JP2833063B2 - 核酸の検出法 - Google Patents

核酸の検出法

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Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明は特定の塩基配列を持つDNAあるいはRNAを検出
する方法でありウイルスや細菌による疾患、遺伝病の診
断、あるいは種の同定、親子鑑別などの分野に用いられ
る。
(従来の技術) ハイブリダイゼーション法は遺伝子の変異により生じ
る疾患やウイルスによる病気の診断に有効である。
従来、検出の際には目的DNAやRNAを菌、ウイルス、白
血球などから超音波破砕、などの物理学的方法、プロテ
ネースKのような酵素やドデシル硫酸ナトリウム(SD
S)のような界面活性剤、を用いて化学的な方法で抽出
する。その後フェノール、クロロホルム処理、エタノー
ル沈殿でDNA(RNA)を精製した後,NaOHのようなアルカ
リで変性させて1本DNA(RNA)にする。そしてこの目的
の1本鎖DNA(RNA)をメンブランフィルター(ニトロセ
ルロース、ナイロン)上に固定する方法が,良く知られ
たフィルターハイブリダイゼーション法である。このDN
A(RNA)を固定したフィルターに放射性同位元素。酵
素、ビオチン、蛍光物質などでラベルしたオリゴヌクレ
オチドプローブを加えると、オリゴヌクレオチドが対象
DNA(RNA)と相補的配列を持つと両者の間に水素結合が
生じて2本鎖を形成する。相補鎖をもたなかったり過剰
のオリゴヌクレオチドプローブは洗浄によってフィルタ
ーから除去される。その後放射活性、酵素活性、蛍光強
度測定によって目的DNA(RNA)の検出を行う。
あるいはフィルターを使わない方法としてポリメラー
ゼチェーンリアクション(PCR)(Saiki,R.K.et al, Sc
ience 239 487−491(1988)を利用して、各々のプライ
マーにビオチンをラベルしてPCR反応を行った後ラベルD
NAプローブと液相でハイブリダイゼーションを行なった
後アビジンを固定したアフィニティマトリックスを用い
て検出する方法,(Ann−Christine Syvanen et al,Nuc
l.Acidsb Res.16 11327−11338(1988))、オリゴヌク
レオチドプローブに複数のビオチンを標識し目的RNAと
液相でハイブリダイゼーションを行った後、アビジンを
固定したアフィニティマトリックスと酵素標識抗RNA−D
NA抗体を添加して検出する方法(Clifford O.Yehle et
al,Molecular and Celluar Probes 1,177−193(1987)
などがある。
(発明が解決しようとする課題) フィルターを用いる方法では、フィルターにDNA(RN
A)を固定するための操作、DNA(RNA)を熱や紫外線に
よって固定する操作、及び相補鎖を形成しなっかたたDN
Aプローブの洗浄の煩雑な操作がつきまとう。さらにオ
リゴヌクレオチドプローブがフィルター表面に非特異的
に吸着して検出感度の低下やバックグランドの上昇を招
くという不都合もあった。
またアフィニティーマトリックスを用いる方法におい
てもフィルター法に較べて操作性が優れたものの、アフ
ィニティーマトリックスの添加の操作、及び二本鎖を形
成しなかったオリゴヌクレオチドプローブをのぞくため
の操作(B/F分離)が必要となる。
(課題を解決するための手段) 上記観点から鋭意研究を行った結果、ラベル化オリゴ
ヌクレオチドを用いて溶液中でハイブリダイゼーション
を行い、その溶液を直接分子量の大小、あるいは荷電の
大小の差を利用して、相補鎖を形成しなかったオリゴヌ
クレオチドプローブを自動的に分離することで、特定し
た核酸の塩基配列を検出することを見いだしこの発明に
達した。
具体的には、a)目的DNAあるいはRNAの塩基配列の一
部分に相補的な配列を持つラベル化オリゴヌクレオチド
とDNA(RNA)を溶液中で交雑(ハイブリダイゼーショ
ン)させ、b)溶液をそのまま荷電の大小、あるいは分
子量の大小を識別できる装置で分析しラベル剤をそのラ
ベル剤の検出に適した検出器で識別する。
こうして目的DNA(RNA)の存在をしいては特定遺伝子
の検出を行うことができる。この発明の目的(対象)DN
AあるいはRNAはウイルス、細菌、血液等をプロテネース
Kのような酵素、SDSのような界面活性剤、NaOHのよう
