja be;
és a 13. ábra olyan szendvics-hibridek egy sorozatát mutatja be, amelyek akkor képződnek, amikor a pKTH 1271 rekombináns plazmidból készült nukleinsav-fragmensek egy sorozatát alkalmazzuk.
Találmányunk nukleinsav-fragmensek sorozatából álló nukleinsav-reagensekre vonatkozik. A nukleinsav-reagenseknek ezek a sorozatai legalább két, de előnyösen több váltakozó nukleinsav-fragmenst tartalmaznak akár 20 fragmensig is, amelyek egy vagy több, az azonosítandó nukleinsavra megfelelően homokig nukleinsavból származnak. Ezáltal a nukleinsav fragmensek váltakozó sorozatainak legalább két szériáját nyerjük, amelyek nem szabad, hogy egymással homológok legyenek.
A nukleinsav-reagensek sorozatát elő lehet állítani szintetikusan. Ebben az esetben a nukleinsav-fragmensek sorozatainak két váltakozó szériájából származó fragmensek nem szabad, hogy homológok legyenek egymással. Ezeknek azonban megfelelően homológoknak kell lenniök az azonosítandó nukleinsavakban levő váltakozó helyekre. Ezeket a fragmenseket könnyen elő lehet állítani teljesen automatizált berendezésekkel az azonos’tandó nukleinsav-szekvenciájának jellemzése után.
A találmány szerinti nukleinsav-reagensek nukleinsav-fragmensek elkülönített vagy egyesített, vagy mind elkülönített, mind egyes tett sorozatából vannak összeállítva.
A nukleinsav-fragmensek sorozatait lehet egy vektorra egyesíteni, vagy ezek tartalmazhatják vektorok részeit, vagy teljesen mentesek lehetnek vektor-részektől.
Az alkalmazott nukleinsav-fragmenseknek minimális hossza 15 nukleotid. A hosszban nincs tényleges felső határ, de előnyös olyan fragmenseket alkalmazni, amelyek boszsza 20—5000 nukleotid. A találmány szerinti nukleinsav-fragmensek vagy az azonosítandó genomból származnak, vagy a genom egy részéből, pl. egy viszonylag nagy, a genom egy bizonyos részét képviselő klónból. A találmány szerinti nukleinsav-fragmensek soroztait így számos független genom területből lehet készíteni, amelyek nem közvetlenül szomszédosak egymással. Az így készített nukleirsav-fragmens sorozatokat egyesítjük és azonos reagenshez alkalmazzuk. Nukleinsav-fragmensek sorozatát lehet izolálni olyan DNS-ből is, amely nem azonos a meghatározandó nukleinsavval, de kielégítően homológ arra, úgyhogy stabil hibrid képződik a reagens és az azonosítandó nukleinsav között. A nukleinsav-fragmensek megfelelő sorozatának készítése kétségtelenül a megfelelő nukleinsav fragmensek izolálására korlátozódik a genom3
-3194938 ból. Sok egyformán hasznos módszer áll rendelkezésre a fragmensek ilyen sorozatának elkészítéséhez. Azok, akik a szakterületen jártasak, tudnak készíteni nukleinsav-fragmens sorozatokat akár szintetikus, akár fél-szintetikus módszerekkel.
A reagenseket olyan módon izoláljuk, hogy váltakozó nukleinsav-fragmensek legalább két szériáját, a,, a2, a3, stb-t és b,, b2, b3, stb-t, nyerjük. Az a,, a2, a3, stb szériákhoz tartozó nukleinsav-fragmenseket olyan fragmensekből alkotjuk meg, amelyek közel, de nem szomszédosán helyezkednek el egymáshoz. A b,, b2, b3, stb szériákhoz tartozó nukleinsav-fragmenseket szintén olyan fragmensekből alkotjuk meg, amelyek közel, de nem szomszédosán helyezkednek el egymáshoz. Az a,, a2, a3, stb. szériához tartozó nukleinsav-fragmenseknek és a b,, b2, b3, stb, szériához tartozó nukleinsav-fragmenseknek nem szabad homológoknak lenni egymáshoz. Előnyös, ha az a,, a2, a3, stb. szériához tartozó nukleinsavakat olyan módon izoláljuk, hogy minden második fragmens tartozzék az a-szériához és minden második b-szériához, amint ez a 3. ábrában látható. A 3. ábrában a,, a2, a3 és b,, b2, b3 olyan nukleinsav-fragmens sorozatok, amelyek kielégítően homológok az azonosítandó nukleinsavra. Ez természetesen úgy is lehetséges, hogy még egy harmadik, c,, c2, c3, stb. nukleinsav-fragmens szériát is izolálunk ugyanabból a nukieinsavból, amint ez a 4. ábrán látható. Előnyős, ha a váltakozó két nukleinsav-reagens közvetlenül követi egymást, de ez nem abszolút előfeltétele a találmány szerinti eljárásnak.
A fentebb leírt nukleinsav szériákat lehet használni vagy mint a,, a2, a3, stb. és b,, b2, b3, stb. elkülönített fragmenseket (5a. ábra) vagy egymással egyesített hosszabb szálakká a,-a2-a3, stb. és b[-b2-b3, stb. formában (5b. ábra). Természetesen el lehet készíteni az intermedier formák összes fajtáját, mint pl. egy olyan a-szériát, amelyben a, elkülönített fragmens és a2-a3 egyesítve vannak, és a b-szériában pl. b,-b2 vannak egyesítve egymással és a b3 van elkülönítve, stb., amint ez az 5c. ábrában látható.
A 6. ábra szendvics-hibridek különböző sorozatait mutatja be. A 6a ábra olyan szendvics-hibridek sorozatait mutatja be, amelyekben a nukleinsav-fragmensek sorozatai el vannak különítve. A 6b ábra olyan hibridek sorozatát mutatja be, amelyben a nukleinsav-fragmensek jelzett sorozata egymással egyesítve van. A 6c ábra olyan esetet mutat be, amelyben szendvics-hibrideknek egy sorozata képződik nukleinsav-fragmensek mind egyesített, mind elkülönített jelzett sorozataiból. A 6. ábrában x jelenti az azonosítandó nukleinsavat, b,, b2 és b3 jelenti a jelzett vizsgáló mintát, és a,, a2 és a3 jelzik egy szilárd hordozóra rögzített nukleinsav-fragmensek sorozatát. Azokat a nukleinsav-fragmenseket, amelyek a b-szériához tartoznak, lehet pl. 4 olyan módon jelezni, hogy jelzett nukleinsav-reagenst alkalmazunk, azaz B vizsgáló mintát. Azokat a nukleinsav-reagenseket, amelyek az, a-szériához tartoznak, olyan módon lehet szilárd hordozóra rögzíteni, hogy egy szilárd hordozóhoz kötött A nukleinsav reagenst nyerünk. Van természetesen más lehetőség is: egy jelzett A nukleinsav-reagens és egy megfelelő szilárd hordozóhoz kötött B nukleinsav-reagens előállítása.
Ilyen A és B, vagy B és A nukleinsav-párokat, amelyek jelezve^ illetve szilárd hordozóra kapcsolva vannak, számos különböző azonosítandó nukleinsavhoz lehet készíteni. Ezeket össze lehet kombinálni megfelelő nukleinsav-reagens kombinációkká, amelyek különböző A, és B,, A2 és B2, A3 és B3, stb. vagy B, és A,, B2 és A2, B3 és A3, stb. nukleinsav-reagens párokból vannak összeállítva. Azokat a reagenseket, amelyek nukleinsav-fragmensek olyan sorozatait tartalmazzák, amelyek különböző nukleinsavakat azonosítanak, szintén lehet úgy kombinálni, hogy egy Av-A„-Az vizsgáló mintát nyerjünk, amely pl. (a,-a2-a3)x- (3,-32-33)1,-(3,-32-33)2 nukleinsav-fragmens sorozatot tartalmaz, amint ez a 7. ábrában látható, amelyben a,x, a2X, és a3x az Ax nukleinsav-fragmensek sorozatai, amelyek azonosítják az x nukleinsavat; az a, a2„ és a3;/ az Ay nukleinsav-fragmensek sorozatai, amelyek az y nukleinsavat azonosítják; a,2, a2?, és a37 az A? nukleinsav-fragmensek sorozatai, amelyek a z nukleinsavat azonosítják, és v egy vektor-eredetű nukleinsav-rész. Nukleinsav-fragmensek egyesített sorozatait természetesen szintén lehet alkalmazni, akár mint elkülönített fragmenseket, akár mint megfelelő keverékeket.
A 8. ábra szerinti szendvics-hibridek sorozatát a 7. ábrában bemutatott reagensek alkalmazásával nyerjük. Ha több különböző nukleinsav egyidejű meghatározása szükséges, akkor természetesen elkülönített szűrőket kell alkalmazni, amint ez a 8. ábrában látható. A 8a. ábra az x nukleinsavat azonosító szilárd hordozót mutat be, a 8b. ábra az y nukleinsavat azonosító szilárd hordozót, a 8c. ábra pedig a z nukleinsavat azonosító szilárd hordozót. A 8a, 8b és 8c ábrákban a b,v és b2, egy szilárd hordozóra rögzített és az x nukleinsavat azonosító nukleinsav-fragmensek sorozatát jelöli; a b,,, és b2l( egy szilárd hordozóra rögzített és az y nukleinsavat azonosító nukleinsav-fragmensek sorozatát jelölik; és a b,, és b2> egy szilárd hordozóra rögzített és a z nukleinsavat azonosító nukleinsav-fragmensek sorozatát jelölik;és x, y és z a meghatározandó nukleinsavak.Fr, és F, a megfelelő szilárd hordozók vagy szűrők. A,.-Ay-A, egy vizsgáló minta, amely mind a három nukleinsavat egyidejűleg azonosítja, ha elkülönített szilárd hordozókat alkalmazunk.
A fentebb leírt nukleinsav-fragmens szériák, reagensek és reagens-kombinációk ismert rekombináns DNS technikákkal készíthetők.
-4194938
Az azonosítandó nukleinsavakból vagy ezek részeiből restrikciós enzimek alkalmazásával különböző hosszúságú nukleinsav-fragmensek egész sora alakítható ki. Ha az azonosítandó genom restrikciós térképe ismert, lehetséges a genomból kiválasztani a megfelelő szomszédos fragmenseket, amelyek restrikciós enzimek alkalmazásával alakultak ki, és így a fragmenseket izolálhatjuk és rekombináns DNS technikával sokszorozhatjuk.
Amikor ismeretlen genomról van szó, egy közbenső stádiumot kell alkalmazni a reagensek készítésében, olyan módon, hogy egy viszonylag nagy restrikciós fragmenst klónozunk, ezt a fragmenst feltérképezzük, és az a,, a2, a3, stb. és b,, b2, b3, stb. nukleinsav-fragmens sorozatok szériáit az így nyert információ alapján előállítjuk.
Lehetséges természetesen a fenti módszerek kombinációit is alkalmazni és több nagy különböző klónozott restrikciós fragmenst alkalmazni kiindulási anyagként, és több különböző szériát készíteni, amelyet azután egyesítünk, hogy megfelelő kombinációt képezzünk.
Előnyös az a,, a2, a3, stb. és b,, b2 és b3, stb. nukleinsav-fragmerrs szériákat a találmány szerint rekombináns DNS technikákkal olyan módon előállítani, hogy az a szériát egy vektorba, pl. pBR 322 plazmidba klónozzuk, miközben a b szériát egy másik megfelelő vektorba klónozzuk, amelynek nincsenek közös szekvenciái az előbbi vektorral. Az M13 bakteriofág lehet példa ilyen előnyös második vektorra. Az a szériához tartozó fragmenseket lehet egyesíteni egymással, és az egyesített szériákat egy vektorba lehet klónozni. Pl. az egymással egyesített a,-a2-t klónozni lehet, mint folyamatos beiktatást az azonos pBR 322 vektorba. Ennek megfelelő módon el lehet készíteni a b,-b2 reagens sorozatokat is. A klónozáshoz előnyös olyan vektorokat használni, amelyekhez idegen DNS nagyon nagy beiktatásai lehetnek csatolva. így pl. a lambda-fág és a kozmid vektorok megfelelők erre a célra.
így a találmány szerint két, nukleinsav-fragmensek sorozatát tartalmazó reagens-pár szükséges a szendvics-hibridizálási módszerben: egy, az azonosítandó jel-vegyülettel jelzett reagens, azaz a vizsgáló minta, és egy úgynevezett szűrő-reagens, amely szilárd hordozóra van rögzítve.
