DE69837146T2

DE69837146T2 - Direkte quantifizierung von gering vorkommender rns

Info

Publication number: DE69837146T2
Application number: DE69837146T
Authority: DE
Inventors: Jill M. Cross Plains KOLESAR; Peter G. Madison ALLEN
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 1997-08-05
Filing date: 1998-08-05
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2018-08-06
Also published as: ATE354673T1; DE69837146D1; US6013442A; CA2298884C; EP0990048A1; EP0990048B1; AU8693798A; CA2298884A1; EP0990048B9; WO1999007894A1; JP2001512699A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft das Gebiet der direkten Nucleinsäuredetektion, insbesondere von RNA in geringer Kopienanzahl, ohne dass eine Amplifikation der Anzahl an RNA-Molekülen oder eine Amplifikation eines Detektionssignals erforderlich wäre. Das Verfahren nutzt weiters Kapillarelektrophorese zur Detektion einer Target-RNA-DNA-Sonden-Hybrid-Bande. Außerdem kombiniert die Erfindung laserinduzierte Fluoreszenz und Kapillarelektrophorese.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Quantifizierung von RNA, insbesondere von infektiösen Mitteln oder von zellulären Quellen stammender RNA, ist wichtig für die Diagnose und Überwachung von Krankheitszuständen, die durch solche Mittel verursacht werden. Die in einem Serum detektierte Viruslast korreliert beispielsweise mit hohen Konzentrationen eines Virus in den Lymphknoten und hat prognostischen Wert für die Einschätzung der Weiterentwicklung von AIDS in fortgeschrittene Stadien, wie von Ho et al., Nature 373, 123 (1995), und Mellors et al., Ann. Intern. Med. 122, 573 (1996), beschrieben wurde. Virustiter in einem Serum korrelieren außerdem mit dem Fortschreiten der Krankheit bei anderen Viren, wie z.B. HCV, andere Non-A-Non-B-Hepatitis als HCV und atypische Lentiviren.
Es gibt eine Reihe von grundlegenden Problemen bei der RNA-Quantifizierung in geringer Kopienzahl. Wenn zu wenig Moleküle für eine Detektion durch herkömmliche Mittel vorhanden sind, ist eine Amplifikation der Targetsequenz erforderlich, um ihre Anzahl um mehrere logarithmische Einheiten zu erhöhen. Die Variabilitätskoeffizienten (VK) können oft über 20 Prozent oder mehr betragen, sodass das erhaltene Ergebnis nicht verlässlich ist und nicht mit dem Krankheitszustand korreliert. Der Variabilitätskoeffizient (VK) ist definiert als Standardabweichung der erhaltenen Werte dividiert durch das Mittel. Ein verstärktes Signal von einer kleineren Anzahl an Targetmolekülen ist ein weiterer Ansatz, aber das Endergebnis hängt davon ab, dass eine große Zahl an Reaktionen in der richtigen Reihenfolge stattfindet. Dies führt wieder zu einem großen VK, da Fehler in der Reaktionsabfolge ein Spektrum von Werten ergeben.
Alternativ dazu wird eine direkte Messung der geringen RNA-Kopienzahl in der nativen Probe, auch wenn eine angemessene Detektionsempfindlichkeit erreicht werden kann, durch die inhärente Instabilität der RNA-DNA-Doppelstränge verhindert. Eine Steigerung der Länge des hybridisierten Targets kann sowohl die Empfindlichkeit als auch die Stabilität des Hybrids erhöhen, aber die zusätzlichen Nucleotidsequenzkombinationen erhöhen auch die Möglichkeit einer nichtspezifischen Hybridisierung an Fragmente von Wirt-Nucleinsäuren oder einer partiellen Hybridisierung an nichtselektierte Regionen des Virusgenoms, was zu einem fälschlicherweise erhöhten positiven Wert führt. Die meisten Verbesserungen in der Quantifizierung von RNA in geringen Kopien bis heute stellen Versuche dar, die an Signal- oder Nucleinsäure-Amplifikationsstrategien beteiligten mehreren molekularen Vorgänge besser kontrollieren zu können.
Die drei derzeit verfügbaren Hauptamplifikationssysteme umfassen Verzweigtketten-Signalamplifikation (bDNA), Umkehrtranskriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) und nucleinsäureseqüenzgestützte Amplifikation (NASBA). Die Strategie der ersten beiden, bDNA und RT-PCR, umfasst den Einsatz eines ersten Reaktionsschritts, der das System von einem RNA-Target in ein DNA-Target überführt.
Bei bDNA umfasst eine anfängliche Sonde, die mit einer komplementären Sonde hybridisiert, eine Vielzahl an nichtkomplementären Stellen, die zur Hybridisierung an weitere DNA-Stränge in der Lage sind, welche wiederum Stellen hybridisieren können, die zur Sondensequenz nicht komplementär sind, sodass, indem wiederholte Hybridisierungsschichten entstehen, eine verzweigte DNA-Struktur mit äußerster Komplexität entsteht. Der letzte Strang, der einem Annealing in der verzweigten Struktur unterzogen werden soll, trägt einen Reporter. Somit führt das ursprüngliche RNA-Targetmolekül zu einer Verstärkung der Signalerzeugungsfähigkeit des Systems. Eine umfassende Erklärung und Beschreibung des bDNA-Verfahrens findet sich in Fultz et al., Quantitation of Plasma HIV-1 RNA Using an Ultra Senstitive Bran ched DNA (bDNA) Assay, in: Program and Abstracts of the 2nd National Conference on Human Retroviruses (1995), und in der Produktliteratur, L-6170 Rev. 5.0 für den Quantiplex^TM HIV-RNA Assay (Chiron Corporation).