なアルカリで処理すること、超音波破砕のような物理的
手段によって、あるいはそれらの組合せで入手すること
ができる。
オリゴヌクレオチドプローブは目的DNA(RNA)と相補
的な配列を有するオリゴヌクレオチドに適当なラベルを
施した物を使用する。ここでラベル化オリゴヌクレオチ
ドのラベル剤としては、β−壊変をする32P、131Iのよ
うな放射性同位元素やFITC(フルオレセインイソシアネ
ート)のような蛍光物質、ルミノール及びその誘導体で
ある化学発光物質、4−イソシアネート−テンプ、4−
マレイミド−テンプのようなスピンラベル剤、ユーロピ
ウム錯体のような遅延蛍光を示す物質等が用いられる。
ラベル剤とオリゴヌクレオチドの結合はオリゴヌクレオ
チドにアミノ基、チオール基等の官能基を化学的に導入
した後アミノ基あるいはチオール基特異的なラベル剤と
反応させることができる。オリゴヌクレオチドへの官能
基の導入はオリゴヌクレオチドを固相合成した後5′位
の保護基であるジメトキシトリチル(DMTr)基を酸処理
ではずした後、カルボニルイミダゾールを反応させヘキ
サエチレンジアミンを反応だせアミノ基を導入する方法
(L.Wachterb et al,Nucl.Acids Res.14,7985 (198
6))、脱保護したオリゴヌクレオチドの5′位を酵素
的に燐酸化した後エチレンジアミン、シスタミンのよう
なジアミンと反応させアミノ基あるいはチオール基を導
入させる方法(B.F.Chu et al,Nucl.Acids Res.11,6513
(1983))、H−ホスホネートを用いて四塩化炭素、
I2、ジアミンを保護オリゴヌクレオチドの燐酸基にアミ
ノ基を導入する方法(B.Frohler,Nucl.Acids.Res.16 48
31 (1988))、などの方法で行うことができる。
アミノ基を導入したオリゴヌクレオチドにはアミノ基
指向性のFITCのような蛍光物質、4−イソシアネート−
テンプのようなスピンラベル剤、などを用いることで適
当なラベル剤を導入することができる。目的DNA(RNA)
の検出は、分子量の大小あるいは、荷電の大小で対象DN
A(RNA)と二本鎖を形成したラベル化プローブと二本鎖
を形成しなかったラベル化プローブを識別することで行
う。例えば電気泳動法、ゲルろ過法、キャピラリー電気
泳動法、イオン交換法、等の方法で行うことができる。
検出器としては蛍光物質をプローブにラベルした時には
蛍光光度計、放射性同位元素をラベルした時にはRIディ
テクター、化学発光物質の時にはルミノメーター、など
の検出器を用いることができる。このようにして目的DN
A(RNA)の存在を、あるいは特定遺伝子の塩基配列を検
出することができる。
(実施例) (サンプルの調製)対象DNAとしてはM13mp8一本鎖ファ
ージDNA、オリゴヌクレオチドプローブとしてはM13ファ
ージDNAの一部分に相補的な配列を持つ17量体(dGTAAAA
CGACGGCCAGT,以下P17と呼ぶ)とした。P17を島津DNA合
成装置NS−1で合成後脱保護を施しC18カラムを備えた
液体クロマトグラフィー(HPLC)で精製した。P17(25n
mol)をT4ポリヌクレオチドキナーゼ(3OU.)で37℃、
2時間処理し5′位に燐酸残基を導入した。(以下P17
P)反応液はSEP PAKC18カラム(ミリポア社)で精製し
た。振とう下減圧濃縮した。次にフォスフォロアミデー
ト法(B.F.Chu et, Nucl.Acids Res.11 6513(1983))
を用いて5′位にアミノ基を導入した。すなわちP17P
(5nmol)に対して1−エチル−3−(ジメチル)アミ
ノプロピルカルボヂイミド(1M 10ul)、ルチジン塩酸
緩衝液(0.75M,88ul)の存在下、シスタミン塩酸塩(1
M,2ul)と20℃、18時間反応させた。(以下アミノ−P17
と呼ぶ。)(詳細は A.Murakami etb al, Nucl.Acids
Res.17 5587(1989)に記載した。)アミノ−P17(5nmo
l)を炭酸緩衝液(0.5M,100ul)に溶解してFITC(1mg)
を加えて室温で15時間反応させた。精製はG−25ゲルろ
かカラムでまず行い、つぎにHPLCで目的ピークを回収し
た。残渣を減圧下振とう濃縮し蒸留水に溶解した。(FI
TCを標識したアミノP17を以下FITC−P17と呼ぶ) (ハイブリダイゼーション) ハイブリダイゼーション