A legáltalánosabb radioaktív izotópokat alkalmaznak a vizsgáló minták jelzésére, így pl. a 2, 034, 323 lajstromszámú brit és 4, 358, 535 és 4, 302, 204 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások a következő izotópokat alkalmazzák: 32P, 125I, 13II, és 3H. A 79, 139 laistromszámú európai szabadalmi leírás a l5sI izotópot alkalmazza. A nukleinsav vizsgáló mintákat különböző módokon módosították és jelölték pl. fluorescens jelzésekkel (2, 518, 755 lajstromszámú francia szabadalmi leírás). Alkalmaz8 tak enzimes vagy enzimesen mérhető jelzéseket is (2, 019, 408 lajstromszámú brit, 63, 879 lajstromszámú európai és 2,519,005 lajstromszámú francia szabadalmi leírások). A 70, 685 és 70, 687 lajstromszámú európai szabadalmi leírások fény-kibocsátó jelzést és jelölési módszert írnak le, és a 2, 518, 755 lajstromszámú francia szabadalmi leírás immunológiailag mérhető jelölést ír le. A 4, 374, 120 lajstromszámú amerikai egyesült államok beli szabadalmi leírásban leírt lantanid-kelátokat is lehet alkalmazni jelző vegyületként. A Leary és munkatársai által leírt (PNAS 80, 4045—4049 (1983)) biotin-avidin jelző anyag is alkalmas jelzésként. A találmány szerinti nukleinsav-reagensek jelzéséhez alkalmazható jelzéseknek néhány példáját említettük csak fentebb, de nyilvánvaló, hogy fejlesztenek majd ki új, javított jelző anyagokat, amelyek szintén alkalmasak lesznek a találmány szerinti nukleinsav-fragmens sorozatok jelzéséhez.
A szűrő-reagensekhez alkalmas hordozók különböző nitrocellulóz-szűrők lehetnek (4, 358, 535 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli és 2, 095, 833 lajstromszámú brit szabadalmi leírás). A 148, 955 lajstromszámú NDK-beli szabadalmi leírás nukleinsavak kémiai kötési módszerét írja le hordozóra (papírra). A 4,359,535 és 4,302,204 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások vegyileg módosított papírokat írnak le, amelyeket lehet szilárd hordozóként alkalmazni. Más változatok lehetnek a nylon membránok és módosított nitrocellulóz szűrők. Nyilvánvaló azonban, hogy tj anyagokat is fejlesztenek ki majd, amelyek még alkalmasabbak lesznek a találmány szerinti szilárd hordozók céljára. Természetesen lehet használni még más szilárd hordozókat is, pl. különböző kromatográfiás mátrixokat, mint pl. triazinnal vagy epoxival akt vált cellulózt, látexet, stb. Elvileg nincs semmiféle más korlátozás a szilárd hordozó kiválasztásában, mint az, amelyet az alábbiakban leírunk. Lehetségessé kell tenni a nukleinsavak rögzítését egyszálú formában a szilárd hordozóhoz úgy, hogy ezek az egyszálú nukleinsavak hibridizálódni tudjanak a komplementer nukleinsavakkal. A szilárd hordozónak könnyen eltávolíthatónak kell lenni a hibridizáló oldattól, vagy a hibridizáló oldatnak kell könnyen eltávolíthatónak lenni a szilárd hordozótól. A vizsgáló mintának sem szabad a hordozó anyaghoz magához úgy tapadnia, hogy ne lehessen onnan lemosni.
Az A és B vagy B és A nukleinsav-reagens sorozat párok fentebb leírt kombinációiból, amelyek jelezve,illetve szilárd hordozóra rögzítve vannak, és olyan nukleinsav-párokból, amelyek a különböző nukleinsavak azonosítfsához vannak készítve, lehetséges összeál1 tani Ax és Bx, A^ és B^, Az és B? kombinációt. Ezeket a kombinációkat lehet alkalmazni az x, y és z nukleinsavak egyidejű azonosí5
-5194938 tásához szendvics-hibridizálási módszerekkel.
A mintát olyan módon kezeljük, hogy a nukleinsavakat a hibridizáló oldatba bocsátjuk, és azokat egyszálúvá tesszük. A hibridizálást egy hibridizáló oldatban hajtjuk végre, amelyhez hozzáadjuk mind a szilárd hordozóhoz rögzített nukleinsavat, mind a jelzett nukleinsavat. Amikor a hibridizálás végbement, a szűrőket kiemeljük a hibridizáló oldatból, ha szűrőt alkalmazunk szilárd hordozóként. Ha kromatográfiás mátrixot, látexet vagy hasonlókat alkalmazunk, a hibridizáló folyadékot távolítjuk el. A szilárd hordozót egy megfelelő mosó oldattal leöblítjük. A képződött szendvics hibridek sorozatát (8a, 8b, 8c ábrák) ismert módszerekkel mutatjuk ki. A radioaktív jelzést pl. autoradiográfiával, vagy szcintillációs számlálóval, vagy gammaszámlálóval mérjük. Egy enzimes jelzést pl. egy színreakció kialakulása után fotometriásan mérhetünk, vagy csapadékképződés alapján. A lantanid-kelátokat egy úgynevezett „idő felbontó fluoreszcencia (time resolved fluorenscence) módszerrel mutathatjuk ki. Egy immunológiai jelzést a célnak megfelelő immunológiai módszerekkel mutathatunk ki.
Több különböző keveréket lehet alkalmazni hibridizáló oldatként; a 79, 139 lajstromszámú európai és 4, 302, 204 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban bemutatott változatokat a példákban is megemlítjük. Természetes, hogy lehet alkalmazni más hibridizáló keverékeket is. A hibridizálás 0—80°C hőmérsékleten megy végbe, de előnyös pl. 65°C hőmérsékletet alkalmazni. Megfelelő hibridizálás mehet végbe igen rövid idő alatt is, de előnyös pl. 12—20 óra hibridizálási időt alkalmazni.
A két-lépéses szendvics-hibridizációs módszert elvileg azonos módon hajtjuk végre, de ebben az esetben a szilárd hordozóhoz rögzített nukleinsav-reagenst adjuk először a hibridizáló oldathoz. Amikor a hibridizálás végbement, a szilárd hordozót mossuk és második hibridizálást hajtunk végre, amelyben a jelzett nukleinsav-reagens van jelen.
A fentebb leírt jelzett nukleinsav-reagenseket vagy Ax, Ay, Az, stb. és Bx, B^, Bz, stb. reagens-kombinációkat természetesen lehet alkalmazni közvetlen hibridizálási módszerekben is. Ilyen esetben egy oldatban levő nukleinsav mintát az azonosítandó x, y és z nukleinsavhoz szét kell osztani, vagy ha a minta szilárd hordozóhoz van rögzítve, külön-külön, hordozóhoz rögzített mintát kell készíteni minden egyes mintához. A hibridek így képződött sorozatát (9. ábra) ismert módszerekkel lehet kimutatni. A 9. ábrában F jelenti a szilárd hordozót, azaz a szűrőt, x jelenti az azonosítandó nukleinsavat, és v jelenti a vektorból származó részeket. Az alkalmazott jelzett vizsgáló minták az a,, a2, és a3 (9a. ábra), b, és b2 (9b. ábra) és a,, b,, a2, b2, a3 (9c. ábra).
Amint ezt már fentebb leírtuk, a nukleinsav-reagensek különböző kombinációit készíthetjük el a találmány szerinti nukleinsav-fragmensék sorozatából. Lehetséges ezeket a kombinációkat alkalmazva azonosítani több különböző nukleinsavat egyidejűleg. Az azonosítandó különböző nukleinsavakra homológ nukleinsav-fragmensek sorozatát lehet használni elkülönített fragmensekként a keverékben, vagy egymással egyesítve olyan módon, hogy egy, több különböző nukleinsavat azonosító vizsgáló mintát nyerünk. Szilárd hordozóra kötött nukleinsav-reagenseket természetesen elkülönítve kell tartani abból a célból, hogy az azonosítás sikeres legyen.
A nukleinsav-fragmensek sorozatát alkalmazó hibridizálást lehet használni humán-, állat- és növénypatogén mikroorganizmusok azonosítására. A módszerrel lehet azonosítani élelmiszerekben jelen levő mikroorganizmusokat, mint pl. Clostridiumokat, Salmonellákat, Staphylococcusokat, amelyek élelmiszermérgezést okoznak. A módszer alkalmas a vízben levő fertőzések, pl. enterobaktériumok és enterovírusok azonosítására. Mivel a nukleinsav fragmensek sorozatát alkalmazó szendvics-hibridizáló vizsgálat kvantitatív módszer, ez alkalmazható pl. a gén-sokszorozódás kimutatására és mérésére is. Ez a jellemző fontos pl. a rák kimutatásában és mérésében. Hibridek stabil sorozatának képződéséhez az szükséges, hogy a vizsgáló minta reagens és a szűrő-reagens homológ szekvenciái egy mérsékelt, előnyösen kevesebb, mint 5 kilobázis (kb) távolságon belül legyenek egymástól a minta-szálban. Ha az e között a két terület közötti távolsággal kapcsolatban változások történnek, a változás világosan megfigyelhető ezzel a módszerrel. Ennél fogva a módszer alkalmas a megváltozott mRNS, a kromoszomális átrendeződések, az immunglobulin gének kifejeződéshez való átrendeződése, valamint öröklődési betegségek kimutatására is. így lehetséges megalkotni különböző reagens-kombinációkat a nukleinsav-fragmensek sorozataiból. így pl. a nemi betegségek okozó anyagainak azonosításához lehetséges olyan készleteket készíteni, amelyek magukban foglalnak egy vizsgáló mintát, amely gonorrheát, szifiliszt, herpeszt és chlamidiákat azonosító nukleinsav-fragmerisek sorozatát tartalmazza. Az azonosítás ebben az esetben gonorrheához, szifiliszhez, herpeszhez és chlamidiához külön-külön szűrőket alkalmazva lehetséges,
A találmány főleg a pKTH 1220 és pKTH 1271 rekombináns plazmidokat tartalmazó nukleinsav-fragmensek sorozatára vonatkozik. A pKTH 1220 rekombináns plazmid, a pBR 322 plazmid vektorban, magában foglalja a Chlamydia trachomatis L 2 DNS-ét, amely a Chlamydiákra fajlagos. Ezt a rekombináns plazmidot klónozzuk az Escherichia coli K 12 HB101 gazdaszervezetbe. A 1271 rekombi-6194938 náns plazmid, a pBR 325 plazmid vektorban magában foglalja az AD 169 citomegalovírusból származó DNS-t. Ezt a rekombináns plazmidot klónozzuk az Escherichia coli K .12 HB101 gazdaszervezetbe, a pKTH 1220 és pKTH 1271 rekombináns plazmidokat tartalmazó gazdasejtek a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen tenyészet-gyűjteményben (DSM), Griesebachstrasse 8, D-3400 Göttingen, Nyugat-Németország, letétbe vannak, helyezve. A pKTH 1220 rekombináns plazmidot tartalmazó törzs letéti száma DSM 2825 és a pKTH 1271 rekombináns plazmidot tartalmazó törzs letéti száma DSM 2826. A letétbe helyezett törzsek szabadon rendelkezésre állnak, amint a szabadalmi bejelentés nyilvánosságra kerül.
A találmányt nagyobb részletességgel írják le a következő példák. Ezeket a példákat azonban nem szabad úgy felfogni, mint a találmány oltalmi körét korlátozó tényezőket. A nukleinsavak (DNS és RNS) szerkezete hasonló, a szóban forgó nukleinsav akár prokarióta, akár eukarióta sejtből származik. Ez okból a példákban bemutatott elvek egyaránt jól alkalmazhatók az állati (embert is beleértve) nukleinsavakhoz és a növényi t mikrobiális vagy vírus nukleinsavakhoz. A nukleinsav-fragmensek sorozatait szintetikusan is elő lehet állítani. Az azonosítandó nukleinsavak szekvenciáját jellemezni lehet és fragmensek homológ sorozatait lehet előállítani automatikus nukleinsav-előállító berendezésekkel.
