FI71768B - Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning - Google Patents
Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning Download PDFInfo
- Publication number
- FI71768B FI71768B FI840655A FI840655A FI71768B FI 71768 B FI71768 B FI 71768B FI 840655 A FI840655 A FI 840655A FI 840655 A FI840655 A FI 840655A FI 71768 B FI71768 B FI 71768B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- nucleic acid
- fragments
- reagents
- stripe
- dna
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/682—Signal amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
71768
Parannetut nukleiinihapporeagenssit ja niiden valmistusmenetelmä
Keksinnön kohteena ovat raitasarjanukleiinihappofragmenteista 05 koostuvat parannetut nukleiinihapporeagenssit. Keksintö koskee myös raitasarjaklooneista koostuvien nukleiinihappo-reagenssien valmistusmenetelmää yhdistelmä-DNA-tekniikalla.
Nukleiinihappojen tunnistamisessa ja tutkimisessa on yleises-10 ti käytetty erilaisia hybridisaatiomenetelmiä. Esimerkkeinä voidaan mainita suorat hybridisaatiomenetelmät, joissa tunnistettavaa nukleiinihappoa sisältävä näyte on joko liuoksessa (Brautigam et ai., J.Clin.Microbiol., 1980, 12^, 226-234 ja patenttijulkaisu GB 2,019,408) tai kiinnitettynä kiinteään 15 kantajaan (patenttijulkaisut US 4,139,346, US 4,302,204, US 4,358,535, US 4,395,486, GB 2,034,323, GB 2,095,833, EP 62,286, EP 62,237 ja EP 61,740) ja osoitetaan yhdellä leimatulla nukleiinihapporeagenssilla, joka hybridisoituu osoitettavan nukleiinihapon kanssa.
20
Muita tunnettuja hybridisaatiomenetelmiä ovat Dunn ja Hassell' in julkaisussa Cell, 12^, 23-36, 1977 esittämä kaksivaiheinen kerroshybridisaatiomenetelmä ja patentissa FI 63,596 esitetty yksivaiheinen kerroshybridisaatiomenetelmä. Nämä 25 menetelmät poikkeavat suorista menetelmistä siinä, että nukleiinihapon tunnistamiseen tarvitaan kaksi erillistä nukle-iinihapporeagenssia, joilla osoitetaan näyteliuoksessa oleva nukleiinihappo. Toinen näistä reagensseista on kiinnitetty kiinteään kantajaan ja toinen on leimattu.
30
Nukleiinihapporeagensseille, sekä kiinteään kantajaan kiinnitetyille että leimatuille, on tunnusomaista, että niiden emäsjärjestys on tunnistettavaksi tarkoitetulle nukleiinihapolle komplementaarinen tai lähes komplementaarinen eli homo-35 loginen. Nukleiinihapporeagensseina on käytetty luonnossa esiintyviä nukleiinihappoja sellaisenaan tai fragmentteina. Fragmentit on aikaansaatu esimerkiksi restriktioentsyymien 2 71768 avulla. Nukleiinihapporeagensseja on valmistettu myös synteettisesti tai yhdistelmä DNA-tekniikkaa hyväksi käyttäen. Nukleiinihapporeagensseina on käytetty luonnossa esiintyviä plasmideja (patentti US 4,358,535), nukleiinihappoja bak-05 teriofaageista (patentti US 4,543,535), ribosomaalista RNA:ta ja lähetti-RNA:ta (patentti US 4,302,204) tai nukleiinihappoja eri viruksista (Stälhandske et ai., Curr.Top.Microbiol. Virol. 104, 1983). Koko virusgenomia on käytetty tunnistamaan esimerkiksi hybridiviruksen lähetti-RNA:n eri viruksiin 10 kuuluvia osia (Dunn ja Hassell, Cell, t2, 23-36, 1977). Nukleiinihapporeagensseja on valmistettu myös yhdistelmä-DNA-tekniikkaa hyväksi käyttäen (patentit US 4,395,486, US 4,359,535, FI 63,596, sekä patenttijulkaisut GB 2,034,323 ja EP 62,286). Yhdistelmä-DNA-tekniikalla aikaansaatuja 15 nukleiinihapporeagensseja on käytetty joko siten, että monistettu DNA-fragmentti on puhdistettu erilleen vektorin DNA:sta tai yhdistelmä-DNA-molekyyleinä erilaisiin vektoreihin liitettyinä. Aikaisemmin käytetyt yhdistelmä-DNA-tekniikalla aikaansaadut nukleiinihapporeagenssit koos-20 tuvat yhdestä yhtenäisestä tunnistavasta nukleiinihappofrag-mentista tai useista erillisistä klooneista.
Olemme kehittäneet uudet herkemmät nukleiinihapporeagenssit, jotka koostuvat kahdesta sarjasta pääasiallisesti vuorot-25 televia raitasarjanukleiinihappofragmentteja, jotka on valmistettu joko yhdestä tai useammasta tunnistettavalle nukleiinihapolle homologisesta segmentistä.
Nukleiinihapporeagenssit, jotka koostuvat tällaisista raita-30 sarjanukleiinihappofragmenteista ovat kerroshybridisaatio-testeissä vähintään kaksi kertaa herkemmät kuin aikaisemmin käytössä olleet nukleiinihapporeagenssit. Keksinnön mukaisilla nukleiinihapporeagensseilla ja niiden yhdistelmillä voidaan tunnistaa entistä pienempiä nukleiinihappomääriä, ja ne 35 soveltuvat erikoisen hyvin käytettäväksi kerroshybridisaatio-menetelmissä.
Keksinnön mukaisten nukleiinihapporeagenssien suurempi
II
3 717 6 8 herkkyys kerroshybridisaatiomenetelmissä perustuu osittain siihen, että useampien koettimien käyttö lisää leimattujen hybridien määrää kiinteällä kantajalla. Jokaisen hybridisoi-tuvan koettimen mukana voi olla leimattua vektoriperäistä 05 nukleiinihappoa (kuvat 1 ja 2). Kuvissa 1 ja 2 v esittää vektoriperäistä DNA:ta, x tunnistettavaa nukleiinihappoa, b leimattua koetinta, a kiinteään kantajaan kiinnitettyä tunnistavaa nukleiinihapporeagenssia ja F filtteriä. Kun käytetään useita koettimia, leimattujen vektoriperäisten nuk-10 leiinihappo-osien määrä kasvaa ja muodostuviin hybrideihin sitoutuu enemmän leimaa. Hybridit ovat siten helpommin osoitettavissa.
Kun käytetään keksinnön mukaisia raitasarjanukleiinihappo-15 fragmentteja kerroshybridisaatiomenetelmissä, kiinteään kantajaan on kiinnitetty vähintäin kaksi tai kuten kuvassa 1 on esitetty kolme tunnistavaa nukleiinihappofragmenttia. Tällöin osoitettava nukleiinihapposäie x saattaa hybridi-soitua eri alueistaan kiinteään kantajaan kiinnitettyihin 20 nukleiinihappofragmentteihin, esimerkiksi a^, a2 ja a^, joko yhdestä tai useammasta kohdasta reaktioasteesta riippuen. Reaktion saavuttaessa lopputilansa saattaa syntyä kuvan 1 mukainen tilanne, jossa näytesäie muodostaa silmukan tai silmukoita, joihin koetin tai koettimet esimerkiksi b^ ja b2 25 kuvassa 1 kiinnittyvät. Tällöin vektoriperäisten nukleiinihappo-osien etäisyys hybridisaatioliitoskohdasta (1) pienenee (kuva 1) ja hybridi on stabiilimpi kuin kuvassa 2 esitetty yhden reagenssiparin (tekniikan tasoon kuuluva) muodostama hybridi, joka on samankokoinen kuin raitasarja-alue yhteensä. 30 Yhdestä reagenssiparista muodostuneen hybridin vektoriperäi-set osat katkeavat helposti esimerkiksi mekaanisesta rasituksesta, kuten ravistelusta. Tällöin hybridiin jo sitoutunut leima karkaa.
35 Koska keksinnön mukaiset parannetut nukleiinihapporeagenssit ovat herkempiä kuin aikaisemmin käytetyt nukleiihapporeagens-sit, ne sopivat kromosomaalisten uudelleenjärjestelyjen osoittamiseksi ja perinnöllisten tautien osoittamiseksi.
4 71 768
Keksintömme kohteena ovat raitasarjanukleiinihappofragmen-teista koostuvat nukleiinihapporeagenssit nukleiinihappojen osoittamiseksi hybridsaatiomenetelmissä sekä kyseisten reagenssien valmistus.
05
Keksinnön tunnusomaiset seikat selviävät patenttivaatimusten tunnusmerkeistä ja keksintö selviää tarkemmin seuraavasta selityksestä ja oheisista piirustuksista, joissa kuva 1 esittää raitasarjakerroshybridiä, 10 kuva 2 esittää tekniikan tasoon kuuluvaa kerroshybridiä, kuva 3 esittää vuorottelevien raitasarjanukleiinihappo-fragmenttien paikat nukleiinihapossa, joka on valittu keksinnön mukaisten raitasarjanukleiinihapporeagenssien valmistamiseksi , 15 kuva 4 esittää pääasiallisesti vuorottelevien raitasarja-nukleiinihappofragmenttien vastaavat paikat, ts. tilanteen, jossa b-sarjan fragmentit jakaantuvat vierekkäisiin ali fragmentteihin kuva 5 esittää kuvan 3 mukaiset raitasarjanukleiinihappo-20 fragmentit erillisinä (a), yhteenliitettyinä (b) ja sekä erillisinä että yhteenliitettyinä (c), kuva 6 esittää raitasarjakerroshybridejä, kuva 6a esittää raitasarjakerroshybridiä, joka muodostuu, kun käytetään erillisiä fragmentteja, 25 kuva 6b esittää raitasarjakerroshybridiä, joka muodostuu, kun käytetään yhteenliitettyjä b-fragmentteja, kuva 6c esittää raitasarjakerroshybridiä, joka muodostuu, kun on käytetty sekä erillisiä että yhteenliitettyjä b-fragment-te ja, 30 kuva 7 esittää eri nukleiinihappoja tunnistavia raitasarja-nuklei inihapporeagensseja, kuva 8 esittää raitasarjakerroshybridejä, jotka muodostuvat, kun käytetään kuvan 7 mukaisia eri nukleiinihappoja tunnistavia raitasarjanukleiinihapporeagensseja, 35 kuva 9 esittää suorassa hybridisaatiomenetelmässä muodostuvaa raitasarjahybridiä, kuva 10 esittää rekombinanttiplasmidia pKTHl220, kuva 11 kuvaa raitasarjakerroshybridiä, joka muodostuu kun 71768 5 käytetään rekombinanttiplasmidista pKTHl220 valmistettuja raitasarjanuklei inihappofragmentteja, kuva 12 esittää rekombinanttiplasmidia pKTHl271, kuva 13 esittää raitasarjakerroshybridiä, joka muodostuu kun 05 käytetään rekombinanttiplasmidista pKTHl271 valmistettuja raitasarjanuklei inihappofragmentteja.
Keksintömme kohteena ovat raitasarjanukleiinihappofragmen-teista koostuvat nukleiinihapporeagenssit. Nämä raitasarja-10 nukleiinihapporeagenssit koostuvat vähintään kahdesta, mutta edullisesti useammasta pääasiallisesti vuorottelevasta nukleiinihappofragmentista, jopa 20 fragmentista, jotka ovat peräisin yhdestä tai useammasta nukleiinihaposta, joka on tunnistettavalle nukleiinihapolle riittävän homologinen.
