JP3495752B2 - 生標的個体の検出方法およびプローブ - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、非天然型核酸からなる
プローブを用いて、細胞や微生物を生きた状態で核酸レ
ベルで検出、判別あるいはその個体数の計測が可能な方
法に関する。
プローブを用いて、細胞や微生物を生きた状態で核酸レ
ベルで検出、判別あるいはその個体数の計測が可能な方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、遺伝子の変異に基づく遺伝病の診
断、発癌遺伝子の発現による細胞の癌化の検出、研究レ
ベルでの遺伝子組換え体の検出等、遺伝子レベル、すな
わち核酸レベルで細胞や微生物等（以下標的個体とい
う）を特定、判別したり、検出あるいは標的個体数を計
測することの重要度が高まっている。
断、発癌遺伝子の発現による細胞の癌化の検出、研究レ
ベルでの遺伝子組換え体の検出等、遺伝子レベル、すな
わち核酸レベルで細胞や微生物等（以下標的個体とい
う）を特定、判別したり、検出あるいは標的個体数を計
測することの重要度が高まっている。
【０００３】従来、これら標的個体の検出や標的個体数
の計測には明視野顕微鏡観測法、位相差顕微鏡観測法あ
るいは微分干渉顕微鏡観測法等が用いられてきた。ま
た、これらの方法では標的個体が見えずらい場合や、よ
り効果的に、あるいはより高感度に検出するためにメチ
レンブルー、サフラニン等の色素や、オーラミン、フル
オレセイン等の蛍光色素で染色した後に、明視野顕微鏡
あるいは蛍光顕微鏡で観測する方法が一般的に行われて
きた。
の計測には明視野顕微鏡観測法、位相差顕微鏡観測法あ
るいは微分干渉顕微鏡観測法等が用いられてきた。ま
た、これらの方法では標的個体が見えずらい場合や、よ
り効果的に、あるいはより高感度に検出するためにメチ
レンブルー、サフラニン等の色素や、オーラミン、フル
オレセイン等の蛍光色素で染色した後に、明視野顕微鏡
あるいは蛍光顕微鏡で観測する方法が一般的に行われて
きた。
【０００４】これらの方法では、染色を行わない場合は
もちろんのこと、標的個体全体をあるいは部分的に染色
する染色法を併用する場合でも、標的個体を形態的に観
察、評価し、別種の個体と区別することはできても、形
態上の差のない同種の個体間における遺伝子の変異によ
る差異を区別することはできない。また、色素や蛍光色
素は、生きている状態の標的個体（生標的個体）の細胞
膜や核膜を透過しにくいので生標的個体を染色して検出
することは困難である。
もちろんのこと、標的個体全体をあるいは部分的に染色
する染色法を併用する場合でも、標的個体を形態的に観
察、評価し、別種の個体と区別することはできても、形
態上の差のない同種の個体間における遺伝子の変異によ
る差異を区別することはできない。また、色素や蛍光色
素は、生きている状態の標的個体（生標的個体）の細胞
膜や核膜を透過しにくいので生標的個体を染色して検出
することは困難である。
【０００５】一方、標的個体を遺伝子、核酸レベルで評
価する方法として、最近、標的個体から核酸を抽出して
その塩基配列を調べたり、あるいはその制限酵素切断の
パターンを調べることが行われるようになってきた。し
かし、このような方法によってもやはり標的個体を生き
ている状態で、かつ形態を保ったままで評価することは
できない。また、この標的個体からの核酸を扱う試験
は、一連の操作が煩雑で検出に長時間を必要とする等の
問題点も有している。
価する方法として、最近、標的個体から核酸を抽出して
その塩基配列を調べたり、あるいはその制限酵素切断の
パターンを調べることが行われるようになってきた。し
かし、このような方法によってもやはり標的個体を生き
ている状態で、かつ形態を保ったままで評価することは
できない。また、この標的個体からの核酸を扱う試験
は、一連の操作が煩雑で検出に長時間を必要とする等の
問題点も有している。
【０００６】このような従来からの一般的な方法におけ
る問題点を解決する方法の一つとして、近年、標的個体
を遺伝子レベルで評価するin situハイブリダイゼーシ
ョン法が研究され、一部実用化されてきている（例え
ば、Nucleic Acid Research, Vol. 20, No. 1, 83-88,
1991）。以下、in situハイブリダイゼーション法につ
いて簡単に説明する。標的個体内の核酸に固有の塩基
配列に相補的な塩基配列を有する核酸プローブを用意す
る。なお、この核酸プローブはなんらかの検出可能な部
位（標識）を有している。標的個体をメタノール等で
死滅、固定化する。上記核酸プローブと固定化した標
的個体の核酸を標的個体内（in situ）でハイブリダイ
ゼーションさせる。ハイブリッド体を形成しなかった
プローブを洗う。標的個体内に形成されたハイブリッ
ド体を前記標識を利用して検出する。このin situハイ
ブリダイゼーション法によれば、標的個体からの核酸の
抽出工程を省略でき、その形態を保ったままで遺伝子や
核酸レベルでの標的個体の検出やその数の計測が可能と
なる。なお、この方法では、生標的個体を死滅させるこ
とで、細胞膜や核膜を改変して核酸プローブのこれらの
膜の通過を容易にしている。
る問題点を解決する方法の一つとして、近年、標的個体
を遺伝子レベルで評価するin situハイブリダイゼーシ
ョン法が研究され、一部実用化されてきている（例え
ば、Nucleic Acid Research, Vol. 20, No. 1, 83-88,
1991）。以下、in situハイブリダイゼーション法につ
いて簡単に説明する。標的個体内の核酸に固有の塩基
配列に相補的な塩基配列を有する核酸プローブを用意す
る。なお、この核酸プローブはなんらかの検出可能な部
位（標識）を有している。標的個体をメタノール等で
死滅、固定化する。上記核酸プローブと固定化した標
的個体の核酸を標的個体内（in situ）でハイブリダイ
ゼーションさせる。ハイブリッド体を形成しなかった
プローブを洗う。標的個体内に形成されたハイブリッ
ド体を前記標識を利用して検出する。このin situハイ
ブリダイゼーション法によれば、標的個体からの核酸の
抽出工程を省略でき、その形態を保ったままで遺伝子や
核酸レベルでの標的個体の検出やその数の計測が可能と
なる。なお、この方法では、生標的個体を死滅させるこ
とで、細胞膜や核膜を改変して核酸プローブのこれらの
膜の通過を容易にしている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】前述のように、in sit
