DE3505287C2 - Verbesserte Nucleinsäure-Reagenzien und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Verbesserte Nucleinsäure-Reagenzien und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number
DE3505287C2
DE3505287C2 DE3505287A DE3505287A DE3505287C2 DE 3505287 C2 DE3505287 C2 DE 3505287C2 DE 3505287 A DE3505287 A DE 3505287A DE 3505287 A DE3505287 A DE 3505287A DE 3505287 C2 DE3505287 C2 DE 3505287C2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
nucleic acid
fragments
series
dna
rows
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE3505287A
Other languages
English (en)
Other versions
DE3505287A1 (de
Inventor
Airi Marjatta Palva
Tuula Marjut Ranki
Hans Erik Soederlund
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SANGTEC MEDICAL AB, BROMMA, SE
Original Assignee
Orion Yhtyma Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Orion Yhtyma Oy filed Critical Orion Yhtyma Oy
Publication of DE3505287A1 publication Critical patent/DE3505287A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE3505287C2 publication Critical patent/DE3505287C2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Description

Die Erfindung betrifft verbesserte Nucleinsäure-Reagenzien, die mindestens eine Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten enthalten, und Zusammenstellungen solcher verbesserter Reagenzien. Außer­ dem betrifft die Erfindung gentechnologische Herstellungs­ verfahren der Nucleinsäure-Reagenzien, die mindestens eine Reihe von Klonen enthalten, und DNA-Rekombinationsverfahren zur Her­ stellung von Kombinationen solcher Nucleinsäure-Reagenzien. Schließlich betrifft die Erfindung die Verwendung der Nuclein­ säure-Reagenzien zur Identifizierung von Nucleinsäuren durch Hybridisierungs-Verfahren.
Verschiedene Hybridisierungs-Verfahren wurden bereits für die Identifizierung und die Untersuchung von Nucleinsäuren angewendet. Einige Beispiele sind die direkten Hybridisie­ rungs-Verfahren, bei denen die die zu identifzierende Nuclein­ säure enthaltende Probe entweder in einer Lösung (Brautigam et al., J. Clin. Microbiol. 12, 226-234 (1980) und GB-OS 20 19 408) oder an einen festen Träger gebunden vor­ liegt (US-PSen 41 39 346, 43 02 204, 43 58 535, 43 95 486, GB-OSen 20 34 323, 20 95 833, EP-A-62 286, 62 237 und 61 740) und mit einem markierten Nucleinsäure- Reagenz nachgewiesen wird, das mit der zu identifizierenden Nucleinsäure hybridisiert.
Zu weiteren bekannten Hybridisierungs-Verfahren gehören das zweistufige "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahren von Dunn und Hassell (Cell 12, 23-36 (1977)) und die einstufigen "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahren der EP-A-79 139. Bei der Identifizierung von Nucleinsäuren durch die "Sandwich"- Verfahren werden zwei getrennte Nucleinsäure-Reagenzien zum Nachweis der Nucleinsäuren in der Probenlösung benötigt. Eines dieser Reagenzien ist an ein festes Trägermaterial ge­ bunden, das andere ist markiert. Sowohl die Nucleinsäure- Reagenzien, die an das feste Trägermaterial gebunden sind, als auch die, die markiert sind, sind dadurch gekennzeich­ net, daß ihre Nucleotidsequenz komplementär oder nahezu komplementär zu der der zu identifizierenden Nucleinsäure ist, d. h. sie ist homolog. Die verwendeten Nucleinsäure-Reagenzien sind entweder natür­ liche Nucleinsäuren oder Fragmente von diesen. Die Fragmente werden beispielsweise mit Restriktionsenzymen hergestellt. Nucleinsäure-Reagenzien wurden auch bereits synthetisch oder mit Hilfe von DNA-Rekombinations-Verfahren hergestellt. Auch natürliche Plasmide (US-PS 43 58 535), Nucleinsäuren aus Bakteriophagen (US-PS 45 43 535), Ribosomale-RNA und Boten-RNA (US-PS 3 02 204) oder Nucleinsäuren aus verschie­ denen Viren (Stålhandske et al., curr. top. Microbiol. Virol. 104 (1983)) wurden bereits als Nucleinsäure-Reagen­ zien verwendet. Das gesamte Virus-Genom wurde beispielswei­ se bereits zur Identifizierung der Anteile verschiede­ ner Viren in der mRNA eines Hybrid-Virus verwendet (Dunn und Hassell, Cell 12, 23-36 (1977)). Ebenso wurden Nu­ cleinsäure-Reagenzien bereits mit DNA-Rekombinationsver­ fahren hergestellt (US-PS 43 95 486 und 43 95 535, EP-A- 79 139 und GB-OS 20 34 323 sowie EP-A-62 286). Mit DNA- Rekombinations-Verfahren hergestellte Nucleinsäure-Rea­ genzien wurden entweder als definierte, aus dem Vektor herausgeschnittene und von dessen DNA abgetrennte DNA-Frag­ mente oder als rekombinante DNA-Moleküle, also verbunden mit verschiedenen Vektoren, hergestellt. Die im Stand der Technik verwendeten, mit DNA-Rekombinations-Verfahren hergestellten Nucleinsäure-Reagenzien bestehen aus einem kontinuierlichen, zur Identifizierung verwendeten Nucleinsäure-Fragment oder aus verschiedenen getrennten Klonen.
Erfindungsgemäß wurden neue, empfindlichere Nucleinsäure- Reagenzien entwickelt, die mindestens eine "Reihe" von Nu­ cleinsäure-Fragmenten enthalten, die aus zu der zu iden­ tifizierenden Nucleinsäure homologen DNA-Segmenten gewonnen werden. Aus verschiedenen zu der zu identifizierenden Nuclein­ säure homologen DNA-Sequenzen gewonnene Reihe von Fragmen­ ten können zu einer "Serie" zusammengestellt werden, wobei die einzelnen Fragmente ganz oder zum Teil miteinander ver­ bunden werden können. Das Nucleinsäure- Reagenz der Erfindung enthält mindestens zwei derartige Serien, wobei die Fragmente der Serien nicht miteinander hybridisieren.
Nucleinsäure-Reagenzien, die solche Reihen von Nucleinsäu­ re-Fragmenten enthalten, sind bei "Sandwich"-Hybridisie­ rungs-Verfahren mindestens doppelt so empfindlich wie die im Stand der Technik verwendeten Nucleinsäure-Reagenzien. Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäure-Reagenzien oder ihrer Kombinationen ist es möglich, geringere Nuclein­ säure-Mengen als früher nachzuweisen und sie sind besonders gut für "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahren geeignet.
Die höhere Empfindlichkeit der erfindungsgemäßen Nuclein­ säure-Reagenzien bei "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahren beruht teilweise darauf, daß die Verwendung verschiedener Sondenmoleküle die Menge der markierten Hybride auf dem fe­ sten Trägermaterial erhöht. Jedes hybridisierende Sonden­ molekül kann auch vom Vektor abgeleitete markierte Nuclein­ säure enthalten (Fig. 1 und 2). In Fig. 1 und 2 ist Vektor- DNA mit v gekennzeichnet, die zu identifizierende Nucleinsäure mit x, die markierte Probe mit b, das an das feste Trägermaterial gebundene identifizierende Nuclein­ säure-Reagens mit a und der Filter mit F. Wenn mehrere Son­ denmoleküle verwendet werden, steigt die Menge markierter, vom Vektor abgeleiteter Nucleinsäure-Anteile und mehr Mar­ kierung wird an die sich bildenden Hybride gebunden. Deshalb sind die Hybride leichter nachzuweisen.
Wenn die Reihe der erfindungsgemäßen Nucleinsäure-Fragmente bei "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahren verwendet wird, werden mindestens zwei oder, wie in Fig. 1 abgebildet, drei identi­ fizierende Nucleinsäure-Fragmente an das feste Trägermaterial gebunden. Je nach Ausmaß der Reaktion können in diesem Fall verschiedene Bereiche des nachzuweisenden Nucleinsäure-Stran­ ges x an die an das feste Trägermaterial gebundenen Nuclein­ säure-Fragmente, beispielsweise a₁, a₂ und a₃, an einem oder mehreren Stellen hybridisieren. Wenn die Reaktion ihr End­ stadium erreicht, kann eine Situation, wie sie in Fig. 1 be­ schrieben ist, vorliegen. Dabei bildet der nachzuweisende Strang eine oder mehrere Schleifen an die ein oder mehrere Sondenmoleküle hybridisieren, in Fig. 1 sind dies beispiels­ weise b₁ und b₂. Zu diesem Zeitpunkt nimmt die Entfernung von vom Vektor abgeleiteten Nucleinsäure-Bereichen vom Hy­ bridisierungs-Verbindungs-Punkt (1) (Fig. 1) ab und das Hy­ brid ist stabiler als ein aus einem Reagenz-Paar gebildetes (Stand der Technik, Fig. 2). Das einzelne Reagenz-Paar- Hybrid hat dabei die gleiche Größe wie der Gesamtbereich der Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten. Die Vektorbereiche des aus einem Reagenz-Paar gebildeten Hybrids werden beispiels­ weise durch mechanische Beanspruchung (z. B. Schütteln) leicht zerstört. Dabei wird die bereits an das Hybrid gebundene Mar­ kierung freigesetzt.
Da die verbesserten erfindungsgemäßen Nucleinsäure-Reagen­ zien empfindlicher sind als die im Stand der Technik ver­ wendeten Nucleinsäure-Reagenzien, sind sie zum Nachweis von Chromosomen-Umlagerungen und von Erbkrankheiten geeignet.
Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäure-Reagenzien aus mindestens einer Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten, ihre Kombina­ tionen, ihre Herstellung und ihre Verwendung zum Nachweis von Nucleinsäuren bei Hybridisierungs-Verfahren.
Die Beispiele und Zeichnungen erläutern die Erfindung.
Fig. 1 zeigt eine Reihe von "Sandwich"-Hybriden.
Fig. 2 zeigt ein "Sandwich"-Hybrid, das aus dem Stand der Technik bekannt ist,
Fig. 3 zeigt die Bereiche von alternierenden Abschnitten einer Nucleinsäure, die für die Herstellung von zwei Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten (für zwei verschiedene Serien) ausgewählt wurde.
Fig. 4 zeigt die entsprechenden Bereiche von Abschnitten für die Herstellung von drei Reihen von Nucleinsäure- Fragmenten (für drei verschiedene Serien).
Fig. 5 zeigt die in Fig. 3 beschriebenen Reihen von Nu­ cleinsäure-Fragmenten, die getrennt (a), miteinan­ der verbunden (b) und sowohl getrennt als auch mit­ einander verbunden (c) vorliegen.
Fig. 6 zeigt verschiedene Ausführungen von "Sandwich"- Hybriden.
Fig. 6a zeigt ein "Sandwich"-Hybrid, das bei der Verwendung getrennter b-Fragmente entsteht,
Fig. 6b zeigt ein "Sandwich"-Hybrid, das bei Verwendung ver­ bundener b-Fragmente entsteht und
Fig. 6c zeigt ein "Sandwich"-Hybrid, das bei Verwendung so­ wohl getrennter als auch verbundener b-Fragmente ent­ steht.
Fig. 7 zeigt eine aus drei Reihen bestehende Serie von Nucleinsäure-Fragmenten zur Identifizierung verschie­ dener Nucleinsäuren.
Fig. 8 zeigt "Sandwich"-Hybride, die bei Verwendung der in Fig. 7 beschriebenen, verschiedene Nucleinsäuren identifizierenden Serie von Nucleinsäure-Fragmenten entstehen.
Fig. 9 zeigt Hybride, die bei direkter Hybridisierung ent­ stehen.
Fig. 10 zeigt das rekombinante Plasmid pKTH 1220.
Fig. 11 zeigt ein "Sandwich"-Hybrid, das bei Verwendung einer Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten aus dem re­ kombinanten Plasmid pKTH 1220 entsteht.
Fig. 12 zeigt das rekombinante Plasmid pKTH 1271.
Fig. 13 zeigt ein "Sandwich"-Hybrid, das bei der Verwendung von Nucleinsäure-Fragmenten des rekombinanten Plas­ mids pKTH H1271 entsteht.
Die Erfindung betrifft Nucleinsäure-Reagenzien, welche mindestens eine Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten enthalten. Vorzugsweise umfas­ sen die Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten mindestens zwei, vor­ zugsweise jedoch mehrere (bis zu zwanzig), alternierende Nucleinsäure-Fragmente, die sich von einer oder mehreren Nucleinsäuren ableiten, welche homolog genug zur zu identi­ fizierenden Nucleinsäure sind. Dabei erhält man mindestens zwei Serien alternierender Reihen von Nucleinsäure-Fragmen­ ten, die nicht zueinander homolog sein dürfen.
Die Reihen von Nucleinsäure-Reagenzien können synthetisch hergestellt werden. In diesem Fall dürfen die Fragmente der beiden alternierenden Serien von Reihen von Nucleinsäure- Fragmenten nicht miteinander homolog sein. Sie müssen jedoch ausreichend homolog zu alternierenden Bereichen in den zu identifizierenden Nucleinsäuren sein. Diese Fragmente kön­ nen leicht durch vollautomatische Maschinen nach der Charak­ terisierung der Nucleinsäure-Sequenz der zu identifizieren­ den Nucleinsäure hergestellt werden.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäure-Reagenzien setzen sich aus einzelnen oder miteinander verbundenen oder sowohl aus einzelnen und miteinander verbundenen Reihen von Nuclein­ säure-Fragmenten zusammen. Die einzelnen oder miteinander ver­ bundenen Nucleinsäure-Fragmente, die Reihen und/oder die Serien von Nucleinsäure-Fragmenten können in einen Vektor eingebaut sein, können Teile von Vektoren umfassen oder kön­ nen ohne jegliche Vektor-Bereiche vorliegen.
