PT98489B

PT98489B - Processo para a producao de um grande polinucleotido ramificado do tipo pente

Info

Publication number: PT98489B
Application number: PT98489A
Authority: PT
Inventors: Michael S Urdea; Thomas Horn; Chu-An Chang
Original assignee: Chiron Corp
Priority date: 1990-07-27
Filing date: 1991-07-29
Publication date: 1998-04-30
Also published as: EP0541693A1; PT98489A; JP2641322B2; EP0541693B1; AU8412991A; PL169801B1; PL297659A1; DE69130612D1; IE912662A1; JPH05508862A; RU2142467C1; EP0541693A4; WO1992002526A1; DE69130612T2; CA2087961A1; ATE174339T1

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Campo do invento

Este invento pertence ao campo dos ensaios bioquímicos e quimica de ácidos nucleicos. Mais particularmente, ele diz respeito a grandes polinucleótidos com ramificações de tipo pente gue são úteis como multimeros de amplificação em ensaios de hibridização de ácidos nucleicos.

Antecedentes do invento

Os ensaios de hibridização de ácidos nucleicos são vulgarmente usados em investigação genética, investigação biomédica e diagnósticos clínicos. No ensaio básico de hibridização de ácidos nucleicos, o ácido nucleico de cadeia simples a analisar é hibridizado com uma sonda marcada de ácido nucleico de cadeia simples, e os duplexes marcados resultantes são detectados. Foram desenvolvidas variações deste esquema básico para facilitar o processo de separar os duplexes a detectar dos materiais extrínsecos, e/ou amplificar o sinal detectado. Um método para amplificar o sinal detectado é descrito no Pedido de Patente Europeia EPA No. 883096976 (correspondente ao Pedido de Patente Norte-americana com o No. de série 340.031, depositado em 18 de Abril de 1989). Este método obtém a amplificação do sinal através da utilização de multimeros de amplificação. Estes multimeros são polinucleótidos construídos de forma a possuírem um primeiro segmento que se hibridiza especificamente com o ácido nucleico a analisar, ou uma cadeia de ácido nucleico ligada ao produto para análise e repetições de um segundo segmento que se hibridiza especificamente com uma sonda marcada. A amplificação é teoricamente proporcional ao número de repetições do segundo segmento. Os multimeros podem ser lineares ou ramificados. São descritos dois tipos de multimeros ramificados: em forquilha ou de tipo pente.

Ao testar os dois tipos de multimeros ramificados, verificou-se que as estruturas em forquilha possuindo mais do que cerca de oito ramificações exibiam um impedimento estêrico que inibia a ligação das sondas marcadas ao multimero. Por outro lado, as estruturas de tipo pente não exibiam quaisquer problemas estéricos, e por essa razão foram determinadas como sendo o tipo preferido de multimero ramificado. Infelizmente, no entanto,

I tentativas repetidas de produção de estruturas de tipo pente possuindo mais do que cerca de 10 locais de ramificação foram infrutíferas. Os requerentes desenvolveram procedimentos para a produção de grandes multimeros com ramificações de tipo pente. Estas grandes estruturas de tipo pente permitem um maior grau de amplificação em relação ao anteriormente possivel.

Descrição do Invento

Um aspecto do invento consiste num grande polinucleótido com ramificações de tipo pente, compreendendo:

(a) um polinucleótido com uma estrutura de suporte, possuindo:

(i)	pelo menos	cerca	de 15 nucleótidos
multifuncionais, cada um dos quais	define	um local de inserção	de
cadeia lateral, e
(ii)	uma primeira	unidade	oligonucleotidica	de
cadeia simples que	é capaz de se	ligar	especificamente a	uma
primeira sequência	polinucleotidica de	cadeia simples	com

interesse; e (b) cadeias laterais polinucleotldicas pendentes, estendendo-se desde os ditos nucleótidos multifuncionais, cada uma possuindo repetições de uma segunda unidade oligonucleotidica de cadeia simples capaz de se ligar especificamente a uma segunda sequência nucleotidica de cadeia simples com interesse.

Outro aspecto do invento consiste num processo de produção de um grande polinucleótido com ramificações de tipo

I pente, útil como um multimero de amplificação num ensaio de hibridização de ácidos nucleicos, compreendendo:

(a) a sintese de um polinucleótido de estrutura de suporte em cadeia simples, possuindo:

(i) pelo menos cerca de 15 nucleótidos multifuncionais, cada um dos quais possui um grupo funcional protegido que funciona como um local de extensão de uma cadeia nucleotidica lateral, e (ii) um primeiro segmento de local de ligação;

(b) a desprotecçao dos ditos grupos funcionais;

(c) a extensão de cada um dos ditos locais em pelo menos cerca de cinco nucleótidos, de modo a proporcionar segundos segmentos de local de ligação;

(d) a ligação de uma primeira unidade oligonucleotidica de cadeia simples ao primeiro local de ligação, sendo a dita primeira unidade oligonucleotidica de cadeia simples capaz de se ligar especificamente a uma primeira sequência de ácido nucleico de cadeia simples com interesse; e (e) a ligação das segundas unidades oligonucleotidicas de cadeia simples aos segundos segmentos de local de ligação, compreendendo as ditas segundas unidades oligonucleotidicas de cadeia simples repetições de uma sequência que é capaz de se ligar especificamente a um segundo oligonucleótido de cadeia simples com interesse.

Ainda outro aspecto do invento consiste num processo alternativo de produção de um grande polinucleótido com ramificações de tipo pente, útil como um multimero de amplificação num ensaio de hibridizaçâo de ácidos nucleicos, compreendendo:

(i) pelo menos cerca de 15 nucleótidos multifuncionais, cada um dos quais possui um grupo funcional protegido que funciona como um local de extensão de uma cadeia nucleotidica lateral, e (ii) uma primeira unidade oligonucleotidica de cadeia simples que é capaz de se ligar especificamente a uma primeira sequência polinucleotidica de cadeia simples, com interesse;

(b) a desprotecção dos ditos grupos funcionais;

(c) a extensão de cada um dos ditos locais em pelo menos cerca de cinco nucleótidos, de modo a proporcionar segmentos de local de ligação; e (d) a ligação das segundas unidades oligonucleotidicas de cadeia simples aos segmentos de local de ligação, compreendendo as ditas segundas unidades oligonucleotidicas de cadeia simples repetições de uma sequência que é capaz de se ligar especificamente a um segundo oligonucleótido de cadeia simples com interesse.

