JP2676535B2 - 選択可能な切断部位を用いたポリヌクレオチドの測定 - Google Patents

選択可能な切断部位を用いたポリヌクレオチドの測定

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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 随意にオリゴヌクレオチド配列を合成し，合成的手法
により調製したポリヌクレオチド配列，または天然に存
在する起源より得たポリヌクレオチドをクローン化する
能力は，例えば染色体，配列混合物,mRNAなどのような
広範囲に及ぶオリゴヌクレオチド配列中における特定配
列の存在を検出する機会を大きく発展させた。特定配列
に関する興味には，その機会の例をいくつか挙げれば，
病原体の存在の診断，対立形質の存在の決定，宿主ゲノ
ム中における損傷の存在，特定のmRNAの検出，あるいは
宿主細胞の改変をモニターすることが伴い得る。試料中
の様々な抗原の存在を診断する分析を行なうために抗体
を利用することは，放射性免疫分析の出現により，技術
およびプロトコルが非常に発展したが,DNAプローブの領
域では，それに匹敵する活性が最近まで見られなかっ
た。それ故，配列の検出は，大体，ポリヌクレオチド配
列を支持体へ結合させることと，放射標識したプローブ
を用いることとを必要とする様々なハイブリダーゼーシ
ョン技術を伴っている。
多量のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション配
列を経済的な方法で生産する能力の増大を考慮すると，
研究者の注目は，簡便，正確，かつ効率的に特定のオリ
ゴヌクレオチド配列を検出する技術に向けられる。望ま
しくは，これらの技術は，迅速であり，技術者が誤りを
犯す機会を最小にし，自動化が可能であり，そして簡便
かつ正確な検出方法が可能となる。この目的に向けて，
標識に結合させるためにオリゴヌクレオチドを誘導する
改良された方法だけでなく，放射性同位元素以外の標識
でオリゴヌクレオチドプローブを標識する手段およびゲ
ルから支持体へDNA配列を移動させる精度を向上するた
めの努力が既になされている。DNAが様々な起源に由来
する種々の場合に興味あるDNA配列を検出するのに柔軟
性を考慮した新しいプロトコルを与える必要性が続いて
いる。
（従来の技術） MeinkothおよびWahlは，Anal.Biochemisty（1984）13
8:267−284に，ハイブリダイゼーション技術に関する優
れた総説を与えている。Learyらは，Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA（1983）80:4045−4049で，アビジン酵素複合体に
結合させたビオチニル化DNAを，特定のオリゴヌクレオ
チド配列の検出に利用することを述べている。Rankiら
は，Gene（1983）21:77−85で，オリゴヌクレオチド配
列を検出するための「サンドウィッチ」ハイブリダイゼ
ーションと呼ばれる方法について述べている。Pfeuffer
およびHelmrichは，J.of Biol.Chem.（1975）250:867−
876で，セファロース4Bへのグアノシン−５′−Ｏ−
（３−チオトリホスフェート）の結合について述べてい
る。Baumanらは，J.of Histochem.and Cytochem.（198
1）29:227−237で，蛍光剤によるRNAの３′標識につい
て述べている。PCT出願WO/8302277には，標識するため
の修飾リボヌクレオチドをDNA断片に付加すること，お
よびこのようなDNA断片を分析する方法が述べられてい
る。RenzおよびKurzは，Nucl.Acids Res.（1984）12:34
35−3444で，オリゴヌクレオチドに酵素を共有結合させ
ることについて述べている。Wallaceは,DNA Recombinan
t Technology（Woo,S.編）CRC Press,Boca Raton,Flori
daに，診断におけるプローブの利用について，総括的な
背景を与えている。ChouおよびMeriganは，N.Eng.J.of
Med.（1983）308:921−925で，放射性同位元素により標
識したプローブをCMVの検出に利用することについて述
べている。Inmanは,Method in Enzymol.34B,24（1974）
30−59で，ポリアクリルアミドへの結合方法について述
べている。他方,Parikhらは,Methods in Enzymol.34B,2
4（1974）,77−102で，アガロースとの結合反応につい
て述べている。Alweineらは，Proc.Natl.Acad.Sci.USA
（1977）74:5350−5354で，オリゴヌクレオチドをゲル
から固体支持体に移動させる方法について述べている。
Chinらは，Nucl.Acids Res.（1983）11:6513−6529で，
末端のヌクレオチドを誘導する技術について述べてい
る。Hoらは,Biochemistry（1981）20:64−67で，リン酸
により末端のヌクレオチドを誘導し，エステルを形成さ
せる技術について述べている。AshleyおよびMcDonald
は，Anal.Biochem.（1984）140:95−103で，表面に結合
した鋳型からプローブを調製する方法について報告して
いる。いくつかの技術について述べているこれらの文献
は，標識したオリゴヌクレオチドの調製に関する参照文
献としてここに採用する。
（発明の要旨） 固体支持体と，少なくとも１つの標識と，試料および
標識したプローブが関係しているハイブリダイゼーショ
ンとを用いた特定のヌクレオチド配列の検出方法が提供
される。該方法においては，二本鎖形成の有無により，
支持体と標識との間の空間的な関係を改変する能力が与
えられる。この技術の例は，標識したプローブと試料の
DNAとの二本鎖形成により，標識と支持体との間の切断
部位を与えることである。ここで，二本鎖は支持体に結
合している。次いで，該切断部位は切断されて，支持体
と標識との分離を生じる。標識の有無の検出は，従来の
技術に従って行い得る。
当該分野における本発明の第一の利点は，本発明の方
法が，標識の特異的結合と非特異的結合とを区別するこ
とを可能にすることである。従来の技術では，標識は典
型的には固体支持体上で検出される。すなわち，試料
は，支持体に固定され，標識した相補的なプローブと接
触し，次いで該支持体上で二本鎖の形成が分析される。
この方法における問題点は，標識が，分析物の非存在下
においても支持体に結合し得ることである。支持体に標
識が直接結合することを，ここでは，「非特異的」結合
と呼ぶ。この非特異的な結合が，相当量生じれば，分析
物の有無にかかわらず，標識が支持体上で検出され，誤
った陽性の結果を与える。
対照的に，本発明の方法では，標識は興味ある分析物
が存在する場合にのみ検出される。すなわち，「特異
的」結合だけが検出される。ある好ましい実施態様で
は，この方法は，試料と１つまたはそれ以上のプローブ
との間に二本鎖を形成することによって，支持体と選択
された標識との間に切断部位を導入することにより行な
われる。この切断部位は，本出願の優先権主張の基礎と
なる米国出願の親出願である米国特許出願No.06/661,50
8に述べられているように，制限エンドヌクレアーゼ切
断部位でもあり得，あるいは数多くの種類の化学的に分
解可能な部位（例えば，ジスルフィド結合，過ヨウ素酸
分解可能な1,2−ジオールなど）の１つでもある得る。
他の実施態様では，特異的に結合した標識は，鎖置換法
によって放出される。該方法では，分析物／プローブ複
合体により支持体に標識を結合させた後，分析物／プロ
ーブ複合体のある部分に相補的であり，標識した部分に
置換して，該標識した部分を放出するように選択された
DNA鎖が導入される。
核酸試料中に存在する核酸分析物の興味あるオリゴヌ
クレオチド配列の存在を検出する本発明の方法は，該核
酸試料を，ハイブリダイゼーション条件下でポリヌクレ
オチド試薬と混合する工程であって，該試料または該試
薬の成分のうちの一方が支持体に結合し，該分析物と該
ポリヌクレオチド試薬とのハイブリダイゼーションによ
って，選択可能な切断部位で該支持体に結合している標
識を与える工程；該支持体を，該支持体に結合している
標識から，該選択可能な切断部位以外により実質的に遊
離させる工程；該切断部位で切断する工程；および該支
持体から遊離した標識を検出する工程，を包含する。
核酸試料中に存在する核酸分析物の興味あるオリゴヌ
クレオチド配列の存在を検出する本発明の他の方法は，
該核酸を，ハイブリダイゼーション条件下で第１のポリ
ヌクレオチド捕獲プローブおよび第２のポリヌクレオチ
ド標識プローブと混合する工程であって，該第１および
第２のプローブが，該分析物中に存在する配列と相補的
なオリゴヌクレオチド配列を有し，該ハイブリダイゼー
ション条件下で第１および第２の二本鎖を形成し，そし
て該捕獲プローブが固体支持体に結合している工程；選
択されたポリヌクレオチド鎖の置換を導入し，該捕獲プ
ローブと，第１の二本鎖よりも安定な二本鎖を形成し，
それにより該支持体を，該支持体に結合している標識か
ら実質的に遊離させる工程；および該支持体から遊離し
た標識を検出する工程，を包含する。
（発明の構成） 特定の配列の検出はハイブリダイゼーションを用いて
行なわれる。それにより，試料DNAとプローブとの二本
鎖形成が，標識と支持体との間の空間的な関係を改変す
る能力に影響を及ぼす。このようにして，試料中におけ
る特定配列の有無は，媒体中に放出された標識量によっ
て容易に決定し得る。
主要な方法は，プロトコルおよび試薬の変更を考慮し
ており，試料の核酸は支持体に結合されるか，あるいは
溶液中に遊離した状態であり得る。ある好ましい実施態
様では，該方法は核酸の二本鎖を形成することを包含す
る。標識は選択的に切断可能な結合により支持体から分
離される。従って，選択的な切断を与える条件下で放出
された標識の量は，核酸の試料中における興味ある配列
の存在およびその量の尺度となる。選択可能な切断部位
は，ホモ二本鎖形成による制限酵素認識部位の形成の結
果であるか，あるいはこのような選択可能な部位は，該
二本鎖中にこのような部位を導入した結果であり得る。
試薬としては，核酸の分析物にハイブリダイズする興
味あるオクリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチ
ド配列を含有するものが使用される。この試薬は，ここ
では時として「捕獲プローブ」と呼ばれ，本発明の方法
では，選択された固体支持体に結合する。興味ある配列
を含むか，あるいは含まない標識プローブも使用され
る。
第１の好ましい実施態様では，主要な方法は，選択可
能な切断部位により支持体に結合した標識を与えるハイ