1. példa
a.) Nukleinsav reagensek sorozatai Chlamydia trachomatisból, és ezek előállítása
A Chlamydia trachomatis csoport diagnosztikájához megfelelő DNS fragmenseket állítunk elő Chlamydia trachomatis L 2 szerotípus DNS-éből. A DNS izolálását és fragmensekre bontását ismert módszerekkel végezzük, és az így létrejött DNS fragmenseket pBR 322 plazmidba klónozzuk és átvisszük Escherichia coli K 12 HB101 gazdaszervezetbe ismert módszerekkel. A Chlamydia trachomatis L2 baktériumnak egy gén-bankját nagyszámú rekombináns plazmid klónozása eredményeként nyerjük, amely plazmidok mindegyike Chlamydiákból származó DNS elkülönített BamHI restrikciós fragmenseivel rendelkezik. A reagensek előállításához a
Chlamydia eredetű DNS-ből származó maximálisan nagy DNS beiktatásokat tartalmazó rekombináns plazmidokat választjuk ki a gén-barikból. Egy ilyen plazmid a pKTH 1220nak nevezett plazmid, amely a Deutsche,5 Sammlung von Mikroorganismen tenyészetgyűjteményben DSM 2825 számon van letétbe helyezve, és amelynek alkalmasságát a reagensként való felhasználáshoz egy közvetlen hibridizálási vizsgálattal mutatjuk be. A vizs20 gálát kimutta, hogy a pKTH 1220 azonosította az összes, különböző Chlamydia trachomatis szerotípusokból származó nukleinsavakat, ce más nukleinsavakat nem.
A különböző restrikciós enzimeket alkal25 mazva nyerhető, alkalmazható fragmenseket a pKTH 1220-plazmid DNS-ből választjuk ki, és ezek közül a fragmensek közül néhányat átviszünk további klónozásra pAT153 plazmidba (Maniatis és munkatársai: Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1982) 6. oldal), és néhányat M 13 fágba. Á 10. ábra mutatja be a pKTH 1220 rekombináns plazmidot, amelynek molekulahossza 14 kb. A 10. ábrában
BamHI, Sáli és Clal jelenti az alkalmazott restrikciós enzimeket, és a,, a2, b,, b2 és b3 mutatja az ezeknek a restrikciós enzimeknek a segítségével termelt fragmensek méretét és kölcsönös elhelyezkedését. A b szériához tartozó fragmensek a jelzett vizsgálati minták. Az 1. táblázat sorolja fel a további klónozáshoz alkalmazott vektorok és fragmensek méretét, a rekombináns plazmidok nevét, és ezek felhasználását.
· Táblázat
| Fragmens | Méret | Vektor | Rekombináns plazmid | Alkalmazás | |
| ai | Clal-Sall | 3,0 kb | ΡΑΤ153 | pKTH1252 | Szűrő |
| a2 | Sall-Clal | 2,9 kb | pAT153 | pKTH1250 | Szűrő |
| bi | Sall-BarhHI | 0,7 kb | M13mp8 | mKTH1242 | Jelzett vizsgáló minta |
| b2 | BamHI-Sall | 1,4 kb | M13mp8 | mKTH1239 | Jelzett vizsgáló minta |
| b3 | Clal-Clal | 1,7 kb | M13mp8 | mKTH1248 | Jelzett vizsgáló minta |
| bi-b2 | BamHI-BamHI | 2,1 kb | M13mp8 | mKTH1245 | Jelzett vizsgáló minta |
Az 1. táblázatban felsorolt fragmenseket agaróz gélről izoláljuk elektroelúcióval és klónozzuk az 1. táblázatban felsorolt vektorok alkalmas restrikciós enzim-azonosítási helyeire, ismert módszereket alkalmazva.
A 2,1 kb-s BamHI-BamHI fragmenst a következőképpen állítjuk elő: a pKTH 1220 plazmid 1,4 kb-s BamHI-Sall és 0,7 kb-s SaII-BamHI íragmenseit elkülönítjük agaróz gél65 ben végzett gélelektroforézissel, amelyből 7
-7194938 ezeket izoláljuk. A tisztított fragmenseket egyesítjük egymással T4 ligáz enzim segítségével, és a reakcióban előállított 2,1 kb-s DNS-ből azokat, amelyeknek olyan szabad végeik vannak, amelyek BamHI enzimmel azonosítottunk, tovább egyesítjük M13mp8 fág DNS kétszálú formájának BamHI restrikciós helyeihez. így egy rekombináns fág-DNS-t készítünk (mKTH1245), amely tartalmazza a Chlamydia trachomatis DNS-t; ez két elkülönített DNS fragmensből áll, amelyek nem szomszédosán vannak elhelyezve a genomban. A genomban azonban ezek a szűrőhöz rögzítendő pKTH1250 és pKTH1252 DNS reagensekkel szomszédosán helyezkednek el (11. ábra). All. ábra bemutatja a szendvics-hibridek egy sorozatát, amely akkor képződik, amikor az 1. táblázatban felsorolt rekombináns plazmidokat és rekombináns tagokat alkalmazzuk, mint nukleinsav-reagensek sorozatait.
b.) Chlamydia trachomatisból származó nukleinsav reagensek egy sorozata érzékenységének bemutatása szendvics-hibridizálási módszert alkalmazva
A nukleinsav-reagensek sorozatának érzékenységét tanulmányozzuk szendvics-hibridizálási módszerrel, összehasonlítva egyedi folyamatos reagens-párral. A vizsgálatot olyan szűrőket alkalmazva hajtjuk végre, amelyek mind 10 molekulát tartalmaznak egyszálúvá rendezett mind pKTH1250(a2)-ből, mind pKTH1252(a[)-ből. A tanulmányozandó minta a pKTH 1220 plazmid, amely a vizsgálathoz egyszálúvá van rendezve 5 perces forralással 0,17 mól/literes NaOH-ban, amely után ezt átvisszük 0°C hőmérsékletre és sem10 legesítjük ekvimoláris mennyiségű ecetsavval. A következő, l25I-vel jelzett, 1. táblázatban felsorolt vizsgálati mintákat alkalmazzuk a vizsgálatban: mKTH1242(b,), mKTH1239 (b2), mKTH1248 (b3), és mKTH1245(b,-b2).
A hibridizál ást +65°C hőmérsékleten hajtjuk végre 17 órán át hibridizáló oldatban, amelynek az összetétele a következő:
4-szeres SSC, 0,02% Ficoll, 0,02% polivi20 nilpirrolidon, 0,2% SDS (nátrium-dodecil-szulfát) és 200 pg/ml hering-sperma DNS. A szűrőket 2 órán át mossuk 50°C hőmérsékleten mosó oldattal, amelynek összetétele a következő: 0,1-szeres SSC, 0,2% SDS, és megszámláljuk gamma-számlálóval. Az eredményeket a 2. táblázatban mutatjuk be, ezek öt párhuzamos vizsgálat eredményeinek átlagát mutatják.
2. Táblázat
| Minta- | Hibridizált radioaktivitás, | (b)-vel, mint vizsgálati mintá- |
| molekula/ | val | |
| vizsgálat | bi b2 b3 b1}b2 | (bi~b2)(bi_b2), b3 |
| 0 | 37 37 33 49 | 39 52 |
| 106 | 48 44 48 | 93 | 68 140 |
| 107 | 226 236 232 396 | 416 686 |
| 108 | 1475 1415 1456 2912 | 2637 3580 |
| bi | 380,000 cpm/vizsgálat; | 5.107 cpm/jüg DNS |
| b2 | 340,000 cpm/vizsgálat: | 4.107 cpm/jug DNS |
| b3 | 350,000 cpm/vizsgálat; | 5 ·107 cpm/jüg DNS |
| bi-b2 | 310,000 cpm/vizsgálat; | 7 · 107 cpm/jug DNS |
| bi ,b2 | 700,000 cpm/vizsgálat; | |
| (bi_b2),b3 | 700,000 cpm/vizsgálat; |
Statisztikailag kalkulálva minta nélkülvég. rehajtott (negatív kontroll) vizsgálatok 95%-os biztonsági (konfidencia) határát tekintjük a pozitivításhoz alsó határnak. Ezek az értékek, amikor a vizsgáló minta b,, b2 vagy b3, 52—54 cpm; amikor a vizsgáló minta b,, b2, 58 cpm; amikor a vizsgáló minta b,-b2, 56 cpm; és amikor a vizsgáló minta b,-b2, b3, 65 cpm.
c.) Chlamydia diagnosztika szendvics-hibridizálást alkalmazva nukleinsav-fragmensek sorozatával
Három férfitől, akik urethritisben szenvednek és három nőtől, akik cervicitisben szénvednek, mintákat veszünk a vizsgálathoz. Chlamydia trachomatist izolálunk a férfi húgy55 csövekből és a női méhnyakból vett mintákból. Ezen kívül megfelelő hasonló páciensből vett mintákat is tanulmányozunk, akikből Chlamydiát nem tudunk izolálni. A vizsgálandó mintákat gyapottal fedett tamponokkal θθ vesszük, amelyeket Chlamydia mintavevő pufferba merítünk, amely puffer 0,2 mól/liter szacharózt, 20 mmól/liter foszfát-puffért, 3% borjúembrió szérumot, 10 pg/ml gentamicint, 100 μg/ml vankomicint, és 25 nemzetközi egység/ml nisztatint tartalmaz.
A Chlamydiát a mintákból tenyésztjük.
-8194938
Az eredeti mintákat szendvics-hibridizálással is megvizsgáljuk, nukleinsav-fragmensek sorozatát alkalmazva. A mintákat 2-butanolt használva koncentráljuk, hogy eltávolítsuk a folyadékot belőlük olyan módon, hogy a végső térfogat mintegy 800 μΐ legyen, a vizsgálathoz a minták koncentrációja mintegy 5—7-szeres lesz. Ez után 70 mmól/liter EDTA-t, 0,7% SDS-t és 200 pg/ml K proteináz enzimet adunk a mintához, és 15 percen át kezeljük 55°C hőmérsékleten, és 45 percen át 37°C hőmérsékleten. A mintát ez után 5 percen át forraljuk 0,175 mól/literes NaOH oldatban. A felforralt mintákat 0°C hőmérsékletre viszsziik át és semlegesítjük ekvimoláris menynyiségű ecetsavval, majd megvizsgáljuk. Az lb. példában leírt szűrőket és hibridizálási körülményeket alkalmazzuk a vizsgálatban. Az alkalmazott vizsgáló minta mKTH1245 (b,-b2), 300,000 cpm/400 μΐ hibridizáló reakciókeverék. Az eredmények a 3. táblázatban láthatók.
3. Táblázat
| Minta | Hibridi- A Chlamydia zált ra- tenyésztés | |
| díoakti- vitás | eredménye | |
| 1 . férfi | 151 | + |
| 2. férfi | 164 | + |
| 3. férfi | 154 | + |
| 4. férfi | 61 | - |
| 5. férfi | 76 | - |
| 6. férfi | 55 | - |
| 1. nő | 343 | + |
| 2. nő | 509 | + |
| 3. nő | 362 | + |
| 4. nő | 57 | - |
| 5. nő | 58 | - |
| 6. nő | 81 | - |
| Puffer, X4 | 30-55 |
Chi. trachomatis
L2 baktérium,
105 419 +
A pozitivitás határértéke a vizsgálatban 104 cpm
A 3. táblázatban az eredmények azt mutatják, hogy a nukleinsav-fragmensek sorozatát alkalmazó szendvics-hibridizálás alkalmas nemi betegségek diagnosztizálásához. A minták, amelyek negatívak a tenyésztési vizsgá16 latokban, negatívak a szendvics-hibridizálási vizsgálatban is.