15 Tällöin saadaan kaksi sarjaa pääasiallisesti vuorottelevia raitasarjanukleiinihappofragmentteja, jotka eivät saa olla toisilleen homologisia.
Keksinnön mukaiset nukleiinihapporeagenssit koostuvat joko 20 erillisistä, yhteenliitetyistä tai sekä erillisistä että yhteenliitetyistä raitasarjanukleiinihappofragmenteista.
Raitasarjanukleiinihappofragmentit voivat olla vektoriin liitettyjä, sisältää osia vektoreista tai olla täysin vapaita vektoriosista.
25 Käytetyt nukleiinihappofragmentit ovat vähintäin 15 nukleotidin pituisia. Varsinaista pituuden ylärajaa ei ole, mutta on edullista käyttää 20-5000 nukleotidin pituisia fragmentteja. Keksinnön mukaiset nukleiinihappofragmentit ovat peräisin 30 joko tunnistettavasta genomista tai yhdestä genomin osasta, esimerkiksi suhteellisen suuresta genomin määrättyä osaa edustavasta kloonista. Keksinnön mukaiset raitasarjanukleiinihappof ragmentit voidaan siis valmistaa useista riippumattomista genomialueista, jotka eivät ole välittömästi vierek-35 käin. Näin valmistetut raitasarjanukleiinihappofragmentit yhdistetään samaan reagenssiin. Raitasarjanukleiinihappo-fragmentit voidaan myös eristää DNArsta, joka ei ole tunnistettavan nukleiinihapon kanssa identtinen, mutta on 6 71 768 riittävän homologinen niin, että reagenssin ja tunnistettavan nukleiinihapon kesken syntyy stabiili hybridi.
Reagenssit eristetään siten, että saadaan kaksi sarjaa 05 pääasiallisesti vuorottelevia nukleiinihappofragmentteja jne* ja 3ne· Sarjaan a^,82,3^ jne. kuuluvat nukleiinihappofragmentit koostuvat lähellä toisiaan, edullisesti ei kuitenkaan vierekkäin sijaitsevista fragmenteista. Sarjaan b^,b2,bj, jne. kuuluvat nukleiinihappofragmentit 10 koostuvat myös lähellä toisiaan, edullisesti ei kuitenkaan vierekkäin sijaitsevista nukleiinihappofragmenteista. Sarjaan a^,82^3 jne. kuuluvat ja sarjaan b^,b2»b2 jne. kuuluvat nukleiinihappofragmentit eivät saa olla homologisia toisilleen. On edullista, että sarjaan a1#a2»a3 jne. ja sarjaan 15 b^,b2ibg jne. kuuluvat nukleiinihapot on eristetty niin, että joka toinen fragmentti kuuluu a-sarjaan ja joka toinen b-sar-jaan, kuten on esitetty kuvassa 3. Kuvassa 3 a^, a2 ja a^ sekä b^, b2 ja b^ ovat tunnistettavalle nukleiinihapolle riittävän homologisia raitasarjanukleiinihappofragmentteja.
20 On tietysti mahdollista valmistaa kunkin nukleiinihappo-fragmentin asemasta useampia ns. alifragmentteja, kuten on esitetty kuvassa 4. Aiifragmentit voivat olla vierekkäin ts. niiden ei tarvitse täysin vuorotella toisen sarjan fragmenttien kanssa. On edullista, että vuorottelevat kaksi nuk-25 leiinihapporeagenssia seuraavat toisiaan välittömästi, mutta tämä ei ole mikään välttämätön edellytys keksinnölle. Vastaavasti on edullista, että alifragmentit seuraavat toisiaan välittömästi, mutta tämäkään ei ole välttämätön edellytys keksinnölle.
30
Yllä kuvattuja nukleiinihappofragmenttisarjoja voidaan käyttää joko erillisinä fragmentteina a^,a2,a.j jne. ja b^,b2,b2 jne. (kuva 5a) tai toisiinsa liitettyinä nauhoina a^-a2-aj jne. ja b^-b2-bj jne. (kuva 5b). On tietysti 35 mahdollista valmistaa kaikenlaisia välimuotoja kuten esimerkiksi a-sarja, jossa a^ on erillisenä fragmenttina ja a2-a3 ovat yhteenliitettyjä ja b-sarjassa esimerkiksi ^^2 ovat yhteenliitettyinä ja b^ erillisenä jne., kuten on ti 7 71768 esitetty kuvassa 5c.
Kuvassa 6 on esitetty erilaisia raitasarjakerroshybrideja. Kuvassa 6a on esitetty raitasarjakerroshybridi, jossa raita-05 sarjanukleiinihappofragmentit ovat erillisiä. Kuvassa 6b on esitetty raitasarjahybridi, jossa leimatut raitasarjanukleiinihappof ragmentit ovat yhteenliitettyjä. Kuvassa 6c on esitetty tapaus, jossa sekä yhteenliitetyt että erilliset leimatut raitasarjanukleiinihappofragmentit muodostavat raitasar-10 jakerroshybridin. Kuvassa 6 x esittää tunnistettavaa nukleiinihappoa, b^, b2 ja b^ leimattua koetinta sekä a^, a2 ja a3 kiinteään kantajaan kiinnitettyjä raitasarjanukleiinihappo-fragmentteja.
15 Nukleiinihappofragmentit, jotka kuuluvat b-sarjaan voidaan esimerkiksi leimata niin, että saadaan leimattu nukleiini-happoreagenssi eli koetin B. Nukleiinihapporeagenssit, jotka kuuluvat a-sarjaan voidaan kiinnittää kiinteään kantajaan niin, että saadaan kiinteään kantajaan sidottu nukleiini-20 happoreagenssi A. Voidaan tietysti vaihtoehtoisesti tehdä leimattu nukleiinihapporeagenssi A ja vastaava kiinteään kantajaan sidottu nukleiinihapporeagenssi B.
Tällaisia leimattuja ja kiinteään kantajaan kiinnitettyjä 25 nukleiinihappopareja A ja B tai B ja A voidaan valmistaa useille eri tunnistettaville nukleiinihapoille ja yhdistää sopiviksi nukleiinihapporeagenssien yhdistelmiksi, jotka koostuvat eri nukleiinihapporeagenssipareista A^ ja B^, A2 ja B2' A3 -^a B3 ^ne· ta^ Bl Ai' B2 ^a A2' B3 ^a A3 jne· Er* 30 nukleiinihappoja tunnistavia raitasarjanukleiinihappofrag- mentteja sisältävät reagenssit voidaan myös liittää yhteen niin, että saadaan koetin A -A -A , joka koostuu esimerkiksi x y z raitasarjanukleiinihappofragmenteista (ai~a2-a3)χ-(ai_a2~ a2)y-(a^~a2-a3)z» kuten on esitetty kuvassa 7, jossa a^x, a2x 35 ja ajx ovat nukleiinihappoa x tunnistavia raitasarja-nukleiinihappofragmentteja Αχ; a^y, a2y 3a a3y ovat nukleiinihappoa y tunnistavia raitasarjanukleiinihappo-fragmentteja A; a^z, a2z 3a a3z ovat nukleiinihappoa z 71 768 8 tunnistavia raitasarjanukleiinihappofragmentteja A ja v on
Z
vektoriperäinen nukleiinihappo-osa. Yhteenliitettyjä raitasar janukleiinihappof ragmentte ja voidaan tietysti käyttää myös erillisinä fragmentteina sopivina seoksina.
05
Kuvassa 7 esitetyillä reagensseilla saadaan kuvan 8 mukaisia raitasarjakerroshybridejä. Jos halutaan tunnistaa useita eri nukleiinihappoja samanaikaisesti, on tietysti käytettävä erillisiä filttereitä kuten kuvassa 8 on esitetty. Kuvassa 8a 10 on esitetty nukleiinihappoa x tunnistava kiinteä kantaja, kuvassa 8b nukleiinihappoa y tunnistava kiinteä kantaja ja kuvassa 8c nukleiinihappoa z tunnistava kiinteä kantaja. Kuvissa 8a, 8b ja 8c b^x, b2x ja b^x ovat kiinteään kantajaan kiinnitettyjä, nukleiinihappoa x tunnistavia raitasarja-15 nukleiinihappofragmentteja, b^, &2y ^3y ovat kiinteään kantajaan sidottuja, nukleiinihappoa y tunnistavia raitasar janukleiinihappof ragmentte ja ja b^z, k>2z ja b3z ovat kiinteään kantajaan kiinnitettyjä, nukleiinihappoa z tunnistavia raitasarjanukleiinihappofragmentteja ja x, y ja z 20 ovat tunnistettavat nukleiinihapot. Fx, F^ ja Fz ovat vastaavat kiinteät kantajat tai filtterit, A -A -A on koetin, joka x y z tunnistaa kaikki kolme nukleiinihappoa samanaikaisesti, mikäli käytetään erillisiä kiinteitä kantajia.
25 Edellä kuvatut nukleiinihappofragmenttisarjät, reagenssit ja reagenssien yhdistelmät voidaan valmistaa sinänsä tunnettujen yhdistelmä-DNA-tekniikoiden avulla. Tunnistettavasta nukleiinihaposta tai sitä edustavasta osasta valmistetaan joukko eripituisia nukleiinihappofragmentteja restriktioentsyymien 30 avulla. Jos tunnistettavan genomin restriktiokartta on tunnettu, voidaan tästä suoraan valita sopivia vierekkäisiä restriktioentsyymien avulla pilkottuja fragmentteja, jotka eristetään ja monistetaan yhdistelmä-DNA-tekniikkaa hyväksi käyttäen.
Kun on kysymys tuntemattomasta genomista, voidaan reagenssien tuotannossa käyttää välivaihetta siten, että kloonataan kohtalaisen suuri restriktiofragmentti, joka kartoitetaan ja 35 71768 täten saadun tiedon perusteella aikaansaadaan raitasarja-nukleiinihappofragmenttisarjät a^,a2,a3 jne. ja b^,b2,b3 jne.
Luonnollisesti voidaan käyttää edellisten menetelmien yhdis-05 telmiä ja käyttää useita suuria erillisiä kloonattuja res-triktiofragmentteja lähtökohtana ja valmistaa useita erillisiä sarjoja, jotka kombinoidaan sopiviksi yhdistelmiksi.
Keksinnön mukaisia nukleiinihappofragmenttisarjoja a^,a2,a3 10 jne. sekä b^,b2,b3 jne. on edullisinta valmistaa yhdistelmä-DNA-tekniikkaa hyväksi käyttäen siten, että sarja a kloonataan yhdessä vektorissa, esimerkiksi plasmidissa pBR322, ja sarja b puolestaan kloonataan toisessa sopivassa vektorissa, jolla ei ole edellisen vektorin kanssa yhteisiä alueita. Täl-15 lainen toinen edullinen vektori on esimerkiksi bakteriofaagi M13. Sarjaan a kuuluvat fragmentit voidaan liittää toisiinsa ja yhdistetty sarja kloonata yhteen vektoriin. Esimerkiksi voidaan kloonata a^-a2 toisiinsa liitettynä yhtenäisenä in-serttinä samassa pBR322-vektorissa. Vastaavalla tavalla 20 voidaan valmistaa reagenssisarja b^-b2· Kloonauksessa voidaan edullisesti käyttää vektoreita, joihin voidaan liittää erittäin suuria vierasta DNA:ta sisältäviä inserttejä. Esimerkiksi lambdafaagi ja kosmidivektorit ovat tähän tarkoitukseen sopivia.