Die verwendeten Nucleinsäure-Fragmente haben eine Mindest­ länge von 15 Nucleotiden. Für die Länge gibt es keine obere Grenze, vorzugsweise werden jedoch Fragmente mit einer Länge von 20 bis 5000 Nucleotiden verwendet. Die erfindungsgemäßen Nucleinsäure-Fragmente werden entweder vom zu identifizie­ renden Genom oder von einem Teil des Genoms abgeleitet, bei­ spielsweise von einem verhältnismäßig großen Clon, der einen gewissen Teil des Genoms repräsentiert. Die erfindungsgemäßen Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten können somit aus verschie­ denen unabhängigen genomischen Bereichen hergestellt werden, die nicht direkt benachbart sind. Die so hergestellten Rei­ hen von Nucleinsäure-Fragmenten werden kombiniert und für dasselbe Reagenz verwendet. Die Reihen von Nucleinsäure- Fragmenten können ebenso aus DNA isoliert werden, die nicht identisch, jedoch ausreichend homolog mit der zu identifizierenden Nuclein­ säure ist, so daß stabile Hybride zwischen dem Reagenz und der zu identifizierenden Nucleinsäure gebildet werden. Die Herstellung geeigneter Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten ist nicht auf die Isolierung geeigneter Nucleinsäure-Frag­ mente des Genoms beschränkt. Es gibt viele ebensogut geeig­ nete Verfahren zur Herstellung solcher Reihen von Fragmenten. Der Durchschnittsfachmann kann Reihen von Nucleinsäure-Frag­ menten auch durch synthetische oder semisynthetische Ver­ fahren gewinnen.
Die Reagenzien werden so isoliert, daß mindestens zwei Serien alternierender Nucleinsäure-Fragmente erhalten werden, d. h. a₁, a₂, a₃ usw. und b₁, b₂, b₃ usw. die Nucleinsäure-Fragmen­ te der Serie a₁, a₂, a₃ usw. bestehen aus Fragmenten, die sehr nahe beieinanderliegen, jedoch nicht direkt benachbart sind. Die Nucleinsäure-Fragmente der Serie b₁, b₂, b₃ usw. bestehen ebenfalls aus Nucleinsäure-Fragmenten, die nahe bei­ einanderliegen, jedoch nicht direkt benachbart sind. Die Nu­ cleinsäure-Fragmente der Serie a₁, a₂, a₃ usw. und die der Serie b₁, b₂, b₃ usw. dürfen nicht miteinander homolog sein. Vorzugsweise werden die Nucleinsäuren der Serie a₁, a₂, a₃ usw. und die der Serie b₁, b₂, b₃ usw. so isoliert, daß je­ des zweite Fragment zur a-Serie und jedes zweite Fragment zur b-Serie gehört (s. Fig. 3). In Fig. 3 sind a₁, a₂, a₃ usw. und b₁, b₂, b₃ usw. Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten, die ausreichend homolog zur zu identifizierenden Nucleinsäure sind. Wie in Fig. 4 dargestellt, ist es natürlich auch mög­ lich, daß sogar eine dritte Nucleinsäure-Fragment-Serie, c₁, c₂, c₃ usw. aus der gleichen Nucleinsäure isoliert wird. Vorzugsweise folgen die alternierenden zwei Nucleinsäure- Reagenzien direkt aufeinander, jedoch ist dies erfindungs­ gemäß keine notwendige Voraussetzung.
Die vorstehend beschriebene Serie von Nucleinsäure-Fragmen­ ten kann entweder als voneinander getrennte Fragmente a₁, a₂, a₃ usw. und b₁, b₂, b₃ usw. (Fig. 5a) oder als miteinander zu längeren Strängen verbundene Fragmente a₁, a₂, a₃, usw. und b₁, b₂, b₃, usw. (Fig. 5b) verwendet werden. Natürlich ist es auch möglich, alle Arten von Zwischenprodukten herzustellen, wie beispielsweise eine a-Serie, in welcher a₁ ein getrenn­ tes Fragment ist und a₂, a₃ miteinander verbunden sind sowie solche der b-Serie, bei der beispielsweise b₁-b₂ miteinander verbunden sind und b₃ getrennt vorliegt (Fig. 5c).
In Fig. 6 sind "Sandwich"-Hybride dargestellt, bei denen das Reagenz aus zwei Serien mit je einer Reihe von Nucleinsäure- Fragmenten besteht. Fig. 6a zeigt ein "Sandwich"-Hybrid, bei dem die Fragmente in den Reihen getrennt vor­ liegen. Fig. 6b zeigt ein Hybrid, bei dem die Fragmente der markierten Reihe miteinander ver­ bunden sind. In Fig. 6c ist ein Fall dargestellt, bei dem eine Reihe von "Sandwich"-Hybriden sowohl aus miteinander verbun­ denen als auch aus voneinander getrennten markierten Fragmenten gebildet wird. In Fig. 6 ist x die zu identifizierende Nucleinsäure; b₁, b₂ und b₃ sind das markierte Sondenmolekül und a₁, a₂ und a₃ sind die an ein festes Trägermaterial gebundenen Fragmente.
Zur b-Serie gehörende Nucleinsäure-Fragmente können bei­ spielsweise so markiert werden, daß ein Sondenmolekül B als markiertes Nucleinsäure-Reagenz erhalten wird. Die Nuclein­ säurereihe der a-Serie kann so an ein festes Trägermate­ rial gebunden werden, daß ein Nucleinsäure-Reagenz A erhal­ ten wird. Umgekehrt ist es natürlich auch möglich ein mar­ kiertes Nucleinsäure-Reagenz A herzustellen und das entspre­ chende Nucleinsäure-Reagenz B an ein festes Trägermaterial zu binden.
Solche Nucleinsäure-Paare A und B oder B und A, die markiert und entsprechend an ein festes Trägermaterial gebunden sind, können für einige verschiedene zu identifizierende Nuclein­ säuren hergestellt werden. Sie können in geeigneten Nuclein­ säure-Reagenz-Kombinationen miteinander kombiniert werden, die verschiedene Nucleinsäure-Regenz-Paare A₁ und B₁, A₂ und B₂, A₃ und B₃, usw. oder B₁ und A₁, B₂ und A₂, B₃ und A₃ usw. enthalten. Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten-enthaltende Reagenzien zur Identifizierung verschiedener Nucleinsäuren können auch so kombiniert werden, daß ein Sondenmolekül Ax-Ay-Az erhalten wird, welches beispielsweise eine Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten (a₁, a₂, a₃)x-(a₁, a₂, a₃)y-(a₁, a₂, a₃)z enthalten (s. Fig. 7), in welcher a1x, a2x und a3x Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten Ax sind, die die Nuclein­ säure x identifizieren; a1y, a2y und a3y Reihen von Nuclein­ säure-Fragmenten Ay sind, die die Nucleinsäure Ay identifi­ zieren; a1z, a2z und a3z Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten Az sind, die die Nucleinsäure z identifizieren und in der v ein aus dem Vektor stammender Nucleinsäure-Bereich ist. Mitein­ ander verbundene Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten können natürlich ebenso als getrennte Fragmente in geeigneten Gemi­ schen verwendet werden.
Die in Fig. 8 abgebildeten "Sandwich"-Hybride wer­ den mit den in Fig. 7 abgebildeten Reagenzien erhalten. Wenn gleichzeitig die Identifizierung mehrerer verschiedener Nu­ cleinsäuren beabsichtigt wird, ist es selbstverständlich er­ forderlich, wie in Fig. 8 abgebildet, verschiedene Filter zu verwenden. Fig. 8a zeigt ein festes Trägermaterial, das die Nucleinsäure x identifiziert, Fig. 8b ein festes Trägermate­ rial, das die Nucleinsäure y identifiziert und Fig. 8c zeigt ein festes Trägermaterial, das die Nucleinsäure z identifi­ ziert. In den Fig. 8a, 8b und 8c sind b1x, b2x und b3x eine Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten, die an ein festes Trägermaterial gebunden ist und die die Nucleinsäure x identifiziert; b1y, b2y und b3y ist eine Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten, die an ein festes Trägermaterial gebunden ist und die die Nuclein­ säure y identifiziert; b1z, b2z und b3z ist eine Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten, die an ein festes Trägermaterial gebunden ist und die die Nucleinsäure z identifiziert und x, y und z sind die zu identifizierenden Nucleinsäuren. Fx, Fy und Fz sind die entsprechenden festen Trägermaterialien oder Fil­ ter, Ax-Ay-Az ist ein Sondenmolekül, das gleichzeitig alle drei Nucleinsäuren identifiziert, wenn verschiedene feste Trägermaterialien verwendet werden.
Die vorstehend beschriebenen Nucleinsäure-Fragment- Reihen und -Serien, Reagenzien und Reagenz-Kombinationen können durch an sich bekannte DNA-Rekombinations-Verfahren hergestellt werden. Eine Reihe unterschiedlich langer Nucleinsäure-Fragmente kann mit Restriktionsenzymen aus der zu identifizierenden Nucleinsäure oder aus einem sie repräsentierenden Bereich ausgeschnitten werden. Wenn die Restriktionskarte des zu identifizierenden Genoms bekannt ist, ist es möglich, aus dem Genom geeignete benachbarte Fragmente auszuwählen. Die­ se werden mit Restriktionsenzymen ausgeschnitten, isoliert und mit DNA-Rekombinations-Verfahren vermehrt.
Wenn ein unbekanntes Genom untersucht wird, kann ein Zwi­ schenprodukt für die Herstellung der Reagenzien verwendet werden. In diesem Fall wird ein verhältnismäßig großes Restriktions-Fragment cloniert, dieses Fragment wird kar­ tiert und die Reihen von Nucleinsäure-Fragment-Serien a₁, a₂, a₃ usw. und b₁, b₂, b₃ usw. werden auf Grundlage der so er­ haltenen Information hergestellt.
Es ist natürlich möglich, Kombinationen der vorstehend ge­ nannten Methoden einzusetzen und mehrere große, voneinander getrennt clonierte Restriktions-Fragmente als Ausgangsmate­ rial zu verwenden sowie mehrere getrennte Serien herzustel­ len, die zu geeigneten Kombinationen zusammengestellt wer­ den.
Erfindungsgemäß werden die Nucleinsäure-Fragment-Serien a₁, a₂, a₃ usw. und b₁, b₂, b₃ usw. vorzugsweise mit DNA-Rekom­ binations-Verfahren hergestellt. Dabei wird die Serie a in einem Vektor cloniert, beispielsweise im Plasmid pBR 322. Die Serie b dagegen wird in einem anderen geeigneten Vektor cloniert, der keine zum vorstehenden Vektor homologen Se­ quenzen enthält. Der Bakteriophage M13 ist ein Beispiel eines solchen zweiten geeigneten Vektors. Die Fragmente, die zu dieser Serie gehören, können miteinander verbunden werden und die verbundene Serie kann in einem Vektor clo­ niert werden. Beispielsweise können a₁, a₂ miteinander ver­ bunden werden und als kontinuierliche Insertion im gleichen Vektor, nämlich in pBR 322 cloniert werden. Entsprechend ist es möglich, eine Reagenz-Serie b₁, b₂ herzustellen. Bei der Clonierung werden vorzugsweise Vektoren verwendet, in die man große Fremd-DNA-Insertionen einsetzen kann. Beispiels­ weise sind für diese Zwecke der λ-Phage und Cosmid-Vektoren geeignet.
Es werden also zwei Reagenz-Paare, die eine Reihe von Nucle­ insäure-Fragmenten enthalten, bei dem "Sandwich"-Hybridisie­ rungs-Verfahren der vorliegenden Erfindung benötigt, nämlich ein Reagenz, das mit der zu identifizierenden Markersubstanz markiert ist, d. h. ein Sondenmolekül und ein sogenanntes Filter-Reagenz, das an ein festes Trägermaterial gebunden ist.
Meistens werden radioaktive Isotope zur Markierung der Son­ denmoleküle verwendet. Beispielsweise werden in der GB-OS 20 34 323, den US-PSen 43 58 535 und 43 02 204 die folgen­ den Isotope verwendet: ³²P, ¹²⁵J, ¹³¹J und ³H. In der EP-A- 79 139 wird das Isotop ¹²⁵J verwendet. Nucleinsäure-Sonden­ moleküle wurden auch anderweitig modifiziert und beispiels­ weise mit Fluoreszenz-Markierungen versehen (FR-OS 25 18 755). Auch enzymatische oder enzymatisch meßbare Markierungen wer­ den verwendet (GB-OS 20 19 408, EP-A-63 879 und FR-OS 25 19 005). Die EP-A-70 685 und 70 687 beschreiben eine Licht-emittierende Markierung und ein entsprechendes Markie­ rungsverfahren. Die FR-OS 25 18 755 beschreibt eine immuno­ logisch meßbare Markierung. Auch Lanthanidchelate (US-PS 43 74 120), insbesondere Europium, können als Markersubstan­ zen verwendet werden. Ebenso ist die Biotin-Avidin-Markie­ rung geeignet (Leary et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80, 4045-4049 (1983)). Neben den vorstehend genannten, erfin­ dungsgemäß verwendbaren Substanzen zur Markierung von Nu­ cleinsäure-Reagenzien können selbstverständlich auch neu entwickelte, verbesserte Markersubstanzen verwendet werden, die ebenso für die erfindungsgemäße Markierung von Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten geeignet sind. Als Trägermaterial für Filter-Reagenzien sind beispielsweise verschiedene Nitro­ cellulose-Filter geeignet (US-PS 43 58 535 und GB-OS 20 95 833). In der DD-OS 1 48 955 ist ein Verfahren zur chemischen Bin­ dung von Nucleinsäuren an das Trägermaterial (Papier) be­ schrieben. In den US-PSen 43 59 535 und 43 02 204 sind che­ misch modifizierte Papierarten beschrieben, die als festes Trägermaterial verwendet werden können. Auch Nylonmembranen und modifizierte Nitrocellulose-Filter können verwendet wer­ den. Natürlich können auch in Zukunft entwickelte Materialien, die noch besser als festes Trägermaterial geeignet sind, er­ findungsgemäß verwendet werden. Auch andere feste Träger­ materialien, wie verschiedene Chromatographie-Matrizen (bei­ spielsweise Triazin- oder Epoxy-aktivierte Cellulose) oder Latex können erfindungsgemäß verwendet werden. Außer den nachstehend beschriebenen Beschränkungen gibt es grundsätz­ lich keine weiteren Beschränkungen für die Auswahl des fe­ sten Trägermaterials. Es muß möglich sein, die Nucleinsäure in einzelsträngiger Form so an das feste Trägermaterial zu binden, daß diese einzelsträngigen Nucleinsäuren mit der komplementären Nucleinsäure hybridisieren können. Das feste Trägermaterial muß außerdem leicht aus der Hybridisierungs­ lösung entfernt werden können oder die Hybridisierungslö­ sung muß leicht vom festen Trägermaterial entfernt werden können. Schließlich darf das Sondenmolekül nicht am Träger­ material selbst anhaften, so daß es nicht mehr abgewaschen werden kann.
