PL169801B1 - sposób wykonania próby hybrydyzacji kwasu nukleinowego PL - Google Patents
sposób wykonania próby hybrydyzacji kwasu nukleinowego PLInfo
- Publication number
- PL169801B1 PL169801B1 PL91297659A PL29765991A PL169801B1 PL 169801 B1 PL169801 B1 PL 169801B1 PL 91297659 A PL91297659 A PL 91297659A PL 29765991 A PL29765991 A PL 29765991A PL 169801 B1 PL169801 B1 PL 169801B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- yes yes
- polynucleotide
- nucleotides
- nucleic acid
- stranded
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/682—Signal amplification
Abstract
1. Sposób wytwarzania wielkiego, rozgalezionego polinukleotydu o strukturze grzebienia, uzytecznego jako multimer amplifikacyjny w próbie hybrydyzacji kwasu nukleinowego, znam ienny tym, ze syntetyzuje sie jednoniciowy glówny lancuch polinukleotydowy zawierajacy co najmniej okolo 15 wielofunkcyjnych nukleo- tydów, z których kazdy posiada zablokowana funkcyjna grupe sluzaca jako miejsce przedluzenia nukleotydo- wego lancucha bocznego oraz segment z pierwszym miejscem ligacji, odblokowuje sie te grupy funkcyjne, przylacza sie do kazdego z tych miejsc co najmniej okolo piec nukleotydów w celu uzyskania segmentów z drugim miejscem ligacji, prowadzi sie ligacje pierwszej jednoniciowej jednostki oligonukleotydowej z pier- wszym miejscem ligacji, gdzie ta pierwsza jednoniciowa jednostka oligonukleotydowa ma zdolnosc wiazania sie z pierwsza zadana jednoniciowa sekwencja kwasu nukleinowego oraz prowadzi sie ligacje drugich jedno- niciowych jednostek oligonukleotydowych z segmentami z drugimi miejscami ligacji, gdzie te drugie jednoni- ciowe jednostki oligonukleotydowe zawieraja powtórzenie sekwencji zdolnych do wiazania sie z drugim, zadanym jednoniciowym oligonukleotydem. 11. Sposób wykonania próby hybrydyzacji kwasu nukleinowego przez poddanie analizowanego kwasu nukleinowego hybrydyzacji ze znakowana sonda kwasu nukleinowego, znam ienny tym , ze poddaje sie hybrydyzacji wielki rozgaleziony polinukleotyd o strukturze grzebienia zawierajacy polinukleotydowy lancuch glówny zlozony z co najmniej 15 wielofunkcyjnych nukleotydów, z których kazdy okresla miejsce lancucha bocznego oraz pierwszej jednoniciowej jednostki oligonukleotydowej zdolnej do specyficznego wiazania z pierwsza zadana jednoniciowa sekwencja polinukleotydowa a takze zwisajace polinukleotydowe lancuchy boczne rozciagajace sie od tych wielofunkcyjnych nukleotydów, przy czym kazdy z tych lancuchów bocznych posiada powtórzenia drugiej jednoniciowej jednostki oligonukleotydowej zdolnej do specyficznego wiazania z druga zadana, jednoniciowa sekwencja polinukleotydowa, a ogólna ilosc powtórzen we wszystkich lancuchach bocznych wynosi co najmniej okolo 20, przy czym dla polinukleotydu tego pierwszego zadana jednoniciowa sekwencje polinukleotydowa stanowi analizowany kwas nukleinowy albo polinukleotyd zwiazany z analizo- wanym kwasem nukleinowym a druga zadana jednoniciowa sekwencje polinukleotydowa stanowi znakowany polinukleotyd. PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wielkiego rozgałęzionego polinukleotydu o strukturze grzebienia i sposób wykonania próby hybrydyzacji.
Wynalazek należy do dziedziny chemii kwasów nukleinowych i badań biochemicznych. Dotyczy on zwłaszcza wielkich, rozgałęzionych polinukleotydów o strukturze grzebienia, użytecznych jako multimery amplifikacyjne w próbach hybrydyzacji kwasów nukleinowych. Hybrydyzacja kwasów nukleinowych jest powszechnie stosowana w badaniach genetycznych, badaniach biomedycznych i w diagnostyce klinicznej. W podstawowej próbie hybrydyzacji kwasu nukleinowego, jednoniciowy analizowany kwas nukleinowy poddaje się hybrydyzacji ze znakowaną sondą jednoniciowego kwasu nukleinowego, po czym wykrywa się znakowane dupleksy. W celu ułatwienia rozdzielenia tych dupleksów /poddawanych następnie detekcji/ od substancji pochodzących z zewnątrz i/lub w celu amplifikacji sygnału do detekcji, do tego podstawowego schematu wprowadzono wiele zmian. Jeden ze sposobów amplifikacji sygnału do detekcji jest opisany w publikacji europejskiego zgłoszenia patentowego nr EPA 883096976, odpowiadającego europejskiemu opisowi nr 317 077 i odpowiadającego zgłoszeniu patentowemu Stanów Zjednoczonych, numer seryjny 340 031 z dnia 18 04 89. W sposobie tym wzmacnia się sygnał przez zastosowanie multimerów amplifikacyjnych. Te multimery są polinukleotydami skonstruowanymi w ten sposób, że zawierają pierwszy segment, który hybrydyzuje specyficznie z analizowanym kwasem nukleinowym albo z nicią kwasu nukleinowego związanego z analizowaną substancją oraz powtórzenia drugiego segmentu, które hybrydyzują specyficznie ze znakowaną sondą. Teoretycznie, amplifikacja jest proporcjonalna do ilości powtórzeń drugiego segmentu. Multimery mogą być liniowe lub rozgałęzione. Opisane są tam dwa główne typy rozgałęzionych multimerów: multimery o strukturze widełkowej i o strukturze grzebienia.
Przy testowaniu tych dwu typów rozgałęzionych multimerów okazało się, że w strukturach widełkowych zawierających ponad 8 rozgałęzień występują przeszkody przestrzenne,które hamują wiązanie znakowanych sond z tymi multimerami. Z drugiej strony, struktury grzebienia nie wykazują przeszkód przestrzennych i zostały uznane za korzystny typ rozgałęzionych multimerów. Jednak niestety, wielokrotne wysiłki wytworzenia struktur grzebienia, które zawierałyby ponad 10 miejsc rozgałęzienia nie powiodły się. Nieoczekiwanie techniki rozwinięte w
169 801 przedstawionym rozwiązaniu pozwoliły na opracowanie sposobów wytwarzania wielkich multimerów o strukturze grzebienia, zawierające co najmniej 15 miejsc rozgałęzień. Te wielkie struktury grzebienia pozwalają na uzyskanie większego stopnia apmlifikacai niż to było możliwe dotychczas.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wielkiego rozgałęzionego polinukleotydu o strukturze grzebienia użytecznego jako multimer amplifikacyjny w próbie hybrydyzacji kwasu nukleinowego, polegający na tym, że syntetyzuje się jednoniciowy główny łańcuch polmukleotodowy zawierający co najmniej około 15 wielofunkcyjnych nukleotndyw, z których każdy posiada zablokowaną grupę funkcyjną służącąjako miejsce przedłużenia nukleotydowego łańcucha bocznego, oraz segment z pierwszym miejscem ligacji, odblokowuje się te grupy funkcyjne, przyłącza się do każdego z tych miejsc co najmniej około pięć óukleotndyw w celu uzyskania segmentów z drugim miejscem ligacji, przeprowadzi się ligację pierwszej jednoniciowej jednostki oligonukleotydowej z pierwszym miejscem ligacji, gdzie ta pierwsza jednoniciowa jednostka oligonukleotydowa ma zdolność wiązania z pierwszą żądaną jednoniciową sekwencją kwasu nukleinowego oraz przeprowadza się ligację drugich jednoniciowych jednostek oligonukleotndowych z segmentami z drugimi miejscami ligacji, gdzie te drugie jednoniciowe jednostki oligonukleotydowe zawierają powtórzenie sekwencji zdolnych do specyficznego wiązania z drugim żądanym jednoniciowym oligonukleotydem.
Syntezę wielkiego rozgałęzionego polinukleotydu i wydłużanie łańcucha prowadzi się w fazie stałej, przy czym z fazą stałą wiąże się koniec 3' łańcucha głównego, który to łańcuch główny zawiera sekwencję 3'-lideaową złożoną z co najmniej około 15 nukleotydów. Korzystnie jako fazę stałą wykorzystuje się szkło o porowatej wielkości porów, wynoszącej co najmniej 2000 A. Korzystnie w miejscach wydłużania występujących w tym nukleotydzie włącza się wydłużenie 5-10 nukleotydowe. Korzystnie jako wielofunkcyjny nukleotyd stosuje się wielofunkcyjny nukleotyd o wzorze hn(ch2)θ-OR2 łańcuch główny łańcuch główny w którym R oznacza grupę o wzorze albo o wzorze
O (MAC)
Przedmiotem wynalazku jest również alternatywny sposób wytwarzania wielkiego rozgałęzionego polinukleotndu o strukturze grzebienia użytecznego jako multimer amplifikacyjóy w próbie hybrydyzacji kwasu nukleinowego, polegający na tym, że syntetyzuje sięjednoniciowy,
169 801 główny łańcuch polinukleotydowy zawierający co najmniej około 15 wielofunkcyjnych nukleotydów, z których każdy posiada zablokowaną grupę funkcyjną służącą jako miejsce przedłużenia nukleotydowego łańcucha bocznego oraz pierwszą jednoniciową jednostkę oligonukleotydową zdolną do specyficznego wiązania z pierwszą żądaną jednoniciową sekwencją polinukleotydową, odblokowuje się te grupy funkcyjne, przyłącza się do każdego z tych miejsc co najmniej około pięć nukleotydów w celu uzyskania segmentów z drugim miejscem ligacji, przeprowadza się ligację drugich jednoniciowychjednostek oligonukleotydowych z segmentami z miejscami ligacji, gdzie te drugie jednoniciowe jednostki oligonukleotydowe zawierają powtórzenia sekwencji zdolnych do wiązania z drugim żądanym jednoniciowym oligonukleotydem.
W sposobie według wynalazku jako wielofunkcyjny nukleotyd stosuje się wielofunkcyjny nukleotyd o wzorze łańcuch główny
łańcuch główny
Korzystnie synteza i wydłużanie łańcucha odbywa się w fazie stałej, przy czym z tą fazą stałą wiąże się koniec 3' łańcucha głównego, który to łańcuch główny zawiera sekwencję wypełniającą 3' złożoną z co najmniej około 15 nukleotydów. Jako fazę stałą stosuje się szkło o kontrolowanej wielkości porów wynoszącej co najmniej 2000 A. W miejsce wydłużenia występujące w nukleotydzie wielofunkcyjnym włącza się wydłużenia 5-10 nukleotydów.
Przedmiotem' wynalazku jest ponadto zastosowanie tych wielkich rozgałęzionych polinukleotydów o strukturze grzebienia w próbie hybrydyzacji. Sposób wykonania próby hybrydyzacji kwasu nukleinowego polega na tym, że poddaje się hybrydyzacji wielki rozgałęziony polinukleotyd o strukturze grzebienia zawierający polinukleotydowy łańcuch główny złożony z co najmniej 15 wielofunkcyjnych nukleotydów, z których każdy określa miejsce łańcucha
169 801 bocznego oraz pierwszej jednoniciowej jednostki oligonukleotydowej zdolnej do specyficznego wiązania z pierwszą żądaną jednoniciową sekwencją polinukleotydową a także zwisające polinukleotydowe łańcuchy boczne rozciągające się od tych wielofunkcyjnych nukleotydów, przy czym każdy z tych łańcuchów bocznych posiada powtórzenia drugiej jednoniciowej jednostki oligonukleotydowej zdolnej do specyficznego wiązania z drugą żądaną, jednoniciową sekwencję polinukleotydową, a ogólna ilość powtórzeń we wszystkich łańcuchach bocznych wynosi co najmniej około 20, przy czym dla polinukleotydu tego pierwszą żądaną jednoniciową sekwencję polinukleotydową stanowi analizowany kwas nukleinowy albo polinukleotyd związany z analizowanym kwasem nukleinowym a drugą żądaną jednoniciową sekwencję polinukleotydową stanowi znakowany polinukleotyd.
Korzystnie w sposobie wykonania próby hybrydyzacji stosuje się rozgałęziony polinukleotyd zawierający od 15 do 50 wielofunkcyjnych nukleotydów. Jako taki wielofunkcyjny nukleotyd korzystnie stosuje się nukleotyd o wzorze łańcuch główny
łańcuch główny
O Λ w którym R oznacza wodór, grupę metylową, jod, brom albo fluor, R4 oznacza wodór albo grupę metylową, Z oznacza grupę przedstawioną wzorem:
(2) O (1) // (CH2)x - NH - C - o (2) O (1)
- {CH2)x - NH - C - (CH2)y - O (2) O (D lCiI2}x - NH - C - (CH2)y -S-S - (CH2)y 169 801 (2) (ch2) (2)
CH,
(CH~) y
albo (1)
- (CH2’x - 0 ' w których x i y są takie same lub różne i oznaczają liczby całkowite w zakresie od 1 do 8 włącznie.
W rozgałęzionym polinukleotydzie w sposobie według wynalazku pierwsza i druga, jednoniciowe jednostki oligonukleotydowe zawierają po 15 do 50 nukleotydów a ilość powtórzeń w każdym łańcuchu bocznym korzystnie wynosi od 2 do 10.
Przedmiotem wynalazku jest także alternatywny sposób wykonania próby hybrydyzacji kwasu nukleinowego. Sposób wykonania próby hybrydyzacji kwasu nukleinowego ze znakowaną sondą kwasu nukleinowego polega na tym, że hybrydyzacji poddaje się rozgałęziony polinukleotyd, zawierający polinukleotydowy łańcuch główny złożony z co najmniej 15 wielofunkcyjnych nukleotydów, z których każdy określa miejsce łańcucha bocznego oraz pierwszej jednoniciowej jednostki oligonukleotydowej zdolnej do specyficznego wiązania z pierwszą żądaną jednoniciową sekwencją polinukleotydową a także zwisające polinukleotydowe łańcuchy boczne rozciągające się od tych wielofunkcyjnych nukleotydów, przy czym każdy z tych łańcuchów bocznych posiada powtórzenia drugiej jednoniciowej jednostki oligonukleotydowej zdolnej do specyficznego wiązania z drugą żądaną, jednoniciową sekwencją polinukleotydową, a ogólna ilość powtórzeń we wszystkich łańcuchach bocznych wynosi co najmniej około 20 o strukturze przedstawionej wzorem: 3' s - (XS') - (R) - s - A 5' ιπ n (R)
L w którym S oznacza pierwszy segment wypełniający złożony z co najmniej około 15 nukleotydów, X oznacza wielofunkcyjny nukleotyd z miejscem rozgałęzienia, S' oznacza segment wypełniający miejsce rozgałęzienia złożony z 0 do około 15 nukleotydów, m oznacza liczbę całkowitą równą lub większą od 15, a R oznacza rozszczepialną cząsteczkę łącznikową, n oznacza zero albo 1, S oznacza drugi segment wypełniający złożony z 0 do 10 nukleotydów, A oznacza segment nukleotydowy zdolny do hybrydyzacji specyficznej z analizowanym kwasem nukleinowym albo z kwasem nukleinowym związanym z analizowaną substancją, S' oznacza trzeci segment wypełniający z 0 do 10 nukleotydów, E oznacza wydłużenie oligonukleotydowe złożone z 5 do 10 nukleotydów, L oznacza segment zawierający 2 do 10 powtórzeń sekwencji nukleotydowej zdolnej do specyficznej hybrydyzacji ze znakowaną sondą oligonukleotydową bezpośrednio lub pośrednio z analizowaną substancją poprzez pierwszą jednoniciowąjednostkę oligonukleotydową i następnie hybrydyzuje się znakowaną sondę kwasu nukleinowego z tym rozgałęzionym polinukleotydem poprzez drugą jednoniciową jednostkę oligonukleotydową.