uハイブリダイゼーションによれば、それ以前の一般的
な方法では不可能であった形態を保ったままでの標的個
体の核酸レベルでの判別、検出、個体数の計測が可能で
ある。しかしながら、標的個体を生きた状態で検出でき
ないという問題点は依然として残されている。
uハイブリダイゼーションによれば、それ以前の一般的
な方法では不可能であった形態を保ったままでの標的個
体の核酸レベルでの判別、検出、個体数の計測が可能で
ある。しかしながら、標的個体を生きた状態で検出でき
ないという問題点は依然として残されている。
【０００８】従来のin situハイブリダイゼーション法
において生標的個体の検出が不可能であった理由を要約
すれば以下のとおりである。核酸プローブの核酸部分
は、天然なものでも、化学合成されたものでも、天然型
であるので、リン酸部分の親水性が強いため生標的個体
の細胞膜や核膜を通過しにくい。核酸プローブが、細
胞膜や核膜を通過しても、生標的個体内の一本鎖核酸分
解酵素によって分解されてしまう場合がある。この傾向
は、核酸プローブの核酸部分がＤＮＡであるよりもＲＮ
Ａである場合の方が強い。核酸プローブの核酸部分が
ＤＮＡである場合、核酸プローブが生標的個体内の標的
核酸とハイブリッド体を形成したとしても生標的個体内
の二本鎖核酸分解酵素によって分解されてしまう場合が
ある。核酸プローブの標識部分として一般的に用いら
れている蛍光色素のなかには生標的個体に対して毒性を
示すものがあり、そうした色素を利用すると生標的個体
が死滅してしまう場合がある。
において生標的個体の検出が不可能であった理由を要約
すれば以下のとおりである。核酸プローブの核酸部分
は、天然なものでも、化学合成されたものでも、天然型
であるので、リン酸部分の親水性が強いため生標的個体
の細胞膜や核膜を通過しにくい。核酸プローブが、細
胞膜や核膜を通過しても、生標的個体内の一本鎖核酸分
解酵素によって分解されてしまう場合がある。この傾向
は、核酸プローブの核酸部分がＤＮＡであるよりもＲＮ
Ａである場合の方が強い。核酸プローブの核酸部分が
ＤＮＡである場合、核酸プローブが生標的個体内の標的
核酸とハイブリッド体を形成したとしても生標的個体内
の二本鎖核酸分解酵素によって分解されてしまう場合が
ある。核酸プローブの標識部分として一般的に用いら
れている蛍光色素のなかには生標的個体に対して毒性を
示すものがあり、そうした色素を利用すると生標的個体
が死滅してしまう場合がある。
【０００９】本発明の目的は、生きた状態の標的個体の
核酸レベルで検出あるいは識別したり、その個体数を計
測するための方法を提供することにある。
核酸レベルで検出あるいは識別したり、その個体数を計
測するための方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明の生個体の検出方
法は、検出すべき生標的個体中の核酸が有する固有の塩
基配列に相補的な塩基配列を含み、該生標的個体が取込
み可能な非天然型核酸、及び該非天然型核酸に結合し
た、６００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の波長域に吸収と
蛍光を有するシアニン系色素またはアズレン系色素から
選ばれる蛍光色素を標識物質として有するプローブを、
該生標的個体を含んでいる可能性のある試料と混合し、
該プローブの非天然型核酸と該生標的個体中の固有の塩
基配列を有する核酸とがハイブリダイズする条件下に置
く過程； 該プローブと混合し、該プローブと該生標的個
体中の固有の塩基配列を有する核酸とがハイブリダイズ
する条件下に置いた該試料に６００〜１０００ｎｍの波
長域の光を照射する過程；及び 該生標的個体中に取り込
まれて該固有の塩基配列を有する核酸とハイブリダイズ
したプローブについて該プローブの該標識物質が発する
蛍光の有無を検出する過程； を有することを特徴とす
る。
法は、検出すべき生標的個体中の核酸が有する固有の塩
基配列に相補的な塩基配列を含み、該生標的個体が取込
み可能な非天然型核酸、及び該非天然型核酸に結合し
た、６００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の波長域に吸収と
蛍光を有するシアニン系色素またはアズレン系色素から
選ばれる蛍光色素を標識物質として有するプローブを、
該生標的個体を含んでいる可能性のある試料と混合し、
該プローブの非天然型核酸と該生標的個体中の固有の塩
基配列を有する核酸とがハイブリダイズする条件下に置
く過程； 該プローブと混合し、該プローブと該生標的個
体中の固有の塩基配列を有する核酸とがハイブリダイズ
する条件下に置いた該試料に６００〜１０００ｎｍの波
長域の光を照射する過程；及び 該生標的個体中に取り込
まれて該固有の塩基配列を有する核酸とハイブリダイズ
したプローブについて該プローブの該標識物質が発する
蛍光の有無を検出する過程； を有することを特徴とす
る。
【００１１】本発明にかかる検出方法は、プローブの構
造を用途に応じて適宜選択することで、検出すべき生標
的個体としての、各種の細胞や、ウイルス、細菌、放線
菌、酵母、かび、きのこ、藻類及び原生動物などの各種
微生物の検出に利用できる。
造を用途に応じて適宜選択することで、検出すべき生標
的個体としての、各種の細胞や、ウイルス、細菌、放線
菌、酵母、かび、きのこ、藻類及び原生動物などの各種
微生物の検出に利用できる。
【００１２】本発明にかかるプローブは、検出すべき生
標的個体中の核酸に固有の塩基配列に相補的な塩基配列
を含み、該生標的個体が取込み可能な非天然型核酸、お
よび該非天然型核酸に結合した、６００ｎｍ以上１００
０ｎｍ以下の波長領域に吸収と蛍光発光能を有するシア
ニン系色素およびアズレン系色素から選ばれる蛍光色素
とを有することを特徴とする。前述のようにプローブの
核酸部分が天然型であると、細胞膜や核膜を通過しにく
くなり、また生標的個体内での分解を受けやい。本発明
において、天然型核酸とは、ＤＮＡの場合、２’−デオ
キシリボヌクレオチドが３’→５’リン酸ジエステル結
合を介して結合しているものをいう。ＲＮＡの場合に
は、リボヌクレオチドが３’→５’リン酸ジエステル結
合を介して結合しているものをいう。これら天然型の核
酸以外の構造を有する核酸を本発明では基本的に非天然
型核酸と言う。生体内においても微量ではあるが、天然
型以外の核酸が存在し、これらの核酸は修飾型と呼ばれ
非天然型核酸に分類される。