Bei der RT-PCR wird eine cDNA aus der RNA-Matrize hergestellt, worauf eine herkömmliche PCR-Amplifikation unter Einsatz von ausgewählten Primern zur Definition des linken und rechten Endes des Amplikons folgt. Jeder nachfolgende Synthese- und Denaturierungsdurchgang führt zu einer exponentiellen Steigerung der Anzahl an Nachkommensträngen, die im System erzeugt werden. Nachdem die Amplifikation abgeschlossen ist, kann eine Sonde mit einer zu einem gewissen Abschnitt des Amplikons komplementären Sequenz, die einen Reporter trägt, zur Detektion des amplifizierten Targets eingesetzt werden. Sowohl bei RT-PCR als auch bei bDNA kann theoretisch ohne das ursprüngliche RNA-Target ausgekommen werden, ohne das die Empfindlichkeit des Tests beeinträchtigt wird, sobald die Überführung in ein DNA-System stattgefunden hat. Diese Verfahren umgehen die inhärente Labilität des RNA-Targets oder seines RNA-DNA-Doppelstrang-Hybrids effektiv.
Auf ähnliche Weise teilen RT-PCR und bDNA auch viele Mängel. Beide Systeme hängen von der Vollständigkeit einer großen Anzahl an aufeinander folgenden Hybridisierungsvorgängen ab. Wenn ein früher Hybridisierungsvorgang aus einem von einer Reihe von Gründen, wie z.B. einer strukturellen (sterischen) Hinderung, unkorrigierter Fehlpaarung, Bindung eines defekten Enzymmoleküls usw., fehlschlägt, nimmt die Endzahl der Kopien und somit die Intensität des Signals ab. Diese zufälligen Vorfälle tragen zum Teil zur großen Empfindlichkeit der Tests bei, die mit einem stark variierbaren Variabilitätskoeffizienten gekoppelt sind. Die handelsübliche Form des Tests normalisiert die Variabilität durch Coamplifikation eines internen Standards. Um die Variabilität zu kontrollieren, muss der interne Standard unter identischen Bedingungen amplifiziert werden wie das Target, aber immer noch vom Target unterschieden werden können, eine fast unmögliche Aufgabe. Außerdem verändert die Einführung eines internen Standards die PCR-Reaktionskinetik selbst. RT-PCR ist zwar bis zu einem gewissen Grad wirksam, in der Praxis ist sie jedoch sehr arbeitsaufwändig und unter normalen klinischen Laborbedingungen nicht praktisch.
Bei NASBA wird die Labilität von RNA überwunden, indem die Kopienanzahl auf einen sehr hohen Wert erhöht wird. Das Verfahren umfasst die Schaffung einer cDNA aus der Target-RNA und dann die Bildung einer großen Anzahl an Transkripten aus einer bDNA-Matrize, die wiederum in cDNA übergeführt werden können, usw. Die Anzahl an produzierten Transkripten ist immer viel höher als die in cDNA übergeführte, sodass eine großer Überschuss an RNA vorhanden ist. Das Verfahren wird durch Annealing zweier Primer initiiert, von denen einer einen Phagenpromotor enthält, der in der nachfolgenden cDNA einen Punkt zur Initiierung der Transkription bereitstellt. Anders als bei der PCR, wo die Anzahl an tatsächlichen Amplifikationsdurchgängen nominal durch die Anzahl an Temperaturzyklen geregelt wird, gibt es bei NASBA weniger Kontrolle. Dem Verfahren fehlt Uniformität, beispielsweise zwischen unterschiedlichen Targetsequenzen und innerhalb der gleichen Targetsequenz zwischen einzelnen Durchläufen. Die kommerzielle Form des Tests nutzt drei interne Kalibratoren, die mit der Targetsequenz coamplifiziert werden. Bei jedem Detektionsverfahren ist es wünschenswert, dass der analytische Variabilitätskoeffizient (VK) weniger als 15 Prozent beträgt.
Die drei Verfahren wurden vor kurzem von Coste et al., J. Med. Virol. 50, 293 (1996), in einer Studie verglichen. Es zeigte sich, dass bDNA am besten reproduzierbar war, mit VKs im Bereich von 6-35 Prozent. Bessere Ergebnisse wurden bei hohen Kopienanzahlen erreicht, 12,4% im Vergleich zu 31% bei einer geringen Kopienanzahl. Die Empfindlichkeit betrug jedoch nur 68 Prozent mit einem niedrigeren Detektionsniveau bei 4000 HIV-Äquivalenten. NASBA war der am wenigsten verlässliche Test mit VKs im Bereich von 13-62 Prozent, mit VK-Mittelwerten von 20,7 Prozent für hohe Kopienanzahlen und 41,8 Prozent für niedrige Kopienanzahlen. Die Empfindlichkeit war 100 Prozent bei einem niedrigeren Detektionsniveau von 2600 HIV-Äquivalenten. Die RT-PCR, schließlich, wies eine Empfindlichkeit von 93 Prozent auf, aber einen mittleren VK von 43 Prozent.
Während Verbesserungen in den oben genannten Verfahren aus einer Optimierung der Durchführungsbedingungen der Tests und aus der Entdeckung von Reagenskombinationen, die Interferenzen mit Hybridisierungen minimieren können, resultieren können, ist es unwahrscheinlich, dass die Variabilität jemals einheitlich auf Werte unter 15 Prozent verringert wird. Der Grund dafür ist, dass Priming-Fehler und Hybridisierungsinterferenzen nicht vollständig überwunden werden können, sodass Fehler früh in der Abfolge von Amplifikationsschritten eine geometrische Auswirkung auf das Ergebnis haben. Deshalb der große VK-Bereich. Wenn der Grad der Empfindlichkeit für eine direkte Detektion von RNA im Vergleich zu herkömmlichen W-Detektionsverfahren um mehrere Größenordnungen erhöht werden und das Problem der Instabilität von RNA-DNA-Doppelsträngen gelöst werden könnte, würde die direkte Detektion eine gangbare Alternative zu derzeitigen auf Amplifikation basierenden Verfahren bereitstellen, ohne Verlässlichkeit einzubüßen.