ブリダイゼーション媒体中におけるポリヌクレオチド二
本鎖の形成を包含する。試料DNAが支持体に結合するか
あるいは溶媒中に分散するような様々な方法が使用され
得る。
包含される様々なヌクレオチド配列を区別するため
に，以下の用語が使用され得る： 核酸試料−興味あるオリゴヌクレオチド配列を有する核
酸配列を含有すると思われる試料； 核酸の分析物−興味あるオリゴヌクレオチド配列を有す
る前記核酸試料中のDNAまたはRNA; 興味あるオリゴヌクレオチド配列−ヌクレオチド鎖の
全体または一部であり，普通少なくとも６塩基，より普
通には少なくとも約10塩基，好ましくは少なくとも約16
塩基，そして5kbまたはそれ以上でもあり得るが，通常
0.2kbを超えない,DNA配列またはRNA配列。該DNA配列ま
たはRNA配列は検出すべき特性に特徴的である。該特性
は遺伝子特性や病源体などに特徴的な遺伝子または配列
である。
ポリヌクレオチド配列−興味あるオリゴヌクレオチド
配列の検出用試薬として用いられるDNA配列またはRNA配
列。該ポリヌクレオチド配列は，標識しても標識しなく
てもよく，支持体に結合させても結合させなくてもよ
く，そして興味あるオリゴヌクレオチド配列に相補的な
配列を必らずしも含んでいるわけではない。単独で，ま
たは核酸分析物と共に，標識と支持体との間の架橋とし
て作用する１つまたは２つのポリヌクレオチド配列が存
在する。該配列は，標識と支持体との中間に，選択的に
切断可能な部位を有する；そして 選択的に切断可能な部位−選択的に切断することがで
き，そして制限酵素部位，リン酸エステル，プリン，ペ
プチド結合などを包含する１つの官能基または複数の官
能基である。
説明の便宜のために，選択可能な切断部位を生成する
本発明の好ましい実施態様は，さらに４つの主要な実施
態様に分割される。これらのうちの第１の実施態様（第
２図Ａを参照）では，使用される試薬は単一成分であ
り，一方の末端の近くで支持体に結合し，他方の末端の
近くで１つまたはそれ以上の検出可能な標識に結合した
ポリヌクレオチドである。該ポリヌクレオチドには，興
味ある配列とホモ二本鎖を形成する少なくとも４つの連
続的なヌクレオチドの領域が含まれ，このような配列は
支持体と標識との中間にある制限酵素部位を含む。
第２の実施態様（第２図Ｂを参照）の場合には，使用
される試薬は核酸試料が支持体に結合されるか，あるい
は結合されないか，および選択可能な切断部位の性質に
よって異なる２つの成分を有する。核酸試料が支持体に
結合している場合,2つの成分は，（１）架橋ポリヌクレ
オチド配列；および（２）架橋ポリヌクレオチド配列の
ある部分と相補的であり，ハイブリダイズするポリヌク
レオチド配列である。架橋または相補的なポリヌクレオ
チドのいずれかが標識され得る。架橋配列に結合した標
識の存在は，架橋および分析物ポリヌクレオチド配列の
二本鎖が選択可能な切断部位として制限酵素部位を定義
する場合に限定される。それ以外の場合には，相捕的な
配列だけが標識される。相補的な配列と二本鎖を形成す
る配列を有する以外に，架橋ポリヌクレオチド配列は，
興味あるオリゴヌクレオチド配列と二本鎖を形成する領
域を有する。
試料核酸が溶液である場合,2つの成分は，（１）支持
体に結合した第１のポリヌクレオチドであり，該ポリヌ
クレオチドは核酸分析物中に存在する配列に相補的な領
域を有し，該配列は必らずしも制限酵素部位を定義する
ものではなく，また必らずしも興味あるオリゴヌクレオ
チド配列を定義するものではない；および（２）核酸分
析物中に存在する配列に相補的な領域のような標識され
た第２のポリヌクレオチド配列であり，該領域は第１の
ポリヌクレオチド配列の領域と同じ制限を受ける。二本
鎖を形成する領域の少なくとも１つは，興味ある配列を
定義する。制限酵素部位を定義する領域の１つが存在し
ない場合，あるいは制限酵素部位の存在に加えて，第１
または第２のポリヌクレオチド配列と共に選択可能な切
断部位が存在する。
第３の場合（第２図Ｃを参照）には，分析物は支持体
に結合され，そして使用する試薬は制限酵素部位を定義
し得る興味あるオリゴヌクレオチド配列に相補的な領域
を有する標識されたポリヌクレオチド配列である単一成
分である。制限酵素部位および／または標識されたポリ
ヌクレオチド配列上に存在する官能基は選択可能な切断
部位として役に立つ。
第４の場合（第２図Ｄを参照）には，捕獲プローブが
提供される。該捕獲プローブは，結合「Ｙ」を介して固
体支持体に結合したポリヌクレオチド鎖であり，その反
対側の末端は核酸分析物中に存在する第１の配列に相補
的である。標識された第２のポリヌクレオチド鎖を含有
する標識プローブは，第１の配列とは異なり，かつ重複
しない分析物中の第２の配列に相補的な領域を有する。
第２図Ｄにおいて「Ｙ」と示された結合は，支持体にプ
ローブを結合させるあらゆる従来の手段を表わす。結合
「Ｘ」は選択可能な切断部位，すなわちジスルフィド結
合，過ヨウ素酸で切断可能な1,2−ジオールなどのよう
な化学的に切断可能な結合である。
核酸を含む試料は，二本鎖形成が相補的な配列間で起
こるような条件下で，適当な試薬と混合される。得られ
た混合物は，興味あるオリゴヌクレオチド配列に対して
少なくともヘテロ二本鎖の形成またはホモ二本鎖の形成
を起こすような所定の厳密な条件下で，ハイブリダイズ
させる。ハイブリダイゼーションが起こるのに充分な時
間の後に，支持体を上清から分離して洗浄し，少なくと
も実質的にすべての非特異的に結合した標識を遊離させ
る。次いで支持体に結合したオリゴヌクレオチドを１つ
またはそれ以上の試薬で処理すると，少なくとも一方の
鎖が切断され，支持体に結合した標識が遊離する。
二本鎖形成をもたらす試料中の特定の配列の存在に依
存して，支持体に結合した標識の遊離が観察される。通
常，標識の存在に対して上清培地を分析する様々なプロ
トコルを使用し得る。しかし，場合によっては支持体が
測定される。上清から支持体を物理的に分離することが
必らずしも必要ではないプロトコルおよび試薬を使用し
得る。
本発明の方法は，種々様々な場合におけるオリゴヌク
レオチド配列，すなわちDNAまたはRNAの検出に使用し得
る。興味ある１つの重要な分野は，特定の宿主に感染し
得る病原体，ウィルス，細菌，カビ，原生動物などの検
出である。例えば，米国特許第4,358,535号を参照され
たい。興味ある別の分野は，羊水穿刺に伴うような宿主
のゲノムに存在する対立遺伝子，差異，または障害の検
出；遺伝的カウンセリング；宿主の感受性または罹病性
の決定；および細胞集団のモニターである。興味ある第
３の分野は，転写のモニター,RNAウィルスの検出，発現
されないRNAによる生物の識別などのような理由によるR
NAの存在の決定である。興味ある他の分野は，外来染色
体DNAまたは組込まれたDNAの存在,DNA配列の増幅，この
ような配列の維持のために改変された生物をモニターす
ることを包含する。これらは，例示とすることを意図さ
れるものであるが，全体的に包含されるものではない。
生理学的な試料は，本発明の方法を用いる様々な目的
から明らかなように，種々様々な起源から得ることでき
る。起源は，種々の生理学的な流体を包含する：排泄物
（例えば，大便，痰，小便，唾液など）；血漿，血液，
血清，目の水晶体液，脊髄液，リンパ液など。試料は，
改変することなく使用するか，あるいは試料をクローニ
ングなどで増加させることにより改変し，単離を与え得
る。後者の場合には,DNAまたはRNAの全体の増幅，およ
び外来のRNAまたはDNAの減少が起こる。ウイルスは，ウ
イルスDNAの量が増加するように，適合可能な細胞の層
の上に播種することができる；臨床上の単離物は，試料
を栄養寒天培地上に塗布するかまたはスポットし，個々
のコロニーを分析するか，あるいは試料全てを液体肉汁
に導入し，細胞を選択的に，または非選択的に増加させ
ることにより得ることができる。試料を処理する特定の
方法は，試料の性質,DNAまたはRNAの起源の性質，存在
する核酸の総量に対する，存在すると予想される興味あ
るオリゴヌクレオチド配列の量，および使用されるプロ
トコルおよび標識の感度に依存する。
試料核酸または試薬ポリヌクレオチドは，共有結合的
にまたは非共有結合的に，少なくとも非拡散的に，支持
体に結合される。（第２図Ｄにより表わされる実施態様
の場合には，捕獲プローブだけが固体支持体に結合され
る）。試料核酸が支持体に結合される場合，種々の支持
体には特定の用途が見い出され，その程度までそれらの
支持体は好ましい。これらの支持体は，ニトロセルロー
スフィルター，ジアゾ紙，エクテオラ紙（ecteola pape
r），または他の支持体を包含する。他の支持体は，低
い特異的結合または非特異的結合，核酸試料の保持，操
作の簡単さ，および種々の適切な処理（例えば，生物の
増殖，洗浄，加熱，移動，および標識の検出）を許容す
るような所望の特性を与える。
ポリヌクレオチド試薬の成分が支持体に結合されると
いう範囲まで，支持体の種類は，試料オリゴヌクレオチ
ドを伴う支持体の種類にわたって非常に多種多様であ
る。支持体は，粒子，紙，プラスチックシート，容器
壁，ディバイダー，ミリポアフィルターなどを包含す
る。支持体の材質は，天然に存在する有機高分子および
合成された有機高分子の両方を包含する：多糖類，ポリ
スチレン，ポリアクリル酸，およびこれらの誘導体（例
えば，ポリアクリルアミド），ガラス，セラミック，金
属，炭素，ポリ塩化ビニル，タンパクなど。これらの種
々の材料は，共有結合または非共有結合のいずれが望ま
れるかに依存して，官能基化または非官能基化され得
る。
試料核酸が支持体に結合される場合，特定の支持体に
依存して，加熱は核酸を申し分なく結合させるのに充分
であり得る。他の場合には，ジアゾ基を核酸に結合させ
るのに使用し得る。しかしながら，ポリヌクレオチド試
薬の成分が支持体に結合される場合には，種々様々な技
術がポリヌクレオチド試薬の支持体への結合の維持を確
実にするために用いられ得る。例えば，支持体は，結合
のための活性アミノ基を有するように官能基化すること
ができる。この官能基化は，支持体へのアルキルアミ
ン，ヒドラジン，またはチオセミカルバジドの結合によ
り行なわれる。末端トランスフェラーゼを用いることに
よって，リボヌクレオチドをDNAポリヌクレオチド試薬
に付加することができる。適当な酸化剤（例えば，過ヨ
ウ素酸，過酸化水素に加えた酸化オスミウム，四酢酸鉛
など）と共にグリコール開裂を行なうと，ジアルデヒド
が形成され，次いで表面のアミノ基に結合し，一置換の
アミノ基または二置換のアミノ基を与える。あるいは，
チオホスフェートを使用するとアルキルチオエステルを
形成するマレイミド基を与えることができる。アガロー
スおよびポリアクリルアミドに対して,Parikhら（前
出）およびInman（前出）により述べられた種々の技術
を使用し得る。これらの技術は，他の材料に対しても応