25
Keksinnön mukaisessa raitasarjakerroshybridisaatiomenetelmäs-sä tarvitaan siis kaksi reagenssia, tunnistettavalle merkkiaineelle leimattu reagenssi eli koetin ja kiinteään kantajaan kiinnitetty nk. filtterireagenssi.
30
Koettimien leimaamisessa on yleisimmin käytetty radioaktiivisia isotooppeja. Esimerkiksi patenttijulkaisussa GB 2,034,323, US 4,358,535 ja US 4,302,204 on käytetty 32 125 131 3 seuraavia isotooppeja P, J, J ja H. Patentissa 125 35 FI 63,596 on käytetty J isotooppia. Nukleiinihappo-koettimia on myös modifioitu eri tavoilla ja leimattu esimerkiksi fluoresoivilla leimoilla (patenttijulkaisu FR 2,518,755). Myös entsymaattisia tai entsymaattisesti 10 71 768 mitattavia leimoja on käytetty (patenttijulkaisu GB 2,019,408, EP 63,879 ja FR 2,519,005). Patenttijulkaisuissa EP 70,685 ja EP 70,687 on kuvattu valoa emittoiva leima ja leimausmenetelmä ja patenttijulkaisussa FR 2,518,755 05 immunologisesti mitattava leima. Patentissa US 4,374,120 kuvattuja lantaniidikelaatteja etenkin europiumia voidaan käyttää merkkiaineina. Leimaksi sopii myös Leary et ai.'in kuvaama biotiini-avidiinimerkkiaine (PNAS 130, 4045-4049, 1983). Edellä on mainittu muutamia esimerkkejä leimoista, 10 joita voidaan käyttää keksinnön mukaisten nukleiinihappo- reagenssien leimaamiseksi, mutta on selvää, että uusia entistä parempia merkkiaineita tullaan kehittämään, jotka myös soveltuvat keksinnön mukaisten raitasarjanukleiinihappofrag-menttien leimaamiseen.
15
Filtterireagensseiksi sopivia kantajia ovat erilaiset nitro-selluloosafiltterit (patentit US 4,358,535 ja GB 2,095,833). Patenttijulkaisussa DD 148,955 on kuvattu tapa sitoa nukleiinihappoja kantajaan (paperiin) kemiallisesti. Patenteissa 20 US 4,359,535 ja US 4,302,204 on kuvattu kemiallisesti modifioituja papereita, joita voidaan käyttää kiinteinä kantajina. Muita vaihtoehtoja ovat nylonmembraanit ja modifioidut nit-roselluloosafiltterit. Mutta on selvää, että uusia materiaaleja tullaan kehittämään, jotka sopivat entistä paremmin kek-25 sinnön mukaisiksi kiinteiksi kantajiksi. On tietysti mahdollista käyttää myös muita kiinteitä kantajia kuten erilaisia kromatografiamatrikseja kuten triatsiini- tai epoksiaktivoi-tua-selluloosaa, lateksia ym. Kiinteän kantajan valinnassa ei periaatteessa ole muita rajoituksia kuin seuraavassa se-30 lostettavat. Kiinteään kantajaan on voitava kiinnittää nukleiinihappoa yksisäikeisessä muodossa niin, että nämä yksisäi-keiset nukleiinihapot voivat hybridisoitua komplementaarisen nukleiinihapon kanssa. Kiinteän kantajan on myös oltava helposti poistettavissa hybridisaatioliuoksesta tai hybridisaa-35 tioliuoksen on oltava helposti poistettavissa kiinteästä kantajasta. Koetin ei myöskään saa tarttua itse kantajamateriaa-liin niin, ettei se ole poispestävissä.
H
71768
Edellä kuvatut, leimatut ja kiinteään kantajaan sidotut rai-tasarjanukleiinihapporeagenssiparien yhdistelmät A ja B tai B ja A ja tällaisista eri nukleiinihappojen tunnistamista varten tehdyistä nukleiinihappopareista voidaan koota yhdistelmä 05 Αχ ja Βχ, Α^ ja B^, Az ja Bz· Näitä yhdistelmiä voidaan käyttää nukleiinihappojen x, y ja z samanaikaiseksi tunnistamiseksi kerroshybridisaatiomeneteImillä.
Näyte käsitellään siten, että nukleiinihapot vapautuvat hyb-10 ridisaatioliuokseen ja ne saatetaan yksisäikeiseen muotoon. Hybridisaatio suoritetaan hybridisaatioliuoksessa, johon lisätään sekä kiinteään kantajaan kiinnitetyt että leimatut nukleiinihapporeagenssit. Kun hybridisaatio on tapahtunut, nostetaan filtterit hybridisaatioliuoksesta, jos kiinteinä 15 kantajina on käytetty filttereitä. Jos on käytetty kromato-grafiamatrikseja, lateksia tai vastaavaa, hybridisaatioliuos poistetaan. Kiinteät kantajat huuhdellaan sopivalla pesuliu-oksella. Muodostuneet raitasarjakerroshybridit (kuvat 8a, 8b, 8c) detektoidaan sinänsä tunnetuilla menetelmillä. Radioak-20 tiivinen leima mitataan esimerkiksi autoradiografiällä tai tuike- tai ^-laskimella. Entsymaattinen leima tunnistetaan esimerkiksi värireaktion jälkeen fotometrialla tai sakan perusteella. Lantaniidikelaatit voidaan detektoida niin kutsutulla "time resolved fluorescence"-menetelmällä. Immunologi-25 nen leima osoitetaan tarkoitukseen sopivilla immunologisilla menetelmillä.
Hybridisaatioliuoksena voidaan käyttää useita erilaisia seoksia, joista esimerkkeinä mainittakoon patenteissa FI 63,596, 30 ja US 4,302,204 esitetyt vaihtoehdot. Myös muita hybridisaa-tioseoksia voidaan tietysti käyttää. Hybridisaatio tapahtuu lämpötilassa 0-80 °C, mutta on edullista käyttää esimerkiksi lämpötilaa 65 °C. Riittävä hybridisaatio saattaa tapahtua hyvin lyhyessä ajassa, mutta on edullista käyttää 35 esimerkiksi 12-20 tunnin hybridisaatioaikoja.
Kaksivaiheinen kerroshybridisaatiomenetelmä suoritetaan periaatteessa samalla tavalla, mutta tässä tapauksessa lisätään i2 71768 ensin kiinteään kantajaan kiinnitetty nukleiinihapporeagenssi hybridisaatioliuokseen. Kun hybridisaatio on tapahtunut, kiinteä kantaja pestään ja suoritetaan toinen hybridisaatio, jossa leimattu nukleiinihapporeagenssi on mukana.
05
Edellä kuvattuja leimattuja nukleiinihapporeagensseja tai reagenssien yhdistelmiä A ,A ,A jne. ja B ,B ,B jne. voi-
X y Z X y Z
daan tietysti käyttää suorissa hybridisaatiomenetelmissä. Tällöin jokaista tunnistettavaksi tarkoitettua nukleiinihap-10 poa x, y ja z varten liuoksessa oleva nukleiinihapponäyte on jaettava tai, jos näyte kiinnitetään kiinteään kantajaan, jokaista näytettä kohden on valmistettava oma kantajaan sidottu näyte. Muodostunut raitasarjahybridi (kuva 9) osoitetaan sinänsä tunnetuin menetelmin. Kuvissa 9 F esittää kiinteää kan-15 tajaa eli filtteriä, x tunnistettavaa nukleiinihappoa ja v vektoriperäisiä osia. Leimattuina koettimina on käytetty a^, a2 ja a^ (kuva 9a), b^ ja b2 (kuva 9b) ja a^, b^, a2, b2, a^ (kuva 9c ) .
20 Kuten jo edellä on kuvattu, keksinnön mukaisista raitasarja-nukleiinihapoista voidaan koota erilaisia nukleiinihapporea-genssien yhdistelmiä. Näillä yhdistelmillä voidaan tunnistaa useita eri nukleiinihappoja samanaikaisesti. Tunnistettaville eri nukleiinihapoille homologiset raitasarjanukleiinihappo-25 fragmentit voidaan käyttää erillisinä fragmentteina seoksissa tai liittää yhteen niin, että saadaan yksi monia eri nukleiinihappoja tunnistava koetin. Kiinteään kantajaan kiinnitetyt nukleiinihapporeagenssit on tietysti pidettävä erillään, jotta identifiointi onnistuisi.
30
Raitasarjahybridisaatiota voidaan käyttää eri ihmis-, eläin-tai kasvipatogeenisten mikro-organismien tunnistamiseksi. Menetelmällä voidaan tunnistaa ruoka-aineissa olevat mikro-organismit, kuten ruokamyrkytyksiä aiheuttavat klostridiat, 35 salmonellat, stafylokit jne. Menetelmä sopii vedessä esiintyvien kontaminanttien, kuten enterobakteerien ja enterovi-rusten tunnistamiseen. Koska raitasarjakerroshybridisaatio-testi on kvantitatiivinen menetelmä, se soveltuu esimerkiksi il 13 71 768 geeniamplifikaation havaitsemiseen ja mittaamiseen. Tämä piirre on merkityksellinen esimerkiksi syövän havaitsemisessa ja hoidossa. Jotta stabiili raitasarjahybridi muodostuisi, edellytetään, että koetin- ja filtterireagenssien kanssa 05 homologiset alueet sijaitsevat kohtuullisella, edullisesti alle 5 kb:n (kilobase) etäisyydellä toisistaan näytesäi-keessä. Muutokset tämän seikan suhteen ovat selvästi havaittavissa, joten menetelmä soveltuu myös muuttuneen mRNA:n, kromosomaalisten uudelleen järjestelyjen, immunoglobuliinin 10 geenien ekspressioon järjestäytymisen ja perinnöllisten tautien osoittamiseksi. Raitasarjanukleiinihappofragmenteista voidaan siis rakentaa erilaisia reagenssiyhdistelmiä. Esimerkiksi sukupuolitautien aiheuttajien tunnistamiseksi voidaan valmistaa kittejä, joissa on koetin, joka sisältää 15 sekä tippuria, syfilistä, herpestä että klamydiaa tunnistavia raitasarjanukleiinihappofragmentteja. Tunnistaminen on tällöin mahdollinen erillisten tippuri, syfilis-, herpes- ja klamydiafilttereiden avulla.
20 Keksinnön kohteena ovat erityisesti rekombinanttiplasmideista pKTHl220 ja pKTHl271 koostuvat raitasarjanukleiinihappo-fragmentit. Rekombinanttiplasmidi pKTHl220 sisältää Chlamydia trachomatis L2 bakteerin klamydioille spesifistä dna:ta plasmidissa pBR322. Tämä rekombinanttiplasmidi on transfor-25 moitu isäntään Escherichia coli K12 HB 101. Rekombinanttiplasmidi pKTHl271 sisältää cytomegaloviruksen AD169 DNA:ta plasmidissa pBR325. Tämä rekombinanttiplasmidi on transformoitu isäntään Escherichia coli K12 HB 101. Rekombinantti-plasmideja pKTHl220 ja pKTHl271 sisältävät isännät on 30 deponoitu kantakokoelmaan Deutsche Sammlung von Mikro-organismen (DSM), Griesebachstrasse 8, D-3400 Göttingen, Länsi-Saksa. Rekombinanttiplasmidia pKTHl220 sisältävän talletuksen numero on DSM 2825 ja rekombinanttiplasmidia pKTHl271 sisältävän talletuksen numero on DSM 2826.