Bianchi et al. (J. Virol. Methods 47, 321-329 (1994)) beschreiben eine kapillarelektrophoretische Detektion der Hybridisierung zwischen synthetischen Oligonucleotiden und genomischer HIV-1-DNA, die durch PCR amplifiziert wurde. Schwartz et al. (Analytical Chemistry 64, 1737-1740 (1997)) beschreiben eine Kapillarelektrophorese mit einer laserinduzierten Fluoreszenzdetektion von PCR-Fragmenten unter Einsatz von Thiazolorange. Die JP890284322 betrifft die Detektion von Nucleinsäuren unter Einsatz von Kapillarelektrophorese. Sunzeri et al. (Blood 77, 879-886 (1991)) beschreiben die Detektion von retroviralen DNA-Sequenzen unter Einsatz von PCR und Kapillar-DNA-Chromatographie.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Im Verfahren der vorliegenden Erfindung werden zwei unterschiedliche Farbstoffmoleküle verwendet, um bei Anregung mit einem Laserstrahl eine charakteristische Signalemission zu erzeugen. RNA wird aus einer zellfreien biologischen Probe, wie z.B. Serum, oder aus einer zellulären RNA-Quelle extrahiert, an eine Fluoreszenz-DNA-Sonde (erstes Farbstoffmolekül, kovalent an eine Sonde gebunden) einer komplementären Sequenz hybridisiert, um ein RNA-DNA-Hybrid zu bilden, als RNA- DNA-Doppelstrang-Hybrid auf eine Kapillarelektrophoresesäule aufgetragen, einer Elektrophorese in einer Hybridbande in Gegenwart eines interkalierenden Farbstoffs (zweiter Farbstoff in Elektrophoresepuffer) unterzogen, wonach die Menge des RNA-DNA-Hybrids durch Messung der Gesamtfluoreszenzintensität des Lichts, das von der Hybridbande nach Anregung mittels laserinduzierter Fluoreszenz emittiert wird, und des Verfalls der angeregten Moleküle mit Licht mit einer größeren Wellenlänge quantitativ detektiert wird.
Bei der Kapillarelektrophorese wird die das RNA-DNA-Hybrid enthaltende Probe auf die Gelsäule aufgetragen, und elektrischer Strom wird an die Gelmatrix angelegt. Der Farbstoff, der in die Gelmatrix eindringt, ist zur Interkalation des Hybrids in der Lage und bindet an die Zwischenräume des Doppelstrangs, sodass diese interkalierten Moleküle mit der Hybridbande wandern. Die ungebundenen Farbstoffmoleküle werden nicht als Hintergrund betrachtet, weil ihre Quantenausbeute in Gegenwart von Nucleinsäure variiert. Die Bande wird durch quantifiziert, indem ein Scanning-Laserinduktionsstrahl entlang des Gels gerichtet wird. Die Hybride mit einem daran hängenden Farbstoff (sowohl kovalent gebunden als auch durch elektrostatische Interaktion gebunden) wandern als Bande, absorbieren das Licht mit Anregungsewellenlänge und emittieren bei einer niedrigeren Energiewellenlänge. Peakflächen der Lichtemissionsintensität werden identifiziert. Die Gesamtfluoreszenz ist die Summe der Fluoreszenzwerte unter dem Peak.
Die Anmelder haben herausgefunden, dass die Konfiguration einer terminalen Markierung der DNA-Sonde mit einem Farbstofftyp und das Interkalieren-Lassen des Doppelstrang-Hybrids durch einen zweiten Farbstofftyp den unerwarteten Vorteil mit sich bringt, dass die Stabilität des Hybrids enorm ansteigt. Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Stabilisierung von Nucleinsäurehybriden, die aus einem RNA-Strang und einem mit Fluorophor terminal markierten DNA-Strang mit geringer Länge (15 bis etwa 40 Basenpaare lang) bestehen, während einer Kapillarelektrophorese bereit, welches das Durchführen von Elektrophorese dieses Nucleinsäurehybrids in Gegenwart eines interkalierenden Farbstoffs umfasst. Jeder beliebige Farbstoff, vorzugsweise mit derselben Wellenlänge fluoreszierend wie der kova lent an die DNA-Sonde gebundene Farbstoff, der doppelsträngige Nucleinsäuren interkalieren kann, ist wirksam zu Erhöhung der Stabilität. Die Fähigkeit, kurze RNA-DNA-Doppelstränge zu stabilisieren, bedeutet, dass nun leicht eine RNA-Targetsequenz ausgewählt werden kann, die weniger als 5 Prozent Homologie zu jedem anderen Abschnitt des Targets aufweist und zu Wirts-Nucleinsäuren nicht homolog ist, wie durch eine GenBank-Suche oder durch einen Vergleich mit anderen veröffentlichten Sequenzdatenbanken verifiziert wurde.
