KR19990082229A - 뉴클레오사이드 유사체 - Google Patents

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KR19990082229A
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안토니 제이 롤린스
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Abstract

변성 염기 유사체 P 및 이들의 유도체를 함유하는 뉴클레오사이드 유사체가 신호 부분을 바람직하게 포함하는 리포터 부분과 함께 제공된다. 상기 뉴클레오사이드는 올리고뉴클레오티드 내로 삽입하거나 또는 DNA 또는 RNA를 라벨링하는데 유용하다.

Description

뉴클레오사이드 유사체
핵산은 매우 다양한 연구 및 진단 기술에서 인 비트로 (in vitro) 상에서 조작된다. 본 발명의 방법은 염기 서열 확인의 결정 또는 라벨링 (labelling)을 위한 폴리머라아제 (polymerase) 또는 말단 트랜스퍼라아제 (terminal transferase) 효소에 의한 핵산 표지체 (probe)의 합성에 관한 것이다. 라벨링은 종종 검출 가능하도록 하는 특정 화학적 조성물이거나 화학적으로 라벨되는 뉴클레오타이드의 삽입을 포함한다. 이러한 방법으로 제조된 핵산 표지체는 상기 타겟 (target)에 상기 표지체를 교잡시킴으로써 상보적 서열을 갖는 핵산 타겟의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다.
화학적으로 라벨되거나 또는 다른 방법으로 변형된 뉴클레오티드를 DNA에 삽입시키는 또다른 방법은 뉴클레오사이드 포스포라미다이트 (nucleoside phosphoramidite) 또는 올리고뉴클레오티드 합성에서 어떤 바람직한 서열내로 함께 연결되어서, 그 최종 생성물이 폴리머라아제의 사용에 의해 만들어진 DNA와 유사한 다른 전구체를 이용하는 화학적 합성을 포함한다.
어떤 경우에 있어서, 이는 상기 천연 염기의 염기쌍 특이성을 갖지 않는 올리고- 또는 폴리-뉴클레오티드로 염기 유사체를 삽입시키는데 유용하다. 본 발명은 하나 이상의 뉴클레오티드로 염기쌍을 형성할 수 있으며, 수용체 군을 운반하는 신규한 뉴클레오사이드를 기술한다.
P Kong Thoo Lin 및 D M Brown은 변성 염기 유사체 P (6H, 8H-3-4-디하이드로피리미도[4,5-c][1,2]옥사진-7-온 (6H,8H-3-4-dihydropyrimido[4,5-c][1,2] oxazin-7-one))을 함유하는 모노머 (monomer)의 합성을 보고하였다 (Nucleic Acids Research, 1989, 17권, 10373-10383쪽). 아미노 및 이미노 (imino) 토토머 (tautomer) 내에 존재하는 상기 염기 유사체의 능력에 기인하여, 이는 퓨린 (purine) 염기 A 및 G 모두와 염기쌍을 이룰 수 있다. 저자들은 하나 또는 그이상의 P 염기를 함유하는 올리고머 (oligomer)는 모 (parent) 이중나선에 비교할 만한 안정성을 갖는 DNA 이중나선구조를 형성하며, 이는 또한 용융시 예리한 전이상태를 보였음을 발견하였다. 또다른 증거는 염기쌍 P/A 및 P/G는 필수적으로 왓슨-크릭 타입임을 확인하였다.
저자들은 또한, 상기 염기가 변성 위치에 놓여질 때, 결과적으로 다중-사슬 프라이머 (primer)(또는 표지체)에 대한 요구를 피할 수 있으며, 상기 사슬의 다양성을 의미있게 감소시킬 수 있는, 교잡 표지체 및 프라이머 내에서 상기 염기 유사체의 사용을 강력히 주장한다. 사실상, 몇몇 P 염기를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 도트 블랏 (dot blot) 교잡화 및 DNA 서열화 실험에 효과적이었다.
Nucleic Acids Research, 1992, 20권, 19호, 5149-5142쪽에서, 상기 저자들은 또한 폴리머라아제 사슬 반응 (PCR) 실험에서 프라이머로서 3'-말단 및 그 외에서 상기 P 염기를 함유하는 올리고뉴클레오티드의 사용을 주장하였다.
퓨린 및 피리미딘 염기 뉴클레오사이드 및 뉴클레오티드는 리포터 (reporter) 군과 함께 유래되었으며, 공지되어 있고, DNA 또는 RNA를 라벨링하는데 사용되고 다른 분자생물학적 적용에 넓게 사용된다. 그러나, 상기 분자들은 A, C, G 및 T중 하나와 함께만 염기-쌍을 이룰 수 있으며, 상기 뉴클레오사이드 트리포스페이트 (triphosphate)는 종종 효소 기질로서 부적절하다. 그의 트리포스페이트가 우수한 효소 기질이며, 예를 들면, 두 개의 피리미딘 (T/C) 또는 두 개의 퓨린 (A/G)과 같은 둘 또는 세 개의 천연 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는 능력을 가짐으로써, 또는 일반적으로, 식별법 없이 상기 천연 염기 각각과 염기-쌍을 형성함으로써 변성인 염기 유사체를 갖는 뉴클레오사이드 유사체가 요구된다. 본 발명은 상기 요구를 충족시키기 위하여 상기 P 염기를 사용한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 적어도 하나의 리포터 부분을 갖는 뉴클레오사이드 유사체를 제공한다:
X는 O, S, Se, SO, CO 또는 N-R7이고,
상기 점선은 R6및 R7사이의 적절한 연결을 나타내며,
R1, R2, R3및 R4은 서로 같거나 다르게, 각각 H, OH, F, NH2, N3, O-하이드로카빌 (hydrocarbyl), 또는 리포터 부분 (reporter moiety)이고,
R5은 OH 또는 모노-, 디- 또는 트리-포스페이트 또는 -티오포스페이트 (thiophosphate) 또는 대응 보라노포스페이트 (boranophosphate)이거나,
또는 R2및 R5중 하나는 포스포라미다이트 또는 폴리뉴클레오티드 사슬 내로 삽입하기 위한 다른 기이며,
Z는 O, S, Se, SO, NR9또는 CH2이고,
R6, R7, R8및 R9는 서로 같거나 다르게, 각각 H 또는 알킬 또는 아릴 (aryl) 또는 리포터 부분이며,
n은 0 또는 1이다.
뉴클레오사이드 유사체는 화학적이거나 효소적으로 올리고머성 또는 폴리머성 핵산 (DNA 또는 RNA) 사슬 내로 삽입될 수 있고, 이렇게 삽입될 때, 적절한 핵산 사슬 내로 스태킹 (stacking)하는 상보적 사슬 또는 염기 내의 핵산과 염기 쌍을 형성하는 분자이다.
리포터 부분은 다양한 것들 중 하나일 수 있다. 이는 상기 뉴클레오사이드 유사체가 쉽게 검출 가능하게 하는 방사선 동위원소일 수 있으며, 예를 들면, 포스페이트 또는 티오포스페이트 또는 포스포라미다이트 또는 H-포스페이트기, 또는 선택적으로 3-H 또는 125-1 내로 삽입된 쉽게 검출 가능한 32-P 또는 33-P 또는 35-S이다. 이는 질량 분석법에 의해 검출 가능한 안정한 동위원소일 수 있다. 이는 예를 들면, 효소, 햅텐 (hapten), 형광분자 (fluorophore), 화학발광성 기, 라만 라벨 (Raman label) 또는 전기화학적 라벨과 같은 신호 부분일 수 있다. 상기 리포터 부분은 상기 분자의 잔여 부분에 이를 연결시키는 연결기 및 신호 부분을 포함하며, 상기 연결기는 최대 30 탄소, 질소, 산소 및 황 원자의 사슬일 수 있으며, 이 분야에서 잘 알려져 있는 바와 같이 견고하거나 유연하며, 불포화된 것이거나 포화된 것이다. 상기 리포터 부분은 상기 분자의 나머지 부분에 이를 연결하는 연결기 및 고체 표면을 포함할 수 있다. 상기 리포터 부분은 말단을 갖는 연결기 또는 예를 들면, 핵산 사슬 내에 상기 뉴클레오사이드 유사체의 삽입 전 또는 후에 이에 의해 신호 부분 및/또는 고체 표면이 접촉될 수 있는 NH2, OH, COOH, CONH2또는 SH와 같은 다른 반응성기로 이루어 질 수 있다. 상기 리포터 기는 공지되어 있으며, 문헌에 기술되어 있다.
R1, R2, R3및 R4는 각각 H, OH, F, NH2, N3, O-알킬 또는 리포터 부분일 수 있다. 결과적으로 리보뉴클레오사이드 및 데옥시리보뉴클레오사이드 및 디데옥시리보뉴클레오사이드가 다른 뉴클레오사이드 유사체와 함께 구상된다. 이러한 당 치환체들은 하나 또는 둘의 상기 염기 내에 존재하는 것에 부가하여 리포터 부분을 포함할 수 있다.
R5은 OH 또는 모노-, 디- 또는 트리-포스페이트 또는 -티오포스페이트 또는 대응 보라노포스페이트이다. 선택적으로, R2및 R5중 하나는 포스포라미다이트 또는 H-포스페이트 또는 메틸포스페이트 또는 포스포로티오에이트 (phosphorothioate) 또는 예를 들면, 헤미석시네이트 (hemisuccinate) 조절된 기공 유리와 같은 고체 표면상의 적절한 연결제, 또는 일반적으로 화학적 방법에 의해 폴리뉴클레오티드 사슬 내에 삽입하기 위한 다른 기일 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 합성하는데 있어서 포스포라미다이트 및 관련된 유도체들의 사용은 공지되어 있으며, 문헌에 기술되어 있다. 뉴클레오사이드 (R5는 OH)로부터 문헌의 방법에 의해 대응 뉴클레오티드 (R5은 트리포스페이트)를 쉽게 만들 수 있다.
본 발명의 목적인 신규한 뉴클레오사이드 유사체들에 있어서, 적어도 하나의 리포터 부분이 상기 당 부분 또는 포스페이트 기 또는 염기 유사체에 바람직하게 존재한다. 리포터 부분은 문헌의 방법 (예를 들면,J. Chem. Soc. Chem. Commun.1990, 1547-8:J. Med. Chem., 1988, 31, 2040-8 참조)에 의해 뉴클레오사이드 유사체의 당 부분으로 삽입될 수 있다. 동위원소 라벨 형태의 리포터들은 문헌의 방법 (Analytical Biochemistry, 214, 338-340, 1993; WO 95/15395)에 의해 포스페이트 기 내로 삽입될 수 있다.
본 발명이 관련된 염기 유사체는 하나의 고리가 점선으로서 식에 나타난 선택적 이중 결합을 함유하는 융합된 환 구조이다. 이중 결합이 존재할 때, 상기 고리는 평면이고, 어떠한 나사선성 (chirality) 문제도 발생하지 않는다. 단일 결합이 존재할 때, 리포터 부분 R6또는 R8의 삽입은 나사선 중심을 만든다. 만일 나사선성이 상기 리포터가 핵산 나선 구조의 뒤가 아니라 밖으로 부착하도록 선택된다면 이는 이로울 수 있다.
본 발명의 뉴클레오사이드 유사체들은 하나 이상의 염기를 대치시킬 수 있는 플로레세인-dUTP (fluorescein-dUTP)와 같은 통상적인 햅텐 라벨된 뉴클레오티드 또는 더 효율적인 효소적 삽입의 장점과 함께, 올리고뉴클레오티드 내로의 삽입 또는 DNA 또는 RNA를 라벨링하는데 유용하다. 리포터 부분은 상기 뉴클레오사이드 유사체의 물리적 또는 생화학적 특성, 특히 Tm을 의미있게 감소시키지 않고 단일 가닥 및 이중 가닥 핵산 내로 삽입되는 능력을 방해하지 않는 위치에 부착된다. 본 발명의 삽입된 뉴클레오사이드 유사체를 함유하는 주형 (template)은 핵산 합성에서 복제 (copying)에 적합하다. 만일 삽입된 뉴클레오사이드 유사체의 리포터 부분이 연결기로 이루어져 있다면, 상기 연결기의 말단 반응성기를 통하여 부착됨으로써 삽입된 뉴클레오사이드 유사체 내로 신호 부분이 삽입될 수 있다.
상술된 상기 뉴클레오사이드 유사체에서, 데옥시 또는 디데옥시 또는 다른 치환된 리보오즈 (ribose) 부분은 1'-위치에서 염기 유사체에 연결된다. 상기 염기 유사체는 바람직하게, 항체와 결합하도록 하는 햅텐으로서 작용할 수 있으며, 리포터 부분이 존재하든 부재하든 간에 이를 행할 수 있다. 또다른 목적으로, 본 발명은 뉴클레오사이드 유사체를 검출하는 방법을 제공하며, 리포터 부분이 존재하든 부재하든 간에, 상기 뉴클레오사이드 유사체는 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산 사슬에 삽입될 수 있고, 상기 방법은 이들의 염기 유사체에 결합하는 항체를 검출에 사용하는 단계를 포함한다.
프라이머 워킹 시퀀싱 (primer walking sequencing)에서, 프라이머/주형 복합체는 전기영동 및 검출 (방사선 동위원소 또는 형광제) 후 상기 서열이 읽혀지는 안긴 세트 (nested set)의 단편들을 생성하기 위해 종결된 사슬 및 폴리머라아제와 함께 확장된다. 그 후, 제 1 프라이머로부터 얻은 서열의 말단에 인접한 서열 정보를 이용하여 제 2 프라이머가 합성된다. 상기 제 2 ("워킹") 프라이머는 그 후, 동일한 주형을 서열화 (sequencing)하는데 사용된다. 프라이머 워킹 시퀀싱은 선택적인 "쇼트 건 (shot gun)" 방법보다 덜 풍부한 서열 정보를 생성한다는 의미에서 더 효율적이다.
프라이머 워킹의 주요한 단점은 서열화의 각 라운드 (round) 후 워킹 프라이머를 합성할 필요가 있다는 점이다. 사이클 (cycle) 시퀀싱은 상기 사이클 시퀀싱에 사용되는 폴리머라아제에 대한 최적 온도에 가까운 어닐링 (annealing) 온도를 갖는 프라이머를 필요로 한다. 사이클 시퀀싱에 18과 24 잔기 길이 사이의 프라이머가 일반적으로 사용된다. 필요한 전합성된 워킹 프라이머의 크기는 프라이머 워킹 사이클 시퀀싱을 비실용적으로 만든다. 변성 또는 전체적인 뉴클레오사이드 유사체의 사용은 이러한 문제를 극복한다. 또한, 예를 들면 본 발명의 뉴클레오사이드 유사체와 같은 라벨된 상기 유사체의 사용은 상기 문제를 극복하는데 도움을 줄 것이다. 상기 목적을 위한 바람직한 리포터 부분은 통상적인 사이클 시퀀싱 반응에 사용되는 방서성 동위원소 또는 형광성 기이다.