Ainda outro aspecto do invento consiste na utilização destes grandes polinucleótidos com ramificações de tipo pente, em ensaios de hibridização de ácidos nucleicos. Nestes ensaios:

(a) o polinucleótido ramificado é hibridizado, por intermédio da primeira unidade oligonucleotidica, com o ácido nucleico de cadeia simples a analisar, ligado a uma fase sólida, ou com um oligonucleótido de cadeia simples ligado ao produto para análise;

(b) o polinucleótido ramificado não ligado é removido;

(c) o oligonucleótido marcado de cadeia simples é hibridizado com o polinucleótido ramificado por intermédio das segundas unidades oligonucleotidicas;

(d) o oligonucleótido marcado não ligado é removido; e (e) é detectada a presença do marcador ligado ao polinucleótido ramificado.

Modos de Realização do Invento

Definições

Grande, tal como aqui usado para descrever os polinucleótidos ramificados de tipo pente do invento, quer significar uma molécula possuindo pelo menos 15 locais de ramificação, e pelo menos 20 repetições da sequência de ligação da sonda marcada.

De tipo pente, tal como aqui usado para descrever a estrutura dos polinucleótidos ramificados do invento, quer significar um polinucleótido possuindo uma estrutura de suporte linear, com uma multiplicidade de cadeias laterais que se estendem a partir da estrutura de suporte.

Um nucleótido multifuncional ou modificado quer significar um monómero de nucleótido que pode ser incorporado, de forma estável, num polinucleótido possuindo um grupo funcional adicional (de preferência uma citosina na qual a posição 4 foi modificada de modo a proporcionar um grupo funcional hidroxi), ao qual um nucleótido pode ser ligado covalentemente para formar uma cadeia lateral.

Uma molécula de ligação clivável quer significar uma molécula que pode ser incorporada de forma estável numa cadeia polinucleotidica, e que inclui uma ligação covalente que pode ser quebrada ou clivada por tratamento quimico, ou por tratamento fisico, tal como irradiação.

Um multimero de amplificação quer significar um polinucleótido que é capaz de se hibridizar directamente ou indirectamente com um ácido nucleico a analisar e com uma multiplicidade de sondas marcadas.

Caracterização as Grandes Polinucleótidos com

Ramificações de Tipo Pente

Os multimeros polinucleotidicos do invento são compostos por uma estrutura linear de suporte, e por cadeias laterais pendentes. A estrutura linear de suporte inclui um segmento que proporciona um local especifico de hibridização para o ácido nucleico a analisar, ou para um ácido nucleico ligado ao produto a analisar; enquanto que as cadeias laterais pendentes incluem repetições de um segmento que proporcionam locais específicos de hibridização para uma sonda marcada.

As formas de realização preferidas para estes multimeros polinucleotidicos de tipo pente podem ser representadas pela seguinte fórmula esquemática:

3' S----(XS')_m----(R)_n----S----A 5'

S''' (R)n

E

I

L em que S é um primeiro segmento espaçador com pelo menos cerca de 15 nucleótidos, de preferôncia cerca de 15 a 50 nucleótidos, X é um nucleótido multifuncional que proporciona um local de ramificação, S' é um segmento espaçador no local de ligação, possuindo de 0 a cerca de 15 nucleótidos, de preferência 0 a 10 nucleótidos, m é um indice igual ou superior a 15, preferencialmente no intervalo de 15 a 100, R é uma molécula de ligação clivável, n é 0 ou 1, S'' é um segundo segmento espaçador com cerca de 0 a 10 nucleótidos, de preferência 5 a 10 nucleótidos, A é um segmento capaz de se hibridizar especificamente com um ácido nucleico a analisar ou com um ácido nucleico ligado ao produto a analisar, S''' é um terceiro segmento espaçador com 0 a 10 nucleótidos, E é uma extensão oligonucleotidica com 5 a 10 nucleótidos e L é um segmento contendo 2 a 10 repetições, de preferência 3 a 6 repetições, de uma sequência nucleotidica capaz de se hibridizar, especificamente, com uma sonda oligonucleotidica marcada.

A estrutura de suporte completa do multimero, ou a sua porção compreendida entre S e S'^r, inclusivé, e a porção da cadeia lateral excluindo L serão tipicamente sintetizadas por via quimica sob a forma de uma unidade integral, usando um equipamento e princípios quimicos convencionais de sintese automatizada de oligonucleótidos em fase sólida. Neste âmbito, o segmento espaçador S serve para fazer o espaçamento entre a porção da molécula que contém os locais de ramificação e a fase sólida (a extremidade 3' de S está ligada à superfície da fase sólida).

Os nucleótidos modificados, ou monómeros de ramificação, designados por X na fórmula acima, são nucleótidos multifuncionais nos quais um grupo funcional é usado para extensão da cadeia lateral e os outros são usados para as ligações da estrutura de suporte. Exemplos de nucleótidos multifuncionais são descritos no Pedido de Patente Europeia com o No. 883096976 (correspondente à Patente norte-americana com o No de série 340.031), a qual é aqui incorporada para referência. Estes nucleótidos modificados possuem de preferência a fórmula:

Cadeia lateral (1) (2)

Estrutura de suporte

R³

Estrutura de suporte

4 em que R é um hidrogénio, metilo, I, Br ou P, R’ é um hidrogénio ou metilo, Z é seleccionado a partir do grupo consistindo em 0 (2) II (D —(CHj) _x—NH —C —O- ;

(2) II ω —(CH.) _x—NH —C — (CHj) _y-0(2) || Π) — (CH₂) —NH —C —(CH₂) y —s —S -(CHn) _y-0- ;

<2) (l) —lCH₂) x —09 ί

em que x e y podem ser iguais ou diferentes e são Índices no intervalo de 1 a 8, inclusivé (as designações (1) e (2), no ponto de ligação Z, indicam a orientação da porção Z de ligação).

