JPH05508862A - 大きな櫛型分枝状ポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 大きな櫛型枝状ポリヌクレオチド 説明 技術分野 本発明は、核酸化学および生化学アッセイの分野に関する。

より詳細には、核酸ハイブリダイゼーシ璽ンアッセイにおける増幅マルチマーと して有用な、大きな櫛型分枝状ポリヌクレオチドに関する。

核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、一般に、遺伝子の研究、生物医学研究 および臨床診断に用いられる。基本的な核酸ハイブリダイゼーションアッセイで は、−零値核酸分析物が、標識された一本鎖核酸分析物ブにハイブリダイズされ 、得られた標識二本鎖が検出される。この基本的な技法の改変は、検出される二 本鎖の外来性物質からの分離を容易にするため、および／または検出されるシグ ナルを増幅させるために開発されている。検出されるシグナルを増幅させる１つ の方法は、同一出願人のヨーロッパ特許出願（ＥＰＡ）　１１８３０９６９７６ 　（１９８９年４月１８日に提出された、米国特許出願第３４０．０３１号に対 応する）に記載されている。この方法では、シグナルは、増幅マルチマーを用い て増幅される。これらのマルチマーは、核酸分析物または分析物に結合した核酸 の鎖に特異的にハイブリダイズする第１セグメント、および標識されたプローブ に特異的にハイブリダイズするＩ！＆２セグメントの繰り返しを有するように構 築されたポリスクレオチドである。増幅は、理論的には、第２セグメントの繰り 返しの数に比例する。マルチマーは、線形または分校状であり得る。２つの一般 的なタイプの分枝状マルチマーである、フォーク型および櫛型について説明する 。

２つのタイプの分枝状マルチマーをテストすると、約ａ＠より多くの枝を有する フォーク型構造が、標識されたプローブのマルチマーへの結合を阻害する立体障 害を示すことが見いだされた。一方、櫛型構造は、立体障害を示さなかったため 、好ましいタイプの分校状マルチマーであることが分かった。

しかし、残念なことに、約１０個より多くの分枝状部位を有する櫛型構造を形成 するための不断の試みは失敗に終わった。

出願人は、大きな櫛型分校状マルチマーを生産する手法を開発した。これらの大 きな櫛型構造により、以前可能だったよりもさらに程度の高い増幅が可能になる 。

１ユニ皿丞 本発明の１つの局面は、大きなｆｇ盟分校状ポリヌクレオチドであって、 （ａ）以下を含むポリヌクレオチド骨格：（ｉ）各々が側鎖部位を形成する、少 なくとも約１５個の多官能性ヌクレオチド、および （ｉｆ）目的の箪−の−末鎖ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し得る、藁− の−末鎖オリゴヌクレオチドユニット；および （ｂ）各側鎖が、目的の第二の一本鎖ヌクレオチド配列に特異的に結合し得る第 二の一本鎖オリゴヌクレオチドユニットの繰り返しを有する、該多官能性ヌクレ オチドから伸びるペンダントポリヌクレオチド側鎖、 を含む。

本発明の他の局面は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、増幅マル チマーとして有用な大きな櫛型分校状ポリヌクレオチドを形成する方法であって 、（ａ）以下を含む一本鎖ポリヌクレオチド骨格を合成する工程（ｉ）各々が、 側鎖ヌクレオチド伸長の部位として作用する保護された官能基を有する、少なく とも約１５個の多官能性ヌクレオチド、および （ｉｔ）３１Ｇ−のライゲージ１ン部位セグメント；（ｂ）該官能基を脱保護す る工程； （ｃ）該部位の各々を少なくとも約５個のヌクレオチドだけ伸長して、第二のラ イゲージ蕩ン部位セグメントを提供する工程； （ｄ）第一の一本鎖オリゴヌクレオチドユニットを該策−のライゲージ１ン部位 に連結する工程であって、ここで、該第−の−末鎖オリゴヌクレオチドユニット が、目的の第一の一本鎖核酸配列に特異的に結合し得る、工程；および（ｅ）第 二の一本鎖オリゴヌクレオチドユニットを該第二のライゲージ璽ン部位セグメン トに連結する工程であって、ここで、該第二の一本鎖オリゴヌクレオチドユニッ トが、目的の第二の一本鎖オリゴヌクレオチドに特異的に結合し得る配列の繰り 返しを含む、工程、 を包含する。

本発明のさらに他の局面は、核酸ハイブリダイゼーシ言ンアブセイにおいて増幅 マルチマーとして有用な大きな櫛型分校状ポリヌクレオチドを形成する他の方法 であって、（ａ）以下を含む一本鎖ポリヌクレオチド骨格を合成する工程（１） 各々が、側鎖ヌクレオチド伸長の部位として作用する保護された官能基を有する 、少なくとも約ＩＳ個の多官能性ヌクレオチド、および （ｉｉ）目的の第一の一本鎖ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し得る、第一 の一本鎖オリゴヌクレオチドユニット；（ｂ）該官能基を脱保護する工程； （Ｃ）該部位の各々を少な（とも約５個のヌクレオチドだけ伸長させてライゲー ジ１ン部位セグメントを提供する工程；および （ｄ）第二の一本鎖オリゴヌクレオチドユニットを該ライゲージ１ン部位セグメ ントに連結する工程であって、ここで、該第二の一本鎖オリゴヌクレオチドユニ ットが、目的の第二の一本鎖オリゴヌクレオチドに結合し得る配列の繰り返しを 含む、工程、 を包含する。

本発明のさらに他の局面は、これらの大きな櫛型分校状ポリヌクレオチドを核酸 ハイブリダイゼーシ１ンアフセイにおいて使用することである。これらのアブセ イにおいて、（ａ）分校状ポリヌクレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドユニ ットを介して、固相に結合した一本鎖核酸分析物、または分析物に結合した一本 鎖オリゴヌクレオチドに／％イブリダイズされ； （ｂ）非結合分校状ポリヌクレオチドは除去され；（ｅ）−末鎖ｊｌＡ識オリゴ ヌクレオチドは、該箪２オリゴヌクレオチドユニブトを介して、該分枝状ポリヌ クレオチドにハイブリダイズされ； （ｄ）非結合標識オリゴヌクレオチドは除去され；および（ｅ）該分枝状ポリヌ クレオチドに結合した標識の存在は検出される。

ｌｌ　り ■ 本発明の櫛型分校状ポリヌクレオチドを説明するのに本明細書に用いられる「大 きな」は、少なくとも約１５個の分枝部位、および標識されたプローブ結合配列 の織り返しを少なくとも約２０４Ｉｌ有する分子を指す。

本発明の分枝したポリヌクレオチドの構造を説明するのに本明細書に用いられる ｒｍ豐」は、骨格から伸びる多数の側鎖を有する、直鎖状骨格を持つポリヌクレ オチドを指す。

「多官能性」または「改変」ヌクレオチドは、追加的な官能基（好ましくは、４ 位を改変して官能ヒドロキシ基が得られるシトシン）を有し、ヌクレオチドと共 有結合して側鎖を形成する、ポリヌクレオチドに安定的に導入され得るヌクレオ チドモノマーを指す。

「開裂リンカ−分子」は、ポリヌクレオチド鎖に安定的に導入され簿、化学的処 理または照射などの物理的処理によって、分解または開裂し得る共有結合を含む 分子を指す。

「増幅マルチマー」は、核酸分析物および多数の標識されたプローブと、直接ま たは間接にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを指す。

な　ポリヌクレオチドの、　・ 本発明のポリヌクレオチドマルチマーは、直鎖状骨格およびペンダント側鎖から なる。骨格は、核酸分析物または分析物に結合した核酸と特異的にハイブリダイ ズする部位となるセグメントを含有し；一方、ペンダント側鎖は、標識されたプ ローブと特異的にハイブリダイズする部位となるセグメントの繰り返しを含有す る。