35 Talletukset ovat vapaasti saatavissa kun patenttihakemus tulee julkiseksi.
Keksintö kuvataan tarkemmin seuraavissa esimerkeissä.
71768 14
Nukleiinihapon (DNA:n ja RNA:n) rakenne on samanlainen olipa kysymys eukaryoottisesta tai prokaryoottisesta solusta peräisin olevasta nukleiinihaposta. Tämän vuoksi samat periaatteet, jotka esitetään esimerkeissä soveltuvat myös 05 yhtä hyvin eläinten (ihminen mukaan luettuna), kasvien kuin mikrobien tai virusten nukleiinihappoihin. Siten keksinnön mukaisia reagensseja voidaan käyttää osoittamaan sekä ihmisten, eläinten, kasvien, mikrobien että virusten nukleiinihappoja.
10
Esimerkki 1 a) Chlamydia trachomatis-raitasarjanukleiinihapporeagenssit ja niiden valmistus 15
Chlamydia trachomatis-ryhmän diagnostiikkaan sopivat DNA-fragmentit valmistettiin Chlamydia trachomatis L2 serotyypin DNA:sta. DNA eristettiin ja hajotettiin tunnetuin menetelmin ja syntyneet DNA-fragmentit kloonattiin pBR322-plasmidiin ja 20 siirrettiin isäntäorganismiin Escherichia coli K 12 HB 101 tunnettuja menetelmiä käyttäen. Kloonauksen seurauksena saatiin Chlamydia trachomatis L2-bakteerin geenipankki, ts. suuri joukko yhdistelmäplasmideja, joissa kussakin on erillinen BamHI-entsyymin avulla aikaansaatu klamydiasta peräisin oleva 25 DNA-fragmentti. Reagenssituotantoa varten geenipankista valittiin sellaisia yhdistelmäplasmideja, jotka sisälsivät mahdollisimman suuren klamydia-DNA:sta peräisin olevan DNA-pätkän. Eräs tällainen on pKTHl220-numeron saanut plasmidi, joka on tallennettu Deutsche Sammlung von Mikroorganismen 30 kantakokoelmaan numerolla (DSM 2825) ja jonka sopivuus reagenssikäyttöön osoitettiin suoralla hybridisaatiotestillä. Testistä kävi ilmi, että pKTHl220 tunnisti kaikki eri Chlamydia trachomatis-serotyypeistä peräisin olevat nukleiinihapot, muttei muita nukleiinihappoja.
pKTHl220-plasmidi-DNA:sta valittiin soveltuvat, eri rest-riktioentsyymein aikaansaatavat fragmentit, joista osa siirrettiin jatkokloonauksen avulla edelleen pATl53-plasmidiin 35 15 71768 (Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual,
Cold String Harbor Laboratory, p.6, 1982)ja osa Ml3mp8-faagiin. Kuvassa 10 on esitetty rekombinanttiplasmidi pKTHl220, jonka molekulaarinen pituus on 14 kb:tä. Kuvassa 10 05 BamHI, Sali ja Clal esittävät käytettyjä restriktioentsyymejä ja a^, a2, ^ι» kuvaavat restriktioentsyymeillä aikaansaatujen fragmenttien kokoa ja keskinäistä sijaintia. Sarjaan a kuuluvat fragmentit on käytetty filtterireagenssei-na ja sarjaan b kuuluvat leimattuina koettimina. Taulukossa 1 10 on lueteltu kyseisten fragmenttien koko ja jatkokloonaukseen käytetyt vektorit, yhdistelmäplasmidien nimet sekä käyttö.
Taulukko 1.
15 Fragmentti Koko Vektori Yhdistelmä- Käyttö _plasmidi_ a1 Clal-Sall 3.0kb pATl53 pKTHl252 Filtteri a2 Sall-Clal 2.9kb pATl53 pKTHl250 Filtteri 20 b^ Sall-BamHI 0.7kb Ml3mp8 mKTHl242 Leimattu koetin b2 BamHI-Sall 1.4kb Ml3mp8 mKTHl239 Leimattu koetin bj Clal-Clal 1.7kb Ml3mp8 mKTHl248 Leimattu koetin b^-b2 BamHI-BamHI 2.1kb Ml3mp8 mKTHl245 Leimattu koetin 25
Taulukossa 1 luetellut fragmentit eristettiin agaroosigee-listä elektroeluution avulla ja kloonattiin taulukossa 1 lueteltujen vektoreiden asianomaisiin restriktioentsyymien tunnistuskohtiin tunnettuja menetelmiä hyväksi käyttäen.
30
Fragmentti BamHI-BamHI 2.1kb saatiin aikaan seuraavasti: pKTHl220-plasmidin BamHI-Sall 1.4kb ja Sall-BamHI 0.7kb fragmentit eroteltiin geelielektroforeesin avulla agaroosi-geelissä, josta ne eristettiin. Puhdistetut fragmentit 35 liitettiin toisiinsa T4-ligaasientsyymin avulla ja reaktiossa syntyneistä 2.1kb:n mittaisista DNA-fragmenteista ne, joilla oli vapaat BamHI-entsyymin tunnistamat päät, liitettiin edelleen Ml3mp8-faagin kaksisäikeisen replikoituvan muodon 16 71768
BamHI-katkaisukohtaan. Näin tehtiin yhdistelmä-faagi-DNA-(mKTHl245), joka sisältää Chlamydia trachomatis DNA:ta, joka koostuu kahdesta erillisestä DNA-fragmentista, jotka genomis-sa eivät sijaitse vierekkäin. Ne kuitenkin sijaitsevat 05 filtterille kiinnitettävien DNA-reagenssien pKTHl250 ja pKTHl252 vieressä genomissa (kuva 11). Kuvassa 11 on esitetty raitasarjakerroshybridi, joka muodostuu kun käytetään taulukossa 1 lueteltuja rekombinanttiplasmideja ja -faageja raitasarjanuklei inihapporeagensseinä.
10 b) Chlamydia trachomatis-raitasarjanukleiinihapporeagenssien herkkyyden osoittaminen kerroshybridisaatiomenetelmällä
Raitasarjanukleiinihapporeagenssien herkkyys verrattuna 15 yhteen yhtenäiseen reagenssipariin tutkittiin kerroshybridisaatiomenetelmällä . Testissä käytettiin filttereitä, jotka kaikki sisälsivät 1011 molekyyliä sekä pKTHl250(a2)- että pKTHl252(a^)-DNA:ta yksisäikeiseen muotoon saatettuna. Tutkittava näyte oli plasmidi pKTHl220, joka testiä varten saa-20 tettiin yksisäikeiseen muotoon keittämällä 5 min 0.17 M
NaOH:ssa, jonka jälkeen se siirrettiin 0 °C:een ja neutraloitiin ekvimolaarisella määrällä etikkahappoa. Testissä käytettiin seuraavia taulukossa 1 lueteltuja koettimia mKTHl242-(b1), mKTHl239(b2), mKTHl248(b3) ja mKTHl245(b1~b2).
25
Hybridisaatio tapahtui +65 °C:ssa 17 tunnissa hybridisaatio-liuoksessa, jonka koostumus oli seuraava: 4 x SSC, 0.02 % Ficoll, 0.02 % polyvinyylipyrrolidoni, 0.2 % SDS ja 200 μg/ml sillin sperraa-DNA. Filttereitä pestiin 2 t 50 °C:lla pesu-30 liuoksella, jonka koostumus oli seuraava: 0.1 x SSC, 0.2 % SDS ja laskettiin ^-laskijalla. Tulokset on esitetty taulukossa 2 ja ovat viiden rinnakkaisen testin keskiarvoja.
17 71 768
Taulukko 2.
Hybridi soitunut radioaktiivisuus, 05 Näyte _koettimena (b)_ molek/testi b^ b2 b3 b1> b2 (b1~b2) (b1-b2),b3 0 37 37 33 49_39_52_ 10 106 48 44 48 9368140 107 226 236 232 396 416 686 108 1475 1415 1456 2912 2637 3580
15 b^ 380.000 cpm/testi; 5 x 107 cpm/ugDNA
b2 340.000 cpm/testi; 4 x 107 cpm/jugDNA
b3 350.000 cpm/testi; 5 x 107 cpm/ugDNA
b^-b2 310.000 cpm/testi; 7 x 107 cpm/jugDNA
b^,b2 700.000 cpm/testi; 20 (b1-b2),b3 700.000 cpm/testi;
Ilman näytettä tehtyjen testien ( negatiiviset kontrollit) tilastollisesti laskettuna 95 %:n luotettavuusrajaa pidet-25 tiin positiivisuuden alarajana. Nämä arvot olivat 52-54 cpm kun koetin oli b^, b2 tai b3, 58 cpm kun koetin oli b^,b2, 56 cpm kun koetin oli b^-b2 ja 65 cpm kun koetin oli b^-b2,b3.
c) Klamydiadiagnostiikka raitasarjakerroshybridisäätiön 30 avulla
Testaukseen valittiin 3 virtsaputken tulehdusta sairastavaa miestä, joiden virtsaputkesta otetusta näytteestä oli eristetty Chlamydia trachomatis, ja 3 kohdunkaulan tulehdusta 35 sairastavaa naista, joiden kohdunkaulasta otetusta näytteestä oli niinikään eristetty Chlamydia trachomatis. Lisäksi tutkittiin vastaava määrä samanlaisia potilasnäytteitä, joista ei klamydiaa ollut eristetty. Tutkittavat näytteet oli otettu 71 768 18 pumpulitikulla, joka oli upotettu klamydianäytteenottopus-kuriin, joka sisälsi 0.2 M sakkaroosia, 20 mM fosfaatti-puskuria, 3 % sikiövasikan seerumia, 10 pg/ml gentamysiiniä, 100 jug/ml vankomysiiniä ja 25 IU/ml nystatiinia.
05 Näytteistä oli tehty klamydiaviljelyt, jonka jälkeen ne tutkittiin raitasarjahybridisaation avulla. Näytteet konsentroitiin 2-butanolin avulla siten, että niistä poistui nestettä niin, että lopullinen volyymi oli noin 80 μΐ, jolloin kon-10 sentroituminen testausta varten oli noin 3-7 kertainen. Tämän jälkeen näytteeseen lisättiin liuosta, joka sisälsi 70 mM EDTAra, 0.7 % SDS:a, 200 jug/ml proteinaasi K-entsyymiä ja käsiteltiin 15 min 55 °C:ssa ja 45 min 37 °C:ssa. Tämän jälkeen näytettä keitettiin 5 min 0.175 M NaOH:ssa. Keitetty 15 näyte siirrettiin 0 °C ja neutraloitiin ekvimolaarisella määrällä etikkahappoa ja testattiin. Testissä käytettiin esimerkissä Ib esitettyjä filttereitä ja hybridisaatio-olosuhteita. Koettimena käytettiin mKTHl245(b^-bj)» 300.000 cpm/400 μΐ hybridisaatioreaktio. Tulokset on esitetty taulukossa 3.
Taulukko 3.
19 71768 05 Näyte Hybridisoitunut Klamydiaviljelytulos radioaktiivisuus
Mies 1. 151 + 10 Mies 2. 164 +
Mies 3. 154 +
Mies 4. 61
Mies 5. 76
Mies 6. 55 15
Nainen 1. 343 +
Nainen 2. 509 +
Nainen 3. 362 +
Nainen 4. 57 20 Nainen 5. 58
Nainen 6. 81
Puskuri, X^j 30-55 25 Chi, trachomatis L2 bakteeri,10^ 419 +
Testissä positiivisuuden raja oli 104 cpm.