Aus den vorstehend beschriebenen Kombinaationen von Reihen von Nucleinsäure-Reagenz-Paaren A und B oder B und A, ent­ sprechend markiert und an ein festes Trägermaterial gebun­ den, und aus für die Identifizierung von verschiedenen nu­ cleinsäuren hergestellten Nucleinsäure-Paaren kann eine Kombination Ax und Bx, Ay und By, Az und Bz zusammengestellt werden. Diese Kombinationen können für die gleichzeitige Identifizierung der Nucleinsäuren x, y und z durch "Sand­ wich"-Hybridisierungs-Verfahren verwendet werden.
Die Probe wird so behandelt, daß die Nucleinsäuren in die Hybridisierungs-Lösung abgegeben werden und daß diese in einzelsträngiger Form vorliegen. Die Hybridisierung wird in einer Hybridisierungslösung durchgeführt, zu der sowohl die an ein festes Trägermaterial gebundenen Nucleinsäure-Reagen­ zien als auch die markierten Nucleinsäure-Reagenzien zuge­ geben werden. Falls Filter als festes Trägermaterial verwen­ det wurden, werden diese nach der Hybridisierung aus der hy­ bridisierungslösung entnommen. Wenn Chromatographie-Matri­ zen, Latex oder ein vergleichbares Material verwendet wur­ de, wird die Hybridisierungslösung entnommen. Die festen Trägermaterialien werden mit einer geeigneten Waschlösung abgespült. Die Reihen gebildeter "Sandwich"-Hybride (Fig. 8a, 8b, 8c) werden in an sich bekannter Weise nachgewiesen. Bei­ spielsweise wird die radioaktive Markierung durch Autoradio­ graphie, mit einem Szintillations-Zähler oder einem Gamma- Zähler bestimmt. Eine Enzym-Markierung kann beispielsweise nach einer Farbreaktion, photometrisch oder durch Bestimmung eines Niederschlags gemessen werden. Lanthanid-Chelate kön­ nen mit dem sogenannten "time resolved fluorescence"-Verfah­ ren nachgewiesen werden. Eine immunologische Markierung wird mit geeigneten immunologischen Methoden nachgewiesen.
Einige verschiedene Gemische können als Hybridisierungs- Lösung verwendet werden. Geeignet sind beispielsweise die in der EP-A-79 139 und in der US-PS 43 02 204 genannten. Selbst­ verständlich können auch andere Hybridisierungs-Gemische ver­ wendet werden. Die Hybridisierung wird bei 0° bis 80°C durch­ geführt, günstig ist eine Temperatur von 65°C. Eine ausrei­ chende Hybridisierung kann schon nach einer sehr kurzen Zeit­ spanne vorliegen, günstig ist jedoch eine Hybridisierungs- Zeit von etwa 12 bis 20 Stunden.
Das zweistufige "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahren wird an sich genauso durchgeführt, jedoch wird dabei das an das feste Trägermaterial gebundene Nucleinsäure-Reagenz zuerst zur Hybridisierungs-Lösung zugegeben. Wenn die Hybridisierung abgeschlossen ist, wird das feste Trägermaterial gewaschen und eine zweite Hybridisierung wird durchgeführt, bei der das markierte Nucleinsäure-Reagenz verwendet wird.
Die vorstehend beschriebenen markierten Nucleinsäure-Reagen­ zien oder Reagenz-Kombinationen Ax, Ay, Az usw. und Bx, By, Bz usw. können natürlich auch für direkte Hybridisierungs­ Verfahren verwendet werden. Dabei muß die in einer Lösung vorliegende Nucleinsäure-Probe für jede zu identifizierende Nucleinsäure x, y und z geteilt werden. Wenn die Probe an ein festes Trägermaterial gebunden ist, muß für jede Probe eine getrennte, an ein Trägermaterial gebundene Probe herge­ stellt werden. Die gebildete Reihe von Hybriden (Fig. 9) wird mit an sich bekannten Verfahren nachgewiesen. In Fig. 9 ist F das feste Trägermaterial, d. h. der Filter, x die zu identifizierende Nucleinsäure und v kennzeichnet die vom Vektor abgeleiteten Bereiche. Die verwendeten, markierten Sondenmoleküle a₁, a₂ und a₃ (Fig. 9a), b₁ und b₂ (Fig. 9b) und a₁, b₁, a₂, b₂; a₃ (Fig. 9c).
Wie bereits vorstehend beschrieben wurde, können erfindungs­ gemäß verschiedene Kombinationen von Nucleinsäure-Reagenzien aus den Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten zusammengestellt werden. Mit diesen Kombinationen ist es möglich, einige ver­ schiedene Nucleinsäuren gleichzeitig zu identifizieren. Die zu den verschiedenen zu identifizierenden Nucleinsäuren homo­ logen Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten können in den Gemi­ schen als getrennte Fragmente oder als miteinander verbun­ dene Fragmente so verwendet werden, daß ein Sondenmolekül erhalten wird, mit dem einige verschiedene Nucleinsäuren identifiziert werden können. Natürlich müssen an ein festes Trägermaterial gebundene Nucleinsäure-Reagenzien für eine erfolgreiche Identifizierung getrennt aufbewahrt werden.
Die Hybridisierung mit Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten kann für die Identifizierung verschiedener menschlicher, tierischer oder pflanzlicher pathogener Mikroorganismen verwendet werden. Durch das Verfahren ist es möglich, Nah­ rungsmittelvergiftungen hervorrufende Mikroorganismen in Nahrungsmitteln nachzuweisen, beispielsweise Clostridien, Salmonellen oder Staphylococcen. Das Verfahren ist auch für die Identifizierung von Kontaminationen in Wasser, bei­ spielsweise durch Enterobakterien oder Enteroviren, geeignet.
Da der "Sandwich"-Hybridisierungs-Test mit Reihen von Nu­ cleinsäure-Fragmenten ein quantitatives Verfahren ist, kann es beispielsweise auch für die Bestimmung und die Messung von Genamplifikationen verwendet werden. Dieses Merkmal ist beispielsweise für den Nachweis und die Behandlung von Krebs von Bedeutung. Zur Bildung einer stabilen Reihe von Hybriden sollten die homologen Sequenzen des Sondenmolekül-Reagenz und des Filter-Reagenz im Proben-Strang mäßig voneinander entfernt sein, vorzugsweise weniger als 5 kb (Kilobasen). Zwischen diesen beiden Bereichen auftretende Entfernungsver­ änderungen sind mit diesem Verfahren deutlich zu beobachten. Deshalb ist das Verfahren ebenso für den Nachweis veränder­ ter mRNA, von chromosomalen Umlagerungen, von bei Immunglo­ bulin-Genen für die Exppression ablaufenden Umlagerungen und von Erbkrankheiten geeignet. Es ist also möglich, verschie­ dene Reagenz-Kombinationen aus den Reihen von Nucleinsäure- Fragmenten zu konstruieren. Beispielsweise können für die Identifizierung von Geschlechtskrankheiten-verursachenden Stoffen Analysebestecke hergestellt werden, die ein Sonden­ molekül mit Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten enthalten, mit denen Gonorrhö, Syphilis, Herpes und Chlamydien nachge­ wiesen werden können. In diesem Fall ist die Identifizierung durch Verwendung getrennter Filter für Gonorrhö, Syphilis, Herpes und Chlamydien möglich.
Die Erfindung betrifft insbesondere die Reihen von Nuclein­ säure-Fragmenten, die in den rekombinanten Plasmiden pKTH 1220 und pKTH 1271 enthalten sind. Das rekombinante Plasmid pKTH 1220 besteht aus dem Plasmid-Vektor pBR 322 und aus DNA von Chlamy­ dia trachomatis L2, die für die Chlamydien spezifisch ist. Dieses rekombinante Plasmid wird in Escherichia coli K12 HB101 cloniert. Das rekombinante Plasmid 1271 enthält im Plas­ mid-Vektor pBR 325 DNA aus dem Cytomegalovirus AD169. Dieses rekombinante Plasmid wird im Wirt Escherichia coli K12 HB101 cloniert. Die die rekombinanten Plasmide pKTH 1220 und pKTH 1271 enthaltenden Wirte wurden bei der deutschen Samm­ lung von Mikroorganismen (DSM), Griesebachstraße 8, D-3400 Göttingen, Bundesrepublik Deutschland, hinterlegt. Die Hinterlegungs-Nummer des rekombinanten Plasmids pKTH 1220 ist DSM2825 und die Hinterlegungs-Nummer des rekombinanten Plasmids pKTH 1271 ist DSM2826.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher er­ läutert. Die Struktur der Nucleinsäuren von Eucaryoten und Procaryoten (DNA und RNA) ist ähnlich. Deshalb sind die nach­ stehenden Beispiele auch mit Nucleinsäuren von Tieren (dazu gehört in diesem Zusammenhang auch der Mensch), Pflanzen, Mikroorganismen oder Viren ausführbar. Die erfindungsgemäßen Reagenzien können also zum Nachweis von Nucleinsäuren des Menschen, von Tieren, Pflanzen, Mikroorganismen und Viren verwendet werden. Die Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten können auch synthetisch hergestellt werden. Die zu identi­ fizierende Nucleinsäure-Sequenz kann bestimmt werden, und homologe Reihen von Fragmenten können mit geeigneten Maschi­ nen automatisch hergestellt werden.
Beispiel 1 a) Reihen von Nucleinsäure-Reagenzien aus Chlamydia trachomatis und ihre Herstellung
Für die Diagnose der Chlamydia trachomatis-Gruppe wurden ge­ eignete DNA-Fragmente aus der DNA von Chlamydia trachomatis Serotyp L2 hergestellt. Die DNA wurde isoliert, in an sich bekannter Weise fragmentiert, die resultierenden DNA-Frag­ mente wurden im Plasmid pBR 322 cloniert und in an sich be­ kannter Weise in den Wirtsorganismus Escherichia coli K12 HB101 eingebracht. Das Ergebnis diese Clonierungsvorgangs war eine Genbank des Bakteriums Chlamydia trachomatis L2, d. h. eine große Anzahl rekombinanter Plasmide, die jeweils ein bestimmtes BamHI-Restriktions-Fragment der Chlamydia-DNA tragen. Zur Reagenz-Herstellung wurden aus der Chlamydia- Genbank rekombinante Plasmide mit größtmöglichen DNA-In­ sertionen ausgewählt. Eines dieser Plasmide wurde pKTH 1220 genannt. Es wurde bei der deutschen Sammlung von Mikroorga­ nismen unter der Hinterlegungs-Nummer DSM 2825 hinterlegt. Durch einen direkten Hybridisierungs-Test wurde gezeigt, daß dieses Plasmid als Reagenz geeignet ist. In diesem Test identifizierte pKTH 1220 alle aus Chlamydia trachomatis- Serotypen gewonnenen Nucleinsäuren, jedoch keine anderen Nucleinsäuren.
Die verwendbaren Fragmente wurden aus dem Plasmid pKTH 1220 mit verschiedenen Restriktions-Enzymen gewonnen. Einige die­ ser Fragmente wurden im Plasmid pAT153 subcloniert (Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold String Harbor Laboratory, S. 6, 1982). Andere Fragmente wurden im Phagen M13 subcloniert. Fig. 10 zeigt das rekombinante Plas­ mid pKTH 1220, das eine Länge von 14 kb hat. In Fig. 10 sind BamHI, SalI und ClaI die verwendeten Restriktions-Enzyme, und a₁, a₂, b₁, b₂ und b₃ kennzeichnen die Größe und die relative Lage zueinander der mit den vorstehend genannten Restriktions- Enzymen gewonnenen Fragmente. Die Fragmente der Serie b sind markierte Sondenmoleküle. In Tabelle 1 sind die Größen der Fragmente und die für die Subclonierung verwendeten Vektoren die Namen der rekombinanten Plasmide und ihre Anwendung zu­ sammengefaßt.
Tabelle 1
Die in Tabelle 1 aufgeführten Fragmente wurden durch Elek­ troelution aus einem Agarosegel isoliert und in an sich bekannter Weise in mit geeigneten Restriktions-Enzymen ge­ spaltenen und in Tabelle 1 aufgeführten Vektoren subcloniert.