用し得る。
分析培地に利用可能な支持体上のポリヌクレオチド試
薬成分の総数は，大部分が経験的に決定されるが，変更
し得る。望ましくは，ポリヌクレオチド密度がハイブリ
ダイゼーションを妨害しない限り，支持体上の利用可能
な官能基に対して，ポリヌクレオチドの単位表面積当り
に，かなりの高濃度を用い得る。
ポリヌクレオチドの大きさは，広範囲に変化し，普通
は約15塩基を下回らず,50塩基またはそれ以上であり，
普通は約500塩基を越えず，より普通には250塩基を越え
ない。通常，核酸試料中の配列と相同性を有する，ポリ
ヌクレオチド試薬成分中の領域が存在し，通常興味ある
該配列は，少なくとも６塩基，通常少なくとも12塩基を
有する。ハイブリダイゼーションのための領域は,16塩
基またはそれ以上であり，通常約1kbpを越えない。完全
な相同性は必要ではなく，少なくとも約50％，より好ま
しくは少なくとも80％の相同性があれば充分である。
（相同性の割合（％）は相補性を表すことを意図する。
ただし，環状に突出している５塩基より大きな非相補的
挿入部分は無視する。） 特に，対立遺伝子群，数多くの異なる株，または関連
のある種（mRNAやゲノム部分は良く保存されるが，それ
にもかかわらず多くの形態をとる）に興味がある場合に
は，しばしば，その相違を反映し，いかなる特定の配列
に対しても興味あるすべての配列に対する相同性を最適
化するプローブの調製が望まれる。
標識されたポリヌクレオチド試薬成分の標識は，選択
的に切断可能な部位または分析中に保持される架橋によ
り，ポリヌクレオチド配列に加えられ得る。種々様々な
標識を使用し得る。該標識は検出可能な信号または検出
可能な信号を得るための手段を提供し得る。
従って，標識は，配位子，放射性同位元素，酵素，蛍
光体，化学発光体，酵素自己不活化抑制剤，酵素共同因
子，酵素基質などの種々の置換基，あるいは直接的また
は間接的に検出可能な信号を与え得る他の置換基を包含
する。
配位子が含まれる場合には，通常，該配位子に特異的
に結合する受容体，例えばビオチンおよびアビジン,2,4
−ジニトロベンゼンおよび抗（2,4−ジニトロベンゼ
ン）IgGなどが使用される。該受容体は，上述のよう
に，適当な標識で置換される。このようにして，ポリヌ
クレオチド配列１つあたりに１個の検出可能な信号を与
える標識の数を増加させ得る。
大部分は，免疫分析法で使用するために用いられる標
識は，本発明の分析に使用し得る。これらの標識は，米
国特許第3,850,752号（酵素）；第3,853,914号（スピン
標識）；第4,160,016号（蛍光体）；第4,174,384号（蛍
光体および消光剤）；第4,160,645号（触媒）；第4,27
7,437号（化学発光体）；第4,318,707号（消光粒子）；
および第4,318,890号（酵素基質）に例示されている。
例示となる蛍光標識および化学発光標識は，フルオレ
セイン，ローダミン，ダンシル，ウンベリフェロン，ビ
リプロテイン，ルミノールなどを包含する。
例示となる興味ある酵素は，西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ，グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ，アセチルコリンエステラーゼ，β−ガラクトシダー
ゼ，α−アミラーゼ，ウリカーゼ，マレートデヒドロゲ
ナーゼなどを包含する。すなわち，興味ある酵素は，主
に加水分解酵素および酸化還元酵素である。
標識をポリヌクレオチド配列に結合させる方法は，該
標識の性質に依存して，広範囲に変化する。すでに指摘
したように，リボヌクレオチドは，オリゴヌクレオチド
配列に付加され，切断され，そして得られたジアルデヒ
ドはアミノ基またはヒドラジン基に結合される。この結
合の永続性は，アルキルアミンの形成をもたらす還元条
件を用いるとにより，さらに向上する。あるいは，これ
ら標識は，α−ブロモまたはα−クロロアセチルのよう
な活性ハロゲンと置換され得る。活性ハロゲンは，チオ
リン酸基またはチオプリンに結合され，チオエーテルを
形成する。あるいは，これら標識はマレイミド官能性を
有し得る。この場合，ポリヌクレオチド上に存在するメ
ルカプト基はチオエーテルを形成する。ポリヌクレオチ
ドの末端リン酸は，カルボジイミドで活性化され得る。
この場合，得られたホスホイミダゾリドは，アミノ基ま
たはアルコールと反応し，ホスホアミデートまたはホス
フェートエステルとなる。ポリペプチド結合は，アミノ
修飾されたプリンに形成され得る。このように，標識の
選択，結合の方法，および結合基の選択には，大きな自
由度がある。
ポリヌクレオチド試薬を試料と結合させることによ
り，存在する核酸分析物は支持体と結合するようにな
る。選択的に切断可能な部位における切断により支持体
から放出される標識の量は，分析物の存在に関係し，該
分析物の量は定量的に決定され得る。
標識と支持体との間の空間的な関係の改変は，数多く
の方法で達成され得る。指摘したように，プローブおよ
び同じポリヌクレオチドに共通する少なくとも１つの認
識部位が存在し得る。該部位は制限酵素で切断され，従
って，支持体からプローブが放出される。種々様々な制
限酵素は,4塩基,6塩基，または８塩基の認識部位を検出
するに利用可能である。認識部位における，または認識
部位から離れた箇所における切断は，平滑末端または付
着末端を与え得る。このようにして，認識部位の二本鎖
形成は，標識の放出を伴って二本鎖が開裂する機会を与
える。
選択的に切断可能な部位の性質は，必ずしも結合基に
依存しない。制限部位を含む場合，試薬成分に含まれる
結合は，分析条件下で安定であることだけが必要であ
る。制限部位を含まない場合，部位は支持体から標識を
分離させる結合を含む。
無秩序な加水分解が支持体から標識を分離するホスホ
ジエステラーゼを使用し得る。ポリヌクレオチドは，引
き続いて標識されるか，または標識され得る改変ヌクレ
オチドに連結され得る。
ヌクレオチドが標識の結合に対して改変されるか，ま
たは改変されない種々様々な結合基を使用し得る。WO83
/02277には,8−アミノアルキルアデノシンの使用が報告
されている。この場合，標識はアミノ基に結合し得る。
次いで,DNAポリヌクレオチド試薬は，複数の標識が各標
識されたポリヌクレオチドの末端に存在するように，リ
ボヌクレオチドを連結し得る。連結されたリボヌクレオ
チドは,RNaseを使用して選択的に切断され得る。これ
は，信号を改変するような相互作用をする標識を使用す
る場合に，特に有利である。例えば，極めて接近した蛍
光体は自己消光する傾向がある。観察される蛍光体信号
は，リン酸結合の加水分解によって非常に促進されるの
で，個々の蛍光体分子は溶液中に無秩序に存在する。も
ちろん，蛍光体はこの現象を示す唯一の標識である必要
はなく，他の標識体も同様の効果を示し得る。酵素基質
または共同因子を用いる場合には，支持体に結合するポ
リマー上に，それらが存在することにより，酵素の接近
に伴う実質的な立体障害が起こる。従って，標識体の解
重合および支持体からの放出は酵素反応速度を実質的に
増大させる。
別の技術は,DNAポリヌクレオチド試薬にリボヌクレオ
チドを付加し，次いでリボース部分を解裂させて，ジア
ルデヒドを生成させることである。（例えば,Leeら，Bi
ochemistry（1979）９:113−118を参照されたい）。ジ
アルデヒドは，選択的に切断可能な部位により標識に結
合するアミノ基に連結され得る。例えば，ジスルフィド
結合は，シッフ塩基と，還元により切断される標識との
間に存在し，エルマン試薬などにより標識を放出し得
る。制限エンドヌクレアーゼを用いて標識を放出させる
場合には，ジアルデヒドは，還元アミノ化条件下でアミ
ノ官能基と結合し得る。タンパク（例えば，酵素の）の
ような種々のアミノ源，フィコビリプロテイン蛍光体，
免疫グロブリンやアビジンのような受容体，またはタン
パク標識を使用し得る。
別の結合方法は，カルボジイミドを用いて末端のリン
酸を活性化し，ホスホイミダゾリドを形成することを包
含する（Chuら,Nucleic Acids Res.（1983）11:6513−6
628）。ホスホイミダゾリドは，アミンと反応して，ホ
スホアミデートを形成する。前述のように，アミノ結合
基は，選択可能な切断部位を適当に含む。該部位は，ピ
ロホスファターゼにより開裂し得るピロホスフェートジ
エステル，ペプチダーゼにより開裂し得る短いポリペプ
チド，光感性官能基（例えば，アゾ，ペルオキシなど）
であり得る。
標識を付着する別の方法は,12原子のアミンリンカー
アームを含むシトシンまたはウラシルのような改変可能
なヌクレオチド誘導体を用いたポリヌクレオチドの化学
合成を包含する。該化学合成の後には，フルオレセンま
たはジニトロベンゼンのようなリポータ基の導入が行わ
れる（Ruth,DNA（1984）3:123）。
検出可能な信号を直接与えないが,1つまたはそれ以上
の標識と複合体を形成するリポータに結合するような配
位子で置換されたヌクレオチドを使用し得る。具体例と
しては，アビジンに結合するビオチニル化ヌクレオチ
ド，免疫グロブリンに結合するハプテン，およびタンパ
ク受容体（例えば，レクチンを伴った糖，細胞表面の膜
タンパクを伴ったホルモンおよび成長因子など）に結合
する種々の天然に存在する化合物が挙げられる。
第２図Ｄにより表される実施態様では，選択可能な切
断部位は,2つの方法のうちの一方で導入される。
まず，架橋化合物は，捕獲プローブ１それ自身，すな
わち図中に示されている「Ｘ」の位置に取り込まれる。
いかなる数の架橋剤も，この目的のために使用される。
唯一の制限は，該捕獲プローブ中に導入された切断部位
が，この方法の残りの部分で使用される種々のプロー
ブ，標識などと適合する試薬を用いて開裂しなければな
らないことである。適切な架橋剤の例を以下に示す： プローブ中にアミド結合を導入するＮ−ヒドロキシス
クシンイミド（NHS）；ヒドロキシルアミン感受性架橋
を形成するエチレングリコール ビス（スクシンイミジ
ルスクシネート）（EGS）；塩基感受性スルホン架橋を
与えるビス〔２−スクシンイミド−オキシカルボニルオ
キシ）エチル〕スルホン（BSOCOES）；過ヨウ素酸によ
り開裂し得る1,2−ジオールを導入するジスクシンイミ
ジルタルタレート（DST）；そしてチオールで開裂可能
なジスルフィド結合を与えるジチオビス（スクシンイミ
ジルプロピオン酸）（DSP）である。架橋剤は，好まし
くは以下の方法によって捕獲プローブ中に導入される：
アルキレンアミンプローブの調製（Urdeaら，Nucleic A
cids Research 16（11）:4937−4956（1988））；
（２）プローブ結合架橋剤を与える，選択された架橋剤
によるプローブ上の遊離アミン官能基の反応；（３）ク
ロマトグラフィーまたは他の方法を用いたプローブ結合