169 801
Korzystnie w sposobie według wynalazku w hybrydyzowany rozgałęziony polinukleotyd S zawiera 15 do 50 nukleotydów, X ma budowę przedstawioną wzorem:
łańcuch główny łańcuch boczny
I (1)
łańcuch główny w którym R3 oznacza wodór albo grupę metylową, jod, brom albo fluor, R4 oznacza wodór lub grupę metylową, Z oznacza grupę przedstawioną wzorem:
(2)
O (1)
II (CH,) - NH - C - 0 Ł. X (2) (U (2) (2) (CH2)x - NH - C - (CH2)y - O (1)
O
II (CH ) - NH - C - (CH ) -S-S - (CH2) - O
(2) (1) (U
- (ch2 - ch2 - Ο)χ albo (2) (1)
- (CH2)X - o w których x i y są takie same lub różne i oznaczają liczby całkowite w zakresie 1 do 8 włącznie, S zawiera 5 do 10 nukleotydów, a ilość powtórzeń w segmencie L wynosi 3 do 6, lub też S oznacza poli T a także n oznacza 1. Rozpuszczalna cząsteczka łącznikowa w polinukleotydzie stosowanym w sposobie według wynalazku ma budowę przedstawioną wzorem:
169 801
w którym DMT oznacza resztę dimetoksytrytylową, Bz oznacza resztę benzoilową, R5 oznacza grupę metylową albo (--yjanoeeylową a iPr oznacza grupę izopropylową,
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wykonania próby hybrydyzacji kwasu nukleinowego polegający na tym, że wielki rozgałęziony polinukleotyd o strukturze grzebienia zawierający polinukleotydowy łańcuch główny złożony z co najmniej 15 wielofunkcyjnych nukleotydów, z których każdy określa miejsce łańcucha bocznego oraz pierwszej jednoniciowej jednostki oligonukleotydowej zdolnej do specyficznego wiązania z pierwszą żądaną jednoniciową sekwencją polinukleotydową a także zwisające polinukleotydowe łańcuchy boczne rozciągające się od tych wielofunkcyjnych nukleotydów, przy czym każdy z tych łańcuchów bocznych posiada powtórzenie drugiej jednoniciowej jednostki oligonukleotydowej zdolnej do specyficznego wiązania z drugą żądaną, jednoniciową sekwencją polinukleotydową, a ogólna ilość powtórzeń we wszystkich łańcuchach bocznych wynosi co najmniej około 20, przy czym dla polinukleotydu tego pierwszą żądaną jednoniciową sekwencję polinukleotydową stanowi analizowany kwas nukleinowy albo polinukleotyd związany z analizowanym kwasem nukleinowym a drugą żądaną jednoniciową sekwencję polinukleotydową stanowi znakowany polinukleotyd, poddaje się hybrydyzacji poprzez pierwszą jednostkę oligonukleotydową z jednoniciowym analizowanym kwasem nukleinowym związanym z fazą stałą albo hybrydyzacji z jednoniciowym oligonukleotydem związanym z analizowaną substancją, usuwa się nierozwiązany rozgałęziony polinukleotyd, jednoniciowy, znakowany oligonukleotyd poddaje się hybrydyzacji z rozgałęzionym polinukleotydem poprzez drugie jednostki oligonukleotydowe, usuwa się niezwiązany znakowany oligonukleotyd i wykrywa się obecność znacznika związanego z tym rozgałęzionym polinukleotydem.
Stosowany w sposobie według wynalazku polinukleotyd korzystnie zawiera od 15 do 50 wielofunkcyjnych nukleotydów. Jeszcze bardziej korzystnie ten wielofunkcyjny nukleotyd ma budowę przedstawioną wzorem: t łańcuch boczny
I (1)
łańcuch główny łańcuch główny w którym R- oznacza wodór, grupę metylową, jod, brom albo fluor, r4 oznacza wodór albo grupę metylową, Z oznacza grupę przedstawioną wzorem:
169 801 (2) (2) (2) (2) (1) (CH2)x - NH (CH2)x - NH
O
II
C (1) (^y - O (CH2)X <CH2>x
<CH2>y (1) (2) (1)
- (CH2 - CH2 - Ο)χ - albo (2)
- <CH2>x ' 0 w których x i y są takie same lub różne i oznaczają liczby całkowite w zakresie 1 do 8 włącznie.
Pierwsza i druga, jednoniciowe jednostki oligonukleotydowe w stosowanym rozgałęzionym polinukleotydzie, zawierają po 15 do 50 nukleotydów a ilość powtórzeń \v każdym łańcuchu bocznym wynosi od 2 do 10.
Jeszcze inną odmianą próby hybrydyzacji w alternatywnym rozwiązaniu według wynalazku jest sposób wykonania próby hybrydyzacji polegający na tym, że rozgałęziony polinukleotyd zawierający polinukleotydowy łańcuch główny złożony z co najmniej 15 wielofunkcyjnych nukleotydów, z których każdy określa miejsce łańcucha bocznego oraz pierwszej jednoniciowej jednostki oligonukleotydowej zdolnej do specyficznego wiązania z pierwszą żądaną jednoniciową sekwencją polinukleotydową a także zwisające polinukleotydowe łańcuchy boczne rozciągające się od tych wielofunkcyjnych nukleotydów, przy czym każdy z tych łańcuchów bocznych posiada powtórzenie drugiej jednoniciowej jednostki oligonukleotydowej zdolnej do specyficznego wiązania z drugą żądaną, jednoniciową sekwencją polinukleotydową, a ogólna ilość powtórzeń we wszystkich łańcuchach bocznych wynosi co najmniej około 20 o strukturze przedstawionej wzorem:
r J 3' S - (XS )m - (R)n - s - A 5
S‘ <R<n
E
L w którym S oznacza pierwszy segment wypełniający złożony z co najmniej około 15 nukleotydów, X oznacza wielofunkcyjny nukleotyd z miejscem rozgałęzienia, S' oznacza segment wypełniający miejsce rozgałęzienia złożony z 0 do około 15 nukleotydów, m oznacza liczbę całkowitą równą lub większą od 15, R oznacza rozszczepialną cząsteczkę łącznikową, n oznacza zero albo 1, S oznacza drugi segment wypełniający złożony z 0 do 10 nukleotydów, A oznacza segment nukleotydowy zdolny do hybrydyzacji specyficznej z analizowanym kwa169 801 sem nukleinowym albo z kwasem nukleinowym związanym z analizowaną substancją, S' oznacza trzeci segment wypełniający złożony z 0 do 10 nukleotydów, E oznacza wydłużenie zlizznukleztydowe złożone z 5 do 10 nukleotydów, L oznacza segment zawierający 2 do 10 powtórzeń sekwencji nukleotydowej zazlner do specyficznej hybrydyzacji ze znakowaną sondą zlioznukleztydową poddaje się hybrydyzacji poprzez pierwszą jednostkę oligonukleotydową z jednoniciowym analizowanym kwasem nukleinowym związanym z fazą stałą albo hybrydyzacji z jednoniciowym oligonukleotydem związanym z analizowaną substancją, usuwa się niezwiązany rozgałęziony polinukleotyd, jeanzniciowy, znakowany oligonukleotyd poddaje się hybrydyzacji z rozgałęzionym polinukleotydem poprzez drugie jednostki oligonukleotydowe, usuwa się niezwiązany znakowany oligonukleotyd i wykrywa się obecność znacznika związanego z rozgałęzionym polinukleotydem.
W rozwiązaniu tym korzystnie stosuje się rozgałęziony polinukleotyd, w którym to polinukleotydzie S zawierają 15 do 50 nukleotydów, X ma budowę przedstawioną wzorem:
łańcuch boczny
łańcuch główny łańcuch główny
Λ w którym R oznacza wodór albo grupę metylową, jod, brom albo fluor, R4 oznacza wodór lub grupę metylową, Z oznacza grupę przedstawioną wzorem:
(2) (2) (2) (2)
O
1/ (CH ) - NH - C - O (1)
O
II (CH2) - NH - C - (CH ) -Ου:
O
II (CH ) NH C (CH2)y S - S - (CH2}y 0 (U (U
169 801 (2) (1)
- CH2 - ch2 - O)x albo (2)
- (ch2)x - o w których x i y są takie same lub różne i oznaczają liczby całkowite w zakresie 1 do 8 włącznie, S zawiera 5 do 10 nukleotydów a ilość powtórzeń w segmencie L wynosi 3 do 6.
W polinukleotydzie tym S oznacza poli Tan oznacza korzystnie 1 a rozszczepialna cząsteczka łącznikowa ma budowę przedstawioną wzorem:
Bz _ O O - Bz w którym DMT oznacza resztę dimetoksytrytylową, Bz oznacza resztę benzoilową, R5ozn2cpα grupę metylową albo β-cyjanoetylową a iPr oznacza grupę izopropylową.
Termin wielki w odniesieniu do rozgałęzionych polinukleotydów w sposobie wynalazku o strukturze grzebieni oznacza cząsteczkę posiadającą co najmniej około 15 miejsc rozgałęzionych i co najmniej 20 powtórzeń sekwencji wiążących znakowaną sondę.
Termin ' 'struktura grzebienia w odniesieniu do rozgałęzionych polinukleotydów w sposobie według wynalazku oznacza polinukleotyd posiadający łańcuch główny oraz wiele łańcuchów bocznych rozciągających się od grzbietu.
Wielofunkcyjny albo modyfikowany nukleotyd oznacza monomer nukleotydowy, który może być trwale wprowadzony do polinukleotydu posiadającego dodatkową grupę funkcyjną (korzystnie cytozynę, w której pozycja 4 została zmodyfikowana tak, aby wprowadzić funkcyjną grupę hydroksylową), do której można kowalencyjnie przyłączyć nukleotyd z utworzeniem łańcucha bocznego.
Rozszczepialna cząsteczka łącznikowa oznacza cząsteczkę, która może być trwale wprowadzona do łańcucha polinukleotydowego i która zawiera wiązanie kowalencyjne, które może być rozerwane lub rozszczepione przez traktowanie chemiczne, fizyczne albo przez napromienianie.
Multimer amplifikacyjny oznacza polinukleotyd zdolny do hybrydyzacji bezpośrednio albo pośrednio z analizowanym kwasem nukleinowym oraz z wielokrotnością znakowanych sond.
Multimery polinukleotydowe według wynalazku składają się z liniowego łańcucha głównego i zwisających łańcuchów bocznych. Łańcuch główny zawiera segment, przez który wprowadza się specyficznie miejsce hybrydyzacji z analizowanym kwasem nukleinowym albo z kwasem nukleinowym związanym z substancją analizowaną; natomiast zwisające łańcuchy boczne zawierają powtórzenia segmentu niosące specyficzne miejsca hybrydyzacji dla znakowanej sondy.
Korzystnie rozwiązania takich polinukleotydowych multimerów o strukturze grzebienia można przedstawić następującym wzorem:
169 801
3' S - <XS-)B - (R)n - s - A 5 s' (R)
L gdzie S oznacza pierwszy segment wypełniający złożony z co najmniej 15 nukleotydów, korzystnie od około 15 do 50 nukleotydów, X oznacza wielofunkcyjny nukleotyd z miejscem rozgałęzienia, S' oznacza segment wypełniający miejsce rozgałęzienia złożony z 0 do około 15 nukleotydów, korzystnie 0 do 10 nukleotydów, korzystnie 0 do 10 nukleotydów, m oznacza liczbę całkowitą równą lub większą od 15, korzystnie w zakresie 15 do 100, R oznacza rozszczepialną cząsteczkę łącznikową, n oznacza zero albo 1, S oznacza drugi segment wypełniający złożony z 0 do 10 nukleotydów, korzystnie 5 do 10 nukleotydów, A oznacza segment zdolny do specyficznej hybrydyzacji z analizowanym kwasem nukleinowym albo w kwasem nukleinowym związanym z analizowaną substancją, S' oznacza trzeci segment wypełniający złożony z 0 do 10 nukleotydów, E oznacza wydłużenie oligonukloeotydowe złożone z 5 do 10 nukleotydów a L oznacza segment zawierający 2 do 10 powtórzeń, korzystnie 3 do 6 powtórzeń sekwencji nukleotydowej zdolnej do specyficznej hybrydyzacji ze znakowaną sondą oligonukleotydową.
Całkowity łańcuch główny tego multimeru albo jego część od S do S włącznie oraz część łańcucha bocznego z wyłączeniem L w zasadzie syntetyzuje się chemicznie jako integralną jednostkę, stosując konwencjonalną, automatyczną syntezę oligonukleotydów w fazie stałej i odpowiednią aparaturą. W tym względzie, segment wypełniający S służy do wydłużenia tej części cząsteczki, która zawiera miejsce rozgałęzienia w pobliżu fazy stałej (koniec 3' segmentu S jest związany z powierzchnią fazy stałej.).
W powyższym wzorze, modyfikowane nukleotydy lub rozgałęzione monomery oznaczone symbolem X są wielofunkcyjnymi nukleotydami, w których jedną grupę funkcyjną stosuje się do budowy łańcucha bocznego a inne służą jako wiązania łańcucha głównego poi i nukleotydu. Przykłady wielofunkcyjnych nukleotydów są podane w opisie zgłoszenia patentowego europejskiego, EPA 88 309 6976 odpowiadające numerowi opisu europejskiego nr 317 077, którego ujawnienie jest cytowane w niniejszym opisie. Takie modyfikowane nukleotydy korzystnie mają budowę przedstawioną wzorem:
169 801 łańcuch_ główny
Łańcuch boczny (1)
łańcuch główny gdzie R3 oznacza wodór, grupę metylową, jod, brom albo fluor, R4 oznacza wodór albo grupę metylową, Z oznacza grupy przedstawione wzorami:
| (2) | <0BA | ° (1) | ||
| - NH | -0-0 - | |||
| (2) | 0 li | (1) | ||
| <0H2\ | - NH | - C - (CH2)y - 0 | ||
| (2) | ? | |||
| ’ (®2>ι | - NH | - c - (CH2)y - S | - s - | |
| (2) | • (CH2>x | - NH | -O | - 0 - |
| (2) | (1) | |||
| - (CH2 - | ch2 - | • 0 ) X | oraz | |
| (2) | (1) | |||
| • <0H2>x | - 0 - |
(1)
2'y (1) gdzie x i y mogą być takie same lub różne i oznaczać liczby całkowite w zakresie 1 do 8 włącznie. (Oznaczenia (1) i (2) przy wiązaniu Z oznaczają orientację reszty tego łącznika).
Jak widać, obecność segmentu wypełniającego S' nie jest obowiązująca; jeśli istnieje potrzeba, segment ten może być użyty do zwiększenia odległości każdego miejsca rozgałęzienia od poprzedzających go /następujących po nim flankujących miejsc rozgałęzień lub serii sąsiadujących miejsc rozgałęzień od flankujących serii miejsc rozgałęzień. Obecność drugiego segmentu wypełniającego S również niejest obowiązująca. Może on być użyty dla zwiększenia przestrzeni między rozgałęzioną częścią cząsteczki a segmentem A, z którym ostatecznie wiąże się cząsteczka analizowana. Okazało się, że takie wypełnienie polepsza wiązanie między analizowaną substancją a multimerem. Podobnie, trzeci segment wypełniający S' jest fakultatywny. Korzystnie jest to poli T.
Segment A posiada sekwencję i długość, które pozwalają na specyficzne i trwałe wiązanie z analizowaną substancją albo kwasem nukleinowym związanym z tą substancją. W celu uzyskania takiej specyficzności i stabilności, segment A powinien na ogół zawierać 15 do 50, a korzystnie 15 do 30 nukleotydów a zawartość GC powinna się zawierać w granicach 40%
169 801 do 60%. Specyficzna długość i rodzaj sekwencji tego segmentu, będą się oczywiście zmieniać zależnie od kwasu nukleinowego, z którym ma on hybrydyzować.