Das 2,1 kb-BamHI-BamHI-Fragment wurde folgendermaßen herge­ stellt: Das 1,4 kb-BamHI-SalI-Fragment und das 0,7 kb-SalI- BamHI-Fragment aus dem Plasmid pKTH 1220 wurden in einem Agarosegel elektrophoretisch getrennt und anschließend aus dem Gel isoliert. Die gereinigten Fragmente wurden mit T4- Ligase miteinander verbunden. Von den dabei gebildeten 2,1 kb- langen DNA-Fragmenten wurden die mit freien BamHI-Enden in die BamHI-Restriktions-Spaltstelle doppelsträngiger DNA des Phagen M13mp8 eingebaut. Die auf diese Weise hergestellte rekombinante Phasen-DNA (mKTH 1245) enthält also zwei ver­ schiedene DNA-Fragmente von Chlamydia trachomatis, die in dessen Genom nicht benachbart sind. Sie liegen jedoch im Chlamydia trachomatis Genom benachbart zu den DNA-Reagenzien pKTH 1250 und pKTH 1252, die an den Filter gebunden werden (Fig. 11). Fig. 11 zeigt eine Reihe von "Sandwich"-Hybriden, die entstehen, wenn die in Tabelle 1 aufgeführten rekombi­ nanten Plasmide und rekombinanten Phagen als Reihen von Nucleinsäure-Reagenzien verwendet werden.
b) Nachweis der Empfindlichkeit einer Reihe von Nucleinsäure- Reagenzien aus Chlamydia trachomatis unter Verwendung des "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahrens
Die Empfindlichkeit einer Reihe von Nucleinsäure-Reagenzien, verglichen mit einem einzelnen kontinuierlichen Reagenz-Paar, wurde mit dem "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahren unter­ sucht. Der Test wurde mit Filtern durchgeführt, die jeweils 10¹¹ Moleküle sowohl von pKTH 1250 (a₂)- als auch von pKTH 1252 (a₁)-Einzelstrang-DNA enthielten. Die zu untersuchende Probe war das Plasmid pKTH 1220, welches für den Test durch 5minü­ tiges Erhitzen in 0,17 M NaOH, anschließendes Abschrecken bei 0°C und durch Neutralisierung mit einer äquimolaren Menge Essigsäure in die Einzelstrangform überführt wurde. Die fol­ genden mit ¹²⁵J markierten und in Tabelle 1 aufgeführten Sondenmoleküle wurden bei den Tests verwendet: mKTH 1242(b₁), mKTH 1239(b₂), mKTH 1248(b₃) und mKTH 1245(b₁-b₂).
Die Hybridisierung wurde 17 Stunden bei +65°C in einer Hybri­ disierungs-Lösung der folgenden Zusammensetzung durchgeführt: 4×SSC, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,2% SDS und 200 µg/ml Hering-Spermien DNA. Die Filter wurden 2 Stun­ den bei 50°C mit einer Waschlösung der folgenden Zusammen­ setzung gewaschen: 0,1×SSC, 0,2% SDS. Anschließend wurden sie in einem Gamma-Zähler gezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt und sind jeweils der Mittelwert von fünf Parallelversuchen.
Tabelle 2
Bei der statistischen Berechnung wurden 95% der ohne Probe durchgeführten Tests (=negative Kontrollen) als untere Grenze für eine positive Reaktion gewertet. Diese Werte waren 52-54 cpm, wenn das Sondenmolekül b₁, b₂ oder b₃ war, 58 cpm, wenn das Sondenmolekül b₁ oder b₂ war, 56 cpm, wenn das Sondenmolekül b₁, b₂ war und 65 cpm, wenn das Sondenmolekül b₁, b₂, b₃ war.
c) Diagnose von Chlamydia durch "Sandwich"-Hybridisierung mit Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten
Von drei an Urethritis leidenden Männern sowie von drei an Cervicitis leidenden Frauen wurden Proben für den Test ge­ nommen. Aus Urethra der Männer und Cerbix der Frauen wurde Chlamydia trachomatis isoliert. Zusätzlich wurde eine Reihe von ähnlichen Proben aus Patienten untersucht, aus denen Chlamydia nicht isoliert wurde. Die zu untersuchenden Pro­ ben wurden mit Wattestäbchen genommen, die in einen Chla­ mydia-Probenaufnahme-Puffer eingetaucht waren, der 0,2 M Saccharose, 20 mM Phosphatpuffer, 3% fötales Kälberserum, 10 µg/ml Gentamicin, 100 µg/ml Vancomycin und 25 IU/ml Nystatin enthielt.
Aus den Proben wurde Chlamydia gezüchtet. Die ursprüngli­ chen Proben wurden außerdem durch "Sandwich"-Hybridisierung mit einer Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten untersucht. Die Proben wurden mit 2-Butanol konzentriert. Dabei wurde soviel Flüssigkeit entfernt, daß das Endvolumen 80 µl be­ trug und die Proben damit drei- bis siebenfach konzentriert waren. Danach wurde den Proben 70 mM EDTA, 0,7% SDS, 200 µg/ml Proteinase K zugesetzt und sie wurden 15 Minuten bei 55°C und 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Proben wur­ den dann 5 Minuten in 0,175 M NaOH gekocht. Die gekochten Proben wurden bei 0°C abgeschreckt, mit einer äquimolaren Men­ ge Essigsäure neutralisiert und getestet. Die in Beispiel 1b) beschriebenen Filter und Hybridisierungs-Bedingungen wurden bei diesem Test verwendet. Das bei der Hybridisie­ rungs-Reaktion verwendete Sondenmolekül war mKTH 1245 (b₁, b₂) mit einer Radioaktivität von 300 000 cpm/400 µl. Die Ergeb­ nisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.
Tabelle 3
Die Grenze für die positive Beurteilung des Tests war 104 cpm.
Die Ergebnisse aus Tabelle 3 zeigen, daß die "Sandwich"- Hybridisierung mit einer Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten für die Diagnose von Geschlechtskrankheiten geeignet ist. Proben mit negativem Ergebnis bei Kultur-Test zeigten auch bei der "Sandwich"-Hybridisierung ein negatives Er­ gebnis.
Beispiel 2 a) Reihe von Nucleinsäure-Reagenzien des Cytomegalovirus und ihre Herstellung
Für die Diagnose des Cytomegalovirus geeignete DNA-Fragmente wurden aus dem Cytomegalovirus (AD 169, ATCC VR-538)-(CMV) hergestellt. Die DNA wurde isoliert und in an sich bekannter Weise fragmentiert. Das etwa 9 kb lange EcoRI-Fragment I (definiert von Spector et al., J. Virol. 42, 558-582 (1982)) wurde nach der Größentrennung der EcoRI-Restriktions-Frag­ mente auf einem Agarosegel durch Elektroelution isoliert. Die eluierte DNA wurde mit Phenol extrahiert und anschließend mit Äthanol gefällt. Die so gereinigte DNA wurde mit T4-Ligase in mit dem Enzym EcoRI-gespaltene DNA des Plasmids pBR 325 ligiert. Die erhaltene rekombinante DNA wurde in E. coli K12 HB101 überführt. Aus den Ampicillin- und Tetra­ cyclin-resistenten, jedoch Chloramphenicol-sensitiven Clonen wurde ein Clon mit einer Cytomegalovirus-DNA-Insertion der richtigen Größe ausgewählt. Die Identität der Cytomegalovi­ rus-DNA wurde durch einen Southern blot bestätigt. Der Test zeigte, daß das beschriebene 9 kb-EcoRI-Fragment aus dem HindIII-D-Fragment der Cytomegalovirus-DNA stammt (Oram et al., J. Gen. Virol. 59, 111-129 (1982)). Das genannte rekombi­ nante Plasmid wurde als pKTH 1271 bezeichnet und bei der deut­ schen Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungs- Nummer DSM 2826 hinterlegt. Das rekombinante Plasmid wurde in an sich bekannter Weise vermehrt und gereinigt.
Weitere Clonierungsschritte wurden in an sich bekannter Wei­ se unter Verwendung des Plasmids pBR 322 und der Phagen M13mp7 und M13mp8 durchgeführt. Fig. 12 zeigt das hybride Plasmid pKTH 1271 mit einer Länge von etwa 9 kb. Die in Fig. 12 ge­ zeigte Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten wurde mit den Re­ striktionsenzymen EcoRI, BamHI, ClaI und PstI hergestellt. Fig. 12 zeigt die mit Restriktions-Enzymen erhaltenen Frag­ menten und ihre relative Lage und Größe. In Tabelle 4 sind die Größen der in Frage kommenden Fragmente und die für ihre Subclonierung verwendeten Vektoren, die Bezeichnung der so erhaltenen Plasmide und ihre Verwendung entweder als Filter- Reagenzien oder als markierte Sondenmoleküle aufgeführt. Fig. 13 zeigt eine Reihe von "Sandwich"-Hybriden, die gebil­ det wird, wenn die in Tabelle 4 aufgeführte Reihe von Nu­ cleinsäure-Fragmenten verwendet wird.
Tabelle 4
b) Nachweis der Empfindlichkeit einer Reihe von Nucleinsäure-Reagenzien des Cytomegalovirus mit dem "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahren
Die Empfindlichkeit einer Reihe von Nucleinsäure-Reagenzien im Verhältnis zur Empfindlichkeit eines Paares kontinuier­ licher Reagenzien wurde mit dem "Sandwich"-Hybridisierungs- Verfahren untersucht. Die Proben bei den Tests waren CMV-DNA, die in 0,17 M NaOH 5 Minuten gekocht wurde und anschließend gemäß Beispiel 1b) neutralisiert wurde. Die Filter enthiel­ ten alle 10¹¹ Moleküle sowohl von pKTH 1273(a₁)-DNA als auch von pKTH 1274(a₂)-DNA, die in die einzelsträngige Form über­ führt worden war. Die folgenden mit ¹²⁵J markierten, in Ta­ belle 4 aufgeführten Sondenmoleküle wurden verwendet: mKTH 1277(b₁), mKTH 1278(b₂) und mKTH 1279(b₃). Die Proben ent­ hielten jeweils 10⁸ cpm/µg DNA. Die Hybridisierung wurde wie in Beispiel 1b) beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefaßt.
Tabelle 5
Die untere Grenze für eine positive Beurteilung des Test­ ergebnisses waren 51-55 cpm, wenn das Sondenmolekül b₁, b₂ oder b₃ war, 59 cmp, wenn das Sondenmolekül b₁ oder b₂ war und 63 cpm, wenn das Sondenmolekül b₁, b₂ oder b₃ war.
Die in Tabelle 5 zusammengefaßten Ergebnisse zeigen, daß bei einer "Sandwich"-Hybridisierung mit einem einzelnen Sondenmolekül-Reagenz (b₁, b₂ oder b₃) jeweils 4×10⁶ CMV-DNA-Moleküle nachgewiesen werden. Andererseits wer­ den bei einer Hybridisierung mit einem Reagenz aus b₁, b₂ oder b₁, b₂, b₃ nur 10⁶ Moleküle CMV-DNA nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigen, daß die Reihe von Nucleinsäure- Reagenzien viermal empfindlicher ist als ein einzelnes Nucleinsäure-Reagenz.
c) CMV-Diagnose durch "Sandwich"-Hybridisierung mit einer Reihe von Nucleinsäure-Reagenzien
Klinische Proben wurden durch "Sandwich"-Hybridisierung mit einer Reihe von Reagenzien untersucht. Zu diesen Proben ge­ hören auch zwei Urinproben von Kindern mit einem Alter von weniger als einem Jahr. Es wurde angenommen, daß diese Kin­ der an der congenitalen Cytomegalovirus-Erkrankung leiden. Eine Lungenbiopsie-Probe aus einem Patienten mit einer CMV- Pulmonar-Infektion wurde ebenso mit der "Sandwich"-Hybridi­ sierung untersucht. Sowohl Cytomegalovirus-infizierte als auch nicht-infizierte fötale menschliche Zellen wurden als Proben beim Test verwendet.
Zu 10 ml einer Urin-Probe wurde eine Lösung mit 1% Sarcosyl und 5 mM EDTA sowie 200 µg Kalbsthymus-DNA zugegeben. Da­ durch wird die Virus-DNA freigesetzt. Durch Zugabe von 10 ml Isopropanol bei Raumtemperatur wird die DNA zusammen mit dem "carrier" (Kalbsthymus-DNA) ausgefällt. Der DNA-Niederschlag wurde in 200 µl TE-Puffer gelöst. Die DNA wurde dann durch 5minütiges Kochen und Abschrecken bei 0°C in die Einzel­ strangform überführt und zur Hybridisierungs-Lösung zugege­ ben.
Die Lungenbiopsie-Probe (einige mm³) wurde mit einem Messer zerkleinert und 200 µl TE-Puffer mit 1% SDS und 1 mg/ml Pro­ teinase K wurden zugegeben. Bei +37°C wurde der Abbau 1 Stunde durchgeführt, und die Probe wurde anschließend zweimal in eine Injektions-Spritze mit einer dünnen Hypodermis-Nadel aufgezogen. Die so homogenisierte Probe wurde gekocht und anschließend zur Test-Lösung zugegeben.
Die mit Cytomegalovirus infizierten Zellen und die nicht­ infizierten Zellen wurden wie vorstehend beschrieben durch SDS, Proteinase K-Behandlung, Homogenisierung und Kochen aufgeschlossen.
Als Filter-Reagenzien wurden beim Hybridisierungs-Test pKTH 1273(a₁) und pKTH 1274(a₂) und als Sondenmoleküle mKTH 1277(b₁), mKTH 1278(b₂) und mKTH 1279(b₃) mit jeweils 200 000 cpm/Reaktion verwendet. Ansonsten wurde die Hybri­ disierung, das Waschen der Filter und das Auswerten der Ergebnisse wie vorstehend in Beispiel 1b) beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse der vorliegenden Hybridisie­ rung sind in Tabelle 6 aufgeführt.
Tabelle 6
Die in Tabelle 6 aufgeführten Ergebnisse zeigen, daß es möglich ist, mit einer Reihe von Nucleinsäure-Reagenzien CMV in verschiedenen klinischen Proben, wie Urin, Lungen­ biopsie-Proben und in Zellen nachzuweisen.
Der Test ist für Cytomegalovirus spezifisch. Er identifi­ ziert keine menschliche DNA, d. h. der Test zeigt keine Inter­ ferenzen mit der in der Probe vorhandenen menschlichen DNA. Die Art der Probe spielt überhaupt keine Rolle für die Spe­ zifität des Tests.