본 발명의 뉴클레오사이드 유사체들은 또한 예를 들면, 서던 블랏 (Southern blots), 도트 블랏 (dot blot) 상, 폴라아크릴아마이드 (polyacrylamide) 또는 아가로우즈 (agarose) 겔 기초 방법에서, 햅텐 또는 형광분자 또는 다른 리포터 기로 라벨된 천연 핵산 표지체를 사용하는 현행 적용 중 하나에 사용될 수 있다. 상기 표지체들은 스스로 부가적인 화학적 변형을 피하는데 유리한 염기 유사체 또는 염기 유사체에 부착되는 햅텐에 대하여 타겟된 항체와 함께 검출될 수 있다. 상기 방법에 사용된 항체들은 일반적으로, 형광분자 또는 효소와 같은 검출 가능한 기로 라벨된다. 만일 상기 염기 유사체 자체가 형광성이거나, 상기 뉴클레오사이드 유사체에 부착된 형광분자가 있다면 형광 검출법도 또한 사용될 수 있다.
분자의 변화 및 리포터 기가 첨가될 수 있는 위치 수의 증가로 본 발명의 뉴클레오사이드 유사체들은 일련의 향상된 효소 기질을 만들 수 있다.
아데닌 및 구아닌과 함께 쌍을 이루는 그의 이미노 및 아미노 토토머성 형태의 본 발명의 뉴클레오사이드 유사체는 하기 화학식 2로 표시된다. 각 경우에 있어서, C1은 데옥시 또는 디데옥시 또는 다른 치환된 리보오즈 부분을 나타낸다.
5-알릴-2'-데옥시유리딘 (5-allyl-2'-deoxyuridine)은 하기 실시예에 기술된 P 염기 유사체 (X=O) 범위의 합성을 위한 최조 제조 차단제 (building block)이다. 5-알릴-2'-데옥시유리딘의 합성은 대응 5-알릴-유리딘 유도체에 따라, J.L. Ruth 및 D.E.BergstromJ. Org. Chem.43, 2870-2876 (1978)에 의해 기술되어 있다. 화학적 합성법의 분야에 능통한 자에게, 상기 5-알릴-유리딘 리보오즈 당 상의 적절한 보호기에 의해, 실시예 화합물 (2.4), (3.6), (3.7), (4.4)의 관련된 리보오즈 유도체 및 이들과 관련한 트리포스페이트 유도체들이 쉽게 합성될 수 있음은 명백하다. 상기 보호기는 결과적으로 상기 기술된 합성법을 통하여 사용된 동일한 실릴 (silyl) 보호기를 보유한 tert-부틸디메틸실란 (tert- butyldimethylsilane)일 수 있다. 실시예 6에서, 실시예 화합물 (6.4), (7.3), (7.4) 및 (8.5)의 리보오즈 유도 유사체를 제공하는데 사용될 수 있는 보호된 5-(2 -클로로에틸)-유리딘의 제조를 위한 방법이 기술되어 있다.
유사하게, 화학적 합성법의 분야에 능통한 자에게, 하기 실시예 내에 기술된 리보 또는 데옥시 리보 화합물들은 공지의 방법에 의해 디데옥시 유도체로 쉽게 전환될 수 있음은 분명하다.
실시예 1
3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-5-(카보닐메틸)-2'-데옥시유리딘(1,3)[3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxanylidene))-5-(carbonylmethyl)-2'-deoxyuridine(1,3)] 및 3',5'-O-(1,3- (1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-5-(2,3-에폭시프로필)-2'-데옥시유리딘(1,4) [3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxanylidene))-5- (2,3-epoxypropyl)-2'-deoxyuridine(1,4)] 의 합성
3'5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-5-(2-프로페닐)-2'-데옥시유리딘 (1.1)의 제조
5-알릴-2'데옥시유리딘은 문헌 방법에 따라 제조되었다; G.B.Dreyer & P.B.Dervan,Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 82, 968-972 (1985); J.L.Ruth & D.E.Bergstrom,J. Org. Chem., 43, 2870, (1978).
5-알릴-2'-데옥시유리딘 (11.3g, 42mmol)을 우선 건조 피리딘 내에 두번 용해시키고 감소된 압력 하에서 건조될 때까지 증발을 두 번 시행하여 건조하였다. 결과적으로 생성된 거품 덩어리 (foam)는 건조 피리딘 (50ml) 내에 재용해되었고, 질소 분위기 하에 놓여졌으며, 얼음-물 중탕에서 0℃로 냉각되었다. 1,3-디클로로-1,1,3,3-테트라이소프로필디실록산 (12.6g, 42mmol)을 주사기를 통하여 5분에 걸쳐 상기 용액에 첨가하였다. 결과적인 혼합물을 실온에서 16시간동안 교반하였고, 그 후, 감소된 압력 하에서 증발에 의해 용매를 제거하였다. 잔여물은 에틸 아세테이트와 물 사이에 분배되었다; 유기층을 모아 물과 브린 (brine)으로 세척하고, 건조시키며 (Na2SO4), 여과하고, 감소된 압력 하에서 밀한 고체로 증발시켰다. 이를 플래쉬 (flash) 칼럼 크로마토그래피 (실리카; 에닐 아세테이트 50%:라이트 페트롤륨 (light petroleum) 50%)로 정제하여 목적 화합물 (1.1) 14.5g (68%)을 얻었다. Mpt. 168℃; UV (CHCl3) 268nm.
δH(300 MHz;CDCl3) 0.85-1.05 (28H, m, Si-iPrx4), 2.18-2.48 (2H, m, 당 2'), 3.02 (2H, m, -CH 2-CH=CH2), 3.72 (1H, m, 당 4'), 3.99 (2H, m, 당 5'), 4.45 (1H, m, 당 3'), 5.78 (1H, m, 5.06 (2H, m, -CH2-CH=CH 2), 5.78 (1H, m, -CH2-CH=CH2), 6.02 (1H, m, 당 1'), 7.24 (1H, s, C6), 8.44 (1H, s, N3)ppm.
3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-5-(2(R,S),3-디하이드록시프로필)-2'-데옥시유리딘 (1.2)의 제조
3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록시닐리덴))-5-(2-프로페닐)-2'-데옥시유리딘 (1.1) (7.0g, 13.7mmol) 및 N-메틸모폴린(methylmorpholine)-N-옥사이드 (4.7g, 40mmol)를 아세톤 (200ml)에 용해시켰다. 상기 용액에 물 (10ml) 내 포타슘 오스메이트 디하이드레이트 (potassium osmate dihydrate) (50mg) 용액을 5분간 점적하여 첨가하였다. 결과적인 혼합물을 실온에서 16시간동안 교반시킨 후, 증발시켜 용매를 제거하였다. 잔여물은 디에틸 에테르와 물 사이에서 분배되었다; 유기층을 남기고, 물과 브린으로 세척한 후, 건조 (Na2SO4)시키고 여과하며, 감소된 압력 하에서 증발시켰다. 상기 잔여물은 플래쉬 칼럼 프로마토그래피 (실리카; 5-15% 메탄올/디클로로메탄)에 의해 목적 화합물 (1.2)을 흰색 거품 덩어리, 5,4g (72%)로 얻었다. UV (CHCl3) 270nm.
δH(300 MHz;CDCl3) 0.89-1.06 (28H, m, Si-iPrx4), 1.5-2.0 (1H, broad, OH), 2.14-2.57 (4H, m, 당 2'+ -CH 2-CHOH-CH2OH), 3.47-3.80 (5H, m, 당 4'+ CH2-CHOH-CH 2OH + OH), 3.97-4.09 (2H, m, 당 5'), 4.46 (1H, m, 당 3'), 6.04 (1H, m, 당 1'), 7.44+7.47 (1H, 2s, C6 부분입체 이성질체), 9.0-9.4 (1H, broad, N3) ppm.
3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-5-(카보닐메틸)-2'-데옥시유리딘 (1.3)의 제조
3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-5-(2(R,S),3-디하이드록시프로필)-2'-데옥시유리딘 (2,18g, 4.0mmol)을 테트라하이드로퓨란 (50ml)에 용해시킨 후, 물 (40ml)을 첨가하였다. 상기 용액에 물 (10ml) 내 소듐 페리오데이트 (sodium periodate) (0.94g, 4.4mmol) 용액을 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 2시간동안 교반시킨 후, 디에틸 에테르와 물 사이에서 분배시켰다. 유기층을 남기고, 물과 브린으로 세척한 후 건조 (Na2SO4)시키고 여과하며, 감소된 압력 하에서 증발시켰다. 상기 잔여물은 플래쉬 칼럼 프로마토그래피 (실리카; 4% 메탄올/디클로로메탄)에 의해 목적 화합물 (1.3)을 흰색 거품 덩어리, 1.9g (93%)로 얻었다. Mpt. 187℃; UV (CHCl3) 268nm.
δH(300 MHz;CDCl3+ CD3CO2D) 0.8-1.1 (28H, m, Si-iPrx4), 2.24-2.54 (2H, m, 당 2'), 3.39 (2H, s, -CH 2-CHO), 3.76 (1H, m, 당 4'), 4.05 (2H, m, 당 5'), 4.45 (1H, m, 당 3'), 6.02 (1H, m, 당 1'), 7.56 (1H, s, C6), 8.46 (1H, s, N3), 9.70 (1H, s, CH2-CHO) ppm.
3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-5-(2,3-에폭시프로필)-2'-데옥시유리딘 (1.4)의 제조
3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-5-(2-프로페닐)-2'-데옥시유리딘 (1.1) (2,04g, 4.0mmol)을 디클로로메탄 (25ml)에 용해시킨 후, 상기 용액에 3-클로로퍼옥시벤조익산 55% (1.3g = 4.1mmol mCPBA)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 16시간동안 교반시켰다. 그 후, 10% 소듐 카보네이트 수용액으로 세 번 세척한 후, 브린으로 세척하였다. 이를 건조 (Na2SO4)시키고, 여과하며, 감소된 압력 하에서 증발시켜 고체를 얻었으며, 이를 플래쉬 칼럼 프로마토그래피 (실리카; 25% 에틸 아세테이트/디클로로메탄)에 의해 정제하였고, 목적 화합물 (1.4) 1.25g (59%)을 얻었다. UV (MeOH) 266nm.
δH(300 MHz;CDCl3) 0.96-1.08 (28H, m, Si-iPrx4), 2.30-2.52 (4H, m, 당 2'+ -CH 2-CH(O)CH2), 2.65-2.77 (2H, m, -CH2-CH(O)CH 2), 3.11 (1H, m, -CH2-CH(O)CH2), 3.75 (1H, m, 당 4'), 4.03 (2H, m, 당 5'), 4.50 (1H, m, 당 3'), 6.06 (1H, m, 당 1'), 7.41+7.44 (1H, 2s, C6 부분입체 이성질체), 8.57 (1H, s, N3) ppm.
실시예 2
6-(2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-3(R,S)-메틸-8 H -피리미도[4,5-c][1,2]옥사진-7-온 (2.4)의 합성
3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-5-(2(R,S)-하이드록시프로필)-2'-데옥시유리딘 (2.1)의 제조
질소 하, 0℃에서 메틸 마그네슘 브로마이드 (에테르 내 1.4M 용액 35ml, 49mmol)에 건조 에테르 (35ml) 내 3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-5-(카모닐메틸)-2'-데옥시유리딘 (1.3) 및 3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-5-포밀(formyl)-2'-데옥시유리딘 (프로톤(proton) NMR에 의한 3:1 혼합물 3.95g, 약 7mmol*) 및 아세트산 (100μl, 1.75mmol)을 15분에 걸쳐 점적 첨가법으로 첨가하였다. 포화된 염화암모늄 용액 (약 200ml)으로 쏟아 중단시키기 전에, 상기 반응 혼합물을 0℃에서 30분 동안 질소 하에서 교반시켜 방치하였다. 상기 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하였고, 유기 상을 물, 브린, 0.1M HCl로 세척하였고, 벌크 (bulk)한 마그네슘 염을 제거하기 위해 다시 브린으로 세척하였다. 감소된 압력 하에서 유기층을 제거하였고, 결과적으로 생긴 잔여물로 메탄올/디클로로메탄 5:95 용출 용매를 이용하여 실리카 겔 플래쉬 칼럼 정제법을 시행하였다. 목적 화합물 (2.1) 및 대응 3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴)-5-(1(R,S)-하이드록시에틸)-2'-데옥시유린으로 이루어진 1.79g의 고무질 (gum)을 얻었다. 프로톤 NMR에 의한 비율 2.2:1. TLC상에서 메탄올/디클로로메탄 5:95에서의 Rf는 각각 0.27 및 0.31.
혼합 생성물의 데이터: δH(300 MHz;CDCl3), 0.9-1.1 (28H, m, SiCH(CH3)2) 1.20-1.22 (3H, d의 쌍, 부분입체 이성질성 CH3), 2.25-2.6 (4H, m, CH22' CH25), 3.8 (1H, m, H4'), 3.7-4.05 (3H, m, CHOH-CH3CH25'), 4.5 (1H, m, H3'), 6.05 (1H, m, H1'), 7.41-7.46 (1H, s의 쌍, H6), 8.43 (1H, s, NH) ppm.
*NB 상기 포밀 (formyl) 종은 화합물 (1.3)의 제조 동안 과-산화에 의해 생성되며, 정제 절차 동안 제거되지 않았다. 대응 5-(1-R,S)-하이드록시에틸은 목적 화합물의 신호와 겹쳐질 뿐만 아니라, δ1.46-1.49 (d의 쌍, 부분입체 이성질성 CH3) 4.65 (m. CHOH-CH3) 7.50-7.58 (s의 쌍, H6) ppm에서 프로톤-NMR 신호를 갖는다.
3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-5-(2(R,S)-프탈리미도-옥시프로필)-2'-데옥시유리딘 (2.2)의 제조
실온, 질소하에서 건조 THF (40ml) 내의 상기 1-(R,S)-하이드록시에틸 유사체 (1.79g, (2.1)의 약 3.4mmol)와 혼합된 3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-5-(2(R,S)-하이드록시프로필)-2'-데옥시유리딘 (2.1)에 트리페닐포스핀 (triphenylphosphine) (0.886g, 3.4mmol), N-하이드록시프탈이미드 (N-hydroxyphthalimide) (0.551g, 3.4mmol) 및 디에틸 아조디카르복실레이트 (diethyl azodicarboxylate) (0.58ml, 3.7mmol)을 첨가하였다. 노란색으로 엷어지는 일시적인 붉은 색이 되었다. 상기 반응 혼합물은 그 후 실온에서 20시간동안 질소 하에서 교반하여 방치되었다. 감소된 압력 하에서 용매를 제거하고, 결과적으로 형성된 잔여물에 에테르, 라이트 페트롤륨, 디클로로메탄 70:15:15을 용출액으로 사용하여 실리카 플래쉬 칼럼 크로마토그래피를 시행하였다. 수율 1.07g. TLC 에테르 용출액 상에서 두 개의 부분입체 이성질체에 대한 Rf 0.47 및 0.55.
