JPH03147797A - 核酸の検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は特定の塩基配列を持つＤＮＡあるいはＲＮＡを
検出する方法でありウィルスや細菌による疾患、遺伝病
の診断、あるいは種の同定、親子鑑別などの分野に用い
られる。

（従来の技術〉 ハイブリダイゼーシ３ン法は遺伝子の変異により生じる
疾患やウィルスによる病気の診断に有効である。

従来、検出の際には目的ＤＮＡやＲＮＡｔ−菌、ウィル
ス、白血球などから超音波破砕、などの物理学的方法１
．アロテネースにのような酵素やドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＯ８）６ｒ）ような界面活性剤、を用いて化学的
な方法で抽出する。その後フェノール、クロロホルム処
理、エタノール沈澱でＤＮＡ　（ＲＮＡ）を精製したｆ
＆、ＮａＯＨのようなアルカリで変性させて１本ＭＤＮ
Ａ　（ＲＮＡ）にする、そしてこの目的の１本ＭＤＮＡ
　（ＲＮＡ）をメンブランフィルタ−にトロセルロース
、ナイロン）上に固定する方法が洲、よく知られたフィ
ルターハイプリダイゼーシゴン法である。このＤＮＡ　
（ＲＮＡ＞を固定したフィルターに放射性同位元素、酵
素、ビオチン、蛍光物質などでラベルしたオリゴヌクレ
オチドプローブを加えると、オリゴヌクレオチドが対ｆ
ｉＤＮ−Ａ（ＲＮＡ）と相補的配列を持つと両者の間に
水素結合が生じて二本鎖を形成する。相ＭＭをもたなか
ったり過剰のオリゴヌクレオチドプローブは洗浄によっ
てフィルターから除去される。　　その後放射活性、酵
素活性、　　蛍光強度測定によって目的ＤＮＡ（ＲＮＡ
＞の検出を行う。

あるいはフィルターを使わない方法としてボリメラーゼ
チェーンリアクション（ＰＣＲ）（５ａｉｋｉ、　Ｒ，
Ｋ、　ｅｔ　ｉｌ、　　５ｃｉｅｎｃｅ　ＩＪＩ　４８
７−４９１（１９８８））を利用して、各々のプライマ
ーにビオチンをラベルしてＰＣＲ反応を行った後ラベル
ＤＮＡプローブと液相でハイブリダイゼーションを行な
った後アビジンを固定したアフィニティマトリックスを
用いて検出する方法。

（Ａｎｎ−Ｃｈｒｊｓｔｌｎｅ　５ｙｖａｎｅｎ　ｅｔ
　ａｌ、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、ｌｊ　１１３２
７−１１３３８　（１９８８））、　　　オリゴヌクレ
オチドプローブに複数のビオチンを標識し目的ＲＮＡと
液相でハイブリダイゼーションを行った後、アビジンを
固定したアフィニティマトリックスと酵素ｍｍ抗ＲＮＡ
−ＤＮＡａ：＃を添加して検出する方法（Ｃ１ｉｆｆｏ
ｒｄＯ，Ｙｅｈｌｅ　　ｅｔ　ａｌ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕａｒＰｒｏｂｅｓ　１，１７
７−１９３　（１９８７）などがある。

（発明−１４が解決しようとする課Ｍ）フィルターを用
いる方法では、フィルターにＤＮＡ　（ＲＮＡ）を固定
するための操作、ＤＮＡ　（ＲＮＡ）を熱や紫外線によ
って固定する操作、及び相補鎖を形成しなつかたたＤＮ
Ａプローブの洗浄の煩雑な操作がつきまとう、さらにオ
リゴヌクレオチドプローブがフィルター表面に非特異的
に吸着して検出感度の低下やバックグランドの上昇を招
くという不都合もあった。

またアフィニティーマトリックスを用いる方法において
もフィルター法に較べて操作性が優れるものの、アフィ
ニティーマトリックスの添加の操作、及び二本鎖を形成
しなかったオリゴヌクレオチドプローブをのぞくための
操作（Ｂ／Ｆ＋離〉が必要となる。