Tal como indicado, o segmento de espaçamento S' é opcional e pode ser usado, se desejado, para fazer o espaçamento entre cada local de ramificação e os locais de ramificação flanqueadores precedentes/subsequentes, ou para fazer o espaçamento entre uma série de locais de ramificação adjacentes e uma série de locais de ramificação flanqueadores. 0 segundo segmento espaçador S é também opcional e pode ser usado para fazer o espaçamento entre a porção ramificada da molécula e o segmento A, ao qual o produto a analisar se ligará por fim. Verificou-se que um tal espaçamento melhorava a ligação entre o produto a analisar e o multimero. Da mesma forma, o terceiro segmento espaçador S''' é opcional. Este é preferencialmente constituído por poliT.

segmento A possui uma sequência e extensão que lhe permite ligar-se especificamente e de forma estável ao produto a analisar ou ao ácido nucleico ligado ao produto a analisar. De forma a atingir uma tal especificidade e estabilidade, o segmento A terá normalmente 15 a 50, de preferência 15 a 30, nucleótidos de extensão, e possuirá um conteúdo em GC dentro do intervalo de 40% a 60%. 0 comprimento e sequência específicos deste segmento t

variarão, como é evidente, consoante o ácido nucleico com o qual é pretendida a sua hibridizaçâo.

segmento E é uma extensão da cadeia lateral que é quimicamente sintetizada utilizando equipamento e técnicas de sintese automatizada de oligonucleótidos em fase sólida. Este

segmento possui tipicamente cerca de 5 a 10 nucleótidos de extensão e funciona como um local ao qual pode ser ligado, por via enzimática, o segmento L.

segmento L compreende repetições de uma unidade oligomérica capaz de se hibridizar especificamente, e de forma estável, com uma sonda oligonucleotidica marcada. Estas unidades têm também tipicamente 15 a 150, de preferência 20 a 120, nucleótidos de extensão, e possuem um conteúdo em GC dentro do intervalo de 40% a 60%. Cada segmento L conterá normalraente 2 a 10 repetições da unidade, preferencialmente 3a 6 repetições. Algumas cadeias laterais poderão não incluir um segmento L. Normalmente, pelo menos cerca de 50% das cadeias laterais, de preferência pelo menos cerca de 70% das cadeias laterais, incluirão um segmento L.

As moléculas de ligação cliváveis (R) na estrutura de

I suporte e/ou nas cadeias laterais são preferenciais. Elas proporcionam locais seleccionáveis, de forma a que amostras do grande polinucleótido de tipo pente possam ser clivadas para fins de análise e caracterização. Neste âmbito, é preferido que existam locais de clivagem em cada cadeia lateral'e um local de clivagem na extremidade 5' do local de ramificação mais próximo da extremidade 5' do conjunto. Exemplos de moléculas de ligação cliváveis que podem ser incorporados nos polinucleótidos são apresentados no Pedido de Patente Europeia No. 883096976 e nos Exemplos abaixo.

opcionais, mas de clivagem

Sintese de Grandes Multlmeros Ramificados de Tipo Pente

Os polinucleótidos do invento são estruturados utilizando uma combinação de síntese directa de oligonucleótidos em fase sólida e de métodos de ligação enzimática.

A estrutura de pente, que inclui o espaçador 3' (S), locais de ramificação (X), opcionalmente os segmentos S', S'' e S''', o segmento A, opcionalmente as desejáveis moléculas de ligação (R) e a extensão de cadeia lateral E, é sintetizada recorrendo a técnicas de síntese automatizada de oligonucleótidos em fase sólida. Uma fase sólida preferida consiste em vidro de poro controlado, com uma dimensão de poro de pelo menos 2000 Ã. Neste processo de síntese, o segmento espaçador S cresce a partir da fase sólida. Por conveniência, este segmento é poliT. Os nucleótidos multifuncionais que proporcionam os locais de ramificação são então adicionados à cadeia, com ou sem nucleótidos intervenientes como espaçadores entre os locais de ramificação. São usados grupos protectores ou bíoqueadores ortogonais nos nucleótidos modificados, de forma a que o grupo protector, que permite a extensão da estrutura de suporte, possa ser removido sem que seja afectado o grupo protector que permite a extensão da cadeia lateral.

Exemplos de grupos protectores apropriados são igualmente descritos no Pedido de Patente Europeia No 883096976. De preferência, o dimetoxitritilo (DMT) é usado como um grupo bloqueador ao nivel da porção açúcar do nucleótido. O levulinilo ou um grupo antraquinolilo com a seguinte fórmula:

em que o R' é um hidrogénio, um grupo arilo ou aralquilo, os Rq podem ser idênticos ou diferentes, e sao seleccionados a partir do grupo que consiste em amino, nitro, halo, hidroxilo, alquilo inferior, e alcoxi inferior; os Rj podem ser idênticos ou diferentes, e são seleccionados a partir do grupo que consiste em amino, nitro, halo, hidroxilo, alquilo inferior, e alcoxi inferior; i é igual a 0, 1, 2 ou 3; e j é igual a 0, 1, 2, 3 ou 4, eé preferencialmente usado como um grupo bloqueador na porção hidroxilo dos nucleótidos modificados. Após ter sido incorporado o número desejado de locais de ramificação, a extremidade 5' da molécula é acrescentada com os segmentos S'' (opcional) e A, ou simplesmente com um pequeno segmento S'^f (5 a 10 nucleótidos) que proporciona um local para a ligação enzimática do segmento A a esse nivel. Tal como acima indicado, um local seleccionado de clivagem é preferencialmente incorporado na extensão. Se o segmento A for sintetizado directamente e não adicionado por ligação, deve ser usado um grupo protector, tal como o 2-metilantraquinolilo, o qual pode ser selectivamente removido sem que o resto da molécula seja adversamente afectado, para proteger os locais de inserção das cadeias laterais dos nucleótidos modificados.

Após a extremidade 5' da estrutura em pente ter sido acrescentada como desejado, são removidos os grupos que protegem a porção hidroxilo dos nucleótidos modificados, e os locais de ramificação são simultaneamente acrescentados, de preferência com a inclusão de um local de clivagem seleccionável, de forma a que cada local de ramificação possua, pelo menos, a extensão de 5 a 10 nucleótidos (E) que funciona como um local de ligação.

Os segmentos L (e, se não directamente sintetizado, o segmento A também) são então ligados às extensões das cadeias laterais através da adição de ligase T4 e de moldes apropriados de ligação. Os segmentos A e L, e os moldes, podem igualmente ser sintetizados utilizando técnicas e equipamento para sintese automatizada de oligonucleótidos em fase sólida.

Ensaios de Hibridização

Em ensaios de hibridização de ácidos nucleicos, o grande multimero de tipo pente do invento é ligado ao ácido nucleico a analisar ou a um oligonucleótido de cadeia simples ligado ao produto a analisar. Uma vez que o multimero inclui um grande número (20 ou mais) de repetições de uma sequência, que estão disponíveis para hibridização especifica com o oligonucleótido marcado, podem ser ligados ao produto a analisar um número maior de grupos marcados do que em procedimentos anteriores. 0 grande número de grupos marcados diminui o limiar de detecçâo do produto a analisar.