δH(300 MHz;CDCl3) 0.9-1.05 (28H, m, SiCH(CH3)2), 1.3-1.4 (3H, d의 쌍, 부분입체 이성질성 CH3), 2.4-2.75 (4H, m, =C-CH2, CH22'), 3.75 (1H, m, H4'), 4.0 (2H, m, CH25') 4.2-4.6 (2H, m, H3' 및 NOCH부분입체 이성질성 쌍), 6.1-6.25 (1H, m의 쌍, 부분입체 이성질성 H1'), 7.65-7.82 (5H, m, ArH, H6), 8.22-8.25 (1H, s의 쌍, 부분입체 이성질성 NH) ppm.
1-(3,5-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-4-트리아졸로-5-(2(R,S)-프탈리미도-옥시프로필)-1 H -피리미딘-2-온 [1-(3,5-O-(1,3-(1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxanylidene))-2- deoxy-β-D-ribofuranosyl)-4-triazolo-5-(2(R,S)-phthalimido-oxypropyl)-1 H -pyrimidin-2-one] (2.3)의 제조
0℃에서 건조 아세토니트릴 (30ml)에 용해된 1,2,4-트리아졸 (4.2g, 60.7mmol)에 트리에틸아민 (10.3ml, 73.5mmol)을 첨가한 후, 아세토니트릴 (10ml)에 용해된 포스포러스 옥시클로라이드 (phosphorus oxychloride) (1.15ml, 12.4mmol)를 10분에 걸쳐 점적하여 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃ 질소 하에서 10분간 교반한 후, 실온에서 20분간 교반하였다. 상기 반응 혼합물에 건조 아세토니트릴 (20ml)에 용해된 3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-5-(2(R,S)-프탈리미도-옥시프로필)-2'-데옥시유리딘 (2.2) (1.07g)을 20분에 걸쳐 점적하여 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 감소된 압력 하에서 반응 용매를 제거하기 전에 실온에서 50분간 교반하였다. 잔여물은 디클로로메탄과 브린 사이에서 분배되었다. 유기 상을 모아서, 마그네슘 설페이트 (magnesium sulphate)로 건조시키고, 감소된 압력 하에서 고무질로 될 때까지 농축시켰다. 생성물 정제는 에테르, 에테르/에틸 아세테이트 1:1 및 최종적으로 순수한 에틸 아세테이트로 이루어진 그래디언트 (gradient) 용출액을 사용하여 겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 수행하여 고무질로써 상기 목적 화합물 (2.3)을 얻었다. 수율 0.59g. 상기 두 개의 부분입체 이성질체에 대한 실리카 TLC 상에서 에틸 아세테이트 내의 Rf 0.24 및 0.29.
δH(300 MHz;CDCl3) 0.9-1.2 (28H, m, SiCH(CH3)2), 1.4-1.52 (3H, d의 쌍, 부분입체 이성질성 CH3), 2.5-3.0 (3H, m, 당 H2 및 H2', =C-CH2로부터 1H), 3.4-5.3 (6H, m의 시리즈, 당 H4, H3, 2×H5 및 =C-CH2로부터 1H, NOCH), 6.04-6.25 (1H, m의 쌍, 부분입체 이성질성 =CH), 8.26-8.4 (1H, s의 쌍, 부분입체 이성질성 트리아졸 H), 9.3-9.35 (1H, s의 쌍, 부분입체 이성질성 쌍 트리아졸 H) ppm.
6-(2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-3(R,S)-메틸-8 H -피리미도[4,5-c][1,2]옥사진-7-온[6-(2-deoxy-β-D-ribofuranosyl)-3,4-dihydro- 3(R,S)-methyl-8 H -pyrimido[4,5-c][1,2]oxazin-7-one (2.4)의 제조
1-(3,5-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-4-트리아졸-5-(2(R,S)-프탈리미도-옥시프로필)-1H-피리미딘-2-온 (2.3) (0.59g, 0.81mmol)을 암모니아 (100ml)로 포화된 건조 디옥산 (dioxan)에 용해시키고, 상기 용액을 실온에서 18시간동안 교반시켰다. 감소된 압력 하에서 상기 디옥산을 제거하고, 고리화된 생성물을 에테르를 용출액으로 사용하여 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제시켜 무색 고무질을 얻었다. 수율 310mg. 실리카 TLC 상에서 에테르 내 Rf 0.44; 어떠한 부분입체 이성질체의 분리도 관찰되지 않았다.
상기 당은 하기 방법으로 보호해제되었다: 테트라하이드로퓨란 (5ml)에 용해된 상기 물질 (208mg, 0.4mmol)로부터 얻은 생성물에 테트라-n-뷰틸암모늄 플루오라이드 (THF내의 1.0M 용액 435㎕, 0.44mmol)를 첨가하였고, 상기 혼합물을 실온에서 5분동안 교반하였다. 감소된 압력 하에서 상기 용액을 제거하였고, 상기 생성물을 메탄올/에틸 아세테이트 1:9를 사용하여 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 깨끗한 고무질로서 목적 화합물 (2.4)을 얻었다. 수율 84mg. 실리카 TLC 상에서 메탄올/에틸 아세테이트 1:9 내 Rf 0.33; 어떠한 부분입체 이성질체 분리도 관찰되지 않았다.
δH(300 MHz;CD3OD) 1.2 (3H, d, CH3 Ｊ6.2Hz), 2.04-2.08 (2H, m, CH2-), 2.18-2.27 (1H, m, 당 H2), 2.52-2.57 (1H, m, 당 H2), 3.6-3.75 (3H, m, 당 2×H5 및 CH-CH3), 3.75 (1H, m, 당 H4), 4.27 (1H, m, 당 H3), 6.15 (1H, m, 당 H1), 7.00 (1H, s,HC=C)ppm.
화합물 (2.1)의 제조에서14C 메틸 마그네슘 브로마이드의 사용은 상기 합성을 방사성 종의 공식적 합성이 되게 한다.
실시예 3
6-(2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-3(R,S)-(N(2,4-디니트로페닐아실(dinitrophenylacyl))-3-아미노프로필)-8 H -피리미도[4,5-c][1,2]옥사진-7온 [3.6] 및 6-(2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-3(R,S)-(N-(6-(플로레세인-5-(및-6)-카르복사미도헥사노일(carboxamidohexanoyl)))-3-아미노프로필)-8 H -피리미도[4,5-c][1,2]옥사진-7온 [3.7]의 합성
3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-5-(N-(4-메톡시트리페닐메틸)-5-아미노-2(R,S)-하이드록시페닐)-2'-데옥시유리딘 (3.1)의 제조
실온, N2하에서 건조 에테르 (20ml) 내의 마그네슘 터닝스 (turnings) (520mg, 217mg 원자)에 요오드 결정을 첨가하고, 무수 에테르 (20ml) 내 2,2,5,5-테트라메틸-1-아자(aza)-2,5-디실라사이클로펜탄(disilacyclopentane)-3-브로모프로판 (5.46mg, 27.3mmol)을 천천히, 점적하여 첨가하였다. 첨가가 완결된 후, 추가 30분동안 실온, N2하에서 교반하여 그리냐드 (Grignard) 제법을 시행하였다. 형성된 2,2,5,5-테트라메틸-1-아자-2,5-디실라사이클로펜탄-1-프로필마그네슘 브로마이드 (하기 참조)에 무수 테트라하이드로퓨란 (40ml) 내 아세트산 (100㎕, 1.75mmol) 및 3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-5-(2-카보닐메틸)-2'-데옥시유리딘 화합물 (2.45g, 4.79mmol) 용액을 15분에 걸쳐 천천히 점적하여 첨가하였다. 반응의 완결을 확실히 하기 위해, 상기 반응 혼합물을 N2하에서 추가 30분 동안 실온에서 교반하였다. 포화된 NH4Cl 용액 (250ml) 및 브린 (100ml)내에 쏟아서 상기 반응을 중단시켰다. 감소된 압력 하에서 유기 용매를 제거하고, 계속적으로 결과물을 디클로로메탄 (×3)으로 추출하였다. 상기 디클로로메탄 추출물은 마그네슘 설페이트와 결합, 건조되었고, 감소된 압력 하에서 농축되어서 높은 진공 하에서 건조된 고무질로 되었다. 상기 고무질을 디클로로메탄 (20ml) 및 4-메톡시트리페닐메틸 클로라이드 (1.77g, 5.75mmol) 내에 용해시키고, 무수 트리에틸아민 (3.3ml, 23.95mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 18시간동안 교반하여 방치하였다. 상기 유기 용액을 브린 (×1)으로 세척하고, 마그네슘 설페이트로 건조하고, 최종적으로 감소된 압력 하에서 고무질로 농축하였다. 생성물 정제는 용출액 에테르, 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 수행되었고, 연노란 색 거품 덩어리로서 목적 화합물 (3.1)을 얻었다. 수율 2.45g, 61%. 실리카 TLC 상 에테르 내 Rf 0.41.
δH(300 MHz;CDCl3) 0.95-1.0 (2.8H, m, Si-CH(CH 3)2), 1.4-1.6 (4H, m, CH2CH2), 2.1-2.6 (6H, m, CH2N, =C-CH2, H2, H2'), 3.7-3.8 (5H, m, OCH3, H4, CH-OH), 3.9-4.1 (2H, m, H5), 4.5 (1H, m, H3), 6.05 (1H, m, H1), 6.8 (2H, d, ArH), 7.15-7.46 (15H, m, ArH, =CH) ppm.
F.Z.Basha 및 J.F.DeBernardis.Tetrahedron Lett.25, 5271, 1984 참조.
3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-5-(N-(4-메톡시트리페닐메틸)-5-아미노-2(R,S)-프탈리미도-옥시펜틸)-2'-데옥시유리딘 (3.2)의 제조
이는 알코올 (3.1) (2.35g)과 함께 출발한 3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-5-(2-(R,S)-프탈리미도-옥시펜틸)-2'-데옥시유리딘(2.2)과 유사한 방법으로 제조되었다. 라이트 페트롤륨/디클로로메탄 내에서의 분쇄 및 반복적인 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (에틸 아세테이트-클로로포름-트리에틸아민 10:89:1-20:79:1 그래디언트)에 의한 천연물의 정제로 트리페닐포스핀 옥사이드로 오염된 목적 화합물 (3.2) (ca. 2.0g)을 얻었다.
δH(300 MHZ;CDCl3) 0.81-1.13 (28H, m, 4×Me2CH), 1.61-1.87 (4H, m, 3"-CH2및 4"-CH2), 2.06-2.19 (2H, m, 5"-CH2), 2.35-2.50 (2H, m, 2'-CH2), 2.50-2.81 (2H, m, 1"-CH2), 3.68-3.83 (1H, m, 4'-CH), 3.76 (3H, s, Ar-OMe), 3.94-4.08 (2H, m, 5'-CH2), 4.26-4.37 (0.5H, m, 2"-CH), 4.37-4.50 (0.5H, m, 2"-CH), 4.50-4.65 (1H, m, 3'-CH), 6.15 및 6.23 (각각 0.5H, app. t, 1'-CH), 6.71-6.82 (2H, m, ArH), 7.08-7.84 (16.5H, m, 16ArH + 0.56-CH), 7.92 (0.5H, s, 6-CH) 및 8.29 (1H, broad, NH)ppm.
1-(3,5-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-4-트리아졸로-5-(N-(4-메톡시트리페닐메틸)-5-아미노-2(R,S)-프탈리미도-옥시펜틸)-1 H -피리미딘-2-온 (3.3)의 제조
이는 1-(3,5-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-4-트리아졸로-5-(2(R,S)-프탈리미도-옥시헥스(oxyhex)-5-엔틸(entyl))-1H-피리미딘-2-온 (2.3)과 유사한 방법으로 제조되었다. 불순물 (3.2) (2.0g)은 끈끈한 고무질로서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (에틸 아세테이트-라이트 페트롤륨 80:20) 후 목적 화합물 (3.3) (1.29g)로 되었다.
δH(300 MHz;CDCl3) 0.77-1.13 (28H, m, 4xMe2CH), 1.42-1.98 (4H, m, 3"CH2및 4"CH2), 2.03-2.19 (2H, m, 5"-CH2), 2.35-2.50 (1H, m, 2'-CHH), 2.50-2.68 (1H, m, 2'-CHH), 2.76 (0.5H, dd,J15.0 및 10.3Hz, 1"-CHH), 2.98 (0.5H, dd,J14.7 및 8.4Hz, 1"-CHH), 3.41 (0.5H, dd,J15.0 및 3.8Hz, 1"-CHH), 3.63-3.77 (0.5H, m, 1"-CHH), 3.70 (3H, s, ArOMe), 3.77-3.87 (1H, m, 4'-CH), 4.92-5.23 (3H, m, 5'-CH2및 2"-CH), 5.38 (1H, m, 3'-CH), 6.00 (0.5H, d,J5.5Hz, 1'-CH), 6.13 (0.5H, dd,J7.3 및 1.8Hz, 1'-CH), 6.73 (2H, m, ArH), 6.98-7.45 (12H, m, ArH), 7.58-7.74 (4.5H, m, 0.5×6-CH 및 4×프탈리미드 H), 7.86 (0.5H, s, 6-H), 8.18, 8.31, 9.18 및 9.26 (각각 0.5H, s, 트리아졸라이드 H) ppm.
6-(2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-3(R,S)-(N-(4-메톡시트리페닐메틸)-3-아미노프로필)-8 H -피리미도[4,5-c][1,2]옥사진-7-온 (3.4)의 제조
1-(3,5-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-4-트리아졸-5-(N-(4-메톡시트리페닐메틸)-5-아미노-2(R,S)-프탈리미도-옥시펜틸)-1H-피리미딘-2-온 (3.3) (1.29g, 1.24mmol)을 실시예 (2.4)와 유사한 방법으로 반응시켜서 용출용매로서 메탄올:디클로로메탄, 5:95을 이용하여 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피 후 깨끗한 거품 덩어리로서 목적 화합물 (3.4)을 얻었다. 수율 0.50g, 68%. 실리카 TLC 상에서 메탄올:디클로로메탄, 5:95 내 Rf 0.31.
δH(300 MHz;CDCl3) 1.4-1.6 (4H, m, CH2-CH2), 2.0-2.35 (6H, 당 H2, H2', CH2, CH2N), 3.4 (1H, m, NO-CH), 3.6-3.7 (5H, m, OCH3, 당 2×H5), 3.8 (1H, m, 당 H4), 4.37 (1H, m, 당 H3), 6.05 (1H, m, 당 H1), 6.6-6.7 (3H, m, =CH, Ar 2×H), 7.0-7.3 (12H, m, ArH) ppm.