これらの櫛型ポリヌクレオチドマルチマーの好適な実施態様は、以下の概略式に よって表され得る：（以下余白） ここで、Ｓは、少なくとも約１５個のヌクレオチド、好ましくは約１５から５０ 個のヌクレオチドの、箪−のスペーサーセグメントであり、Ｘは、分枝部位とな る多官能性ヌクレオチドであり、Ｓ′は、０から約１５個のヌクレオチド、好ま しくはＯから１０個のヌクレオチドの分枝部位スペーサーセグメントであり、ｍ は、１５またはそれ以上、好ましくは１５から１００の範囲の整数であり、Ｒは 、開裂リンカ−分子であり、ｎは、０または１であり、Ｓ″は、約Ｏから１０個 のヌクレオチド、好ましくは５から１０個のヌクレオチドの第二のスペーサーセ グメントであり、Ａは、核酸分析物または分析物に結合した核酸と特異的にハイ ブリダイズし得るセグメントであり、Ｓ°゛°は、０から１０個のヌクレオチド の第三のスペーサーセグメントであり、Ｅは、５から１０個のヌクレオチドの伸 長オリゴヌクレオチドであり、Ｌは、標識されたオリゴヌクレオチドプローブと 特異的にハイブリダイズし得る、ヌクレオチド配列の繰り返しを、２から１０個 、好ましくは３から６個含有するセグメントである。

マルチマーの全骨格、または、ＳとＳ″を含めたＳからＳ”までの部分、および Ｌを除いた側鎖部分は、一般に、従来の自動化固相オリゴヌクレオチド合成化学 および装置を用いて、統合的単位として化学的に合成される。この点において、 スペーサーセグメントは、分枝部位を含有する分子の部分を、固相から離す役割 を果たしている（Ｓの３′末端は、固相の表面に結合されている）。

上式においてＸで示される改変されたヌクレオチドまたは分枝しているモノマー は、多官能性のヌクレオチドであり、ここで、１つの官能基は側鎖の伸長のため に用いられ、そして、他の官能基は、骨格の結合に用いられる。多官能性のヌク レオチドの例は、ＥＰＡ　８８３０９６９７６　（米国特許第３４０．０３１号 ）に述べられており、その開示内容はここで参考として援用されている。これら の改変されたヌクレオチドは、好ましくは次式である二 （以下余白） ここで、Ｒ１は、水素、メチル、Ｉ、ＢｒまたはＦであり、Ｒ１は、水素または メチルであり、２は、以下からなる群より選択される： （以下余白） ここで、Ｘおよびｙは、同一、または翼なり得、１から８の範囲（１および８を 含む）の整数である。（２結合におけるｒ　（１）Ｊおよびｒ　（２）Ｊという 番号は、Ｚのリンカ一部分の配列を示す。） 示されているように、スペーサーセグメントＳ′は、任意であり、所望であれば 、各分枝部位と、前後のフランキングする分枝部位とのスペースをあけるために 、または一連の隣接する分校部位と、フランキングする一連の分枝部位とのスペ ースをあけるために用いられ得る。第二のスペーサーセグメントＳ゛もまた、任 意であり、分子の分枝した部分と、最終的に分析物が結合するセグメントＡとの スペースをあけるために、使用され得る。このようなスペースをあけることは、 分析物とマルチマーとの間の結合を改良することがわかった。

同様に、箪三のスペーサーセグメントＳ°°゛は任意である。それは好ましくは 、ｐｏｌｙＴである。

セグメントＡは、分析物またはその分析物に結合した核酸に、特異的におよび安 定に結合することができる配列および鎖長を有する。このような特異性および安 定性を達成するために、セグメントＡは、そのヌクレオチドの長さが、通常、１ ５個から５０個、好ましくは、１５個から３０個であり、そして４０％から６０ ％の範囲のＧＣ含有量を有する。このセグメントの特異的な鎖長および配列は、 もちろん、ハイブリダイズしようとする核酸に依存して変化する。

セグメントＥは、自動固相オリゴヌクレオチド合成装置および技術を用いて化学 的に合成される、側鎖伸長物である。

それは典型的には、ヌクレオチドの長さが、約５個から１０個であり、そして、 セグメントＬが酵素的に結合し得る部位としてはたらく。

セグメントＬは、標識されたオリゴヌクレオチドプローブに、特異的にかつ安定 にハイブリダイズし得るオリゴマー単位の繰り返しを含む。これらの単位はまた 、ヌクレオチドの長さが、典型的に４１５個から１５０個、好ましくは２０個か ら１２０個であり、そして４０％から６０％の範囲のＧＣ含有量を有する。各Ｌ セグメントは、通常、２個から１０個の単位の繰り返し、好ましくは３個から６ 個の繰り返しを含む。ある種の側鎖は、Ｌセグメントを含有し得ない。通常、側 鎖の少なくとも約５０％、好ましくは、側鎖の少な（とも約７０％は、Ｌセグメ ントを含む。

骨格および／または側鎖における開裂可能なリンカ−分子（Ｒ）は任意であるが 、好ましい。それらは、大きな櫛型のポリスクレオチドのサンプルが、分析およ び特徴付けの目的のために開裂され得るような、選択可能な開裂部位を提供する 。この点に関して、各側鎖、および５′の大部分の分校部位の開裂部位である、 まさに５′に、開裂部位があることが好ましい。これらのポリヌクレオチドに組 み込まれ得る開裂可能なシンカー分子の例は、ＥＰＡ　８８３０９６９７６およ び後述の実施例に開示されている。

な　の　マルチマーのム 本発明のポリヌクレオチドは、固相直接オリゴヌクレオチド合成および酵素的ラ イゲージ１ン法の組み合せを用いて、組み立てられる。

櫛体は、３′スペーサー（Ｓ）、分校部位（Ｘ）、任意にｓ’　ｓ”およびＳ゛ °゛°゛セグメントグメント、任意に所望のリンカ−分子（Ｒ）および側鎖の伸 長物Ｅを含む。この櫛体は、自動固相オリゴヌクレオチド合成法によって合成さ れる。好ましい固相は、少な（とも２０００オングストロームの孔径の調整され た多孔性のガラスである。この合成において、スペーサーセグメン）Ｓは、固相 から伸長される。このセグメントがｐｏｌｙＴであることは、好都合である。分 枝部位を提供する多官能性ヌクレオチドは、次いで、分枝部位間のスヘーサーと してヌクレオチドを介在させ、または介在させずに、この鎖に付加される。直交 する保護基またはブロック基は、骨格の伸長を可能とするような保護基が、側鎖 の伸長を可能とする保護基に作用することなく、除去され得るような、改変され たヌクレオチド上で用いられる。

適切な保護基の例もまた、ＥＰＡ　８８３０９６９７６に記述されている。

好ましくは、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）は、このヌクレオチドの糖部分にお けるブロック基として用いられる。次式のレブリニル基マたはアントクキ／ニル 基は、好ましくは改変されたヌクレオチドのヒドロキシル部分におけるブロック 基として用いられる： （以下余白） ここで　Ｒｌ　は、水素、アリール、またはアラルキルであり、Ｒ１は、同一ま たは翼なり得、そしてアミノ、ニトロ、ハロゲン、ヒドロキシル、低級アルキル および低級アルコキシでなる群から選択され；Ｒ４は、同一または異なり得、そ してアミ／、ニトロ、ハロゲン、ヒドロキシル、低級アルキルおよび低級アルコ キシでなる群から選択され；　ｉは、０．１．２または３であり；そしてｊは、 ０．１．２．３または４である。