2. példa
a.) Nukleinsav-reagensek sorozatai Cytomegalovírusból, és ezek előállítása
A Cytomegalovírus diagnosztikájához alkalmas DNS fragmenseket készítünk Cytomegalovírusból (AD 169, ATCC VR-538)-;CMV). A DNS-t ismert módszerekkel izoláljuk és fragmensekké bontjuk. EcoRI I. fragmenst mintegy 9 kb mérettel, amelyet Spector és munkatársai határoztak meg (J. Virol. 42, 558—582 (1982)) izolálunk agaróz gélből elektroelúcióval, miután az EcoRI restrikciós fragmenseket elkülönítettük méretük alapján. Az eluált DNS-t fenollal extrah.íljuk, majd etanollal kicsapjuk. Az így tisztított DNS-t T4 ligáz segítségével EcoRI enzimet alkalmazva kinyitott pBR325 plazmid vektorhoz kötjük, és az így előállított rekombináns DNS-t E. coli K12 HB101 gazda-baktériumba visszük át. Az ampicillinre és tetraciklinre rezisztens, de klóramfenikolra érzékeny kiónok közül egyet választunk ki, amely a korrekt méretű, Cytomegalovírusra fajlagos DNS beiktatást tartalmazza. A klónozott Cytomegalovírus DNS jellemzőit Southern-folt módszerrel derítjük ki. Ez a vizsgálat bebizonyítja, hogy a leírt 9 kb-s EcoRI-DNS fragmens Cytomegalovírus DNS-ből származik, és még jellegzetesebb módon, Hind III-D fragmensében van belefoglalva (Oram és munkatársai: J. Gén. Virol. 59, 111 —129 (1882)), Az így leírt rekomblnáns plazmidot pKTH1271-nek neveztük el, ez a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen tenyészet-gyűjteményben letétbe helyeztük D5M 2826 számon. A rekomblnáns plazmidot ismert technikákkal növesztjük és tisztítjuk.
A további klónozásokat ismert technikákkal hajtjuk végre, vektorként pBR322 plazm dót és M13mp7 és M13mp8 fágokat alkalmazva. A 12. ábra mutatja be a mintegy 9 kt-s molekula-hosszal rendelkező pKTH1271 hibrid-plazmidot. A 12. ábrában bemutatott ni kleinsav-fragmens sorozatot EcoRI, BamHI, Clal és PstI restrikciós enzimeket alkalmazva állítjuk elő. A 12. ábra bemutatja a restrikciós enzimek alkalmazásával nyert fragmenseket, valamint azok relatív méretét és elhelyezkedését. A 4. táblázat felsorolja a szóban fo’gó fragmensek méretét és a további klónozáshoz alkalmazott vektorokat, az így nyert rekombinánsok nevét, valamint alkalmazásukat vagy szürőreagensként, vagy jelzett vizsgáló mintaként. A 13. ábra mutat be egy szendvics-hibrid sorozatot, amely akkor keletkezik, amikor a 4. táblázatban felsorolt nukleinsav-fragmensek sorozatát alkalmazzuk.
4. Táblázat:
Restrikciós fragmens
Vektor Név
Alkalmazás ai EcoRI-PstI /3,3 kb/ a2 Clal-BamHI /3,0 kb/ pBR 322 pKTlI1273 Szűrő pBR 322 pKTF1274 Szűrő
-9194938
4. Táblázat (folytatás)
| Restrikciós | fragmens | Vektor | Név | Alkalmazás | |
| bi | Pstl-PstI | /0,6 kb/ | M13mp7 | mKTII1277 | Jelzett vizsgáló minta |
| b2 | Pstl-Clal | /1,0 kb/ | KI 3mp8 | mKTH1278 | Jelzett vizsgáló minta |
| b3 | BamHI-EcoRI /1,0 kb/ | M13mp8 | mKTH1279 | Jelzett vizsgáló minta |
b.) Cytomegalovírusból származó nukleinsav-reagensek egy sorozata érzékenységének bemutatása szendvics- hibridizálási módszert alkalmazva
A nukleinsav-reagensek sorozatának érzékenységét vizsgáljuk szendvics-hibridizálási módszerrel, összehasonlítva egy folyamatos reagens-párral. A minta a vizsgálatokhoz CMV DNS, amelyet 0,17 mól/literes NaOH oldattal 5 percen át forralunk, majd ez után az lb. példa szerint semlegesítjük. Olyan szűrőket, amelyek mind 10H molekulát tartalmaznak mind egyszálúvá rendezett pKTH1273 (a,) DNS-ből, mind pKTH1274 (a2) DNS-ből, és a következő, 125I-vel jelzett, a 4. táblázatbán felsorolt vizsgáló mintákat: mKTH1277 (b,), mKTH1278 (b2) és mKTH1279 (b?), alkalmazzuk a vizsgálatban. A vizsgáló minták mindegyike 10® cpm/pg DNS-t tartalmaz. A hibridizálást az lb. példában leírt mó2^ dón hajtjuk végre. Az eredményeket az 5. táblázat mutatja be.
5. Táblázat
| Minta molekula/vizsgálat | Hibridizált radioaktivitás, mint vizsgáló mintával | (b)-vel, | ||
| bi b2 b3 | bi»b2 b | i>b2,b3 | ||
| 0 | 35 33 38 | 45 | 53 | |
| 106 | 38 44 46 f | 95 | 125 | |
| 4-106 | 85 135 142 | 205 | 292 | |
| 1,6-107 | 203 254 265 | 415 | 645 | |
| bi | 310.000 | cpm/vizsgálat | ||
| b2 | 320.000 | cpm/vizsgálat | ||
| b3 | 300.000 | cpm/vizsgálat | ||
| b ι, b 2 | 300.000 | cpm mindegyikre/vi | zsgálat | |
| bi ,b2,b3 | 300.000 | cpm mindegyikre/vi | zsgálat |
Az alsó határérték a vizsgálatban, amelyet pozitívnak tekintünk, 51—55 cpm, amikor a vizsgáló minta b, vagy b2, vagy b3; 59 cpm, amikor a vizsgáló minta b,, b2; és 63 cpm, amikor a vizsgáló minta b,, b2, b3.
Az eredmények az 5. táblázatban azt mutatják, hogy a szendvics-hibridizálás, amelyben egyedi vizsgáló reagenseket alkalmazunk (bj, vagy b2, vagy b3) kimutat minden esetben 4·106 CMV-DNS molekulát. Másrészt a b,, b2 vagy b^ b2, b3 reagenssel végzett hibridizálás kimutat már 10° molekula CMV-DNS-t is. Az eredmények azt mutatják, hogy a nukleinsav-reagensek sorozata négyszer érzékenyebb, mint az egyedi nukleinsav-reagensek. 65 10
c.) CMV diagnosztika szendvics-hibridizálást alkalmazva nukleinsav-reagensek sorozatával
Klinikai mintákat vizsgálunk szendvics55 -hibridizálást alkalmazva reagensek sorozatával. Ezek a minták két vizeletmintát foglalnak magukba 1 év alatti gyermekekből. Ezekről a gyermekekről az a gyanú, hogy velük született cytomegália betegségben szenvednek. A paciensekből vett tüdő-biopsziás mintát tüdő CMV fertőzésre szintén megvizsgáljuk a jelen szendvics-hibridizálási módszerrel. Mind Cytomegalovírussal fertőzött, mind nem fertőzött humán embriósejteket is alkalmaztunk mintaként ebben a vizsgálatban.
-10194938
Egy olyan oldatot, amely 1% szarkozilt, 5 mmól/liter EDTA-t és 200 pg borjú timusz DNS-t tartalmaz, adunk 10 ml vizeletmintához, amely után a vírusból kibocsátott DNS-t a hordozóval együtt kicsapjuk 10 ml izopropanolt alkalmazva szobahőmérsékleten. A kicsapott DNS-t 200 pl TE pufferban feloldjuk és egyszálú formába visszük át 5 percen át forralva, majd a DNS oldatot 0°C hőmérsékletre lehűtjük és hozzáadjuk a hibridizáló oldathoz.
A tüdő-biopsziás mintát (néhány mm3) mechanikai úton aprítjuk késsel, 200 pl TE puffért, amely 1% SDS oldatot és 1 mg/ml K proteináz enzimet is tartalmaz, adunk hozzá. Emésztést hajtunk végre 37°C hőmérsékleten 1 órán át, amely után a mintát injekciós fecskendőbe húzzuk be kétszer egy vékony fecskendőn keresztül. Az így homogenizált mintát felforraljuk, majd hozzáadjuk a vizsgáló oldathoz.
A Cytomegalovírussal fertőzött és nem fertőzött sejteket SDS-K-proteináz kezeléssel feltárjuk, homogenizáljuk és forraljuk, amint ezt fentebb leírtuk.
A hibridizációs vizsgálatban a reagensek a pKTH1273(a,) és pKTH1274(a2) a szűrőkön és mKTH1277(b,), mKTH1278(b2) és mKTH1279(b3), mint vizsgálati minták, mindegyik 200 000 cpm/reakciókeverék jelzéssel. A hibridizálás további teendőit illetően a szűrők mosását és az eredmények számolását -az lb. példában leírtak szerint hajtjuk végre. A jelen hibridizálás eredményeit a 6. táblázatban mutatjuk be.
6. Táblázat
Minta Hibridi- Vírus-izolázált ra- lás dioaktivitás
| Fertőzött sejtek (105) | 3521 | Nem végeztük el |
| 1 . vizelet (10 ml) | 243 | CMV |
| 2. vizelet (10 ml) | 3215 | CMV |
| Vizelet egy egészséges személytől (10 ml) | 52 | Nem végeztük el |
| Tüdő-biopsziás minta | 535 | CMV |
6, Táblázat (folytatás)
| Minta | Hibridizált radioaktivitás | Vírus-izolá- lás |
| Kontroll sej- | ||
| tek (105) | 68 | Nem végeztük el |
| Minta nélkül | 65 | Nem végeztük el |
A 6. táblázatban levő eredmények azt mutatják, hogy lehetséges nukleinsav-reagensek sorozatának alkalmazásával CMV-t kimutatni különböző klinikai mintákban, mint pl. \ izeletben, tiidő-biopszia mintákban és sejtekben.
A vizsgálat fajlagos Cytomegalovírusra; ez nem azonosítja a humán DNS-t, vagyis a vizsgálatot a mintában jelen levő humán DNS nem befolyásolja. Valójában a minta típusa semmiképpen nem befolyásolja a vizsgálat fajlagosságát.
3. példa
a) Nukleinsav-reagensek sorozata Herpes simplex 1. és 2. típusú vírusból, és ezek készítése
Herpes simplex 1. és 2. típusú vírus (HSV1 és HSV2) diagnózisához alkalmas DNS fragmenseket készítünk az American Type Culture Collection-nál rendelkezésre álló vírus DNSekből (ATCC VR-733 és ATCC VR-734).
Herpes simplex vírus 1. típus
HSV1 DNS-t izolálunk és emésztünk Hindin restrikciós enzimmel ismert módszerek szerint, az így létrejövő HindHI fragmenseket pBR322 plazmidba klónozzuk, és a rekombinánsokat Escherichia coli K.12 HB101 gazdaszervezetbe visszük át ismert módszerekkel.
Reagens-előállításhoz egy 8,5 kb-os HindHI fragmenst választunk ki, ezt pKZH 1359-nek nevezzük. A pKTH1359 alkalmasságát közvetlen hibridizálási vizsgálattal vizsgáljuk meg. A pKTH1359 mutat bizonyos keresztreakciót HSV2-vel, de más vizsgált nukleinsavakkal nem.
A szubklónozást ismert technikákkal hajtjuk végre, vektorként a pBR322 és pBR325 plazmidokat és az M13mpl0 és M13mpll fágokat alkalmazva. A 14. ábra mutatja be a pKTH1359 rekombináns píazmidot és az EcoRI, PstI, HindHI és BamHI restrikciós enzimek alkalmazásával kapott fragmenseket, valamint ezek relatív méretét és egymáshoz viszonyított elhelyezkedését. A két PstI fragmens belső sorrendjét nem határozzuk meg.
-11194938
A 7. táblázat sorolja fel a szóban forgó fragmensek méretét, a szubklónozáshoz használt vektorokat, a rekombináns plazmidok nevét és ezek alkalmazását. A 15. ábra mutat22 ja be a nukleinsav-fragmensek sorozatát, amely akkor képződik, amikor a 7. táblázatban felsorolt fragmenseket alkalmazzuk.
7. Táblázat
| Fragmens | Méret | Vektor | Rekombináns plazmid | Alkalmazás | |
| a L | EcoRI-PstI | 1 , Ikb | M13mp10 | mKTH1364 | Szűrő |
| a; | EcoRI-PstI | 1, 1kb | Ml3mp11 | mKTHl365 | Szűrő |
| ^2 | Pstl-BamHI | 1,5kb | M13mp10 | mKTHl3u6 | Szűrő |
| a2 | Pstl-BamHI | 1,5kb | M13mp11 | mKTH1367 | Szűrő |
| bi | HindiII-EcoRI | 1,9kb | pBR325 | ΡΚΊΉ1361 | Jelzett vizsgáló minta |
| b2 | Pstl-PstI | 1,8kb | pBR322 | pKTH1361 | Jelzett vizsgáló minta |
| b3 | HindlII-BamHI | 1,3kb | pBR322 | pKTH1363 | Jelzett |
vizsgáló minta
Herpes simplex vírus 2. típus \ 11SY2 DNS-t izoláljuk és HindlII restrikciós enzimmel emésztjük ismert módszerek szerint, és az így létrejövő HindlII fragmenst pBR322 plazmidba klónozzuk és Escherichia coli K12 HB101 gazdaszervezetbe visszük át. Egy 9,5 kb-s HindlII fragmenst választunk ki, és ezt pKTH1351-nek nevezzük el. A HSV1 klón mutat bizonyos keresztaktivitást HSVl-gyel, de más vizsgált nukleinsavval nem.