6-(2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-3(R,S)-(N-(2,4-디니트로페닐아실)-3-아미노프로필)-8 H -피리미도[4,5-c][1,2]옥사진-7-온 (3.6)의 제조
6-(2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-3(R,S)-(N-(4-메톡시트리페닐메틸)-3-아미노프로필)-8H-피리미도[4,5-c][1,2]옥사진-7-온 (3.4) (0.26g, 4.35mmol)을 아세토니트릴 (5ml), 아세트산 (8ml) 및 물 (2ml)에 용해시키고, 실온에서 18시간동안 교반하여 방치하였다. TLC (메탄올:CHCl31:9)는 아민 보호해제가 완결되고, 자유 아미노 화합물 (3.5)이 기본선상에 남아있음을 지시하였다. 그 후 감소된 압력 하에서 반응 용매를 제거하고, 톨루엔 (×3)과의 공-증발 (co-evaporation) 후, 톨루엔 + 트리에틸아민 (0.5ml)(×3)과의 공-증발에 의해 최종 잔여 아세트산을 제거하였다. 상기 잔여 고무질을 CH2Cl2(10ml) 및 DMF (10ml)에 재용해시키고, 2,4-디나이트로페닐아세트산의 N-하이드록시석신이미딜 에스테르 (300mg, 0.93mmol)를 첨가하였으며, 반응물을 실온에서 두 시간동안 교반하였다. 톨루엔과의 고갈성 공-증발법 (exhaustive co-evaporation)에 의해 상기 반응 용매를 제거하였다. 상기 생성물은 CHCl3:메탄올:물, 80:18:2을 이용하여 초기 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피 칼럼 후, PRP-1 칼럼 및 아세토니트릴:물 그래디언트를 이용하여 최종적으로 hplc 정제법에 의해 정제되었으며, 연노란색 고무질로서 목적 화합물 (3.6)을 얻었다. 수율 136mg, 59%. 실리카 TLC 상에서 메탄올:CHCl31:9 내 Rf 0.2.
δH(300 MHz;CD3OD) 1.6-1.8 (4H, m, CH2CH2), 2.15 (2H, m, =CH-CH 2), 2.35 (1H, m, 당 H2), 2.65 (1H, m, 당 H2), 3.3 (2H, m, CH2NHC(O)), 3.6-3.8 (3H, m, 당 2×H5, =N-O-CH), 3.85 (1H, m, 당 H4), 4.07 (2H, s, C(0)-CH2-Ar), 4.35 (1H, m, 당 H3), 6.25 (1H, m, 당 H1), 7.09 (1H, s, =CH), 7.74 (1H, d, ArH,J8.4Hz), 8.46 (1H, dd, ArH,J8.4, 2.2Hz), 8.83 (1H, d, ArH,J2.2Hz) ppm.
표준 방법에 의해, 상기 물질은 필요하다면 포스포라미다이트 (phosphoramidite)로 전환될 수 있다. P.K.T.Lin 및 D.M.Brown,Nucleic Acids Res. 17, 10373 (1989) 참조.
6-(2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-3(R,S)-(N-(6-플로레세인-5-(및-6)-카르복사미도헥사노일(carboxamidohexanoyl))-3-아미노프로필)-8 H -피리미도[4,5-c][1,2]옥사진-7-온 (3.7)의 제조
6-(2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-3(R,S)-(N-(4-메톡시트리페닐메틸)-3-아미노프로필)-8H-피리미도[4,5-c][1,2]옥사진-7-온 (3.4) (44mg, 0.082mmol)을 실시예 (3.6)과 유사한 방법으로 보호해제시키고, 자유 아미노 기를 플로레세인-5(6)-카르복사미도카프로익 산 N-하이드록스석신이미드 (fluorescein- 5(6)-carboxamidocaproic acid N-hydroxsuccinimide) 에스테르 (65mg, 0.11mmol)와 반응시켰다. 생성물 정제는 용출용매로서 CHCl3:메탄올:물, 10:5:1을 이용하여 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 수행되었고, 오렌지색 고무질 형태로 목적 화합물을 얻었다. 수율 39mg, 49%. 실리카 TLC 상에서 CHCl3:메탄올:물, 10:5:1내 Rf 0.49.
δH(300 MHz;CDCL3) 1.3-1.7 (10H, m, -CH2-), 2.1-2.35 (5H, m, CH2C(O), =CH-CH 2, 당 H2), 2.55 (1H, m, 당 H2'), 3.1-3.2 (2H, m, CH2NHC(O)), 3.3-3.4 (2H, m, CH2NH(O)Ar), 3.5-3.×(3H, m, 당 2×H5, =N-O-CH), 3.8 (1H, m, 당 H4), 4.35 (1H, m, 당 H3), 6.25 (1H, m, 당 H1), 6.5-8.4 (10H, m의 시리즈, ArH, =CH) ppm.
실시예 4
6-(2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-3(R,S)-부트-4-에닐-8 H -피리미도[4,5-c][1,2]옥사진-7-온 (4.4)의 제조
3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-5-(2-(R,S)-하이드록시헥스-5-에닐)-2'-데옥시유리딘 (4.1)의 제조
알릴마그네슘 클로라이드 (THF내 2.0M 용액 25ml, 50mmol)를 -78℃에서 THF(132ml)내 브롬화 구리 (I)-디메틸 설파이드 복합체 (10.3g, 50.3mmol)의 교반된, 슬러리 (slurry)에 15분에 걸쳐 점적하여 첨가하였다. 40분 후, -78℃에서 냉각된 THF (80ml)내 에폭사이드 (1.4) (4.41g, 8.38mmol) 용액을 15분에 걸쳐 캐뉼라 (cannula)를 통하여 첨가하였고, THF (10ml) 세척하였다. 상기 반응 혼합물을 추가 70분동안 -78℃에서 교반한 후, 냉각 용기를 제거하고, 반응 혼합물을 60분 이상 주변온도로 가온시켰다. 그 후, 상기 혼합물을 캐뉼라를 통하여 Et2O(250ml), 포화된 NH4Cl(aq)(230ml) 및 진한 NH4OH(20ml)의 점액성 교반 혼합물에 첨가하였다. 상기 물질의 나머지 부분에 첨가된 Et2O(250ml), 포화된 NH4Cl(aq)(20ml) 및 진한 NH4OH(20ml) 혼합물로 상기 반응 용기를 세척하였다. 그 후, 상기 혼합물을 추가 30분동안 교반시키고 Et2O로 희석하였다. 수용액 상을 분리하여, Et2O로 완전히 추출하고, 결합된 유기 상을 브린으로 세척하고, 건조 (MgSO4)시키고, 진공 내 (in vacuo)에서 농축시켰다. TLC 및1H nmr 증거는 모두 요구된 생성물이 상기 브로모하이드린 (bromohydrin)의 실질적인 양으로 오염되었음을 제시하였다. 메탄올성 K2CO3로의 상기 천연 물질의 간단한 처리 후, 표준 추출 작업을 행하여, 초기 에폭사이드 (1.4)를 함유한 천연 혼합물을 제공하였고, 상기 요구된 목적 화합물 (4.1) 및 다른 물질은 실록시 (siloxy) 부분의 부분적인 절단에 기인한 것으로 사료되었다. 상기 천연물 (디클로로메탄-메탄올 100:0-95:5 그래디언트)의 플래쉬 칼럼 크로마토그래피로 초기 에폭사이드로 오염된 목적 화합물 (전체 2.72g)을 얻었다.
δH(300 MHz;CDCl3) 0.82-1.16 (18H, m, 4×Me2CH), 2.00-2.58 (8H, m, 2'-CH2, 1"+3"+4"-CH2), 3.68-3.82 (1H, m, 4'-CH), 3.93-4.13 (2H, m, 5'-CH2), 4.42-4.58 (1H, m, 3'-CH2), 4.90-5.10 (2H, m, 6"-CH2), 5.73-5.90 (1H, m, 5"-CH), 7.39 및 7.44 (각각 0.5H, s, 6-CH) 및 8.18 (1H, br s, NH) ppm.
3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-5-(2-(R,S)-프탈리미도-옥시헥스-5-에닐)-2'-데옥시유리딘 (4.2)의 제조
상기 화합물은 상기 에폭사이드 (1.4)로 오염된 3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-5-(2-(R,S)-하이드록시헥스-5-에닐)-2'-데옥시유리딘 (4.1) (전체 2.70g)을 이용하여 3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-5-(2-(R,S)-프탈리미도-옥시프로필)-2'-데옥시유리딘 (2.2)과 유사한 방법으로 제조되었다. 반복적 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (에틸 아세테이트-라이트 페트롤륨 1:5-7:3 그래디언트 및 디클로로메탄-메탄올 100:0-98.5:1.5 그래디언트) 후, 헥산/디클로로메탄 내에서 적정, 여과 및 여과액을 농축하여 상기 에폭사이드 (1.4)로 여전히 오염된 흰색 고체로서 목적 화합물 (4.2) (3.32g)을 얻었다.
δH(300 MHz;CDCl3) 0.77-1.16 (28H, m, 4×Me2CH), 2.18-2.68 (8H, m, 2'-CH2, 1"+3"+4"-CH2), 3.68-3.85 (1H, m, 4'-CH), 3.95-4.11 (2H, m, 5'-CH2), 4.35-4.63 (1H, m, 3'-CH), 4.90-5.13 (2H, m, 6"-CH2), 5.81 (1H, m, 5"-CH), 6.13 및 6.23 (각각 0.5H, m, 1'-CH), 7.39 및 7.44 (각각 0.5H, s, 6-CH), 7.71-7.84 (4H, m, ArH) 및 8.16-8.27 (1H, broad, NH) ppm.
1-(3,5-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-4-트리아졸로-5-(2(R,S)-프탈리미도-옥시헥스-5-에닐)-1 H -피리미딘-2-온 (4.3)의 제조
이는 불순한 2'-데옥시유리딘 (4.2) (3.3g)을 이용하여, 1-(3,5-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-4-트리아졸로-5-(2(R,S)-프탈리미도-옥시헥스-5-에닐)-1H-피리미딘-2-온 (2.3)과 유사한 방법으로 제조되었다. 반응 진행은 TLC (에틸 아세테이트)에 의해 모니터 (monitor)화되었고, 완결시 상기 혼합물을 여과하고, 고체를 Et2O로 세척하였다. 진공 내에서 상기 여과액을 농축시키고, 잔여물로 표준 추출 작업 (Et2O/H2O)을 시행하였다. 상기 천연물의 플래쉬 크로마토그래피 (에틸 아세테이트-라이트 페트롤륨 1:1-7:3 그래디언트)로 점액성 고체 형태로 목적 화합물 (4.3) (순수물 1.33g 및 불순물 1.1g)을 얻었다.
δH(300 MHz;CDCl3) 0.81-2.16 (28H, m, 4×Me2CH), 1.69-2.05 (2H, m, 3"-CH2), 2.05-2.55 (3H, m, 4"-CH2+2'CHH), 2.55-2.71 (1H, m, 2'-CHH), 2.85 (0.5H, dd,J15.0 및 9.9Hz, 1"-CHH), 3.05 (0.5H, dd,J14.7 및 8.4Hz, 1"-CHH), 3.47(0.5H, dd,J14.8 및 4.1Hz, 1"-CHH), 3.71 (0.5H, dd,J14.9 및 2.6Hz, 1"-CHH), 3.79-3.90 (1H, m, 4'-CH), 3.94-4.24 (3H, m, 5'-CH2+2'-CH), 4.39 (1H, m, 3'-CH), 4.90-5.10 (2H, m, 6"-CH2), 5.79 (1H, m, 5"-CH), 6.04 (0.5H, dd,J6.7 및 1.5Hz, 1'-CH), 6.17 (0.5H, dd,J7.4 및 2.1Hz, 1'-CH), 7.65-7.81 (4.5H, m, 4×ArH+0.56-CH), 7.95 (0.5H, s, 6-CH), 8.21, 8.33, 9.23 및 9.30 (및 0.5H, s, 트리아졸라이드 H) ppm.
6-(2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-3(R,S)-부트-5-에닐-8 H -피리미도[4,5c][1,2]옥사진-7-온 (4.4)의 제조
이는 6-(2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-3(R,S)-메틸-8H-피리미도[4,5c][1,2]옥사진-7-온 (2.4)과 유사한 방법으로 제조되었다. 트리아졸라이드 (triazolide) (4.3) (1.30g)는 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (디클로로메탄-메탄올 99:1-95:5 그래디언트) 후 보호된 고리화 물질을 점액성 거품 덩어리 (930mg)로 되었다.
부분적 프로톤 NMR 데이터: δH(300 MHz;CDCl3) 0.85-1.20 (28H, m, 4×Me2CH), 1.53-1.69 (1H, m, 1"-CHH), 1.75-1.90 (1H, m, 1"-CHH), 2.12-2.61 (6H, m, 3'-CH2+ 4-CH2+ 2"-CH2), 4.03 (2H, m, 5'-CH2), 4.46 (1H, m, 3'CH), 4.95-5.14 (2H, m, 6"-CH2), 5.83 (1H, m, 5"-CH), 6.08 (1H, m, 1'-CH), 6.73 및 6.76 (각각 0.5H, s, 6-CH) 및 8.53 (1H, br, s, NH).
테트라-n-부틸암모늄 플로라이드로 상기 물질 (ca. 450mg)의 일부의 처리 후 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (디클로로메탄-메탄올 95:5-90:10 그래디언트)하여, 점액성 고무질로서 목적 화합물 (4.4) (200mg)을 얻었다.
UV λmax(MeOH) 204, 232 and 298 nm.
δH(300 MHz;CD3OD) 1.53-1.79 (2H, m, 1"-CH2), 2.10-2.45 (5H, m, 4-CHH+ 2'-CH2+ 2"-CH2), 2.65 (1H, br d,J14.4Hz, 4-CHH), 3.53-3.82 (3H, m, 3-CH + 5'-CH2), 3.87 (1H, m, 4'-CH), 4.35 (1H, m, 3'-CH), 4.96 (1H, br d,J10.3Hz, 4"-CHH), 5.04 (1H, dd,J16.9 및 1.7Hz, 4"-CHH), 5.74 (1H, ddt,J16.9, 10.3 및 6.6Hz, 3"-CH), 6.26 (1H, m, 3'-CH), 7.1 (1H, s, 4-H) ppm.
δC(75 MHz;CD3OD) 30.24, 30.38, 30.50, 33.96, 34.01, 40.53, 62.99, 72.32, 72.34, 75.95, 85.53, 88.36, 101.70, 101.76, 115.52, 130.46, 139.07, 151.44, 151.51, 152.63 및 152.65ppm.
실시예 5
6-(2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-3(R,S)-(3,3-디O-(1,3-프로필리덴)-프로필)-8 H -피리미도[4,5c][1,2]옥사진-7-온 (4.4)의 합성
3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-5-(5,5-디O-(1,3-프로필리덴)-2(R,S)-하이드록시펜틸)-2'-데옥시유리딘 (5.1)의 제조
오븐-건조된 3-목 50ml 플라스크에 마그네슘 터닝스 (0.60g, 25mg 원자) 및 건조 디에틸 에테르 (5ml)를 첨가하였고, 상기 혼합물을 아르곤 분위기 하에서 교반하였다. 상기 물질에 잇단 발열반응을 조절하기 위한 비율로, 건조 테트라하이드로퓨란 (15ml)내 깨끗하게 증류된 2-(2-브로모에틸)-1,3-디옥산 (4.88g, 25mmol) 용액을 첨가하였다. 일단 모든 브로마이드 (bromide)가 첨가되면, 반응은 잠잠해진 후, 30분동안 (뜨거운 물 용기) 환류 가열되었다. 후기까지 거의 모든 마그네슘이 소비되고 연노란색 용액을 얻었다.