（課題を解決するための手段） 上記観点から鋭意研究を行った結果、ラベル化オリゴヌ
クレオチドを用いて溶液中でハイブリダイゼーションを
行い、その溶液を直接分子■の大小、あるいは荷電の大
小の差を利用して、相補鎖を形成しなかったオリゴヌク
レオチドプローブを自動的に分離することで、特定の核
酸の塩基配列を検出することを見いだしこの発明に達し
た。

具体的には、　ａ）目的Ｄ　Ｎ　Ａ’あるいはＲＮＡの
塩基配列の一部分に相補的な配列を持つラベル化オリゴ
ヌクレオチドとＤＮＡ（ＲＮＡ）を溶液中で交雑（ハイ
ブリダイゼーション）させ、　ｂ〉溶液をそのまま荷電
の大小、あるいは分子量の大小を識別できる装置で分析
しラベル剤をそのラベル剤の検出に適した検出器で識別
する。

こうして目的ＤＮＡ　（ＲＮＡ＞の存在をしいては特定
遺伝子の検出を行うことができる。

この発明の９的（対象）ＤＮＡあるいはＲＮＡはウィル
ス、細菌、血液等を１０テネースにのような酵素、ＳＤ
Ｓのような界面活性剤、ＮａＯＨのようなアルカリで処
理すること、超音波破砕のような物理的手段によって、
あるいはそれらの組合せで入手することができる。

オリゴヌクレオチド１０−プは目的ＤＮＡ（ＲＮＡ）と
相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドに適当なラベ
ルを施した物を使用する。ここでラベル化オリゴヌクレ
オチドのラベル剤としては、β−壊変をする３２　ｐ、
＋３１　７、のような放射性同位元素やＦＩＴＣ（フル
オレセインイソシアネート〉のような蛍光物質、ルミノ
ール及びその誘導体である化学発光物質、４−インシア
ネート−テンプ、４−マレイミド−テンプのようなスピ
ンラベル剤、ユーロピウム錯体のような遅延蛍光を示す
物質等が用いられる。ラベル剤とオリゴヌクレオチドの
結合はオリゴヌクレオチドにアミノ基、チオール基等の
官能基を化学的に導入した後アミノ基あるいはチオール
基特異的なラベル剤と反応させることができる。オリゴ
ヌクレオチドへの官能基の導入はオリゴヌクレオチドを
固相合成した後５′位の保護基であるジメトキシトリチ
ル（ＤＭＴｒ）基を酸処理ではずした後、カルボニルイ
ミダゾールを反応させヘキサエチレンジアミンを反応だ
せアミノ基を導入する方法　（Ｌ、　Ｗａｃｈｔｅｒｅ
ｔ　　ａｌ、　　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、［
，７９８５（１９８６））、脱保護したオリゴヌクレオ
チドの５″位を酵素的に燐酸化した後エチレンジアミン
、シスタミンのようなジアミンと反応させアミノ基ある
いはチオール基を導入させる方法 （Ｂ、Ｆ、Ｃｈｕ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅｓ、１１．６５１３（１９８３＞）、　　Ｈ−
ホスホネートを用いて四塩化炭素、　Ｉ２、ジアミンを
保護オリゴヌクレオチドの燐酸基にアミノ基を導入する
方法（Ｂ、　Ｆｒｏｅｈｌｅｒ、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ
ｓ、Ｒｅｓ、ｌｊ　４８３１　（１９８８））、などの
方法で行うことができる。