分枝部位の所望の数が組み込まれた後、この分子の５′末端は、Ｓｏｏ（任意） およびＡセグメントで、またはそれにＡセグメントの酵素的ライゲージ１ンのた めの部位を提供する、短いＳ°゛セグメント（５個〜１０個のヌクレオチド）の みで、伸長される。上記で示されたように、選択可能な開裂部位は、好ましくは 、伸長物に組み込まれる。Ａセグメントがライゲーシヲンによって付加されるの ではなく、直接合成されるならば、分子の残りの部分に逆に作用することなく、 選択的に除去され得る、保護基、例えば、２−メチルアントラキノニルは、改変 されたヌクレオチドの側鎖部位を保護するために用いられるべきである。

櫛体の５′末端が所望のように伸長された後、改変されたヌクレオチドのヒドロ キシル部分を保護する基は除去され、そして分校部位は、同時に、好ましくは選 択可能な開裂部位を含有して伸長される。その結果、各分校部位は、結合部位と してはたらく少なくとも５個〜１０個のヌクレオチドの伸長物（Ｅ）を有する。

Ｌセグメント（および、直接合成されない場合、Ａセグメントでもある）は、次 いで、Ｔ４リガーゼおよび適切なリンカ−の鋳型を付加することによって、側鎖 の伸長物に結合される。ＡおよびＬセグメントおよびその鋳型もまた、入手可能 な自動固相オリゴヌクレオチド合成装置および方法を用いて合成され得る。

バイブ１　イゼーシ璽ンア　セイ 核酸のハイブリダイゼーシ曹ンア７セイにおいて、本発明の、大きな櫛型マルチ マーは、核酸分析物に、または分析物に結合する一本鎖オリゴヌクレオチドに結 合する。このマルチマーは、標識されたオリゴヌクレオチドによる特異的なハイ ブリダイゼーションに利用可能である多数の配列（２０以上）の繰り返しを含む ので、従来の方法においてよりも多く標識された大部分の基は、分析物に結合さ れ得る。多数の標識された基は、検出可能な分析物の閾値のレベルを低下させる 。

このマルチマーは、本質的に、公知の核酸のハイブリダイゼーシヨンのフォーマ ットのいずれにおいても用いられ得る。

それは、例えば、分析物が、固相、またはその分析物が固相に交互に結合してい るオリゴヌクレオチドに結合している、サンドイノチハイブリダイゼーシ１ンに 直接結合しているものである。それは、ＥＰＡ　８８３０９６９７６に記述され ている液相のサンドイッチハイブリダイゼーシ重ンア１セイのフォーマ１トにお いて、特に有用である。

このような液相のサンドイッチハイブリダイゼーン１ンアッセイにおいて、マル チマーは以下のように用いられる。−重鎖の核酸分析物を、以下に示す２つの一 末鎖核酸ブローブセクトを過剰量と一緒に、ハイブリダイゼーション条件下でイ ンキ二ベー卜する二　（１）分析物と相補的な第一の結合配列、および固相に結 合している一本鎖オリゴヌクレオチドと相補的である第二の結合配列をそれぞれ 有する捕捉プローブのセット、および（２）分析物に特異的に結合し得る第一の 結合配列、およびマルチマーのＡセグメントに特異的に結合し得る第二の結合配 列をそれぞれ有する、増幅プローブの七ノド。増幅プローブを用いることによっ て、マルチマーは、「汎用の」試薬であるように設計され得、異なるマルチマー は、各分析物のために製造される必要がない。得られる生成物は、それらの第一 の結合配列によって、分析物にハイブリダイズされる、２種のプローブの３成分 の核酸複合体である。

このプローブの第二の結合配列は、それらが分析物と相補的でないので、一本鎖 テールのままである。

この複合体は、次いで、捕捉プローブの第二の結合配列と相補的である複合体に 結合している一本鎖オリゴヌクレオチドを有する固相に、ハイブリダイズするた めの条件下で、付加される。得られる生成物は、固相に結合しているオリゴヌク レオチドおよび捕捉プローブの第二の結合配列によって形成された二本鎖を介し て固相に結合している複合体を含む。

固相に結合している複合体は、次いで、結合していない物質から分離される。

大きなＷＩ型の増幅マルチマーは、次いで、ハイブリダイゼーション条件下で、 固相−分析物−プローブ複合体に付加され、この複合体の増幅プローブの利用可 能な第二の結合配列に、このマルチマーをハイブリダイズさせる。得られる固相 複合体は、次いで、洗浄によって、いかなる結合していないマルチマーからも分 離される。標識されたオリゴヌクレオチドは、次いで、マルチマーの側鎖におい てオリゴヌクレオチドユニットに、それをハイブリダイズさせるような条件下で 、付加される。得られる固相の標識された核酸複合体は、次いで、過剰に標識さ れたオリゴヌクレオチドから、洗浄によって分離され、結合していない標識され たオリゴヌクレオチドが除去され、そして解読される。

核酸分析物は、種々の原料、例えば、生物学的液状物質または固形物、食品成分 、環境物質などに由来し得、そして、種々の手段、例えば、プロティナーゼ［／ ＳＤＳ、カオトロビプク塩などによって、ハイブリダイ上−９１フ分析のために 調製され得る。それはまた、酵素的、物理的または化学的な手段、例えば、制限 酵素処理、音波処理、化学的分解（例えば、金属イオン）などによって、核酸分 析物の平均サイズを低減するのに有利であり得る。このフラグメントは、０．１ 　ｋｂ程＆テあり得、通常、少なくとも約０．５ｋｂであり、そして１　ｋｂ以 上であり得る。この分析物の配列は、分析のためには、−末鎖の形態で提供され る。この配列が、−末鎖の状態で天然に存在する場合には、変性させる必要はな い。しかし、この配列が二本鎖の形態で存在する場合には、この配列は変性され る。

変性は、種々の方法、例えば、アルカリ処理、一般に約０．０５から０．２Ｍの 水酸化物処理、ホルムアミド処理、塩処理、熱処理、またはそれらの組み合せに より、行われ得る。

分析物の配列と相補的である、捕捉プローブおよび増幅プローブの箪−の結合配 列は、それぞれ、少な（とも１５個のヌクレオチド、通常、少な（とも２５個の ヌクレオチドを有し、そして多くとも約５ｋｂであり、通常多（とも約１ｋｂで あり、好ましくは多くともヌクレオチドは約１００個である。

それらは典豐的には、およそ３０個のヌクレオチドを有する。

それらは通常、分析物の異なる配列に結合するために選択される。この第一の結 合配列は、種々の研究に基づいて選択され得る。分析物の性質に依存して、コン センサス配列、多型性に関連する配列、特定の表現型または遺伝型、特定の株な どに関心が払われる。

（以下余白） アンブリファイア−の第１の結合配列および捕捉プローブを適切に選択すること により、興なる核酸分子の一部分として存在する特定の遺伝子あるいは他の配列 を含む特定の核酸分子を同定するのに、それらを使用し得る。目的の核酸分子を 、所定の配列を同様に含有するような他の分子から区別するために、プローブの 一つはこの一定の配列に相補的に、もう一方のプローブは、分子の他の配列に相 補的に作製される。この他の配列は、分子に特有である（すなわち、所定の配列 を含む池の分子には存在しない）。

捕捉プローブおよびアンブリファイアプローブの第２の結合配列は、固相に結合 したオリゴヌクレオチド、およびマルチマーのＡセグメントにそれぞれ相補的で あり、そしてサンプル／分析物の内因性の配列に相対しないように選択される。