Segment E jest wydłużeniem łańcucha bocznego, syntetyzowanym chemicznie z zastosowaniem technik i aparatury do automatycznej syntezy oligonukleotydyw w fazie stałej. Na ogół zawiera on około 5 do 10 nukleotydów w długości i służy jako miejsce, do którego przyłącza się enzymatycznie, na drodze ligacji, segment L.
SegmenLE zawiera powtarzające się jednostki oligomeryczne zdolne do specyficznej i trwałej hybrydyzacji ze znakowaną sondą oligonukleotydową. Takie jednostki zawierają również na ogól 15 do 150, a korzystnie 20 do 120 nukleotydów długości a zawartość GC wynosi w nich 40 do 60%. Każdy segment L zawiera na ogół 2 do 10 powtórzeń tych jednostek, korzystnie 3 do 6 powtórzeń. Niektóre łańcuchy boczne mogą nie zawierać segmentu L. Na ogół, co najmniej około 50%, a korzystnie co najmniej około 70% łańcuchów bocznych będzie zawierało segment L.
Rozszczepialne cząsteczki łącznikowe (R) w łańcuchu głównym i/lub w łańcuchach bocznych polinukleotydu nie są obowiązujące ale korzystne. Zawierają one miejsca rozszczepialne selektywnie, a więc, próbki wielkich polinukleotndów o strukturze grzebienia mogą być rozszczepiane dla celów analizy i charakteryzacji. Po tym względem, jest korzystne, aby miejsca rozszczepialne selektywnie występowały w każdym łańcuchu bocznym i w miejscu 5' najbardziej rozgałęzionego miejsca 5'. Przykłady rozszczepialnych cząstek łącznikowych, które mogą być wprowadzone do polinukleotydów są podane w opisie i w przykładach europejskiego zgłoszenia patentowego, EPA 883096976.
Polinukleotydy konstruuje się stosując kombinację bezpośredniej syntezy oligonukleotydów w fazie stałej i enzymatycznych metod ligacji. Łańcuch główny grzebienia, zawierający segment wypełniający 3' (S), miejsca rozgałęzienia (X), ewentualnie segmenty S', S i S', segment A, ewentualnie pożądane cząsteczki łącznikowe (R) i przedłużenie łańcucha bocznego (E), syntetyzuje się technikami automatycznej syntezy oligonukleotydyw w fazie stałej. Korzystną fazę stałą stanowi szkło o kontrolowanej wielkości porów, co najmniej 2000 A. W syntezie tej, segment wypełniający Sjest związany z fazą stałą. Dla wygody, segmentem tym jest poli T. Do tego łańcucha przyłącza się następnie wielofunkcyjne nukleotydy, będzie źródłem miejsc rozgałęzienia, z dodatkiem lub bez dodatku wtrąconych óukleotydyw jako wypełnień pomiędzy miejscami rozgałęzień. Na modyfikowanych nukleotydach stosuje się prostopadłe grupy ochronne lub blokujące, tak, aby grupa ochronna, która zezwala na wydłużanie łańcucha głównego mogła być usunięta bez wpływu na grupę ochronną, która umożliwia wydłużenie łańcucha bocznego.
Przykłady odpowiednich grup ochronnych są również podane w opisie zgłoszenia patentowego europejskiego, EPA 883096976. Grupę dimetoksytrytylową (DMT) korzystnie stosuje
gdzie R' oznacza wodór, aryl albo aryloalkil, podstawniki Ri mogą być takie same lub różne i oznaczać grupy: aminową, nitrową, chlorowiec, grupę hydroksylową, niższą grupę alkilową lub niższą grupę alkoksylową, podstawniki Rj mogą być takie same lub rożne i oznaczać grupy: aminową, nitrową, chlorowiec, grupę hydroksylową, niższą grupę alkilową lub niższą grupę alkoksylową, i oznacza zero, 12 albo 3 aj oznacza zero, 1,2, 3 albo 4, korzystnie stosuje się jako grupę blokującą na reszcie hydroksylowej modyfikowanych nukleotydów. Po wprowadzeniu żądanej liczby miejsc rozgałęzienia wydłuża się koniec 5' cząsteczki segmentami S (fakultatywnie) i segmentami A albo po prostu krótkim segmentem S (5-10 nukleonów),
169 801 dzięki czemu uzyskuje się miejsce dla enzymatycznej ligacji z segmentem A. Jak podano powyżej, miejsce rozszczepialne selektywnie korzystnie wprowadza się w wydłużeniu. Jeśli segment A syntetyzuje się bezpośrednio i nie jest on przyłączony przez ligację, wówczas w celu zablokowania odpowiednich miejsc w łańcuchach bocznych modyfikowanych nukleotydów należy użyć grupę ochronną taką jak 2-metyloantrachinonylowa, którą można selektywnie usunąć nie naruszając reszty cząsteczki.
Po odpowiednim wydłużeniu końca 5' łańcucha głównego struktury grzebienia usuwa się grupy ochronne z reszt hydroksylowych modyfikowanych nukleotydów i jednocześnie wydłuża się miejsca rozgałęzień, korzystnie włączając miejsca selektywnie rozszczepialne, tak, aby od każdego miejsca rozgałęzienia odchodziło co najmniej 5-10 nukleotydowe wydłużenie (E) służące jako miejsce ligacji.
Do tych wydłużeń łańcuchów bocznych przyłącza się drogą ligacji segmenty L (oraz segment A, o ile nie jest syntetyzowany bezpośrednio), dodając ligazę T4 i odpowiednie matryce linkera.
Segmenty A i L oraz matryce można również syntetyzować stosując aparaturę do automatycznej syntezy oligonukleotydów w fazie stałej i odpowiednie procedury.
W próbach hybrydyzacji kwasu nukleinowego wiąże się wielki multimer o strukturze grzebienia z analizowanym kwasem nukleinowym albo z jednoniciowym oligonukleotydem związanym z analizowaną substancją. Ponieważ multimer zawiera dużą ilość (20 lub więcej) powtórzeń sekwencji, która jest dostępna dla specyficznej hybrydyzacji ze znakowanym oligonukleotydem, to znacznie więcej znakowanych grup można związać z analizowaną substancją niż w dotychczasowych technikach. Duża ilość znakowanych grup zmniejsza próg wykrywalności analizowanej substancji.
Powyższe multimery można stosować zasadniczo w każdej ze znanych technik hybrydyzacji kwasów nukleinowych, a więc takich, w których analizowana substancja jest bezpośrednio związana ze stałą fazą, w hybrydyzacjach typu kanapkowego,w których analizowana substancja jest związana z oligonukleotydem, który jest z kolei związany z fazą stałą. Są one szczególnie użyteczne w próbach hybrydyzacji typu sandwiczowego prowadzonych w roztworze, opisanych w opisie zgłoszenia patentowego europejskiego, EPA 883096976, odpowiadającego europejskiemu opisowi nr 317 077.
W takich próbach hybrydyzacji typu kanapkowego prowadzonych w roztworze multimer stosuje się w sposób następujący. Jednoniciowy analizowany kwas nukleinowy inkubuje się w warunkach hybrydyzacji z nadmiarem dwu zespołów sond jednoniciowego kwasu nukleinowego:
(1) zestawu sond wychwytowych, w którym to zestawie każda sonda posiada pierwszą sekwencję wiążącą komplementarną z analizowaną próbką i drugą sekwencję wiążącą, komplementarną z jednoniciowym oligonukleotydem związanym z fazą stałą i (2) zestawu sond amplifikacyjnych, w którym to zestawie każda sonda posiada pierwszą sekwencję wiążącą zdolną do specyficznego wiązania z analizowaną substancją i drugą sekwencję wiążącą, zdolną do specyficznego wiązania z segmentem A multimeru. Stosując sondę amplifikacyjną, multimer można zaprojektować tak, aby był on reagentem uniwersalnym i aby nie było potrzebne wykonywanie różnych multimerów dla każdej analizowanej próbki. Wytworzony projekt jest trójskładnikowym kompleksem nukleinowym dwu sond hybrydyzujących z analizowaną substancją poprzez ich pierwsze sekwencje wiążące. Drugie sekwencje wiążące tych sond pozostają jako jednoniciowe ogony, ponieważ nie są one komplementarne z analizowaną substancją.
Ten kompleks dodaje się następnie w warunkach hybrydyzacji do fazy stałej, z którą został uprzednio związany jednoniciowy oligonukleotyd, komplementarny do drugiej sekwencji wiążącej w sondzie wychwytowej. Wytworzony produkt zawiera kompleks związany z fazą stałą poprzez dupleks utworzony przez oligonukleotyd związany z fazą stałą i drugą sekwencję wiążącą sondy wychwytowej. Następnie oddziela się fazę stałą ze związanym kompleksem od niezwiązanych substancji. Do kompleksu: faza stała - substancja analizowana - sonda, w warunkach hybrydyzacji dodaje się wielki multimer amplifikacyjny o strukturze grzebienia, co umożliwia hybrydyzację multimeru z dostępną drugą sekwencją wiążącą sondy amplifikacyjnej.
169 801
Uzyskany kompleks fazy stałej oddziela się następnie od niezwiązanego multimeru przez przemywanie, po czym dodaje się znakowany oligonukleotyd w warunkach, które umożliwiają jego hybrydyzację z jednostkami oligonukleotydowymi na łańcuchach bocznych multimeru. Uzyskany kompleks fazy stałej ze znakowanym kwasem nukleinowym oddziela się od nadmiaru znakowanego oligonukleotydu przez przemywanie, usuwając ten niezwiązany znakowany oligonukleotyd i dokonuje się odczytu.
Analizowane kwasy nukleinowe mogą pochodzić z wielu źródeł, np. z płynów lub stałych substancji biologicznych, żywności, materiałów ze środowiska itp. Możnaje przygotowywać do hybrydyzacji w różny sposób, np. przez traktowanie proteinazą K i dodecylosiarczanem sodowym, solami chaotropowymi i podobnymi reagentami. Może być również korzystne zmniejszenie średniej wielkości analizowanych kwasów nukleinowych na drodze enzymatycznej, fizycznej lub chemicznej, np. przez działanie enzymami restrykcyjnymi, przez traktowanie ultradźwiękami, przez degradację chemiczną (np. jonami metali) lub w inny sposób. Fragmenty mogą być małe, ich wielkość może wynosić 0.1 kb, na ogół około 0.5 kb ale również mogą to być fragmenty o wielkości 1 kb lub wyższej. Do analizy, analizowaną sekwencję wprowadza się w formie jednoniciowej. Tam, gdzie sekwencja w sposób naturalny występuje w formie jednoniciowej denaturacja nie jest potrzebna. Jeśli jednak sekwencja występuje w formie dwuniciowej, wówczas denaturuje się ją. Denaturację prowadzi się różnymi technikami, takimi jak traktowanie alkaliami, zwykle 0.05-0.2 molarnym wodorotlenkiem, formamidem, solami, traktowanie ciepłem lub kombinacje tych metod.
Każda z pierwszych sekwencji wiążących sondy wychwytowej i sondy amplifikacyjnej, komplementarna do sekwencji analizowanej składa się z co najmniej 15 nukleotydów, zwykle co najmniej 25 nukleotydów i nie więcej niż około 5 kb, zazwyczaj nie więcej niż około 1 kb, korzystnie nie więcej niż około 100 nukleotydów. Na ogół będzie ona zawierać około 30 nukleotydów. Będą one na ogół tak dobrane, aby wiązały się z różnymi sekwencjami próbki analizowanej. Te pierwsze sekwencje wiążące dobiera się w oparciu o szereg czynników. Zależnie od rodzaju analizowanej próbki dobiera się sekwencje zgodne, sekwencje związane z polimorfizmem, szczególnego fenotypu lub genotypu, szczególny szczep i podobne.
Odpowiednio dobierając pierwsze sekwencje wiążące sond amplifikacyjnych i wychwytowych, można je zastosować do identyfikacji specyficznej cząsteczki kwasu nukleinowego, zawierającej szczególny gen lub inną sekwencję występującą jako część innych cząsteczek kwasu nukleinowego. W celu odróżnienia cząsteczki analizowanego kwasu nukleinowego od innych cząsteczek, które również zawierają daną sekwencję jedną z sond przygotowuje się jako komplementarną do danej sekwencji a drugą - jako komplementarną do innej sekwencji tejże cząsteczki, przy czym ta inna sekwencja jest unikalna dla tej cząsteczki (co oznacza, że nie występuje w innych cząsteczkach zawierających daną sekwencję).
Drugie sekwencje wiążące w sondzie wychwytowej i w sondzie amplifikacyjnej dobiera się tak, aby były odpowiednio komplementarne do oligonukleotydu związanego z fazą stałą i do segmentu A multimeru, tak, aby nie były atakowane przez endogenne sekwencje w próbce/analizowanej sekwencji. Druga sekwencja wiążąca może przylegać do pierwszej sekwencji wiążącej lub może być od niej oddalona pośrednią sekwencją niekomplementarną. O ile to wskazane, sondy mogą zawierać inne sekwencje niekomplementame. Te niekomplementame sekwencje nie mogą przeszkadzać w wiązaniu sekwencji wiążących lub stwarzać możliwość wiązania niespecyficznego.
Sondę wychwytową i sondę amplifikacyjną można wytwarzać metodami syntezy oligonukleotydowej lub przez klonowanie, korzystnie w pierwszy sposób.
Jest rzeczą cenną to, że sekwencje wiążące nie muszą wykazywać pełnej komplementarności wymaganej do powstania homodupleksów. W wielu sytuacjach wystarcza powstanie heterodupleksów, w których poniżej 10% zasad jest niedopasowanych, pomijając pętle pięciu lub więcej nukleotydów. Tak więc, stosowany w opisie termin komplementarny wyraża stopień komplementarności wystarczającej do powstania stabilnej struktury dupleksu.
Jako fazę stalą, w tego typu próbach można stosować materiał rozdrobniony albo może to być stała powierzchnia ściany różnego rodzaju pojemników, np. probówek wirówkowych, kolumn, wgłębień, w płytkach do mikromiareczkowania, filtrów, rurek i podobnych.
169 801
W stosowanym do tego celu materiale rozdrobnionym rozmiary ziaren wynoszą od około 0.4 do 200 mikronów, częściej od około 0.8 do 4.0 mikronów. Mogą to być cząstki dogodnego materiału, takiego jak lateks lub szkło. Korzystną powierzchnię stałą stanowią płytki do mikromiareczkowania. Oligonukleotyd komplementarny do drugiej sekwencji wiążącej w sondzie wychwytowej można trwale związać ze stałą powierzchnią poprzez grupy funkcyjne, stosując znane procedury.
Cenne byłoby zastąpienie drugiej sekwencji wiążącej w sondzie wychwytowej oraz oligonukleotydu przyłączonego do fazy stałej odpowiednią parą: ligand - receptor, która będzie tworzyć trwałe połączenie, wiążące fazę stałą z pierwszą sekwencją wiążącą sondy wychwytowej. Przykładami takich par są biotyna/awidyna, tyroksyna/ globulina wiążąca tyroksynę, antygen/przeciwciało, cukier/lektyna i podobne.
Znakowany oligonukleotyd będzie zawierał sekwencję komplementarną do jednostek oligonukleotydowych w łańcuchach bocznych multimeru. Ponadto będzie on zawierał jedną lub więcej cząsteczek (znaczników), które w sposób bezpośredni lub pośredni dają wykrywalny sygnał. Znaczniki mogą być związane z indywidualnymi członami sekwencji komplementarnej lub też mogą występować jako człon końcowy lub końcowy ogon zawierający wiele znaczników. W piśmiennictwie podane są różne sposoby wprowadzania znaczników związanych z sekwencją. Przykładami są następujące pozycje: Leary i wsp., Proc.Natl.Acad.Sci. USA (1983), 80, 4045; Renz i Kurz, Nucl.Acids Res. (1984), 12,3435; Richardson i Gumport, Nucl.Acids Res. (1983), 11, 6167, Smith i wsp. Nucl.Acids Res. (1985) 13, 2399; Meinkoth i Wahl, Anal. Biochem. (1984), 138, 267. Znaczniki mogą być związane z sekwencją komplementarną kowalencyjnie lub niekowalencyjnie. Do znaczników, które można tu zastosować należą radionuklidy, fluorofory, związki chemiluminescencyjne, barwniki, enzymy, substraty enzymów, kofaktory enzymów, inhibitory enzymów, podjednostki enzymów, jony metali, i podobne substancje. Przykładami specyficznych znaczników są fluoresceina, rodamina, czerwień teksaska, fikoerytryna, umbeliferron, luminol, NADPH, α-β-galaktozydaza, peroksydaza chrzanu i podobne.