상기 용액 (12mmol 그리냐드 시약)의 대략 반을 2차 건조된, 아르곤-충진 용기로 옮겼다. 여기에 건조 테트라하이드로퓨란 (5ml) 및 아세트산 (40㎕)내 3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-5-(카보닐메틸)-2'-데옥시유리딘 (1.3) (1.64g, 3.2mmol)을 첨가하였다. 결과적으로 생긴 혼합물을 30분간 교반한 후, 포화된 염화암모늄 수용액으로 중단시키고, 디에틸 에테르로 추출하였다. 상기 결합된 에테르 추출물을 건조 (Na2SO4), 여과시키고, 감소된 압력 하에서 노란색 오일 (oil)이 될 때까지 증발시켰다. 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (실리카; 25% 라이트 페트롤륨/에틸 아세테이트)로 정제하여 회백색 거품 덩어리로서 목적 화합물 (5.1), 1.37g (68%)을 얻었다. UV (CHCl3) 270nm.
δH(300 MHz;CDCl3) 0.8-1.1 (28H, m, Si-iPrx4), 1.31 (1H, m, 프로필리덴 O-CH2-CHH-CH2-O), 1.40-1.75 (5H, m), 2.06 (1H, m, 프로필리덴 O-CH2-CHH-CH2-O), 2.23-2.58 (4H, m), 3.28 (1H, broad t, OH), 3.70-3.78 (4H, m, 당 4' + -CHOH + 프로필리덴 O-CH 2-CHH-CH2-O), 4.00-4.10 (4H, m, 당 5' + 프로필리덴 O-CH2-CHH-CH 2O), 4.48 (1H, m, 당 3'), 4.56 (1H, t,J4.5Hz, 아세탈 O-CH-O), 6.05 (1H, m, 당 1'), 7.36+7.42 (1H, 2s, C6 부분입체 이성질체), 8.60+8.62 (1H, 2s, N3 부분입체 이성질체) ppm.
3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-5-(5,5-디O-(1,3-프로필리덴)-2(R,S)-프탈리미도-옥시펜틸)-2'-데옥시유리딘 (5.2)의 제조
3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-5-(2-(R,S)-프탈리미도-옥시펜틸)-2'-데옥시유리딘 (2.2)과 같은 방법으로 제조되었다. UV (CHCl3) 242, 268nm.
δH(300 MHz;CDCl3) 0.86-1.11 (28H, m, Si-iPr×4), 1.23-1.30 (1H, m, 프로필리덴 O-CH2-CHH-CH2-O), 1.70-2.10 (5H, m), 2.37-2.71 (4H, m), 3.66-3.81 (3H, m, 당 4' + 프로필리덴 O-CH 2-CHH-CH2-O), 3.96-4.08 (4H, m, 당 5' + 프로필리덴 O-CH2-CHH-CH 2-O), 4.33-4.50 (1H, 2m, -CH(O-프탈리미드) 부분입체 이성질체), 4.50-4.60 (2H, m, 당 3' + 아세탈 O-CH-O), 6.13+6.22 (1H, 2 apparent t, 당 1' 부분입체 이성질체), 7.70-7.86 (5H, m, C6 + 프탈리미드 4H), 8.44+8.46 (1H, 2s, N3 부분입체 이성질체).
1-(3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-4-트리아졸로-5-(5,5-디O-(1,3-프로필리덴)-2(R,S)-프탈리미도-옥시펜틸)-1 H -피리미딘-2-온 (5.3)의 제조
1-(3',5'-O-(1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴))-2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-4-트리아졸로-5-(2-(R,S)-프탈리미도-옥시프로필)-1H-피리미딘-2-온 (2.3)과 같이 제조되었다. 다음 단계에 직접 사용되었다.
6-(2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-3(R,S)-(3,3-디O-(1,3-프로필리덴)-프로필)-8 H -피리미도[4,5c][1,2]옥사진-7-온 (5.4)의 제조
6-(2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-3(R,S)-메틸-8H-피리미도[4,5c][1,2]옥사진-7-온 (2.4)와 같이 제조되었다. 트리아졸라이드 (5.3) (0.50g)는 암모니아로 포화된 1,4-디옥산으로의 처리 및 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (실리카; 40% 에틸 아세테이트/디클로로메탄)에 의한 정제 후, 보호된 고리화 생성물 (0.28g)을 얻었다. UV (CHCl3) 302nm.
δH(300 MHz;CDCl3) 0.89-1.07 (28H, m, Si-iPr×4), 1.31 (1H, m), 1.50-2.53 (9H, m), 3.65-3.78 (4H, m, 당 4' + 고리 3-H + 프로필리덴 O-CH 2-CHH-CH2-O), 3.94-4.10 (4H, m, 당 5' + 프로필리덴 O-CH2-CHH-CH 2-O), 4.43 (1H, m, 당 3'), 4.55 (1H, broad t, 아세탈 O-CH-O), 6.03 (1H, m, 당 1'), 6.66+6.69 (1H, 2s, C5 부분입체 이성질체), 7.5-8.0 (1H, broad s) ppm.
테트라-n-부틸암모늄 플루오라이드로 상기 물질을 처리하여 목적 화합물 (100mg)을 얻었다. 상기 테트라-n-부틸암모늄 이온의 완전한 제거는 불가능하였다.
실시예 6
6-(2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-8 H -피리미도[4,5-c][1,2]피리다진(pyridazin)-7-온 (6.4) 및 5-(2-클로로에틸)-1-(2',3'-이소프로필리딘-β-D-리보퓨라노실)유리딘 (6.8)의 합성
5-(2-클로로에틸)-1-(3',5'-디O-디메톡시트리틸-2'-데옥시-β-D-리보퓨라노실)유리딘 (6.1)의 제조
5-(2-클로로에틸)-2'데옥시유리딘 (2g, 6.9mmol)을 피리딘 (40ml)에 용해시키고, 디메톡시트리틸 글로라이드 (7g, 21mmol)를 첨가하였으며, 상기 용액을 50℃에서 하룻밤동안 가열하였다. 용매를 증발시키고, 생성물을 클로로포름에 용해시켰으며, 소듐 바이카보네이트 (sodium bicarbonate) 용액으로 세척하고, 건조시키며, 감소된 압력 하에서 크로마토그래프화 (CHCl3)된 노란색 고무질로 될 때까지 증발시켜, 노란색 거품 덩어리를 얻었다. 수율 5.8g, 94%.
1-(3',5'-디O-디메톡시트리틸-2'-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-4-(1,2,4-트리아졸로)-5-(2-클로로에틸)-피리미드-2-온 (6.2)의 제조.
아세토니트릴 (100ml) 내 1,2,4-트리아졸 (6.4g, 9.3mmol)의 얼음-냉각 현탁액에 포스포러스 옥시클로라이드 (1.7ml, 2.8mmol)를 첨가하였고, 상기 용액을 0℃에서 15분간 교반하였다. 그 후 여기에 트리에틸아민 (15.5ml, 11.2mmol)을 첨가하였고, 상기 용액을 추가 15분간 교반하였다. 아세토니트릴 (25ml) 내 상기 트리틸화된 (tritylated) 뉴클레오사이드 (6.1) (5.5g, 6.1mmol)를 첨가하였고, 상기 용액을 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 용매를 제거하고, 결과물을 클로로포름에 용해시키며, 세척 (소듐 바이카보네이트), 건조 (소듐 설페이트)시키며, 크로마토그래피화 (CHCl3)된 갈색 고무질로 될 때까지 증발시켜, 노란색 거품 덩어리를 얻었다. 수율 6.1g, 105%.
1-(2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-4-(1,2,4-트리아졸로)-5-(2-클로로에틸)-피리미드-2-온 (6.3)의 제조
디클로로메탄 (100lm) 내 상기 뉴클레오사이드 (6.2) (6g, 6.3mmol) 용액에 트리클로로아세트산 (5.2g, 32mmol)에 첨가하였고, 상기 용액을 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 상기 용액을 농축하고, 크로마토그래피 (CHCl3후 CHCl3/5% MeOH)화시켜 흰색 고체를 얻었다. 수율 1.73g, 80%.
δH(DMSO-d6) 2.09-2.17, 2.35-2.41 (2H, m, H2', H2"), 3.20-3.30 (2H, m, C5-CH2), 3.58-3.77 (4H, m, H5', H5", CH2Cl), 3.89-3.93 (1H, m, H3'), 4.23-4.28 (1H, m, H4'), 5.23 (1H, br, s, OH), 5.32 (1H, br, s, OH), 6.11 (1H, T,J5.9 Hz, H1'), 8.40 (1H, s, 트리아졸로 CH), 8.69 (1H, s, H6), 9.33 (1H, s, 트리아졸로 CH) ppm. UV λmax321 (ε=5600), 249 (ε=6500), ε260 (μM)=4.9, pH 12(비가역)λmax267.
적은 양의 상기 트리아졸로 뉴클레오사이드 (6.3)를 아세토니트릴에 용해시키고, 무수 하이드라진을 처리하여 이중고리성 생성물 (6.4)를 얻었다. UVλmax280 (ε=14800).
5-(2-클로로에틸)-1-(2',3',5'-트리-O-아세틸-β-D-리보퓨라노실)유리딘 (6.6)의 제조
Griengl (J Med Chem28권, 1679-1684, 1985)에 의해 제조된 5-(2-클로로에틸)유라실 (6.5) (0.5g, 2.9mmol)을 헥사메틸디실라잔 (hexamethyldisilazane) (20ml) 및 클로로트리메틸실란 (1.5ml)과 함께 120℃에서 하룻밤동안 가열하였다. 이를 실온으로 냉각시키고, 증발한 후 건조 크실렌 (3×25ml)과 함께 공증발시키고, 그 후 건조 아세토니트릴 (25ml)에 용해시켰다. 1,2,3,5-테트라-O-아세틸 리보오즈 (1.0g, 3.1mmol)를 건조 아세토니트릴 (25ml)에 용해시킨 후, 요오드화 나트륨 (1.29g, 8.6mmol)을 첨가하고, 용해시켰다. 그 후, 여기에 클로로트리메틸실란 (0.55ml, 4.3mmol)을 첨가하고, 상기 용액을 실온에서 20분간 교반하였다. 그 후, 상기 물질을 실릴화된 (silylated) 염기에 첨가하고, 전체물을 실온에서 2시간동안 교반하였다. TLC는 하나의 주 점을 나타낸다. 상기 용액은 그 후 증발되고 클로로포름에 재용해되었으며, 우선 소듐 바이카보네이트 용액으로, 그 후 소듐 티오설페이트 용액으로 추출되었고, 건조상태까지 건조 및 증발되었다. 그 후 잔여물을 칼럼 크로마토그래피 (실리카, 클로로포름 내지 클로로포름/2% 메탄올 그래디언트)로 정제하여, 흰색 거품 덩어리로서 생성물을 분리하였다. 생성물은 TLC 상에서 p-아니스알데히드 (anisaldehyde) 용액 (아니스알데히드, 황산, 에탄올; 1:1:10)으로 염색하고, 상기 판을 가열함으로써 관찰되었다. 수율 0.88g, 71%.
δH(DMSO-d6) 2.00, 2.04, 2.07 (9H, 3×s, 3×COCH3), 2.66(2H, t,J6.9Hz, 5-CH2), 3.70 (2H, t,J6.9Hz, CH2Cl), 4.18-4.33 (3H, m), 5.31-5.36 (1H, m), 5.41-5.45 (1H, m), 5.89 (1H, d,J5.2Hz, 1'-CH), 7.66 (1H, s, 6-CH), 11.56 (1H, s, NH) ppm.
5-(2-클로로에틸)-1-(β-D-리보퓨라노실)유리딘 (6.7)의 제조
5-(2-클로로에틸)-1-(2',3',5'-트리-O-아세틸-β-D-리보퓨라노실)유리딘 (15g, 34.76mmol)을 포타슘 카보네이트 (메탄올/물, 3:1 내 0.5M) (350ml)에 용해시켰다. 2시간 후, TLC는 모든 출발 물질이 기본선 근처의 생성물로 전환되었음을 나타내었다. 상기 용액의 pH에 의해 나타난 바와 같이 상기 염기를 중화시키기 위해 가-세척된 Dowex 50W×8 이온 교환 수지 (H+ 형태)를 첨가하였다. 상기 고체 수지를 여과하고, 메탄올/물, 3:1로 세척하였다. 메탄올을 진공 내에서 증발시키고, 상기 용액을 물 (300ml)로 희석하였다. 그 후, 상기 수용액은 디클로로메탄 (2×100ml)으로 추출하였고, 수용액 층을 건조상태까지 증발하였다. 그 후, 상기 고체 잔여물을 에탄올로 재결정하여, hplc (mp 158-160℃)에 의해 균질화된 무색의 목적 화합물 (6.7)을 얻었다. 수율 7.7g, 76%.
5-(2-클로로에틸)-1-(2',3'-이소프로필리딘-β-D-리보퓨라노실)유리딘 (6.8)의 제조
5-(2-클로로에틸)-1-(β-D-리보퓨라노실)유리딘 (6.7) (0.85g, 2.8mmol)을 아세톤 (30ml)에 용해시키고, p-톨루엔 설포닉산 수화물 (0.506g, 2.66mmol)을 첨가한 후, 트리에틸 오쏘포르메이트 (orthoformate) (1.66g, 11.2mmol)을 첨가하였다. 우선 상기 비용해성 뉴클레오사이드를 15분 내에 용해시켜 약한 노란색의 용액을 얻었다. 2.5시간동안 교반한 후, TLC (디클로로메탄/메탄올; 9:1)는 모든 출발 물질이 새로운 점 Rf 0.52으로 전환되었음을 나타내었다. 상기 휘발성 물질을 진공 내에서 증발시키고, 상기 잔여물은 디포타슘 하이드로겐 포스페이트 용액 (0.815g 포스페이트를 함유하는 수용액 25ml)으로 처리하였으며, 에틸 아세테이트 (2×30ml)로 추출하였다. 상기 유기 추출물을 물 (2×40ml)로 세척한 후, 브린 (40ml)으로 세척하고, 유기 층을 소듐 설페이트로 건조하였다. 상기 추출물을 건조상태까지 여과 및 증발시킨 후, 생성물을 디클로로메탄/아세토니트릴 7:3을 이용하여 용출하는 실리카 겔에 대한 크로마토그래피에 의해 정제하여 무색 고체 (0.8g, 86%)로서 목적 화합물을 얻었다. TLC (디클로로메탄/아세토니트릴; 7:3, Rf 0.21); h.p.l.c.에 의한 순도 (C-18 칼럼, 40% 아세토니트릴, 60% 0.1M 트리에틸암모늄 아세테이트) > 98%.
δH(CDCl3) 7.54 (1H, s), 5.75 (1H, d), 4.81 (2H, m), 4.18(1H, m), 3.80-3.55(4H, m), 2.66 (2H, m), 1.49 (3H, s), 1.26 (3H, s) ppm. δ13C(CDCl3) 163.488 (C), 150.367 (C), 139.650 (CH), 113.759 (C), 110.271 (C), 92.957 (CH), 86.480 (CH). 84.108 (CH), 80.352 (CH), 61.952 (CH2), 42.683 (CH2), 30.352 (CH2), 27.069 (CH3) 25.139 (CH3).