アミノ基を導入したオリゴヌクレオチドにはアミノ基指
向性のＦＩＴＣのような蛍光物質、４−インシアネート
−テンプのようなスピンラベル剤、などを用いることで
適当なラベル剤を導入することができる０口約ＤＮＡ　
（ＲＮＡ）の検出は、分子量の大小あるいは、荷電の大
小で対象ＤＮＡ　（ＲＮＡ）と二本鎖を形成したラベル
化プローブと二本鎖を形成しなかったラベル化プローブ
を識別することで行う０例えば電気泳動法、ゲルろ適法
、キャピラリー電気泳動法、イオン交換法、等の方法で
行うことができる。検出器としては蛍光物質をプローブ
にラベルした時には蛍光光度計、放射性同位元素をラベ
ルした時にはＲＩディテクター、化学発光物質の時には
ルミノメータ−１などの検出器を用いることができる。

このようにして目的ＤＮＡ　（ＲＮＡ）の存在を、ある
いは特定遺伝子の塩基配列を検出することができる。

（実施例） （サンプルの調製〉　対象ＤＮＡとしてはＭ１３ｍｐ８
−本鎖ファージＤＮＡ、　オリゴヌクレオチドプローブ
としてはＭ　１３フアージＤＮＡの一部分に相捕的な配
列を持つ１７量本ＣｄＧＴ＾＾ＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡ
ＧＴ、　　以下Ｐ１７と呼ぶ〉とした、ＰＩ３を品温Ｄ
ＮＡ合成装置Ｎ５−ｌで合成後説ｅＡ護を施しＣ３カラ
ムを備えた液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製
した。Ｐ　１７　（２５ｎｍｏｌ＞をＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（３０Ｕ、　）で３７℃、　２時間処理し
５位に燐酸残基を導入した。　（以下Ｐ　１７　Ｐ）反
応液はＳ　Ｅ　Ｐ　　Ｐ　Ａ　Ｋ　Ｃ＋　ｓカラム（ミ
リポア社）でＮ製した。振とう下減圧濃縮した。

次にフォスフォロアミデート法（Ｂ、Ｆ、Ｃｈｕ　ｅｔ
ａｌ、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　ｌＪ　６５
１３　（１９８３））を用いて５°位にアミノ基を導入
した。すな咥ちＰ　１７　Ｐ　（５ｎ＋＊ｏｌ）に対し
て１−エチル−３−（ジメチル）アミノプロビルカルボ
ヂイミド（ＬＭ　１０ｕｌ）、ルチジン塩酸Ｉｆ街液（
０，７５Ｍ、　８８ｕｌ）の存在下、シスタミン塩酸塩
（ＩＭ、　２ｕｌ）と２０℃、　１８時間反応させた。

　（以下アミノ−ＰＩ３と呼ぶ、）（詳細は　　Ａ、Ｍ
ｕｒａｋａ＋Ｉｉ　ｅｔａｔ、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ
　Ｒｅｓ、　ＬＺ　５５８７　（１９８９）に記載した
。　）アミノ−Ｐ　１７　（５ｎｍｏｌ）を炭［！新液
（０，５Ｍ、　ＩＱＯｕｌ）に溶解してＦ　ｒ　Ｔ　Ｃ
（１ｍｇ＞を加えて室温で１５時間反応させた。精製は
Ｇ−２５ゲルろがカラムでまず行い、　　つぎにＨＰＬ
Ｃで目的ピークを回収した。残査を減圧下振とう濃縮し
蒸留水に溶解した。

（Ｆ　Ｉ　ＴＣを標識したアミノＰ１７を以下ＦＩＴＣ
−Ｐ１７と呼ぶ） （ハイブリダイゼーション）　ハイブリダイゼーション
は目的ＤＮＡであるＭ１３ｍｐ８ファージＤ　Ｎ　Ａ　
（１００ｐｍｏｌ）を６　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ（０，９ＭＮ
ａＣＩ）　（５０ｕｌ）に溶解し、　ＦＩＴＣ−ＰＩ３
（Ｉｐｍｏ＋）を加えて３７Ｃで３０分ハイブリダイゼ
ーションを行った。その溶液をそのままキャピラリー電
気泳動に用いた。