A szubklónozást vektorként a pBR322 plazmidot és az M13mpl0 és M13mpll fágokat alkalmazva hajtjuk végre. A 16. ábra mutatja be a pKTH1351 rekombináns plazmidot és a HindlII és PstI restrikciós enzimek alkalmazásával készített restrikciós fragmenseket, valamint ezeknek a fragmenseknek a relatív méreteit és kölcsönös elhelyezkedését.
A 8. táblázat sorolja fel ezeknek a fragmenseknek a méretét, a vektorok nevét, a rekombináns plazmidok nevét, és alkalmazásukat a nukleinsav-fragmensek sorozatában. A 17. ábrában mutatjuk be a nuklein40 sav-fragmensek sorozatát, amely akkor képződik, amikor a 8. táblázatban felsorolt fragmenseket alkalmazzuk.
8, Táblázat
| Fragmens | Méret | Vektor | Rekombináns plazmid | Alkalmazás |
| ai HindlII-PstI | 2,0kb | M13mp 10 | mKTH1355 | Szűrő |
| ai HindlII-PstI | 2,0kb | M13mp11 | mKTH1356 | Szűrő |
| a2 Pstl-HindlII | 1,2kb | M13mp10 | mKTH1357 | Szűrő |
| a2 Pstl-HindlII | 1,2kb | M13mp11 | mKTH1358 | Szűrő |
| bi Pstl-PstI | 5,7kb | pBR322 | ΡΚΤΗ1352 | Jelzett vizsgáló minta |
b.) Herpes simplex vírus 1. típusból kapott nukleinsav-reagensek sorozata érzékenységének bemutatása szendvics-hibridizációs módszerrel
A nukleinsav-reagensek sorozatának érzékenységét az egyedi folyamatos reagenspárokkal összehasonlítva tanulmányozzuk szendvics-hibridizálási módszerrel.
A vizsgálathoz alkalmazott minta a HSV1 DNS, amelyet egyszálúvá teszünk és semlegesítünk, hasonlóan, mint az lb. példában leírt mintánál. A HSVl-hez tartozó vizsgálatot olyan szűrők alkalmazásával hajtjuk végre, amelyek 10 molekulát tartalmaznak mKTH1364, mKTH1365 DNS-ból (a,), és mKTH1366, mKTH1367 DNS-ből (a2), vala-12194938 mint 32P-vel jelzett b,, b2 és b3 vizsgáló mintákból. A jelzett vizsgáló minták 10®—108 cpny /g DNS-t tartalmaznak. A hibridizálást az
l.b. példában leírtak szerint hajtjuk végre Az eredményeket a 9. táblázatban mutatjuk be
9. Táblázat
| Minta Molekula/ vizsgálat | Hibridizált radioaktivitás (b)-veT, mint vizsgáló mintával | |||
| bi | b2 | b3 | bi, b2, b3 | |
| 0 | 13 | 12 | 10 | 27 |
| 106 | 28 | 30 | 26_Γ | 135 |
| 5 · 106 | 62 | 60 | 65 | 430 |
| 109 | 2100 | 2035 | 2210 | 9560 |
| bi | 250000 | cpm/vizsgálat | ||
| b2 | 250000 | cpm/vizsgálat | ||
| b3 | 250000 | cpm/vizsgálat | ||
| bi ,b2,b3 | 750000 | cpm/vizsgálat |
cpm= beütés/perc
A pozitivitás alsó határa 30 cpm, amikor a vizsgáló minta b,, vagy b2, vagy b3, és 60 cpm, amikor a vizsgáló minta bb b2, b3.
Az eredmények azt mutatják, hogy a nukleinsav-reagensek sorozata ötször olyan érzékeny, mint az egyedi nukleinsavak.
c.) Herpes simplex diagnosztikumok nukleinsav-reagensek sorozatával végzett szendvics-hibridizálást alkalmazva Az érzékenységi vizsgálatokon kívül a
HSVl-hez és HSV2-höz tartozó nukleinsav-reagensek sorozatának fajlagosságát is megvizsgáljuk, egy vizsgálatban egyesítve a két szűrőt — amelyek egyike HSVl-re, másika HSV2-re fajlagos — a jelzett vizsgáló mintákkal együtt.
A 10. táblázat mutatja be a HSV tipizáló készlet ‘fajlagosságát.
10. Táblázat
10. Táblázat (folytatás)
| Minta | Szűrő (cpm) | |
| HSV1 | HSV2 Vak | |
| 1. minta | 5903 | 726 |
| Klinikai | ||
| 2. minta | 344 | 2638 |
| Minta | HSV1 | Szűrő (cpm) 1ISV2 | Vak |
| HSV1 DNS 107 molekula | 569 | 98 | 27 |
| 10s molekula | 3621 | 503 | |
| HSV2 DNS 107 molekula | 78 | 353 | 31 |
| 108 molekula | 356 | 1741 | |
| ΡΚΤΗ1359 108 molekula | 3313 | 59 | |
| pKTH1351 109 molekula | 130 | 13510 | |
| Klinikai |
A 10. táblázat eredményei azt mutatják, 40 hogy a HSV1 és HSV2 tipizálását egyértelműen el lehet végezni a klinikai mintákból.
4. példa
a.) Nukleinsav-reagensek sorozata humán 11. papillomavírusból és ezek készítése pBR322 plazmidban, a BamHI helyben klónozott, 7,9 kb-s humán 11. papillómavírus (HPV11) DNS-t emésztünk BamHI és PstI restrikciós enzimekkel, és a frakciókat elkülönítjük és izoláljuk ismert módszerekkel. A kiónt a Germán Cancer Research Center-tői (Német Rákkutató Központ), Heidelbergből, di. Gissman Lutz-tól kapjuk.
A 18. ábra mutatja be az előállított fragmensek relatív méretét és kölcsönös elhelyezkedését.
A szubklónozást ismert technikákkal hajtjuk végre, vektorként pBR322 plazmidot vagy M13mpl0 és M13mpll fágokat alkalmazva. All. táblázat felsorolja a szóban forgó fragmensek méretét, a szubklónozáshoz alkalmazott vektorokat, a rekombináns plazmidok nevét és ezek felhasználását.
A 19. ábra mutatja be a nukleinsav-reagensek sorozatát, amely akkor alakul ki, amikor a 11. táblázatban felsorolt fragmenseket alk; Imazzunk.
-13194938
11. Táblázat
| Fragmens | Méret | Vektor | Rekombináns plazmid | Felhasználás |
| ax BamHI-Pstl | 1,4kb | M13mp10 | mKTH1285 | Szűrő |
| bi BamHI-Pstl | 1, 4kb | M13mp11 | mKTH1286 | Szűrő |
| a2 Pstl-PstI | 0,8kb | M13mp1C | mKTH1291 | Szűrő |
| a2 Pstl-PstI | 0,8kb | M13mp1C | mKTH1292 | Szűrő |
| aa Pstl-PstI | 0,9kb | M13mp1C | mKTI-11288 | Szűrő |
| a3 Pstl-PstI | 0,9kb | M13mp1C | mKTH1289 | Szűrő |
| bi Pstl-PstI | 1,7kb | pBR322 | pKTH1281 | Jelzett vizsgáló minta |
| b2 Pstl-PstI | 1,5kb | pBR322 | PKTH1284 | Jelzett vizsgáló minta |
b.) Nukleinsav-reagensek sorozata érzékenységének bemutatása humán 11. papillómavírushoz, szendvics-hibridizálási módszert alkalmazva
A nukleinsav-fragmensek sorozatának ér- 25 zékenységét úgy vizsgáljuk meg, amint ezt az lb. példában leírtuk, olyan szűrőket alkalmazva, amelyek mindegyike 1011 molekula mKTH1285, mKTH1286 (a,) DNS-t, és mKTH 1291, mKTH1292 (a2) DNS-t, valamint mKTH 1288, mKTH1289 (a3) DNS-t tartalmaz. A tanulmányozandó minta a HPV11 genomja, és a 11. táblázatban felsorolt, 32P-vel jelzett vizsgáló mintákat alkalmazzuk 108 cpm/g fajlagos aktivitással. 2g
Az eredményeket a 12. táblázatban mutatjuk be. Az eredmények szerint a nukleinsav-reagensek sorozata mintegy 3—4-szer olyan érzékeny, mint az egyedi folyamatos reagenspár. 40
12, Táblázat
| Minta molekula/ vizsgálat | Hibridízált radioaktivitás (b)-vel, mint vizsgáló mintával | ||
| bi | b2 | bi, b2 | |
| 0 | 31 | 35 | 72 |
| 5 · 105 | 42 | 50 | | 30Ϊ |
| 106 | 65 | 72 | 482 |
| 5 · 106 | 351 | 365 | 1818 |
| 107 | 735 | 783 | 4025 |
bi 350000 cpm/vizsgálat b2 350000 cpm/vizsgálat bi, b2 700000 cpm/vizsgálat
A pozitivítás alsó határa 60 cpm, amikor a vizsgáló minta b,, vagy b2, és 150 cpm, amikor b,, b2.
c.) Humán 11. papillómavírus diagnosztikája nukleinsav-reagensek sorozatával, szendvics-hibridizálást alkalmazva
A HPV11 reagensek fajlagosságát vizsgáljuk meg 6., 11., 16., és 18. HPV típusok rekombináns DNS-eit használva mintaként. 16. és 18. HPV-vel nem látható keresztreakció a vizsgált koncentrációtartományban. 107 6. HPV DNS molekula a háttérnél több, mint kétszeres hibridizálási jelet mutat (kimutathatósági határ), ezért pozitívnak tekintjük. A humán embrió fibroblaszttal (HEF), mint mintával kapott eredmények a vizsgálati háttérrel hasonlíthatók össze (13. táblázat).
A klinikai tanulmányokhoz vélt HPV fertőzés miatt nyomon követett csoporthoz tartozó nőktől veszünk mintákat.
Méhnyaki kenetet veszünk egymás utáni lekaparással két műanyag spatulával, és a sejteket foszfáttal pufferolt, gentamicint tartalmazó fiziológiás sóoldatban (PBS) szuszpendáljuk. A sejteket kétszer mossuk PBS-ben végül 0,2 ml TE pufferban szuszpendáljuk (10 mmól/1 trisz-HCl, pH 7,5; 1 mmól/1 EDTA).
Klinikai mintákat szuszpendálunk 1% SDS-t és 0,2 mól/1 NaOH-t tartalmazó oldatban, mechanikusan nyírjuk, 5 percen át forraljuk, és semlegesítjük ekvimoláris menynyiségű ecetsavval, és hozzáadjuk a sorozat-keverékhez. A hibridizálási vizsgálatban alkalmazott reagensek azok, amelyeket a 11. táblázatban felsoroltunk. Egyébként a hibridizálási vizsgálatokat úgy hajtjuk végre, amint ezt az lb. példában leírtuk.
A 13. táblázat 6 mintából kapott eredményeket mutat be, amelyeket 11. HPV-re vizsgáltunk. Ezen kívül minden vizsgálatban lizált humán embrió fibroblaszt (HEF) 10 mintájának sorozata is benne van. Ezek egyike sem pozitív.
öt minta pozitív a találmány szerinti nukleinsav-reagensek sorozatával. A pont folt (dót biot) hibridizálási vizsgálat, amelyet referencia-módszerként alkalmazunk, ezek közül csak hármat mutat ki.