Stosunek ilości sondy wychwytowej i sondy amplifikacyjnej do zakładanej ilości moli analizowanej substancji powinien być co najmniej stechiometryczny a korzystnie stanowić nadmiar. Stosunek ten korzystnie wynosi co najmniej około 1,5:1 a bardziej korzystnie, co najmniej 2:1. Na ogół będzie się on kształtował w granicach 2:1 do 10.000:1. Stężenia każdej z tych sond mieszczą się na ogół w zakresie próbki w granicach od 10'21 do 10'12 mola. Na ogół, poszczególne etapy hybrydyzacji trwają od około 10 minut do 2 godzin, najczęściej kończy się je w czasie godziny. Hybrydyzację prowadzi się w lekko podwyższonej temperaturze, na ogół w zakresie od około 20°C do około 80°C, najczęściej od około 35°C do 70°C, konkretnie -65°C.
Reakcję hybrydyzacji zwykle prowadzi się w środowisku wodnym, zwłaszcza w buforowym roztworze wodnym, który może zawierać różne dodatki, Do takich zalicza się niskie stężenie detergenta (0.1 do 1%), sole, np, cytrynian sodowy (0.017 do 0.17 mola), odczynnik Ficoll, Poliwinylopirolidon, nośnikowe kwasy nukleinowe, nośnikowe białka i podobne. Do roztworu wodnego można dodawać rozpuszczalniki niewodne, takie jak dimetyloformamid, dimetylosulfotlenek, alkohole i formamid. Te inne rozpuszczalniki występują w ilościach od 2 do 50%.
Moc środowiska hybrydyzacyjnego może być kontrolowana przez temperaturę, stężenie soli, układ rozpuszczalników i podobne czynniki. Tak więc,zależnie od długości i rodzaju badanej sekwencji, moc ta może się zmieniać.
W próbie tej, procedury stosowane w etapach rozdziału będą różne zależne od rodzaju fazy stałej. W przypadku stosowania jako fazy stałej materiału w postaci drobnych cząstek, dla celów rozdziału dogodne jest wirowanie lub filtrowanie, z odrzuceniem lub izolacją supernatantu. Tam, gdzie cząsteczki te poddaje się analizie, przemywa się je dokładnie, zwykle od jednego do pięciu razy odpowiednim buforowanym roztworem, np. PBS zawierającym środek powierzchniowoczynny, taki jak dodecylosulfonian sodowy. Jeśli fazę stałą stanowi ścianka naczynia lub sztywny nośnik, wówczas izoluje się lub odrzuca supernatant a ściankę przemywa w taki sam sposób jak w przypadku cząstek.
169 801
Zależnie od rodzaju znacznika, do detekcji obecności tego znacznika stosuje się różne techniki. Do oznaczania substancji fluoryzujących dostępnych jest wiele różnych fluorymetrów. W przypadku znaczników chemiluminescencyjnych stosuje się luminometry lub błony filmowe. W przypadku użycia enzymów można wprowadzić substancję fluorescencyjną, chemiliminescencyjną lub barwniki i prowadzić oznaczenie metodami fluorymetrycznymi, luminometrycznymi, ępjktrofztometrycpnymi lub wizualnie. Do prób tych można również użyć różne znaczniki stosowane w próbach immunologicznych. Oznaczenie prowadzi się wówczas technikami stosowanymi dla prób immunologicznych.
W próbie hybrydyzacji, gdzie analizowany kwas nukleinowy jest bezpośrednio związany z fazą stałą, takiej jak próba przeniesienia punktowego, dot blot, multimer poddaje się hybrydyzacji bezpośrednio z tym związanym badanym kwasem nukleinowym. W takich przypadkach segment A multimeru jest komplementarny z sekwencją analizowanej próbki a jednostki oligonukleotydowe na łańcuchach bocznych są komplementarne ze znakowanym oligonukleotydem. Niezwiązany multimer usuwa się z fazy stałej a znakowany olizonukleotya poddaje się hybrydyzacji ze związanym kompleksem: analizowana substancja - multimer. Następnie usuwa się nadmiar znakowanego oligomeru i dokonuje pomiaru zawartości znakowanego związanego kompleksu.
Multimery można również stosować w innych oznaczeniach, takich jak immunologiczne próby bezpośrednie, pośrednie i typu kanapkowego. W takich przypadkach, reagent pełniący rolę znakowanego przeciwciała albo innego ligandu bezpośrednio lub pośrednio związanego z analizowaną substancją posiada oligonukleotyd komplementarny z segmentem A multimeru związanego z nim a nie ze znacznikiem. Przykładowo^ immunologicznej próbie typu kanapkowego zastosowanej do ozaczania antygenu, próbę materiału analizowanego inkubuje się z fazą stałą, z którą związuje się pierwsze przeciwciało wobec tego antygenu. Niezwiązaną próbkę usuwa się z fazy stałej a związany kompleks poddaje się reakcji z drugim przeciwciałem względem tego antygenu, takim, który zawiera związany oligonukleotyd komplementarny do jednostki multimeru. Tworzy się trójczłonowy kompleks. Po usunięciu nadmiaru drugiego przeciwciała, multimer poddaje się hybrydyzacji z tym kompleksem poprzez ten oligonukleotyd związany z drugim przeciwciałem. Usuwa się nadmiar multimeru i znakowany oligonukleotyd hybrydyzuje się z innymi jednostkami tego multimeru. Po usunięciu nadmiaru znakowanego oligonukleotydu dokonuje się odczytu zawartości kompleksu.
Zestawy do prowadzenia amplifikacyjnych prób hybrydyzacji kwasów nukleinowych według wynalazku zawierają upakowaną kombinację następujących reagentów: multimer; odpowiedni znakowany oligonukleotyd; fazę stałą zdolną do wiązania substancji analizowanej; ewentualnie sondę wychwytową, jeśli jest to ten rodzaj próby, w którym substancja analizowana jest związana z fazą stałą poprzez pośredni olizonukleotya lub inny ligand; ewentualnie sondę amplifikacyjną, jeśli jest to rodzaj próby, gdzie multimer nie hybrydyzuje bezpośrednio z substancją analizowaną. Na ogół, w tym zestawie reagenty znajdują się w osobnych pojemnikach. Zestaw może również zawierać reagent denaturyzacyjny do denaturacji substancji analizowanej, bufory hybrydyzujące, roztwory do przemywania, substraty enzymów, kontrolę negatywną i pozytywną oraz druki instrukcji prowadzenia próby.
Poniższe przykłady podane są dla ilustracji wynalazku, nie ograniczając jego zakresu.
Przykład I. Niniejszy przykład ilustruje syntezę rozgałęzionego polinukleotydu o strukturze grzebienia, posiadającego 15 miejsc rozgałęzienia oraz wydłużenia łańcuchów bocznych zawierające trzy miejsca wiązania ze znakowaną sondą. Ten polinukleotyd zaprojektowano do użycia w próbach hybrydyzacji prowadzonych w roztworze. Jest on opisany w publikacji zgłoszenia patentowego europejskiego, nr EP 883096976 odpowiadającego opisowi europejskiemu nr 317 077.
Wszystkie syntezy chemiczne olizonukleztyadw prowadzi się w automatycznym syntetyzerze DNA (Applied Biosystems, Inc., (ABI), model 380 A/B). Zamiast 5'-foęforylacji stosuje się metodę fosforynoamidową z reagentem zawierającym grupę metoksylową, w której to metodzie stosuje się reagent Phostel (ABN). Za wyjątkiem przypadków, gdzie jest to zaznaczone, stosuje się standardowe protokoły ABI. Tam, gdzie to wskazane, stosuje się wielokrotność cyklu (np. 1,5 x cykl, 4,5 x cykl), w jednym, specyficznym cyklu stosuje się
169 801 wielokrotność standardowej ilości fosforynoamidu zalecanego przez ABI. W załącznikach podane są programy przebiegu cykli 0.4, 1.5,4.5 i program CAP-PRIM, tak, jak one zachodzą w syntecyzerpe DNA, model 380 A/B firmy Applied Biosystems.
W pierwszym rzędzie przygotowuje się łańcuch główny grzebienia o następującej strukturze:
3'T2o-Xi5(GTCAGTp5'),5 - (GTTTGTp-5’), gdzie X oznacza opisany powyżej modyfikowany nukleotyd.
Na początku syntetyzuje się część struktury grzebienia zawierającą 15 powtórzeń, stosując 40 mg tymidyny osadzonej na szkle o kontrolowanej wielkości porów (CPG) (3000 A, 3 mikromoOe tymidyny na gram nc^ί;I^ii^aI i proOokóó L5 x cę^l^l. Zastosowano nukleooyd z miejscem rozgałęzienia o wzorze:
łańcuch główny łańcuch główny
(KAC)
Monomer, w którym R' oznacza MAC preparuje się w sposób następujący. Do roztworu 16 milimoli N-4-(6-hydroksyheksylo)-5'-DMT-5-metylo-2'-aezoksycytydyny wytworzonej w sposób opisany przez Horna i Urdea’ę (NAR 17, str. 6959-6967, 1989) w 200 ml chlorku metylenowego dodaje się do 40 milimoli pirydyny i mieszaninę oziębia się do temperatury 0°C. Następnie dodaje się kroplami roztwór 20 milimoli chloromrówczanu 2-antrachinonometoksylowego (MAC-C1) w 200 ml CH2CL2 i miesza się przez 10 minut. Analiza metodą chromatografii cienkowarstwowej (płytki krzemionkowe rozwijane układem 10% metanol/CH2Cb) wykazuje, że substancja wyjściowa całkowicie przereagowała. Mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się ilością 400 ml octanu etylowego i fazę organiczną poddaje się ekstrakcji 2 razy po 300 ml 5% roztworu NaHCO3 i 80% nasyconym roztworem NaCl. Po wysuszeniu fazy organicznej nad Na2^^4 w czasie 30 minut i filtracji, odparowuje się rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt
169 801 oczyszcza się metodą chromatografii w żelu krzemionkowym, prowadząc eluowanie w gradiencie metanolu (0-6%) w CH2CI2. Otrzymuje się 13 g czystego produktu (85% wydajności).
Roztwór 0.1 molarny 2-(hydroksnmetnlo)-aótrachinonu (MAQ-OH) przygotowuje się przez rozpuszczenie 25 milimoli (5.95 g) tej substancji w 250 dioksanu. Roztwór o barwie żółtej filtruje się i dla odwodnienia odparowuje się rozpuszczalnik. Pozostałość rozpuszcza się w 200 ml dioksanu i dodaje się 2 ml (25 milimoli) pirndnóy. Ten roztwór dodaje się kroplami do mieszanego roztworu 2.5 g (25 milirywnoważnikyw) taifosgeóu w 50 ml CH2CI2. Po zakończeniu dodawania, mieszaninę miesza się w temperaturze 20°C przez 18 godzin. Następnie mieszaninę rozcieńcza się ilością 800 ml octanu etylowego i fazę organiczną przemywa się trzy razy po 60 ml 80% nasyconego wodnego roztworu NaCl. Po wysuszeniu fazy organicznej nad Na2S04 odparowuje się rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując osad o barwie żółtej. Osad ten rozpuszcza się w 250 ml (0.1 M) CH2CI2. Roztwór ten stosuje się bez dalszego oczyszczania.
Nukleozyd, N-4-(0-;óttaachinonometoksnkaaboóylo-6-oksnheksnlo)-5'-DMT-5-metylo2'-dezoksycytndynę (14.4 milimola) rozpuszcza się w 50 ml CH2CI2 zawierającego 70 milimoli DiPEA. Po schłodzeniu do temperatury 0°C, dodaje się 2.72 ml (14 milimoli) N,Ndiizopropyloaminometoksnchlorofosfiny. Ten środek fosfornnujący dodaje się w małych porcjach do czasu przereagowania 95% substancji wyjściowej. Następnie, prowadzi się ekstrakcję dwa razy po 300 ml 5% NaHCCb i następnie dwa razy po 300 ml 80% nasyconego roztworu NaCl po czym suszy się nad Na2SO4 Rozpuszczalnik usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem.
Surowy fosforynoamid oczyszcza się chromatograficznie na żelu krzemionkowym. Oczyszczony fosforynoamid rozpuszcza się w toluenie i dodaje przy szybkim mieszaniu do 800 ml zimnego heksanu (-50°C). Wytrącony osad szybko odfiltrowuje się i suszy w warunkach wysokiej próżni przez 18 godzin. Uzyskuje się 12.4 g (4.5 milimola, 80% wydajności) osadu o barwie lekko żółtej. Nukleotyd zablokowany resztą MAC odblokowuje się przez działanie dwutionianem sodowym w środowisku obojętnym.
Do syntezy struktury grzebienia (nie zawierającej łańcuchów bocznych) stosuje się stężenia monomerów metylofosforyóoamidownch wynoszące 0.1 mola dla A, C. G i T, 0,15 mola dla monomeru X z miejscem rozgałęzienia i 0.2 mola dla reagentu Phostel. Resztę trotylową usuwa się działając 3% kwasem trójchlorooctowym w chlorku metylenowym, stosując ciągły przepływ w czasie trwania deprotekcji. W końcu, 5'-DMT zastępuje się grupą acetylową.
Przy każdym miejscu rozgałęzienia monomeru syntetyzuje się sześcio-zasadowe łańcuchy boczne o wzorze 3'-GTCAGTp w sposób następujący. Usuwanie grup chroniących zasady (R w powyższym wzorze)prowadzi się ręcznie, zachowując nośnik szkła o kontrolowanej wielkości porów (CPG) na tej samej kolumnie, którą stosuje się do syntezy łańcucha głównego grzebienia. W przypadku, gdy R2 oznacza resztę wprowadza się roztwór 0.5 molarny wodzianu hydrazyny w mieszaninie pirydnón i lodowatego kwasu octowego (1:1, objętościowo) i utrzymuje w kontakcie z nośnikiem w czasie 90 minut z odnową cieczy co 15 minut. Po wyczerpującym wypłukaniu mieszaninę pirndnóy i lodowatego kwasu octowego (4:1. objętościowo) i następnie acetonitrnlem wymienia się filtry w kolumnie. W przypadku, gdy r2 oznacza grupę 2-metyloαótrαchinonylową, wprowadza się roztwór ditionianu sodowego (1 g ditionianu sodowego rozpuszczony w 20 ml 1 molarnego dwuwęglanu trójmetyloamoniowego) i następnie dodaje się 20 ml dioksanu i utrzymuje w kontakcie z nośnikiem w czasie 90 minut. Po deprotekcji wprowadza się sześcio-zasadowe łańcuchy boczne stosując 4.5 x cykl i stężenia monomerów 0.2 molarne.
W tych syntezach, stężenie monomerów wynosi 0,2 mola (łącznie z R i reagentem Phostel™). Grupy tantylowe usuwa się przez działanie roztworem 2.5% kwasu dichlorooctowego w mieszaninie toluenu i 30% kwasu trójchlorooctowego w chlorku metylenowym (1:1, objętościowo) przy ciągłym przepływie. Grupy ochronne usuwa się następująco. Fosforanowe grupy ochronne usuwa się z fragmentu produktu osadzonego na stałym nośniku przez działanie na szkło (CPG) mieszaniną tiofenolu, trietnloαmióy i aceton^lu (1:1:2, objętościowo) przez godzinę w temperaturze 20°C, i następne przemywanie acetonitrnlem (10 x 1 ml) i metanolem. Ten fragment produktu usuwa się z nośnikiem szklanym przez działanie ilością 0.5 ml stężonego wodorotlenku amonowego w czasie 20 minut i usunięcie supernatantu. Tę procedurę powtarza
169 801 się dwukrotnie, co daje łącznie godzinny kontakt z wodorotlenkiem amonowym. Połączony supernatant przenosi się do fiolki z nakrętką i utrzymuje się w temperaturze 60°C przez 18 godzin. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej usuwa się rozpuszczalnik w szybkiej wyparce próżniowej Speed-Vac i pozostałość rozpuszcza się w 100 pl wody.