標的個体中の核酸に固有の塩基配列に相補的な塩基配列
を含み、該生標的個体が取込み可能な非天然型核酸、お
よび該非天然型核酸に結合した、６００ｎｍ以上１００
０ｎｍ以下の波長領域に吸収と蛍光発光能を有するシア
ニン系色素およびアズレン系色素から選ばれる蛍光色素
とを有することを特徴とする。前述のようにプローブの
核酸部分が天然型であると、細胞膜や核膜を通過しにく
くなり、また生標的個体内での分解を受けやい。本発明
において、天然型核酸とは、ＤＮＡの場合、２’−デオ
キシリボヌクレオチドが３’→５’リン酸ジエステル結
合を介して結合しているものをいう。ＲＮＡの場合に
は、リボヌクレオチドが３’→５’リン酸ジエステル結
合を介して結合しているものをいう。これら天然型の核
酸以外の構造を有する核酸を本発明では基本的に非天然
型核酸と言う。生体内においても微量ではあるが、天然
型以外の核酸が存在し、これらの核酸は修飾型と呼ばれ
非天然型核酸に分類される。
【００１３】この非天然型の核酸は、プローブとして必
要な塩基配列を有する核酸を、上記の機能が付与される
ように適宜修飾して得ることができる。このような修飾
を行う方法としては、特に限定はないが、核酸のリン酸
部、糖部、塩基部等に目的に応じた修飾を行う方法が利
用できる。例えば、核酸の糖部を修飾する方法として
は、β−Ｄ−リボフラノシル環に代えて、アノマーやア
ラビノース環を導入する方法等が挙げられる。
要な塩基配列を有する核酸を、上記の機能が付与される
ように適宜修飾して得ることができる。このような修飾
を行う方法としては、特に限定はないが、核酸のリン酸
部、糖部、塩基部等に目的に応じた修飾を行う方法が利
用できる。例えば、核酸の糖部を修飾する方法として
は、β−Ｄ−リボフラノシル環に代えて、アノマーやア
ラビノース環を導入する方法等が挙げられる。
【００１４】この核酸の修飾にあたっては、核酸のプロ
ーブとしての機能、すなわち標的核酸とのハイブリッド
体の形成機能が損なわれないように注意する必要があ
る。具体的には、核酸部分の有する塩基部分の水素結合
部位を修飾することを避け、例えば、修飾を、ウラシル
の５位、β−Ｄ−リボフラノシル環の２’位あるいはリ
ン酸部分に行うようにすると良い。
ーブとしての機能、すなわち標的核酸とのハイブリッド
体の形成機能が損なわれないように注意する必要があ
る。具体的には、核酸部分の有する塩基部分の水素結合
部位を修飾することを避け、例えば、修飾を、ウラシル
の５位、β−Ｄ−リボフラノシル環の２’位あるいはリ
ン酸部分に行うようにすると良い。
【００１５】また、プローブの生標的個体との反応及び
生標的個体への取込み、及び生標的個体内での輸送の形
態を考慮して、その核酸部分の修飾を選択することも必
要である。例えば、適当な緩衝液中でプローブと生標的
個体を接触させるには、プローブが水溶性であることが
必要である。しかしながら、生標的個体への取込みとい
う観点からは、プローブの親水性は適度にコントロール
されていることが必要である。なぜならば、天然型の核
酸が細胞膜や核膜を通過しにくいのは、該核酸のリン酸
部分の親水性が強すぎて細胞膜や核膜の脂質二重膜の疎
水性構造部分を通過しにくいためである。一方、核酸を
疎水性とすると、この脂質二重膜の親水性構造部分の通
過が困難になるばかりではなく、水溶性が失われてしま
う。従って、プローブの核酸部分の親水性部分と疎水性
部分のバランスを目的に応じてコントロールすることが
必要となる。この親水性部分と疎水性部分のバランスの
コントロールは、リン酸部分の必要数を修飾して疎水性
にしたり、その他の部分に疎水性もしくは親水性の官能
基を導入する等の方法によって行うことができる。更
に、修飾後のプローブが生標的個体に対して無毒である
ように修飾を選択する必要もあり、例えば、ウラシルの
５位のフッ素での置換等の修飾は好ましくない。
生標的個体への取込み、及び生標的個体内での輸送の形
態を考慮して、その核酸部分の修飾を選択することも必
要である。例えば、適当な緩衝液中でプローブと生標的
個体を接触させるには、プローブが水溶性であることが
必要である。しかしながら、生標的個体への取込みとい
う観点からは、プローブの親水性は適度にコントロール
されていることが必要である。なぜならば、天然型の核
酸が細胞膜や核膜を通過しにくいのは、該核酸のリン酸
部分の親水性が強すぎて細胞膜や核膜の脂質二重膜の疎
水性構造部分を通過しにくいためである。一方、核酸を
疎水性とすると、この脂質二重膜の親水性構造部分の通
過が困難になるばかりではなく、水溶性が失われてしま
う。従って、プローブの核酸部分の親水性部分と疎水性
部分のバランスを目的に応じてコントロールすることが
必要となる。この親水性部分と疎水性部分のバランスの
コントロールは、リン酸部分の必要数を修飾して疎水性
にしたり、その他の部分に疎水性もしくは親水性の官能
基を導入する等の方法によって行うことができる。更
に、修飾後のプローブが生標的個体に対して無毒である
ように修飾を選択する必要もあり、例えば、ウラシルの
５位のフッ素での置換等の修飾は好ましくない。
【００１６】本発明におけるプローブの標識部分として
は、標的個体の生きた状態での検出を可能とするもので
あれば特に制限はないが、色素や蛍光色素を利用するこ
とができる。標識の選択に当っては、例えば、以下のよ
うな点を考慮すると良い。Ａ）核酸部分と同様に、この
標識部分もまた生標的個体に対して無毒である必要があ
り、例えば、シアニン系色素やアズレン系色素あるいは
ピリリウム系色素で生体に対する毒性を示さないものが
利用できる。Ｂ）蛍光色素を利用する場合、生標的個体
自体や検出系に存在する物質による励起光の吸収や蛍光
によるバックグランドの上昇によって検出感度が低下す
ることを避けるために、標識以外の物質による励起光の
吸収や蛍光の検出への影響がない、あるいはそれが問題
とならない励起波長の蛍光色素を選択するのが好まし
い。このような蛍光色素としては、例えば、６００〜１
０００ｎｍの近赤外の波長領域に吸収、蛍光を有する蛍
光色素を挙げることができる。なお、１０００ｎｍを超
える波長領域に吸収を持つ色素を標識とした場合、吸収
によって発熱をおこす場合があるので好ましくない。前
記シアニン系色素やアズレン系色素あるいはピリリウム
系色素には、６００〜１０００ｎｍの波長領域に吸収及
び蛍光を有するものが多く、この意味でもこれらの色素
を用いることは有利である。本発明においては、これら
の色素の中から、６００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の波