Die Prinzipien der Erfindung sind auch auf eine DNA-Detektion durch Sichtbarmachung von DNA/DNA-Hybriden anwendbar. Das Verfahren ist besonders für die Detektion und Quantifizierung von Target-Wildtyp- und mutierten DNA-Sequenzen wirksam, die mit Onkogen- und Tumorsuppressormarkern, wie z.B. K-ras, DPC4, DCKNZ und p53, assoziierte Mutationen aufweisen. Die Schritte dieses Verfahrens sind im Wesentlichen die gleichen.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur direkten, nicht auf Amplifikation basierenden Quantifizierung einer Targetnucleinsäure-DNA- oder -RNA-Sequenz bereit, die in einer Probe in geringer Kopienanzahl vorliegt, umfassend:

(a) Extraktion der Target-DNA oder -RNA aus einer biologischen Probe;
(b) Hybridisierung der nicht amplifizierten Target-DNA oder -RNA aus Schritt (a) mit einer terminal markierten Fluoreszenz-DNA-Sonde mit einer Länge von 15-40 Basen, die eine zur Target-DNA oder -RNA komplementäre Sequenz aufweist, um einen Targetnucleinsäure-DNA-Sonden-Hybrid zu bilden;
(c) Auftragen des Hybrids auf eine Kapillarelektrophoresesäule;
(d) Durchführen von Elektrophorese des Hybrids in einer Bande unter elektrischem Strom, der an diese Kapillarsäule angelegt wird, in Gegenwart eines Farbstoffes, der doppelsträngige Nucleinsäuren interkalieren kann; und
(e) quantitative Detektion des Hybrids durch Messung der Gesamtfluoreszenzintensität des Lichts, das von der Hybridbande nach Anregung mittels laserinduzierter Fluoreszenz emittiert wird.

Weiters stellt die Erfindung ein Verfahren zur Stabilisierung von Nucleinsäurehybriden, die aus einem RNA-Strang und einem mit Fluorophor terminal markierten DNA-Strang von einer Länge von 15 bis 40 Basenpaare bestehen, während der Kapillarelektrophorese, umfassend das Durchführen von Elektrophorese dieser Nucleinsäurehybride in Gegenwart eines Farbstoffs, der doppelsträngige Nucleinsäuren interkalieren kann.
Die vorliegende Erfindung stellt weiters ein Set zur Durchführung eines direkten quantitativen Tests auf HIV-1 oder andere Targetsequenzen bereit, die im Verdacht stehen, in einer biologischen Probe vorzuliegen, unter Einsatz von Kapillarelektrophorese und laserinduzierter Fluoreszenz, umfassend eine DNA-Sonde mit 15 bis 30 Nucleotiden, die terminal mit einem Fluorophor am 5'-Ende markiert sind und eine Sequenz aufweisen, die zur Targetsequenz komplementär ist, die weniger als 5% Homologie mit jeder anderen Sequenz gleicher Länge, die im Strukturgen und Wirtsgenom enthalten ist, aufweist, wie durch den Vergleich mit veröffentlichten Datenbanken bestätigt ist, und einen Farbstoff, der ein RNA-DNA-Hybridmolekül mit 15-30 Basenpaaren interkaliert.
Außerdem ist hierin ein Fluorophor am 3'-Terminus, am 5'-Terminus oder an beiden Termini der Sonde beschrieben.
Die Gefäße, welche die Reagenssonde und den Farbstoff enthalten, bestehen aus Materialien, an welchen die Reagenzien nicht haften, wie beispielsweise oberflächenbehandeltem Borsilicatglas, Polypropylen und dergleichen, und sind so geformt, dass sie die Spitze eines automatischen Pipettierers aufnehmen können.
Die Verfahren und Reagenzien der vorliegenden Erfindung weisen folgende Vorteile auf und erreichen die folgenden Ziele:

– rascher und äußerst verlässlicher Test für eine quantitative RNA-Bestimmung
– niedriger Variabilitätskoeffizient, auch bei geringen RNA-Kopienzahlen
– geringere Kosten als bei auf Amplifikation basierenden Tests
– höhere Empfindlichkeit als andere direkte Gen-Quantifizierungsverfahren.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A–1C sind Elektropherogramme von zellulärer RNA (1,856 μg/μl), die aus einer Spodoptera-frugiperda-Kultur gewonnen wurde. 1A stellt eine Injektion zum Zeitpunkt 0 dar. Eine zweite Injektion der gleichen Probe nach 30 Minuten bei Raumtemperatur ist in 1B dargestellt. 1C zeigt eine dritte Injektion der gleichen Probe nach 60 Minuten bei Raumtemperatur.
2 ist eine Elektropherogrammanalyse einer fluoreszierend markierten HIVspezifischen Sonde alleine, in einer Konzentration von 72 fg/7,1 nl in mit DEPC behandeltem Wasser verdünnt, die nach 11 min eluiert.
3A–3C zeigen eine Elektropherogrammanalyse von Hybridisierungsprodukten. RNA-Proben, die aus einem HIV-seropositiven Patienten und einem seronegativen Freiwilligen gewonnen wurde, wurden mit einer HIV-spezifischen Sonde hybridisiert und wie im experimentellen Teil beschrieben analysiert. 3A zeigt einen HIV-RNA/Sonden-Komplex, der nach 12 min eluiert, was die Gegenwart von HIV-RNA, im Patientenserum anzeigt. 3B zeigt einen seronegativen Freiwilligen. 3C ist eine negative Kontrolle, die alle Reaktionskomponenten außer RNA enthält.