Os multimeros podem ser usados em essencialmente qualquer um dos formatos conhecidos de hibridização de ácidos nucleicos, tais como aqueles nos quais o produto a analisar é directamente ligado a uma fase sólida, ou hibridizações em sandwich nas quais o produto a analisar é ligado a um oligonucleótido, o qual é por sua vez ligado a uma fase sólida. Este último método é particularmente útil no âmbito dos formatos de ensaio de hibridização em sandwich em fase de solução, descritos no Pedido de Patente Europeia No. 883096976.

Em tais ensaios de hibridização em sandwich em fase de solução, o multimero é usado como se segue. 0 ácido nucleico de cadeia simples a analisar é incubado, sob condições de hibridização, com um excesso de dois conjuntos de sondas de ácido nucleico de cadeia simples: (1) um conjunto de sondas de captura, cada qual possuindo uma primeira sequência de ligação, complementar ao produto a analisar, e uma segunda sequência de ligação, complementar a um oligonucleótido de cadeia simples ligado a uma fase sólida, e (2) um conjunto de sondas de amplificação, cada qual possuindo uma primeira sequência de ligação, capaz de se ligar especificamente ao produto a analisar, e uma segunda sequência de ligação, capaz de se ligar especificamente ao segmento A do multimero. Graças à utilização de uma sonda de amplificação, o multimero pode ser concebido para ser um reagente universal, e não será necessário produzir diferentes multimeros para cada produto a analisar. 0 produto resultante é um complexo de ácido nucleico com três componentes, formado pelas duas sondas hibridizadas com o produto a analisar, através das suas primeiras sequências de ligação. As segundas sequências de ligação das sondas permanecem como caudas de cadeia simples, dado que não são complementares ao produto a analisar.

Este complexo é então adicionado, sob condições de hibridização, a uma fase sólida possuindo um oligonucleótido de cadeia simples a ela ligado, que é complementar à segunda sequência de ligação da sonda de captura. 0 produto resultante compreende o complexo ligado à fase sólida através do duplex formado pelo oligonucleótido ligado à fase sólida e pela segunda sequência de ligação da sonda de captura. A fase sólida com o complexo ligado é então separada dos materiais não ligados.

grande multimero de amplificação de tipo pente é

então adicionado ao complexo fase sólida-produto a analisarsonda, sob condições de hibridização, para permitir que o multimero se hibridize com a disponível segunda sequência de ligação da sonda amplificadora do complexo. 0 complexo resultante em fase sólida é então separado, por lavagem, de qualquer multimero não ligado. 0 oligonucleótido marcado ê então adicionado, sob condições que permitem a sua hibridização com as unidades de oligonucleótido nas cadeias laterais do multimero. 0 resultante complexo de ácido nucleico marcado em fase sólida é então separado do excesso de oligonucleótido marcado, através de lavagem para remoção do oligonucleótido marcado não ligado, e é submetido a leitura.

Os ácidos nucleicos a analisar podem provir de uma variedade de fontes, e.g., sólidos ou fluidos biológicos, materiais alimentares, materiais ambientais, etc., e podem ser preparados para a análise por hibridização através de uma variedade de meios, e.g., proteinase K/SDS, sais caotrópicos, etc. Da mesma forma, pode revelar-se vantajosa a diminuição da dimensão média dos ácidos nucleicos a analisar através de meios enzimáticos, fisicos ou quimicos, e.g., enzimas de restrição, sonicaçâo, degradação quimica (e.g., iões metálicos), etc. Os fragmentos podem ser tão pequenos como 0,1 kb, possuindo geralmente pelo menos 0,5 kb, e podem possuir 1 kb ou mais. A sequência a analisar é proporcionada na forma de cadeia simples para análise. No caso de a sequência se encontrar naturalmente presente sob a forma de cadeia simples, não será necessária a desnaturação. Contudo, no caso de a sequência se encontrar presente sob a forma de cadeia dupla, a sequência será desnaturada. A desnaturação pode ser efectuada através de diversas técnicas, tais como o uso de bases, geralmente com cerca de 0,05 a 0,2 M de hidróxido, formamida, sais, calor, ou combinações destes.

As primeiras sequências de ligação da sonda de captura e da sonda de amplificação, que são complementares à sequência do produto a analisar, terão cada uma, pelo menos, 15 nucleótidos, habitualmente pelo menos 25 nucleótidos, e não mais do que cerca de 5 kb, habitualmente não mais do que 1 kb, de preferência não mais do que cerca de 100 nucleótidos. Tipicamente, terão aproximadamente 30 nucleótidos. Normalmente, serão escolhidas para ligar a diferentes sequências do produto a analisar. As primeiras sequências de ligação podem ser seleccionadas com base numa variedade de considerações. Dependendo da natureza do produto a analisar, poder-se-á estar interessado numa sequência de consenso, uma sequência associada com polimorfismos, um genotipo ou fenotipo particular, uma cadeia particular, ou semelhantes.

Através de apropriada selecçâo das primeiras sequências de ligação das sondas de amplificação e captura, estas podem ser usadas para identificar uma molécula especifica de ácido nucleico que inclua um gene particular ou outra sequência que esteja presente como parte de diferentes moléculas de ácido nucleico. De modo a discriminar a molécula de ácido nucleico com interesse, das outras moléculas que também contêm a sequência dada, uma das sondas é escolhida como complementar da sequência dada, enquanto que outra é escolhida como complementar de outra sequência da molécula, sendo essa sequência única para essa molécula (i.e., não está presente nas outras moléculas que contêm a sequência dada).

As segundas sequências de ligação da sonda de captura e da sonda de amplificação são escolhidas como complementares, respectivamente, do oligonucleótido ligado à fase sólida e do segmento A do multimero, e de modo a que não sejam retidas por sequências endógenas na amostra/produto a analisar. A segunda sequência de ligação pode ser contígua à primeira sequência de ligação, ou estar espaçada desta através de uma sequência intermédia nâo-complementar. Se desejado, as sondas podem incluir outras sequências nâo-complementares. Estas sequências nãocomplementares não devem impedir a ligação das sequências de ligação, ou causar a ocorrência de ligações não-especificas.

A sonda de captura e a sonda de amplificação podem ser preparadas através de procedimentos de sintese de oligonucleótidos, ou por clonagem, sendo preferencial o primeiro destes processos.

Será apreciado que as sequências de ligação não necessitam de ter complementaridade perfeita para proporcionar homoduplexes. Em muitas situações, serão suficientes heteroduplexes, quando menos de cerca de 10% das bases não estão emparelhadas, ignorando segmentos não emparelhados de cinco ou mais nucleótidos. Concordantemente, o termo complementar, tal como aqui usado, quer significar um grau suficiente de complementaridade para proporcionar uma estrutura duplex estável.