長域に吸収を有し、且つこの波長領域内の波長を有する
蛍光を発光するシアニン系色素及びアズレン系色素から
選ばれた蛍光色素が用いられる。
は、標的個体の生きた状態での検出を可能とするもので
あれば特に制限はないが、色素や蛍光色素を利用するこ
とができる。標識の選択に当っては、例えば、以下のよ
うな点を考慮すると良い。Ａ）核酸部分と同様に、この
標識部分もまた生標的個体に対して無毒である必要があ
り、例えば、シアニン系色素やアズレン系色素あるいは
ピリリウム系色素で生体に対する毒性を示さないものが
利用できる。Ｂ）蛍光色素を利用する場合、生標的個体
自体や検出系に存在する物質による励起光の吸収や蛍光
によるバックグランドの上昇によって検出感度が低下す
ることを避けるために、標識以外の物質による励起光の
吸収や蛍光の検出への影響がない、あるいはそれが問題
とならない励起波長の蛍光色素を選択するのが好まし
い。このような蛍光色素としては、例えば、６００〜１
０００ｎｍの近赤外の波長領域に吸収、蛍光を有する蛍
光色素を挙げることができる。なお、１０００ｎｍを超
える波長領域に吸収を持つ色素を標識とした場合、吸収
によって発熱をおこす場合があるので好ましくない。前
記シアニン系色素やアズレン系色素あるいはピリリウム
系色素には、６００〜１０００ｎｍの波長領域に吸収及
び蛍光を有するものが多く、この意味でもこれらの色素
を用いることは有利である。本発明においては、これら
の色素の中から、６００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の波
長域に吸収を有し、且つこの波長領域内の波長を有する
蛍光を発光するシアニン系色素及びアズレン系色素から
選ばれた蛍光色素が用いられる。
【００１７】本発明において、生標的個体中に取込まれ
て、標的核酸とハイブリッド体を形成しているプローブ
と未反応のプローブとの区別ができない場合には、いわ
ゆる洗いの操作が必要となる。この操作は、例えば、プ
ローブを含まない培地で６〜１２時間培養する操作を数
回繰り返すことにより行うことができる。
て、標的核酸とハイブリッド体を形成しているプローブ
と未反応のプローブとの区別ができない場合には、いわ
ゆる洗いの操作が必要となる。この操作は、例えば、プ
ローブを含まない培地で６〜１２時間培養する操作を数
回繰り返すことにより行うことができる。
【００１８】また、標識として、ハイブリッド体の２本
鎖構造と特異的な相互作用を行い、プローブがハイブリ
ッド体を形成した状態で検出可能となるものを利用すれ
ば、上述の洗いの操作は不要となるので有利である。こ
のような標識としては、例えば、アクリジン等のよう
に、核酸塩基に対するインターカレーターとしての機能
を有し、２本鎖構造にインターカレートして蛍光強度が
増大する蛍光色素を利用することができる。
鎖構造と特異的な相互作用を行い、プローブがハイブリ
ッド体を形成した状態で検出可能となるものを利用すれ
ば、上述の洗いの操作は不要となるので有利である。こ
のような標識としては、例えば、アクリジン等のよう
に、核酸塩基に対するインターカレーターとしての機能
を有し、２本鎖構造にインターカレートして蛍光強度が
増大する蛍光色素を利用することができる。
【００１９】プローブと標的核酸とのハイブリッド体を
有する生標的個体を検出する方法は、プローブに結合さ
せた標識に応じて選択する。標識として蛍光色素を利用
した場合には、大量に存在する標的でない生個体から生
標的個体を効率良く区別できるという点からフローサイ
トメトリー法が有利である。この際、前述した６００〜
１０００ｎｍの近赤外の波長領域に吸収と蛍光を有する
色素を使用すればフローサイトメーター（ＦＣＭ）の光
源として半導体レーザー装置、Ｈｅ−Ｎｅレーザー装置
等の小型で安価なレーザー装置を利用できるという利点
もある。生標的個体をプローブで標識し、その検出にＦ
ＣＭを利用することにより、例えば、生体や土壌中等の
環境から抽出した生標的個体を速やかに検出し、その数
を計測することが可能となる。
有する生標的個体を検出する方法は、プローブに結合さ
せた標識に応じて選択する。標識として蛍光色素を利用
した場合には、大量に存在する標的でない生個体から生
標的個体を効率良く区別できるという点からフローサイ
トメトリー法が有利である。この際、前述した６００〜
１０００ｎｍの近赤外の波長領域に吸収と蛍光を有する
色素を使用すればフローサイトメーター（ＦＣＭ）の光
源として半導体レーザー装置、Ｈｅ−Ｎｅレーザー装置
等の小型で安価なレーザー装置を利用できるという利点
もある。生標的個体をプローブで標識し、その検出にＦ
ＣＭを利用することにより、例えば、生体や土壌中等の
環境から抽出した生標的個体を速やかに検出し、その数
を計測することが可能となる。
【００２０】生標的個体の標的核酸の選択には特に制限
はなく、検出目的に応じて適宜選択する。例えば、ゲノ
ムＤＮＡ、リボゾームＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、
プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が利用でき、一個
の生標的個体内に標的核酸がより多くのコピー数で存在
していればより高感度な測定が可能となるので、このよ
うな観点からは、リボゾームＲＮＡやメッセンジャーＲ
ＮＡが好ましく、また、生標的個体が細菌である場合に
は、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡが望ましい。な
お、生標的個体が外来遺伝子が導入された組換え体の場
合には、該外来遺伝子やそれに基づいて形成されたＲＮ
Ａ等を標的核酸とすれば、組換え体の検出を本発明の方
法で行うことができる。
はなく、検出目的に応じて適宜選択する。例えば、ゲノ
ムＤＮＡ、リボゾームＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、
プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が利用でき、一個
の生標的個体内に標的核酸がより多くのコピー数で存在
していればより高感度な測定が可能となるので、このよ
うな観点からは、リボゾームＲＮＡやメッセンジャーＲ
ＮＡが好ましく、また、生標的個体が細菌である場合に
は、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡが望ましい。な