4A und 4B zeigen eine Elektropherogrammanalyse von DNA/DNA-Hybridisierungsprodukten. 4A ist die Kontrolle, die ein Wandern der Sonde nach 8-9 Minuten zeigt. 4B zeigt den DNA/DNA-Hybrid-Peak, der nach etwa 12,75 min wandert.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
Ein Grundproblem der direkten Genquanifizierung, das die Anmelder gelöst haben, ist die hohe Labilität von Target-RNA-DNA-Doppelsträngen unter Elektrophoresebedingungen. Interessanterweise zeigt der Einsatz von Träger-RNA zur Stabilisierung der Target-RNA und der doppelsträngigen Nucleinsäure des Hybrids keine Ergebnisse. Versuche mit dem Einsatz von Träger-RNA, wie sie in Beispiel 3, Tabelle 4, dargelegt sind, zeigen, dass in Gegenwart eines Trägers keine Stabilisierung des RNA-DNA-Hybrids mit der Sequenz von Seq.-ID Nr. 1 stattfindet. Normalerweise dient Trägernucleinsäure oder ein Trägerprotein, im Falle von proteinartigen Targets, als Copräzipitator oder konkurriert um ein abbauendes Enzym, wodurch die Targetspezies durch schier überwältigende Zahlen geschützt wird. Das Unvermögen von Träger-RNA, den Abbau des Hybrids einzuschränken, stimmt mit der Schlussfolgerung überein, dass der RNA-DNA-Hybrid mit geringer Länge von Natur aus instabil ist, und seine Labilität ist nicht auf eine verunreinigende Nuclease oder einen anderen Vorgang, beim dem eine Trägerpopulation Schutz oder Rettung bereitstellen kann, zurückzuführen. Da die Labilität durch den elektrischen Strom ausgelöst zu werden scheint, kann eine Trennung von tRNA vom Doppelstrang zum Verlust jeglichen Schutzes führen, der ansonsten vielleicht vorhanden ist.
Eine Isolation von RNA von biologischen Proben kann mithilfe jedes beliebigen herkömmlichen Verfahrens erfolgen, bei dem Vorkehrungen zur Minimierung des RNA-Abbaus getroffen werden. Demgemäß müssen Verfahren, bei denen Hitze oder stark saure oder basische Reagenzien eingesetzt werden, vermieden werden. Bei der Herstellung von Proben aus Serum wird Blut zentrifugiert, um Zellen zu entfernen, und dann extrahiert. Im Handel sind verschiedene Extraktionssets für diesen Zweck verfügbar, wie beispielsweise das RNA-Isolationssystem Ultraspec II von Biotex.
Die Sondensequenz wird aufgrund seiner Einzigartigkeit innerhalb des Genoms des Organismus, das detektiert und überwacht werden soll, selektiert und zeigt eine geringe Wahrscheinlichkeit einer Homologie mit dem Wirtsgenom. Das ist wichtig, da nicht garantiert werden kann, dass alle Zellen in der Probe durch die Zentrifugation entfernt werden. Der Homologiegrad zwischen der Sondensequenz und dem Rest des Targetgenoms sollte so gering wie möglich sein, aber auf jeden Fall weniger als 5 Prozent betragen. Somit ist es möglich, eine Sequenz zu selektieren, die lang genug ist, um Selektivität zu verleihen, und kurz genug, um partielle Homologien mit Nichttarget-RNAs zu vermeiden.
Die DNA-Sonde weist eine Nucleotidsequenz aus etwa 15 bis 50 Basen, vorzugsweise zwischen 20 und 30 Basen, auf. Im Falle von HIV-1 wurde eine einzigartige, genetisch stabile 26-Basen-Sequenz aus dem pol-Gen mit der Sequenz 5'-ACAGTATTAGAAGAYATGRRTTTGCC-3' (Seq.-ID Nr. 1) selektiert (worin Y = A oder C ist; und R = A oder G ist). Diese Sequenz ist in der GenBank als Eintrag U62632 bezeichnet. Eine am 5'-Ende terminal mit einem Fluorophor markierte Sonde mit der oben angeführten Sequenz, die komplementär zum HIV-1-Sense-Strang ist, wurde unter Einsatz von 5'-Fluoresceinphosphoramidit synthetisch hergestellt. Eine weitere Sequenz von Interesse bei der HIV-Quantifizierung ist: 5'-GGCAAARRCATYTCTTCTAATACTGT-3' (Seq.-ID Nr. 2). Außerdem sind die folgenden Sequenzen in der vorliegenden Erfindung zur Quantifizierung von Chinonakzeptoroxidoreductase bzw. menschlicher Topoisomerase 1 zweckdienlich.
NAD(P)H:

5'-TCGGACCTCTATGCCATGAACT-3' Seq.-ID Nr. 3
5'-AGTTCATGGCATAGAGGTCCGA-3' Seq.-ID Nr. 4
5'-AGGCTGGTTTGAGCGAGTGTTC-3' Seq.-ID Nr. 5
5'-GAACACTCGCTCAAACCAGCCT-3' Seq.-ID Nr. 6
5'-CAGCAGACGCCCGAATTCAAAT-3' Seq.-ID Nr. 7
5'-ATTTGAATTCGGGCGTCTGCTG-3' Seq.-ID Nr. 8

Menschliche Topoisomerase I:

5'-AGAGACCTCGAGATGAGGATGA-3' Seq.-ID Nr. 9
5'-TCATCCTCATCTCGAGGTCTCT-3' Seq.-ID Nr. 10
5'-TCTCGTATTTCTGCCAGTCCTT-3' Seq.-ID Nr. 11
5'-AAGGACTGGCAGAAATACGAGA-3' Seq.-ID Nr. 12

Die Anmeldet haben versucht, einen interkalierenden fluoreszierenden Farbstoff einzusetzen, um eine Bande einer sondierten RNA sichtbar zu machen, die auf einer Elektrophoresesäule wanderte. Es wurde jedoch herausgefunden, dass bei kurzen (15-30) Basenpaaren weder ein mit Fluorescein markierter DNA-sondierter RNA-Doppelstrang ohne interkalierenden Farbstoff noch ein nicht terminal markierter DNA-sondierter RNA-Doppelstrang in Gegenwart eines interkalierenden Farbstoffs alleine während einer Elektrophorese stabil waren. Die Kombination aus einer terminal mit Fluorophor markierten DNA-Sonde und der Gegenwart eines interkalierenden fluoreszierenden Farbstoffs führte jedoch aus noch nicht geklärten Gründen zu einer bemerkenswerten Stabilität des Doppelstrangs.