東２の結合配列は第１の結合配列に隣接し得るか、あるいは介在する非相補的な 配列によって箪１の結合配列との間に間隔をあけられ得る。所望するならば、プ ローブは他の非相補的配列を含有し得る。これらの非相補的配列は、結合配列の 結合を妨げるものであってはならないし、あるいは非特異的な結合を生じさせる ものであってはならない。

捕捉プローブおよびアンプリファイアブローブは、オリゴヌクレオチド合成法、 あるいはクローニングによって調製され得るが、前者が好ましい。

結合配列には、ホモ二本鎖を提供するための完全な相補性は必要ではないことは 認識される。多（の場合、５以上のヌクレオチドのループは別として、約１０％ よりも少ない塩基のミスマツチのへテロ二本鎖であれば十分である。従って、本 明細書で用いられる用語「相補的」は、安定な二本鎖構造を提供するのに十分な 相補性の度合を意味している。

アッセイに用いる固相は、微粒子であるか、あるいは例えば遠心用のチューブ、 カラム、マイクロタイタープレートウェル、フィルター、チュービングなどの種 々の容器のいずれかの固壁表面であり得る。微粒子を用いる場合は、その粒子の サイズは約０．４から２００ミクロンの範囲内にあるのが好ましい。より一般的 には約０．８から４．０！クロンである。粒子はラテックス、あるいはガラスの ような任意の手近な物質であり得る。マイクロタイタープレートは好ましい固体 表面である。

捕捉プローブの茶２の結合配列に相補的なオリゴヌクレオチドは、既知の方法に より官能基を介して安定的に固相に結合され得る。

捕捉プローブの東２の結合配列および固相に結合したオリゴヌクレオチドを、捕 捉プローブの′１ｇ１の結合配列の固相を結合させる安定な結合を形成する適当 なりガント−レセプターペアーで置換できることは認識される。このようなベア ーの例には、ビオチン／アビチン、チロキシン／チロキシン結合グロブリン、抗 原／抗体、炭水化物／レクチンなどが挙げられる。

標識オリゴヌクレオチドは、マルチマーの側鎖上のオリゴヌクレオチドユニット に相補的な配列を含む。この標識オリゴヌクレオチドは、１以上の分子（「標識 」）を含み、これらは直接的にあるいは間接的に検出可能なシグナルを提供する 。

標識は相補的な配列の個々のメンバーに結合し得るか、あるいは複数の標識を有 する末端メンバーまたは末端テールとして存在し得る。配列に結合する標識を供 給する種々の方法が文献に報告されている。例えば、Ｌａａｒｙら、　ｒｃａｃ ｄ江己］（１９１１３）８０：４０４５、ＲｅｎｚおよびＫｕｒｚ、ｕｃ　Ａｃ ’ｄｓ　ｅｓ　（１９１１４）　ｌｌ：３４３５、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎおよび Ｇｕｍｐｏｒｔ％Ｕ！劇−η側ＬＪＬ競　（１９８３）　ｌｌ：６１６７、Ｓ曹 ｉｔｈら、１匹上」且辷口」し１　（１９８５）１ｉ＋２３９９、　Ｍｅｉｎｋ ｏｔｈおよびＷａｈｌ、　ｎａｌ　’　ｃｈ　ｍ　（１９８４）ｕｉ：Ｚ６７を 参照のこと。標識は、共有結合であるいは非共有結合で相補的配列に結合し得る 。使用し得る標識には、放射能核酸、蛍光剤、化学ルミネブサー、染料、酵素、 酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、酵素サブユニット、金属イオンなどが含ま れる。特定の標識には、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、フィコ エリチン、ウンベリフェロン、ルミノール、ＮＡＤＰＨ，α−β−ガラクトシダ ーゼ、ホースラディツシュパーオキサイドなどが例として挙げられる。

されるモルに対する比率は、それぞれ少な（とも化学量論上の量であり、好まし くは過剰である。この比率は好ましくは少なくとも約１．５：１であり、そして より好ましくは少なくとも２：１である。通常は２：１から１０．０００：　ｔ の範囲内である。各プローブの濃度は一般に約１０−Ｉ＠から１０−’　Ｍの範 囲であり、すンプルの核酸濃度は１０−２１からｔｏ−１２Ｍまで変化する。本 ア・１セイのハイブリダイゼーシ蜜ンの工程は、一般に約１０分間から２時間で 行い、約１時間で終結することが多い。ノーイブリダイゼーシプンはやや高めの 温度で行われ得、一般に約２０℃から８０℃の範囲、より普通には約３５℃から ７０℃、とりわけ６５℃で行われ得る。

ハイブリダイ上−２１フ反応は、通常水性媒体中で行われ、特に緩衝化水性媒体 で行われ、これらは種々の添加物を含み得る。使用し得る添加物には、低濃度の 、界面活性剤（０，１から１％）、例えばクエン酸ナトリウムのような塩類（０ ，０１７カ）ら０．１７　Ｍ）　、フィコール、ポリビニルビクリジン、キャリ アー核酸、キャリヤータンパク質などが含まれる。ジメチルホルムアミド、ジメ チルスルホキシド、アルコール類、およびホルムアミドのような非水性溶媒を水 性媒体中に加え得る。

これらの他の溶媒は、２から５０％の範囲の量で存在する。

ハイブリダイゼーシ嘗ン媒体の緊縮性は、温度、塩濃度、溶媒系などにより制御 され得る。従って、目的の配列の長さおよび性質によって緊縮性が異なる。

アッセイの分離工程に用いられる方法は、固相の性質（こよって異なる。微粒子 の場合は、遠心分離あるいは濾過により、上澄みを捨てるかあるいは上澄みを単 離して微粒子を分離する。微粒子をアッセイするときは、微粒子を徹底的に、通 常は１から５回、例えばＳＤＳのような界面活性剤を含むＰＢＳのような適当な バ、１ファー媒体を用いて洗浄する。分離する手段が璧あるいは支持体の場合は 、上澄みを単離しあるいは捨て、微粒子に対して示したのと同様の方法で壁を洗 浄する。

標識の存在を検出するのには、標識の性質によって種々の技法を使用し得る。蛍 光を発するものに対しては多数の異なる蛍光光度計が利用できる。化学ルミネッ サーに対しては発光光度計あるいはフィルムが利用できる。酵素とともに、蛍光 、化学ルミネツセント、あるいは着色産物が提供され蛍光光度定量、化学発光定 量、分光光度定量であるいは視覚的に測定される。イム／アッセイに使用される 種々の標識、およびイムノアッセイに適用可能な技法は、本アッセイに使用し得 る。

「ドブドブロット」アッセイのような、核酸分析物が直接的に固相に結合するよ うな）１イブリダイゼーシ１ンアツセイにおいては、マルチマーは結合した分析 物に直接ハイブリダイズする。このような例では、マルチマーのＡセグメントは 、分析物の配列に相補的であり、そして側鎖のオリゴヌクレオチドユニットは標 識オリゴヌクレオチドに相補的である。結合していないマルチマーを固相から取 り除き、次に標識オリゴヌクレオチドを結合した分析物−マルチマー複合体にハ イブリダイズする。過剰の標識オリゴマーを取り除き、そして標識結合複合体を 測定する。

このようなマルチマーは、直接的イム／アッセイ、間接的イム／アッセイ、ある いはサントイブチイムノアッセイのような他のアッセイにも使用され得る。これ らの例では、分析物に直接的にあるいは間接的に結合する標識抗体、あるいは他 のリガンドの役目をする試薬は、標識ではな（マルチマーに結合するマルチマー のＡセグメントに相補的なオリゴヌクレオチドを宵している。例えば、抗原分析 物に対するサントイブチイムノアッセイにおいては、分析物試料をその抗原に対 する１次抗体が結合する固相とともにインキュベートする。