（キャピラリー電気泳動） １、電気泳動用Ｍ新液の調製 ８０ｍ１の蒸留水に０．５ｇの低融点アガロースを加え
、よく攬はんした後加黙し溶解させ放冷後、これに１．
２１ｇのトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン、９３
ｍｇのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム及び２０＋
ｇのドデシルＨａナトリウムを溶解させた。これにさら
にほう酸を加え、　ｐＨを８．１に調整し、蒸留水を加
えて正確に１００ｍ１にした。

２、ハイブリダイゼーション溶液のキャピラリー電気泳
動 第１図に示したシステムを用いてキャピラリー電気泳動
を行った。すなわち、蛍光検出器（１）は島原ＲＦ−５
４０型蛍光分光光度計（励起波長４９０　ｎｍ、検出波
長５２０ｎｍに設定〉、高電圧電源（２〉は校定プレシ
ジョンｆ（ＥＲ−３０Ｐ０．１゜記録計（３）は島原Ｃ
−Ｒ４＾型、電極（４）はＰｔ線（０，５ｍｍφ−３（
ｌａｇ）、　　電極槽（５）は１．５膠１のサンプリン
グチューブを用いた。

キャピラリー（６）は５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｇｌａｓ
ｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社のフユーズドシリ力キャビ
ラリーの内径７５μ■のものを使用した。キャピラリー
の全長は４５０■であり子種側から３００１１ｍの所か
ら２厘口の幅で被覆を剥し、蛍光検出器に取り付けた。

このキャピラリー内には使用時に上記の低融点アガロー
スを含有する電気泳動用緩衝液を満たし、両端はそれぞ
れ低融点アガロースを含有する電気泳動用Ｉ！液を入れ
た＋極側電極槽及び−極（ｌ１ｇ電極槽に浸しておいた
。このとき二つの電極槽内の！！ｌ！衝液の新液の高さ
が同じになるように調整しておいた。

試料のキャピラリーへの導入はキャピラリーの子種側の
端部を＋側電極槽がら引き上げ試料溶液中に１０秒間浸
して行った。このとき試料の液面の高さはｔ掻槽内の緩
衝液の液面より　５０ａｍ高くなるように調整して行っ
た。

試料をキャピラリー内に導入した後、キャピラリーの端
部をｔ補槽に戻しキャピラリーの両端に７．５ｋＶの直
流電圧を印加した。Ｔ４ａＭは１２〜１５μＡとなり、
キャピラリー内には子種側から一極側に向がってＭ新液
の流れが生じ、標的ＤＮＡ　（ＲＮＡ）とハイブリダイ
ズしたラベル化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし
ていないラベル化オリゴヌクレオチドは分離され蛍光検
出器で検出された。　　　すなわち、電気泳動開始後約
１０分に標的ＤＮＡ（ＲＮＡ）とハイブリダイズしたラ
ベル化オリゴヌクレオチドが検出され、約２５分にハイ
ブリダイズしていないラベル化オリゴヌクレオチドが検
出された。この結果から本発明の方法によって標的ＤＮ
Ａを簡便に検出することができることがわかる。

（発明の効果） 本発明を用いると従来法のようにメンブランフィルタ−
に目的ＤＮＡを固定してハイブリダイゼーションを行う
煩雑さから開放される。

また液相でハイブリダイゼーションを行うためメンブラ
ンフィルタ−を使う時のようにオリゴヌクレオチドプロ
ーブのメンブランフィルタ−上への非特異吸着が避けら
れる０本発明はウィルスや細菌による病気の診断等に用
いられる方法に適用でき本発明を用いることで目的ＤＮ
Ａの検出が自動化できる。そのため自動臨床検査機器へ
の応用も可能である。

４、

【図面の簡単な説明】

第１図は、 本発明に係る方法を実施するための 装置図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）溶液中で目的ＤＮＡ（ＲＮＡ）とその一部分に相
   補的な配列からなるオリゴヌクレオチドを交雑せしめ、
   その溶液を分子量の大小、あるいは荷電の大小の差を利
   用して分離することにより特定の核酸の塩基配列を検出
   することを特徴とする核酸の検出法。