5'-Wydłużenia łańcucha głównego (segment A), wydłużenia łańcuchów bocznych oraz matryce/linkery ligacyjne o poniższych strukturach wytwarza się również w automatycznym syntetyzatorze:
Wydłużenie 5' łańcucha głównego 3' - AGGTGCTCCGTATCCTGGGCACAG - 5' Wydłużenie łańcucha bocznego 3' - GATGCGR(TTCATGCTGTTGGTGTAG)3-5/ Matryca ligacyjna do połączenia wydłużenia 5' łańcucha głównego 3' - GCACCTACAAAC - 5'
Matryca ligacyjna do połączenia wydłużenia łańcucha bocznego 3' - CGCATCACTGAC - 5'
W wydłużeniu łańcucha bocznego R oznacza linker rozszczepialny selektywnie o wzorze:
Bz — —Bz gdzie DMT oznacza dimetoksytrytyl, Bz oznacza grupę benzoilową, R5 oznacza grupę metylową albo β-cyjanoetylową a iPr oznacza β grupę izopropylową.
Rozszczepienie w miejscu R osiąga się na drodze chemicznej, w postępowaniu dwuetapowym: (1) utlenianiu wodnym roztworem NaJO4 przez godzinę i (2) traktowaniu wodnym roztworem n-propyloaminy. Produkt o strukturze grzebienia w stanie surowym oczyszcza się standardową metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym (10% z dodatkiem 7 moli mocznika).
Wydłużenie łańcucha głównego 5' oraz wydłużenie łańcuchów bocznych poddaje się ligacji z główną strukturą grzebienia postępując według standardowego przepisu z użyciem ligazy T4 (Urdea, Methods in Enzymol., 1987, 146,22-41), wprowadzając zmiany polegające na wydłużeniu czasu reakcji do ponad 8 godzin, zastosowaniu 14% glikolu polietylenowego i prowadzeniu procesu w temperaturze otoczenia.
Po ligacji i oczyszczeniu, część tego produktu znakuje się fosforem 32P i poddaje opisanym powyżej etapem rozszczepiania. Następnie próbkę analizuje się metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym oznaczając ilość wydłużeń łańcuchów bocznych wprowadzonych do cząsteczki przez zliczanie ilości pasm na żelu. Produkt zawiera ogółem 24 miejsca wiązania znakowanej sondy.
Przykład II. Niniejszy przykład ilustruje wytwarzanie tego samego multimeru jaki został wytworzony w przykładzie I, z tym, że stosuje się szkło CPG o średniej wielkości porów i większe obciążenie szkła, które uprzednio przystosowuje się do odpowiedniego poziomu obciążenia. W pierwszej syntezie wychodzi się z 30 mg tymidyny sprzęgniętej z nośnikiem szklanym CPG (średnica porów 1000 A, 20 milimoli tymidyny/g nośnika). Pierwszych 20 cykli sprzęgania z tymidyną prowadzi się w programie 0,4 x cykl w celu zmniejszenia obciążenia do poniżej 10 milimoli/g nośnika.
169 801
Następnie prowadzi się 20 cykli sprzęgania z tymidyną, 15 cykli z X (modyfikowany nukleotyd) i w końcu wprowadza się sekwencję 3'-GTTTGTGGp przy ustawieniu 1,5 x cykl. Usuwa się końcową grupę 5' -DMT i zabezpiecza się sekwencję włączając program cyklu CAP-PRlM w syntetyzerze ABI. Usuwa się kolumnę z aparatu i następnie operacje wykonuje się ręcznie. Eliminację lewulinianowych grup zabezpieczających miejsca rozgałęzień prowadzi się w sposób opisany powyżej, po czym pozostały nośnik CPG przenosi się do nowej kolumny ABI. Wydłużenia łańcuchów bocznych w postaci sekwencji 3' -GTCAGTp wprowadza się podobnie jak to opisano powyżej, w programie 4,5 x cykl. Grupy ochronne usuwa się jak w przykładzie 2 (powyżej) i surowy produkt rozpuszcza się w 100 μί wody.
Ligację grup A i L prowadzi się jak w przykładzie I.
Przykład III. Rozgałęziony polinukleotyd o strukturze grzebienia z przykładu I z 24 miejscami rozgałęzienia stosuje się w prowadzonej w roztworze próbie typu kanapkowego na obecność N.gonorrhoeae. W próbie tej stosuje się wychwyt specyficzny dla genu pyliny i sondy amplifikacyjne oraz sondy znakowane zarówno fosforem rjak i alkaliczną fosfatazę, co zostało opisane w przykładzie 5 publikacji europejskiego zgłoszenia patentowego nr 883096976. Te dwa typy znaczników użyto dla określenia, czy zastosowanie sondy znakowanej alkaliczną fosfatazą przy strukturze grzebieniowej z 24 miejscami rozgałęzienia powoduje jakieś problemy steryczne.
Wyniki porównano z tymi, które uzyskano ze strukturą grzebieniową z 5 miejscami rozgałęzienia nie powodującą jakichkolwiek problemów przeszkód przestrzennych.
Jeśli stosuje się sondę ^P, wówczas cząsteczka z 24 miejscami rozgałęzienia daje wzrost względnej mocy na wyjściu w stosunku do standardowej struktury grzebienia z 5 miejscami rozgałęzień wynoszący 4.76 (teoretycznie 4.8; odpowiednio 195.000 ± 10.000 impulsów na minutę (cpm) wobec 41.000 ± 1.200 impulsów na minutę przy 10 attmolach (10 x 10'18 molach).
Jeśli stosuje się sondę znaczoną alkaliczną fosfatazą, wówczas cząsteczka z 24 miejscami rozgałęzienia daje 3.94 - krotne zwiększenie względnej końcowej wydajności w stosunku do standardowej cząsteczki z 5 miejscami rozgałęzienia (odpowiednio 50.1 ± 1.7 sygnałów świetlnych (LC) względem 12.7 ± 0.2 LC przy 10 attomolach. Różnica w wydajności znakowania tymi dwoma rodzajami sond wskazuje, że znacznik enzymatyczny dobrze przystosowuje się do struktury grzebienia.
Podobnie można prowadzić próby na obecność innych analizowanych kwasów nukleinowych. Próby te są podane w przykładach opisu europejskiego zgłoszenia patentowego nr 883096976.
Modyfikacje opisanych powyżej sposobów prowadzenia wynalazku, oczywiste dla specjalistów z dziedziny chemii kwasów nukleinowych i hybrydyzacji kwasów nukleinowych objęte są zakresem dołączonych zastrzeżeń.
| Numer etapu | Numer i nazwa funkcji | Czar etapu | Etap stosuje się do zasad | Etap bezpieczny | |||||||
| A | G | C | T | 5 | 6 | 6 | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
| 1 | 10 | nr 18 do ścieków | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 2 | 9 | nr 18 na kolumnę | 40 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 3 | 2 | płukanie w kierunku odwrotnym | 20 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 4 | 1 | blokada przepłukiwania | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 5 | 28 | przygotowanie fosforynoamidu | 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 6 | +45 | włączenie grupy 1 | 1 | tak | tak | tak | tak | lak | tak | tak | tak |
| 7 | 90 | tetrazol na kolumnę | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 8 | 19 | zasada + letrazol na kolumnę 1 | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
169 801
2
| 9 | 90 | tetrazol na kolumnę |
| 10 | -46 | wyłączenie grupy 1 |
| 11 | +47 | włączenie grupy 2 |
| 12 | 90 | tetrazol na kolumnę |
| 13 | 20 | zasada + tetrazol na kolumnę 2 |
| 14 | 90 | tetrazol na kolumnę |
| 15 | -48 | wyłączenie grupy 2 |
| 16 | +49 | włączenie grupy 3 |
| 17 | 90 | tetrazol na kolumnę |
| 18 | 21 | zasada + tetrazol na kolumnę 3 |
| 19 | 90 | terazol na kolumnę |
| 20 | -50 | wyłączenie grupy 3 |
| 21 | 16 | przygotowanie reagentu wychwytującego |
| 22 | 10 | nr 18 do ścieków |
| 23 | 2 | płukanie w kierunku odwrotnym |
| 24 | 9 | nr 18 na kolumnę |
| 25 | 2 | płukanie w kierunku odwrotnym |
| 26 | 1 | blokada przepłukiwania |
| 27 | +45 | włączenie grupy 1 |
| 28 | 22 | odczynniki zabezpieczające na kolumnę 1 |
| 29 | -46 | wyłączenie grupy 1 |
| 30 | +47 | włączenie grupy 2 |
| 31 | 23 | odczynniki zabezpieczające na kolumnę 2 |
| 32 | -48 | wyłączenie grupy 2 |
| 33 | +49 | włączenie grupy 3 |
| 34 | 24 | odczynniki zabezpieczające na kolumnę 3 |
| 35 | -50 | wyłączenie grupy 3 |
| 36 | 4 | czekanie |
| 37 | 10 | nr 18 do ścieków |
| 38 | 2 | płukanie w kierunku odwrotnym |
| 39 | 1 | blokada przepłukiwania |
| 40 | 81 | nr 15 do ścieków |
| 41 | 13 | nr 15 na kolumnę |
| 42 | 4 | czekanie |
| 43 | 10 | nr 18 do ścieków |
| 44 | 2 | płukanie w kierunku odwrotnym |
| 45 | 1 | blokada przepłukiwania |
| 46 | 9 | nr 18 na kolumnę |
| 47 | 2 | płukanie w odwrotnym kierunku |
| 48 | 9 | nr 18 na kolumnę |
| 49 | 2 | płukanie w odwrotnym kierunku |
| 50 | 9 | nr 18 na kolumnę |
| 51 | 2 | płukanie w odwrotnym kierunku |
| 52 | 9 | nr 18 na kolumnę |
| 53 | 2 | płukanie w odwrotnym kierunku |
| 54 | 1 | blokada przepłukiwania |
| 55 | 5 | zbiornik frakcji wyprzedzającej |
| 56 | 33 | wejście cyklu |
| 57 | 10 | na 18 na ścieków |
| 58 | 9 | nr 18 na kolumnę |
| 59 | 2 | płukanie w odwrotnym kierunku |
dalszy ciąg
| 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 |
| 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | |
| 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 25 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 1 | tak | tak | tak | tak | ' tak | tak | tak | tak |
| 20 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 20 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 30 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 7 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 7 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 30 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 30 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 20 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 15 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 15 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 15 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 15 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 20 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
169 801 dalszy ciąg
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
| 60 | 1 | blokada przepłukiwania | 6 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 61 | 6 | odprowadzanie ścieków do odbieralnika | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 62 | 82 | nr 14 do ścieków | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 63 | 14 | nr 14 na kolumnę | 50 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | nie |
| 64 | 1 | blokada przepłukiwania | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | nie |
| 65 | 10 | nr 18 do ścieków | 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | nie |
| 66 | 9 | nr 18 na kolumnę | 20 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | nie |
| 67 | 2 | płukanie w odwrotnym kierunku | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | nie |
| 68 | 1 | blokada przepłukiwania | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 69 | 7 | ścieki do butelki | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 70 | 9 | nr 18 na kolumnę | 15 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 71 | 2 | płukanie w odwrotnym kierunku | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 72 | 9 | nr 18 na kolumnę | 15 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 73 | 2 | płukanie w odwrotnym kierunku | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 74 | 9 | nr 18 na kolumnę | 15 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 75 | 2 | płukanie w odwrotnym kierunku | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 76 | 9 | nr 18 na kolumnę | 15 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 77 | 2 | płukanie w odwrotnym kierunku | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 78 | 1 | blokada przepłukiwania | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| Numer etapu | Numer i nazwa funkcji | Czas etapu | Etap stosuje się do zasad | s N o & JS C- rt E | |||||||
| A | G | C | T | 5 | 6 | 6 | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
| 1 | 10 | nr 18 do ścieków | 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 2 | 9 | nr 18 na kolumnę | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 3 | 2 | płukanie w odwrotnym kierunku | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 4 | 1 | blokada przepłukiwania | 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 5 | 28 | przygotowanie fosforynoamidu | 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 6 | +45 | włączenie grupy 1 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 7 | 90 | tetrazol na kolumnę | 6 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 8 | 19 | zasada + tetrazol na kolumnę 1 | 7 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 9 | 90 | tetrazol na kolumnę | 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 10 | 19 | zasada + tetrazol na kolumnę 1 | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 11 | 90 | tetrazol na kolumnę | 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 12 | 19 | zasada +tetrazol na kolumnę | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 13 | 9 | na 18 na kolumnę | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 14 | -46 | wyłączenie kolumny 1 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 15 | +47 | włączenie grupy 2 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 16 | 10 | nr 18 do ścieków | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 17 | 1 | blokada przepłukiwania | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 18 | 90 | tetrazol na kolumnę | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 19 | 20 | zasada + tetrazol na kolumnę 2 | 7 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 20 | 90 | tetrazol na kolumnę | 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 21 | 20 | zasada + tetrazol na kolumnę 2 | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 22 | 90 | tetrazol na kolumnę | 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
169 801 dalszy ciąg
| 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 |
| zasada + tetrazol na kolumnę 2 | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| nr 18 na kolumnę | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| wyłączenie grupy 2 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| włączenie grupy 3 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| nr 18 do ścieków | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| blokada przepłukiwania | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | lak |
| tetrazol na kolumnę | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| zasada + tetrazol na kolumnę 3 | 7 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| tetrazol na kolumnę | 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| zasada + tetrazol na kolumnę 3 | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| tetrazol na kolumnę | 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| zasada + tetrazol na kolumnę 3 | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| nr 18 na kolumnę | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| wyłączenie grupy 3 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| czekanie | 15 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| przygotowanie reagentu zabezpieczającego | 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| nr 18 do ścieków | 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| płukanie w odwrotnym kierunku | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| blokada przepłukiwania | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| odczynnik zabezpieczający na kolumnę | 12 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| nr 18 do ścieków | 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| czekanie | 8 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| płukanie w kierunku odwrotnym | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| blokada przepłukiwania | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| nr 15 do ścieków | 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| nr 15 na kolumnę | 12 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| nr 18 do ścieków | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| czekanie | 15 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| płukanie w kierunku odwrotnym | 6 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| blokada przepłukiwania | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| nr 18 na kolumnę | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| płukanie do ścieków | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| nr 18 na kolumnę | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| płukanie w kierunku odwrotnym | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| nr 18 na kolumnę | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| płukanie w kierunku odwrotnym | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| nr 18 na kolumnę | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | lak | tak | tak |
| płukanie w odwrotnym kierunku | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| blokada przepłukiwania | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| wejście cyklu | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| nr 18 do ścieków | 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| nr 18 na kolumnę | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| płukanie w kierunku odwrotnym | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| blokada przepłukiwania | 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| odprowadzenie ścieków | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| nr 14 do ścieków | 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | nie |
| nr 14 na kolumnę | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | nie | |
| płukanie do ścieków | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | nie | |
| nr 14 na kolumnę | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | nie |
| płukanie do ścieków | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | nie |
| nr 14 na kolumnę | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | lak | nie |
169 801 dalszy ciąg
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
| 74 | 34 | płukanie do ścieków | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | nie |
| 75 | 14 | nr 14 na kolumnę | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | nie |
| 76 | 34 | płukanie do ścieków | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | nie |
| 77 | 14 | nr 14 na kolumnę | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | nie |
| 78 | 34 | płukanie do ścieków | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | nie |
| 79 | 14 | nr 14 na kolumnę | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | nie |