結合していない試料を固相から取り除き、抗原に対する２次抗体であって、マル チマーのユニットに相補的なオリゴヌクレオチドが結合している２次抗体を、結 合複合体と反応させ、３構成酸分複合体を形成させる。過剰の２次抗体を取り除 き、次に２次抗体に結合するオリゴヌクレオチドを介してマルチマーを複合体に ハイブリダイズさせる。過剰のマルチマーを取り除き、そして標識オリゴヌクレ オチドをマルチマーの他のオリゴヌクレオチドユニットとノーイブリダイズさせ る。過剰の１’ｍｌオリゴヌクレオチドを取り除いた後、複合体を測定する。

本発明による増幅された核酸）＼イブリダイゼーシゴンア・ツセイを行うための キットは、箱詰めの組み合わせで以下のような試薬を含む：マルチマー；適当な 標識オリゴヌクレオチド；分析物に結合し得る固相；もしそのア・ｌセイフオー マ・ノドが、分析物が、介在オリゴヌクレオチドあるいは池のリガンドを介して 固相に結合しているようなフォーマ・ノドである場合は、任意に捕捉プローブ： もしそのア・１セイフオーマツトが、マルチマーが直接的に分析物に／１イブリ ダイズしな０ようなフォーマットである場合は、任意に増幅プローブ。これらの 試薬は典型的には、キット中の別々の容器に入れられている。キットには、分析 物を変性させるための変性試薬、ハイブリダイゼーシ１ンバ、ファー、洗浄溶液 、酵素基質、負および正のコントロール、およびアッセイを行うための説明書が 含まれ得る。

本発明の以下の実施例は、例示するためのものであって限定するためのものでは ない。

Ｌ血医工 この実施例は、１５個の分枝部位、および３個の標識プローブ結合部位を有する 側鎖伸長物を有する櫛型分枝状ポリヌクレオチドの合成を例示する。このポリヌ クレオチドは、ＥＰＡ　８８３０９６９７６に記載の液相ハイブリダイゼーシヨ ンに用いるようにデザインされたものである。

オリゴヌクレオチドのすべての化学合成は、ＤＮＡ自動シンセサイザーによって 行った（アプライド　バイオシステムスインコーホレーテッド（ＡＢＩ）モデル ３８０　Ａ／Ｂ）。メトキシ型のホスホルアミダイト化学を用いたが、５゛−の リン酸化にはＰｈｏｓｔｅｌ”試薬（ＡＢＮ）を用いた。上記（５’−）を除い ては、標準ＡＢ１プロトコールを用いた。提示されている多数のサイクル（例え ば１．５ｘサイクル、４．５ｘサイクル）を用いた。ＡＢ［によって勧められて いる多数の標準アミダイト量を、その仕分けされたサイクルに対して用いた。こ こに添付したのはアプライド　バイオシステムス　モデル３８０　Ａ／Ｂ　ＤＮ Ａシンセサイザーで動く、０．４．１，５．４．５およびＣＡＰＩ’ＲＩＭサイ クルを実施するためのプログラムである。

以下の構造式を有する櫛体を最初に調製する：３’Ｔ２゜−Ｘ、５（ＧＴＣＡＧ Ｔｐ５’）　、５−（ＧＴＴＴＧＴｐ−５１）　。

ここでＸは前述の改変されたヌクレオチドである。

ＩＳの繰り返しになっている櫛体の部分を、４０ｍｇのチミジン調整ボアガラス （ＣＰＧ）　（３０００オングストローム、１グラム支持体当り３マイクロモル のチミジン）を用いて、１．５Ｘサイクルのプロトコールで合成する。分枝部位 のヌクレオチドは以下の構造式を有する： ここでＲは Ｒ２がＭＡＣであるモノマーは以下のように作製した。前述（ＨｏｒｎおよＴＪ ＵｒｄａａＳＮＡＲｖａｔ、　Ｌ７：１７．　ｐ、　６９５９−６９６７　（１ ９８９））のように調製したＮ−４−（６−ヒドロ亭シヘキシル）−５°−ＤＭ Ｔ−５−メチル−２゛デオ牛シシチジン（１７＊ｍｏｌｅ）のメチレンクロライ ド溶液の２００婁ｌ中にピリジン（４０謹ｍｏｌｅ）を加え、混合物を０℃まで 冷却した。２−アントラ亭ノンメトキシクロロホルメート（ＭＡＣ−ＣＩ）（２ ０ｍｍｏｌｅ＞のＣＨ２Ｃｌ２溶液の２００ｇ＋１を滴下し、１０分間攪拌した 。ＴＬＣ分析（１０％メタノール／ＣＨ２Ｃｌ２で展開したシリカプレート）で は、開始の物質が完全に消費されたことが示された。

反応混合物を４００■ｌの酢酸エチルで希釈し、この有機相を３００１１の５％ ＮｌｌＨＣＯ３および８０％飽和ＮａＣ１溶液で２回抽出した。有機相をＮ　ａ ２Ｓｏｄで３０分間乾燥し、続いて濾過した後減圧下で溶媒を除去する。生成物 をＣ１１２Ｃ１２中のメタノール勾配（０−６％）を用いたシリカゲルクロマト グラフィーにより精製し、１３ｇの純粋な生成物を得た（収率８Ｓ％）。

２５ｍｍｏｌｅ（５，９５ｇ）の２−（ヒドロ牛ジメチル）−アントラキノン（ ＭＡＱ−０１（）を２５０■ｌのジオキサンに溶解することにより、０．１モル 溶液を調製した。黄色の溶液を濾過し、水を除去するため、エバポレーションに より溶媒を取り除いた。残渣を２００ｍ１のジオキサンに再溶解し、ピリジン（ ２１１％　２５ｍｍｏｌｅ）を加えた。

この溶液を攪拌しながら５０１１のＣＨ２Ｃｌ２中のトリホスゲン（２，５ｇ、 ２％Ｍｅｑ）に滴下した。滴下が終了した後、混合物を２０°Ｃで１８時間攪拌 した。混合物を８００ｍ１の酢酸エチルで希釈し、有機相を６０ｉ１の８０％胞 和ＮａＣ１で３回洗浄した。有機相をＮａ２５Ｏ＊で乾燥した後、溶媒を減圧下 で除去し、黄色の固体を得た。これをＣＩｈＣ１２中に再溶解した（２５０■ｌ 、０．１Ｍ＞。この溶液はさらに精製することなく用いた。

（以下余白） ヌクレオチドト４−（Ｏ−アントラキノンメトキシカルボニル−６−オ牛シヘキ シル）−５’−ＤＭＴ−５−メチル−２゛−デオキシシチジン（１４，４ｍｍｏ ｌｅ）を、７０　ｍｍｏｌｅ　ＤｉＰＥＡを食前するＣＨ２Ｃｌ２　（５０ｍり に溶解した。０℃に冷却した後、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノメトキシクロロ ホスフィン（２，７２ｍｌ；　１４　ｍｍｏｌｅ）を加えた。

ホスフィチル化剤を少量ずつ加えて、出発物質の９５％を消費させた。次に、こ の反応混合物を酢酸エチル（３００ｍｌ）で希釈し、３００　ｍｌの５％　Ｎａ ＨＣＯ３で２回抽出し、次に３００　ｍｌの８０％飽和Ｎａｃ１水溶液で２回抽 出した。そして最終的に固体のＮａ２５Ｏａ上で乾燥した。溶媒を、減圧下で除 去した。