架橋剤の精製；そして（４）所望の切断部位を有する支
持体結合プローブを与える，プローブ結合架橋剤の，遊
離反応部分（例えば，遊離アミン基）を有する固定支持
体との反応。
それ故，切断部位は，例えば次の結合の型を包含し得
る： −Ｓ−Ｓ（チオール感受性）；および 第２図Ｄにおける選択可能な切断部位「Ｘ」はまた，
固体支持体への結合の前に，捕獲プローブの適当な改変
により導入され得る。この方法は，次の構造を有するポ
リヌクレオチドの調製を含有する： ここで,Xは，上記の選択可能な切断部位であるか，あ
るいはこれらの切断部位を含む。特に好適な実施態様で
は，ポリヌクレオチドは次の構造を有する： 次いで，この化合物は，当該分野でよく知られた従来
の方法を用いて固体支持体に付着され，第２図Ｄに示さ
れた捕獲プローブを与える。後者の化合物は，酒石酸か
ら誘導された試薬を用いて調製される。この場合,1,2−
ジオール系は,DNAの合成の間にジベンゾイル化合物とし
て保護され，さらにジメトキシトリチル（DMT）で保護
された水酸基と，ホスホアミダイト由来の水酸基（ここ
で，「iPr」はイソプロピルを表す）とを含んでいる。
これらの水酸基は標準的なホスホアミダイト法用いて
DNA断片に結合される。合成および完全な脱保護化の後,
DNA/DNAハイブリッドは，上記のように,1,2−ジオー
ル，すなわちNaIO4で特異的に開裂され得る結合を含ん
でいる。当業者により容易に認められているように,DMT
保護基は，酸感受性でありかつ塩基安定性であるような
適当な部分R1（例えば，非置換または置換のアリール基
またはアルキル基）で置換され得る。ここで，アルキル
基は，例えばフェニル，ナフチル，フラニル，ビフェニ
ルなどであり，これらの置換基は０〜３個，通常は０〜
２個である。R1は，非干渉の安定な基（中性または極性
の基，電子供与性または電子吸引性の基）を含有する。
同様に，ホスホアミダイト部分は，ポリヌクレオチド合
成に適したリン誘導体（例えば，ホスホトリエステル，
ホスホジエステル，ホスファイト,H−ホスホネート，ホ
スホロチオエートなど）を包含する別の種のR2,あるい
はハロゲンで置換され得る。例えば，特開昭62−188970
号（Urdaeら，「溶液相核酸サイドウィッチ分析および
該分析に有用なポリヌクレオチドプローブ」）を参照さ
れたい。
第２図Ａ〜Ｃによって示された実施態様におけるよう
に，第２図Ｄの実施態様は，溶液中の特異的結合標識の
検出（および，分析物２の正確な測定）を可能にする。
この場合，非特異的結合標識６は固体支持体５に結合し
たままである。
第３図ＡおよびＢによって示された本発明の他の実施
態様では，捕獲プローブ１（結合Ｙにより固体支持体５
に結合している）と，核酸分析物２と，標識プローブ３
との間で，複合体が，第２図の実施態様におけるよう
に，形成される。このハイブリッド複合体を得る方法
は，上で引用した特開昭62−188970号にさらに詳細に記
載されている。特異的に結合した標識を溶液中へ放出さ
せるために，「置換」ポリヌクレオチド鎖４が導入さ
れ，分析物と捕獲プローブとが形成するハイブリッドよ
りも安定なハイブリッドを捕獲プローブ１と形成するよ
うに選択される。G/C含量もまた,1つの要素であるが，
この方法では，典型的に，置換鎖の長さ「Ｂ」が捕獲プ
ローブと分析物との間で形成された二本鎖の長さ「Ａ」
よりも若干長いことが必要である。
オリゴヌクレオチド鎖の非拡散性結合のための種々様
々な支持体および技術は文献に報告されている。総説と
しては,MeinkothおよびWahlのAnal.Biochem.（1984）13
8:267−284を参照されたい。80℃の温度で２時間加温す
るだけで充分な支持体には，ニトロセルロースフィルタ
があり，さらに活性化を行わなくても結合が起こる支持
体にはジアゾ紙があり，その他の支持体にはエクテオラ
紙などがある。アガロースビーズは,DNAとの直接反応の
ために臭化シアンで活性化され得る（Baumanら，J.Hist
ochem,Cytochem.（1981）29:227−237）あるいは，ポリ
ヌクレオチド鎖に存在するチオール官能基と反応し得る
ビーズを提供するために，臭化シアンおよびジアミンと
反応させ，次いでα−ハロアセチル（例えば，ブロモア
セチル）と，または活性カルボキシル置換オレフィン
（例えば，無水マレイン酸）と，反応させ得る。例え
ば,DNAは，改変して，結合のためのα−チオホスフェー
トを形成し得る（PfeufferおよびHilmreich,J.Biol.Che
m.（1975）250:867−876）。化学的手段によって，テフ
ロン支持体に結合したオリゴヌクレオチドを合成し，次
いでそれを除去することなく，該物品を充分に脱保護化
することも可能である（Lohrmannら，DNA（1984）４:12
2）。
標識および試薬の多種多様性を考慮して，本発明の方
法における共通の局面が述べられ，次いで2,3の例示的
なプロトコルが述べられている。これらの手順に共通す
る部分はハイブリダイゼーションである。ハイブリダイ
ゼーションは，様々な程度の厳密さで実行され得る。従
って，より高いあるいはより低い相同性が二本鎖の形成
に必要とされる。大部分の場合，水溶性媒体が用いら
れ，それは様々な他の成分の混合物を有し得る。特に，
有機極性溶媒は厳密さを高めるために用いられる。溶媒
の例としては，ジメチルホルムアミド，ジメチルアセト
アミド，ジメチルスルホキシドなどが挙げられる。すな
わち，使用量では，水と混和し得る有機溶媒が用いられ
る。厳密さはまた，塩濃度を増大することによっても高
められ，大きなイオン強度が得られる。また，温度を上
昇させることも，厳密に使用され得る。各場合には，逆
のことを行えば，厳密さは減少する。他の添加剤（例え
ば，界面活性剤）もまた，厳密さを限定するために使用
され得る。
ハイブリダイゼーションの時間は，興味ある配列の濃
度，厳密さ，相補配列の長さなどにより様々である。通
常，ハイブリダイゼーションは，少なくとも約15分，一
般的には約72時間またはそれ比内，より普通には約24時
間またはそれ以内で行われる。さらに，ある厳密さでハ
イブリダイゼーションを行い，次いでより高い厳密さで
洗浄することにより，充分な相同性を欠くヘテロ二本鎖
が除去される。
核酸試料は，様々な方法で処理される。この場合，完
全なゲノム，機械的に剪断されるか，または制限酵素で
分解された0.5kb〜30kbの様々なサイズのゲノム断片，
あるいは例えば電気泳動によりサイズで分離された断片
を使用し得る。場合によっては，興味ある配列は，例え
ば一本鎖DNAまたはRNAウイルス（例えば,M13）のような
適当なベクター内でクローン化された配列である。
分析媒体中に含有されるのは，緩衝液，界面活性剤
（例えば,SDS）フィコール，ポリビニルピロリドンを包
含する他の添加剤と，外来DNAであり，それらは非特異
的結合を最小にする。これらの添加剤のすべては，文献
中に例が挙げられているので，ここでは詳しく述べる必
要はない。
特定のプロトコルに従って，試料核酸およびポリヌク
レオチド試薬は，所定の厳密さのハイブリダイゼーショ
ン媒体中で混合される。充分な時間にわたってハイブリ
ダイゼーションを行った後，支持体は，ハイブリダイゼ
ーション媒体よりも厳しいあるいは緩やかな厳密さの媒
体で，少なくとも１度洗浄される。結合したポリヌクレ
オチドおよび分析物を有する支持体は，次いで選択可能
な切断部位を切断するために必要な反応物（物理的処
理，例えば光を包含する）と接触させ，一本鎖または二
本鎖の開裂を行なう。大部分の場合，加水分解酵素（例
えば，制限エンドヌクレアーゼ，ホスホジエステラー
ゼ，ピロホスファターゼ，ペプチダーゼ，エステラーゼ
など）が使用される。しかし，還元剤，エルマン試薬，
または光のような他の試薬にも有用性が見られる。切断
後，標識および測定方法に依存して，支持体および上清
は必ずしも分離されず，該支持体から放出された標識の
量が測定される。
さらに本発明を例示するために,2,3の例示的なプロト
コルが述べられる。第１の例示的なプロトコルでは，マ
イクロタイタープレートが使用される。この場合，蛍光
標識されたポリヌクレオチドは，各ウェルの底に結合す
る。クローン化されている病原体由来のDNAは，約0.5kb
〜2kbの断片を与えるために,1つまたはそれ以上の制限
酵素で制限される。断片は，変性させるための緩やかな
塩基性の条件下で単離され，ハイブリダイゼーション媒
体中に分散される。次いで，これら断片は，様々なウェ
ルに順番に加えられる。各ウェルは，様々な配列を有し
ており，これらの配列は，特定の病原体種の様々な株の
配列と特異的な相同性を有する。
これらのウェルは，高温（例えば,60℃）で，ハイブ
リダイゼーションが起こるのに充分な時間にわたって保
持される。その後，上清は除去され，ウェルはハイブリ
ダイゼーション媒体よりも低い厳密さの緩衝化媒体で繰
り返し充分に洗浄される。二本鎖を形成することにより
すべての株に共通する制限酵素の認識部位が得られる。
次いで，各ウェルには，二本鎖DNAを分解するための制
限酵素媒体が添加され，分解の結果，蛍光標識は上清中
に放出される。上清は，各ウェルから吸い出され，照射
される。次いで，蛍光の量は，興味ある配列の存在の指
標として測定される。このようにして，液相中の蛍光の
存在を観察することによって，株が存在するものを迅速
にスクリーニングし得る。
第２の例示的なプロトコルでは，標識されていないポ
リヌクレオチドが結合したガラスビーズを含むカラムを
使用する。次いで，このカラムに，哺乳動物細胞から得
られたDNA断片を含有する試料核酸を加える。これらの
断片は約0.5kb〜10kbまでの範囲に及ぶ。DNA試料は，適
当なハイブリダイゼーション媒体中に分散され，そして
カラムに加えられ，ハイブリダイゼーションが起こるの
に充分な時間にわたってカラム中に保持される。試料の
ハイブリダイゼーションの後，ハイブリダイゼーション
媒体は，カラムから放出され，ジスルフィド結合により
西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）で標識されたポリ
ヌクレオチド試薬は，第１の媒体よりも厳密な条件下
で，第２のハイブリダイゼーション媒体中に加えられ
る。第２の媒体は，ハイブリダイゼーションが起こるの
に充分な時間にわたってカラム中に保持される。標識さ
れたポリヌクレオチドは，興味ある配列に相補的な配列
を有する。ハイブリダイゼーション媒体はカラムから減
圧により除去される。
標識されたポリヌクレオチドと不充分な相同性しか有
さないポリヌクレオチド配列を除去するために，カラム
はより高い厳密さの溶液で,1度またはそれ以上，洗浄さ
れ得る。次いで，エルマン試薬がカラムに加えられ，ジ
スルフィド結合が切断され，そしてHRPが放出される。
このHRPを含んでいる溶液は，カラムから減圧により除