-14194938
13, Táblázat
| Kísérlet száma | Beteg száma | Hibridizált radioaktivi- tás | HPV mennyisége | Folt-vizsgálat HPV11 |
| 2 | 1 | 10676 | >107 | + |
| 2 | 2 | 7700 | >107 | + |
| 2 | 3 | 3590 | >107 | + |
| 2 | 4 | 234 | 1,5-105 | - |
| 2 | 5 | 228 | 1,5 Ί05 | - |
| 1 | 6 | 43 | <105 | — |
A pozitivítás határa a háttér kétszerese 79 cpm (1. kísérlet, vagy 144 cpm (2. kísérlet). A lizált HEF sejtek (10 vizsgálat átlaga) 39 cpm-et (1. kísérlet) vagy 100 cpm-et (2. kísérlet) mutatnak. A tanulmány azt demonstrálja, hogy a nukleinsav-reagensek sorozata 1—3-10° kimutathatósági határnál megbízható diagnosztikai módszert képvisel HPV 11-hez.
5. példa
a.) Nukleinsav-reagensek sorozata humán
16. típusú papillómavírusból, és ennek előállítása
A BamHl helynél pBR322 plazmidban klónozott, 7,9 kb-s humán 16. papillómavírus (HPV16) DNS-t emésztjük Pstl restrikciós enzimmel, és a frakciókat elkülönítjük és izoláljuk ismert módszerekkel. A kiónt a Germán Cancer Research Centertől (Német
Rákkutató Központ) kapjuk, Heidelbergből, dr. Gissman Lutz-tól.
A 20. ábra mutatja be a fragmensek relatív méretét és kölcsönös elhelyezkedését.
A szubklónozást ismert technikákkal hajt25 juk végre, vektorként pBR322 plazmidot és
M13mpl0 fágot alkalmazva.
A 14. táblázat felsorolja a szóban forgó fragmensek méretét, a szubklónozáshoz alkalmazott vektorokat, a rekombináns plazmi30 dók nevét, és ezek alkalmazását.
A 21. ábra a szendvics-hibrid reagensek sorozatát mutatja be, amely akkor keletkezik, amikor a 14. táblázatban felsorolt fragmenseket alkalmazzuk.
14. Táblázat
| Fragmens | Méret | Vektor | Rekombináns plazmid | Alkalmazás |
| ax Pstl-PstI | 1,7kb | M13mp10 | mKTHl378 | Szűrő |
| &2 Pstl-PstI | 1,7kb | M13mp10 | mKTH1379 | Szűrő |
| a2 Pstl-PstI | 1, 1kb | M13mp10 | mKTI11380 | Szűrő |
| a2_ Pstl-PstI | 1,1 kb | M13mp 10 | mKTH1381 | Szűrő |
| bi BamHI-PstI | 0,6kb | pBR322 | pKT-11375 | Vizsgáló minta |
| b2 Pstl-PstI | 2,7kb | pBR322 | pKTH1371 | Vizsgáló minta |
| b3 Pstl-PstI | 0,5kb | pBR322 | pKTH1376 | Vizsgáló minta |
b.) Nukleinsav-reagensek sorozata érzékenységének bemutatása humán 16. típusú papillómavírushoz, szendvics-hibridizálási módszert alkalmazva
A nukleinsav-fragmensek sorozatának érzékenységét úgy vizsgáljuk meg, amint ezt az lb'. példában leírtuk, olyan szűrőket alkalmazva, amelyek 10 mKTH1378, mKTH1379 molekula DNS-t (a,) és mKTH1380, mKTH 1381 molekula DNS-t (a?) tartalmaznak θθ A minta 16. HPV genomja, és a 14. táblázatban felsorolt jelzett vizsgálómintákat alkalmasunk.
A 15. táblázatban bemutatott eredmények azt jelzik, hogy a HPV16-hoz készített nukleinsav-reagensek sorozata ötször olyan érzé65 kény, mint egy egyedi reagenspár.
-15194938
30
15. Táblázat
| Minta | Hibridizált | radioaktivitás (b)-vel | , mint | |
| molekula/ | vizsgáló | mintával | ||
| vizsgálat | bi | b2 | b3 bi, | b2, b3 |
| 0 | 25 | 27 | 32 | 56 |
| 5Ί05 | 35 | 38 | 42 | 332 |
| 107 | 632 | 655 | 683 3952 | |
| bi | 250000 | cpm/vizsgálat | ||
| b2 | 250000 | cpm/vizsgálat | ||
| b3 | 250000 | cpm/vizsgálat | ||
| bi, b2, b3 | 750000 | cpm/vizsgálat |
A kimutatási határ 60 cpm b,-nél, b2-nél és b3-nál, míg 120 cpm b,, b2, b3-nál.
Claims (8)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás Chlamydia mikroorganizmusok nukleinsavainak azonosítására szendvics-hibridizálási technikával, azzal jellemezve, hogy Chlamydia eredetű nukleinsav-fragmensek legalább két váltakozó sorozatának két szériáját, ahol ezeknek a szériáknak egyike megfelelő jelzéssel van ellátva és a másika szilárd hordozóhoz van rögzítve, összehozzuk az azonosítandó nukleinsav-mintával és az így keletkezett szendvics-hibridek sorozatát kimutatjuk.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pKTH1220 rekombináns plazmidból (DSM2825) származó nukleinsav-fragmensek legalább két váltakozó sorozatának két szériáját alkalmazzuk.
- 3. Eljárás Cytomegalovírusok nukleinsavainak azonosítására szendvics-hibridizálási technikával, azzal jellemezve, hogy Cytomegalovírus eredetű nukleinsav-fragmensek legalább két váltakozó sorozatának két szériáját, ahol ezeknek a szériáknak egyike megfelelő jelzéssel van ellátva, és a másik szilárd hordozóhoz ván rögzítve, összehozzuk az azonosítandó nukleinsavmintával és az így keletkezett szendvics-hibridek sorozatát kimutatjuk.
- 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pKTH1271 rekombináns plazmidból (DSM2826) származó nukleinsav-fragmensek legalább két váltakozó sorozatának két szériáját alkalmazzuk.
- 5. Eljárás Herpes simplex vírus 1. vagy2. típus DNS fokozott érzékenységű kimuta25 tására szendvics-hibridizálási technikával, azzal jellemezve, hogy Herpés simplex 1. vagy2. típus eredetű nukleinsav-fragmensek legalább két váltakozó sorozatának két szériáját, ahol ezeknek a szériáknak egyike megfelelő jelzéssel van ellátva és a másika szilárd hordozóhoz van rögzítve, összehozzuk az azonosítandó nukleinsavmintával és az így keletkezett szendvics-hibridek sorozatát kimutatjuk.
- 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás Herpes 35 simplex vírus 1. típus DNS kimutatására, azzal jellemezve, hogy pKTH 1359 rekombináns plazmidból származó fragmensek két vagy három változó sorozatát alkalmazzuk.
- 7. Az 5. igénypont szerinti eljárás Herpes 40 simplex vírus 2. típus DNS kimutatására, azzal jellemezve, hogy pKTH1351 rekombináns plazmidból származó fragmensek két vagy három változó sorozatát alkalmazzuk.
- 8. Eljárás humán 11. és 16. papillómaví45 rus DNS fokozott érzékenységű kimutatására, szendvics-hibridizálási technikával, azzal jellemezve, hogy humán 11. vagy 16. típusú papillómavírus nukleinsav-fragmensek legalább két váltakozó sorozatának két szériáját, ahol ezeknek a szériáknak egyike megfelelő jelzéssel van ellátva és másika szilárd hordozóhoz van rögzítve, összehozzuk az azonosítandó nukleinsav mintával és az így keletkezett szendvics-hibridek sorozatát kimu55 tatjuk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI840655A FI71768C (fi) | 1984-02-17 | 1984-02-17 | Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT37459A HUT37459A (en) | 1985-12-28 |
| HU194938B true HU194938B (en) | 1988-03-28 |
Family
ID=8518568
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU85570A HU194938B (en) | 1984-02-17 | 1985-02-15 | Process for preparing improved nucleinic acid reagents |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4731325A (hu) |
| JP (1) | JPS60188100A (hu) |
| AT (1) | AT394578B (hu) |
| AU (1) | AU577568B2 (hu) |
| BE (1) | BE901671A (hu) |
| CA (1) | CA1248895A (hu) |
| CH (1) | CH671778A5 (hu) |
| DE (1) | DE3505287C2 (hu) |
| DK (1) | DK174675B1 (hu) |
| FI (1) | FI71768C (hu) |
| FR (1) | FR2559783B1 (hu) |
| GB (1) | GB2156074B (hu) |
| HU (1) | HU194938B (hu) |
| IE (1) | IE57652B1 (hu) |
| IT (1) | IT1183184B (hu) |
| LU (1) | LU85768A1 (hu) |
| NL (1) | NL193663C (hu) |
| NO (1) | NO166543C (hu) |
| RO (1) | RO92633B (hu) |
| SE (1) | SE463103B (hu) |
| SU (1) | SU1523053A3 (hu) |
| ZA (1) | ZA85511B (hu) |
Families Citing this family (151)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1260372A (en) * | 1984-04-27 | 1989-09-26 | Elazar Rabbani | Hybridization method for the detection of genetic materials |
| US4725536A (en) * | 1985-09-19 | 1988-02-16 | Genetics Institute, Inc. | Reagent polynucleotide complex with multiple target binding regions, and kit and methods |
| US4876187A (en) * | 1985-12-05 | 1989-10-24 | Meiogenics, Inc. | Nucleic acid compositions with scissile linkage useful for detecting nucleic acid sequences |
| US4868105A (en) * | 1985-12-11 | 1989-09-19 | Chiron Corporation | Solution phase nucleic acid sandwich assay |
| US4910300A (en) * | 1985-12-11 | 1990-03-20 | Chiron Corporation | Method for making nucleic acid probes |
| US4882269A (en) * | 1985-12-13 | 1989-11-21 | Princeton University | Amplified hybridization assay |
| FI76119C (fi) * | 1986-02-27 | 1988-09-09 | Orion Yhtymae Oy | Kvantitativ bestaemning av nukleinsyramolekyler och reagensfoerpackning som anvaends vid foerfarandet. |
| US4925785A (en) * | 1986-03-07 | 1990-05-15 | Biotechnica Diagnostics, Inc. | Nucleic acid hybridization assays |
| US5281518A (en) * | 1986-05-01 | 1994-01-25 | Washington Research Foundation | Detection of a unique chlamydia strain associated with acute respiratory disease |
| CA1341065C (en) * | 1986-05-01 | 2000-08-01 | J. Thomas Grayston | Detection of a unique chlamydia strain associated with acute respiratory disease |
| US6270961B1 (en) * | 1987-04-01 | 2001-08-07 | Hyseq, Inc. | Methods and apparatus for DNA sequencing and DNA identification |
| US5202231A (en) * | 1987-04-01 | 1993-04-13 | Drmanac Radoje T | Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes |
| US5359100A (en) * | 1987-10-15 | 1994-10-25 | Chiron Corporation | Bifunctional blocked phosphoramidites useful in making nucleic acid mutimers |
| CA1339351C (en) * | 1987-10-15 | 1997-08-26 | Michael S. Urdea | Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same |
| US5124246A (en) * | 1987-10-15 | 1992-06-23 | Chiron Corporation | Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same |
| CA1323293C (en) * | 1987-12-11 | 1993-10-19 | Keith C. Backman | Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization |
| GB8810400D0 (en) * | 1988-05-03 | 1988-06-08 | Southern E | Analysing polynucleotide sequences |
| US6054270A (en) * | 1988-05-03 | 2000-04-25 | Oxford Gene Technology Limited | Analying polynucleotide sequences |
| US5700637A (en) * | 1988-05-03 | 1997-12-23 | Isis Innovation Limited | Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays |
| US7811751B2 (en) * | 1988-05-03 | 2010-10-12 | Oxford Gene Technology Limited | Analysing polynucleotide sequences |
| EP0379559B1 (en) * | 1988-06-24 | 1996-10-23 | Amgen Inc. | Method and reagents for detecting nucleic acid sequences |
| US5185243A (en) * | 1988-08-25 | 1993-02-09 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Method for detection of specific nucleic acid sequences |
| JPH0638758B2 (ja) * | 1989-02-03 | 1994-05-25 | イーストマン コダック カンパニー | 核酸試験片及び所定の核酸を検出するためのその使用 |
| US6346413B1 (en) | 1989-06-07 | 2002-02-12 | Affymetrix, Inc. | Polymer arrays |
| US5143854A (en) | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
| US6955915B2 (en) * | 1989-06-07 | 2005-10-18 | Affymetrix, Inc. | Apparatus comprising polymers |
| US5925525A (en) * | 1989-06-07 | 1999-07-20 | Affymetrix, Inc. | Method of identifying nucleotide differences |
| US6040138A (en) * | 1995-09-15 | 2000-03-21 | Affymetrix, Inc. | Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays |
| US6919211B1 (en) | 1989-06-07 | 2005-07-19 | Affymetrix, Inc. | Polypeptide arrays |
| US5800992A (en) | 1989-06-07 | 1998-09-01 | Fodor; Stephen P.A. | Method of detecting nucleic acids |
| US5424186A (en) | 1989-06-07 | 1995-06-13 | Affymax Technologies N.V. | Very large scale immobilized polymer synthesis |