A fase sólida que é usada no ensaio pode ser particulada ou ser a superfície da parede sólida de qualquer de uma variedade de reservatórios, e.g., tubos de centrifugação, colunas, cúpulas de placas de microtitulaçâo, filtros, tubos, etc. Quando são usadas partículas, estas terão, de preferência, um tamanho na gama de cerca de 0,4 a 200 μιη, mais habitualmente na gama de cerca de 0,8 a 4,0 μιη. As partículas podem ser de qualquer material conveniente, como latex, ou vidro. As placas de microtitulaçâo constituem uma superfície sólida preferida. O oligonucleótido, que é complementar à segunda sequência de ligação da sonda de captura, pode ser ligado de forma estável à superfície sólida através de grupos funcionais, usando procedimentos conhecidos.

Será apreciado o facto de se poder substituir a segunda sequência de ligação da sonda de captura e o oligonucleótido ligado à fase sólida por um par ligando-receptor adequado, que forme uma ligação estável entre a fase sólida e a primeira sequência de ligação da sonda de captura. Exemplos de tais pares são biotina/avidina, tiroxina/globulina de ligação à tiroxina, antigénio/anticorpo, carbohidrato/lectina, e semelhantes.

oligonucleótido marcado incluirá uma sequência complementar das unidades oligonucleotidicas nas cadeias laterais do multimero. O oligonucleótido marcado incluirá uma ou mais moléculas (marcadores), que directa ou indirectamente proporcionam um sinal detectável. As moléculas marcadoras podem ser ligadas a membros individuais da sequência complementar, ou podem estar presentes como membros de terminação ou como cauda de terminação possuindo uma multiplicidade de marcadores. Encontramse descritos na literatura vários meios para proporcionar marcadores ligados à sequência complementar. Veja-se, por exemplo, Leary et al, Proc.Nat.Acad.Sci.USA (1983) 80:4045; Renz

subunidades

Marcadores e Kurz, Nucl.Acids Res. (1984) 12:3435; Richardson e Gumport, Nucl.Acids Res. (1983) 11:6167; Smith et al., Nuc1.Ac ids Res.

(1985) 13:2399; Meinkoth e Wahl, Anal.Biochem. (1984) 138:267. Os marcadores podem ser ligados quer covalentemente, quer nâocovalentemente à sequência complementar. Os marcadores que podem ser empregues incluem núcleos radioactivos, fluorescentes, quimioluminescentes, corantes, enzimas, substratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inibidores enzimáticos, enzimáticas, iões metálicos, e semelhantes, específicos ilustrativos incluem fluoresceina, rodamina, vermelho de Texas, ficoeritrina, umbeliferona, luminol, NADPH, α-βgalactosidase, peroxidase de rábano, etc.

A relação de sonda de captura e sonda de amplificação para o número antecipado de moles do produto a analisar deve ser pelo menos estequiométrica, e de preferência em excesso. Esta relação é preferencialmente de pelo menos cerca de 1,5:1 e, mais preferencialmente, pelo menos 2:1. Normalmente estará no intervalo de 2:1 a 10.000:1. As concentrações de cada uma das —10 “6 sondas estarão geralmente no intervalo de cerca de 10” a 10 M, com concentrações de ácido nucleico na amostra variando entre 10” 21 -12 a 10 M. 0 tempo necessário para realizar os passos de hibridização do ensaio estará geralmente no intervalo de cerca de 10 min a 2 h, estando os ditos passos completos frequentemente em cerca de 1 h. A hibridização pode ser levada a cabo a uma temperatura ligeiramente elevada, geralmente no intervalo de cerca de 20°C a 80°C, mais habitualmente no intervalo de cerca de 35°C a 70°C, particularmente a 65°C.

A reaeção de hibridização é geralmente realizada em

meio aquoso, particularmente num meio tampão aquoso, o qual pode incluir vários aditivos. Os aditivos que podem ser empregues incluem baixas concentrações de detergente (0,1 a 1%), sais, e.g, citrato de sódio (0,017 a 0,17 Μ), Ficoll, polivinilpirrolidina, ácidos nucleicos de transporte, proteínas de transporte, etc. Podem ser adicionados ao meio aquoso solventes não-aquosos, tal como dimetilformamida, dimetilsulfóxido, álcoois, e formamida. Estes outros solventes estarão presentes em quantidades no intervalo de 2 a 50%.

A consistência do meio de hibridizaçâo pode ser controlada através da temperatura, concentração de sais, sistema de solventes, e semelhantes. Desta forma, dependendo do comprimento e natureza da sequência com interesse, poderá ser variada a consistência.

O procedimento usado nos passos de separação do ensaio poderão variar, dependendo da natureza da fase sólida. Para particulas, a separação será proporcionada por centrifugação ou filtração, rejeitando o sobrenadante ou isolando o sobrenadante. Nos casos em que é feito o ensaio com particulas, estas serão lavadas abundantemente, habitualmente de 1 a 5 vezes, com um meio tampão apropriado, e.g., PBS contendo um detergente como o SDS. Quando o meio de separação é uma parede ou suporte, o sobrenadante pode ser isolado ou rejeitado, e a parede pode ser lavada da mesma forma que o indicado para as particulas.

Dependendo da natureza dos marcadores, podem ser usadas diversas técnicas para a detecção da presença do marcador. Para marcadores que exibem fluorescência, encontram-se disponíveis um grande número de diferentes fluorómetros. Para marcadores

fluorescente, determinação quimioluminescentes, encontram-se disponíveis luminómetros ou filmes. Com enzimas, pode ser proporcionado um produto quimioluminescente, ou possuindo cor, e a pode ser feita fluorometricamente, luminometricamente, espectrofotometricamente, ou visualmente. Os vários marcadores que têm sido empregues em imunoensaios e as técnicas aplicáveis a imunoensaios podem ser empregues nos ensaios em questão.

Num ensaio de hibridizaçâo no qual o ácido nucleico a analisar está directamente ligado a uma fase sólida, tal como um ensaio de tipo dot blot, o multimero é hibridizado directamente com o produto a analisar ligado. Nestas circunstâncias, o segmento A do multimero é complementar de uma sequência do produto a analisar e as unidades oligonucletidicas nas cadeias laterais são complementares de um oligonucleótido marcado. 0 multimero não-ligado é removido da fase sólida e o oligonucleótido marcado é então hibridizado com o complexo produto a analisar ligado-multimero. 0 excesso de oligómero marcado é removido e é lido o complexo ligado e marcado.