| 80 | 34 | płukanie do ścieków | 8 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 81 | 9 | nr 18 na kolumnę | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | nie |
| 82 | 34 | płukanie do ścieków | 8 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | nie |
| 83 | 1 | blokada przepłukiwania | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 84 | 7 | odprowadzenie ścieków do butelki | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 85 | 5 | zbiornik frakcji wyprzedzającej | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 86 | 9 | nr 18 na kolumnę | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 87 | 2 | płukanie w odwrotnym kierunku | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 88 | 9 | nr 18 na kolumnę | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 89 | 2 | płukanie w odwrotnym kierunku | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 90 | 1 | blokada przepłukiwania | 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| Numer etapu | Numer i nazwa funkcji | Czar etapu | Etap stosuje się do zasad | Etap bezpieczny | |||||||
| A | G | C | T | 5 | 6 | 7 | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
| 1 | 10 | nr 18 do ścieków | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 2 | 9 | nr 18 na kolumnę | 15 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 3 | 2 | płukanie w odwrotnym kierunku | 20 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 4 | 1 | blokada przepłukiwania | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 5 | 28 | przygotowanie fosforynoamidu | 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 6 | +45 | włączenie grupy 1 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 7 | 90 | tetrazol na kolumnę | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 8 | 19 | zasada + tetrazol na kolumnę 1 | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 9 | 90 | tetrazol na kolumnę | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 10 | -56 | wyłączenie grupy 1 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 11 | +47 | włączenie grupy 2 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 12 | 90 | tetrazol na kolumnę | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 13 | 20 | zasada + tetrazol na kolumnę 2 | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 14 | 90 | tetrazol na kolumnę | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 15 | -48 | wyłączenie grupy 2 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 16 | +49 | włączenie grupy 3 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 17 | 90 | tetrazol na kolumnę | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 18 | 21 | zasada + tetrazol na kolumnę 3 | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 19 | 90 | tetrazol na kolumnę | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 20 | -50 | wyłączenie grupy 3 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 21 | 4 | czekanie | 30 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 22 | +45 | włączenie grupy 1 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 23 | 90 | tetrazol na kolumnę | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 24 | 19 | zasada + tetrazol na kolumnę 1 | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
169 801 dalszy ciąg
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
| 25 | 90 | tetrazol na kolumnę | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 26 | -46 | wyłączenie grupy 1 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 27 | +47 | włączenie grupy 2 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 28 | 90 | tetrazol na kolumnę | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 29 | 20 | zasada + tetrazol na kolumnę 2 | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 30 | 90 | tetrazol na kolumnę | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 31 | -48 | wyłączenie grupy 2 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 32 | +49 | włączenie grupy 3 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 33 | 90 | tetrazol na kolumnę | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 34 | 21 | zasada + tetrazol na kolumnę 3 | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 35 | 90 | tetrazol na kolumnę | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 36 | -50 | wyłączenie grupy 3 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 37 | 4 | czekanie | 30 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 38 | +45 | włączenie grupy 1 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 39 | 90 | tetrazol na kolumnę | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 40 | 19 | zasada + tetrazol na kolumnę 1 | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 41 | 90 | tetrazol na kolumnę | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 42 | -46 | wyłączenie grupy 1 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 43 | +47 | włączenie grupy 2 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 44 | 90 | tetrazol na kolumnę | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 45 | 20 | zasada + tetrazol na kolumnę 2 | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 46 | 90 | tetrazol na kolumnę | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 47 | -48 | wyłączenie grupy 2 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 48 | +49 | włączenie grupy 3 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 49 | 90 | tetrazol na kolumnę | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 50 | 21 | zasada + tetrazol na kolumnę 3 | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 51 | 90 | tetrazol na kolumnę | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 52 | -50 | wyłączenie grupy 3 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 53 | 4 | czekanie | 30 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 54 | +45 | włączenie grupy 1 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 55 | 90 | tetrazol na kolumnę | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 56 | 19 | zasada + tetrazol na kolumnę 1 | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 57 | 90 | tetrazol na kolumnę | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 58 | -46 | wyłączenie grupy 1 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 59 | +47 | włączenie grupy 2 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 60 | 90 | tetrazol na kolumnę | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 61 | 20 | zasada + tetrazol na kolumnę 2 | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 62 | 90 | tetrazol na kolumnę | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 63 | -48 | wyłączenie grupy 2 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 64 | +49 | włączenie grupy 3 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 65 | 90 | tetrazol na kolumnę | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 66 | 21 | zasada + tetrazol na kolumnę 3 | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 67 | 90 | tetrazol na kolumnę | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 68 | -50 | wyłączenie grupy 3 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 69 | 4 | czekanie | 30 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 70 | +45 | włączenie grupy 1 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 71 | 90 | tetrazol na kolumnę | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 72 | 19 | zasada + tetrazol na kolumnę 1 | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 73 | 90 | tetrazol na kolumnę | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 74 | -46 | wyłączenie grupy 1 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 75 | +47 | włączenie grupy 2 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
169 801 dalszy ciąg
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
| 76 | 90 | tetrazol na kolumnę | 4 | tak | lak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 77 | 20 | zasada + tetrazol na kolumnę 2 | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 78 | 90 | tetrazol na kolumnę | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 79 | -48 | wyłączenie grupy 2 | 1 | tak | tak | tak | tak | lak | tak | tak | tak |
| 80 | +49 | włączenie grupy 3 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 81 | 90 | tetrazol na kolumnę | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 82 | 21 | zasada + tetrazol na kolumnę 3 | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 83 | 90 | tetrazol na kolumnę | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 84 | -50 | wyłączenie grupy 3 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 85 | 4 | czekanie | 30 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 86 | +45 | włączenie grupy 1 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 87 | 90 | tetrazol na kolumnę | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 88 | 19 | zasada + tetrazol na kolumnę 1 | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 89 | 90 | tetrazol na kolumnę | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak , | tak | tak |
| 90 | -46 | wyłączenie grupy 1 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 91 | +47 | włączenie grupy 2 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 92 | 90 | tetrazol na kolumnę | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 93 | 20 | zasada + tetrazol na kolumnę 2 | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 94 | 90 | tetrazol na kolumnę | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 95 | -48 | wyłączenie grupy 2 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | lak |
| 96 | +49 | włączenie grupy 3 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 97 | 90 | tetrazol na kolumnę | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 98 | 21 | zasada + tetrazol na kolumnę 3 | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 99 | 90 | tetrazol na kolumnę | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 100 | -50 | wyłączenie grupy 3 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 101 | 4 | czekanie | 30 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 102 | +45 | włączenie grupy 1 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 103 | 90 | tetrazol na kolumnę | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 104 | 19 | zasada + tetrazol na kolumnę 1 | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 105 | 90 | tetrazol na kolumnę | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 106 | -46 | wyłączenie grupy 1 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 107 | +47 | włączenie grupy 2 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 108 | 90 | tetrazol na kolumnę | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 109 | 20 | zasada + tetrazol na kolumnę 2 | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 110 | 90 | tetrazol na kolumnę | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 111 | -48 | wyłączenie grupy 2 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 112 | +49 | włączenie grupy 3 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 113 | 90 | tetrazol na kolumnę | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 114 | 21 | zasada + tetrazol na kolumnę 3 | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 115 | 90 | tetrazol na kolumnę | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 116 | -50 | wyłączenie grupy 3 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 117 | 4 | czekanie | 30 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 118 | +45 | włączenie grupy 1 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 119 | 90 | tetrazol na kolumnę | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 120 | 19 | zasada + tetrazol na kolumnę 1 | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 121 | 90 | tetrazol na kolumnę | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 122 | -46 | wyłączenie grupy 1 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 123 | +47 | włączenie grupy 2 | 1 | tak | tak | tak | lak | tak | tak | tak | tak |
| 124 | 90 | tetrazol na kolumnę | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 125 | 20 | zasada + tetrazol na kolumnę 2 | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 126 | 90 | tetrazol na kolumnę | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
169 801 dalszy ciąg
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
| 127 | -48 | wyłączenie grupy 2 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 128 | +49 | włączenie grupy 3 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 129 | 90 | tetrazol na kolumnę | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 130 | 21 | zasada + tetrazol na kolumnę 3 | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 131 | 90 | tetrazol na kolumnę | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 132 | -50 | wyłączenie grupy 3 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 133 | 4 | czekanie | 30 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 134 | +45 | włączenie grupy 1 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 135 | 90 | tetrazol na kolumnę | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 136 | 19 | zasada + tetrazol na kolumnę 1 | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 137 | 90 | tetrazol na kolumnę | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 138 | -46 | wyłączenie grupy 1 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 139 | +47 | włączenie grupy 2 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 140 | 90 | tetrazol na kolumnę | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 141 | 20 | zasada + tetrazol na kolumnę 2 | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 142 | 90 | tetrazol na kolumnę | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 143 | -48 | wyłączenie grupy 2 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 144 | +49 | włączenie grupy 3 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 145 | 90 | tetrazol na kolumnę | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 146 | 21 | zasada + tetrazol na kolumnę 3 | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 147 | 90 | tetrazol na kolumnę | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 148 | -50 | wyłączenie grupy 3 | 1 | tak | tak | tak | tak | 'tak | tak | tak | tak |
| 149 | 4 | czekanie | 30 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| .150 | 16 | przygotowanie reagentu zabezpieczającego | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 151 | 10 | nr 18 do ścieków | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 152 | 2 | płukanie w kierunku odwrotnym | 10 | tak | tak | lak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 153 | 1 | blokada płukania | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 154 | +45 | włączenie grupy 1 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 155 | 22 | odczynniki zabezpieczające na kolumnę 1 | 26 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 156 | -46 | wyłączenie grupy 1 | 1 | tak | tak | tak | tak | lak | tak | tak | tak |
| 157 | +47 | włączenie grupy 2 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 158 | 23 | odczynniki zabezpieczające na kolumnę 2 | 21 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 159 | -48 | wyłączenie grupy 2 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 160 | +49 | włączenie grupy 3 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 161 | 24 | odczynniki zabezpieczające na kolumnę 3 | 21 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 162 | -50 | wyłączenie grupy 3 | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 163 | 4 | czekanie | 30 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 164 | 10 | nr 18 do ścieków | 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 165 | 2 | płukanie w kierunku odwrotnym | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 166 | 1 | blokada płukania | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 167 | 81 | nr 15 do ścieków | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 168 | 13 | nr 15 na kolumnę | 16 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 169 | 4 | czekanie | 30 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 170 | 10 | nr 18 do ścieków | 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 171 | 2 | płukanie w kierunku odwrotnym | 20 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 172 | 1 | blokada płukania | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 173 | 9 | nr 18 na kolumnę | 15 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 174 | 2 | płukanie w kierunku odwrotnym | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 175 | 9 | nr 18 na kolumnę | 15 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 176 | 2 | płukanie w kierunku odwrotnym | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 177 | 9 | nr 18 na kolumnę | 15 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
169 801 dalszy ciąg
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
| 178 | 2 | płukanie w kierunku odwrotnym | 9 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 179 | 9 | nr 18 na kolumnę | 15 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 180 | 2 | płukanie w kierunku odwrotnym | 9 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 181 | 1 | blokada płukania | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 182 | 33 | wejście cyklu | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 183 | 10 | nr 18 do ścieków | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 184 | 9 | nr 18 na kolumnę | 15 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 185 | 2 | płukanie w kierunku odwrotnym | 9 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 186 | 1 | blokada płukania | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 187 | 6 | odprowadzenie ścieków do odbieralnika | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 188 | 82 | nr 14 do ścieków | 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 189 | 14 | nr 14 na kolumnę | 65 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 190 | 1 | blokada płukania | 6 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | nie |