| US6309822B1 (en) | 1989-06-07 | 2001-10-30 | Affymetrix, Inc. | Method for comparing copy number of nucleic acid sequences |
| US6406844B1 (en) | 1989-06-07 | 2002-06-18 | Affymetrix, Inc. | Very large scale immobilized polymer synthesis |
| US6379895B1 (en) | 1989-06-07 | 2002-04-30 | Affymetrix, Inc. | Photolithographic and other means for manufacturing arrays |
| US5744101A (en) | 1989-06-07 | 1998-04-28 | Affymax Technologies N.V. | Photolabile nucleoside protecting groups |
| US6551784B2 (en) | 1989-06-07 | 2003-04-22 | Affymetrix Inc | Method of comparing nucleic acid sequences |
| US5232829A (en) * | 1989-09-29 | 1993-08-03 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes |
| US6506558B1 (en) | 1990-03-07 | 2003-01-14 | Affymetrix Inc. | Very large scale immobilized polymer synthesis |
| CA2039517C (en) * | 1990-04-03 | 2006-11-07 | David Segev | Dna probe signal amplification |
| US5071962A (en) * | 1990-05-31 | 1991-12-10 | The United State Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Nucleotide, deduced amino acid sequence, isolation and purification of heat-shock chlamydial proteins |
| DE69112309T2 (de) * | 1990-06-28 | 1996-01-25 | Wakunaga Seiyaku Kk | Verfahren zum Nukleinsäurenachweis. |
| US5645994A (en) * | 1990-07-05 | 1997-07-08 | University Of Utah Research Foundation | Method and compositions for identification of species in a sample using type II topoisomerase sequences |
| GB9020621D0 (en) * | 1990-09-21 | 1990-10-31 | Imp Cancer Res Tech | Identification of organisms |
| GB2262987A (en) * | 1990-09-21 | 1993-07-07 | Imp Cancer Res Tech | Identification of organisms |
| EP0834576B1 (en) | 1990-12-06 | 2002-01-16 | Affymetrix, Inc. (a Delaware Corporation) | Detection of nucleic acid sequences |
| US5437976A (en) * | 1991-08-08 | 1995-08-01 | Arizona Board Of Regents, The University Of Arizona | Multi-domain DNA ligands bound to a solid matrix for protein and nucleic acid affinity chromatography and processing of solid-phase DNA |
| US5632957A (en) * | 1993-11-01 | 1997-05-27 | Nanogen | Molecular biological diagnostic systems including electrodes |
| US6569382B1 (en) * | 1991-11-07 | 2003-05-27 | Nanogen, Inc. | Methods apparatus for the electronic, homogeneous assembly and fabrication of devices |
| US6017696A (en) | 1993-11-01 | 2000-01-25 | Nanogen, Inc. | Methods for electronic stringency control for molecular biological analysis and diagnostics |
| US6051380A (en) * | 1993-11-01 | 2000-04-18 | Nanogen, Inc. | Methods and procedures for molecular biological analysis and diagnostics |
| US6652808B1 (en) * | 1991-11-07 | 2003-11-25 | Nanotronics, Inc. | Methods for the electronic assembly and fabrication of devices |
| US5849486A (en) * | 1993-11-01 | 1998-12-15 | Nanogen, Inc. | Methods for hybridization analysis utilizing electrically controlled hybridization |
| US5605662A (en) * | 1993-11-01 | 1997-02-25 | Nanogen, Inc. | Active programmable electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics |
| US6048690A (en) * | 1991-11-07 | 2000-04-11 | Nanogen, Inc. | Methods for electronic fluorescent perturbation for analysis and electronic perturbation catalysis for synthesis |
| US5556961A (en) * | 1991-11-15 | 1996-09-17 | Foote; Robert S. | Nucleosides with 5'-O-photolabile protecting groups |
| DE69233331T3 (de) | 1991-11-22 | 2007-08-30 | Affymetrix, Inc., Santa Clara | Kombinatorische Strategien zur Polymersynthese |
| US6943034B1 (en) | 1991-11-22 | 2005-09-13 | Affymetrix, Inc. | Combinatorial strategies for polymer synthesis |
| US6468740B1 (en) | 1992-11-05 | 2002-10-22 | Affymetrix, Inc. | Cyclic and substituted immobilized molecular synthesis |
| US6864101B1 (en) | 1991-11-22 | 2005-03-08 | Affymetrix, Inc. | Combinatorial strategies for polymer synthesis |
| WO1993013227A1 (en) * | 1991-12-23 | 1993-07-08 | Chiron Corporation | Cmv probes for use in solution phase sandwich hybridization assays |
| JPH07502414A (ja) * | 1991-12-23 | 1995-03-16 | バイエル コーポレイション | 溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイに用いるためのクラミジアプローブ |
| US5583211A (en) * | 1992-10-29 | 1996-12-10 | Beckman Instruments, Inc. | Surface activated organic polymers useful for location - specific attachment of nucleic acids, peptides, proteins and oligosaccharides |
| US7713528B1 (en) | 1993-02-18 | 2010-05-11 | Enzo Therapeutics, Inc. | Method for in vivo delivery of active compounds using reagent conjugate |
| EP0787183A4 (en) | 1993-07-23 | 1998-05-27 | Hyseq Inc | METHOD FOR DETECTION OF UNKNOWN ORGANISMS |
| FR2710075B1 (fr) * | 1993-09-15 | 1995-10-27 | Bio Merieux | Réactif et procédé pour la détection d'une séquence nucléotidique avec amplification de signal. |
| US20040077074A1 (en) * | 1993-11-01 | 2004-04-22 | Nanogen, Inc. | Multi-chambered analysis device |
| US6375899B1 (en) | 1993-11-01 | 2002-04-23 | Nanogen, Inc. | Electrophoretic buss for transport of charged materials in a multi-chamber system |
| US6331274B1 (en) | 1993-11-01 | 2001-12-18 | Nanogen, Inc. | Advanced active circuits and devices for molecular biological analysis and diagnostics |
| US7314708B1 (en) | 1998-08-04 | 2008-01-01 | Nanogen, Inc. | Method and apparatus for electronic synthesis of molecular structures |
| US6315953B1 (en) | 1993-11-01 | 2001-11-13 | Nanogen, Inc. | Devices for molecular biological analysis and diagnostics including waveguides |
| US6319472B1 (en) | 1993-11-01 | 2001-11-20 | Nanogen, Inc. | System including functionally separated regions in electrophoretic system |
| US6309602B1 (en) | 1993-11-01 | 2001-10-30 | Nanogen, Inc. | Stacked, reconfigurable system for electrophoretic transport of charged materials |
| US6225059B1 (en) | 1993-11-01 | 2001-05-01 | Nanogen, Inc. | Advanced active electronic devices including collection electrodes for molecular biological analysis and diagnostics |
| US7582421B2 (en) * | 1993-11-01 | 2009-09-01 | Nanogen, Inc. | Methods for determination of single nucleic acid polymorphisms using a bioelectronic microchip |
| US7172864B1 (en) | 1993-11-01 | 2007-02-06 | Nanogen | Methods for electronically-controlled enzymatic reactions |
| US7101661B1 (en) | 1993-11-01 | 2006-09-05 | Nanogen, Inc. | Apparatus for active programmable matrix devices |
| US6068818A (en) | 1993-11-01 | 2000-05-30 | Nanogen, Inc. | Multicomponent devices for molecular biological analysis and diagnostics |
| US6254827B1 (en) | 1993-11-01 | 2001-07-03 | Nanogen, Inc. | Methods for fabricating multi-component devices for molecular biological analysis and diagnostics |
| US6726880B1 (en) | 1993-11-01 | 2004-04-27 | Nanogen, Inc. | Electronic device for performing active biological operations and method of using same |
| US6638482B1 (en) | 1993-11-01 | 2003-10-28 | Nanogen, Inc. | Reconfigurable detection and analysis apparatus and method |
| US6287517B1 (en) | 1993-11-01 | 2001-09-11 | Nanogen, Inc. | Laminated assembly for active bioelectronic devices |
| US6287850B1 (en) * | 1995-06-07 | 2001-09-11 | Affymetrix, Inc. | Bioarray chip reaction apparatus and its manufacture |
| EP0695941B1 (en) * | 1994-06-08 | 2002-07-31 | Affymetrix, Inc. | Method and apparatus for packaging a chip |
| US5807522A (en) * | 1994-06-17 | 1998-09-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for fabricating microarrays of biological samples |
| US7378236B1 (en) | 1994-06-17 | 2008-05-27 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Method for analyzing gene expression patterns |
| US7323298B1 (en) * | 1994-06-17 | 2008-01-29 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Microarray for determining the relative abundances of polynuceotide sequences |
| US6306657B1 (en) * | 1994-06-28 | 2001-10-23 | Kalyx Biosciences, Inc. | Polynucleotide probe and kit for amplifying signal detection in hybridization assays |
| US6403367B1 (en) | 1994-07-07 | 2002-06-11 | Nanogen, Inc. | Integrated portable biological detection system |
| US7857957B2 (en) * | 1994-07-07 | 2010-12-28 | Gamida For Life B.V. | Integrated portable biological detection system |
| US6121048A (en) * | 1994-10-18 | 2000-09-19 | Zaffaroni; Alejandro C. | Method of conducting a plurality of reactions |
| US8236493B2 (en) * | 1994-10-21 | 2012-08-07 | Affymetrix, Inc. | Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA |
| US6720149B1 (en) * | 1995-06-07 | 2004-04-13 | Affymetrix, Inc. | Methods for concurrently processing multiple biological chip assays |
| US20040086917A1 (en) * | 1995-09-27 | 2004-05-06 | Nanogen, Inc. | Methods for electronic fluorescent perturbation for analysis and electronic perturbation catalysis for synthesis |
| EP0880598A4 (en) * | 1996-01-23 | 2005-02-23 | Affymetrix Inc | RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM |
| US6706473B1 (en) | 1996-12-06 | 2004-03-16 | Nanogen, Inc. | Systems and devices for photoelectrophoretic transport and hybridization of oligonucleotides |
| US6297006B1 (en) | 1997-01-16 | 2001-10-02 | Hyseq, Inc. | Methods for sequencing repetitive sequences and for determining the order of sequence subfragments |
| US6309824B1 (en) | 1997-01-16 | 2001-10-30 | Hyseq, Inc. | Methods for analyzing a target nucleic acid using immobilized heterogeneous mixtures of oligonucleotide probes |
| US20020042048A1 (en) | 1997-01-16 | 2002-04-11 | Radoje Drmanac | Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species |
| US6326489B1 (en) | 1997-08-05 | 2001-12-04 | Howard Hughes Medical Institute | Surface-bound, bimolecular, double-stranded DNA arrays |
| DE19741715A1 (de) | 1997-09-22 | 1999-03-25 | Hoechst Ag | Pentopyranosyl-Nucleosid, seine Herstellung und Verwendung |
| US6485944B1 (en) | 1997-10-10 | 2002-11-26 | President And Fellows Of Harvard College | Replica amplification of nucleic acid arrays |
| US6511803B1 (en) * | 1997-10-10 | 2003-01-28 | President And Fellows Of Harvard College | Replica amplification of nucleic acid arrays |
| AU737174B2 (en) | 1997-10-10 | 2001-08-09 | President & Fellows Of Harvard College | Replica amplification of nucleic acid arrays |
| US6548021B1 (en) | 1997-10-10 | 2003-04-15 | President And Fellows Of Harvard College | Surface-bound, double-stranded DNA protein arrays |
| AU746061B2 (en) * | 1997-12-12 | 2002-04-11 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Assessment of human papilloma virus-related disease |
| US6355419B1 (en) | 1998-04-27 | 2002-03-12 | Hyseq, Inc. | Preparation of pools of nucleic acids based on representation in a sample |
| US6232067B1 (en) * | 1998-08-17 | 2001-05-15 | The Perkin-Elmer Corporation | Adapter directed expression analysis |
| US6545264B1 (en) | 1998-10-30 | 2003-04-08 | Affymetrix, Inc. | Systems and methods for high performance scanning |
| US7510841B2 (en) | 1998-12-28 | 2009-03-31 | Illumina, Inc. | Methods of making and using composite arrays for the detection of a plurality of target analytes |
| AU4025300A (en) * | 1999-03-24 | 2000-10-09 | Packard Bioscience Company | Continuous porous matrix arrays |