Claims (12)

1. Nucleinsäure-Reagenzien für die Anwendung in einem "Sandwich"-Hybridisierungsverfahren, dadurch gekenn­ zeichnet, daß sie mindestens zwei Serien von alternie­ renden Nucleinsäure-Fragmenten umfassen, die nicht homo­ log zueinander sein dürfen, jedoch ausreichend homolog zu alternierenden Bereichen der zu identifizierenden Nucleinsäure sein müssen, wobei mindestens eine Serie von Nucleinsäure-Fragmenten an einem festen Trägermate­ rial gebunden ist und mindestens eine Serie von Nuclein­ säure-Fragmenten markiert ist.
2. Nucleinsäure-Reagenzien nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie entweder getrennte oder mitein­ ander verbundene Reihen alternierender Nucleinsäure- Fragmente enthalten.
3. Nucleinsäure-Reagenzien nach Anspruch 1 oder 2, da­ durch gekennzeichnet, daß sie Reihen von Nucleinsäure- Fragmenten mit von Vektoren abgeleiteten Bereichen ent­ halten.
4. Nucleinsäure-Reagenzien nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie markierte Reihen von Nucleinsäure- Fragmenten enthalten.
5. Nucleinsäure-Reagenzien nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie an ein festes Trägermaterial ge­ bundene Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten enthalten.
6. Nucleinsäure-Reagenzien nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie das rekombinante Plasmid pKTH 1220 oder Derivate davon enthalten, welches DNA des Bakteriums Chlamydia trachomatis L2 enthält.
7. Nucleinsäure-Reagenzien nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie das rekombinante Plasmid pKTH 1271 oder Derivate davon enthalten, welches DNA des Cytomegalo­ virus AD169 enthält.
8. Verfahren zur Herstellung der Nucleinsäure-Reagenzien nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man mit DNA-Rekombinations-Verfahren, oder auf synthetischem oder semisynthetischem Weg Reihen von Nucleinsäure-Frag­ menten herstellt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:
  • a) Isolierung einer ausgewählten Nucleinsäure mit geeig­ neter Länge,
  • b) Clonierung der ausgewählten Nucleinsäure in einem ge­ eigneten Vektor,
  • c) Fragmentierung der Nucleinsäure mit Restriktions- Enzymen,
  • d) Zuordnung von nicht miteinander hybridisierenden Frag­ menten zu verschiedenen Reihen von Fragmenten, wobei die Fragmente gegebenenfalls kovalent miteinander ver­ bunden werden,
  • e) gegebenenfalls Zuordnung geeigneter Reihen von Fragmen­ ten zu Serien, wobei die Reihen gegebenenfalls kovalent miteinander verbunden werden,
  • f) Subclonierung der getrennt vorliegenden oder miteinan­ der verbundenen, zu einer Reihe zugeordneten Fragmente, oder der miteinander verbundenen, zu einer Serie zuge­ ordneten Reihen von Fragmenten in geeigneten Vektoren, wobei Fragmente oder Reihen von Fragmenten, die ver­ schiedenen Serien angehören, vorzugsweise in verschie­ denen, nicht miteinander hybridisierenden Vektoren sub­ cloniert werden,
  • g) gegebenenfalls Bindung der getrennt vorliegenden oder miteinander verbundenen Fragmente einer Reihe oder Serie an ein festes Trägermaterial, und
  • h) Markierung der getrennt vorliegenden oder miteiander verbundenen Fragmente einer anderen Reihe oder Serie.
10. Verwendung der Nucleinsäure-Reagenzien nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Identifizierung von Nucleinsäuren in diagnostischen Hybridisierungs-Verfahren.
11. Ausführungsform nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß zur Identifizierung mehrerer verschiedener Nuclein­ säuren geeignete Kombinationen von Nucleinsäure-Reagenzien aus Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten zusammengestellt werden, die ausreichend homolog zu diesen verschiedenen Nucleinsäuren sind.
12. Ausführungsform nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Identifizierung als diagnostisches "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahren durchgeführt wird.
DE3505287A 1984-02-17 1985-02-15 Verbesserte Nucleinsäure-Reagenzien und Verfahren zu ihrer Herstellung Expired - Lifetime DE3505287C2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI840655A FI71768C (fi) 1984-02-17 1984-02-17 Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE3505287A1 DE3505287A1 (de) 1985-09-05
DE3505287C2 true DE3505287C2 (de) 1994-01-20