Das bevorzugte terminate Fluorophor ist Fluorescein, obwohl auch andere wie Rhodamin oder die BODIPY-Reihe (Molecular Probes, Inc.) eingesetzt werden können. Der bevorzugte interkalierende Farbstoff ist Thiazolorange, obwohl auch andere Farbstoffe wie YOYO (ebenfalls von Molecular Probes Inc. erhältlich, dessen Struktur auf S. 155 des Katalogs aus dem Jahr 1996 für Produkt Nr. Y-3601 angegeben ist) eingesetzt werden können. Wird ein laserinduziertes Detektionssystem verwendet, sollten vom Standpunkt der Empfindlichkeit gesehen vorzugsweise terminierende und interkalierende Farbstoffpaare eingesetzt werden, die Licht mit derselben Wellenlänge emittieren, wodurch das Signal additiv verstärkt wird, siehe Tabelle 3. Fluorescein und Thiazolorange absorbieren bei 488 nm und emittieren bei 520 nm. Zu Herstellung einer Sonde ist Fluorescein ideal, weil es einfach zu handhaben ist, eine wohlbekannte Kupplungschemie aufweist und kostengünstig ist. Thiazolorange ist teurer, aber beim Kappilarmodus der Elektrophorese reduzieren die geringen Volumina den Verbrauch. In einer alternativen Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens kann der interkalierende Farbstoff vor dem Auftragen auf das Gel durch den DNA-RNA-Hybrid aufgenommen werden.
Unter Einsatz der Farbstoffkombination wird ein Abbau des RNA-DNA-Hybrids verhindert, und außerdem wird die Empfindlichkeit auf mit anderen Verfahren vergleichbare Werte gesteigert. Zur Überwachung von HIV ist das empfindlichste Testsystem das beste Testsystem, und mit einer niedrigeren Nachweisgrenze von 50 ag ist dieses System empfindlicher als andere verfügbare Systeme. Die Untergrenze des linearen Bereichs ist 11 Pikogramm bis 72 Femtogramm, was eine niedrigere Nachweisgrenze von 7200 HIV-Äquivalenten pro ml ergibt, im Vergleich zu 10.000 Äquivalenten bei bDNA. Die größere Empfindlichkeit von RT-PCR (350 Äquivalente/ml) weist eine Genauigkeit von nur 11-93 Prozent auf, während beim vorliegenden Ver fahren der direkten Detektion des VK im Peakbereich (Gesamtfluoreszenz) immer unter 15 Prozent liegt. Die Genauigkeit (VK) der Peakposition im Gel (vergangene Zeit) beträgt weniger als 1 Prozent. Bei Hybridisierungstests an tatsächlichen Patientenseren, die RNA-DNA-Hybride produzieren, konnte eine verlässliche und quantitative Detektion von weniger als 2000 Äquivalenten HIV erreicht werden.
Im vorliegenden Verfahren wird das Verfahren der Kapillarelektrophorese (KE) eingesetzt. Eine Erläuterung der Verfahren, die für das in den Beispielen beschriebenen Versuchen eingesetzte Beckman-Gerät geeignet sind, finden sich in Altria et al., Quantitative Applications of Capillary Electrophoresis in Pharmaceutical Analysis, Beckman (1994), Veröffentlichungsnummer 538703, und Altria, Capillary Elektrophoresis Guidebook, Humana Press (1995). KE wurde für die direkte Quantifizierung von HIV-1 in Patienten mit hohen Serumwerten von HIV-1 eingesetzt. Ferandez-Arcaz et al., J. Acq. Immune Defic. and Hum. Retrobiol. 12, 107 (1996), berichteten über eine Detektion durch direkte UV-Analyse von extrahierter RNA bei Werten von über 10⁸ Virionen/ml, was mit den sehr hohen Werten des zirkulierenden Virus zu Beginn der Infektion korreliert. Dieses direkte Verfahren ist jedoch, auch mit der durch laserinduzierte Fluoreszenz erwarteten Steigerung, nicht empfindlich genug, um eine Anti-HIV-Arzneimitteltherapie zu überwachen, bei der das Niveau des zirkulierenden Virus abnimmt. Für weitere umfassendere Informationen über herkömmliche Verfahren und Anwendungen der Kapillarelektrophorese siehe Landers, Handbook of Capillary Electrophoresis, CRC Press (1997).
Weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den nachstehenden Beispielen.
BEISPIEL 1
Probengewinnung und RNA-Extraktion. RNA wurde durch 15-minütige Zentrifugation von Vollblut bei 3.000 × g und 4°C auf einer gekühlten Zentrifuge vom Typ Centra GP8R (International Equipment Corporation, Needham Heights, MA, USA) aus einem HIV-seropositiven Patienten gewonnen. Das Plasma wurde abgetrennt und bei –80 °C gelagert. Mithilfe des RNA-Isolationssystems Ultraspec II (Biotex, Houston, TX, USA) wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers RNA aus Plasmaproben extrahiert. RNA wurde auch aus Plasma und Peripherblutlymphozyten eines HIV-seronegativen normalen Freiwilligen extrahiert. Außerdem wurde RNA aus Spodoptera frugiperda 21 gewonnen, die in TC-100-Serum (HyClone, Logan, UT, USA) bei 27°C gezüchtet worden war. Die RNA wurde in mit DPEC behandeltem Wasser (Biotex, Houston, TX, USA) resuspendiert und spektrophotometrisch quantifiziert.