실시예 7
2-벤질-6-(2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-8 H -피리미도[4,5-c][1,2]피리다진-7-온 및 2-(3-하이드록시벤질)-6-(3,5-디-O-p-톨루오일-2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-8 H -피리미도[4,5-c][1,2]피리다진-7-온의 합성
1-(3,5-디-O-p-톨루오일-2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-4-(1,2,4-트리아졸로)-5-(2-클로로에틸)-피리미드-2-온 (7.1)의 제조
1,2,4-트리아졸 (12.1g, 176mmol)을 0℃에서 아세토니트릴 (250ml)에 현탁시키고, 여기에 포스포러스 옥시클로라이드 (3.8ml, 40mmol)를 첨가하였으며, 상기 용액을 0℃에서 15분간 교반하였다. 그 후, 여기에 트리에틸아민 (30ml, 214mmol)을 첨가하고, 상기 용액을 0℃에서 추가 30분간 교반하였다. 그 후, 여기에 아세토니트릴 (50ml) 내 3'.5'-디-O-p-톨루오일-2'-데옥시리보퓨라노실-5-(2-클로로에틸)-유라실 (5.3g, 10.5mmol) 용액을 첨가하고, 상기 용액을 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 상기 용액을 증발시키고, 클로로포름에 용해시키고, 소듐 바이카보네이트 수용액으로 세척하였으며, 고무질로 될 때까지 건조 및 증발시키고, 상기 고무질을 크로마토그래피 (CHCl3/2% MeOH)로 정제하여 흰색 거품 덩어리를 얻었다. 수율 5.82g, 96%.
δH1.7 (1H, s), 2.35 (3H, s,), 2.42 (3H, s,), 3.16 (1H, s,), 3.20 (2H,), 3.65 (2H,), 4.68 (1H, d,), 4.70 (1H,), 4.88 (1H,), 5.60 (1H,), 6.35 (1H,), 7.18 (2H,), 7.25 (2H), 7.82 (2H,), 7.95 (2H,), 8.15 (1H), 8.20 (1H,), 9.3 (1H,) ppm. FAB mass 578.4, C29H28CIN5O6은 577.5을 요한다.
정확한 질량 측정치 577.17299.
2-벤질-6-(3,5-디-O-p-톨루오일-2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-8 H -피리미도[4,5-c][1,2]피리다진-7-온 (7.2)의 제조
에탄올 (200ml) 내 트라이졸 (7.1) (6.35g, 11mmol) 및 벤질하이드라진 디하이드로클로라이드 (2.35g, 12.1mmol) 용액에 트리에틸아민 (6ml)을 첨가하고, 상기 용액을 하룻밤동안 환류 가열하였다. 상기 용액을 증발하고, 크로마토그래피 (EtOAc:헥산 1:1 후, CHCl3/MeOH 2-5%)하여 4개의 생성물을 얻었다. 생성물 1은 C4-O-에틸 유도체 (0.76g)로 확인되었고, 화합물 3은 5-환 고리 생성물 (2.9g)로, 화합물 4는 미-확인 (3.1g)되었다. 화합물 2는 의도한 생성물 (1.29g, 20%)로 확인되었다; δH(DMSO-d6) 2.23-2.56 (6H, m, CH2N, C5-CH2, H2', H2"), 2.35 (3H, s, CH3), 2.37 (3H, s, CH3), 3.92 (2H, s, CH2Ph), 4.36-4.38 (1H, m, H4'), 4.46-4.61 (2H, m, H5', H5"), 5.52-5.54 (1H, m, H3'), 6.26 (1H, t,J6.5 Hz, H1'), 6.58 (1H, s, H6), 7.21-7.35 (9H, m, PhthCH, ArCH), 7.86-7.91 (4H, m, ArCH), 10.13 (1H, s, NH) ppm. FAB mass 595.2 (M+H).
2-벤질-6-(2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-8 H -피리미도[4,5-c][1,2]피리다진-7-온 (7.3)의 제조
상기 화합물 (7.2) (1.4g, 2.35mmol)을 메탄올 (50ml) 내에서 현탁시키고, 여기에 소듐 메톡사이드 (140mg, 2.6mmol)를 첨가하였으며, 상기 용액을 실온에서 1시간동안 교반하였다. 용매를 제거하고, 생성물을 크로마토그래피 (CHCl3/10% MeOH)하여 연노란색 분말을 얻었다. 수율 0.61g, 72%. δH1.88-2.03 (2H, m, H2', H2"), 2.45-2.50 (2H, m, CH2N), 2.59-2.63 (2H, m, CH2C(5)), 3.41-3.54 (2H, m, H5', H5"), 3.65-3.66 (1H, m, H4'), 3.92 (2H, s, CH2Ph), 4.16 (1H, m, H3'), 4.89 (1H, t, 5'-OH), 5.15 (1H, d, 3'-OH), 6.13 (1H, t,J6.1 Hz, H1'), 6.74 (1H, s, H6), 7.21-7.34 (5H, m, Ph), 9.98 (1H, s, NH) ppm. UV λmax295 (ε=7800). ε260 (μM)=5.7.
2-(3-하이드록시벤질)-6-(3,5-디-O-p-톨루오일-2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-8 H -피리미도[4,5-c][1,2]피리다진-7-온 (7.4)의 제조
에탄올 (25ml) 내 트리아졸 (7.1) (1g, 1.7mmol) 및 3-하이드록시벤질하이드라진 디하이드로클로라이드 (0.73g, 3.5mmol) 용액에 트리에틸아민 (0.72g, 5.2mmol)을 첨가하고, 상기 용액을 50℃에서 2일간 가열하였다. 상기 용액을 감소된 압력 하에서 증발시키고, 크로마토그래피 (디클로로메탄:에틸 아세테이트 1:1 후, CHCl3/MeOH 2%)로 정제하여 2개의 생성물을 얻었다. 생성물 1은 5-환 고리 화합물 (0.57g, 54%)로 확인되었다. 화합물 2는 의도한 생성물 (7.4) (0.39g, 37%)로 확인되었다. δH(DMSO-d6) 2.36, 2.38 (6H, 2×s, 2×ArCH3), 2.43-57 (4H, m, H2', H2", C5-CH2), 3.45 (2H, t,J7.6 Hz, N-CH2), 3.93 (2H, d,J4.7 Hz, CH2Ph), 4.43-4.63 (3H, m, H4', H5', H5"), 5.54-5.57 (1H, m, H3'), 5.67 (1H, t,J4.7 Hz, NH), 6.36 (1H, t,J6.7 Hz, H1'), 6.63 (1H, d,J7.7 Hz, Ph-H6), 6.75-6.78 (2H, m, Ph-H2, Ph-H4), 7.09 (1H, t,J7.7 Hz, Ph-H5), 7.30-7.37 (5H, m, 4×ArCH, H6), 7.85-7.92 (4H, m, ArCH), 9.34 (1H, s, OH) ppm.
실시예 8
1 및 2-(6'-(플로레세인-5-카르복사미도헥사노일))-6-(2'-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-8 H -피리미도[4,5-c][1,2]피리다진-7-온-5'-트리포스페이트 (8.5)의 합성
6-(3,5-디아세틸-2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-8 H -피리미도[4,5-c][1,2]피리다진-7-온 (8.1)의 제조
1-(3,5-디-O-아세틸-2-데옥시리보퓨라노실)-4-(1,2,4-트라이졸로)-5-(2-클로로에틸)피리미도-2-온 (P.Kong Thoo Lin 및 D.M.Brown,Nucleic Acids Res.17, 10373-10383, 1989)(0.25g, 0.6mmol)을 건조 디클로로메탄 (10ml)에 용해시키고, 무수 하이드라진 (37㎕, 1.2mmol)을 첨가하였으며, 상기 용액을 실온에서 30분간 교반하였다. 상기 용액을 농축하고, 크로마토그래피 (클로로포름/10% 메탄올)로 정제하여 목적 화합물 (8.1)을 흰색 고체로 얻었다. 수율 0.2g, 100%.
δH(DMSO-d6) 1.96, 2.01 (6H, 2×s, 2×CH3CO), 2.15-2.45 (2H, m, H2', H2"), 2.75 (2H, t,J6.8Hz, CH2), 3.6 (1H, br, s, NH), 3.83 (2H, t,J6.8Hz, CH2N), 4.12-4.14 (1H, m, H4'), 4.21-4.24 (2H, m, H5', H5"), 5.17-5.20 (1H, m, H3'), 6.18 (1H, t,J6.2Hz, H1'), 7.17 (1H, s, H6), 9.72 (1H, s, NH) ppm. m/z 352 M+. 정확한 질량 측정치 352.1376 (C15H2ON4O6) 오차 -0.7ppm. UV λmax279.6 (ε=14800).
1 및 2-(6-(트리플루오로아세타미도)헥사노일)-6-(3',5'-디아세틸-2'-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-8 H -피리미도[4,5-c][1,2]피리다진-7-온 (8.2)의 제조
무수 디클로로메탄 (25ml) 내 상기 3',5'-디아세틸 뉴클레오사이드 (8.1) (350mg, 1mmol) 교반 용액에 N-(트리플루오로아세틸)-6-아미노헥사노익 산 (356mg, 1.1mmol)의 N-하이드록시석신이미딜 에스테르 및 트리에틸아민 (110mg, 1.1mmol)을 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서 4시간동안 교반하였다. 그 후, 상기 용액을 건조상태까지 농축하였고, 5% 메탄올/클로로포름 내 반응 혼합물의 얇은 층 크로마토그래피는 두 개의 부 생성물 및 하나의 주 생성물의 존재를 지시하였다. 상기 주생성물을 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 흰색 고체 화합물을 얻었으나, 그 부분적인 이성질체는 유용한 데이터로부터 분류될 수 없었다.
δH(CDCl3) 1.27-1.79 (6H, m, 3×CH2), 2.10, 2.14 (6H, 2×s, 2×COCH3), 2.12, 2.41 (2H, m, H2', H2"), 2.73 (2H, t,J6.8Hz, NCOCH2), 3.22-3.47 (3H, m, CH2N), 3.70 (2H, t,J6.8Hz, C5-CH2), 4.14-4.43 (3H, m, H5', H5", H3'), 5.11-5.25 (1H, m, H4'), 6.24 (1H, t,J6.6Hz, H1'), 7.31 (1H, s, H6) 9.56, 11.38 (2×s, NH) ppm.
1 및 2-(6-(트리플루오로아세타미도)헥사노일)-6-(2'-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-8 H -피리미도[4,5-c][1,2]피리다진-7-온 (8.3)의 제조
N-트리플루오로아세틸헥사노일 연결제 (8.2) (500mg, 0.9mmol)를 함유한 상기 3',5'-디아세틸 뉴클레오사이드를 메탄올 (20ml)에 용해시키고, 실온에서 상기 교반 용액에 소듐 메톡사이드 메탄올 용액 (2.0ml, 0.5M, 1.0mmol)을 첨가하였다. 20분 후, 상기 용액을 감소된 압력 하에서 증발하고, 결과물을 실리카 겔 칼럼 (CHCl3/10% 메탄올)상에서 크로마토그래피하여 목적 화합물 (8.3) (250mg, 56%)을 흰색 고체로서 얻었다.
δH(DMSO-d6) 1.27-1.52 (6H, m, 3×CH2), 1.84-2.50 (2H, m, H2', H2"), 2.18 (2H, t,J6.8Hz, NCOCH2), 2.85 (2H, m, CH2N), 3.19 (1H, m, CHN), 3.39 (1H, m, CHN), 3.52 (2H, m, C5-CH2), 3.70-3.81 (3H, m, H5', H5", H3'), 3.39-4.01 (1H, m, H4'), 6.18 (1H, t,J6.6Hz, H1'), 7.71 (1H, s, H6), 9.43, 10.22 (2×s NH) ppm.
1 및 2-(6-아미노헥사노일)-6-(2'-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-8 H -피리미도[4,5-c][1,2]피리다진-7-온-5'-트리포스페이트 (8.4)의 제조
트리메틸포스페이트 (2ml) 내 2-(6-트리플루오로아세타미도)헥사노일)-6-(2'-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-8H-피리미도[4,5-c][1,2]피리다진-7-온 (8.3) (220mg, 0.46mmol)의 교반 및 냉각 (0℃) 용액에 POCl3(65㎕, 0.69mmol)를 첨가하였다. 한 시간 후, 상기 반응 혼합물에 bis-n-트리부틸암모늄 피로포스페이트 (4.72ml, 2.30mmol) 및 n-트리부틸아민 (547ml, 2.30mmol)의 0.5M DMF 용액을 일제히 처리하였다. 실온에서 10분간 상기 반응 혼합물을 교반한 후, 이를 1.0M TEAB (트리에틸암모늄 바이카보네이트)로 중화시키고, 실온에서 하룻밤동안 교반하였으며, 감소된 압력 하에서 증발하고, 얻어진 잔여물을 물 (30ml)에 용해시켰다. 결과적으로, 상기 천연 트리포스페이트를 Sephadex 칼럼 (500ml)상에 점적하고, 0.05 (2L) 내지 1.0M TEAB (2L, pH=7) 그래디언트를 이용하여 2ml/분의 유속으로 원하는 트리포스페이트를 용출하였다.31P nmr, δp(D2O/EDTA) -10.36 (d, γ-P), -10.86 (d, α-P), -22.79 (t, β-P) ppm으로 이를 특징화한 후, 상기 아미노 기를 보호해제하기 위해 상기 트리포스페이트에 30% NH4OH (6ml)를 하룻밤동안 처리하였다. 상기 반응 혼합물을 감소된 압력 하에서 증발하고, Waters Delta Pak 15 마이크론 C18 칼럼 (5cm×30cm)을 이용하여 0-100% 완충액 A (0.1M TEAB) 및 완충액 B (0.1M TEAB 내 25% CH3CN)의 그래디언트 조건 하에서 30분에 걸쳐 130ml/분의 속도로 세미-프렙-HPLC (semi-prep-HPLC)를 하여 얻어진 잔여물을 정제하였다. 원하는 트리포스페이트 (8.4) 분획을 모아서 증발하고 동결건조하여 순수물 (8.4) (83mg, 19.45%)을 트리에틸암모늄 염의 형태로 얻었다.