お、生標的個体が外来遺伝子が導入された組換え体の場
合には、該外来遺伝子やそれに基づいて形成されたＲＮ
Ａ等を標的核酸とすれば、組換え体の検出を本発明の方
法で行うことができる。
【００２１】
【実施例】以下、実施例に従って本発明を詳細に説明す
る。
る。
【００２２】実施例１
（１）ホスホロチオエート型非天然型核酸（ＤＮＡ）の
合成 Ｈｅｌａ細胞のβ−アクチンｍＲＮＡの有する塩基配列
の一部に相補的な以下に示す塩基配列を有する２０量体
全ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドをＡＢＩ社
製３８１Ａ ＤＮＡ自動合成機を用いて合成した。更に
このオリゴヌクレオチドの５’末端にアミノモディファ
イアー（Ｃ６）（グレン・リサーチ社製）を自動合成機
上で結合した。 ５’ＧＣＧＣＧＧＣＧＡＴＡＴＣＡＴＣＡＴＴＣ ３’ （下線部は制限酵素ＥｃｏＲＶによる切断部位であ
る。） （２）シアニン系色素のスクシイミドエステル化 アルゴン気流下、１００ｍｌの遮光した反応容器にカル
ボキシル基を有するシアニン系色素 ＮＫ−３６６９
（日本感光色素）０．５ｇを乾燥ＤＭＦ３０ｍｌに溶解
させた。これを−１０℃に冷却した後、Ｎ，Ｎ’−ジス
クシイミジルカーボネート０．４ｇを添加した。同温度
で５時間反応させた後、クロロホルム１５０ｍｌに反応
液を注入し、食塩水２００ｍｌで３回洗浄してから、水
洗後、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラ
ムで精製後、エタノール−イソプロピルエーテル中で結
晶させて、シアニン系色素のスクシイミドエステルの結
晶０．２ｇを得た。 （３）非天然型オリゴヌクレオチドとシアニン系色素の
結合 先の（１）で合成した全ホスホロチオエート型オリゴヌ
クレオチド０．１μｍｏｌを水７００μｌに溶解した。
この溶液に１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９．０）
を加え、更に、（２）で合成したシアニン系色素のスク
シイミドエステル１ｍｇのＤＭＦ溶液２００μｌを攪拌
下徐々に加えた後、４０℃で２４時間反応させた。次
に、この反応液からゲル濾過カラムＮＡＰ−２５で過剰
な色素を除去し、ＲＰＬＣで精製して、７５ｎｍｏｌの
シアニン系色素結合ホスホロチオエート型オリゴヌクレ
オチドを得た。このヌクレオチドをプローブ（Ｉ）とし
て以下の操作に用いた。 （４）酵素消化 プローブ（Ｉ）の１００ｐｍｏｌの所定のプロトコール
に従ったＳ１ヌクレアーゼでの１時間消化反応を行っ
た。反応液のポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）
の結果、プローブ（Ｉ）はＳ１ヌクレアーゼで消化され
ないことがわかった。次に、プローブ（Ｉ）と相補的な
天然型オリゴヌクレオチド（ｉ）をＡＢＩ社製３８１Ａ
ＤＮＡ自動合成機を用いて合成し、この天然型オリゴ
ヌクレオチド（ｉ）とプローブ（Ｉ）とをハイブリダイ
ズさせて得られたハイブリッド体に、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｖでの所定のプロトコールに従った１時間の消化反応を
行った。反応終了後、反応液のＰＡＧＥを行ったとこ
ろ、このハイブリッド体はＥｃｏＲＶでは切断されない
ことがわかった。 （５）ハイブリダイゼーション ＨｅＬａ細胞をＭＥＭ培地に懸濁後、２．５×１０5個
／枚となるようにディシュに蒔いた。３７℃で３６時間
培養した後、プローブ（Ｉ）を１０ｎＭの濃度で含むＭ
ＥＭ培地と交換し、引き続き２４時間培養した。つい
で、プローブ（Ｉ）を含まないＭＥＭ培地に交換して１
２時間培養する操作を２回繰り返した後、ＰＢＳ（−）
で二回洗浄してから、０．００１％トリプシン、１ｍＭ
ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（−）で更に処理した後、遠心
して細胞を回収した。回収した細胞をＰＢＳ（−）に懸
濁して得た細胞懸濁液を以下の（６）のＦＣＭによる計
測に用いた。 （６）ＦＣＭ計測 用いたＦＣＭは光源を波長７８０ｎｍの半導体レーザー
仕様としたもので、蛍光の計測にはプローブ（Ｉ）の有
するシアニン系色素標識の８３０ｎｍの蛍光波長を９０
％以上透過するフィルターを用いた。
合成 Ｈｅｌａ細胞のβ−アクチンｍＲＮＡの有する塩基配列
の一部に相補的な以下に示す塩基配列を有する２０量体
全ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドをＡＢＩ社
製３８１Ａ ＤＮＡ自動合成機を用いて合成した。更に
このオリゴヌクレオチドの５’末端にアミノモディファ
イアー（Ｃ６）（グレン・リサーチ社製）を自動合成機
上で結合した。 ５’ＧＣＧＣＧＧＣＧＡＴＡＴＣＡＴＣＡＴＴＣ ３’ （下線部は制限酵素ＥｃｏＲＶによる切断部位であ
る。） （２）シアニン系色素のスクシイミドエステル化 アルゴン気流下、１００ｍｌの遮光した反応容器にカル
ボキシル基を有するシアニン系色素 ＮＫ−３６６９
（日本感光色素）０．５ｇを乾燥ＤＭＦ３０ｍｌに溶解
させた。これを−１０℃に冷却した後、Ｎ，Ｎ’−ジス
クシイミジルカーボネート０．４ｇを添加した。同温度
で５時間反応させた後、クロロホルム１５０ｍｌに反応
液を注入し、食塩水２００ｍｌで３回洗浄してから、水
洗後、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラ
ムで精製後、エタノール−イソプロピルエーテル中で結
晶させて、シアニン系色素のスクシイミドエステルの結
晶０．２ｇを得た。 （３）非天然型オリゴヌクレオチドとシアニン系色素の
結合 先の（１）で合成した全ホスホロチオエート型オリゴヌ
クレオチド０．１μｍｏｌを水７００μｌに溶解した。
この溶液に１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９．０）
を加え、更に、（２）で合成したシアニン系色素のスク
シイミドエステル１ｍｇのＤＭＦ溶液２００μｌを攪拌
下徐々に加えた後、４０℃で２４時間反応させた。次
に、この反応液からゲル濾過カラムＮＡＰ−２５で過剰
な色素を除去し、ＲＰＬＣで精製して、７５ｎｍｏｌの
シアニン系色素結合ホスホロチオエート型オリゴヌクレ
オチドを得た。このヌクレオチドをプローブ（Ｉ）とし
て以下の操作に用いた。 （４）酵素消化 プローブ（Ｉ）の１００ｐｍｏｌの所定のプロトコール