Sondensynthese und Hybridisierung. Um Spezifität sicherzustellen, wird eine einzigartige Gensequenz sondiert. Die pol-Region ist die genetisch einzigartigste des HIV-Genoms, und eine 26-bp-Sequenz aus dieser Region wurde gewählt (GenBank-Eintrag U62632). Die Einzigartigkeit wurde durch eine GenBank-Suche verifiziert. Eine mit 5'-Fluoresceinphosphoramidit (Glenn Research, Sterling, VA, USA) (Sondensequenz = 5'-ACAGTATTAGAAGAYATGRRTTTGCC-3') markierte DNA-Sonde für diese Sequenz wurde von der University of Wisconsin Biotechnology Center (Madison, WI, USA) synthetisiert. Proben-RNA, die in einer Konzentration von 0,095 μm/μl vorhanden war, wurde mit DEPC-behandeltem Wasser reihenverdünnt und mit der DNA-Sonde (1,0125 μg) in einem Puffervolumen von 30 μl mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,2), 1 mM EDTA (pH 8,0), 50 mM NaCl und 1 mM Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) (ACROS, Pittsburgh, PA, USA) hybridisiert. Das Gemisch wurde 10 min lang auf 85°C erhitzt und dann 4 h lang bei 42°C inkubiert. Der Zusatz von CTAB zur Hybridisierung erfolgte wie von Pontius et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8237 (1991), berichtet.
Nach einer Inkubation wurden die Proben 30 min lang bei 37°C mit RNAse One (4,5 U) (Promega Corporation, Madison, WI, USA) in 50 μl Verdaupuffer aus 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 5 mM EDTA (pH 8,0) verdaut. Dann wurden die Proben bei –80°C schockgefroren, um den enzymatischen Verdau zu Stoppen.
BEISPIEL 2
KE-LIF-Analyse. Trennungen wurden auf einem System P/ACE 2050 CE (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA) durchgeführt, wobei die Temperatur konstant auf 20°C gehalten wurde. Die Detektion von Hybridisierungsproben wurde mithilfe von laserinduzierter Fluoreszenz im Polaritätsumkehrmodus (Anode auf der Detektorseite) bei einer Anregung mit 488 nm und Emission mit 520 nm durchgeführt. Proben wurden durch 10-s-Injektionen bei 0,34 Pa über eine beschichtete eCAP-dsDNA-Kapillare mit 65 cm × 100 μm, die mit einem ersetzten linearen Polyacrylamid gefüllt war (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA), hydrodynamisch eingeführt. Die Kapillare wurde mit Gelpuffer „eCAP dsDNA 1000" konditioniert, der 60 μl Interkalator „LiFluor dsDNA 1000 EnhanceCE" (Thiazolorange) pro 20 ml enthielt (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA). Eine Trennung wurde bei einer konstanten Spannung von 7,0 kV über einen Zeitraum von 15-30 min durchgeführt. Die Kapillare wurde vor jeder Injektion 3 min lang mit Gelpuffer gespült. Dann wurde die Kapillare mit der fluoreszierend markierten Sonde und einem Gemisch aus RNA-Molekularmarkern (Ambion, Austin, TX, USA) kalibriert. Die 5 MaRker weisen eine Größe im Bereich von 100-500 bp auf. Eine Analyse der Daten nach dem Vorgang erfolge mithilfe des Chromatographiedatensystems System Gold (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA).
In Tabelle 1 sind die Stabilitätswerte für verschiedene Kalibrator-RNA-Standards angegeben. Die geringen KV-Prozentwerte zeigen, dass KE in Bezug auf die Variation sowohl hinsichtlich der Gesamtfluoreszenz (Peakfläche) als auch der Migrationsdauer auf dem Gel äußerst präzise ist.
Tabelle 1: Stabilität von zellulärer RNA bei Raumtemperatur
In Tabelle 2 werden die Nachweisgrenzen und die Reproduzierbarkeit der Doppelstrangkombination von RNA/RNA, RNA/DNA und DNA/DNA verglichen. Die niedrigere Nachweisgrenze für DNA/DNA erklärt sich aus der größeren bekannten Anzahl an Farbstoffmolekülen, die diesen Doppelstrang interkalieren, als bei RNA/RNA. Alle VK-Werte lagen unter 15 Prozent.
Tabelle 2: Vergleich der Nachweisgrenzen und Reproduzierbarkeit verschiedener Nucleotidkomplexe
Tabelle 3 zeigt, dass die Gesamtfluoreszenz, wenn sowohl ein terminaler Farbstoff als auch ein interkalierender Farbstoff eingesetzt werden, additiv ist, wenn eine Emission bei derselben Wellenlänge stattfindet. Die untere Tafel zeigt den deutlichen Betrag der Farbstoffkombination zur Doppelstrang-Stabilität.
Tabelle 3 1. Synergie Versuch: DNA/DNA-Hybride
2. Stabilität Versuch DNA/RNA-Hybride
BEISPIEL 3
Analyse von HIV-RNA mit niedriger Kopienanzahl durch den Zusatz von Träger-RNA. Ein aus dem HIV-seropositiven Patienten Nr. 31 erhaltenes Serum wurde mit sterilem, doppelt destilliertem H₂O reihenverdünnt. Die ursprüngliche Probe enthielt 5 × 10⁵ HIV-Kopien pro ml, und fünf Verdünnungen wurden vorgenommen, wobei die stärkste Verdünnung 10 Kopien HIV-RNA pro ml enthielt. E.-coli-tRNA (100 μg) wurde zu den verdünnten Proben zugesetzt, und die Hybridisierungen an eine markierte Sonde wurden durchgeführt.