| EP1088101A4 (en) * | 1999-03-30 | 2004-10-20 | Nanogen Inc | UNIQUE NUCLEOTIDE POLYMORPHIC DISCRIMINATION BY ELECTRONIC DOT BLOT TEST ON SEMICONDUCTOR MICROCHIPS |
| JP2003524772A (ja) | 1999-04-27 | 2003-08-19 | シファーゲン バイオシステムズ， インコーポレイテッド | 気相イオン分析計のためのプローブ |
| EP1054259A1 (en) * | 1999-05-19 | 2000-11-22 | Remacle, José | Method for the identification of a target compound |
| US20030096321A1 (en) * | 1999-05-19 | 2003-05-22 | Jose Remacle | Method for the identification and/or the quantification of a target compound obtained from a biological sample upon chips |
| US6465183B2 (en) * | 1999-07-01 | 2002-10-15 | Agilent Technologies, Inc. | Multidentate arrays |
| JP2001017166A (ja) * | 1999-07-02 | 2001-01-23 | Fuji Photo Film Co Ltd | Ｄｎａチップ、ｄｎａチップの検定キットおよびｄｎａチップの検定法 |
| US6428957B1 (en) * | 1999-11-08 | 2002-08-06 | Agilent Technologies, Inc. | Systems tools and methods of assaying biological materials using spatially-addressable arrays |
| US6235483B1 (en) | 2000-01-31 | 2001-05-22 | Agilent Technologies, Inc. | Methods and kits for indirect labeling of nucleic acids |
| US7955794B2 (en) | 2000-09-21 | 2011-06-07 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
| US7582420B2 (en) | 2001-07-12 | 2009-09-01 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
| US8076063B2 (en) | 2000-02-07 | 2011-12-13 | Illumina, Inc. | Multiplexed methylation detection methods |
| US6455007B1 (en) * | 2000-06-13 | 2002-09-24 | Symyx Technologies, Inc. | Apparatus and method for testing compositions in contact with a porous medium |
| US7439016B1 (en) | 2000-06-15 | 2008-10-21 | Digene Corporation | Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method |
| US7601497B2 (en) | 2000-06-15 | 2009-10-13 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method |
| US6905816B2 (en) | 2000-11-27 | 2005-06-14 | Intelligent Medical Devices, Inc. | Clinically intelligent diagnostic devices and methods |
| CA2440656A1 (en) * | 2001-03-09 | 2002-09-19 | Apollo Biotechnology, Inc. | Conjugate probes and optical detection of analytes |
| EP2246438B1 (en) | 2001-07-12 | 2019-11-27 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
| US6893822B2 (en) | 2001-07-19 | 2005-05-17 | Nanogen Recognomics Gmbh | Enzymatic modification of a nucleic acid-synthetic binding unit conjugate |
| US7601493B2 (en) * | 2002-07-26 | 2009-10-13 | Nanogen, Inc. | Methods and apparatus for screening and detecting multiple genetic mutations |
| US20040241659A1 (en) * | 2003-05-30 | 2004-12-02 | Applera Corporation | Apparatus and method for hybridization and SPR detection |
| US7622281B2 (en) | 2004-05-20 | 2009-11-24 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and compositions for clonal amplification of nucleic acid |
| US7828954B2 (en) * | 2004-09-21 | 2010-11-09 | Gamida For Life B.V. | Electrode based patterning of thin film self-assembled nanoparticles |
| US7314542B2 (en) * | 2004-09-23 | 2008-01-01 | Nanogen, Inc. | Methods and materials for optimization of electronic transportation and hybridization reactions |
| US20060246576A1 (en) | 2005-04-06 | 2006-11-02 | Affymetrix, Inc. | Fluidic system and method for processing biological microarrays in personal instrumentation |
| JP5187847B2 (ja) | 2005-05-06 | 2013-04-24 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | 核酸標的の捕獲方法 |
| WO2007070553A2 (en) * | 2005-12-12 | 2007-06-21 | The Johns Hopkins University | Double-tiled and multi-tiled arrays and methods thereof |
| EP1971690B1 (en) | 2005-12-28 | 2018-10-17 | Translational Therapeutics, Inc. | Translational dysfunction based therapeutics |
| US20080003667A1 (en) * | 2006-05-19 | 2008-01-03 | Affymetrix, Inc. | Consumable elements for use with fluid processing and detection systems |
| NZ576149A (en) | 2006-09-29 | 2012-06-29 | Translational Therapeutics Inc | Eif4e regulon-based diagnostics |
| EP1912067A1 (en) * | 2006-10-12 | 2008-04-16 | Eppendorf Array Technologies S.A. | Method for quantification of a target compound obtained from a biological sample upon chips |
| US9938641B2 (en) * | 2006-12-18 | 2018-04-10 | Fluidigm Corporation | Selection of aptamers based on geometry |
| WO2008085777A2 (en) * | 2007-01-03 | 2008-07-17 | Xgenetics Inc. | A method for early detection of cancer |
| JP2012506705A (ja) * | 2008-10-27 | 2012-03-22 | キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド | 迅速に結果を得るハイブリッドキャプチャー法による分析およびシステム |
| CA2750338C (en) * | 2009-01-28 | 2019-06-25 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Sequence-specific large volume sample preparation method and assay |
| JP5738278B2 (ja) * | 2009-05-01 | 2015-06-24 | キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド | 試料中のｒｎａスプライシング形態を検出するための非標的増幅法 |
| WO2011032124A1 (en) | 2009-09-14 | 2011-03-17 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Compositions and methods for recovery of nucleic acids or proteins from tissue samples fixed in cytology media |
| JP6103941B2 (ja) | 2010-01-29 | 2017-03-29 | キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド | 核酸の配列特異的精製および多重分析のための方法および組成物 |
| JP2013517803A (ja) | 2010-01-29 | 2013-05-20 | キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド | サンプル中のｈｐｖの存在を決定および確認する方法 |
| JP2013528049A (ja) | 2010-05-19 | 2013-07-08 | キアゲン ガイサーズバーグ アイエヌシー． | 核酸の配列特異的な精製及び多重分析のための方法及び組成物 |
| US9376727B2 (en) | 2010-05-25 | 2016-06-28 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Fast results hybrid capture assay and associated strategically truncated probes |
| WO2012116220A2 (en) | 2011-02-24 | 2012-08-30 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Materials and methods for detection of hpv nucleic acid |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4366246A (en) * | 1977-11-08 | 1982-12-28 | Genentech, Inc. | Method for microbial polypeptide expression |
| US4293652A (en) * | 1979-05-25 | 1981-10-06 | Cetus Corporation | Method for synthesizing DNA sequentially |
| FI63596C (fi) * | 1981-10-16 | 1983-07-11 | Orion Yhtymae Oy | Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser |
| GB8306426D0 (en) * | 1983-03-09 | 1983-04-13 | Malcolm A D B | Detecting polynucleotide sequence |
| CA1260372A (en) * | 1984-04-27 | 1989-09-26 | Elazar Rabbani | Hybridization method for the detection of genetic materials |
| US4563417A (en) * | 1984-08-31 | 1986-01-07 | Miles Laboratories, Inc. | Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes |
-
1984
- 1984-02-17 FI FI840655A patent/FI71768C/fi not_active IP Right Cessation
-
1985
- 1985-01-22 ZA ZA85511A patent/ZA85511B/xx unknown
- 1985-01-24 US US06/694,325 patent/US4731325A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-01-29 IE IE202/85A patent/IE57652B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-02-04 AU AU38422/85A patent/AU577568B2/en not_active Expired
- 1985-02-07 BE BE214463A patent/BE901671A/fr not_active IP Right Cessation
- 1985-02-07 IT IT19432/85A patent/IT1183184B/it active
- 1985-02-08 DK DK198500589A patent/DK174675B1/da not_active IP Right Cessation
- 1985-02-12 CA CA000474112A patent/CA1248895A/en not_active Expired
- 1985-02-12 LU LU85768A patent/LU85768A1/fr unknown
- 1985-02-13 NO NO850554A patent/NO166543C/no not_active IP Right Cessation
- 1985-02-14 NL NL8500424A patent/NL193663C/nl not_active IP Right Cessation
- 1985-02-15 GB GB08503900A patent/GB2156074B/en not_active Expired
- 1985-02-15 JP JP60029207A patent/JPS60188100A/ja active Granted
- 1985-02-15 AT AT0044185A patent/AT394578B/de not_active IP Right Cessation
- 1985-02-15 SU SU853856877A patent/SU1523053A3/ru active
- 1985-02-15 FR FR858502188A patent/FR2559783B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1985-02-15 CH CH725/85A patent/CH671778A5/de not_active IP Right Cessation
- 1985-02-15 DE DE3505287A patent/DE3505287C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-02-15 HU HU85570A patent/HU194938B/hu unknown
- 1985-02-15 SE SE8500733A patent/SE463103B/sv not_active IP Right Cessation
- 1985-02-18 RO RO117684A patent/RO92633B/ro unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU194938B (en) | Process for preparing improved nucleinic acid reagents | |
| US5057411A (en) | Type-specific papillomavirus DNA sequences and peptides | |
| US4992364A (en) | Probe for DNA and a process for the detection of "Shigellae" and entero-invasive strains of Escherichia coli | |
| EP0444115B2 (en) | In situ suppression hybridization and uses therefor | |
| US6207367B1 (en) | Process for genetic mapping for plant identification and breeding purposes | |
| US5695926A (en) | Sandwich hybridization assays using very short capture probes noncovalently bound to a hydrophobic support | |
| Szostak et al. | [29] Hybridization with synthetic oligonucleotides | |
| US5407797A (en) | Oligonucleotide probes and methods for detecting by hybridization the nucleic acids of bacteria and other living organisms | |
| EP0370625B1 (en) | Human papillomavirus type 52 DNA sequences and methods for employing the same | |
| EP0672186A4 (en) | IMPROVED STRAND MOVEMENT TECHNIQUE AND COMPLEX USED FOR THIS PURPOSE. | |
| US5545525A (en) | Detection of candida albicans | |
| US5691138A (en) | Nucleotide sequences which hybridize specifically with a Campylobacter jejuni genomic nucleic sequence | |
| JPH08501220A (ja) | Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ同定用の単離されたヌクレオチド配列 | |
| US5091301A (en) | Diagnostic and epidemiological nucleic acid probe for bovine leptospirosis | |
| Kirii et al. | Detection of enterotoxigenic Escherichia coli by colony hybridization with biotinylated enterotoxin probes | |
| Pettersson et al. | Nucleic acid hybridization—an alternative tool in diagnostic microbiology | |
| Humphries et al. | Differences between the endogenous and exogenous DNA sequences of Rous-associated virus-O | |
| EP0178435A2 (en) | cDNA probe for the detection of bluetongue virus | |
| CN102719519B (zh) | 用于检测Ⅰ型新德里金属β-内酰胺酶基因的组合物和试剂盒 | |
| Raab-Traub et al. | Hybridization of viral nucleic acids: Newer methods on solid media and in solution | |
| CA1340100C (en) | Polynucleotide commposition and method | |
| Nath et al. | The characterization of Gardnerella vaginalis DNA using non-radioactive DNA probes | |
| EP0998491B1 (en) | Hop mosaic virus gene and method for detecting hop mosaic virus | |
| WO1995014107A1 (en) | Analytical method of detecting mutations in virus mixtures or attenuated live virus vaccines | |
| Garman | Development of a DNA hybridisation method for the identification of Rhizobium and Bradyrhizobium: a thesis presented in partial fulfilment of the requirements for the degree of Master of Science in microbiology at Massey University, New Zealand |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HU90 | Patent valid on 900628 | ||
| HPC4 | Succession in title of patentee |
Owner name: SANGTEC MEDICAL AB, SE |
|
| HPC4 | Succession in title of patentee |
Owner name: SANGTEC MOLECULAR DIAGNOSTICS AB, SE |