に従ったＳ１ヌクレアーゼでの１時間消化反応を行っ
た。反応液のポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）
の結果、プローブ（Ｉ）はＳ１ヌクレアーゼで消化され
ないことがわかった。次に、プローブ（Ｉ）と相補的な
天然型オリゴヌクレオチド（ｉ）をＡＢＩ社製３８１Ａ
ＤＮＡ自動合成機を用いて合成し、この天然型オリゴ
ヌクレオチド（ｉ）とプローブ（Ｉ）とをハイブリダイ
ズさせて得られたハイブリッド体に、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｖでの所定のプロトコールに従った１時間の消化反応を
行った。反応終了後、反応液のＰＡＧＥを行ったとこ
ろ、このハイブリッド体はＥｃｏＲＶでは切断されない
ことがわかった。 （５）ハイブリダイゼーション ＨｅＬａ細胞をＭＥＭ培地に懸濁後、２．５×１０5個
／枚となるようにディシュに蒔いた。３７℃で３６時間
培養した後、プローブ（Ｉ）を１０ｎＭの濃度で含むＭ
ＥＭ培地と交換し、引き続き２４時間培養した。つい
で、プローブ（Ｉ）を含まないＭＥＭ培地に交換して１
２時間培養する操作を２回繰り返した後、ＰＢＳ（−）
で二回洗浄してから、０．００１％トリプシン、１ｍＭ
ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（−）で更に処理した後、遠心
して細胞を回収した。回収した細胞をＰＢＳ（−）に懸
濁して得た細胞懸濁液を以下の（６）のＦＣＭによる計
測に用いた。 （６）ＦＣＭ計測 用いたＦＣＭは光源を波長７８０ｎｍの半導体レーザー
仕様としたもので、蛍光の計測にはプローブ（Ｉ）の有
するシアニン系色素標識の８３０ｎｍの蛍光波長を９０
％以上透過するフィルターを用いた。
【００２３】まず、あらかじめプローブ（Ｉ）で処理し
ていない未処理ＨｅＬａ細胞（未処理細胞）をＦＣＭで
計測し、前方散乱のパターンを調べた。また、蛍光の測
定においては未処理ＨｅＬａ細胞では、蛍光を有する細
胞は検出されなかった。
ていない未処理ＨｅＬａ細胞（未処理細胞）をＦＣＭで
計測し、前方散乱のパターンを調べた。また、蛍光の測
定においては未処理ＨｅＬａ細胞では、蛍光を有する細
胞は検出されなかった。
【００２４】ついで、先の（５）でプローブ（Ｉ）で処
理した細胞の懸濁液を用いて計測を行った。その結果得
られた前方散乱パターンは、上記の未処理細胞と同一で
あった。計測された前方散乱を有する微粒子（計測数５
０００個、細胞を含む）のうち約９５％が主ピークに集
中した。従って、残り５％は緩衝液中に含まれる塵等で
ある。この主ピークが示す細胞のうち約９０％が蛍光を
有していた。後述の比較例１及び２の結果と比較して、
この結果は、非天然型であるプローブ（Ｉ）がＨｅＬａ
細胞内の標的核酸と特異的にハイブリッド体を形成した
ことを示す。このように、生細胞が取り込み可能な構造
を有する非天然型核酸からなり、蛍光色素により標識さ
れたプローブを用いることで、細胞を生きている状態で
検出及びその個数を計測することが可能となる。
理した細胞の懸濁液を用いて計測を行った。その結果得
られた前方散乱パターンは、上記の未処理細胞と同一で
あった。計測された前方散乱を有する微粒子（計測数５
０００個、細胞を含む）のうち約９５％が主ピークに集
中した。従って、残り５％は緩衝液中に含まれる塵等で
ある。この主ピークが示す細胞のうち約９０％が蛍光を
有していた。後述の比較例１及び２の結果と比較して、
この結果は、非天然型であるプローブ（Ｉ）がＨｅＬａ
細胞内の標的核酸と特異的にハイブリッド体を形成した
ことを示す。このように、生細胞が取り込み可能な構造
を有する非天然型核酸からなり、蛍光色素により標識さ
れたプローブを用いることで、細胞を生きている状態で
検出及びその個数を計測することが可能となる。
【００２５】比較例１
全ホスホロチオエート型の２０量体デオキシアデニル酸
ホモオリゴヌクレオチドをＡＢＩ社製３８１Ａ ＤＮＡ
自動合成機を用いて合成し、これに実施例１と同様にし
てシアニン系色素を結合させ、プローブ（ＩＩ）を得
た。次に、このプローブ（ＩＩ）を用いて実施例１と同
様にして、ＨｅＬａ細胞の処理を行った後、ＦＣＭで計
測したところ、実施例１で計測された蛍光の約１％にあ
たる蛍光しか検出されなかった。
ホモオリゴヌクレオチドをＡＢＩ社製３８１Ａ ＤＮＡ
自動合成機を用いて合成し、これに実施例１と同様にし
てシアニン系色素を結合させ、プローブ（ＩＩ）を得
た。次に、このプローブ（ＩＩ）を用いて実施例１と同
様にして、ＨｅＬａ細胞の処理を行った後、ＦＣＭで計
測したところ、実施例１で計測された蛍光の約１％にあ
たる蛍光しか検出されなかった。
【００２６】比較例２
実施例１のプローブ（Ｉ）と同じ塩基配列を有する全リ
ン酸ジエステル（天然）型の２０量体オリゴヌクレオチ
ドをＡＢＩ社製３８１Ａ ＤＮＡ合成機を用いて合成
し、これに実施例１と同様にしてシアニン系色素を結合
させてプローブ（ＩＩＩ）とした。このプローブ（ＩＩ
Ｉ）を用いて実施例１と同様にして、ＨｅＬａ細胞の処
理を行った後、ＦＣＭで計測したところ、蛍光は検出さ
れなかった。
ン酸ジエステル（天然）型の２０量体オリゴヌクレオチ
ドをＡＢＩ社製３８１Ａ ＤＮＡ合成機を用いて合成
し、これに実施例１と同様にしてシアニン系色素を結合
させてプローブ（ＩＩＩ）とした。このプローブ（ＩＩ
Ｉ）を用いて実施例１と同様にして、ＨｅＬａ細胞の処
理を行った後、ＦＣＭで計測したところ、蛍光は検出さ
れなかった。
【００２７】実施例２
（１）核酸プローブの合成
実施例１のプローブ（Ｉ）と同じ塩基配列を有する全ホ
スホロチオエート型２０量体非天然型オリゴヌクレオチ
ドをＡＢＩ社製３８１Ａ ＤＮＡ自動合成機を用いて合
成した後、その５’末端にチオールモディファイアー
（Ｃ６）（グレンリサーチ社製）を自動合成機で縮合さ
せた。ＣＰＧカラムからの切り出し、脱保護、脱トリチ
ル、ＲＰＬＣによる精製は所定のプロトコールに従って
行った。得られた５’末端にチオール基が結合したオリ
ゴヌクレオチドにＮ−（９−アクリジニル）マレイミド
（シグマ社製）を結合して、プローブ（ＩＶ）を得た。
その結合条件は、緩衝液を１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ＝７．０）とした以外は実施例１におけるシアニ
ン系色素の結合と同様である。このプローブ（ＩＶ）の
標識部分であるアクリジン部分は２本鎖核酸の塩基対間