Family

ID=8518568

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE3505287A Expired - Lifetime DE3505287C2 (de) 1984-02-17 1985-02-15 Verbesserte Nucleinsäure-Reagenzien und Verfahren zu ihrer Herstellung

Country Status (22)

Country Link
US (1) US4731325A (de)
JP (1) JPS60188100A (de)
AT (1) AT394578B (de)
AU (1) AU577568B2 (de)
BE (1) BE901671A (de)
CA (1) CA1248895A (de)
CH (1) CH671778A5 (de)
DE (1) DE3505287C2 (de)
DK (1) DK174675B1 (de)
FI (1) FI71768C (de)
FR (1) FR2559783B1 (de)
GB (1) GB2156074B (de)
HU (1) HU194938B (de)
IE (1) IE57652B1 (de)
IT (1) IT1183184B (de)
LU (1) LU85768A1 (de)
NL (1) NL193663C (de)
NO (1) NO166543C (de)
RO (1) RO92633B (de)
SE (1) SE463103B (de)
SU (1) SU1523053A3 (de)
ZA (1) ZA85511B (de)

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6261776B1 (en) 1989-06-07 2001-07-17 Affymetrix, Inc. Nucleic acid arrays
US6310189B1 (en) 1989-06-07 2001-10-30 Affymetrix, Inc. Nucleotides and analogs having photoremoveable protecting groups
US6309822B1 (en) 1989-06-07 2001-10-30 Affymetrix, Inc. Method for comparing copy number of nucleic acid sequences
US6344316B1 (en) 1996-01-23 2002-02-05 Affymetrix, Inc. Nucleic acid analysis techniques
US6355432B1 (en) 1989-06-07 2002-03-12 Affymetrix Lnc. Products for detecting nucleic acids
US6379895B1 (en) 1989-06-07 2002-04-30 Affymetrix, Inc. Photolithographic and other means for manufacturing arrays
US6406844B1 (en) 1989-06-07 2002-06-18 Affymetrix, Inc. Very large scale immobilized polymer synthesis
US6410229B1 (en) 1995-09-15 2002-06-25 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density nucleic acid arrays
US6420169B1 (en) 1989-06-07 2002-07-16 Affymetrix, Inc. Apparatus for forming polynucleotides or polypeptides
US6451536B1 (en) 1990-12-06 2002-09-17 Affymetrix Inc. Products for detecting nucleic acids
US6468740B1 (en) 1992-11-05 2002-10-22 Affymetrix, Inc. Cyclic and substituted immobilized molecular synthesis
US6506558B1 (en) 1990-03-07 2003-01-14 Affymetrix Inc. Very large scale immobilized polymer synthesis
US6545264B1 (en) 1998-10-30 2003-04-08 Affymetrix, Inc. Systems and methods for high performance scanning
US6551784B2 (en) 1989-06-07 2003-04-22 Affymetrix Inc Method of comparing nucleic acid sequences
US6566495B1 (en) 1989-06-07 2003-05-20 Affymetrix, Inc. Very large scale immobilized polymer synthesis
US8236493B2 (en) 1994-10-21 2012-08-07 Affymetrix, Inc. Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA

Families Citing this family (135)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1260372A (en) * 1984-04-27 1989-09-26 Elazar Rabbani Hybridization method for the detection of genetic materials
US4725536A (en) * 1985-09-19 1988-02-16 Genetics Institute, Inc. Reagent polynucleotide complex with multiple target binding regions, and kit and methods
US4876187A (en) * 1985-12-05 1989-10-24 Meiogenics, Inc. Nucleic acid compositions with scissile linkage useful for detecting nucleic acid sequences
US4910300A (en) * 1985-12-11 1990-03-20 Chiron Corporation Method for making nucleic acid probes
US4868105A (en) * 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
US4882269A (en) * 1985-12-13 1989-11-21 Princeton University Amplified hybridization assay
FI76119C (fi) * 1986-02-27 1988-09-09 Orion Yhtymae Oy Kvantitativ bestaemning av nukleinsyramolekyler och reagensfoerpackning som anvaends vid foerfarandet.
US4925785A (en) * 1986-03-07 1990-05-15 Biotechnica Diagnostics, Inc. Nucleic acid hybridization assays
CA1341065C (en) * 1986-05-01 2000-08-01 J. Thomas Grayston Detection of a unique chlamydia strain associated with acute respiratory disease
US5281518A (en) * 1986-05-01 1994-01-25 Washington Research Foundation Detection of a unique chlamydia strain associated with acute respiratory disease
US6270961B1 (en) * 1987-04-01 2001-08-07 Hyseq, Inc. Methods and apparatus for DNA sequencing and DNA identification
US5202231A (en) * 1987-04-01 1993-04-13 Drmanac Radoje T Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes
US5124246A (en) * 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
CA1339351C (en) * 1987-10-15 1997-08-26 Michael S. Urdea Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US5359100A (en) * 1987-10-15 1994-10-25 Chiron Corporation Bifunctional blocked phosphoramidites useful in making nucleic acid mutimers
AU622426B2 (en) * 1987-12-11 1992-04-09 Abbott Laboratories Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization
GB8810400D0 (en) * 1988-05-03 1988-06-08 Southern E Analysing polynucleotide sequences
US5700637A (en) * 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
US7811751B2 (en) * 1988-05-03 2010-10-12 Oxford Gene Technology Limited Analysing polynucleotide sequences
US6054270A (en) * 1988-05-03 2000-04-25 Oxford Gene Technology Limited Analying polynucleotide sequences
JP2801051B2 (ja) * 1988-06-24 1998-09-21 アムジエン・インコーポレーテツド 核酸塩基配列を検出するための方法及び試薬
US5185243A (en) * 1988-08-25 1993-02-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Method for detection of specific nucleic acid sequences
CA2026573A1 (en) * 1989-02-03 1990-08-04 John B. Findlay Nucleic acid test article and its use to detect a predetermined nucleic acid
US5925525A (en) * 1989-06-07 1999-07-20 Affymetrix, Inc. Method of identifying nucleotide differences
US6955915B2 (en) * 1989-06-07 2005-10-18 Affymetrix, Inc. Apparatus comprising polymers
US6919211B1 (en) * 1989-06-07 2005-07-19 Affymetrix, Inc. Polypeptide arrays
US5232829A (en) * 1989-09-29 1993-08-03 Hoffmann-La Roche Inc. Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes
CA2039517C (en) * 1990-04-03 2006-11-07 David Segev Dna probe signal amplification
US5071962A (en) * 1990-05-31 1991-12-10 The United State Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Nucleotide, deduced amino acid sequence, isolation and purification of heat-shock chlamydial proteins
EP0466367B1 (de) * 1990-06-28 1995-08-23 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Verfahren zum Nukleinsäurenachweis
US5645994A (en) * 1990-07-05 1997-07-08 University Of Utah Research Foundation Method and compositions for identification of species in a sample using type II topoisomerase sequences
GB9020621D0 (en) * 1990-09-21 1990-10-31 Imp Cancer Res Tech Identification of organisms
GB2262987A (en) * 1990-09-21 1993-07-07 Imp Cancer Res Tech Identification of organisms
US5437976A (en) * 1991-08-08 1995-08-01 Arizona Board Of Regents, The University Of Arizona Multi-domain DNA ligands bound to a solid matrix for protein and nucleic acid affinity chromatography and processing of solid-phase DNA
US6051380A (en) * 1993-11-01 2000-04-18 Nanogen, Inc. Methods and procedures for molecular biological analysis and diagnostics
US6048690A (en) * 1991-11-07 2000-04-11 Nanogen, Inc. Methods for electronic fluorescent perturbation for analysis and electronic perturbation catalysis for synthesis
US5632957A (en) 1993-11-01 1997-05-27 Nanogen Molecular biological diagnostic systems including electrodes
US6017696A (en) 1993-11-01 2000-01-25 Nanogen, Inc. Methods for electronic stringency control for molecular biological analysis and diagnostics
US5605662A (en) * 1993-11-01 1997-02-25 Nanogen, Inc. Active programmable electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics
US5849486A (en) 1993-11-01 1998-12-15 Nanogen, Inc. Methods for hybridization analysis utilizing electrically controlled hybridization
US6569382B1 (en) * 1991-11-07 2003-05-27 Nanogen, Inc. Methods apparatus for the electronic, homogeneous assembly and fabrication of devices
US6652808B1 (en) * 1991-11-07 2003-11-25 Nanotronics, Inc. Methods for the electronic assembly and fabrication of devices
US5556961A (en) * 1991-11-15 1996-09-17 Foote; Robert S. Nucleosides with 5'-O-photolabile protecting groups
US6849462B1 (en) 1991-11-22 2005-02-01 Affymetrix, Inc. Combinatorial strategies for polymer synthesis
DE69233331T3 (de) 1991-11-22 2007-08-30 Affymetrix, Inc., Santa Clara Kombinatorische Strategien zur Polymersynthese
US6943034B1 (en) * 1991-11-22 2005-09-13 Affymetrix, Inc. Combinatorial strategies for polymer synthesis
WO1993013221A1 (en) * 1991-12-23 1993-07-08 Chiron Corporation Chlamydiae probes for use in solution phase sandwich hybridization assays
CA2124796A1 (en) * 1991-12-23 1993-07-08 Chiron Diagnostics Corporation Cmv probes for use in solution phase sandwich hybridization assays
US5583211A (en) * 1992-10-29 1996-12-10 Beckman Instruments, Inc. Surface activated organic polymers useful for location - specific attachment of nucleic acids, peptides, proteins and oligosaccharides
US7713528B1 (en) 1993-02-18 2010-05-11 Enzo Therapeutics, Inc. Method for in vivo delivery of active compounds using reagent conjugate
WO1995003401A1 (en) * 1993-07-23 1995-02-02 Hyseq, Inc. Method for screening unknown organisms
FR2710075B1 (fr) * 1993-09-15 1995-10-27 Bio Merieux Réactif et procédé pour la détection d'une séquence nucléotidique avec amplification de signal.
US6319472B1 (en) 1993-11-01 2001-11-20 Nanogen, Inc. System including functionally separated regions in electrophoretic system
US7101661B1 (en) 1993-11-01 2006-09-05 Nanogen, Inc. Apparatus for active programmable matrix devices
US6254827B1 (en) 1993-11-01 2001-07-03 Nanogen, Inc. Methods for fabricating multi-component devices for molecular biological analysis and diagnostics
US6331274B1 (en) 1993-11-01 2001-12-18 Nanogen, Inc. Advanced active circuits and devices for molecular biological analysis and diagnostics
US6068818A (en) 1993-11-01 2000-05-30 Nanogen, Inc. Multicomponent devices for molecular biological analysis and diagnostics
US7582421B2 (en) * 1993-11-01 2009-09-01 Nanogen, Inc. Methods for determination of single nucleic acid polymorphisms using a bioelectronic microchip
US7314708B1 (en) 1998-08-04 2008-01-01 Nanogen, Inc. Method and apparatus for electronic synthesis of molecular structures
US6287517B1 (en) 1993-11-01 2001-09-11 Nanogen, Inc. Laminated assembly for active bioelectronic devices
US6375899B1 (en) 1993-11-01 2002-04-23 Nanogen, Inc. Electrophoretic buss for transport of charged materials in a multi-chamber system
US6638482B1 (en) 1993-11-01 2003-10-28 Nanogen, Inc. Reconfigurable detection and analysis apparatus and method
US6309602B1 (en) 1993-11-01 2001-10-30 Nanogen, Inc. Stacked, reconfigurable system for electrophoretic transport of charged materials
US7172864B1 (en) 1993-11-01 2007-02-06 Nanogen Methods for electronically-controlled enzymatic reactions
US20040077074A1 (en) * 1993-11-01 2004-04-22 Nanogen, Inc. Multi-chambered analysis device
US6225059B1 (en) 1993-11-01 2001-05-01 Nanogen, Inc. Advanced active electronic devices including collection electrodes for molecular biological analysis and diagnostics
US6726880B1 (en) 1993-11-01 2004-04-27 Nanogen, Inc. Electronic device for performing active biological operations and method of using same
US6315953B1 (en) 1993-11-01 2001-11-13 Nanogen, Inc. Devices for molecular biological analysis and diagnostics including waveguides
US6287850B1 (en) * 1995-06-07 2001-09-11 Affymetrix, Inc. Bioarray chip reaction apparatus and its manufacture
DE69527585T2 (de) * 1994-06-08 2003-04-03 Affymetrix Inc Verfahren und Vorrichtung zum Verpacken von Chips
US5807522A (en) * 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US7323298B1 (en) * 1994-06-17 2008-01-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Microarray for determining the relative abundances of polynuceotide sequences
US7378236B1 (en) 1994-06-17 2008-05-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method for analyzing gene expression patterns
US6306657B1 (en) * 1994-06-28 2001-10-23 Kalyx Biosciences, Inc. Polynucleotide probe and kit for amplifying signal detection in hybridization assays
US6403367B1 (en) 1994-07-07 2002-06-11 Nanogen, Inc. Integrated portable biological detection system
US7857957B2 (en) * 1994-07-07 2010-12-28 Gamida For Life B.V. Integrated portable biological detection system
US6121048A (en) * 1994-10-18 2000-09-19 Zaffaroni; Alejandro C. Method of conducting a plurality of reactions
US6720149B1 (en) * 1995-06-07 2004-04-13 Affymetrix, Inc. Methods for concurrently processing multiple biological chip assays
US20040086917A1 (en) * 1995-09-27 2004-05-06 Nanogen, Inc. Methods for electronic fluorescent perturbation for analysis and electronic perturbation catalysis for synthesis
US6706473B1 (en) 1996-12-06 2004-03-16 Nanogen, Inc. Systems and devices for photoelectrophoretic transport and hybridization of oligonucleotides
US20020042048A1 (en) 1997-01-16 2002-04-11 Radoje Drmanac Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species
US6309824B1 (en) 1997-01-16 2001-10-30 Hyseq, Inc. Methods for analyzing a target nucleic acid using immobilized heterogeneous mixtures of oligonucleotide probes
US6297006B1 (en) 1997-01-16 2001-10-02 Hyseq, Inc. Methods for sequencing repetitive sequences and for determining the order of sequence subfragments
US6326489B1 (en) 1997-08-05 2001-12-04 Howard Hughes Medical Institute Surface-bound, bimolecular, double-stranded DNA arrays
DE19741715A1 (de) 1997-09-22 1999-03-25 Hoechst Ag Pentopyranosyl-Nucleosid, seine Herstellung und Verwendung
US6511803B1 (en) 1997-10-10 2003-01-28 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
US6485944B1 (en) 1997-10-10 2002-11-26 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
AU737174B2 (en) 1997-10-10 2001-08-09 President & Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
EP1021558A1 (de) 1997-10-10 2000-07-26 President And Fellows Of Harvard College Oberflächengebundene, doppelsträngige dna-protein-arrays
ES2246546T3 (es) * 1997-12-12 2006-02-16 Digene Corporation Valoracion de enfermedades relacionadas con el virus de papiloma humano.
US6355419B1 (en) 1998-04-27 2002-03-12 Hyseq, Inc. Preparation of pools of nucleic acids based on representation in a sample
US6232067B1 (en) 1998-08-17 2001-05-15 The Perkin-Elmer Corporation Adapter directed expression analysis
US7612020B2 (en) * 1998-12-28 2009-11-03 Illumina, Inc. Composite arrays utilizing microspheres with a hybridization chamber
AU4025300A (en) * 1999-03-24 2000-10-09 Packard Bioscience Company Continuous porous matrix arrays
AU4058500A (en) * 1999-03-30 2000-10-16 Nanogen, Inc. Single nucleotide polymorphic discrimination by electronic dot blot assay on semiconductor microchips
EP1173878B1 (de) 1999-04-27 2011-04-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Probenhalter für ein gasphaseionenspektrometer
US20030096321A1 (en) * 1999-05-19 2003-05-22 Jose Remacle Method for the identification and/or the quantification of a target compound obtained from a biological sample upon chips
EP1054259A1 (de) * 1999-05-19 2000-11-22 Remacle, José Verfahren zur Identifizierung von einer Zielverbindung
US6465183B2 (en) * 1999-07-01 2002-10-15 Agilent Technologies, Inc. Multidentate arrays
JP2001017166A (ja) * 1999-07-02 2001-01-23 Fuji Photo Film Co Ltd Ｄｎａチップ、ｄｎａチップの検定キットおよびｄｎａチップの検定法
US6428957B1 (en) 1999-11-08 2002-08-06 Agilent Technologies, Inc. Systems tools and methods of assaying biological materials using spatially-addressable arrays
US6235483B1 (en) 2000-01-31 2001-05-22 Agilent Technologies, Inc. Methods and kits for indirect labeling of nucleic acids
US8076063B2 (en) 2000-02-07 2011-12-13 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
US7582420B2 (en) 2001-07-12 2009-09-01 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US7955794B2 (en) 2000-09-21 2011-06-07 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US6455007B1 (en) * 2000-06-13 2002-09-24 Symyx Technologies, Inc. Apparatus and method for testing compositions in contact with a porous medium
US7601497B2 (en) 2000-06-15 2009-10-13 Qiagen Gaithersburg, Inc. Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method
US7439016B1 (en) * 2000-06-15 2008-10-21 Digene Corporation Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method
US6905816B2 (en) 2000-11-27 2005-06-14 Intelligent Medical Devices, Inc. Clinically intelligent diagnostic devices and methods
DK1373573T3 (da) * 2001-03-09 2014-01-20 Trovagene Inc Konjugatsonder og optisk detektion af analytter
EP1481076A4 (de) 2001-07-12 2005-05-11 Illumina Inc Multiplex-nukleinsäurereaktionen
US6893822B2 (en) 2001-07-19 2005-05-17 Nanogen Recognomics Gmbh Enzymatic modification of a nucleic acid-synthetic binding unit conjugate
US7601493B2 (en) * 2002-07-26 2009-10-13 Nanogen, Inc. Methods and apparatus for screening and detecting multiple genetic mutations
US20040241659A1 (en) * 2003-05-30 2004-12-02 Applera Corporation Apparatus and method for hybridization and SPR detection
US7622281B2 (en) 2004-05-20 2009-11-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for clonal amplification of nucleic acid
US7828954B2 (en) * 2004-09-21 2010-11-09 Gamida For Life B.V. Electrode based patterning of thin film self-assembled nanoparticles
US7314542B2 (en) * 2004-09-23 2008-01-01 Nanogen, Inc. Methods and materials for optimization of electronic transportation and hybridization reactions
US20060246576A1 (en) 2005-04-06 2006-11-02 Affymetrix, Inc. Fluidic system and method for processing biological microarrays in personal instrumentation
JP5187847B2 (ja) 2005-05-06 2013-04-24 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 核酸標的の捕獲方法
WO2007070553A2 (en) * 2005-12-12 2007-06-21 The Johns Hopkins University Double-tiled and multi-tiled arrays and methods thereof
EP1971690B1 (de) 2005-12-28 2018-10-17 Translational Therapeutics, Inc. Auf translationaler fehlfunktion beruhende therapeutika
WO2008060369A2 (en) 2006-09-29 2008-05-22 Translational Therapeutics, Inc. Eif4e regulon-based diagnostics
US20080003667A1 (en) * 2006-05-19 2008-01-03 Affymetrix, Inc. Consumable elements for use with fluid processing and detection systems
EP1912067A1 (de) * 2006-10-12 2008-04-16 Eppendorf Array Technologies S.A. Verfahren zur Quantifizierung eines Analyten in einer biologischen Probe durch Microarray-Chips
US9938641B2 (en) * 2006-12-18 2018-04-10 Fluidigm Corporation Selection of aptamers based on geometry
WO2008085777A2 (en) * 2007-01-03 2008-07-17 Xgenetics Inc. A method for early detection of cancer
US8288520B2 (en) * 2008-10-27 2012-10-16 Qiagen Gaithersburg, Inc. Fast results hybrid capture assay and system
ES2644516T3 (es) * 2009-01-28 2017-11-29 Qiagen Gaithersburg, Inc. Método y ensayo de preparación de muestras de gran volumen específico de secuencia
US9797000B2 (en) * 2009-05-01 2017-10-24 Qiagen Gaithersburg Inc. Non-target amplification method for detection of RNA splice-forms in a sample
EP2478087B1 (de) 2009-09-14 2017-01-18 QIAGEN Gaithersburg, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur rückgewinnung von nukleinsäuren oder proteinen aus in zytologischen medien fixierten gewebeproben
JP2013517803A (ja) 2010-01-29 2013-05-20 キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド サンプル中のｈｐｖの存在を決定および確認する方法
CN102822189B (zh) 2010-01-29 2016-06-29 奇亚根盖瑟斯堡股份有限公司 用于核酸的序列特异性纯化和多重复合体分析(multiplex analysis)的方法和组合物
JP2013528049A (ja) 2010-05-19 2013-07-08 キアゲン ガイサーズバーグ アイエヌシー． 核酸の配列特異的な精製及び多重分析のための方法及び組成物
AU2011258501B2 (en) 2010-05-25 2016-07-07 Qiagen Gaithersburg, Inc. Fast results hybrid capture assay and associated strategically-truncated probes
US9885092B2 (en) 2011-02-24 2018-02-06 Qiagen Gaithersburg Inc. Materials and methods for detection of HPV nucleic acids