Os multimeros podem também ser usados noutros ensaios tais como imunoensaios directos, indirectos, e em sandwich. Nestas circunstâncias, o reagente que desempenha o papel do anticorpo marcado, ou de outro ligando que é ligado directa ou indirectamente ao produto a analisar, possui um oligonucleótido que é complementar do segmento A do multimero que lhe está ligado, em vez de um marcador. Por exemplo, num imunoensaio em sandwich, para um antigénio no produto a analisar, a amostra a analisar é incubada com uma fase sólida à qual é ligado um primeiro anticorpo do antigénio. A amostra não ligada é removida da fase sólida e um segundo anticorpo do antigénio, ao qual está ligado um oligonucleótido complementar de uma unidade do multimero, reage com o complexo ligado para formar um complexo com 3 membros. A seguir à remoção do excesso do segundo anticorpo, o multimero é então hibridizado ao complexo através do oligonucleótido ligado ao segundo anticorpo. 0 excesso de multimero é removido e é hibridizado um oligonucleótido marcado às outras unidades oligonucleotidicas do multimero. Após remoção do excesso de oligonucleótido marcado, o complexo é submetido a leitura.

Os kits para realizar os ensaios amplificados de hibridização de ácidos nucleicos, de acordo com o invento, compreenderão numa embalagem combinada os seguintes reagentes: o multimero; um oligonucleótido marcado apropriado; uma fase sólida com capacidade de ligação ao produto a analisar; opcionalmente, uma sonda de captura se, no formato de ensaio, o produto a analisar está ligado à fase sólida através de um oligonucleótido intermédio ou outro ligando; e opcionalmente, uma sonda de amplificação se, no formato de ensaio, o multimero não está hibridizado directamente ao produto a analisar. Estes reagentes encontrar-se-ão tipicamente em recipientes separados no kit. 0 kit pode também incluir um reagente de desnaturação para desnaturar o produto a analisar, tampões de hibridização, soluções de lavagem, substratos enzimáticos, controlos positivos e negativos, e instruções escritas para a realização do ensaio.

Os exemplos seguintes do invento são fornecidos como um modo de ilustrar o invento, e não devem ser tomados como limitativos do mesmo.

Exemplo 1

Este exemplo ilustra a sintese de um polinucleótido com ramificações de tipo pente possuindo 15 locais de ramificação e extensões de cadeia lateral possuindo 3 locais de ligação de sonda marcada. Este polinucleótido foi concebido para ser usado numa hibrizidaçâo em fase de solução, tal como descrito no Pedido de Patente Europeia No. 883096976.

Todas as sinteses quimicas de oligonucleótidos foram realizadas num sintetisador automático de DNA (Applied

Biosystems, Inc., (ABI) modelo 380 A/B). Foi usada nas reacções quimicas fosforamidite do tipo metoxi, excepto para a fosforilação da extremidade 5' em que foi empregue reagente TM

Phostel (ABN). Foram usados protocolos padrão da ABI, excepto quando indicado. Quando está indicado que foi usado um múltiplo de um ciclo (e.g., 1.5 x ciclo, 4.5 x ciclo), foi empregue, no ciclo especificado, o múltiplo da quantidade padrão de amidite recomendada pela ABI. Encontram-se aqui apensos os programas para realizar os ciclos 0.4, 1.5, 4.5, a CAP-PRIM, tal como aplicados no Sintetisador de DNA modelo 380 A/B da Applied Biosystems.

Foi primeiro preparado um corpo do tipo pente com a seguinte estrutura:

3'T₂0-Xl5(GTCAGTp5')₁₅-(GTTTGTp-5')]_ em que X é um nucleótido modificado, tal como previamente descrito.

A porção do corpo do tipo pente através das 15 repetições é primeiro sintetisado usando 40 mg de vidro de poro controlado (CPG) por timidina (3000 Agnstrom, 3 iimoles de timidina por grama de suporte) com um protocolo de 1,5 x ciclo, 0 nucleótido do local de ramificação tinha a fórmula:

estrutura de suporte em que R representa

(MAC) seguir se descreve. A uma solução de N-4-(6-hidroxihexil)-5'-DMT5-metil-2'desoxicitidina (17 mmole), preparada como previamente descrito (Horn e Urdea, NAR vol. 17:17, pág. 6959-6967 (1989)), em 200 ml de cloreto de metileno, foi adicionada piridina (40 mmole) e a mistura foi arrefecida a 0^QC. Foi adicionada gota-agota uma solução de 2-antraquinonametoxicloroformato (MAC-C1) (20 mmole) em 200 ml de CH2CI2 θ fez-se a agitação da solução durante 10 min. Uma análise por TLC (placas de silica reveladas com 10% de metanol/CH2Cl2) mostrou que o material inicial tinha sido completamente consumido. A mistura de reacção foi diluida com 400 ml de acetato de etilo e a fase orgânica foi extraida com 2 x 300 ml 5% de NaHCo3 e 80% NaCl aquoso saturado. Após secagem da fase orgânica em Na2SC>4 durante 30 minutos, seguida por filtrâçâo, o solvente foi removido em vácuo. 0 produto foi purificado por cromatografia em silica gel usando um gradiente de metanol (0-6%) em CH2C12, obtendo-se 13 g de produto puro (85% de rendimento).

Foi preparada uma solução 0.1 molar de 2(hidroximetil)-antraquinona (MAQ-OH) dissolvendo 25 mmole (5.95 g) em 250 ml de dioxano. A solução amarela foi filtrada e o solvente foi removido por evaporação para remover água. O residuo foi redissolvido em 200 ml de dioxano e foi adicionada piridina (2 ml; 25 mmole). Esta solução foi adicionada gota-a-gota a uma solução submetida a agitação de trisfogénio (2.5 g; 25 Meq) em 50 ml de CH2CI2· No final da adição a solução foi agitada a 20°C durante 18 h. A mistura foi diluida com 800 ml de acetato de etilo e a fase orgânica foi lavada com 3 x 60 ml de solução aquosa saturada de NaCl a 80%. Após secagem da fase orgânica sobre Na2SO4, o solvente foi removido em vácuo para dar um sólido amarelo, o qual foi dissolvido em CH2CI2 (250 ml; 0.1 M). Esta solução foi usada sem purificação posterior.