去され，集められる。さらに，遊離の酵素がカラム中に
保持されないことを確実にするために，洗浄を行なう。
得られたHRP標識含有溶液は，ここでHRP標識について分
析される。HRPに代えて，種々様々な他の酵素が使用さ
れ得る。これらの酵素は，分光光度または蛍光光度によ
り検出可能な生成物を与える。
第３の方法においては，核酸のサンプルをフィルター
に吸収させ,80℃２時間加熱することにより，ニトロセ
ルロースフィルターの一方の端に非拡散的に結合させ
る。フィルターを洗浄し，それからハイブリダイゼーシ
ョン条件下の下で，アルキルカルボキシ置換アデニンに
エステル結合したウンベリフェロンで標識したポリヌク
レオチドのハイブリダイゼーション溶液に添加する。標
識したポリヌクレオチドは，目的の塩基配列に相補性の
ある配列を有する。充分な時間でハイブリダイゼーショ
ンを行った後，フィルターをハイブリダイゼーション溶
液から取り出し，非特異的に結合した核酸を除くために
洗浄し，そして，計量したエステラーゼ溶液中に浸す。
螢光量の増加の割合を核酸サンプル中における分析物の
量として測定し，モニターする。
また別の方法においては，プラスチック材料製のディ
ップスティック（dipstick）が用いられる。このディッ
プスティックにおいては，該ストリップ（末端に螢光物
質を有し，分析物の配列に相補性のある，標識ポリヌク
レオチド配列を有する）を支持するホルダーが用いられ
得る。核酸サンプルは適当なハイブリダイゼーション媒
質内で調製されディップスティックが導入され，そし
て，ハイブリダイゼーションが行われる。十分な時間で
ハイブリダイゼーションを行った後，ディップスティッ
クを除き，全ての非特異的結合ポリヌクレオチドを除く
ために洗浄する。目的とするポリヌクレオチド配列の存
在により，制限酵素認識部位が形成され，そして，ディ
ップスティックが制限酵素反応混合物に入れられ，分解
が行われる。充分な時間分解した後，ディップスティッ
クを除き，充分に洗浄し，溶液の螢光量を測定する。ベ
ースラインを上回る螢光量は，分析物の存在を示す。
また別の方法においては，ポリヌクレオチド試薬成分
は，核酸分析物のある領域に相補性のある配列を持ち，
かつ，マイクロタイタープレートのウェルの壁に結合す
る第１のポリヌクレオチド；および核酸分析物の別の領
域に相補性のある第２の標識ポリヌクレオチドである。
標識は,N8−アミノヘキシルデオキシアデノシントリホ
スフェート ウンベリフェリカルボキシアミドでポリヌ
クレオチドの尾部分に行なう。核酸サンプルをハイブリ
ダイゼーション条件下で，過剰の標識ポリヌクレオチド
の入ったウェルの中に導入する。充分な時間でハイブリ
ダイゼーションを行った後，ハイブリダイゼーション溶
液をウェルからアスピレーターで取り除き，ウェルを洗
浄し，ウェル内に残ったDNAを脱プリン化する。この脱
プリン化は,90％ギ酸を加え,60℃にて時間加熱するか，
あるいはピペリジンを加え90℃にて30分間加熱すること
により行われる。
あるいは，標識を，螢光物質N6−：エテノアデノシン
をつくるSilverおよびFeishの方法（Biochemistry（198
2）21:6066）によりポリdAをクロロアセトアルデヒド処
理することによって得られるオリゴマーの過剰量で標識
したポリヌクレオチドを連結させることにより行なう。
標識の除去は，ミクロコッカスのヌクレアーゼを用い
て,100μgM CaCl2中で37℃にて１時間にわたり行なうこ
とにより達成される。
両方の場合において，ポリマーの螢光は自己消光のた
めに実質的に減少する。溶解により，螢光量の実質的な
増加が見られる。このように，脱重合化抵抗性を示す非
特異的結合標識ポリヌクレオチドは，検出可能なシグナ
ルの妨げとはならない。さらに，核酸分析物を定量する
ために螢光量増加の割合を測定することができる。なぜ
なら，バックグラウンドの螢光レベルは弱いからであ
る。自己消光の代わりに，螢光物質と消光物質のどちら
か，あるいは，その両方の成分の試薬系を用いることも
可能である。このような系においては,1つの成分中には
非消光螢光物質が存在し，消光物質は，もう一方の成分
中に存在する。
次の実施例は，本発明を説明するものであり，制限す
るものではない。
実施例 I.リボヌクレオチドのDNAの３′末端への結合 a.ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェナーゼ
（TdT）による尾部伸長 次に述べるのは,R.Roychoudry,Method in Enzymology
（1980）65:43の方法に修正を加えたものである。合成
したATTCGACGCTTATGG（５′→３′）である断片１の末
端にrATPを付加した。15μの0.83mM ATP,および2.5μ
の10×TdT緩衝液（1.4Mカコジル酸カリウム,0.6Mトリ
スpH7.6,10mM CoCl2,1mMジチオトレイトール（DTT））
の溶液中の4005ピコモル（20 OD260単位を1mgとする）
の断片１に,2μのTdT（仔ウシの胸腺由来,P−L Bioch
emicals,Inc.:13.5単位）を加える。24.5μのサンプ
ルを,37℃で１時間放置後，エバポレーションにより乾
燥させた。ペレットを10μの90％ホルムアミド,0.05
％ブロモフェノールブルー,1％フィコールに溶解させ,9
0℃にて５分間加温した。次に,20％の変性ポリアクリル
アミドゲル上にのせ,40ミリアンペアで流した。
リボアデノシン１単位によって伸長させた断片１に相
当するバンドをU.V.照射によって確認し，ゲルから切り
出し,0.1Mトリス,pH8.0,5mM EDTA,0.5M NaCl中に１晩か
けて溶出させた。（Maxam and Gilbert,Methods in Enz
ymology（1980）65:499−560）。Ｃ−10 SEP−PAK（Wat
ers Associates）による脱塩は次のようにして行った。
まず，カートリッジを5mlの試薬グレードのメタノール
で，次いで10mlの蒸留水で洗浄した。次に，濾過いたサ
ンプルをSEP−PAKに注射器で注入した。20mlの水で洗浄
後,DNAを3mlの酢酸トリエチルアミン（pH7.3）：メタノ
ール（体積比1:1）で溶出させた。次に，エバポレーシ
ョンにより乾燥させた（収率約80％）。
b.T4リガーゼによるライゲーション（連結） 次に述べられている方法は,3′末端にリボアデノシン
を含む137ベースの断片を合成するのに用いられた。上
記にて合成された断片１は，共通に適合し得るアダプタ
ーとして，ライゲーションにより，末端にリボヌクレオ
チドのついたDNA配列を合成するのに用いられる。
断片２ AGTTGGCAGTACAGCCTAGCAGCCATGGAAACGATGTATATTTCCGCGAG
AGGACGACAG 断片３ GGTCGTCCGCGGGATTCAGCGCCGACGGGACGTAAACAAAGGACGTCCCG
CGAAGGATCC 断片４ TTCCATGGCTGCTAGGCTGTACTGCCAACTGGATCCTTCGCGGGACGTCC
TTTGTTTACG 断片５ AATTCTGTCGTCCTCTCGCG 断片６ CCATAAGCGTCG 特に指示のない限り，上に示した塩基配列の５′およ
び３′末端は水酸基である。これらの配列は，次のよう
に連結され得る。
断片２を,T4ポリヌクレオチドキナーゼにより，リン
酸化した。あらかじめエバポレートして乾燥した900ピ
コモルの断片に,2μの10×KB−TS（500mMトリス,100m
M MgCl2,10μg/mlスペルミジン）と,2μの10mM ATP
と,2μの10mM DTTと,1μ（８ユニット）のT4キナー
ゼ（New England Nuclear）と,13μの水とを加えた。
37℃で30分間保温した後，さらに８ユニットのT4キナー
ゼを加えた。さらに37℃にて30分間保温した後，同様の
方法によりすでに５′位をリン酸化した45μ（990ピ
コモル）の断片１を加えた。22μの2M酢酸ナトリウム
と８μの250Mm EDTAとを加えた後,T4キナーゼを不活
性化させるために，溶液を65℃で５分間加熱した。次
に，断片３〜６を加えた（それぞれ2.6μ,902ピコモ
ル;8μ,1008ピコモル;32μ,1003ピコモル45μ,93
6ピコモル）。この溶液をボルテックスにかけ,680μ
の冷エタノールを加え，−80℃に20分間放置する。次に
ペレットを12800rpmで10分間遠心分離し，上澄みをゆっ
くり捨て，冷エタノールで２回洗浄し，乾燥させる。
これらのものをアニールさせるため,18μの水を加
え，加熱を行ってペレットを溶かした。加熱を行った混
合物の加熱は沸騰水浴中で行い，室温までゆっくりと冷
却した（約10分間）。ここで,3μの10×KB−TSと,3μ
の10mM ATPと,3μとT4リカーゼ（New England Biol
abs;40000単位/ml）とを加えた。14℃で30分間放置した
後，溶液を乾燥させ，（断片１について上述したよう
に）10％の変性ポリアクリルアミドゲルで精製した（収
量：約75ピコモル）。
c.2′−ニトロベンジルウリジン コントロールポアガ
ラス支持体上でのDNAの合成 コントロールポアガラスの５′−ジメトキシトリチル
２′−ニトロベンジンウリジン誘導体（長鎖アルキルア
ミノ；はPierce Chemical Company）は,Gougら，Tetrah
edron Lett.（1981）22:4177の方法により,Cruachem,Be
nd Oregonにより調製された。オリゴヌクレオチドの合
成は，自動合成装置（Warnerら，DNA,3印刷中）により
行った。
２′−ニトロベンジル官能基は,2100ワットの水銀ラ
ンプを使用したこと以外は,Ontsukaら，Nucleic Acids
Res（1974）1:1351に記載されたようにしてUV照射によ
り取除した。全てのサンプル（約14.5μモルの２′−ニ
トロベンジルウリジン）について,5分間の照射は，パイ
レックスのキュベットで行った。
この方法により,5′TTCCATGGCTGCTAGGCTGTACTGCCAACT
GGATCCTTCGCGGGACGTCCTTTGTTTACGrU3′に相当する配列
（断片７）を合成し，下記に述べられている結合に用い
た。
II.DNA3′末端の固体支持体への結合 a.チオセミカルバジド コントロールポアグラス（TSC
−CPG）の合成 イソチオシアネート コントロールポアグラス（Pier
ce Chemical）をヒドラジンにより次のように修飾し，
チオセミカルバジド誘導体を生成させた。400mgのイソ
チアシアネートCPGを50mlの丸底フラスコに入れた。25m
lのジメチルスルホキシド,200μの蒸留ピリジンと，
ジメチルスルホキシド中に溶解させた0.6％のヒドラジ
ン500μを加えた（例えば,J.Baumanら，J.Histochem.