この粗ホスホルアミダイトを、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した。精製 したホスホルアミダイトをトルエンに溶解し、そして冷へ牛サン（−５０℃）８ ００鳳ｌに急速に攪拌しながら加えた。得られた沈殿物をすばやく濾過により集 めて、そして１８時間高減圧下で乾燥して、わずかに黄色の固体の生成物１２． ４ｇ　（４，５ｍｍｏｌｅ、収率１１０％）を得た。標準条件下で、亜ジチオン 酸ナトリウムで処理することにより、ＭＡＣで保護されたヌクレオチドの脱保護 を行った。

櫛体（側鎖を有していない）の合成のためには、メチルホスホルアミダイトモノ マーの濃度は、Ａ、　Ｃ，、ＧおよびＴでは０゜１Ｍであり、分校部位のモノマ ーＸでは０．１５Ｍであり、そしてＰｈｏｓｔｅｌ”試薬では０．２Ｍである。

脱保護を行う間、塩化メチレン中３％のトリクロロ酢酸を連続して流すことによ って、脱トリチル化を行った。最後に、５°ＤＭＴをアセチル基で置き換え式３ °−ＧＴＣＡＧＴｐの６個の塩基側鎖の伸長物を、以下のように各分校モノマー 部位で合成した。塩基保護基（上述の式においてＲ２）の除去を手操作で行い、 櫛体を合成するのに使用するカラムと同じカラムでＣＰＧ支持体を保持した。Ｒ −レブリニルの場合には、０．５Ｍのヒドラジン水和物のピリジン／氷酢酸溶液 （１：１　ｖ／ｖ）を加えて、この液体を１５分毎に新しく取り換えながら、９ ０分間ＣＰＧサポートに接触させた。ピリジン／氷酢Ｈ（４：１　ｖ／ｖ）、次 にアセトニトリルで長時間洗浄した後、カラム中の濾材を取り換えた。Ｉｌｌ” ２−メチルアントラキノニルの場合には、亜ジチオン酸ナトリウム溶液（亜ジチ オン酸ナトＩＪ　ラム１ｇをＩＭ！炭酸トリメチルアンモニウム２０　ｍｌに溶 解すせ、次に２０■ｌのジオキサンを加える）を加えて、ＣＰＧ支持体に９０分 間接触させた。脱保護後、６個の塩基側鎖の伸長物を、４．５×サイクルおよび ０．２Ｍのモノマー濃度で加えた＠これらの合成では、モノマーの濃度は０．２ Ｍである（ＲおよびＰｈｏｓｔｅｌ”試薬を含有する）。脱トリチル化は、２． ５ｚのジクロロ酢酸トルエン溶液／３０％のトリクロロ酢酸塩化メチレン溶液（ １：１　ｖ／ｖ）を連続して流すことにより行われた。保護基を、以下のように して取り除いた。ホスフェート保護基を、２０’Ｃで１時Ｍ、チオフェノール／ トリエチルアミン／アセトニトリ）’　（１：１：２　ｖ／ｖ）溶液でＣＰＧを 処理することによって、次にアセトニトリル（１０！　１　ｍｌ）およびメタノ ールで洗浄することによって、固体で支持された生成物フラグメントから取り除 いた。この生成物フラグメントを、０．５■ｌの濃水酸化アンモニウムで２０分 間処理することによって、ＣＰＧ支持体から取り除き、その上清を除去した。こ のような処理を合計１時間の暴露の間２回繰り返した。上溝を合わせてスクリコ ーキャップ付バイアルに移し換え、６０℃で１８時間加熱した。室温まで冷却し た後、溶媒を５ｐｅｅｄ−１ａｃエバポレーターで除去し、その残渣を１００μ ｌの水に溶解した。

以下の構造を有する５゛骨格の伸長物（Ａセグメント）、側鎖の伸長物および結 合鋳型／リンカ−はまた、当勘合成機により合成した。

（ｔｊ’ｔ％ｎ４’ｐ４４　３ｌ−ＧＡｒｃｃｃＲ（ＴＴＣＡＴＧｃ’ｒＧＴＴ ＧｃＴＧＴＡＣ）、−５’５′ヤト帽坂刊ｔ Ｓへ５１５）丁；ゲ７Ｑフ とｔｉφ製　２．−６゜、。ユゆ。−５゜ａ鎖の伸長におけるＲは、以下の選択 的開裂リンカ−を表す。

ここで、ＤＭＴはジメトキシトリチルを表し、Ｂｚはベンゾイルを表し、Ｒ５は メチルまたはβ−シアノエチルを表し、そしてＥＰｒはイソプロピルを表す。

Ｒ部位の開裂は、２工程の化学的工程により達成される。すなわち、　（１）　 Ｎａ１Ｏａ水溶液による１時間の酸化、次に（２）１−プロピルアミン水溶液に よる処理、である。

粗製の櫛体を標準ポリアクリルアミドゲル（１０％、７Ｍ尿素を含有する）法で 精製した。

５′骨格の伸長物および側鎖の伸長物を、より長い反応時間（〉８時間）、１４ ％ポリエチレングリフール、および室温を用％）たこと以外は標準Ｔ４リガーゼ プロトコール（υｒｄａａ（１９８７）法、Ｅｎｚｙ■ｏ１．１４６：２２−４ １）を用いて櫛体に結合させた。

結合および精製後、生成物の一部を３２ｐでＷ識し、上述した開裂工程を行った 。次に、このサンプルをＰＡＧＥで分析してゲル上のバンドの数を測定すること により、導入された側鎖の伸長の数を決定した。この生成物は、合計２４個の標 識されたプローブ結合部位を有することがわかった。

ｉ良五ユ この実施例は、実施例１で合成したのと同じマルチマーの合成を示す。この合成 は、中程度の孔径のＣＰＧ／高負荷ＣＰＧ　（これは、まず遍切な負荷レベルに 調整されたものである）を用いて行った。第一の合成を、３０　ｔａＨのチミジ ンＣＰＧ支持体（１０００オングストローム；工ｇの支持体につき２０　ｉｕ＋ ｏｌｅｓのチミジン）からスタートして行った。τによる最初の２０の結合サイ クルを０．４×サイクル行い、１ｇの支持体につき約１０　ｍｍｏｌｅｓを下ま わるまで負荷を減少させた。次に、Ｔによる２０の結合サイクル、Ｘ（改変され たヌクレオチド）によるＩＳサイクルを行い、そして１．５×ザイクルにより最 終的に配列３“−ＧＴＴＴＧＴＣＧ、を導入した。末端の５−ＤＭＴ基を取り除 いて、この配列をＡＢ＋機械のＣＡＰ−ＰＲ１Ｍサイクルプログラムを用いてキ ヤツジした。この機械からカラムを取り出して、以下の操作を手操作で行った。

分枝点ルブリネート保護基の除去を上述したように行った。そして、得られたＣ ＰＧ支持体を、新しいＡＢＩカラムに移し換えた。

上述したようにｇｉ鎖の伸長を行うて、４．５Ｘサイクルにより配列３’−ＧＴ ＣＡＧＴ９を導入した。この保護基を実施例１　（上述膠原）に記載したように 取り除いて、粗生成物を１００μの水に溶解した。

Ａ基とＬ基との結合を実施例１のように行った。

１胤五ユ ＥＰＡ　８１１３０９６９７６の実施例５に記載のピリン（ｐｉｌｌｉｎ）遺伝 子特異的捕獲および増幅プローブ、ならびに３２ｐおよびアルカリホスファター ゼで標識されたプローブにより、実施例１の２４部位の櫛型分枝ポリヌクレオチ ドを用いて、Ｍ−眩凹Ｌｌ徨ｕについて、液相サンドイツチアブセイを行った。

２つのタイプの標識物を用いて、アルカリホスファターゼで標識されたプローブ により２４部位の櫛構造の使用が何らかの立体的な問題を起こすかどうかを評価 した。この結果を、何ら立体的障害となる問題を起こさない５部位櫛構造を用い た結果と比較した。