O nucleósido N-4-(0-antraquinonametoxicarbonilo-6oxiexilo)-5'-DMT-5-meti1-2'-desoxicitidina (14.4 mmole) foi dissolvido em CH2CI2 (50 ml) contendo 70 mmole de DiPEA. Após arrefecimento a 0°C, foi adicionado N,Ndiisopropilaminometoxiclorofosfina (2.72 ml; 14 mmole). 0 agente de fosfitilaçâo foi adicionado em pequenas porções até ter sido consumido 95% do material inicial. A mistura de reacção foi então diluida com acetato de etilo (300 ml), extraída com 2 x 300 ml de NaHCO3 a 5%, depois 2 x 300 ml de solução aquosa saturada de NaCl a 80%, e finalmente seca sobre Na2SC>4 sólido. O solvente foi removido em vácuo.

A fosforadimite não purificada foi purificada por cromatografia com silica gel, A fosforamidite purificada foi dissolvida em tolueno e adicionada, agitando rapidamente, a 800 ml de hexanos arrefecidos (-50°C). O precipitado resultante foi recolhido rapidamente por filtraçao, e seco em alto vácuo durante 18 h, obtendo-se 12,4 g (4,5 mmole, 80% de rendimento) de um produto sólido ligeiramente amarelo. A desprotecção do nucleótido protegido por MAC é efectuada através de tratamento com ditionite de sódio sob condiçOes neutras.

Para a sintese do corpo de tipo pente (nao incluindo as cadeias laterais), a concentração dos monómeros de metilfosforamidite é de 0,1 M para A, C, G e T, 0,15 M para o monómero X do local de ramificação, e 0,2 M para o reagente TM

Phostel . A destritilaçao foi efectuada com 3% de ácido tricloroacético em cloreto de metileno usando um fluxo continuo de reagente ao longo do processo de desprotecção. No final, a DMT da extremidade 5' foi substituída com um grupo acetilo.

Foram sintetisadas 6 extensões da cadeia de base com a fórmula 3'-GTCAGTp em cada monómero de local de ramificação, como 2 a seguir se descreve, A remoção do grupo protector de base (R na fórmula acima) foi realizada manualmente, retendo o suporte CPG na mesma coluna usada para sintetisar o corpo de tipo pente. No 2 caso em que R =levuninilo, é introduzida uma solução de hidrato de hidrazina 0,5 M em piridina/ácido acético glacial (1:1 v/v), e mantida em contacto cora o suporte de CPG durante 90 min, com renovação do liquido cada 15 min. Após lavagem extensiva com piridina/ácido acético glacial (4:1 v/v), seguida por acetonitrilo, os filtros na coluna sao substituídos. No caso em 2 que R =2-metilantraquinolilo, é introduzida uma solução de ditionito de sódio (1 g de ditionito de sódio dissolvida em 20 ml de bicarbonato de trimetilamónio 1 M), seguida por adição de 20 ml de dioxano, e mantida em contacto com o suporte de CPG durante 90 min. Após a desprotecção, as seis cadeias básicas laterais de extensão foram adicionadas usando 4,5 x ciclo e concentrações de monómero de 0,2 M.

Nestas sinteses a concentração dos monómeros é 0,2 M (incluindo R e o reagente Phostel ). A destritilaçao é efectuada com uma solução de 2,5% de ácido dicloroacético em tolueno/30% ácido tricloroacético em cloreto de metileno (1:1 v/v), usando adição continua de reagente. Os grupos de protecção foram removidos como se segue. Os grupos protectores fosfato foram removidos do fragmento de produto ligado ao suporte sólido através de tratamento do CPG com uma solução de tiofenol/trietilamina/acetonitrilo (1:1:2 v/v) durante lha 20°C seguido por lavagens com acetonitrilo (10x1 ml) e metanol, 0 fragmento de produto foi removido do suporte de CPG por tratamento com 0.5 ml de hidróxido de amónia concentrado, durante 20 min, e o sobrenadante foi removido. 0 tratamento foi repetido duas vezes para um total de 1 h de exposição. 0 sobrenadante combinado foi transferido para um vaso com tampa roscável e aquecido a 60°C durante 18 h. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, o solvente foi removido num evaporador Speed-Vac e o residuo foi dissolvido em 100 μΐ de água.

Foram também realizadas, usando o sir.tetisador automático, as extensões 5' da estrutura de suporte (segmento A), extensões de cadeia lateral e moldes de ligação/linkers, com as seguintes estruturas:

extensão 5' da estrutura de suporte extensão de cadeia lateral

3'-AGGTGCTCCGTATCCTGGGCACAG-5'

3'-GATGCGR(TTCATGCTGTTGGTGTAG)3-5' molde de ligaçao para ligar a extensão 5' da estrutura de suporte 3'-GCACCTACAAAC-5' molde de ligaçao para ligar a extensão de cadeia lateral 3'-CGCATCACTGAC-5'

R na extensão de cadeia lateral representa o seguinte linker de clivagem seleccionável!

em que DMT representa dimetoxitrilo, Bz representa benzoilo, R representa metilo ou β-cianoetilo, e iPr representa isopropilo.

A clivagem ao nivel de R é conseguida através de um procedimento quimico em dois passos: (1) oxidação ...com NaI04 durante 1 hr, seguida por (2) tratamento com n-propilamina, corpo de tipo pente não purificado foi purificado por um método padrão de gel de poliacrilamida (10% com ureia 7 M).

A extensão 5' da estrutura de suporte e as cadeias laterais, foram ligadas ao corpo de tipo pente, usando um

A extensão 5' da estrutura de suporte e as cadeias laterais, foram ligadas ao corpo de tipo pente, usando um protocolo padrão de ligase T4 (Urdea (1987) Methods in Enzymol. 146:22-41), excepto o facto de ter sido usado um tempo de reacção superior (> 8 h), temperatura ambiente, e 14% de polietilenoglicol.

Após ligação e purificação, uma porção do produto foi 32 marcada com P e submetida aos passos de clivagem acima descritos. A amostra foi então analisada por PAGE, para determinar o número de extensões de cadeia lateral incorporadas, através da contagem do número de bandas no gel. Determinou-se que o produto possuia um total de 24 locais de ligação de sonda marcada.

Exemplo 2

Este exemplo ilustra a preparação do mesmo multimero que o exemplo 1, usando um CPG com poro de tamanho médio e carregamento superior, que é inicialmente ajustado para um nivel adequado. A sintese primária foi realizada partindo de 30 mg de timidina em suporte de CPG (1000 Ã; 20 mmoles de timidina por grama de suporte). Os primeiros 20 ciclos de acoplamento com T foram realizados com 0,4 x ciclo para diminuir o carregamento abaixo de cerca de 10 mmoles por grama de suporte. A isto seguiram-se 20 ciclos de acoplamento com T, 15 ciclos com X (nucleótido modificado), e finalmente incorporação da sequência 3'-GTTTGTGGp usando 1,5 x ciclo. 0 grupo terminal 5'-DMT foi removido e a sequência foi provida de um cap usando o programa de ciclo CAP-PRIM na máquina ABI. A coluna foi removida da

máquina e as manipulações seguintes foram realizadas manualmente. A remoção dos grupos protectores levulinato dos pontos de ramificação foi realizada tal como acima descrito, e o suporte CPG resultante foi transferido para uma nova coluna ABI. A extensão de cadeia lateral foi realizada tal como acima descrito para incorporar a sequência 3'-GTCAGTp usando 4,5 x ciclo. Os grupos protectores foram removidos tal como descrito no exemplo 1 (ver acima) e o produto não purificado foi dissolvido em 100 μΐ de água.