に対するインターカレーターである。
スホロチオエート型２０量体非天然型オリゴヌクレオチ
ドをＡＢＩ社製３８１Ａ ＤＮＡ自動合成機を用いて合
成した後、その５’末端にチオールモディファイアー
（Ｃ６）（グレンリサーチ社製）を自動合成機で縮合さ
せた。ＣＰＧカラムからの切り出し、脱保護、脱トリチ
ル、ＲＰＬＣによる精製は所定のプロトコールに従って
行った。得られた５’末端にチオール基が結合したオリ
ゴヌクレオチドにＮ−（９−アクリジニル）マレイミド
（シグマ社製）を結合して、プローブ（ＩＶ）を得た。
その結合条件は、緩衝液を１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ＝７．０）とした以外は実施例１におけるシアニ
ン系色素の結合と同様である。このプローブ（ＩＶ）の
標識部分であるアクリジン部分は２本鎖核酸の塩基対間
に対するインターカレーターである。
【００２８】これとは別に、上記と同様の方法によっ
て、全ホスホロチオエート型２０量体非天然型オリゴヌ
クレオチドの５’末端にヘキサノールアミンリンカーを
介してＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート、
Sigma 社製）を結合させてプローブ（Ｖ）を得た。な
お、このＦＩＴＣは核酸塩基対間に対するインターカレ
ーターではない。 （２）酵素消化 実施例１と同様の方法で、プローブ（ＩＶ）及び（Ｖ）
がＳ１ヌクレアーゼで消化されるかどうか試験したとこ
ろ、消化されないことがわかった。更に、実施例１と同
様にして、プローブ（ＩＶ）及び（Ｖ）と相補的な塩基
配列を有する天然型オリゴヌクレオチド（ｉｉ）を合成
して、プローブ（ＩＶ）とオリゴヌクレオチド（ｉｉ）
とのハイブリッド体と、プローブ（Ｖ）とオリゴヌクレ
オチド（ｉｉ）とのハイブリッド体をそれぞれ個々に形
成し、これらがＥｃｏＲＶで切断されるかどうか試験し
たところ、これらは切断されないことがわかった。 （３）ハイブリダイゼーション プローブ（ＩＶ）及び（Ｖ）を個々に用いて、実施例１
と同様にしてＨｅＬａ細胞のハイブリダイゼーション処
理を行った。ただし、プローブを含まない培地での最終
培養時間が、０時間、１２時間及び２４時間のサンプル
をそれぞれ用意した。 （４）ＦＣＭ計測 ＦＣＭとしてアルゴンレーザー仕様のものを用いた。ま
た、各計測は５０００個のＨｅＬａ細胞について行っ
た。表１にプローブ（ＩＶ）および（Ｖ）でそれぞれ処
理したＨｅＬａ細胞のＦＣＭでの蛍光計測で得られた蛍
光強度比（プローブを含まない培地での最終培養の培養
時間が０時間のものの蛍光強度に対する比で、この０時
間の蛍光強度を１．０として算出）の該最終培養の培養
時間に応じた変化を示した。
て、全ホスホロチオエート型２０量体非天然型オリゴヌ
クレオチドの５’末端にヘキサノールアミンリンカーを
介してＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート、
Sigma 社製）を結合させてプローブ（Ｖ）を得た。な
お、このＦＩＴＣは核酸塩基対間に対するインターカレ
ーターではない。 （２）酵素消化 実施例１と同様の方法で、プローブ（ＩＶ）及び（Ｖ）
がＳ１ヌクレアーゼで消化されるかどうか試験したとこ
ろ、消化されないことがわかった。更に、実施例１と同
様にして、プローブ（ＩＶ）及び（Ｖ）と相補的な塩基
配列を有する天然型オリゴヌクレオチド（ｉｉ）を合成
して、プローブ（ＩＶ）とオリゴヌクレオチド（ｉｉ）
とのハイブリッド体と、プローブ（Ｖ）とオリゴヌクレ
オチド（ｉｉ）とのハイブリッド体をそれぞれ個々に形
成し、これらがＥｃｏＲＶで切断されるかどうか試験し
たところ、これらは切断されないことがわかった。 （３）ハイブリダイゼーション プローブ（ＩＶ）及び（Ｖ）を個々に用いて、実施例１
と同様にしてＨｅＬａ細胞のハイブリダイゼーション処
理を行った。ただし、プローブを含まない培地での最終
培養時間が、０時間、１２時間及び２４時間のサンプル
をそれぞれ用意した。 （４）ＦＣＭ計測 ＦＣＭとしてアルゴンレーザー仕様のものを用いた。ま
た、各計測は５０００個のＨｅＬａ細胞について行っ
た。表１にプローブ（ＩＶ）および（Ｖ）でそれぞれ処
理したＨｅＬａ細胞のＦＣＭでの蛍光計測で得られた蛍
光強度比（プローブを含まない培地での最終培養の培養
時間が０時間のものの蛍光強度に対する比で、この０時
間の蛍光強度を１．０として算出）の該最終培養の培養
時間に応じた変化を示した。
【００２９】
【表１】
表１の結果から、インターカレーターとしての蛍光色素
であるアクリジンを標識として用いた場合の方が、細胞
中で標的核酸とプローブとのハイブリッド体が安定に維
持されるので、安定した測定が行えることがわかった。
であるアクリジンを標識として用いた場合の方が、細胞
中で標的核酸とプローブとのハイブリッド体が安定に維
持されるので、安定した測定が行えることがわかった。
【００３０】
【発明の効果】本発明によれば、非天然型核酸からなる
プローブを用いることで、標的個体の生きた状態での核
酸レベルでの検出、判別あるいはその数の計測が可能と
なった。更に、プローブに結合する標識として核酸塩基
対間に対するインターカレーターとして機能するものを
用いることで、安定した測定が可能となる。
プローブを用いることで、標的個体の生きた状態での核
酸レベルでの検出、判別あるいはその数の計測が可能と
なった。更に、プローブに結合する標識として核酸塩基
対間に対するインターカレーターとして機能するものを
用いることで、安定した測定が可能となる。
フロントページの続き
(72)発明者 富田 佳紀
東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キ
ヤノン株式会社内
(56)参考文献 Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ，1991， Ｖｏｌ．２， Ｎ
ｏ．４， ｐ．195−200
Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ，1991， Ｖｏ
ｌ．37，Ｎｏ．９， ｐ．1626−1632
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，1991，
Ｖｏｌ．32， ｐ．233−244
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ，Ｎｏｖ 1992， Ｖｏｌ.