1 및 2-(6'-(플로레세인-5-카르복사미도헥사노일))-6-(2'-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-8 H -피리미도[4,5-c][1,2]피리다진-7-온-5'-트리포스페이트 (8.5)의 제조
0.2M Na2CO3-NaHCO3완충액 (800㎕ pH 8.5) 내 상기 트리포스페이트 (8.4) (5mg, 0.05mmol)의 교반 용액에 실온에서 5-카르복시플로레세인 (10mg, 0.02mmol)의 N-하이드록시석신이미딜 에스테르의 무수 DMF 용액 (600㎕)를 첨가하고, 계속하여 하룻밤동안 교반하였다. 감소된 압력 하에서 상기 반응 혼합물을 증발한 후, 얻어진 노란색 잔여물을 최소량의 1:1 메탄올 수용액에 용해시키고, 35-70 마이크론 실리카 겔 60 (EM-Separations, 상품 번호 9389-5)으로 최대 20cm 높이까지 충진된 유리 칼럼 (40cm×2cm)상에 점적하였다. 1:1 클로로포름/메탄올 내지 순수 메탄올을 이용하여 과량의 염료를 용출하였고, 6:3:1 i-PrOH:NH4OH:H2O를 이용하여 원하는 뉴클레오티드-플로레세인 콘쥬게이트 (conjugate)를 용출하였고, 모아서 증발한 후 (8.4)를 노란색 고체로서 얻었다. 화합물 (8.5)은 0-50% 완충액 A (0.1M TEAB, pH 7.1) 및 완충액 B (0.1M TEAB 내 25% 아세토니트릴, pH 7.0)의 그래디언트 조건 하에서 30분간 15/분의 속도로, 15 마이크론 Delta Pak C18 칼럼 (1.9cm×30cm) 상에서 HPLC에 의해 정제되었다. 원하는 화합물 (8.5) 분획을 모아서 증발하고 동결건조하여 순수물 (8.5)을 노란색 고체 (정량적 수율)로서 얻었다.
실시예 9
뉴클레오사이드 트리포스페이트의 합성
모든 하기 트리포스페이트들은 트리포스페이트 실시예 (8.4)와 유사한 방법으로 제조되었다.
6-(2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-3(R,S)-메틸-8 H -피리미도[4,5-c][1,2]옥사진-7-온-5'-트리포스페이트 (9.1)
상기 물질은 뉴클레오사이드 (2.4)로부터 유도되었다.
δP(121 MHz;D2O)-10.91 (d, γ-P),-11.51 (d, α-P) 및 -23.33 (t, β-P).
6-(2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-3(R,S)-부트-5-에닐-8 H -피리미도[4,5c][1,2]옥사진-7-온-5'-트리포스페이트 (9.2)
상기 물질은 뉴클레오사이드 (4.4)로부터 유도되었다.
δH(300 MHz;D2O/KOH) 1.65 (2H, m, 알릴), 2.0-2.8 (6H, m), 3.65 (1H, m, 당), 4.0 (3H, m, 당+H3), 4.5 (1H, broad, 당), 4.9 (2H, dd, 알릴), 5.75 (1H, m, 알릴), 6.2 (1H, m, 당), 7.0 (1H, s) ppm.
δP(121 MHz;D2O/KOH) -5.84 (d, γ-P), -11.00 (d, α-P) 및 -21.88 (t, β-P).
6-(2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-3(R,S)-(N(2,4-디니트로페닐아실)-3-아미노프로필)-8 H -피리미도[4,5c][1,2]옥사진-7-온-5'-트리포스페이트 (9.3)
상기 물질은 뉴클레오사이드 (3.6)으로부터 유도되었다.
δH(300 MHz;D2O) 2.0-2.4 (3H, m), 2.6-3.0 (4H, m), 3.8 (1H, m, 당), 4.0 (3H, m, 당 +H3), 4.45 (1H, m), 6.15 (1H, m, 당), 7.1 (1H, 2×s) ppm.
δP(121 MHz;D2O/H2O) -10.83 (d, γ-P), -11.46 (d, α-P) 및 -21.19 (t, β-P).
실시예 10
삼중수소화된 6-(2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-3(R,S)-부틸-8 H -피리미도[4,5c][1,2]옥사진-7-온 (10.1)의 합성
메탄올 (1.5ml) 내 6-(2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-3(R,S)-부트-5에닐-8H-피리미도[4,5c][1,2]옥사진-7-온-5'-트리포스페이트 (22mg) 용액을 10% Pd/C (4mg) 및 삼중수소 기체 (5Ci)와 함께 20분간 교반하였고, 그 후, 삼중수소 기체 1Ci를 더 소비하였다. Milex-SR 필터를 이용하여 상기 촉매를 여과하고, 불안정한 삼중수소를 에탄올로부터 반복된 증발에 의해 제거하였다. 최종 잔여물을 메탄올 (20ml)에 용해시켰다. 생성물은 648mCi이었다. 상기 용액 1ml를 건조상태까지 만들고 10mM tris 완충액 pH8에 용해시켜 8mCi/ml의 방사능 농도를 얻었다.
실시예 11
프라이머 확장 검정법
유사체 트리포스페이트들이 기질로서 엑소 마이너스 클리나우 (exo minus Klenow) 폴리머라아제에 의해 수용되었는지를 테스트하기 위해, 프라이머 확장 반응이 하기 주형과 함께 수행되었다.
a) 3' ACGTACACGACCTCT ACCTTGCTA 5'
b) 3' ACGTACACGACCTCT GAACTAGTC 5'
밑줄친 서열에 상보적인 프라이머는 [γ33P]ATP 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 이용하여 5' 말단 라벨되었다. 라벨링한 후, 어떤 PNK 활성을 제거하기 위해 반응물을 5분간 가열하였다.
각 확장 반응에 대하여, 1 피코몰 (picomile)의33P 5'말단-라벨된 프라이머를 10㎕×2 클리나우 완충액 내 2 피코몰의 주형과 함께 교잡하였다. 상기 프라이머와 주형 용액을 75℃에서 3분간 가열한 후, 30℃에서 적어도 30분에 걸쳐 서서히 냉각하였다. 5U 엑소뉴클레아제 (exonuclease) 마이너스 클리나우 효소 (Amersham), 40μM 동종 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 갖는 2mU 무기 피로포스파타제 (Amersham) 및/또는 4μM TTPαS 또는 250μM dATP와 dGTP의 부가로 상기 용액을 두배 희석하였다. 반응을 37℃에서 30분간 인큐베이션 (incubation)한 후, 포름아마이드 중단 용액의 부가로 중단하였다. 상기 반응 생성물을 19% 폴리아크릴아마이드 7M 유레아 겔 상에서 분리하였고, 포스포 스크린 (phophor screen)(Storm phosphorimager, Molecular Dynamics) 또는 Biomax 방사선 자동 사진술 필름에 노출시킨 후33P 라벨된 8 내지 32 염기 뉴클레오티드 래더 (ladder)에 비하여 축소하였다.
제 1 주형을 이용하여, TTP로 기대된 바와 같이, 하나의 염기 확장이 관찰되었다; 첨가된 TTP가 없는 대조구는 어떠한 확장도 나타내지 않았다. 유사하게, 상기 메틸 P 유사체 (2.4), 상기 부테닐 P 유사체 (4.4), 상기 디니트로페놀-라벨된 P 유사체 (3.6), 벤질 하이드라지노 P 유사체 (7.3) 및 삼중수소화된 유사체 (10.1)를 효과적으로 삽입하였다. 이는 뉴클레오사이드 유사체 P (dPTP)의 트리포스페이트가TagDNA 폴리머라아제에 대한 우수한 기질이라는 공개된 관찰과 동일하다.
제 2 주형을 이용하여, dCTP로 기대된 바와 같이, 하나의 염기 확장이 관찰되었다; dCTP가 없는 대조구는 어떠한 확장도 나타내지 않았다. 유사하게, 메틸 P 유사체 (2.4), 부테닐 P 유사체 (4.4) 및 디니트로페놀-라벨된 유사체 (3.6)의 트리포스페이트를 효율적으로 삽입하였다. 두 개의 퓨린의 첨가는 상기 프라이머의 확장이 유사체 및 첨가된 피리미딘의 존재하에서 전 길이 생성물로 되게 한다.
실시예 12
말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 (transferase)를 이용한 올리고뉴클레오티드 테일링 (tailing)
상기 유사체 트리포스페이트의 기질로서 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제에 의해 수용되는 능력을 테스트하기 위해, 올리고뉴클레오티드 테일링 반응이 수행되었다.
15mer 프라이머 (서열: 5' TGC ATG TGC TGG AGA 3') 및 8 내지 32 염기 뉴클레오티드 표시제는 [γ33P] ATP 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 이용하여 5'말단 라벨되었다. 라벨링 후 어떤 PNK 활성을 제거하기 위하여 반응물을 5분간 가열하였다. 4 피코몰의 상기 라벨된 프라이머, 25U 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 및 32μM dNTP 또는 유사체 포스페이트를 25㎕ 100mM 카코딜레이트 (cacodylate) 완충액 pH 7.2, 2mM CoCl2및 0.2mM 2-머켑토에탄올 (mercaptoethanol) 내에서 37℃에서 90분간 인큐베이션시켰다. 상기 반응은 포름아마이드 중단 용액의 첨가에 의해 중단되었고, 반응 생성물은 상기 라벨된 표시제를 이용하여 19% 폴리아크릴아마이드 7M 유레아 겔 상에서 전개되었다. 상기 건조 겔상에서 Biomax 필름을 이용한 방사선 자동 사진술을 수행하였다.
결과로, 순수 염기 (native base), dATP 및 TTP 물질이 가장 긴 꼬리를 나타내었고, dCTP 및 dGTP 순으로 나타났다. dPTP 자체는 상기 겔 상에서 상기 생성물의 이동에 기초한 dATP 뿐만 아니라 적어도 삽입한 것으로 나타나는 TdT에 대하여 가장 우수한 동종 기질인 반면, P (화합물 2.4)의 3-메틸 유사체의 트리포스페이트도 또한 우수한 기질이었고, 상기 테일링 생성물은 dATP 또는 TTP 및 dCTP를 이용하여 생성된 물질 사이에서 전개하였다. 생성물이 다소 작을 지라도 3-부테닐-P (4.4) 및 벤질 하이드라지노 P (7.3)도 또한 기질이었다.
각 실험에서, 플로레세인-라벨된 화합물 (8.5)과 상기 아미도카프로에이트 (amidocaproate)-라벨된 화합물 (8.4) 모두는 각각 16 내지 20 염기 길이 및 4 내지 5 염기인 꼬리를 생성한 것을 관찰하였다.
실시예 13
P 염기로 향하는 항체에 의한 DNA의 검출
P를 함유한 DNA가 검출될 수 있도록 항체들이 P 염기에 대하여 제기되었다. P 염기를 단백질 담체에 콘쥬게이트시키기 위해, 제 1 위치 (일반적으로 뉴클레오사이드 내 당에 의해 지배된 위치)에 연결제 및 작용기를 첨가하는 것이 필수적이었다.
1-(4-카르복시부틸)-3,4-디하이드로-8 H -피리미도-[4,5-c][1,2]옥사진-7-온의 합성
5-(2-하이드록시에틸)유라실 (13.1)의 제조
5-(2-하이드록시에틸)유라실은 Lin 및 Brown,Methods in Molecular Biology26권, 187 내지 206쪽 (1994), S.Agrawal, Humana Press Inc. 편집에 의한 방법으로 제조되었다.
1-(4-메틸카르복시부틸)-5-(2-하이드록시에틸)유라실 (13.2)의 제조
5-(2-하이드록시에틸)유라실 (13.1) (5.38g, 19.9mmol)을 질소 분위기 하에서 1,1,1,3,3,3,-헥사메틸디실라잔 (hexamethyldisilazane) (27ml) 및 클로로트리메틸실란 (4ml) 내에서 현탁하였다. 상기 혼합물을 2시간동안 환류시켰다. 상기 반응 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후, 회전 증발법에 의해 노란색 오일이 될 때까지 감소시켰다. 상기 오일을 무수 톨루엔 (5ml)에 재용해시키고, 다시 오일이 될 때까지 감소시켰다.
상기 오일을 무수 아세토니트릴 (20ml)에 용해시키고, 메틸-5-브로모발러레이트 (bromovalerate) (13ml, 91mmol)를 첨가하였다. 상기 반응을 아르곤 분위기 하에서 18시간동안 환류 가열하였다. 그 후, 상기 혼합물을 냉각시키고, 회전 증발법에 의해 오일이 될 때까지 감소시켰다. 생성물을 클로로포름 및 메탄올의 단계적 그래디언트를 이용하여 용출하는 실리카 겔 상에서 액체 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 상기 생성물을 분리하고, 페트롤륨 에테르로 재결정하여 1-(4-메틸카르복시부틸)-5-(2-하이드록시에틸)유라실 (13.2) (6.63g, 71.2%), MP 105℃를 얻었다. 질량 분석법 및 프로톤 NMR에 의해 상기 구조를 확인하였다.
1-(4-메틸카르복시부틸)-5-(2-프탈리미도-옥시에틸)유라실 (13.3)의 제조
1-(4-메틸카르복시부틸)-5-(2-하이드록시에틸)유라실 (13.2) (6.213g, 23mmol)을 무수 테트라하이드로퓨란에 용해시켰다. N-하이드로프탈리미드 (7.505g, 46mmol) 및 트리페닐포스핀 (12.046, 46mmol)을 첨가하고, 실온에서 상기 용액을 교반하였다. 디에틸아조디카르복실레이트 (9.95g, 57mmol)을 0.5ml 분등액 내에서 10분에 걸쳐 첨가한 후, 상기 반응용액을 추가 1시간동안 교반하였다. 상기 생성물을 클로로포름:디에틸 에테르 혼합물로부터 두 번 재결정하여 1-(4-메틸카르복시부틸)-5-(2-프탈리미도옥시에틸)유라실 (13.3) (8.77g, 91.8%)를 얻었다. 질량 분석법 및 프로톤 NMR에 의해 그 구조를 확인하였다.
1-(4-메틸카르복시부틸)-5-(2-프탈리미도-옥시에틸)-4-트리아졸로피리미딘 (13.4)의 제조
1,2,4-트리아졸 (11.843g, 171mmol)을 무수 아세토니트릴 (200ml)에 용해시키고, 0℃에서 교반하였다. 포스포러스 옥시클로라이드 (3.9ml, 42mmol)을 점적하여 첨가한 후, 트리에틸아민 (31ml, 225mmol)을 첨가하였다. 계속하여 0℃에서 1시간동안 교반하였다. 1-(4-메틸카르복시부틸)-5-(2-프탈리미도-옥시에틸)유라실 (3) (4.16g, 10mmol)을 무수 테트라하이드로퓨란 (50ml)에 용해시키고, 무수 아세토니트릴 (80ml)을 상기 교반된 용액에 서서히 첨가하였다. 상기 혼합물을 50℃에서 2.5시간동안 가열한 후, 0℃로 냉각하여 흰색의 침전물을 얻었다. 상기 생성물은 클로로포름:아세톤 (7:3)을 이용하여 용출하는, 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 더욱 정제되었다. 이로서 1-(4-메틸카르복시부틸)-5-(2-프탈리미도-옥시에틸)-4-트리아졸로유라실 (13.4)을 오일 (3.43g, 73.4%)로서 얻었다. 질량 분석법 및 프로톤 NMR에 의해 그 구조를 확인하였다.
1-(4-메틸카르복시부틸)-3,4-디하이드로-8 H -피리미도[4,5-c][1,2]옥사진-7-온 (13.5)의 제조
1-(4-메틸카르복시부틸)-5-(2-프탈리미도-옥시에틸)-4-트리아졸로피리미딘 (4) (0.49g, 1.05mmol)을 무수 디옥산 (30ml)에 용해시켰다. 암모니아로 포화된 무수 디옥산 (70ml)을 첨가하고, 반응 혼합물을 24시간동안 교반하였다. 결과물을 클로로포름:에탄올 (95:5) (0.21g, 74.9%)로 용출된 실리카 겔 GF 판 상에서 얇은-층 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 질량 분석법에 의해 그 구조를 확인하였다.