and Cytochem.（1981）29:227を参照されたい）。時お
り撹拌しながら暗所で18時間放置した後，ジメチルスル
ホキシド，ピリジンおよびメタノールのそれぞれ50μ
ずつ，そして,0.01M,pH7.5のトリス２で洗浄した。
b.固体支持体への断片７の結合 約2000ピコモルの断片７をエバポレーションにより水
を除去して乾燥させた。これに,100μCiのγ32P−ATP
（New England Nuclear）と,2μの10×KB（0.5Mトリ
ス酢酸pH7.8,100mM MgCl2,100mM DDT）と,1μ（８ユ
ニット）のT4キナーゼ（New England Nuclear）とを加
えた。37℃で30分間保温したあと，その溶液をゲル抽出
緩衝液で1mlに稀釈し，上述のように,SEP−PAK脱塩を行
った。断片７（20μ,982ピコモル）に,0.01Mトリス塩
酸（pH8.0）中の1mM過ヨウ素酸ナトリウム（Sigma）20
μを加え，暗所で０度にて１時間保持した。これに,
0.1M酢酸ナトリウム（pH5.6）100μ中のTSC−CPG 10m
gを加え，混合物を暗所で０℃にて１時間保持し,4℃に
て一夜放置した。
残存するチオセミカルバジト官能基をブロックするた
めに，過ヨウ素酸で酸化したATPが用いられた。100mM A
TPの20μのサンプルを,100μの0.01Mトリス酢酸（p
H8.0）中の20mgの過ヨウ素酸により処理した。暗所で１
時間放置した後，この溶液45μを,0.1M酢酸ナトリウ
ム150μ中の断片７−TSC−CPG10mgに加えた。４℃で
６時間放置後，この支持体を４×標準クエン酸ナトリウ
ム（SSC）溶液で充分に洗浄した。
取り込まれたカント数に基づくと，断片７の13％（12
8ピコモル）が，ガラス支持体に結合した。
III.DNAの５′末端の固体支持体への結合 a.ブロモアセチル コントロールポアガラス（BA−CP
G）の調製 Ｏ−ブロモアセチル N−ヒドロキシスクシイミドの合
成は,Cuatreacasas,J.Biol.Chem.（1974）245:3059の方
法にほぼ基づいて行った。
347mgの臭化酢酸と,345mgのＮ−ヒドロキシスクシイ
ミド（Sigma）との混合物を,20μの蒸留ジオキサン中
での混合物を調製した。この混合物に,532mgのジシクロ
ヘキシルカルボジイミドを加えた。室温で70分間振とう
した後，混濁した溶液をグラスウールにより濾過した。
500mgの長鎖アルカリアミノ コントロールポアガラ
ス（Pierce Chemical;0.1meq/g）に,10mlの0.10M酢酸ナ
トリウム（pH7.6）を加えた。このスラリーを氷上に置
き,O−ブロモアシル N−ヒドロキシスクシイミド溶液を
ゆっくりと加えた。30分間，時おり撹拌した後,BA−CPG
を５の0.1M NaClで洗浄した。
支持体上の臭化酢酸の当量数は,5′,5′−ジチオビス
（２−ニトロ安息香酸）（DTNB）テスト（Butterworth
ら，Arch.Biol.Biophysl.（1967）118:716）の方法によ
り決定した。50mlの水に溶解させた200mgのDTNBと,100m
lの水に溶解させた２−メルカプトエチルアミン114mgと
を含有するストック溶液を調製した。BA−CPG（10mg）
を,10μの２−メルカプトエチルアミン溶液に0.05Mの
リン酸ナトリウム500μ（ph8.0）を加えたものと,10
分間室温で反応させた。次に，その溶液を100μのDTN
Bにより試験し可視スペクトルで記録した（Ｅ＝1.36×1
04mol-1cm-1,pH8）。BA−CPGなしで２−メルカプトエチ
ルアミンを用いたものをコントロールとした。BA−CPG
処理によって失われた２−メルカフトエチルアミンの量
から,BA−CPGが10mモル/mgの臭化酢酸を含んでいること
が決定された。
b.DNA5′末端のBA−CPGへの結合 10μ（333ピコモル）の断片３（上記参照）に,10μ
の３−35S−ATP（アデノシン５′−Ｏ−（３−チオト
リリン酸;0.25mCi,New England Nuclear））と,2〜５μ
の10×KBと,1μ（８ユニット）のT4ポリヌクレオチ
ドキナーゼを加えた。37℃で30分間保温し,1μの50mM
3−Ｓ−ATP（リチウム塩,P.−L.Biochemicals），およ
び１μ（8U）のT4キナーゼを添加した。さらに37℃で
30分間保温し，断片を上述したようにゲルにより分離し
た。（収量:266ピコモル）。サンプルをBeckman LS7000
液体シンチレーションカウンターAtomlite（New Englan
d Nuclear）によりカウントした。
BA−CPGの5mgのサンプルを水により３回,0.10M,pH7.6
のリン酸ナトリウム溶液で２回遠心分離にかけることに
より洗浄した。５′−チオリン酸断片２を100μのリ
ン酸緩衝液に溶かし，洗浄したBA−CPGに加えた。スラ
リーは，ロータリーエバポレーターを回転させることに
より２時間室温で撹拌した。溶液はデカンテーションに
より廃棄した。残留する臭化酢酸官能基をブロックする
ため，支持体を200μの50mMリン酸ナトリウム（pH8.
0）と,50μの２−メルカプトエタノールとによってさ
らに２時間処理した。続いて，溶液のデカンテーション
を行い，支持体を４×SSCにより充分に洗浄した（収量:
CPG 1mg当たり約10ピコモル）。
IV.西洋ワサビペルオキシダーゼ−DNA複合体の合成 a. Elutipによる精製 西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）（2mg;タイプVI,
Sigma;10,000U/38mg）を,0.5mlの0.1Mリン酸ナトリウム
緩衝液（PH7.5）に溶解させた。Ｏ−ブロモアセチルＮ
−ヒドロキシスクシイミド（15μ）を上記溶液に加
え，室温で30分間反応させた。この溶液を,30mlの0.1M
リン酸ナトリウム（PH7.5）であらかじめ平衡化したPD
−10 SephadexG−25カラム（ファルマシア）に通した。
褐色のフラクション（１〜1.2ml）を集めた。あらかじ
め３′−35S−ATPで上述のように５′位をチオリン酸化
し，乾燥させた（30ピコモル）断片８（５′−GGTATTGT
TGAACAATGTTGTACTTCTATTTG−３′）を，リン酸緩衝液50
μ中に入れた。このチオリン酸化断片８溶液に，分画
したHRPを加え，混合物を室温に30分放置した。この混
合物をElutip−ｄ（Schleicher and Schuell）カラムに
通した。ペルオキシダーゼ−DNA複合体はボイド体積に
流出する（20％のカウントを回収した。５′位を32P−
リン酸で標識した断片８を用いて対照実験を行なうと，
これらの条件下で0.5％を下まわるカウントが溶出した b. ゲルによる分離 断片９（５′−TTGAAGAACTACGGTTTGTTGTCTTGTTTCAGAA
AGGACTTGCACAAGACCCAAACC−３′）のペルオキシダーゼ
複合体は，前述のように調製した。ただし,360pmoleの
ブロモアセチル化西洋ワサビペルオキシダーゼと156pmo
leの断片９とを,120μの0.025M リン酸ナトリウム,PH
7.5,中で結合させた。Elutip−ｄカラムにかける代わり
に，この混合液をエバポレート・乾固し,1μの75％グ
リセロール,10μの水，そして１μの１％ブロモフ
ェノールブルー混合液に懸濁させた。次いで，これを10
％の天然タンパクゲルに流した。（Lindleら，Methods
of Enzymol.（1983）92:309）。５′32P−リン酸断片９
を用いて，対照実験を行った。酵素−DNA複合体は，結
合していないペルオキシダーゼから（35Sで標識した，
より速く流れるものとして）よく分離した。ゲルは,100
mlの10mM Tris−HCl,pH7.5,50mM NaCl,60μ 30％過酸
化水素水に,60mgの４−クロロ−１−ナフトールを20ml
の冷メタノールに溶かした溶液を加えたもので染色し
た。この染色は，西洋ワサビペルオキシダーゼの活性に
基づいているので，ペルオキシダーゼ−DNA複合体自体
が活性であることを示すことが可能であった。コントロ
ールである32P−断片９により活性のあるものはつくり
出されなかった。
c. NA−ペルオキシダーゼと相補DNAとのハイブリダ
イゼーション ５′−チオリン酸化フラグメント11（５′−CCAAGAGC
TGGTCAAATCTTGAAGCAAACCTACGACAAGTTCGACACCAACATGAGAT
CTGACGACGCTTTG）を前述のように32pで標識化した。10
％過剰量の断片12（断片11に対して）を,5′−チオリン
酸化した断片11とブロモアセチルペルオキシダーゼとの
反応混合物に加えた。溶液は60℃で３分間加熱し，室温
に冷却した。対照実験は，断片12とブロモアセチル化酸
素を用い,5′−チオリン酸化断片11を除いたもので行っ
た。ゲルは，断片11の反応混合物とブロモアセチル化酵
素とを標準試料とし，前述のように泳動させた。断片２
＋酵素，および断片11は，泳動の遅い（断片11−ペルオ
キシダーゼ複合体と比較して）新しいバンドを示した。
これは32P標識を含んでいた。このバンドにはまた，ペ
ルオキシダーゼ活性があった。断片12−ペルオキシダー
ゼの対照実験では，酵素活性である32pでラベルされた
バンドは見い出されなかった。
v.分析 この分析において，断片はモデルシステムで示され,B
型肝炎ウィルスのゲノムの一部分を含む。この部分は,H
BV DNAの1403番目の塩基のBamH I部位から,5′方向に約
60塩基対伸びたもの（断片３）と,3′方向に約60塩基対
伸びたもの（断片２）とを含む。分析物である断片４
は，断片３の３′末端と断片２の５′末端に相補的であ
る。固体支持体に結合した断片３は,III b節で述べたよ
うにして調製した。III b節の初めの部分に記載した方
法に従って，断片２の５′部分をγ32−Ｐ−Ａ−TPで標
識化した（断片７に適用）。
a.ハイブリダイゼーション，プローブの捕捉 約3pmoleの，支持体に固定された断片３（0.3mg）の
懸濁液と,5pmoleの32P−断片２（10μ H2O中）とを，