３２ｐプローブを用いると、２４部位の分子は、標準の５部位の櫛構造が４．７ ６に対して相対的にアウトプットが増加した（理論値４．８）　（それぞれ１９ ５．　Ｇｏｏ±１０．Ｇｏｏ　ＣＰＭ対４１．　Ｇｏｏ±１．２００ＣＰＭ、１ ０原子モルにおける）。アルカリホスファターゼで標識されたプローブを用いる と、２４部位の分子は標準の５部位の櫛構造においては３．９４であるのに対し て相対的にアウトプットが増加した（それぞれ、５０．１±１．７ライトカウン ト、ＬＣ，対１２．７±０．２　ＬＣ，１０原子モルにおける）。２つのタイプ のプローブで標識する際の有効性の相違により、酵素による標識は櫛構造に十分 適合することが示される。

ＥＰＡ　１１８３０９６９７６の実施例に記載されている他の核酸分析物のため のアッセイは、同様にして行われ得る。

本発明を行うために、核酸化学および核酸ハイブリダイゼーシヨンの分野の当業 者には明らかな、上述の方法の改変を行うことは、以下の請求の範囲の範囲内に あることが明らか］−勤旦 ７ｓｏ７１１１７ｔＪ％：　Ｏ−”　”ｒイク廖し」旦ルー （め巳　） 」娼」ｆロ アＯ’ｆｊｋ：　１．５ｘ　イイグ１しコど」エル （廁ｔ　） 」狂１ヱロ ｊ’ｏ／７’ｊｋ：　４．５ｘ　４ＦイクＩし虚江■シ ＋Ｂｌｚｚ＋ 」式狙對 （＞％ジ　） ＋ｌ＠　９＠　ＴＥＴ　ｔｏ　ｃｏＬｕＦＩｎ　２　Ｙ＠ｓ　Ｙ＠ｓ　Ｙ＠ｓ　 Ｙｅｓ　Ｙ＊−Ｙｅｌｌ　Ｙ＠ｌ　マａｍ虫ぼ［ｎ ＴｖＬ乙　） 」豆おｎ （ｂｔ巳　） 」止ムｂ ７１＋Ｄゲ５ＬＡ！　−イアｔレ−ｃＡＰ−ＰＲ工Ｍ（べ下零白２ 要」１１ 以下の式の櫛型分枝状ポリヌクレオチドは、核酸ハイブリダイゼータ１ンアフセ イの増幅マルチマーとして用いられる３’　５−ＬＸＳ”）ｆｆｌ−侃熟−５’ −Ａ　ｓ゛ここでＳは、少なくとも約１５個のヌクレオチドの東−のスペーサー セグメントであり、Ｘは、分枝の部位を提供する改変ヌクレオチドであり、Ｓ９ は、０から約１５個のヌクレオチドの分枝する部位のスペーサーセグメントであ り、ｍは１５以上の整数であり、Ｒは、開裂し得るリンカ−分子であり、ｎはＯ あるいは１であり、Ｓ″は、約０から１０個のヌクレオチドのツユのスペーサー セグメントであり、Ａは、核酸分析物あるいは分析物に結合した核酸に特異的に ハイブリダイズし得るセグメントであり、Ｓ°°゛は、０からｌＯの茅三のスペ ーサーセグメントであり、Ｅは、５から１０個の伸長ヌクレオチドのオリゴヌク レオチドであり、そしてＬは、２から１０の繰り返しを含むセグメントであり、 標識オリゴヌクレオチドプローブに特異的にハイブリダイズし得る配列である。