| 191 | 7 | odprowadzenie ścieków do butelki | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 192 | 5 | zbiornik frakcji wyprzedzającej | 1 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 193 | 10 | nr 18 do ścieków | 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 194 | 9 | nr 18 na kolumnę | 15 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | nie |
| 195 | 2 | płukanie w kierunku odwrotnym | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | nie |
| 196 | 9 | nr 18 na kolumnę | 15 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 197 | 2 | płukanie w kierunku odwrotnym | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 198 | 9 | nr 18 na kolumnę | 15 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 199 | 2 | płukanie w kierunku odwrotnym | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 200 | 1 | blokada płukania | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| Numer etapu | Numer i nazwa funkcji | Czar etapu | Etap stosuje się do zasad | Eaap bezpieczny | |||||||
| A | G | C | T | 5 | 6 | 7 | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
| 1 | 10 | nr 18 do ścieków | 2 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 2 | 9 | nr 18 na kolumnę | 15 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 3 | 2 | płukanie w kierunku odwrotnym | 20 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 4 | 1 | blokada płukania | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 5 | 16 | przygotowanie reagentu zabezpieczającego | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 6 | 91 | reagent zabezpieczający na kolumnę | 30 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 7 | 10 | nr 18 do ścieków | 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 8 | 1 | blokada płukania | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 9 | 4 | czekanie | 300 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 10 | 16 | przygotowanie reagentu zabezpieczającego | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 11 | 91 | reagent zabezpieczający na kolumnę | 30 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 12 | 10 | nr 18 do ścieków | 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 13 | 1 | blokada płukania | 4 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 14 | 4 | czekaniea | 300 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 15 | 2 | płukanie w kierunku odwrotnym | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 16 | 10 | nr 18 do ścieków | 3 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 17 | 9 | nr 18 na kolumnę | 15 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 18 | 2 | płukanie w kierunku odwrotnym | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
169 801 dalszy ciąg
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
| 19 | 9 | nr 18 na kolumnę | 15 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 20 | 2 | płukanie w kierunku odwrotnym | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 21 | 9 | nr 18 na kolumnę | 15 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 22 | 2 | płukanie w kierunku odwrotnym | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 23 | 9 | nr 18 na kolumnę | 15 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 24 | 2 | płukanie w kierunku odwrotnym | 10 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 25 | 9 | nr 18 na kolumnę | 15 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
| 26 | 2 | płukanie w kierunku odwrotnym | 60 | tak | tak | tak | lak | tak | tak | tak | tak |
| 27 | 1 | blokada płukania | 5 | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak | tak |
Funkcje syntetyzera DNA
MANIPULACJE I KONTROLA
- blokada przepłukiwania strumieniem cieczy
- płukanie strumieniem cieczy w kierunku odwrotnym
- czekanie
- zbiornik frakcji wyprzedzającej (wstępnej)
- odprowadzenie ścieków do odbieralnika
- odprowadzenie ścieków do butelki 17 - Przerwa
- włączenie przyrządu rejestrującego
- wyłączenie przyrządu rejestrującego
- wejście cyklu
- (zarezerwowana)
- włączenie przekaźnika nr 3
- wyłączenie przekaźnika nr 3
- praca pulsacyjna przekaźnika nr 3
- włączenie przekaźnika nr 4
- wyłączenie przekaźnika nr 4
- praca pulsacyjna przekaźnika nr 4
- włączenie grupy 1
- wyłączenie grupy 1
- włączenie grupy 2
- wyłączenie grupy 2
- włączenie grupy 3
- wyłączenie grupy 3
- (zarezerwowana)
PODAWANIE NA KOLUMNĘ
- nr 18 na kolumnę
- nr 17 na kolumnę
- nr 16 na kolumnę
- nr 15 na kolumnę
- nr 14 na kolumnę
- nr 13 na kolumnę
- zasada + tetrazol na kolumnę 1
- zasada + tetrazol na kolumnę 2
- zasada + tetrazol na kolumnę 3
- odczynnik zabezpieczający A + odczynnik zabezpieczający B na kolumnę 1
- odczynnik zabezpieczający A + odczynnik zabezpieczający B na kolumnę 2
169 801
- odczynnik zabezpieczający A + odczynnik zabezpieczający B na kolumnę 3
- nr 8 na kolumnę
- tetrazol na kolumnę
DOSTARCZANIE DO FIOLKI ZBIORCZEJ
- przzpłukiwnaie stsumieenem cieczyw cclu zebbaana
- nr 10 w celu zbierania
PRZEMYWANIE ZAWORÓW
- nr 118 do ścieków
- nr 16 do ścieków
- nr 17 do ścieków
PRZYGOTOWANIE REAGENTÓW
16- przygotowanie reagentu zabezpieczającego
- przygotowanie fosfoanóoamidu
ZBIORNIKI ODPOWIETRZAJĄCE
41- nr 18 odpowietrzanie nr 10 odpowietrzanie
FUNKCJE DLA UŻYTKOWNIKA
- nieokreślona
- nieokreślona
- nieokreślona
- nieokreślona
- nieokreślona
- nieokreślona
- nieokreślona
- nieokreślona
ZBIORNIKI NA SUBSTANCJE NIEPOŻĄDANE
- nr 17 do nr 18
- nr 18 usunąć
- fosforynoamid usunąć
- tetrazol usunąć
PIERWSZE LINIE ZASILANIA
- A do ścieków
- G do ścieków
- C do ścieków
- T do ścieków
- nr 5 do ścieków
- nr 6 do ścieków
- nr 7 do ścieków
- odczynnik zabezpieczający A do ścieków
- odczynnik zabezpieceαjązn B do ścieków
- tetrazol do ścieków
- nr 8 do ścieków
- nr 10 do ścieków nr 15 do ścieków
- nr 14 do ścieków
- nr 13 do ścieków
169 801
DOSTARCZANIE ARGONU DO ZBIORNIKÓW
- przepływ do nr 8
- przepływ do A
- przepływ do G
- przepływ do C
- przepływ do T
- przepływ do nr 5
- przepływ do nr 6
- przepływ do nr 7
- przepływ do tetrazołu
- przepływ do nr 18
- przepływ do nr 14 + nr 15
- przepływ do nr 11 + nr 12
- przepływ do nr 10
DOSTARCZANIE ACETONITRYLU DO ZBIORNIKÓW
- nr 18 do A
- nr 18 do G
- nr 18 do C
- nr 18 do T
- nr 18 do nr 5
- nr 18 do nr 6
- nr 18 do nr 7
- nr 18 do tetrazołu
- nr 18 do nr 14 + nr 15
- nr 18 do nr 11 + nr 12
- nr 18 do nr 10
169 801
Wylot 12 1--lj--1--1--j--j--Wylot 5 Wylot 1
| > - | Ί | oo |
| 1 | ΐ·-_··_υ | T“ |
Π
N fS
O
N ro co -► o
N <0 Ci o
| ) | CO | |
| .,,..-2 |
f
CM
LO <
o l·-
N to o
>ł
S co
Od <1)
-H
C <0 fM <0 •H
N
Ό •H +>
(0 ε
tu
Λ
O w
syntetyzera DNA, model 380 A/B
169 801 o σι co CO tO tO UO ·—·~σ·—♦· • · s* · i ił •rl I 4J
Ό ΪΝ Φ O H •rl Oi 4J O
U3 fi •rl 44 C -rl t
N (0 o
(0 c
e
O
CO
-rl Sj +> N 0) cm τ- o σ> w to to
ta c
e o
Kolumna
co <0 c
g o
rH o
co o to rH
Sn
| * | co g Φ | |
| u | ||
| z | co | |
| Cl | Sn | |
| <0 | n o | |
| n | •r| | |
| Φ | m | |
| N >1 | Ό | |
| +J | φ | |
| V | •r| | |
| 4-1 | r-1 | |
| c | Ol | |
| >1 | Ol | |
| co | < | |
| Φ | Sn | |
| •H | g | |
| G | Li | |
| ta | •r| | |
| i*rl | M-l | |
| Λ •rl | n | - |
| N | >1 | |
| Ό | N | |
| •rl | O | (0 i—1 |
| 00 | (C | |
| -U | m | Ό |
| (fl g | r-l | tP |
| Φ | Φ | «tf |
| 43 | Ό | •rl |
| O | O | Φ |
| W | g | —· |
•®· co
4J
O <—( >1 £
169 801
Ścieki
Kolumna 1 Kolumna 2 Kolumna 3 Α0
Tetrazol
| 27 26 | I • · I • · | | (AcJgO |
| 25 | I • · · I | *— DMAP |
| 24 | I • ·· I | — NH4OH |
| 23 | I • ·· I | ·*— Tiofenol |
| 22 | I • ·· I | — CH3CN |
| 21 | I • ·· | | — TCA |
| 20 | I • ·· | | — I2 |
| 19 | I • · | | CH3CN |
| 18 | I • ·· I | — CH3OH |
| 17 | I • · I | — CH3CN |
| 16 | I • · I | -«— Gaz |
w
ΊΓ ΰ
Ϊ6
Ϊ8
Schemat i działanie syntetyzera DNA, model 380 A/B firmy Applied Biosystems (ciąg dalszy)
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 6,00 zł
Claims (30)
1. Sposób wytwarzania wielkiego, rozgałęzionego polinukleotydu o strukturze grzebienia, użytecznego jako multimer amplifikacyjny w próbie hybrydyzacji kwasu nukleinowego, zna« mienny tym, że syntetyzuje się jednoniciowy główny łańcuch polinukleotydowy zawierający co najmniej około 15 wielofunkcyjnych nukleotydów, z których każdy posiada zablokowaną funkcyjną grupę służącą jako miejsce przedłużenia nukleotydowego łańcucha bocznego oraz segment z pierwszym miejscem ligacji, odblokowuje się te grupy funkcyjne, przyłącza się do każdego z tych miejsc co najmniej około pięć nukleotydów w celu uzyskania segmentów z drugim miejscem ligacji, prowadzi się ligację pierwszej jednoniciowej jednostki oligonukleotydowej z pierwszym miejscem ligacji, gdzie ta pierwsza jednoniciowa jednostka oligonukleotydowa ma zdolność wiązania się z pierwszą żądaną jednoniciową sekwencją kwasu nukleinowego oraz prowadzi się ligację drugich jednoniciowych jednostek oligonukleotydowych z segmentami z drugimi miejscami ligacji, gdzie te drugie jednoniciowe jednostki oligonukleotydowe zawierają powtórzenie sekwencji zdolnych do wiązania się z drugim, żądanym jednoniciowym oligonukleotydem.
(2) (2) (2) (2) (2) (2) (CH2)x (CH2)x (CH2)x (CH2)x
O (1)
II
NH - C - O O (1)
II
NH - C - (CH2)y - O O albo ch2 - CH2 - O)x (1) (1)
- (CH2)X - O w którym x i y są takie same lub różne i oznaczają liczby całkowite w zakresie 1 do 8 włącznie, S zawiera 5 do 10 nukleotydów a ilość powtórzeń w segmencie L wynosi 3 do 6.
(2) (CH2)x (CH2)x (CH2)x o (1)
II
NH - C - (CK2)y - O o (1)
II
S-S - (CH2)y -O (2)
- (CH2 - ch2 - O)x (2) (1) (CH2)y - O albo (1)
- (CH2)x - O w których x i y są takie same lub różne i oznaczają liczby całkowite w zakresie 1 do 8 włącznie.
169 801
(2) O (1) (CH2),
NH (2;
(CH2)y O (CH2)x - NH (2)
169 801 (1) (2) (CH2 - CH2 - O)x (1) albo
- (CH2)x - 0 w których x i y są takie same lub różne i oznaczają liczby całkowite w zakresie 1 do 8 włącznie, S zawiera 5 do 10 nukleotydów, a ilość powtórzeń w segmencie L wynosi 3 do 6.
(2) (2)
O (1) “ (CH2)x - NH - C (1)
- (CH2)x - nh - C - (CH2)y - O 169 801 (2) (2) (2) (2)
CH2 - CH2 - O)x - albo (U
- (CH2)x - 0 w których x i y są takie same lub różne i oznaczają liczby całkowite w zakresie 1 do 8 włącznie.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że syntezę i wydłużenie łańcucha prowadzi się w fazie stałej, przy czym z fazą stałą wiąże się koniec 3’ łańcucha głównego, który to łańcuch główny zawiera sekwencję 3’-liderową złożoną z co najmniej około 15 nukleotydów.
3’ S - (XS’)m (R)n - S” - A 5’
S’ ’ ’ (R)
L w którym S oznacza pierwszy segment wypełniający złożony z co najmniej około 15 nukleotydów, X oznacza wielofunkcyjny nukleotyd z miejscem rozgałęzienia, S' oznacza segment wypełniający miejsce rozgałęzienia złożony z 0 do około 15 nukleotydów, m oznacza liczbę całkowitą równą lub większą od 15, R oznacza rozszczepialną cząsteczkę łącznikową, n oznacza zero albo 1, S oznacza drugi segment wypełniający złożony z 0 do 10 nukleotydów, A oznacza segment nukleotydowy zdolny do hybrydyzacji specyficznej z analizowanym kwasem nukleinowym albo z kwasem nukleinowym związanym z analizowaną substancją, S' oznacza trzeci segment wypełniający złożony z 0 do 10 nukleotydów, E oznacza wydłużenie oligonukleotydowe złożone z 5 do 10 nukleotydów, L oznacza segment zawierający 2 do 10 powtórzeń sekwencji nukleotydowej zdolnej do specyficznej hybrydyzacji ze znakowaną sondą oligonukleotydową poddaje się hybrydyzacji poprzez pierwszą jednostkę oligonukleotydową z jednoniciowym analizowanym kwasem nukleinowym związanym z fazą stałą albo hybrydyzacji z jednoniciowym oligonukleotydem związanym z analizowaną substancją, usuwa się niezwiązany rozgałęziony polinukleotyd, jednoniciowy, znakowany oligonukleotyd poddaje się hybrydyzacji z rozgałęzionym polinukleotydem poprzez drugie jednostki oligonukleotydowe, usuwa się niezwiązany znakowany oligonukleotyd i wykrywa się obecność znacznika związanego z tym rozgałęzionym polinukleotydem.
3' S - (XS’)m - (R)n - S - A 5' (R)n
E
L w którym S oznacza pierwszy segment wypełniający złożony z co najmniej około 15 nukleotydów, X oznacza wielofunkcyjny nukleotyd z miejscem rozgałęzienia, S' oznacza
169 801 segment wypełniający miejsce rozgałęzienia złożony z 0 do około 15 nukleotydów, m oznacza liczbę całkowitą równą lub większą od 15, R oznacza rozszczepialną cząsteczkę łącznikową, n oznacza zero albo 1, S oznacza drugi segment wypełniający złożony z 0 do 10 nukleotydów, A oznacza segment nukleotydowy zdolny do hybrydyzacji specyficznej z analizowanym kwasem nukleinowym albo z kwasem nukleinowym związanym z analizowaną substancją, S' oznacza trzeci segment wypełniający złożony z 0 do 10 nukleotydów, E oznacza wydłużenie oligonukleotydowe złożone z 5 do 10 nukleotydów, L oznacza segment zawierający 2 do 10 powtórzeń sekwencji nukleotydowej zdolnej do specyficznej hybrydyzacji ze znakowaną sondą oligonukleotydową bezpośrednio lub pośrednio z analizowaną substancją poprzez pierwszą jednoniciowąjednostkę oligonukleotydową i następnie hybrydyzuje się znakowaną sondą kwasu nukleinowego z tym rozgałęzionym, polinukleotydem poprzez drugą jednoniciową jednostkę oligonukleotydową.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako fazę stałą stosuje się szkło o kontrolowanej wielkości porów, wynoszącej co najmniej 2000 A.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że w miejscach wydłużenia występujących w nukleotydach wielofunkcyjnych włącza się wydłużenie 5-10 nukleotydowe.
5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się wielofunkcyjny nukleotyd o wzorze .
Łańcuch główny łańcuch główny w którym R2 oznacza grupę o wzorze
169 801 albo o wzorze
6. Sposób wytwarzania wielkiego, rozgałęzionego polinukleotydu o strukturze grzebienia, użytecznego jako multimer amplifikacyjny w próbie hybrydyzacji kwasu nukleinowego, znamienny tym, że syntetyzuje się jednoniciowy główny łańcuch polinukleotydowy zawierający co najmniej około 15 wielofunkcyjnych nukleotydów, z których każdy posiada zablokowaną funkcyjną grupę służącą jako miejsce przedłużenia nukleotydowego łańcucha bocznego oraz pierwszą jednoniciową jednostkę oligonukleotydową zdolną do specyficznego wiązania z pierwszą żądaną jednoniciową sekwencją polinukleotydową, odblokowuje się te grupy funkcyjne, przyłącza się do każdego z tych miejsc co najmniej około pięć nukleotydów w celu uzyskania segmentów z drugim miejscem ligacji, prowadzi się ligację drugich jednoniciowych jednostek nukleotydowych do segmentów z miejscami ligacji, gdzie te drugie jednoniciowe jednostki oligonukleotydowe zawierają powtórzenie sekwencji zdolnych do wiązania się z drugim żądanym oligunukleotydem.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że stosuje się wielofunkcyjny nukleotyd o wzorze:
Łańcuch główny łańcuch główny w którym oznacza grupę o wzorze albo o wzorze (MAC)
169 801
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że syntezę i wydłużenie łańcucha prowadzi się w fazie stałej, przy czym tą fazą stałą wiąże się koniec 3' łańcucha głównego, który to łańcuch główny zawiera sekwencję wypełniającą 3' złożoną z co najmniej około 15 nukleotydów.
9. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako fazę stałą stosuje się szkło o kontrolowanej wielkości porów wynoszącej co najmniej 2000 A.
10. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że w miejscach wydłużenia występujących w nukleotydach wielofunkcyjnych włącza się wydłużenia 5-10 nukleotydów.
11. Sposób wykonania próby hybrydyzacji kwasu nukleinowego przez poddanie analizowanego kwasu nukleinowego hybrydyzacji ze znakowaną sondą kwasu nukleinowego, znamienny tym, że poddaje się hybrydyzacji wielki rozgałęziony polinukleotyd o strukturze grzebienia zawierający polinukleotydowy łańcuch główny złożony z co najmniej 15 wielofunkcyjnych nukleotydów, z których każdy określa miejsce łańcucha bocznego oraz pierwszej jednoniciowej jednostki oligonukleotydowej zdolnej do specyficznego wiązania z pierwszą żądaną jednoniciową sekwencją polinukleotydową a także zwisające polinukleotydowe łańcuchy boczne rozciągające się od tych wielofunkcyjnych nukleotydów, przy czym każdy z tych łańcuchów bocznych posiada powtórzenia drugiej jednoniciowej jednostki oligonukleotydowej zdolnej do specyficznego wiązania z drugą żądaną, jednoniciową sekwencją polinukleotydową, a ogólna ilość powtórzeń we wszystkich łańcuchach bocznych wynosi co najmniej około 20, przy czym dla polinukleotydu tego pierwszą żądaną jednoniciową sekwencję polinukleotydową stanowi analizowany kwas nukleinowy albo polinukleotyd związany z analizowanym kwasem nukleinowym a drugą żądaną jednoniciową sekwencję polinukleotydową stanowi znakowany polinukleotyd.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że stosuje się rozgałęziony polinukleotyd zawierający od 15 do 50 wielofunkcyjnych nukleotydów.
13. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że stosuje się wielofunkcyjny nukleotyd o wzorze:
łańcuch boczny I /1/ łańcuch główny /2/ łańcuch główny w którym R3 oznacza wodór, grupę metylową, jod, brom albo fluor, R4 oznacza wodór albo grupę metylową, Z oznacza grupę przedstawioną wzorem:
14. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że stosuje się rozgałęziony polinukleotyd, w którym pierwsza i druga, jednoniciowe jednostki oligonukleotydowe zawierają po 15 do 50 nukleotydów.
15. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że stosuje się rozgałęziony polinukleotyd, w którym to polinukleotydzie ilość powtórzeń w każdym łańcuchu bocznym wynosi od 2 do 10.