30
Taulukossa 3 esitetty tulos osoittaa, että raitasarjaker-roshybridisaatio soveltuu sukupuolitautidiagnostiikkaan. Näytteet, jotka olivat negatiiviset viljelykokeissa, olivat 35 myös negatiivisia raitasarjakerroshybridisaatiotestissä.
71768 20
Esimerkki 2.
a) Cytomeqalovirus-raitasarjanukleiinihapporeagenssit ja niiden valmistus 05
Cytomegaloviruksen diagnostiikkaan sopivat DNA-fragmentit valmistettiin Cytomegaloviruksesta (AD 169, ATCC VR-538)-(CMV). DNA eristettiin ja hajoitettiin tunnetuin menetelmin. Noin 9000 emäksen mittainen EcoRI-fragmentti I, joka on mää-10 ritelty julkaisussa Spector et ai., J.Virol. 42, 558-582, 1982, eristettiin agaroosigeelistä sähkökentässä eluoimalla senjälkeen, kun EcoRl-restriktiofragmentit oli eroteltu toisistaan kokonsa perusteella. Eluoitu DNA ekstrahoitiin fenolilla, jonka jälkeen se saostettiin etanolilla. Näin 15 puhdistettu DNA liitettiin T4-ligaasin avulla EcoRI-entsyymin avulla avattuun pBR325-plasmidivektoriin, ja syntyneet yhdistelmä-DNA:t siirrettiin E.coli K12 HB101 isäntäbaktee-reihin. Ampisilliini- ja tetrasykliiniresistenteistä, mutta kloramfenikolille herkistä klooneista valittiin sellainen, 20 joka sisälsi oikean suuruisen cytomegalovirukselle spesifisen DNA-insertin. Kloonattu cytomegaloviruksen DNA:n luonne varmistettiin Southern blot-menetelmällä. Tämä testi varmisti, että kuvattu 9000 emäksen mittainen EcoRI-DNA-fragmentti oli cytomegaloviruksen DNA:sta peräisin ja tarkemmin sen 25 HindIII-D-fragmenttiin sisältyvä (Oram et ai., J. Gen.Virol., 59, 111-129, 1982). Näin kuvatulle yhdistelmäplasmidille annettiin nimeksi pKTH1271, ja se deponoitiin kantakokoelmaan Deutsche Sammlung von Mikroorganismen numerolla DSM 2826. Yhdistelmäplasmidi kasvatettiin ja puhdistettiin tunnettuja 30 menetelmiä hyväksi käyttäen.
Jatkokloonaukset suoritettiin tunnettujen menetelmien avulla käyttäen vektoreina pBR322-plasmidia ja Ml3mp7- ja Ml3mp8-faageja. Kuvassa 12 on esitetty hybridiplasmidi pKTHl271, 35 jonka molekulaarinen pituus on noin 9 kb:tä. Kuvassa 12 esitetyt raitasarjanukleiinihappofragmentit valmistettiin käyttäen restriktioentsyymejä EcoRI, BamHI, Clal ja Pstl. Kuvassa 12 on esitetty restriktioentsyymeillä aikaansaadut tl 21 71768 fragmentit ja niiden suhteellinen koko ja sijainti. Taulukossa 4 on lueteltu kyseisten fragmenttien koko ja jatkokloo-naukseen käytetyt vektorit näin aikaansaatujen yhdistelmä-plasmidien nimet ja niiden käyttö joko filtterireagensseina 05 tai leimattuina koettimina. Kuvassa 13 on esitetty raitasar-jakerroshybridi, joka muodostuu kun käytetään taulukossa 4 lueteltuja raitasarjanukleiinihappofragmentteja.
Taulukko 4.
10
Restriktiofragmentti Vektori Nimitys Käyttö 15 EcoRI-PstI (3.3kb) pBR322 PKTH1273 Filtteri a2 Clal-BamHl (3.0kb pBR322 pKTHl274 Filtteri b^ Pstl-PstI (0.6kb) Ml3mp7 mKTHl277 Leimattu koetin b2 Pstl-Clal (l.Okb) Ml3mp8 mKTHl278 Leimattu koetin bg BamHI-EcoRI (l.Okb) Ml3mp8 mKTHl279 Leimattu koetin 20 _ b) Cytomegaloviruksen raitasarjanukleiinihapporeagenssien herkkyyden osoittaminen kerroshybridisaatiomenetelmällä 25
Raitasarjanukleiinihapporeagenssien herkkyyttä verrattuna yhteen yhtenäiseen reagenssipariin tutkittiin kerroshybridi-saatiomenetelmällä. Näytteenä testeissä oli CMV-DNA, joka keitettiin 0.17 M NaOH:ssa 5 minuuttia ja sen jälkeen neut-30 raloitiin kuten esimerkissä Ib. Testissä käytettiin filttereitä, jotka kaikki sisälsivät 10^ molekyyliä sekä pKTH 1273(a^)- että pKTHl274(a2)-DNA:ta yksisäikeiseen muotoon saatettuna ja seuraavia taulukossa 4 lueteltuja koettimia mKTHl277(b1), mKTHl278(b2) ja mKTHl279(b3). Koettimet sisäl-35 sivät kukin 10® cpm/>ig DNArta. Hybridisaatio suoritettiin kuten esimerkissä Ib on kuvattu. Tulokset on esitetty taulukossa 5.
Taulukko 5.
22 71 768
Hybridi soitunut radioaktiivisuus, 05 Näyte _koettimena(b)__ molek/testi b^ b2 b3 b^,b2,b3 0 35 33 38 45_53_ 10 106 38 44 46 95 125 4xl06 85 135 142 205 292 1.6xl07 203 254 265 415 645 15 b^ 310.000 cpm/testi b2 320.000 cpm/testi b3 300.000 cpm/testi b^,b2 300.000 cpm kumpaakin/testi b^,b2,b3 300.000 cpm kutakin/testi 20_____
Testissä positiivisuuden alarajan arvo oli 51-55 cpm, kun koetin oli b^, b2 tai b3, 59 cpm kun koetin oli b^,b2 ja 63 cpm kun koetin oli b^,b2,b3· 25
Tulokset taulukossa 5 osoittavat, että kerroshybridisaatio, jossa on yksittäinen koetinreagenssi (b^,b2 tai b3), detektoi kussakin tapauksessa 4 x 106 CMV-DNA molekyyliä. Raitasarja-hybridisaatio b^,b2 tai b^,b2,b3 reagenssein detektoi sen 30 sijaan jo 10^ molekyyliä CMV-DNA:ta. Tulokset osoittavat, että raitasarjanukleiinihapporeagenssit ovat neljä kertaa herkemmät kuin yksittäiset nukleiinihapporeagenssit.
c) CMV-diagnostiikka raitasarjakerroshybridisaation avulla 35
Raitasarjahybridisaatioreagenssien avulla tutkittiin 71 768 23 kliinisiä näytteitä. Tällaisia olivat kaksi alle 1-vuotiaan lapsen virtsanäytettä. Näiden epäiltiin sairastavan synnynnäistä cytomegalotautia. Lisäksi tutkittiin yhden CMV-keuh-kotulehdusta sairastavan potilaan keuhkopala raitasarjaker-05 roshybridisaation avulla. Testissä käytettiin näytteenä myös cytomegaloviruksella infektoituja ihmisen sikiön soluja sekä infektoimattomia soluja.
10 ml virtsanäytteeseen lisättiin liuos, joka sisälsi 1 % 10 sarkosyyliä ja 5 mM EDTA:a ja 200 /ug vasikan thymuksen DNArta, jonka jälkeen viruksesta vapautunut DNA kantajan kera seostettiin 10 ml :11a isopropanolia huoneenlämmössä. DNA-sakka liuotettiin 200 /uljaan TE-puskuria ja saatettiin yk-sisäikeiseen muotoon keittämällä 5 min, jonka jälkeen DNA-15 liuos jäähdytettiin 0 °C:een ja lisättiin hybridisaatioliu-okseen.
3
Keuhkopala (muutama mm ) rikottiin mekaanisesti veitsen avulla, siihen lisättiin 200 /ui TE-puskuria, jossa oli 1 %:sta 20 SDS-liuosta ja 1 mg/ml proteinaasi K-entsyymiä. Digestio suoritettiin +37 °C:ssa 1 t, jonka jälkeen näyte vedettiin 2 kertaa ohuen neulan läpi ruiskuun. Näin homogenisoitu näyte keitettiin, jonka jälkeen se lisättiin testiin.
25 Cytomegaloviruksella infektoidut solut ja infektoimattomat solut hajotettiin SDS-, proteinaasi K-käsittelyllä, homogenisoitiin ja keitettiin kuten yllä.
Hybridisaatiotestissä reagensseina toimivat pKTHl273(a^) ja 30 pKTHl274(a2) filttereillä ja mKTHl277 ( bj_) , mKTHl278 ( b2 ) , mKTHl279(b3) koettimina, kutakin 200.000 cpm/reaktio. Muuten hybridisaatio, filttereiden pesu ja tulosten laskeminen tehtiin kuten on kuvattu esimerkissä Ib.
71 768 24
Raitasarjahybridisaatiotulokset käyvät ilmi taulukosta 6. Taulukko 6.
05 Hybridisoitunut Viruseristys Näyte_radioaktiivisuus_
Infektoidut 3521 Ei tehty solut (105) 10
Virtsa 1(10 ml) 243 CMV
Virtsa 2(10 ml) 3215 CMV
15 Terveen hlön virtsa (10 ml) 52 Ei tehty
Keuhkopala 535 CMV
20 Kontrolli- 5 solut 10 68 Ei tehty
Ei näytettä 65 Ei tehty 25
Tulokset taulukosta 6 osoittavat, että raitasarjanukleiini-happoreagenssien avulla on mahdollista osoittaa CMV erilaisista kliinisistä näytteistä kuten virtsasta, keuhkopaloista ja soluista.
30
Testi on spesifinen cytomegalovirukselle, se ei tunnista ihmisen DNA:ta. Sitä ei myöskään häiritse näytteen laatu.
Claims (6)
1. Nukleiinihappodiagnostiikassa käytettävät nukleiinihappo-reagenssit, tunnettu siitä, että ne koostuvat 05 kahdesta sarjasta pääasiallisesti vuorottelevia raitasarja-nukleiinihappofragmentteja, jotka eivät saa olla homologisia toisilleen ja jotka ovat peräisin yhdestä tai useammasta, tunnistettavalle nukleiinihapolle riittävän homologisesta nukleiinihaposta siten, että toinen sarjoista on leimattu ja 10 toinen on kiinnitetty kiinteään kantajaan ja kumpikin sarja sisältää vähintäin kaksi, edullisesti useampia fragmentteja.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset nukleiinihapporeagenssit, tunnettu siitä, että ne koostuvat joko erillisistä 15 tai yhteenliitetyistä raitasarjanukleiinihappofragmenteista.
3. Patenttivaatimusten 1-2 mukaiset nukleiinihapporeagenssit, tunnettu siitä, että ne koostuvat raitasarja-nukleiinihappofragmenteista, joissa joko on tai ei ole 20 vektoriperäisiä osia.
4. Patenttivaatimusten 1-3 mukaiset nukleiinihapporeagenssit käytettäväksi klamydiadiagnostiikassa, tunnettu siitä, että ne koostuvat rekombinanttiplasmidin pKTHl220 25 johdannaisista, jotka on jatkokloonattu pATl53-plasmidiin ja Ml3mp8-faagiin ja sisältävät Chlamydia trachomatis L2 bakteerin DNA:ta, jolloin rekombinanttiplasmidi pKTHl220 on transformoitu isäntään Escherichia coli K12 HB 101, ja rekombinanttiplasmidia pKTHl220 sisältävän isännän talletus-30 numero on DSM 2825.