それぞれの実験に使用した。適量の試薬（表１参照）を
加え，最終容量を50〜100μとし,90℃に加熱し,1時間
以上にわたり室温にまで放冷した。室温にて４×SSCで
洗浄後，支持体に固定したサンプルをベックマンLS7000
液体シンチレーションカウンターにより，チェルネンコ
フ（Chernenkov）で測定した。
b.制限酵素処理 典型的には，上記のようにプローブと結合した固体支
持体は，BamH I緩衝液（20mM Tris−HCl,pH8.0,7mM MgC
l2,100mM NaCl,2mM 2−メルカプトエタノール）で２回
洗浄し,20μの同じ緩衝液に再び懸濁させた。これに
１μのBamH I（BRL;5000単位/715μ）を加え混合し
た。37℃で30分間インキュベートし，上清および１回水
洗した溶液を，処理された固体支持体の残る試験管から
除去し，カウントした。次に，懸濁液を20μおよび酵
素２μを加え,37℃で一晩放置した。上清と洗浄水は
あらかじめカウントした。酵素の入っていない対照実験
も行った。
VI.PCL（過ヨウ素酸塩開裂リンカー）の調製 0,0ジベンゾイル酒石酸一水和物（18.8g,mmole）を25
0mlのCH3CNに溶かし，溶媒を減圧下で除去した。この操
作を繰返した。得られたオイルを250mlのTHFに溶かし，
ジンクロヘキシルカルボジイミド（DCC）10.6g（50mmol
e）を50ml THFに溶かしたものを加えた。数分以内に，
沈澱が生じ始めた。20℃で18時間撹拌した後，反応液を
濾過し沈澱を少量のTHFで洗浄した。次に沈澱を減圧下
で乾燥させると,10.8g（100％,50mmole）のジシクロヘ
キシルウレア（DCHU）が得られた。濾液に,2−（Ｎ−メ
チル）アミノエタノール（4.0ml,50mmole）を加え，反
応液を20℃で１時間撹拌した。次に,DCC（10.6g,50mmol
e）を50mlのTHFに溶かしたものを加えると，少量の沈澱
を生じた。約１時間後に,2−（Ｎ−メチル）アミノエタ
ノール（4.0ml,50mmole）を加え，反応液を20℃にて,18
時間撹拌した。
生じた沈澱をしばしば濾過し，少量のTHFで洗浄し
た。乾燥させたDCHUの沈澱は10.8g（100％）であった。
濾液を合併し，エバポレートして油状とした。シリカの
クロマトグラフィーにより,8g（17mmole）の0.0−ジベ
ンゾイル酒石酸ジ（Ｎ−メチル−２−ヒドロキシエチ
ル）アミド（１）を得た。生成物は６％のメタノール／
ジクロロメタンで溶出させた。
ジメチルアミノピリジン（DMAP）0.11gとトリエチル
アミン（TEA）2.4mlとを含む（１）（8.6mmole）に,50m
lのCH2Cl2に溶かしたDMT−Cl（8.6mmole）を滴下した。
DMT−Clを加えた後，反応混合物を20℃にて１時間撹拌
した。溶媒はエバポレーションによって除去した。残渣
を600mlの酢酸エチルに溶かし，有機相を400mlの５％炭
酸水素ナトリウムと400mlの80％飽和塩化ナトリウム水
溶液で洗浄した。有機相を固体の硫酸ナトリウム上で乾
燥した。30分後に，硫酸ナトリウムを濾過し，上清を油
状に濃縮し，トルエンおよびCH3CNと共にエパポレート
した。
粗製の物質をシリカゲルクロマトグラフィーにより,n
−ブタノール/CH2Cl2で溶出させた。純粋なモノ−DMT生
成物は,2〜３％ｎ−ブタノール/CH2Cl2で溶出し,1.53g
（2mmole）の0,0−ジベンゾイル酒石酸２−（Ｏ−ジメ
トキシトリチル）ヒドロキシエチル−Ｎ−メチル,N−メ
チル−２−ヒドロキシエチルジアミンを得た。
この物質をジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）3mm
oleを含む20mlのCH2Cl2に溶かした。10℃にまで冷却し,
2.2moleのメトキシ−N,N−ジイソプロピルアミノクロロ
ホスフィンをアルゴン下で加えた。15分後に酢酸エチル
を加え，有機相を80％飽和塩化ナトリウムで洗浄し，固
体の硫酸ナトリウム上で乾燥し，エバポレーションによ
り乾燥した。トルエンと乾燥CH3CNとの共エバポレーシ
ョンの後，残渣を10mlの乾燥CH3CNに溶かした。この溶
液を19本の乾燥したWeatonバイヤルに分注し，溶媒を減
圧下で除いた。バイヤルはネジ付キャップでしめて−20
℃で保存した。
DMT−PCL−ホスホルアミダイトをオリゴヌクレオチド
に常法によりカップリングした。次のオリゴヌクレオチ
ドを合成した。
上記構造において，“PCL"は過ヨウ素酸開裂性の結合
を示す。
“BLA3c"はヌクレオチド配列５′−GATGTGGTTGTCGTAC
TT−３′を示し，“Ｔ．LLA2．TT"はヌクレオチド配列
５′−TTGACACGGGTCCTATGCCTAAT−３′を示す。完全に
脱保護化した後，オリゴヌクレオチドをPAGEによって精
製し，生成物のバンドを切りとり,MG緩衝液にで溶出さ
せ,SEP−PAKカートリッジで,Sanchez−Pescadorら，DNA
３:339−343（1984）の方法により脱塩した。
分解は次のように行った：約0.60Dの精製した物質
（６λ H2O中）を,50λ0.1M NaIO4で処理し,20℃にて１
時間放置した。水（１λ゜/ml）に入った0.4mlのグリセ
ロール水溶液を加えた。溶液を合併し,0.1M酢酸トリエ
チルアンモニウム（TEAA）で平衡化したPD−10カラム
（Sephadex G25）に通し，同じ緩衝液で溶出した。0.5m
lのフラクションを集め,Speed−Vacによって溶媒を除去
した。15％PAGEによる分析で，出発物質は，予想してい
た大きさの２つのバンドに完全に分解していた。
VII 過ヨウ素酸ナトリウム脱離 A.32Pでラベルされたプローブは，Nucleic Acids Reser
ch 16（1988）でUrdeaらより記載されたとおりに調製
した。このプローブの配列は,AAGTACGACAACCACATCGGATG
ACCTCGGATCGACCT＊Ｔ−32P（５′→３′）であった。こ
こで，＊は，特開昭62−188970号（前出）に述べられた
修飾ヌクレオチドであり，この修飾ヌクレオチドは，次
の構造を有する： GATGTGGTTGTCGTACTTCTTCTTTGGAGAAAGTGGTG（５′→
３′）という配列の合成オリゴヌクレオチドが分析物と
して使われた。マイクロタイター捕捉ウェル（Microtit
er capture well）は,2つの異なるプローブを用いて下
記の方法により調製した：（１）＊CACCACTTTCTCCAAAGA
AG（下記の表３でXT1＊1caと命名された）；および
（２）＊TT−Ｘ−CACCACTTTCTCCAAAGAAG（＊は上述のア
ルカリアミンヌクレオチドを示す）。ここで，“X"は前
の節に述べられたように，過ヨウ素酸脱離可能な結合を
示す。このマイクロタイター捕捉ウェルは,200μの20
0μg/mlポリ−フェニルアラニルリジン（Sigma Chemica
l Inc.）の水溶液を各ウェルに加えることにより，イミ
ュロンIIストリップから調製した。カバーされたストリ
ップを室温に30分から２時間保持し，上述のように洗浄
を行なった。上述の3Bオリゴヌクレオチドの10 OD260サ
ンプルを含有する60μの１×PBSを,10mgのエチレング
リコールビス（スクシイミジル−スクシネート）（Pier
ce Chemical Inc.）を含む140μのDMFで処理した。こ
の混合物をボルテックスで撹拌し，室温にて暗所でイン
キュベートした。15分後にこの溶液を，あらかじめ30ml
の１×PBSで平衡化したセファデックスＧ−25カラム（P
D−D;Pharmacia）にかけた。カラムのボイドボリューム
が１×PBSで最終容積が35mlとなるまで希釈された。各
ウェルに，捕捉プローブ（capture probe）溶液50μ
を添加した。プラスチックラップでカバーした後，ウェ
ルを室温で暗所にて30分〜一晩中インキューベートし
た。これらのウェルは，ハイブリダイゼーション混合物
でおおわれていなかった。
1fmole,100amolesおよび10amolesの分析物断片を含有
するストック液は,4×SSCを含むハイブリダイゼーショ
ン緩衝液で調製した。コントール液は同様に調製された
が，これには分析物は含有されない。４組のウェルを調
製した。各ウェルに40μの選択溶液を加えた。この選
択溶液には,1fmole,100amoles,10amolesの分析物または
分析物を含有しない液が包含される。ハイブリダイゼー
ションは55℃の水溶液中で１時間行なった。チューブは
蓋をし，ウェルも粘着性のLinbro/Titertek膜でシール
した。380μの４×SSCで２度洗浄した後,10fmolesの
32P−標識されたプローブを含む４×SSC 40μを加え
た。ウェルを37℃で１時間インキュベートした後，再び
380μの４×SSCで２度洗浄した。
32Pの総カウントは,LKB 1214 Rackbetaシンチレーシ
ョンカウンターで測定した。その結果を表３の「総カウ
ント」の項に示した。
過ヨウ素酸脱離可能なポリヌクレオチドを含有する１
組のウェル，およびXT1＊1ca溶液を含む１組のウェル
に,100μの４×SSCに溶かした100mM NaIO4液を加え
た。ウェルを室温で１分間インキュベートした。この過
ヨウ素酸溶液を新しいウェルに移し，カウントした。結
果を表３の「100mM NaIO4」および「４×SSC」の項に示
す。
コントロールとして,100μの４×SSCを過ヨウ素酸
開裂可能なポリヌクレオチドを含有する１組のウェルに
加えた。次に，ウェルを室温で１分間インキュベート
し，溶液を新たなウェルに移した。この移した溶液をカ
ウントし，その結果を表３の「XT1＊1caウェル」の項に
示す。
B.第２の実験は，以下のように変更を加え，前述と同様
の手法で行なった：（１）使用したプローブは，＊CGTG
TCAGGCATAGGACC（５′→３′，＊は前述と同意義を有す
る）という配列を有する32P−標識化19量体であった；
（２）分析物は,GGTCCTATGCCTGACACGCTTCTTTGGAGAAAGTG