16. Sposób wykonania próby hybrydyzacji kwasu nukleinowego przez poddanie hybrydyzacji analizowanego kwasu nukleinowego ze znakowaną sondą kwasu nukleinowego, znamienny tym, że hybrydyzacji poddaje się rozgałęziony polinukleotyd, zawierający polinukleotydowy łańcuch główny złożony z co najmniej 15 wielofunkcyjnych nukleotydów, z których każdy określa miejsce łańcucha bocznego oraz pierwszej jednoniciowej jednostki oligonukleotydowej zdolnej do specyficznego wiązania z pierwszą żądaną jednoniciową sekwencją polinukleotydową a także zwisające polinukleotydowe łańcuchy boczne rozciągające się od tych wielofunkcyjnych nukleotydów, przy czym każdy z tych łańcuchów bocznych posiada powtórzenia drugiej jednoniciowej jednostki oligonukleotydowej zdolnej do specyficznego wiązania z drugą żądaną, jednoniciową sekwencją polinukleotydową, a ogólna ilość powtórzeń we wszystkich łańcuchach bocznych wynosi co najmniej około 20 o strukturze przedstawionej wzorem:
17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że stosuje się rozgałęziony polinukleotyd, w którym to polinukleotydzie S zawiera 15 do 50 nukleotydów, X ma budowę przedstawioną wzorem: łańcuch boczny łańcuch główny _ łańcuch główny w którym R3 oznacza wodór albo grupę metylową, jod, brom albo fluor, R4 oznacza wodór lub grupę metylową, Z oznacza grupę przedstawioną wzorem:
18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że stosuje rozgałęziony polinukleotyd, w którym to polinukleotydzie S oznacza poli T.
19. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że stosuje się rozgałęziony polinukleotyd, w którym to polinukleotydzie n oznacza 1.
20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że stosuje się rozgałęziony polinukleotyd, w którym to polinukleotydzie rozszczepialna cząsteczka łącznikowa ma budowę przedstawioną wzorem:
w którym DMT oznacza resztę dimetoksytrytylową, Bz oznacza resztę benzoilową, R5 oznacza grupę metylową albo β-cyjanoetylową a i Pr oznacza grupę izopropylową.
21. SposóS wykonania p^rót^y hybryhyzacjikwas unukleinowego, znamienny tym , że wielki rozgałęziony polinukleotyd o strukturze grzebienia zawierający polióukleotydown łańcuch główny złożony z co óaamóiea 15 wielofunkcyjnych nukleotydów, z których każdy określa miejsce łańcucha bocznego oraz pierwszej aedóoóicionea jednostki oligonukleotydowej zdolnej do specyficznego wiązania z pierwszą żądróąaedóoóiciową sekwencją polinukleotydową a także zwisające polinukleotydowe łańcuchy boczne rozciągające się od tych wielofunkcyjnych nukleotydów, przy czym każdy z tych łańcuchów bocznych posiada powtórzenia drugiej jednoniciowej jednostki oligonukleotydowej zdolnej do specyficznego wiązania z drugą żądaną, aedóoótciową sekwencją polinukleotydoną, a ogólna ilość powtórzeń we wszystkich łańcuchach bocznych wynosi co najmniej około 20, przy czym dla polióukleotndu tego pierwszą żądaną jedóoótciową sekwencję polióukleotydoną stanowi analizowany kwas nukleinowy albo polinukleotyd związany z analizowanym kwasem nukleinowym a drugą żądaną jednoniciową sekwencję polinukleotydową stanowi znakowany polmukleotyd, poddaje się hybrydyzacji poprzez pierwszą jednostkę oligonukleotydową z jedóoótcionnm analizowanym kwasem nukleinowym związanym z fazą stałą albo hybrydyzacji z aedóontciowym oligonukleotydem związanym z analizowaną substancją, usuwa się niezntązaóy rozgałęziony polinukleotyd, jednon^^y, znakowany oligonukleotyd poddaje się hybrydyzacji z rozgałęzionym polinukleotydem poprzez drugie jednostki oligonukleotydowe, usuwa się ótezntązaón znakowany oligonukleotyd i wykrywa się obecność znacznika związanego z tym rozgałęzionym polinukleotydem.
169 801
22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że stosuje się rozgałęziony polinukleotyd zawierający od 15 do 50 wielofunkcyjnych nukleotydów.
23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że stosuje się rozgałęziony polinukleotyd, w którym to polinukleotydzie wielofunkcyjny nukleotyd ma budowę przedstawioną wzorem:
łańcuch główny łańcuch boczny łańcuch główny w którym R3 oznacza wodór, grupę metylową, jod, brom albo fluor, R4 oznacza wodór albo grupę metylową, Z oznacza grupę przedstawioną wzorem:
24. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że stosuje się rozgałęziony polinukleotyd, w którym pierwsza i druga, jednoniciowe jednostki oligonukleotydowe zawierają po 15 do 50 nukleotydów.
25. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że stosuje się rozgałęziony polinukleotyd, w którym to polinukleotydzie ilość powtórzeń w każdym łańcuchu bocznym wynosi od 2 do 10.
26. Sposób wykonania próby hybrydyzacji kwasu nukleinowego, znamienny tym, że rozgałęziony polinukleotyd zawierający polinukleotydowy łańcuch główny złożony z co najmniej 15 wielofunkcyjnych nukleotydów, z których każdy określa miejsce łańcucha bocznego oraz pierwszej jednoniciowej jednostki oligonukleotydowej zdolnej do specyficznego wiązania z pierwszą żądaną jednoniciową sekwencją polinukleotydową a także zwisające polinukleotydowe łańcuchy boczne rozciągające się od tych wielofunkcyjnych nukleotydów, przy czym każdy z tych łańcuchów bocznych posiada powtórzenia drugiej jednostki oligonukleotydowej zdolnej do specyficznego wiązania z drugą żądaną, jednoniciową sekwencją polinukleotydową, a ogólna ilość powtórzeń we wszystkich łańcuchach bocznych wynosi co najmniej około 20 o strukturze przedstawionej wzorem:
27. SposóS wedbig eałtrz .26, zn2mienay tym,że stosuj e się rozgęłrzioay polinukleotud, w którym to polinukleotydzie S zawierają 15 do 50 nukleotydów, X ma budowę przedstawioną wzorem:
169 801 łańcuch główny łańcuch boczny
I /1/ łańcuch główny w którym R3 oznacza wodór albo grupę metylową, jod, brom albo fluor, R4 oznacza wodór lub grupę metylową, Z oznacza grupę przedstawioną wzorem:
28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że stosuje się rozgałęziony polinukleotyd, w którym to polinukleotydzie S oznacza poli T.
29. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że stosuje się rozgałęziony polinukleotyd, w którym to polinukleotydzie n oznacza 1.
169 801
30. SposóS wsóług eastg .29,zn2m i^ni^y i^e^my c; sto sue s sisrozgęłęzigay polinupleotyd, w którym to polinukleotydzie rozszczepialna cząsteczka łącznikowa ma budowę przedstawioną wzorem:
w którym DMT oznacza resztę dimetoksytrytylową, Bz oznacza resztę benzoilową, R5 oznacza grupę metylową albo β-cyjanoetylową a i Pr oznacza grupę izopropylową.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US55889790A | 1990-07-27 | 1990-07-27 | |
| PCT/US1991/005363 WO1992002526A1 (en) | 1990-07-27 | 1991-07-29 | Large comb-type branched polynucleotides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL297659A1 PL297659A1 (pl) | 1992-07-13 |
| PL169801B1 true PL169801B1 (pl) | 1996-08-30 |
Family
ID=24231439
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL91297659A PL169801B1 (pl) | 1990-07-27 | 1991-07-29 | sposób wykonania próby hybrydyzacji kwasu nukleinowego PL |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0541693B1 (pl) |
| JP (1) | JP2641322B2 (pl) |
| AT (1) | ATE174339T1 (pl) |
| AU (1) | AU8412991A (pl) |
| CA (1) | CA2087961A1 (pl) |
| DE (1) | DE69130612T2 (pl) |
| IE (1) | IE912662A1 (pl) |
| PL (1) | PL169801B1 (pl) |
| PT (1) | PT98489B (pl) |
| RU (1) | RU2142467C1 (pl) |
| WO (1) | WO1992002526A1 (pl) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07502658A (ja) * | 1991-12-23 | 1995-03-23 | バイエル コーポレイション | 溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイに用いるためのｈａｖプローブ |
| JPH07502653A (ja) * | 1991-12-23 | 1995-03-23 | カイロン コーポレイション | 溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイに用いるためのｈｂｖ増幅プローブ |
| US5561043A (en) * | 1994-01-31 | 1996-10-01 | Trustees Of Boston University | Self-assembling multimeric nucleic acid constructs |
| US5580731A (en) * | 1994-08-25 | 1996-12-03 | Chiron Corporation | N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith |
| AU7264196A (en) * | 1995-10-16 | 1997-05-07 | Chiron Corporation | Method of screening for factors that modulate gene expression |
| EP1645631B1 (en) | 1998-05-01 | 2007-10-24 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Neisseria antigens and compositions |
| US6203989B1 (en) | 1998-09-30 | 2001-03-20 | Affymetrix, Inc. | Methods and compositions for amplifying detectable signals in specific binding assays |
| CA2371843A1 (en) * | 1999-05-07 | 2000-11-16 | Yale University | Multiple tag analysis |
| US7700359B2 (en) | 2000-06-02 | 2010-04-20 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Gene products differentially expressed in cancerous cells |
| EP1370684B1 (en) | 2000-06-15 | 2008-05-28 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Polynucleotides related to colon cancer |
| US7776523B2 (en) | 2000-12-07 | 2010-08-17 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Endogenous retroviruses up-regulated in prostate cancer |
| SG148035A1 (en) | 2002-01-08 | 2008-12-31 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Gene products differentially expressed in cancerous breast cells and their methods of use |
| JP2005520543A (ja) | 2002-03-21 | 2005-07-14 | サイグレス ディスカバリー， インコーポレイテッド | 癌における新規組成物および方法 |
| AU2003276679A1 (en) | 2002-06-13 | 2003-12-31 | Chiron Corporation | Vectors for expression of hml-2 polypeptides |
| US20040170982A1 (en) | 2003-02-14 | 2004-09-02 | Morris David W. | Novel therapeutic targets in cancer |
| WO2004074321A2 (en) | 2003-02-14 | 2004-09-02 | Sagres Discovery, Inc. | Therapeutic gpcr targets in cancer |
| US7767387B2 (en) | 2003-06-13 | 2010-08-03 | Sagres Discovery, Inc. | Therapeutic targets in cancer |
| US20060024677A1 (en) | 2004-07-20 | 2006-02-02 | Morris David W | Novel therapeutic targets in cancer |
| US20090220495A1 (en) | 2005-04-07 | 2009-09-03 | Abdallah Fanidi | Cancer Related Genes (PRLR) |
| EP1865981A2 (en) | 2005-04-07 | 2007-12-19 | Chiron Corporation | Cacna1e in cancer diagnosis, detection and treatment |
| JP2008043332A (ja) * | 2006-08-17 | 2008-02-28 | Panomics Inc | 組織スライドからの核酸定量 |
| EP2699583A4 (en) * | 2011-04-21 | 2015-04-15 | Isis Pharmaceuticals Inc | MODULATION OF EXPRESSION OF HEPATITIS B VIRUS (HBV) |
| CN104995177A (zh) | 2012-12-14 | 2015-10-21 | 巴斯夫欧洲公司 | 用于防治动物害虫的丙二腈化合物 |
| US20190145961A1 (en) | 2016-04-20 | 2019-05-16 | Washington University | Ppar agonist or lxr agonist for use in the treatment of systemic lupus erythematosus by modulation of lap activity |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4626501A (en) * | 1983-09-02 | 1986-12-02 | Integrated Genetics, Inc. | Labeled DNA |
| US4843122A (en) * | 1984-01-30 | 1989-06-27 | Enzo Biochem, Inc. | Detectable molecules, method of preparation and use |
| US4755458A (en) * | 1984-08-30 | 1988-07-05 | Enzo Biochem, Inc. | Composition and method for the detection of the presence of a polynucleotide sequence of interest |
| US4868105A (en) * | 1985-12-11 | 1989-09-19 | Chiron Corporation | Solution phase nucleic acid sandwich assay |
| US4910300A (en) * | 1985-12-11 | 1990-03-20 | Chiron Corporation | Method for making nucleic acid probes |
| CA1339351C (en) * | 1987-10-15 | 1997-08-26 | Michael S. Urdea | Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same |
-
1991
- 1991-07-29 PT PT98489A patent/PT98489B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-07-29 PL PL91297659A patent/PL169801B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1991-07-29 IE IE266291A patent/IE912662A1/en unknown
- 1991-07-29 DE DE69130612T patent/DE69130612T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-29 CA CA002087961A patent/CA2087961A1/en not_active Abandoned
- 1991-07-29 JP JP3514126A patent/JP2641322B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-07-29 EP EP91915000A patent/EP0541693B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-29 AU AU84129/91A patent/AU8412991A/en not_active Abandoned
- 1991-07-29 AT AT91915000T patent/ATE174339T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-07-29 WO PCT/US1991/005363 patent/WO1992002526A1/en active IP Right Grant
- 1991-07-29 RU RU93004859A patent/RU2142467C1/ru active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1992002526A1 (en) | 1992-02-20 |
| RU2142467C1 (ru) | 1999-12-10 |
| AU8412991A (en) | 1992-03-02 |
| CA2087961A1 (en) | 1992-01-28 |
| EP0541693A4 (en) | 1994-07-20 |
| DE69130612D1 (de) | 1999-01-21 |
| EP0541693A1 (en) | 1993-05-19 |
| JPH05508862A (ja) | 1993-12-09 |
| ATE174339T1 (de) | 1998-12-15 |
| DE69130612T2 (de) | 1999-05-06 |
| JP2641322B2 (ja) | 1997-08-13 |
| PL297659A1 (pl) | 1992-07-13 |
| PT98489B (pt) | 1998-04-30 |
| IE912662A1 (en) | 1992-01-29 |
| PT98489A (pt) | 1992-05-29 |
| EP0541693B1 (en) | 1998-12-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL169801B1 (pl) | sposób wykonania próby hybrydyzacji kwasu nukleinowego PL | |
| AU634969B2 (en) | Method and reagents for detecting nucleic acid sequences | |
| JP3892450B2 (ja) | バックグランドノイズの減少を伴う液相核酸サンドイッチアッセイ | |
| CA1340231C (en) | Polynucleotede dertermination with selectable cleavage sites | |
| EP0714986B1 (en) | Method of detecting specific nucleic acid sequences | |
| JP2797047B2 (ja) | 受身固定により核酸フラグメントを固体支持体上に不動化する方法、そのようにして得られた固体支持体およびその使用 | |
| US5573906A (en) | Detection of nucleic acids using a hairpin forming oligonucleotide primer and an energy transfer detection system | |
| US5849481A (en) | Nucleic acid hybridization assays employing large comb-type branched polynucleotides | |
| JP3907201B2 (ja) | 溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイに用いるためのｈｉｖプローブ | |
| JP2509574B2 (ja) | 標識付けした核酸 | |
| US20030077609A1 (en) | Modified oligonucleotides and uses thereof | |
| JPH09500525A (ja) | 核酸配列を増幅し、検出するための化学的方法 | |
| JPH06339378A (ja) | 液相核酸アッセイおよびそこで有用なポリヌクレオチドプローブ | |
| EP0706531A1 (en) | Synthesis of branched nucleic acids | |
| US7495093B2 (en) | Amplification and detection method | |
| JP2593245B2 (ja) | 疎水性核酸プローブ | |
| JPH07502655A (ja) | 溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイに用いるためのｃｍｖプローブ | |
| EP0703296A1 (en) | Polynucleotide determination by strand replacement of a capture probe | |
| US6180777B1 (en) | Synthesis of branched nucleic acids | |
| JP4238381B2 (ja) | ピレン修飾ｒｎａ、およびｒｎａの分析方法 | |
| WO2004058793A1 (ja) | ヌクレオチド誘導体とｄｎａマイクロアレイ | |
| WO1992022671A1 (en) | Polynucleotide determination with selectable cleavage sites | |
| US7285401B1 (en) | Method and reagents for detecting nucleic acid sequences |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20060729 |