20， Ｎｏ．21， ｐ．5691−5698
Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔ
ｉｏｎｓ，1990， Ｖｏｌ．２， Ｎ
ｏ．８， ｐ．287−294
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12Q 1/68
Claims (15)
- 【請求項１】核酸プローブによるハイブリダイゼーショ
ン法を用いて、生標的個体を検出する方法であって、該生標的個体は、細胞膜を有する生細胞または生微生物
であり、 該核酸プローブは、核酸部分と標識部分とを有し、 該核酸プローブの核酸部分は、検出すべき生標的個体中
の核酸が有する固有の塩基配列に相補的な塩基配列を含
み、 該生標的個体が取り込み可能で、且つ、該生標的個体に
対して毒性を示さないように、核酸を構成するリン酸
部、糖部および塩基部のうち、少なくとも、高い親水性
を有するリン酸ジエステル型のリン酸部の一部に、かか
る高い親水性を抑える修飾を加えた非天然型核酸であ
り、 該核酸プローブの標識部分は、標識物質として、該非天
然型核酸に結合した、６００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下
の波長域に吸収と蛍光を有するシアニン色素またはアズ
レン色素から選ばれる蛍光色素を有しており、 検出操作は、 前記プローブと該生標的個体を含んでいる可能性のある
試料と混合し、 該プローブの非天然型核酸と該生標的個体中の固有の塩
基配列を有する核酸とがハイブリダイズする条件下に置
く過程； 該プローブと混合して、該プローブの非天然型核酸と該
生標的個体中の固有の塩基配列を有する核酸とがハイブ
リダイズする条件下に置いた該試料に６００〜１０００
ｎｍの波長域の光を照射する過程；及び 該生標的個体中に取り込まれて、該プローブの非天然型
核酸と該生標的個体中の固有の塩基配列を有する核酸と
がハイブリダイズした該プローブについて、ハイブリッ
ド体中の該プローブの該標識物質が発する蛍光の有無を
検出する過程；を有することを特徴とする生標的個体の
検出方法。 - 【請求項２】該核酸プローブの核酸部分は、ホスホロチ
オエート型オリゴヌクレオチドであることを特徴とする
請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】該標識物質である蛍光色素は、核酸塩基対
間に対するインターカレーターであることを特徴とする
請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】該標識物質が発する蛍光の有無を検出は、
フローサイトメトリーにより行うことを特徴とする請求
項１または２に記載の方法。 - 【請求項５】該検出すべき生標的個体中の核酸は、ゲノ
ムＤＮＡであることを特徴とする請求項１または２に記
載の方法。 - 【請求項６】該検出すべき生標的個体中の核酸は、リボ
ゾームＲＮＡであることを特徴とする請求項１または２
に記載の方法。 - 【請求項７】該検出すべき生標的個体中の核酸は、メッ
センジャーＲＮＡであることを特徴とする請求項１また
は２に記載の方法。 - 【請求項８】前記プローブとハイブリダイズする該生標
的個体中の固有の塩基配列を有する核酸は、 生細胞、生微生物または生ウイルスに由来する固有の塩
基配列を有する核酸であることを特徴とする請求項１ま
たは２に記載の方法。 - 【請求項９】ハイブリダイゼーション法を用いた、生標
的個体の検出に際して利用可能な核酸プローブであっ
て、該生標的個体は、細胞膜を有する生細胞または生微生物
であり、 該核酸プローブは、核酸部分と標識部分とを有し、 該核酸プローブの核酸部分は、検出すべき生標的個体中
の核酸が有する固有の塩基配列に相補的な塩基配列を含
み、 該生標的個体が取り込み可能で、且つ、該生標的個体に
対して毒性を示さないように、核酸を構成するリン酸
部、糖部および塩基部のうち、少なくとも、高い親水性
を有するリン酸ジエステル型のリン酸部の一部に、かか
る高い親水性を抑える修飾を加えた非天然型核酸であ
り、 該核酸プローブの標識部分は、標識物質として、該非天
然型核酸に結合した、６００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下
の波長域に吸収と蛍光を有するシアニン色素またはアズ
レン色素から選ばれる蛍光色素を有していることを特徴
とする生標的個体検出用の核酸プローブ。 - 【請求項１０】該核酸プローブの核酸部分は、ホスホロ
チオエート型オリゴヌクレオチドであることを特徴とす
る請求項９に記載の核酸プローブ。 - 【請求項１１】該標識物質である蛍光色素は、核酸塩基
対間に対するインターカレーターであることを特徴とす
る請求項９または１０に記載の核酸プローブ。 - 【請求項１２】該検出すべき生標的個体中の核酸は、ゲ
ノムＤＮＡであることを特徴とする請求項９または１０
に記載の核酸プローブ。 - 【請求項１３】該検出すべき生標的個体中の核酸は、リ
ボゾームＲＮＡであることを特徴とする請求項９または
１０に記載の核酸プローブ。 - 【請求項１４】該検出すべき生標的個体中の核酸は、メ
ッセンジャーＲＮＡであることを特徴とする請求項９ま
たは１０に記載の核酸プローブ。 - 【請求項１５】前記プローブとハイブリダイズする該生
標的個体中の固有の塩基配列を有する核酸は、 生細胞、生微生物または生ウイルスに由来する固有の塩
基配列を有する核酸であることを特徴とする請求項９ま
たは１０に記載の核酸プローブ。
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