1-(4-카르복시부틸)-3,4-디하이드로-8 H -피리미도[4,5-c][1,2]옥사진-7-온, 암모늄 염 (13.6)의 제조
1-(4-메틸카르복시부틸)-3,4-디하이드로-8H-피리미도[4,5-c][1,2]옥사진-7-온 (13.5) (0.42g, 1.57mmol)을 1M 소듐 하이드록시 용액 (10ml)에 용해시키고, 2시간동안 교반하였다. 상기 혼합물은 Dowex 50 WX8-200의 이온 교환 칼럼에 적용하였다. 상기 물질을 물로 용출하고, 생성물을 2M 암모니아 수용액을 이용하여 회수하였다. 용액의 부피를 감소시킨 후, 동결-건조하여 흰색 고체 (0.24g, 60.4%)을 얻었다. 하기 얇은-층 크로마토그래피 시스템으로 분석될 때, 상기 생성물은 하나의 점으로 나타났다: 실리카 겔은 클로로포름:메탄올 (7:3) 및 부탄-1-올:물:글래이샬 (glacial) 아세트산 (12:5:3)으로 용출하였다; ODS로 포화된 실리카 겔은 메탄올:물:글래이샬 아세트산 (80:20:1)으로 용출하였다; 셀룰로우즈는 부탄-1-올:물:글래이샬 아세트산 (12:5:3)으로 용출하였다. 질량 분석법 및 프로톤 NMR에 의해 그 구조를 확인하였다.
P 염기 KLH 콘쥬게이트 (13.8)의 제조
1-(4-카르복시부틸)-3,4-디하이드로-8H-피리미도[4,5-c][1,2]옥사진-7-온(6) (41.6mg, 0.164mmol)을 디메틸설폭사이드 (2ml)에 용해시켰다. N-하이드록시석신이미드 (26.5mg, 0.23mmol) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디미드 (65.4mg, 0.341mmol)를 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서 26시간동안 교반하였다. 상기 디메틸설폭사이드를 진공 하에서 제거하였다. 잔여물을 실리카 겔 상에서 아세톤을 이용하여 용출하는 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 회전 증발법에 의해 용매를 제거함으로써 생성물 (13.7)을 분리하였다.
상기 N-석신이미딜 에스테르 (13.7)를 DMF (1ml)에 용해시키고, 피리미딘 (0.5ml)에 용해된 KLH 현탁액 (90mg 단백질) 및 물 (4.5ml)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 질소 분위기 하에서 4시간동안 교반하였다. 생성물을 물로 5일간 투석하였다. 상기 콘쥬게이트 (13.8)를 동결-건조에 의해 분리하여 59mg을 얻었다. 항혈청 제조를 위해 상기 물질을 Polyclonal Antibodies Ltd에 보냈다.
항혈청 제조
세 마리의 양을 상기 KLH 콘쥬게이트로 면역화시켰다.
Freunds 완결 보조제 내에서 제조된 상기 콘쥬게이트로 첫 번째 면역화를 수행하였다. Freunds 완결 보조제 내에서 제조된 상기 콘쥬게이트로 4주 간격으로 계속적인 재면역화를 수행하였다. 각 재면역화 후 2주에 혈액 시료를 채취하고 혈청을 얻었다.
항혈청의 테스트
검출을 위한 ECL 기질과 함께 양고추냉이 퍼옥시다아제 (peroxidase)에 콘쥬게이트된 제 2 항체를 이용하여 나일론 막 상에서 P-라벨된 올리고뉴클레오티드 (즉, P 자체가 라벨임)의 도트 블랏에 대하여 항혈청을 테스트하였다. 각 동물로부터 채취한 전-면역 혈청의 반응을 제 1 및 제 2 혈액으로부터 채취한 혈청과 비교하였다.
물에 희석된 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05 및 0.01 피코몰의 P-라벨된 올리고뉴클레오티드 (서열: 5' PPP GTC ACG AC 3')를 함유하는 1 마이크로리터 등분액을 Hybond N+ 막상에 점적하였다. 물에 희석된 대조구 올리고뉴클레오티드 (서열: 5' TGC TGG AGA 3')의 1 마이크로리터 등분액도 또한 적용되었다. 이러한 방법으로 생성된 블랏은 DNA를 고정시키기 위해 80℃에서 90분간 구워졌다. 굽기 후, 전-면역 혈청의 1:1000 희석액의 1 마이크로리터 등분액이 양성 대조구를 제공하는 각 블랏상에 점적되었다.
10mM 포스페이트 완충된 살린 (PBS)으로 1:10 희석된 액체 차단제 (Liquid Block, Amersham) 내에서 진동시키면서 실온에서 60분동안 상기 블랏을 인큐베이션하였다. 그 후, PBS 내 0.5% 소의 혈청 알부민 (BSA) 내의 각 혈청 시료의 1:1000, 1:10000 또는 1:50000 희석액 내에서 진동시키면서 상기 각 블랏을 60분간 인큐베이션하였다. 그 후, 0.3% Tween 20을 함유하는 PBS 내에서 진동시키면서 10분동안 3번 세척하였다. 상기 블랏은 PBS 내 0.5% BSA로 1:2500배 희석된 양고추냉이-퍼옥사이드 콘쥬게이트된 친화-정제된 당나귀 항-양 IgG, H+L (Jackson ImmunoResearch Labs Inc.) 내에서 진동시키면서 60분간 인큐베이션한 후, 0.3% Tween 20을 함유하는 PBS 내에서 진동시키면서 10분동안 3번 세척하였다. 그 후, 이들을 ECL 검출 시약 (Amersham)내에서 1 내지 2분간 인큐베이션한 후, Biomax 필름 (Amersham)에 2분 내지 5분동안 노출하였다.
모든 희석액에서 모든 세 마리 양의 면역화 후 얻어진 항혈청으로부터 양성 신호가 나타났다. 1:1000 항혈청 희석액에서 0.1 피코몰의 P-라벨된 올리고뉴클레오티드의 최대 민감도가 얻어졌다. 전면역 혈청을 포함하는 모든 혈청 시료의 1:1000 희석액에서 비라벨된 올리고뉴클레오티드에서 일부 기저 신호가 나타났으나, 1:10000 또는 1:50000 희석액에서는 나타나지 않았다. 양성 대조구로부터 강한 신호가 얻어졌다.
상기 실험은 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체들로 테일링되거나 또는 라벨된 다른 표지체들을 검출하거나 포획하기 위한 능력을 나타낸 것이다.
실시예 14
3'말단 표지체를 단 도트 블랏 상에서 M13의 검출
플로레세인- 또는 디니트로페놀-함유 뉴클레오티드 유사체로 라벨된 올리고뉴클레오티드 표지체들은 막 상에서 고정된 DNA를 타겟화하는 교잡화반응 후 검출되었다.
표지체 제조
시퀀싱 프라이머 23mer (서열5'GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA-3')에 대하여 6 마이크로리터 (12 피코몰)-40을 10㎕×5 반응 완충액 500mM 소듐 카코딜레이트 pH 7.2, 10mM CoCl2, 1mM 2-머펩토에탄올, 50 유니트 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제, 15㎕ 800μM 플로레세인 라벨된 화합물 (8.5) 또는 디니트로페놀 라벨된 화합물 (9.3)과 함께 혼합하고, 최종 부피가 50㎕가 되도록 물을 첨가하였다. 반응물 모두 37℃에서 90분동안 인큐베이션하였다. 그 후, 어떠한 잔존하는 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 활성을 제거하기 위해 상기 반응물을 5분간 가열하였다.
블랏 제조
M13 단일-가닥 DNA의 도트 블랏은 Hybond N+ 막 상에서 제조되었다. 각각 500, 100, 50, 20, 15, 10, 5 및 2.5 오토몰 (attomole)의 타겟에 대응하는 1200, 240, 120, 48, 36, 24, 12 및 6 피코그램을 함유하는 각 막에 여덟 개의 도트가 적용되었다. 상기 도트는 80℃ 오븐에서 90분간 구워서 상기 막에 고정되었다.
교잡화 방법
5ml 교잡화 완충액 (0.5% 덱스트란 설페이트, 0.1% 소듐 도데실 설페이트 (SDS), 1:20 액체 차단제 (Amersham Life Science) 및 ×5 소듐 클로라이드 소듐 시트레이트 완충액 (SSC)) 내에서 42℃에서 30분동안 중복 도트 블랏이 가-교잡되었다. 25 밀리리터 (약 50ng)의 상기 제조된 표지체가 각 교잡반응에 첨가되어 10ng/ml의 표지체 농도를 얻었다. 상기 블랏들은 42℃ 진동 물중탕 용기 내에 놓여졌다.
상기 블랏은 그 후 실온에서 5분간 5ml×5 SSC/0.1% SDS로 세척되었다. 상기 세척은 추가 5ml×SSC/0.1% SDS로 실온에서 5분간 반복되었다.
그 후, 상기 블랏은 42℃에서 15분간 5ml×5 SSC/0.1% SDS로 세척되었다. 상기 세척은 추가 5ml×SSC/0.1% SDS로 42℃에서 15분간 반복되었다.
그 후, 상기 블랏은 TBS 완충액 (0.3M 소듐 클로라이드 0.1M Trizma duarl pH 7.5)로 희석된 액체 차단제, Amersham 1:10 희석액으로 옮겨졌으며, 궤도 진동기 상에 30분간 방치되었다.
DNP-함유 표지체의 검출을 위해, 블랏들은 TBS 완충액 pH 7.5 내의 5ml 0.5% w/v BSA로 옮겨졌다. 여기에 5㎕ 항-DNP 양고추냉이 퍼옥시다아제 콘쥬게이트된 항체 (상기 항체의 1:1000 희석액을 제공)를 첨가하였다.
플로레세인-함유 표지체의 검출을 위해, 블랏들은 TBS 완충액 pH 9.5내의 5ml 0.5% w/v BSA로 옮겨졌다. 여기에 5㎕ 항-플로레세인 알칼린 포스파타제 콘쥬게이트된 항체 (상기 항체의 1:1000 희석액을 제공)를 첨가하였다.
두 블랏 세트 모두 45분동안 궤도 진동기에 옮겨졌다.
상기 블랏들을 배출하고, TBS pH7.5 (DNP-라벨된 표지체) 내 25ml 0.1% v/v Tween-20 또는 TBS pH9.5 (플로레세인-라벨된 표지체) 내 25ml 0.1% v/v Tween-20에 옮겼다. 상기 세척 단계는 적절한 pH에서 추가 5ml 0.1% v/v Tween-20 TBS 완충액으로 전체 3번 반복되었다.
알칼린 포스파타제 (플로레세인-라벨된 표지체)의 검출
상기 블랏을 배출시키고, 사란 랩 (Saran Wrap)에 옮겼다. 0.5ml CDP-StarTM시약을 각 블랏에 적용하였고, 실온에서 5분간 방치하였다. 상기 블랏을 빼낸 후 사란 랩으로 포장하고, 방사성 자동 사진술 필름상에 30분간 노출시켰다. 전개된 필름 상에서, 500에서 2.5 오토몰 도트 범위에 모든 도트를 관찰할 수 있었다.
양고추냉이 퍼옥시다아제 (DNP-라벨된 표지체)의 검출
상기 블랏을 빼내고, 사란 랩으로 옮겼다. ECL 검출 시약 (Amersham)의 0.5ml 등분액 (1 및 2 용액을 동일한 양으로 혼합하여 제조됨)을 각 블랏에 적용하고, 실온에서 2분간 방치하였다. 상기 블랏을 배출시킨 후, 사란 랩으로 포장하고 방사성 자동 사진술 필름상에 10분간 노출시켰다. 상기 전개된 필름 상에서, 500 및 100 오토몰 도트를 관찰할 수 있었다. 배경을 감소시키기 위해 항체 농도의 최적화로 더 큰 민감도를 얻을 수 있다.

Claims (9)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 적어도 하나의 리포터 부분을 갖는 뉴클레오사이드 유사체.
    화학식 1
    X는 O, S, Se, SO, CO 또는 N-R7이고,
    상기 점선은 R6및 R7사이의 최적 연결을 나타내며,
    R1, R2, R3및 R4은 서로 같거나 다르게, 각각 H, OH, F, NH2, N3, O-하이드로카빌, 또는 리포터 부분 (reporter moiety)이고,
    R5은 OH 또는 모노-, 디- 또는 트리-포스페이트 또는 -티오포스페이트 (thiophosphate) 또는 대응 보라노포스페이트 (boranophosphate)이거나,
    또는 R2및 R5중 하나는 포스포라미다이트 또는 폴리뉴클레오티드 사슬 내로 삽입하기 위한 다른 기이며,
    Z는 O, S, Se, SO, NR9또는 CH2이고,
    R6, R7, R8및 R9는 서로 같거나 다르게, 각각 H 또는 알킬 또는 아릴 또는 리포터 부분이며,
    n은 0 또는 1이다.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 X는 O이고, 상기 Z는 O임을 특징으로 하는 뉴클레오사이드 유사체.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 R5는 트리포스페이트임을 특징으로 하는 뉴클레오사이드 유사체.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 R2및 R5중 하나는 포스포라미다이트 또는 H-포스포네이트임을 특징으로 하는 뉴클레오사이드 유사체.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R6또는 R7은 리포터 부분을 포함함을 특징으로 하는 뉴클레오사이드 유사체.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포터 부분은 신호 부분 및 연결기를 포함함을 특징으로 하는 뉴클레오사이드 유사체.
  7. 제 1 항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오사이드 유사체의 적어도 하나의 잔기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 사슬.
  8. 제 7항에 있어서, 신호 부분이 삽입된 뉴클레오사이드 유사체 잔기 내로 도입된 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 사슬.
  9. 하기 화학식 1로 표시되는 뉴클레오사이드 유사체의 잔기를 함유하는 핵산을 검출하는 방법.
    화학식 1
    X는 O, S, Se, SO, CO 또는 N-R7이고,
    상기 점선은 R6및 R7사이의 최적 연결을 나타내며,
    R1, R2, R3및 R4은 서로 같거나 다르게, 각각 H, OH, F, NH2, N3, O-하이드로카빌, 또는 리포터 부분이고,
    R5은 OH 또는 모노-, 디- 또는 트리-포스페이트 또는 -티오포스페이트 또는 대응 보라노포스페이트이거나,
    또는 R2및 R5중 하나는 포스포라미다이트 또는 폴리뉴클레오티드 사슬 내로 삽입하기 위한 다른 기이며,
    Z는 O, S, Se, SO, NR9또는 CH2이고,
    R6, R7, R8및 R9는 서로 같거나 다르게, 각각 H 또는 알킬 또는 아릴 또는 리포터 부분이며,
    상기 방법은 이들의 염기 유사체에 결합하는 항체를 검출하는데 사용된다.
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