Dann wurde RNA mithilfe des RNA-Isolationssystems Ultraspec II extrahiert, wie üblich hybridisiert und mittels KE-LIF analysiert.
Tabelle 4
Das Unvermögen, virale RNA bei stärkeren Verdünnungen zu detektieren, zeigt, dass die Hybride instabil sind, auch in Gegenwart von Träger-tRNA. Vergleiche mit einer Extraktion von RNA und dann einer Reihenverdünnung. Die Nachweisgrenzen für DNA/RNA-Komplexe betragen 1,9 fg.
BEISPIEL 4
Direkte Detektion von DNA. Direkte Detektionsverfahren zur Analyse von DNA können ebenfalls durchgeführt werden. Genomische DNA wird durch Standardverfahren extrahiert und mit Mbo l verdaut, um kleinere und leichter handzuhabende Fragmente von DNA zu erhalten. Die Target-DNA wird dann mit einer genspezifischen Sonde hybridisiert. Dieses Hybridisierungsprodukt erzeugt eine DNA/DNA-Sonde. Eine typischerweise eingesetzte Sonde ist viel kleiner (26mer) als das Targetfragment von DNA, das durch Mbo-1-Restriktionsnuclease erzeugt wurde (420 bp), sodass dieses zwar detektiert werden kann, der Test an diesem Punkt aber nicht sehr quantitativ ist und die Migrationsdauer etwas variiert.
Durch herkömmliche PCR amplifizierte DNA kann Mutationen enthalten, die durch PCR eingeführt werden. Somit eliminiert eine direkte Detektion durch die vorliegende Erfindung eine Quelle falscher Ergebnisse, was für eine Mutationsanalyse von großer Bedeutung ist. 4B zeigt die Detektion einer Hybrid-DNA/DNA-Peakmigration bei 12,75 Minuten. 4A ist eine Kontrolle, die nur einen vorherrschenden Peak bei 8-9 Minuten für die unhybridisierte Sonde zeigt.

Claims

Verfahren zur direkten, nicht auf Amplifikation basierenden Quantifizierung einer Targetnucleinsäure-DNA- oder -RNA-Sequenz, die in einer Probe in geringer Kopienanzahl vorliegt, umfassend: (a) Extraktion der Target-DNA oder -RNA aus einer biologischen Probe; (b) Hybridisierung der nicht amplifizierten Target-DNA oder -RNA aus Schritt (a) mit einer terminal markierten Fluoreszenz-DNA-Sonde mit einer Länge von 15-40 Basen, die eine zur Target-DNA oder -RNA komplementäre Sequenz aufweist, um einen Targetnucleinsäure-DNA-Sonden-Hybrid zu bilden; (c) Auftragen des Hybrids auf eine Kapillarelektrophoresesäule; (d) Durchführen von Elektrophorese des Hybrids in einer Bande unter elektrischem Strom, der an diese Kapillarsäule in Gegenwart eines Farbstoffes angelegt wird, der doppelsträngige Nucleinsäuren interkalieren kann; und (e) quantitative Detektion des Hybrids durch Messung der Gesamtfluoreszenzintensität des Lichts, das von der Hybridbande nach Anregung mittels laserinduzierter Fluoreszenz emittiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Targetnucleinsäuresequenz eine RNA-Sequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Targetnucleinsäuresequenz eine DNA-Sequenz ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Kapillarelektrophoresesäule eine Matrix umfasst, die einen Farbstoff enthält, der doppelsträngige Nucleinsäuren interkalieren kann.
Verfahren zur Stabilisierung von Nucleinsäurehybriden, die aus einem RNA-Strang und einem mit Fluorophor terminal markierten DNA-Strang von einer Länge von 15 bis 40 Basenpaare bestehen, während der Kapillarelektrophorese, umfas send das Durchführen von Elektrophorese dieser Nucleinsäurehybride in Gegenwart eines Farbstoffs, der doppelsträngige Nucleinsäuren interkalieren kann.
Set zur Durchführung eines direkten quantitativen Tests auf HIV-1 oder andere Targetsequenzen, die im Verdacht stehen, in einer biologischen Probe vorzuliegen, unter Einsatz von Kapillarelektrophorese und laserinduzierter Fluoreszenz, umfassend eine DNA-Sonde mit 15 bis 30 Nucleotiden, die terminal mit einem Fluorophor am 5'-Ende markiert sind und eine Sequenz aufweisen, die zur Targetsequenz komplementär ist, die weniger als 5% Homologie mit jeder anderen Sequenz gleicher Länge, die im Strukturgen und Wirtsgenom enthalten ist, aufweist, wie durch den Vergleich mit veröffentlichten Datenbanken bestätigt ist, und einen Farbstoff, der ein RNA-DNA-Hybridmolekül mit 15-30 Basenpaaren interkaliert.
Set nach Anspruch 6, worin die DNA-Sonde ein DNA-Strang ist, der Seq.-ID Nr. 1-12 entspricht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, worin die RNA-Sequenz ein Teil der Sequenz ist, die für das HIV-1-Genom kodiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, worin die DNA-Sonde ein 25-Basen-Sensestrangsegment ist, das Seq.-ID Nr. 1 entspricht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, worin der Farbstoff aus der aus Thiazolorange und Chinolinium bestehenden Gruppe ausgewählt ist.