A ligação dos grupos A e L foi realizada tal como no

Exemplo 1.

Exemplo 3

O polinucleótido de tipo pente ramificado em 24 locais do Exemplo 1 foi usado num ensaio sandwich em fase de solução, para a N.gonorrhoeae, usando sondas de captura e amplificação especificas para o gene dos pili, e como sondas marcadas tanto 32 por P como fosfatase alcalina, tal como descrito no Exemplo 5 do Pedido de Patente Europeia com o No. 883096976. Os dois tipos de marcadores foram usados para determinar se a utilização de uma estrutura de tipo pente com 24 locais, em conjunção com a utilização de fosfatase alcalina, produzia problemas estéricos. Os resultados foram comparados com os obtidos usando a estrutura de tipo pente com 5 locais, que não tinha exibido problemas de impedimento estérico.

Quando foi usada a sonda P, a molécula com 24 locais proporcionou um aumento de sinal relativo em relação à estrutura de tipo pente padrão com 5 locais de 4.76 (teóricamente 4.8; 195,000 ± 10,000 CPM versus 41,000 ± 1,200 CPM, respectivamente, a 10 attomoles). Quando foi empregue uma sonda marcada de fosfatase alcalina, a molécula com 24 locais proporcionou um aumento de sinal relativo em relação à estrutura de tipo pente padrão com 5 locais de 3.94 (50.1 ± 1.7 contagens de luz, LC, versus 12.7 ± 0.2 LC, respectivamente, a 10 attomoles). A diferença na eficiência de marcação com os dois tipos de sondas indica que o marcador enzimático está bem acomodado na estrutura de tipo pente.

Ensaios para outros ácidos nucleicos a analisar, descritos nos exemplos do pedido de patente europeia com o No. 883096976, podem ser realizados de forma semelhante.

Pretende-se que estejam no âmbito das reivindicações que se seguem as modificações dos acima descritos métodos de realização do invento que são óbvios para os especialistas nos campos de quimica de ácidos nucleicos e de hibridização de ácidos nucleicos.

Claims

reivindicações

1- Um processo de produção de um grande polintccleótido com ramificações do tipo pente, útil como um multimero de amplificação num ensaio de hibridização de ácidos nucleicos, caracterizado pelo facto de compreender:

a) a sintese de uma estrutura polinucleotidica de suporte, de cadeia simples, compreendendo:

(i) pelo menos 15 nucleótidos multifuncionais, cada um dos quais tem um grupo funcional protegido que serve como um local para a extensão de uma cadeia lateral de nucleótidos , e (ii) um primeiro segmento de local de ligação;

b) desprotecçâo dos referidos grupos funcionais;

c) extensão de cada um dos locais por, pelo menos 5 nucleótidos, para proporcionar segundos segmentos de local de ligação;

d) ligação de uma primeira unidade oligonucleotidica de cadeia simples ao primeiro local de ligação, sendo a referida primeira unidade oligonucleotidica de cadeia simples capaz de se ligar a uma primeira sequência de ácido nucleico de cadeia simples de interesse; e

e) ligação das segundas unidades oligonucleotidicas de cadeia simples aos segundos segmentos do local de ligação, compreendendo, as referidas segundas unidades oligonucleotidicas de cadeia simples, repetições de uma sequência que é capaz de se ligar a um segundo oligonucleótido de cadeia simples de interesse.
2- um processo, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto da referida sintese e extensão serem realizadas através de um processo de fase sólida, nas quais a extremidade 3' da estrutura de suporte é afixada à fase sólida, e em que a estrutura de suporte inclui uma sequência leader 3' possuindo, pelo menos cerca de 15 nucleótidos.
3- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizado pelo facto da fase sólida ser vidro com poros de dimensão controlada, possuindo os poros uma dimensão de, pelo menos, 2000 À.
4- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o referido local para a extensão nucleotidica sofrer uma extensão de 5-10 nucleótidos.
5- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o nucleótido multifuncional ter a fórmula:

estrutura

I
6- Um processo para a produção de um grande polinucleótido com ramificações do tipo pente, útil como um multimero de amplificação, num ensaio de hibridização de ácidos nucleicos, caracterizado pelo facto de compreender:

♦ (a) a sintese de uma estrutura polinucleotidica de suporte de cadeia simples, compreendendo:

(i) pelo menos cerca de 15 nucleótidos multifuncionais, cada um dos quais tem um grupo protegido multifuncional que serve como um local para a extensão de uma cadeia lateral de

I nucleótidos, e (ii) uma primeira unidade de oligonucleótido de cadeia simples que é capaz de se ligar especificamente a uma primeira sequência de polinucleótido de cadeia simples de interesse;

(b) desprotecção dos referidos grupos funcionais;

(c) extensão de cada um dos referidos locais por, pelo menos, cinco nucleótidos, para proporcionar segmentos do local de ligação; e (d) a ligação de segundas unidades de oligonucleótidos de cadeia simples aos segmentos do local de ligação, compreendendo as referidas segundas unidades oligonucleotidicas de cadeia simples, repetições de uma sequência que é capaz de se ligar a um segundo oligonucleótido de cadeia simples de interesse.
7- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o nucleótido multifuncional· ter a fórmula ‘ WíCH^-OR» estrutura Ό· t

estrutura
8- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 7, caracterizado pelo facto da referida síntese e extensão serem realizadas através de um processo de fase sólida, no qual a extremidade 3' da estrutura de suporte é afixada à fase sólida e incluindo a estrutura de suporte uma sequência espaçadora 3' de, pelo menos, 15 nucleótidos.
9- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 7, caracterizado pelo facto de a fase sólida ser vidro com poros de dimensão controlada, possuindo os poros uma dimensão de cerca de 2000 Â.
10- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 7, caracterizado pelo facto de o referido local para a extensão nucleotidica sofrer uma extensão de 5-10 nucleótidos.

Lisboa, 29 de Julho de 1991