は目的DNAであるM13mp8ファージDNA(100pmol)を6XSSC
(0.9MNaCl)(50ul)に溶解し、FITC−P17(1pmol)を
加えて37Cで30分ハイブリダイゼーションを行った。そ
の溶液をそのままキャピラリー電気泳動に用いた。
(キャピラリー電気泳動) 1.電気泳動用緩衝液の調製 80mlの蒸留水に0.5gの低融点アガロースを加え、よく
攪はんした後加熱し溶解させ放冷後、これに1.21gのト
リス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、93mgのエチレ
ンジアミン四酢酸二ナトリウム及び20mgのドデシル硫酸
ナトリウムを溶解させた。これにさらにほう酸を加え、
pHを8.1に調整し、蒸留水を加えて正確に100mlにした。
2.ハイブリダイゼーション溶液のキャピラリー電気泳動 第1図に示したシステムを用いてキャピラリー電気泳
動を行った。すなわち、蛍光検出器(1)は島津RF−54
0型蛍光分光光度計(励起波長490nm、検出波長520nmに
設定)、高電圧電源(2)は松定プレシジョンHER−30P
O.1、記録計(3)は島津C−R4A型、電極(4)はPt線
(0.5mmφ−30mm)、電極槽(5)は1.5mlのサンプリン
グチューブを用いた。
キャピラリー(6)はScientific Glass Engineering
社のフューズドシリカキャピラリーの内径75μmのもの
を使用した。キャピラリーの全長は450mmであり+極側
から300mmの所から2mmの幅で被覆を剥し、蛍光検出器に
取り付けた。このキャピラリー内には使用時に上記の低
融点アガロースを含有する電気泳動用緩衝液を満たし、
両端はそれぞれ低融点アガロースを含有する電気泳動用
緩衝液を入れた+極側電極槽及び−極側電極槽に浸して
おいた。このとき二つの電極槽内の緩衝液の液面の高さ
が同じになるように調整しておいた。
試料のキャピラリーへの導入はキャピラリーの+極側
の端部を+側電極槽から引き上げ試料溶液中に10秒間浸
して行った。このとき試料の液面の高さは電極槽内の緩
衝液の液面より50mm高くなるように調整して行った。
試料をキャピラリー内に導入した後、キャピラリーの
端部を電極槽に戻しキャピラリーの両端に7.5kVの直流
電圧を印加した。電流値は12〜15μAとなり、キャピラ
リー内には+極側から−極側に向かって緩衝液の流れが
生じ、標的DNA(RNA)とハイブリダイズしたラベル化オ
リゴヌクレオチドとハイブリダイズしていないラベル化
オリゴヌクレオチドは分離され蛍光検出器で検出され
た。すなわち、電気泳動開始後約10分に標的DNA(RNA)
とハイブリダイズしたラベル化オリゴヌクレオチドが検
出され、約25分にハイブリダイズしていないラベル化オ
リゴヌクレオチドが検出された。この結果から本発明の
方法によって標的DNAを簡便に検出することができるこ
とがわかる。
(発明の効果) 本発明を用いると従来法のようにメンブランフィルタ
ーに目的DNAを固定してハイブリダイゼーションを行う
煩雑さから開放される。また液相でハイブリダイゼーシ
ョンを行うためメンブランフィルターを使う時のように
オリゴヌクレオチドプローブのメンブランフィルター上
へ非特異吸着が避けられる。本発明はウイルスや細菌に
よる病気の診断等に用いられる方法に適用でき本発明を
用いることで目的DNAの検出が自動化できる。そのため
自動臨床検査機器への応用も可能である。
【図面の簡単な説明】
第1図は、本発明に係る方法を実施するための装置図で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) C12Q 1/68 Medline

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】目的DNAあるいはRNAの塩基配列の一部分に
    補助的な配列を持つラベル化オリゴヌクレオチドを、溶
    液中で目的DNAあるいはRNAと交雑せしめ、その溶液を分
    子量の大小、あるいは荷電の大小の差を利用して該オリ
    ゴヌクレオチドが交雑した目的DNAあるいはRNAと、交雑
    していないオリゴヌクレオチドを分離することにより特
    定の核酸の塩基配列を検出することを特徴とする核酸の
    検出法。
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