5. Patenttivaatimusten 1-3 mukaiset nukleiinihapporeagenssit käytettäväksi Cytomegalovirus-diagnostiikassa, tunnettu siitä, että ne koostuvat rekombinantti- 35 plasmidin pKTHl271 johdannaisista, jotka on jatkokloonattu pBR322-plasmidiin ja faageihin Ml3mp7 ja Ml3mp8 ja sisältävät Cytomegaloviruksen AD169 DNA:ta, jolloin rekombinanttiplasmidi pKTHl271 on transformoitu isäntään Escherichia coli Kl2 71768 26 HB 101, ja rekombinanttiplasmidia pKTHl271 sisältävän isännän talletusnumero on DSM 2826.
6. Menetelmä patenttivaatimusten 1-5 mukaisten nukleiini-05 happoreagenssien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) eristetään valittu osoitettavaa nukleiinihappoa tunnistava, sopivan pituinen nukleiinihappo b) kloonataan näin valittu nukleiinihappo sopivaan vektoriin 10 c) hajotetaan näin saatu vektoriin kloonattu nukleiinihappo restriktioentsyymillä d) yhdistetään sopivat fragmentit kahdeksi raitasarjaksi sopivilla ligaaseilla e) jatkokloonataan raitasarjafragmentit, joko erillisinä tai 15 yhteenliitettyinä sopivissa vektoreissa, edullisesti eri sarjoihin kuuluvat fragmentit eri vektoreissa f) leimataan toiseen raitasarjaan kuuluvat joko erilliset tai yhteenliitetyt nukleiinihappofragmentit g) kiinnitetään toiseen raitasarjaan kuuluvat joko erilliset 20 tai yhteenliitetyt nukleiinihappofragmentit kiinteään kantajaan . tl 71 768 27
Priority Applications (22)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI840655A FI71768C (fi) | 1984-02-17 | 1984-02-17 | Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning. |
| ZA85511A ZA85511B (en) | 1984-02-17 | 1985-01-22 | Nucleic acid reagents,a method for their preparation and their use |
| US06/694,325 US4731325A (en) | 1984-02-17 | 1985-01-24 | Arrays of alternating nucleic acid fragments for hybridization arrays |
| IE202/85A IE57652B1 (en) | 1984-02-17 | 1985-01-29 | Improved nucleic acid reagents and methods for their preparation |
| AU38422/85A AU577568B2 (en) | 1984-02-17 | 1985-02-04 | Preparation of nucleic acid reagents having arrays of alternating nucleic acid fragments |
| IT19432/85A IT1183184B (it) | 1984-02-17 | 1985-02-07 | Reagenti acidi nucleici perfezionati e procedimenti per laloro preparazione |
| BE214463A BE901671A (fr) | 1984-02-17 | 1985-02-07 | Reactifs d'acide nucleique perfectionnes et procedes pour leur preparation. |
| DK198500589A DK174675B1 (da) | 1984-02-17 | 1985-02-08 | Nukleinsyrereagenser og fremgangsmåde til fremstilling deraf |
| CA000474112A CA1248895A (en) | 1984-02-17 | 1985-02-12 | Nucleic acid reagents, a method for their preparation and their use |
| LU85768A LU85768A1 (fr) | 1984-02-17 | 1985-02-12 | Reactifs d'acide nucleique perfectionnes et procedes pour leur preparation |
| NO850554A NO166543C (no) | 1984-02-17 | 1985-02-13 | Nukleinsyrereagenser og fremgangsmaate til deres fremstilling. |
| NL8500424A NL193663C (nl) | 1984-02-17 | 1985-02-14 | Werkwijze en kit voor het detecteren van een specifiek nucleïnezuur in een monster. |
| HU85570A HU194938B (en) | 1984-02-17 | 1985-02-15 | Process for preparing improved nucleinic acid reagents |
| CH725/85A CH671778A5 (fi) | 1984-02-17 | 1985-02-15 | |
| SE8500733A SE463103B (sv) | 1984-02-17 | 1985-02-15 | Nukleinsyrareagens bestaaende av minst tvaa serier av minst tvaa uppsaettningar nukleinsyrafragment vilka inte aer homologa till varandra samt saett foer dessas framstaellning |
| GB08503900A GB2156074B (en) | 1984-02-17 | 1985-02-15 | Improved nucleic acid reagents and methods for their preparation |
| JP60029207A JPS60188100A (ja) | 1984-02-17 | 1985-02-15 | 核酸試薬 |
| DE3505287A DE3505287C2 (de) | 1984-02-17 | 1985-02-15 | Verbesserte Nucleinsäure-Reagenzien und Verfahren zu ihrer Herstellung |
| AT0044185A AT394578B (de) | 1984-02-17 | 1985-02-15 | Verfahren zur herstellung von nucleinsaeure-reagenzien |
| FR858502188A FR2559783B1 (fr) | 1984-02-17 | 1985-02-15 | Reactifs d'acide nucleique perfectionnes et procedes pour leur preparation |
| SU853856877A SU1523053A3 (ru) | 1984-02-17 | 1985-02-15 | Способ идентификации вирусов и бактерий, основанный на сэндвич-гибридизации нуклеиновых кислот |
| RO117684A RO92633B (ro) | 1984-02-17 | 1985-02-18 | Metoda de preparare a unui reactiv pentru identificarea acizilor nucleici |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI840655A FI71768C (fi) | 1984-02-17 | 1984-02-17 | Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning. |
| FI840655 | 1984-02-17 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI840655A0 FI840655A0 (fi) | 1984-02-17 |
| FI840655A FI840655A (fi) | 1985-08-18 |
| FI71768B true FI71768B (fi) | 1986-10-31 |
| FI71768C FI71768C (fi) | 1987-02-09 |
Family
ID=8518568
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI840655A FI71768C (fi) | 1984-02-17 | 1984-02-17 | Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning. |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4731325A (fi) |
| JP (1) | JPS60188100A (fi) |
| AT (1) | AT394578B (fi) |
| AU (1) | AU577568B2 (fi) |
| BE (1) | BE901671A (fi) |
| CA (1) | CA1248895A (fi) |
| CH (1) | CH671778A5 (fi) |
| DE (1) | DE3505287C2 (fi) |
| DK (1) | DK174675B1 (fi) |
| FI (1) | FI71768C (fi) |
| FR (1) | FR2559783B1 (fi) |
| GB (1) | GB2156074B (fi) |
| HU (1) | HU194938B (fi) |
| IE (1) | IE57652B1 (fi) |
| IT (1) | IT1183184B (fi) |
| LU (1) | LU85768A1 (fi) |
| NL (1) | NL193663C (fi) |
| NO (1) | NO166543C (fi) |
| RO (1) | RO92633B (fi) |
| SE (1) | SE463103B (fi) |
| SU (1) | SU1523053A3 (fi) |
| ZA (1) | ZA85511B (fi) |
Families Citing this family (151)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1260372A (en) * | 1984-04-27 | 1989-09-26 | Elazar Rabbani | Hybridization method for the detection of genetic materials |
| US4725536A (en) * | 1985-09-19 | 1988-02-16 | Genetics Institute, Inc. | Reagent polynucleotide complex with multiple target binding regions, and kit and methods |
| US4876187A (en) * | 1985-12-05 | 1989-10-24 | Meiogenics, Inc. | Nucleic acid compositions with scissile linkage useful for detecting nucleic acid sequences |
| US4910300A (en) * | 1985-12-11 | 1990-03-20 | Chiron Corporation | Method for making nucleic acid probes |
| US4868105A (en) * | 1985-12-11 | 1989-09-19 | Chiron Corporation | Solution phase nucleic acid sandwich assay |
| US4882269A (en) * | 1985-12-13 | 1989-11-21 | Princeton University | Amplified hybridization assay |
| FI76119C (fi) * | 1986-02-27 | 1988-09-09 | Orion Yhtymae Oy | Kvantitativ bestaemning av nukleinsyramolekyler och reagensfoerpackning som anvaends vid foerfarandet. |
| US4925785A (en) * | 1986-03-07 | 1990-05-15 | Biotechnica Diagnostics, Inc. | Nucleic acid hybridization assays |
| WO1987006617A2 (en) * | 1986-05-01 | 1987-11-05 | Washington Research Foundation | Detection of a unique chlamydia strain associated with acute respiratory disease |
| US5281518A (en) * | 1986-05-01 | 1994-01-25 | Washington Research Foundation | Detection of a unique chlamydia strain associated with acute respiratory disease |
| US6270961B1 (en) * | 1987-04-01 | 2001-08-07 | Hyseq, Inc. | Methods and apparatus for DNA sequencing and DNA identification |
| US5202231A (en) | 1987-04-01 | 1993-04-13 | Drmanac Radoje T | Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes |
| US5359100A (en) * | 1987-10-15 | 1994-10-25 | Chiron Corporation | Bifunctional blocked phosphoramidites useful in making nucleic acid mutimers |
| US5124246A (en) * | 1987-10-15 | 1992-06-23 | Chiron Corporation | Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same |
| CA1339351C (en) * | 1987-10-15 | 1997-08-26 | Michael S. Urdea | Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same |
| AU622426B2 (en) * | 1987-12-11 | 1992-04-09 | Abbott Laboratories | Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization |
| GB8810400D0 (en) * | 1988-05-03 | 1988-06-08 | Southern E | Analysing polynucleotide sequences |
| US7811751B2 (en) * | 1988-05-03 | 2010-10-12 | Oxford Gene Technology Limited | Analysing polynucleotide sequences |
| US5700637A (en) * | 1988-05-03 | 1997-12-23 | Isis Innovation Limited | Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays |
| US6054270A (en) * | 1988-05-03 | 2000-04-25 | Oxford Gene Technology Limited | Analying polynucleotide sequences |
| EP0379559B1 (en) * | 1988-06-24 | 1996-10-23 | Amgen Inc. | Method and reagents for detecting nucleic acid sequences |
| US5185243A (en) * | 1988-08-25 | 1993-02-09 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Method for detection of specific nucleic acid sequences |
| WO1990008840A1 (en) * | 1989-02-03 | 1990-08-09 | Eastman Kodak Company | Nucleic acid test article and its use to detect a predetermined nucleic acid |
| US6416952B1 (en) | 1989-06-07 | 2002-07-09 | Affymetrix, Inc. | Photolithographic and other means for manufacturing arrays |
| US6040138A (en) * | 1995-09-15 | 2000-03-21 | Affymetrix, Inc. | Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays |
| US5143854A (en) | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
| US5800992A (en) | 1989-06-07 | 1998-09-01 | Fodor; Stephen P.A. | Method of detecting nucleic acids |
| US5424186A (en) | 1989-06-07 | 1995-06-13 | Affymax Technologies N.V. | Very large scale immobilized polymer synthesis |
| US6919211B1 (en) | 1989-06-07 | 2005-07-19 | Affymetrix, Inc. | Polypeptide arrays |
| US6551784B2 (en) | 1989-06-07 | 2003-04-22 | Affymetrix Inc | Method of comparing nucleic acid sequences |
| US5925525A (en) * | 1989-06-07 | 1999-07-20 | Affymetrix, Inc. | Method of identifying nucleotide differences |
| US6406844B1 (en) | 1989-06-07 | 2002-06-18 | Affymetrix, Inc. | Very large scale immobilized polymer synthesis |
| US5744101A (en) * | 1989-06-07 | 1998-04-28 | Affymax Technologies N.V. | Photolabile nucleoside protecting groups |
| US6346413B1 (en) | 1989-06-07 | 2002-02-12 | Affymetrix, Inc. | Polymer arrays |
| US6309822B1 (en) | 1989-06-07 | 2001-10-30 | Affymetrix, Inc. | Method for comparing copy number of nucleic acid sequences |
| US6955915B2 (en) * | 1989-06-07 | 2005-10-18 | Affymetrix, Inc. | Apparatus comprising polymers |
| US5232829A (en) * | 1989-09-29 | 1993-08-03 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes |
| US6506558B1 (en) | 1990-03-07 | 2003-01-14 | Affymetrix Inc. | Very large scale immobilized polymer synthesis |
| CA2039517C (en) * | 1990-04-03 | 2006-11-07 | David Segev | Dna probe signal amplification |
| US5071962A (en) * | 1990-05-31 | 1991-12-10 | The United State Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Nucleotide, deduced amino acid sequence, isolation and purification of heat-shock chlamydial proteins |
| EP0466367B1 (en) * | 1990-06-28 | 1995-08-23 | Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha | Process for detecting nucleic acid |
| US5645994A (en) * | 1990-07-05 | 1997-07-08 | University Of Utah Research Foundation | Method and compositions for identification of species in a sample using type II topoisomerase sequences |
| GB9020621D0 (en) * | 1990-09-21 | 1990-10-31 | Imp Cancer Res Tech | Identification of organisms |
| GB2262987A (en) * | 1990-09-21 | 1993-07-07 | Imp Cancer Res Tech | Identification of organisms |
| DE69132843T2 (de) * | 1990-12-06 | 2002-09-12 | Affymetrix, Inc. (N.D.Ges.D.Staates Delaware) | Identifizierung von Nukleinsäuren in Proben |
| US5437976A (en) * | 1991-08-08 | 1995-08-01 | Arizona Board Of Regents, The University Of Arizona | Multi-domain DNA ligands bound to a solid matrix for protein and nucleic acid affinity chromatography and processing of solid-phase DNA |
| US6048690A (en) * | 1991-11-07 | 2000-04-11 | Nanogen, Inc. | Methods for electronic fluorescent perturbation for analysis and electronic perturbation catalysis for synthesis |
| US6652808B1 (en) * | 1991-11-07 | 2003-11-25 | Nanotronics, Inc. | Methods for the electronic assembly and fabrication of devices |
| US5605662A (en) * | 1993-11-01 | 1997-02-25 | Nanogen, Inc. | Active programmable electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics |
| US5632957A (en) * | 1993-11-01 | 1997-05-27 | Nanogen | Molecular biological diagnostic systems including electrodes |
| US6051380A (en) * | 1993-11-01 | 2000-04-18 | Nanogen, Inc. | Methods and procedures for molecular biological analysis and diagnostics |
| US6017696A (en) * | 1993-11-01 | 2000-01-25 | Nanogen, Inc. | Methods for electronic stringency control for molecular biological analysis and diagnostics |
| US5849486A (en) * | 1993-11-01 | 1998-12-15 | Nanogen, Inc. | Methods for hybridization analysis utilizing electrically controlled hybridization |
| US6569382B1 (en) | 1991-11-07 | 2003-05-27 | Nanogen, Inc. | Methods apparatus for the electronic, homogeneous assembly and fabrication of devices |
| US5556961A (en) * | 1991-11-15 | 1996-09-17 | Foote; Robert S. | Nucleosides with 5'-O-photolabile protecting groups |
| US6849462B1 (en) | 1991-11-22 | 2005-02-01 | Affymetrix, Inc. | Combinatorial strategies for polymer synthesis |
| US6468740B1 (en) | 1992-11-05 | 2002-10-22 | Affymetrix, Inc. | Cyclic and substituted immobilized molecular synthesis |
| US5677195A (en) | 1991-11-22 | 1997-10-14 | Affymax Technologies N.V. | Combinatorial strategies for polymer synthesis |
| US6943034B1 (en) * | 1991-11-22 | 2005-09-13 | Affymetrix, Inc. | Combinatorial strategies for polymer synthesis |
| JPH07502414A (ja) * | 1991-12-23 | 1995-03-16 | バイエル コーポレイション | 溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイに用いるためのクラミジアプローブ |
| JPH07502655A (ja) * | 1991-12-23 | 1995-03-23 | バイエル コーポレイション | 溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイに用いるためのｃｍｖプローブ |
| US5583211A (en) * | 1992-10-29 | 1996-12-10 | Beckman Instruments, Inc. | Surface activated organic polymers useful for location - specific attachment of nucleic acids, peptides, proteins and oligosaccharides |
| US7713528B1 (en) | 1993-02-18 | 2010-05-11 | Enzo Therapeutics, Inc. | Method for in vivo delivery of active compounds using reagent conjugate |
| WO1995003401A1 (en) * | 1993-07-23 | 1995-02-02 | Hyseq, Inc. | Method for screening unknown organisms |
| FR2710075B1 (fr) * | 1993-09-15 | 1995-10-27 | Bio Merieux | Réactif et procédé pour la détection d'une séquence nucléotidique avec amplification de signal. |
| US6225059B1 (en) | 1993-11-01 | 2001-05-01 | Nanogen, Inc. | Advanced active electronic devices including collection electrodes for molecular biological analysis and diagnostics |
| US6315953B1 (en) | 1993-11-01 | 2001-11-13 | Nanogen, Inc. | Devices for molecular biological analysis and diagnostics including waveguides |
| US6254827B1 (en) | 1993-11-01 | 2001-07-03 | Nanogen, Inc. | Methods for fabricating multi-component devices for molecular biological analysis and diagnostics |
| US6375899B1 (en) | 1993-11-01 | 2002-04-23 | Nanogen, Inc. | Electrophoretic buss for transport of charged materials in a multi-chamber system |
| US7314708B1 (en) | 1998-08-04 | 2008-01-01 | Nanogen, Inc. | Method and apparatus for electronic synthesis of molecular structures |
| US6319472B1 (en) | 1993-11-01 | 2001-11-20 | Nanogen, Inc. | System including functionally separated regions in electrophoretic system |
| US20040077074A1 (en) * | 1993-11-01 | 2004-04-22 | Nanogen, Inc. | Multi-chambered analysis device |
| US7172864B1 (en) | 1993-11-01 | 2007-02-06 | Nanogen | Methods for electronically-controlled enzymatic reactions |
| US7582421B2 (en) * | 1993-11-01 | 2009-09-01 | Nanogen, Inc. | Methods for determination of single nucleic acid polymorphisms using a bioelectronic microchip |
| US6287517B1 (en) | 1993-11-01 | 2001-09-11 | Nanogen, Inc. | Laminated assembly for active bioelectronic devices |
| US6331274B1 (en) | 1993-11-01 | 2001-12-18 | Nanogen, Inc. | Advanced active circuits and devices for molecular biological analysis and diagnostics |
| US6638482B1 (en) | 1993-11-01 | 2003-10-28 | Nanogen, Inc. | Reconfigurable detection and analysis apparatus and method |
| US6068818A (en) | 1993-11-01 | 2000-05-30 | Nanogen, Inc. | Multicomponent devices for molecular biological analysis and diagnostics |
| US7101661B1 (en) | 1993-11-01 | 2006-09-05 | Nanogen, Inc. | Apparatus for active programmable matrix devices |
| US6309602B1 (en) | 1993-11-01 | 2001-10-30 | Nanogen, Inc. | Stacked, reconfigurable system for electrophoretic transport of charged materials |
| US6726880B1 (en) | 1993-11-01 | 2004-04-27 | Nanogen, Inc. | Electronic device for performing active biological operations and method of using same |
| US6287850B1 (en) * | 1995-06-07 | 2001-09-11 | Affymetrix, Inc. | Bioarray chip reaction apparatus and its manufacture |
| DE69527585T2 (de) * | 1994-06-08 | 2003-04-03 | Affymetrix, Inc. | Verfahren und Vorrichtung zum Verpacken von Chips |
| US7323298B1 (en) | 1994-06-17 | 2008-01-29 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Microarray for determining the relative abundances of polynuceotide sequences |
| US5807522A (en) * | 1994-06-17 | 1998-09-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for fabricating microarrays of biological samples |
| US7378236B1 (en) | 1994-06-17 | 2008-05-27 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Method for analyzing gene expression patterns |
| US6306657B1 (en) * | 1994-06-28 | 2001-10-23 | Kalyx Biosciences, Inc. | Polynucleotide probe and kit for amplifying signal detection in hybridization assays |
| US7857957B2 (en) * | 1994-07-07 | 2010-12-28 | Gamida For Life B.V. | Integrated portable biological detection system |
| US6403367B1 (en) | 1994-07-07 | 2002-06-11 | Nanogen, Inc. | Integrated portable biological detection system |
| US6121048A (en) * | 1994-10-18 | 2000-09-19 | Zaffaroni; Alejandro C. | Method of conducting a plurality of reactions |
| US8236493B2 (en) * | 1994-10-21 | 2012-08-07 | Affymetrix, Inc. | Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA |
| US6720149B1 (en) * | 1995-06-07 | 2004-04-13 | Affymetrix, Inc. | Methods for concurrently processing multiple biological chip assays |
| US20040086917A1 (en) * | 1995-09-27 | 2004-05-06 | Nanogen, Inc. | Methods for electronic fluorescent perturbation for analysis and electronic perturbation catalysis for synthesis |
| EP0880598A4 (en) | 1996-01-23 | 2005-02-23 | Affymetrix Inc | RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM |
| US6706473B1 (en) | 1996-12-06 | 2004-03-16 | Nanogen, Inc. | Systems and devices for photoelectrophoretic transport and hybridization of oligonucleotides |
| US20020042048A1 (en) | 1997-01-16 | 2002-04-11 | Radoje Drmanac | Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species |
| US6297006B1 (en) | 1997-01-16 | 2001-10-02 | Hyseq, Inc. | Methods for sequencing repetitive sequences and for determining the order of sequence subfragments |
| US6309824B1 (en) | 1997-01-16 | 2001-10-30 | Hyseq, Inc. | Methods for analyzing a target nucleic acid using immobilized heterogeneous mixtures of oligonucleotide probes |
| US6326489B1 (en) | 1997-08-05 | 2001-12-04 | Howard Hughes Medical Institute | Surface-bound, bimolecular, double-stranded DNA arrays |
| DE19741715A1 (de) | 1997-09-22 | 1999-03-25 | Hoechst Ag | Pentopyranosyl-Nucleosid, seine Herstellung und Verwendung |
| US6511803B1 (en) | 1997-10-10 | 2003-01-28 | President And Fellows Of Harvard College | Replica amplification of nucleic acid arrays |
| WO1999019341A1 (en) | 1997-10-10 | 1999-04-22 | President & Fellows Of Harvard College | Replica amplification of nucleic acid arrays |
| US6485944B1 (en) | 1997-10-10 | 2002-11-26 | President And Fellows Of Harvard College | Replica amplification of nucleic acid arrays |
| EP1021558A1 (en) | 1997-10-10 | 2000-07-26 | President And Fellows Of Harvard College | Surface-bound, double-stranded dna protein arrays |
| BR9814271A (pt) * | 1997-12-12 | 2001-03-20 | Digene Corp | Determinação de doenças relacionadas com o vìrus do papiloma humano |
| US6355419B1 (en) | 1998-04-27 | 2002-03-12 | Hyseq, Inc. | Preparation of pools of nucleic acids based on representation in a sample |
| US6232067B1 (en) * | 1998-08-17 | 2001-05-15 | The Perkin-Elmer Corporation | Adapter directed expression analysis |
| US6545264B1 (en) | 1998-10-30 | 2003-04-08 | Affymetrix, Inc. | Systems and methods for high performance scanning |
| US7612020B2 (en) | 1998-12-28 | 2009-11-03 | Illumina, Inc. | Composite arrays utilizing microspheres with a hybridization chamber |