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4366246A (en) * 1977-11-08 1982-12-28 Genentech, Inc. Method for microbial polypeptide expression
US4293652A (en) * 1979-05-25 1981-10-06 Cetus Corporation Method for synthesizing DNA sequentially
FI63596C (fi) * 1981-10-16 1983-07-11 Orion Yhtymae Oy Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser
GB8306426D0 (en) * 1983-03-09 1983-04-13 Malcolm A D B Detecting polynucleotide sequence
CA1260372A (en) * 1984-04-27 1989-09-26 Elazar Rabbani Hybridization method for the detection of genetic materials
US4563417A (en) * 1984-08-31 1986-01-07 Miles Laboratories, Inc. Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes

Cited By (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6440667B1 (en) 1989-06-07 2002-08-27 Affymetrix Inc. Analysis of target molecules using an encoding system
US6566495B1 (en) 1989-06-07 2003-05-20 Affymetrix, Inc. Very large scale immobilized polymer synthesis
US6310189B1 (en) 1989-06-07 2001-10-30 Affymetrix, Inc. Nucleotides and analogs having photoremoveable protecting groups
US6309822B1 (en) 1989-06-07 2001-10-30 Affymetrix, Inc. Method for comparing copy number of nucleic acid sequences
US6261776B1 (en) 1989-06-07 2001-07-17 Affymetrix, Inc. Nucleic acid arrays
US6747143B2 (en) 1989-06-07 2004-06-08 Affymetrix, Inc. Methods for polymer synthesis
US6346413B1 (en) 1989-06-07 2002-02-12 Affymetrix, Inc. Polymer arrays
US6660234B2 (en) 1989-06-07 2003-12-09 Affymetrix, Inc. Apparatus for polymer synthesis
US6379895B1 (en) 1989-06-07 2002-04-30 Affymetrix, Inc. Photolithographic and other means for manufacturing arrays
US6646243B2 (en) 1989-06-07 2003-11-11 Affymetrix, Inc. Nucleic acid reading and analysis system
US6403957B1 (en) 1989-06-07 2002-06-11 Affymetrix, Inc. Nucleic acid reading and analysis system
US6403320B1 (en) 1989-06-07 2002-06-11 Affymetrix, Inc. Support bound probes and methods of analysis using the same
US6406844B1 (en) 1989-06-07 2002-06-18 Affymetrix, Inc. Very large scale immobilized polymer synthesis
US6630308B2 (en) 1989-06-07 2003-10-07 Affymetrix, Inc. Methods of synthesizing a plurality of different polymers on a surface of a substrate
US6416952B1 (en) 1989-06-07 2002-07-09 Affymetrix, Inc. Photolithographic and other means for manufacturing arrays
US6420169B1 (en) 1989-06-07 2002-07-16 Affymetrix, Inc. Apparatus for forming polynucleotides or polypeptides
US6329143B1 (en) 1989-06-07 2001-12-11 Affymetrix, Inc. Very large scale immobilized polymer synthesis
US6355432B1 (en) 1989-06-07 2002-03-12 Affymetrix Lnc. Products for detecting nucleic acids
US6395491B1 (en) 1989-06-07 2002-05-28 Affymetrix, Inc. Method of information storage and recovery
US6491871B1 (en) 1989-06-07 2002-12-10 Affymetrix, Inc. System for determining receptor-ligand binding affinity
US6610482B1 (en) 1989-06-07 2003-08-26 Affymetrix, Inc. Support bound probes and methods of analysis using the same
US6600031B1 (en) 1989-06-07 2003-07-29 Affymetrix, Inc. Methods of making nucleic acid or oligonucleotide arrays
US6576424B2 (en) 1989-06-07 2003-06-10 Affymetrix Inc. Arrays and methods for detecting nucleic acids
US6291183B1 (en) 1989-06-07 2001-09-18 Affymetrix, Inc. Very large scale immobilized polymer synthesis
US6551784B2 (en) 1989-06-07 2003-04-22 Affymetrix Inc Method of comparing nucleic acid sequences
US6506558B1 (en) 1990-03-07 2003-01-14 Affymetrix Inc. Very large scale immobilized polymer synthesis
US6544739B1 (en) 1990-12-06 2003-04-08 Affymetrix, Inc. Method for marking samples
US6451536B1 (en) 1990-12-06 2002-09-17 Affymetrix Inc. Products for detecting nucleic acids
US6468740B1 (en) 1992-11-05 2002-10-22 Affymetrix, Inc. Cyclic and substituted immobilized molecular synthesis
US8236493B2 (en) 1994-10-21 2012-08-07 Affymetrix, Inc. Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA
US6548257B2 (en) 1995-09-15 2003-04-15 Affymetrix, Inc. Methods of identifying nucleic acid probes to quantify the expression of a target nucleic acid
US6410229B1 (en) 1995-09-15 2002-06-25 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density nucleic acid arrays
US6344316B1 (en) 1996-01-23 2002-02-05 Affymetrix, Inc. Nucleic acid analysis techniques
US6545264B1 (en) 1998-10-30 2003-04-08 Affymetrix, Inc. Systems and methods for high performance scanning

Also Published As

Publication number Publication date
DK58985D0 (da) 1985-02-08
NO166543B (no) 1991-04-29
RO92633B (ro) 1987-10-31
JPH0463679B2 (de) 1992-10-12
FI71768C (fi) 1987-02-09
BE901671A (fr) 1985-05-29
FI840655A (fi) 1985-08-18
SE8500733L (sv) 1985-08-18
GB2156074A (en) 1985-10-02
GB8503900D0 (en) 1985-03-20
US4731325A (en) 1988-03-15
ZA85511B (en) 1985-11-27
HUT37459A (en) 1985-12-28
HU194938B (en) 1988-03-28
SE8500733D0 (sv) 1985-02-15
NL193663B (nl) 2000-02-01
FR2559783B1 (fr) 1990-03-02
AU3842285A (en) 1985-08-22
SE463103B (sv) 1990-10-08
NO850554L (no) 1985-08-19
FI71768B (fi) 1986-10-31
NL8500424A (nl) 1985-09-16
JPS60188100A (ja) 1985-09-25
IT8519432A0 (it) 1985-02-07
IE850202L (en) 1985-08-17
AT394578B (de) 1992-05-11
IT1183184B (it) 1987-10-05
LU85768A1 (fr) 1985-07-24
DE3505287A1 (de) 1985-09-05
DK174675B1 (da) 2003-08-25
NL193663C (nl) 2000-06-06
DK58985A (da) 1985-08-18
FR2559783A1 (fr) 1985-08-23
CH671778A5 (de) 1989-09-29
SU1523053A3 (ru) 1989-11-15
FI840655A0 (fi) 1984-02-17
RO92633A (ro) 1987-10-30
IE57652B1 (en) 1993-02-10
ATA44185A (de) 1991-10-15
AU577568B2 (en) 1988-09-29
GB2156074B (en) 1988-03-16
CA1248895A (en) 1989-01-17
NO166543C (no) 1991-08-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3505287C2 (de) Verbesserte Nucleinsäure-Reagenzien und Verfahren zu ihrer Herstellung
DE69836632T2 (de) Molekularer nachweis von chromosomalen veränderungen
DE69433816T2 (de) Die bestimmung von nukleinsäuremutationen durch analyse des sputum
DE3750198T3 (de) Hybridisierungssonden.
DE2915082C3 (de) Verfahren und Verwendung eines Reagenzsatzes zum Nachweis und zur Charakterisierung von Nukleinsäuren und ihren Sequenzen
EP0438512B2 (de) Verfahren zur analyse von längenpolymorphismen in dna-bereichen
EP0731849B1 (de) Anordnung von nukleinsäuresequenzen und deren verwendung
DE3752360T2 (de) Menschliche DNS zum Nachweis von Retinoblastoma
DE69230873T3 (de) Selektive Restriktionsfragmentenamplifikation: generelles Verfahren für DNS-Fingerprinting
DE60014067T2 (de) Zusammensetzungen und verfahren zur genetischen analyse
DE69837146T2 (de) Direkte quantifizierung von gering vorkommender rns
DE69814848T2 (de) Untersuchung von nukleotiden in loesung mit hilfe von pna-sonden
WO2000024929A2 (de) Über lineare amplifikation vermittelte pcr (=lam pcr)
JPH05276948A (ja) 遺伝的特性決定用ポリヌクレオチド
DE3629190A1 (de) Verfahren zum nachweis und zur reinigung einer einzelne basenfehlpaarungen aufweisenden dna
DE3904270A1 (de) Verfahren zur markierung bestimmter chromosomen unter verwendung repetetiver rekombinations dns
EP3488012A1 (de) Dna-sonden für eine in-situ hybridisierung an chromosomen
DE602006000713T2 (de) Verfahren zur Verbesserung der Unterscheidung von einer einzelnen Basenfehlanpaarung durch die Verwendung von "hurdle" DNAs und Sonden mit artifiziellen Fehlpaarungen
Jiang et al. The Myb and Ahi-1 genes are physically very closely linked on mouse chromosome 10
EP1141725A2 (de) Testsystem zur erkennung verschiedener analyte
DE69635025T2 (de) Neues verfahren zum nachweis von cryptosporidium
DE69826867T2 (de) Hopfen-mosaik-virus gen und methoden zum nachweis des hopfen-mosaik-virus
WO2001055159A1 (de) Verfahren, kit und dna-sonden zum nachweis einer pilz-spezies in klinischem material
DE29825175U1 (de) Molekularer Nachweis von Chromosomenanomalien
DE4138341C1 (en) DNA molecule for genetic pre-disposition detection to multi-endocrine neoplasia - comprises genomic cloned beta-DNA sequence and fragments in human chromosome, for hybridisation technique and selective cleavage with restriction enzymes

Legal Events

Date Code Title Description
8128 New person/name/address of the agent

Representative=s name: VOSSIUS, V., DIPL.-CHEM. DR.RER.NAT. TAUCHNER, P.,

8110 Request for examination paragraph 44
8125 Change of the main classification

Ipc: C07H 21/00

8128 New person/name/address of the agent

Representative=s name: TAUCHNER, P., DIPL.-CHEM. DR.RER.NAT. HEUNEMANN, D

D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition
8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: SANGTEC MEDICAL AB, BROMMA, SE