国際調査報告

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．大きな櫛型分枝状ポリヌクレオチドであって、（ａ）以下の（ｉ）および（ ｉｉ）を有するポリヌクレオチド骨格： （ｉ）それぞれが側鎖の部位を規定する、少なくとも約１５個の多官能性ヌクレ オチド、および（ｉｉ）目的の第一の一本鎖ポリヌクレオチド配列に特異的に結 合し得る、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドユニット；および （ｂ）該多官能性ヌクレオチドから伸長するペンダントポリヌクレオチド側鎖で あって、それぞれが、目的の第二の一本鎖ポリヌクレオチド配列に特異的に結合 し得る第二の一本鎖オリゴヌクレオチドユニットの繰り返しを含み、全ての側鎖 の繰り返しの総数が少なくとも２０個になる、ポリヌクレオチド側鎖、 を含む、分枝状ポリヌクレオチド。
2. ２．前記目的の第一の一本鎖ポリヌクレオチド配列が、核酸分析物あるいは核酸 分析物に結合しているポリヌクレオチドであり、そして前記目的の第二の一本鎖 ポリヌクレオチド配列が、標識されたポリヌクレオチドである、請求項１に記載 の分枝状ポリヌクレオチド。
3. ３．１５から５０個の多官能性ヌクレオチドを含む、請求項２に記載の分枝状ポ リヌクレオチド。
4. ４．請求項２に記載の分枝状ポリヌクレオチドであって、前記多官能性ヌクレオ チドが、以下の式のものであり、▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、Ｒ３は、水素、メチル、Ｉ、Ｂｒ、あるいはＦであり、Ｒ４は、水素あ るいはメチルであり、Ｚは、以下からなる群から選択され、 ▲数式、化学式、表等があります▼； ▲数式、化学式、表等があります▼；▲数式、化学式、表等があります▼；▲数 式、化学式、表等があります▼； ▲数式、化学式、表等があります▼；および▲数式、化学式、表等があります▼ ここでｘおよびｙは、１から８の範囲の整数（１および８を含む）で、同一ある いは異なるものであり得る、分枝状ポリヌクレオチド。
5. ５．前記第一および第二の一本鎖オリゴヌクレオチドユニットのそれぞれが、１ ５から５０ヌクレオチドの長さである、請求項２に記載の分枝状ポリヌクレオチ ド。
6. ６．前記それぞれの側鎖中の縁り返しの数が、２から１０である、請求項２に記 載の分枝状ポリヌクレオチド。
7. ７．請求項１に記載の分枝状ポリヌクレオチドであって、該分枝状ポリヌクレオ チドが、以下の式のものであり、▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、Ｓは少なくとも約１５個のヌクレオチドの第一のスペーサーセグメント であり、Ｘは分枝の部位を提供する多官能性ヌクレオチドであり、Ｓ′は、０か ら約１５個のヌクレオチドの分枝する部位のスペーサーセグメントであり、ｍは 、１５以上の整数であり、Ｒは、開裂し得るリンカー分子であり、ｎは、０ある いは１であり、Ｓ■は、約０から１０個のヌクレオチドの第二のスペーサーセグ メントであり、Ａは、核酸分析物あるいは分析物に結合した核酸に特異的にハイ ブリダイズし得るヌクレオチドセグメントであり、Ｓ′′′は、０から１０個の ヌクレオチドの第三のスペーサーセグメントであり、Ｅは、５から１０個のヌク レオチドの伸長オリゴヌクレオチドであり、そしてＬは、２から１０の繰り返し を含む、セグメントであり、標識オリゴヌクレオチドプローブに特異的にハイブ リダイズし得るヌクレオチド配列である、分枝状ポリヌクレオチド。
8. ８．請求項７に記載の分枝状ポリヌクレオチドであって、Ｓが、１５から５０個 のヌクレオチドの長さであり、Ｘが以下の式のものであり、 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、Ｒ３は、水素、メチル、Ｉ、Ｂｒ、あるいはＦであり、Ｒ４は、水素あ るいはメチルであり、Ｚは、以下からなる群から選択され、 ▲数式、化学式、表等があります▼； ▲数式、化学式、表等があります▼； ▲数式、化学式、表等があります▼； ▲数式、化学式、表等があります▼； ▲数式、化学式、表等があります▼；および▲数式、化学式、表等があります▼ ， ここでｘおよびｙは、１から８の範囲の整数（１および８を含む）で、同一ある いは累なるものであり得、Ｓ′′は、５から１０個のヌクレオチドの長さであり 、そしてＬの中の繰り返しは、３から６である、 分枝状ポリヌクレオチド。
9. ９．ＳがポリＴである、請求項８に記載の分枝状ポリヌクレオチド。
10. １０．ｎが１である、請求項８に記載の分枝状ポリヌクレオチド。
11. １１．請求項１０に記載の分枝状ポリヌクレオチドであって、前記開裂し得るリ ンカー分枝が、以下の式のものであり、▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、ＤＭＴは、ジメトキシトリチルを表し、Ｂｚは、ベンゾイルを表し、Ｒ ５は、メチルあるいはβ−シアノエチルを表し、そしてｉＰｒは、イソプロピル を表す、分枝状ポリヌクレオチド。
12. １２．核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、増幅マルチマーとして有 用な、大きな櫛型分枝状ポリヌクレオチドを調製する方法であって、 （ａ）以下の（ｉ）および（ｉｉ）を有するポリヌクレオチド骨格を合成する工 程： （ｉ）側鎖ヌクレオチドの伸長のための部位として機能する保護された官能基を 、それぞれが有している、少なくとも約１５個の多官能性ヌクレオチド、および （ｉｉ）第一のライゲーション部位セグメント；（ｂ）該官能基を脱保護する工 程； （ｃ）該部位のそれぞれを、少なくとも約５個のヌクレオチド伸長▽きせ、第二 のライゲーション部位セグメントを提供する工程； （ｄ）第一の一本鎖オリゴヌクレオチドユニットを、第一のライゲーション部位 と結合させる工程であって、該第一の一本鎖オリゴヌクレオチドユニットが、目 的の第一の一本鎖ヌクレオチド配列と結合し得る、工程；および（ｅ）第二の一 本鎖オリゴヌクレオチドユニットを該第二のライゲーション部位セグメントと結 合させる工程であって、該第二の一本鎖オリゴヌクレオチドユニットが、目的の 第二の一本鎖オリゴヌクレオチドに結合し得る配列の繰り返しを含む工程、 を包含する、方法。
13. １３．請求項１２に記載の方法であって、前記合成および伸長が、固相法により 行われ、この固相法では、骨格の３′末端が固相に固定されており、そして骨格 が少なくとも約１５個のヌクレオチドの３′リーダー配列を含む、方法。
14. １４．前記固相が、孔径が少なくとも約２０００Åである、調整ポアガラスであ る、請求項１３に記載の方法。
15. １５．前記ヌクレオチド伸長のための部位が５〜１０個のヌクレオチドで伸長さ れている、請求項１４に記載の方法。
16. １６．請求項１３に記載の方法であって、前記多官能性ヌクレオチドが以下の式 のものであり、 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここでＲ２は、▲数式、化学式、表等があります▼あるいは▲数式、化学式、表 等があります▼（ＭＡＣ）を表す、方法。
17. １７．核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、増幅マルチマーとして有 用な、大きな櫛型分枝状ポリヌクレオチドを調製する方法であって、 （ａ）以下の（ｉ）および（ｉｉ）を有するポリヌクレオチド骨格を合成する工 程： （ｉ）側鎖ヌクレオチドの伸長のための部位として機能する保護された官能基を 、それぞれが有している、少なくとも約１５個の多官能性ヌクレオチド、および （ｉｉ）目的の第一の一本鎖ポリヌクレオチド配列に特異的に結合し得る第一の 一本鎖オリゴヌクレオチドユニット； （ｂ）該官能基を脱保護する工程； （ｃ）該部位のそれぞれを、少なくとも約５個のヌクレオチド伸長▽させ、ライ ゲーション部位セグメントを提供する工程；および （ｄ）第二の一本鎖オリゴヌクレオチドユニットを、該ライゲーション部位セグ メントと結合させる工程であって、該第二の一本鎖オリゴヌクレオチドユニット が、目的の第二の一本鎖オリゴヌクレオチドと結合し得る配列の繰り返しを含む 、工程、 を包含する、方法。
18. １８．請求項１７に記載の方法であって、前記多官能性ヌクレオチドが以下の式 のものであり、 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここでＲ２は、▲数式、化学式、表等があります▼あるいは▲数式、化学式、表 等があります▼（ＭＡＣ）を表す、 方法。
19. １９．請求項１８に記載の方法であって、前記合成および伸長が、固相法により 行われ、この固相法では、骨格の３′末端が固相に固定されており、そして骨格 が少なくとも約１５個のヌクレオチドの３′スべーサー配列を含む、方法。
20. ２０．前記固相が、孔径が少なくとも約２０００Åである、調整ボアガラスであ る、請求項１８に記載の方法。
21. ２１．前記ヌクレオチド伸長のための部位が５〜１０個のヌクレオチドで伸長さ れている、請求項１８に記載の方法。
22. ２２．核酸分析物が、標識された核酸プローブにハイブリダイズされる、核酸ハ イブリダイゼーションアッセイにおいて、 請求項２に記載の分枝状ポリヌクレオチドを、第一の一本鎖オリゴヌクレオチド ユニットを介して、直接的にあるいは間接的に該分析物にハイプリダイズさせる 工程、および第二の一本鎖オリゴヌクレオチドユニットを介して、標識された核 酸プローブを分枝状ポリヌクレオチドにハイプリダイズさせる工程を含む、アッ セイ。
23. ２３．核酸分析物が、標識された核酸プローブにハイプリダイズされる、核酸ハ イブリダイゼーションアッセイにおいて、 請求項７に記載の分枝状ポリヌクレオチドを、第一の一本鎖オリゴヌクレオチド ユニットを介して、直接的にあるいは間接的に該分析物にハイプリダイズさせる 工程、および第二の一本鎖オリゴヌクレオチドユニットを介して、標識された核 酸プローブを分枝状ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる工程を含む、アッ セイ。
24. ２４．核酸ハイブリダイゼーションアッセイであって、ここで、 （ａ）請求項２に記載の分枝状ポリヌクレオチドが、第一のオリゴヌクレオチド ユニットを介して、固相に結合している一本鎖核酸分析物あるいは分析物に結合 している一本鎖オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしており；（ｂ）未結合の 分枝状ポリヌクレオチドが除去され；（ｃ）一本鎖標識オリゴヌクレオチドが、 第二のオリゴヌクレオチドユニットを介して、分枝状ポリヌクレオチドにハイブ リダイズされ； （ｄ）未結合の標識オリゴヌクレオチドが除去され；そして （ｅ）分枝状ポリヌクレオチドに結合している標識の存在が検出される、 核酸ハイブリダイゼーションアッセイ。
25. ２５．核酸ハイブリダイゼーションアッセイであって、ここで、 （ａ）請求項７に記載の分枝状ポリヌクレオチドが第一のオリゴヌクレオチドユ ニットを介して、固相に結合している一本鎖核酸分析物あるいは分析物に結合し ている一本鎖オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ；（ｂ）未結合の分枝状 ポリヌクレオチドが除去され；（ｃ）一本鎖標識オリゴヌクレオチドが、第二の オリゴヌクレオチドユニットを介して、分枝状ポリヌクレオチドにハイブリダイ ズされ； （ｄ）未結合の標識オリゴヌクレオチドが除去され；そして （ｅ）分枝状ポリヌクレオチドに結合している標識の存在が検出される、 核酸ハイブリダイゼーションアッセイ。