| WO2000056934A1 (en) * | 1999-03-24 | 2000-09-28 | Packard Bioscience Company | Continuous porous matrix arrays |
| WO2000058522A1 (en) * | 1999-03-30 | 2000-10-05 | Nanogen, Inc. | Single nucleotide polymorphic discrimination by electronic dot blot assay on semiconductor microchips |
| WO2000066265A2 (en) | 1999-04-27 | 2000-11-09 | Ciphergen Biosystems, Inc. | Probes for a gas phase ion spectrometer |
| US20030096321A1 (en) * | 1999-05-19 | 2003-05-22 | Jose Remacle | Method for the identification and/or the quantification of a target compound obtained from a biological sample upon chips |
| EP1054259A1 (en) * | 1999-05-19 | 2000-11-22 | Remacle, José | Method for the identification of a target compound |
| US6465183B2 (en) * | 1999-07-01 | 2002-10-15 | Agilent Technologies, Inc. | Multidentate arrays |
| JP2001017166A (ja) * | 1999-07-02 | 2001-01-23 | Fuji Photo Film Co Ltd | Ｄｎａチップ、ｄｎａチップの検定キットおよびｄｎａチップの検定法 |
| US6428957B1 (en) | 1999-11-08 | 2002-08-06 | Agilent Technologies, Inc. | Systems tools and methods of assaying biological materials using spatially-addressable arrays |
| US6235483B1 (en) | 2000-01-31 | 2001-05-22 | Agilent Technologies, Inc. | Methods and kits for indirect labeling of nucleic acids |
| US8076063B2 (en) | 2000-02-07 | 2011-12-13 | Illumina, Inc. | Multiplexed methylation detection methods |
| US7582420B2 (en) | 2001-07-12 | 2009-09-01 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
| US7955794B2 (en) | 2000-09-21 | 2011-06-07 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
| US6455007B1 (en) * | 2000-06-13 | 2002-09-24 | Symyx Technologies, Inc. | Apparatus and method for testing compositions in contact with a porous medium |
| US7601497B2 (en) | 2000-06-15 | 2009-10-13 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method |
| US7439016B1 (en) | 2000-06-15 | 2008-10-21 | Digene Corporation | Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method |
| US6905816B2 (en) * | 2000-11-27 | 2005-06-14 | Intelligent Medical Devices, Inc. | Clinically intelligent diagnostic devices and methods |
| EP1373573B1 (en) * | 2001-03-09 | 2013-10-02 | TrovaGene, Inc. | Conjugate probes and optical detection of analytes |
| EP2246438B1 (en) | 2001-07-12 | 2019-11-27 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
| US6893822B2 (en) | 2001-07-19 | 2005-05-17 | Nanogen Recognomics Gmbh | Enzymatic modification of a nucleic acid-synthetic binding unit conjugate |
| US7601493B2 (en) * | 2002-07-26 | 2009-10-13 | Nanogen, Inc. | Methods and apparatus for screening and detecting multiple genetic mutations |
| US20040241659A1 (en) * | 2003-05-30 | 2004-12-02 | Applera Corporation | Apparatus and method for hybridization and SPR detection |
| US7622281B2 (en) | 2004-05-20 | 2009-11-24 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and compositions for clonal amplification of nucleic acid |
| US7828954B2 (en) * | 2004-09-21 | 2010-11-09 | Gamida For Life B.V. | Electrode based patterning of thin film self-assembled nanoparticles |
| US7314542B2 (en) * | 2004-09-23 | 2008-01-01 | Nanogen, Inc. | Methods and materials for optimization of electronic transportation and hybridization reactions |
| US20060246576A1 (en) * | 2005-04-06 | 2006-11-02 | Affymetrix, Inc. | Fluidic system and method for processing biological microarrays in personal instrumentation |
| JP5187847B2 (ja) | 2005-05-06 | 2013-04-24 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | 核酸標的の捕獲方法 |
| US20090305902A1 (en) * | 2005-12-12 | 2009-12-10 | The Johns Hopkins University | Double-Tiled and Multi-Tiled Arrays and Methods Thereof |
| AU2006342447B2 (en) | 2005-12-28 | 2013-06-20 | Translational Therapeutics, Inc | Translational dysfunction based therapeutics |
| US20080003667A1 (en) * | 2006-05-19 | 2008-01-03 | Affymetrix, Inc. | Consumable elements for use with fluid processing and detection systems |
| AU2007320026B2 (en) | 2006-09-29 | 2014-04-03 | Translational Therapeutics, Inc. | eIF4E regulon-based diagnostics |
| EP1912067A1 (en) * | 2006-10-12 | 2008-04-16 | Eppendorf Array Technologies S.A. | Method for quantification of a target compound obtained from a biological sample upon chips |
| US9938641B2 (en) * | 2006-12-18 | 2018-04-10 | Fluidigm Corporation | Selection of aptamers based on geometry |
| WO2008085777A2 (en) * | 2007-01-03 | 2008-07-17 | Xgenetics Inc. | A method for early detection of cancer |
| CA2741650C (en) * | 2008-10-27 | 2017-09-05 | Qiagen Gaithersburg Inc. | Fast results hybrid capture assay and system |
| CA2750338C (en) * | 2009-01-28 | 2019-06-25 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Sequence-specific large volume sample preparation method and assay |
| WO2010127228A1 (en) * | 2009-05-01 | 2010-11-04 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | A non-target amplification method for detection of rna splice-forms in a sample |
| CA2773320C (en) | 2009-09-14 | 2018-02-20 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Compositions and methods for recovery of nucleic acids or proteins from tissue samples fixed in cytology media |
| ES2615728T3 (es) | 2010-01-29 | 2017-06-08 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Métodos y composiciones para una purificación y un análisis múltiple específico de secuencia de ácidos nucleicos |
| CA2787781A1 (en) | 2010-01-29 | 2011-08-04 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Method of determining and confirming the presence of an hpv in a sample |
| US9422593B2 (en) | 2010-05-19 | 2016-08-23 | Qiagen Gaithresburg, Inc | Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids |
| AU2011258501B2 (en) | 2010-05-25 | 2016-07-07 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Fast results hybrid capture assay and associated strategically-truncated probes |
| JP2014511182A (ja) | 2011-02-24 | 2014-05-15 | キアゲン ガイサーズバーグ アイエヌシー． | Ｈｐｖ核酸を検出するための材料及び方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4366246A (en) * | 1977-11-08 | 1982-12-28 | Genentech, Inc. | Method for microbial polypeptide expression |
| US4293652A (en) * | 1979-05-25 | 1981-10-06 | Cetus Corporation | Method for synthesizing DNA sequentially |
| FI63596C (fi) * | 1981-10-16 | 1983-07-11 | Orion Yhtymae Oy | Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser |
| GB8306426D0 (en) * | 1983-03-09 | 1983-04-13 | Malcolm A D B | Detecting polynucleotide sequence |
| CA1260372A (en) * | 1984-04-27 | 1989-09-26 | Elazar Rabbani | Hybridization method for the detection of genetic materials |
| US4563417A (en) * | 1984-08-31 | 1986-01-07 | Miles Laboratories, Inc. | Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes |
-
1984
- 1984-02-17 FI FI840655A patent/FI71768C/fi not_active IP Right Cessation
-
1985
- 1985-01-22 ZA ZA85511A patent/ZA85511B/xx unknown
- 1985-01-24 US US06/694,325 patent/US4731325A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-01-29 IE IE202/85A patent/IE57652B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-02-04 AU AU38422/85A patent/AU577568B2/en not_active Expired
- 1985-02-07 IT IT19432/85A patent/IT1183184B/it active
- 1985-02-07 BE BE214463A patent/BE901671A/fr not_active IP Right Cessation
- 1985-02-08 DK DK198500589A patent/DK174675B1/da not_active IP Right Cessation
- 1985-02-12 CA CA000474112A patent/CA1248895A/en not_active Expired
- 1985-02-12 LU LU85768A patent/LU85768A1/fr unknown
- 1985-02-13 NO NO850554A patent/NO166543C/no not_active IP Right Cessation
- 1985-02-14 NL NL8500424A patent/NL193663C/nl not_active IP Right Cessation
- 1985-02-15 AT AT0044185A patent/AT394578B/de not_active IP Right Cessation
- 1985-02-15 GB GB08503900A patent/GB2156074B/en not_active Expired
- 1985-02-15 HU HU85570A patent/HU194938B/hu unknown
- 1985-02-15 SU SU853856877A patent/SU1523053A3/ru active
- 1985-02-15 FR FR858502188A patent/FR2559783B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1985-02-15 JP JP60029207A patent/JPS60188100A/ja active Granted
- 1985-02-15 DE DE3505287A patent/DE3505287C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-02-15 SE SE8500733A patent/SE463103B/sv not_active IP Right Cessation
- 1985-02-15 CH CH725/85A patent/CH671778A5/de not_active IP Right Cessation
- 1985-02-18 RO RO117684A patent/RO92633B/ro unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI71768B (fi) | Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning | |
| US4563419A (en) | Detection of microbial nucleic acids by a one-step sandwich hybridization test | |
| US4900659A (en) | Nucleotide sequence composition and method for detection of Neisseria gonorrhoeae and method for screening for a nucleotide sequence that is specific for a genetically distinct group | |
| US4992364A (en) | Probe for DNA and a process for the detection of "Shigellae" and entero-invasive strains of Escherichia coli | |
| EP0232085B1 (en) | Campylobacter probe | |
| US4866167A (en) | Detection of human oral cells by nucleic acid hybridization | |
| Hyypiä | Detection of adenovirus in nasopharyngeal specimens by radioactive and nonradioactive DNA probes | |
| US5691138A (en) | Nucleotide sequences which hybridize specifically with a Campylobacter jejuni genomic nucleic sequence | |
| US5489513A (en) | Specific gene probes and processes for the diagnostic investigation of Candida albicans | |
| CA2147618C (en) | Probe for diagnosing of infectious diseases | |
| Pettersson et al. | Nucleic acid hybridization—an alternative tool in diagnostic microbiology | |
| Casebolt et al. | Monoclonal antibody solution hybridization assay for detection of mouse hepatitis virus infection | |
| US5693530A (en) | Marek's disease virus nucleotide sequence and methods of use | |
| CN102719519B (zh) | 用于检测Ⅰ型新德里金属β-内酰胺酶基因的组合物和试剂盒 | |
| CA1340100C (en) | Polynucleotide commposition and method | |
| Zhou et al. | Application of a biotin-labelled DNA probe to detect Campylobacter | |
| KR20230085763A (ko) | 랄스토니아 시지키의 특이적 프라이머 세트 및 이를 이용한 랄스토니아 시지키의 검출방법 | |
| Roy | Use of nucleic acid probes in diagnosis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: SANGTEC MEDICAL AB |
|
| MA | Patent expired |
Owner name: SANGTEC MOLECULAR DIAGNOSTICS AB |