GTG;という配列を有する合成オリゴヌクレオチドであっ
た；（３）分析物の濃度は,3つ測定するのではなく,1つ
であった；（４）32P−標識化プローブは,10fmolでな
く,100fmolであった。結果を表４に要約して示す。
VIII.ストランド（鎖）置換 アルカリホスファターゼプローブは，Nucleic Acids
Research 16，でUrdeaらにより記載された方法により
調製した。このプローブは,AAGTACGACAACCACATCGGATGAC
CTCGGATCGACCT＊Ｔ（５′→３′）という配列を含む。
＊は上記と同意義を有する。GATGTGGTTGTCGTACTTCTTCTT
TGGAGAAAGTGGTG（５′→３′）の配列を有する合成オリ
ゴヌクレオチドを分析物として用いた。第２の合成オリ
ゴヌクレオチドは,CTTCTTTGGAGAAAGTGGTGTTCATAGAGAAAC
GATATATAGAGACACGATATAGGGATAの配列を有し，特異的な
脱離ストランド，つまり，上述のように標識を脱離させ
うる置換ストランドとして使用した。＊TATCCCTATATCGT
GTCTCTATATATCGTTTCTCTATGAACACCACTTTCTCCAAAGAAGの配
列を有するオリゴヌクレオチド捕捉プローブとして使用
し，プレートを作成した。Microlite Iウェル（Dynatec
h）を使用したこと以外は，前節に述べられたようにウ
ェルを調製し，そして，最後のインキュベーション工程
後，ウェルを１×PBSで洗浄し,H緩衝液でおおったの
ち，再び洗浄した。
３組の捕捉ウェルが調製され，各組は，分析物含有ウ
ェルおよびコントロールウェル（つまり分析物を含まな
いウェル）を包含する。各ウェルに1fmolの分析物また
は分析物を含まない40μの４×SSCを加えた。ハイブ
リダイゼーションを55℃にて１時間行った。380μの
４×SSCで２度洗浄した後,100fmolsのアルカリホスファ
ターゼプローブを含有する40μの４×SSCをウェルに
加えた。ウェルを37℃で１時間インキュベートした後，
洗浄を行なった。つまり，（１）0.1×SSCと0.1％SDSと
を含有緩衝液380μで２度洗浄を行ない，（２）４×S
SC 380μで２度洗浄を行なった。
アルカリホスファターゼ活性は，化学発光物質である
ジオキセタン（dioxetane）とのインキュベーションに
より測定した。発光はマイクロタイターディッシュ リ
ーティング ルミノメーター（Dynatech）を使用して記
録した。
１組のウェルに,20μの４×SSCを加えて，次に,37
℃で１時間インキュベーションした。20μのジオキセ
タンを加え，また37℃で再び１時間インキュベートし
た。アルカリホスファターゼ活性を測定し，その結果を
表５の「移動なし」の項に示す。
20μの４×SSCを第２の組のウェルに加え,37℃にて
１時間インキュベートした。個々の溶液をMicrolite I
ウエルに移し,20μのジオキセタンを加えた。これら
のウェルを再び37℃で１時間インキュベートした。アル
カリホスファターゼ活性を上記のように測定し，その結
果を表５「SSC脱離」の項に示す。
20μの４×SSCを第３の組のウェル（30pmolesの特
異的な脱離オリゴヌクレオチドを含有する）に加えた。
ウェルを37℃にて１時間インキュベートした後，この溶
液をMicrolite Iウェルに移した。20μジオキセタン
を加え，ウェルを37℃にて１時間インキュベートした。
アルカリホスファターゼ活性を上記のように測定し，そ
の結果を表５の「オリゴ脱離」の項に示す。
B.第VIII節Ａの実験を繰り返して行ない，その結果を表
６に示す。
上記結果より，本法は，簡単，迅速，そして正確に種
々の試料から特異的なポリヌクレオチド配列を検出する
手段を提供することが明らかである。この方法は異なっ
た型の標識（それは，免疫分析に使用されてきた検出可
能な信号を包含する）を与えることにおいて，高い感度
と広い柔軟性を与える。従って，本法は，免疫分析のた
めの従来の装置に容易に適用し得る。これらの装置は，
放射能活性，分光光度計における吸光度，蛍光光度計あ
るいはシンチレーションカウンターにおける光放射を検
出することが可能である。本法は，どのようなDNA配列
にも適用が可能であり，そして，比較的短いプローブを
使用して偽陽性を減らし，好ましくないヘテロ二本鎖化
を最少にするために用いられ得る。測定のために支持体
から標識を開裂させることにより，バックグラウンド値
を大幅に減らし得る。なぜなら，読みとりが支持体から
離れて行なわれるためである。さらに，ポリヌクレオチ
ド鎖から標識を開裂させる必要性に基づいてバックグラ
ウンドの問題をさらに注目する必要がある。本法は，従
って，病気を診断すること，ハイブリッドDNA操作をモ
ニターすること，遺伝的特徴を決定することなどのため
に正確で経済的なDNA配列を決定することを提供する。
上記に記載された発明は，その理解を明確にするため
に，いくぶん詳細に記載されている。しかし，添付の特
許請求の範囲内でその改変や修飾がなされ得ることは明
らかである。
（発明の要約） 核酸分析の新規方法が提供される。この方法におい
て，分析物における目的とする配列と実質的に相同性を
有するオリゴヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド
を用い，あからじめ決められた程度の厳密な条件下でハ
イブリダイゼーションを行うかまたは行わずに，支持体
から標識を脱離させる。特に，種々の手法が，支持体に
標識を結合し，そして，一本鎖または二本鎖の開裂によ
り，支持体から標識を脱離させるために用いられる。そ
の標識の脱離は，資料中の特定のオリゴヌクレオチド配
列の存在の指標として検出される。この方法は病気の診
断，遺伝的モニター，そして核酸混合物の分析に有用で
ある。
【図面の簡単な説明】
第１図は，固体支持体に対する標識の特異的結合および
非特異的結合の相違を示す。第２図Ａから第２図Ｄまで
は，本発明の好適な方法を模式的に示す説明図であり，
選択的に切断可能な部位が，支持体と標識の間に，分析
とプローブとの複合体を介して導入されることを示す。 第３図は，本発明の別の方法を模式的に示す説明図であ
り，特異的に結合した標識が，鎖置換技術によって，脱
離することを示す。

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】核酸試料中に存在する核酸分析物中の、目
    的のオリゴヌクレオチド配列の存在を検出する方法であ
    って、 該核酸試料を、ハイブリダイゼーション条件下で、標識
    プローブを含むポリヌクレオチド試薬と混合する工程で
    あって、該試料、または該ポリヌクレオチド試薬の成分
    のうちの一方が支持体に結合するが、該標識プローブは
    該支持体に直接結合せず、そして該分析物と該ポリヌク
    レオチド試薬とがハイブリダイズすることによって、該
    支持体と標識とが結合するようにする工程； 該結合した標識を遊離させる工程；および 該支持体から遊離した標識を検出する工程、 を包含する方法。
  2. 【請求項２】前記ポリヌクレオチド試薬が、第１のポリ
    ヌクレオチド捕獲プローブおよび第２のポリヌクレオチ
    ド標識プローブを含み、該第１および第２のプローブ
    が、前記分析物中に存在する配列と相補的なオリゴヌク
    レオチド配列を有し、前記ハイブリダイゼーション条件
    下で第１および第２の二本鎖を形成し、そして該捕獲プ
    ローブが固体支持体に結合しており、 そして前記遊離させる工程が、置換ポリヌクレオチド鎖
    を導入する工程であって、該置換ポリヌクレオチド鎖
    が、該捕獲プローブと、該第１の二本鎖よりも安定な二
    本鎖を形成し、それによって、該支持体から、該支持体
    に結合している標識を実質的に遊離させるように選択さ
    れる工程である、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】前記分析物と前記ポリヌクレオチド試薬と
    がハイブリダイズすることによって、選択可能な切断部
    位を介して前記支持体と標識とが結合し、 そして前記遊離させる工程が、該選択可能な切断部位で
    切断する工程である、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記混合する工程の後に、前記ハイブリダ
    イゼーションに使用される厳密さより高い厳密さで、前
    記標識が結合している支持体を洗浄し、それによって、
    前記支持体から、前記選択可能な切断部位を介さずに該
    支持体に結合している標識を、実質的に遊離させる工程
    をさらに包含する、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記試料が支持体に結合している、請求項
    ３に記載の方法。
  6. 【請求項６】前記ポリヌクレオチド試薬が、支持体に結
    合した第１のポリヌクレオチド捕獲プローブ、および第
    ２のポリヌクレオチド標識プローブを含み、ここで該第
    １および第２のプローブが、前記ハイブリダイゼーショ
    ン条件下で、前記分析物中に存在する配列と二本鎖を形
    成するように相補的なオリゴヌクレオチド配列を有し、
    ここで該捕獲プローブが前記選択可能な切断部位を含
    む、請求項３に記載の方法。
  7. 【請求項７】前記選択可能な切断部位が、ヒドロキシル
    アミン、ヒドロキシド、チオールまたは過ヨウ素酸によ
    り切断可能である結合を含む、請求項３に記載の方法。
  8. 【請求項８】請求項３に記載の方法において使用され
    る、以下の構造を有するポリヌクレオチド試薬： ここで、DNA1がDNAの第１の鎖であり、DNA2はDNAの第２
    の鎖であり、そしてＸはヒドロキシルアミン、SH-、ま
    たは過ヨウ素酸により切断可能である選択可能な切断部
    位を含む。
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