JP2593245B2 - 疎水性核酸プローブ - Google Patents

疎水性核酸プローブ

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JP2593245B2
JP2593245B2 JP2510135A JP51013590A JP2593245B2 JP 2593245 B2 JP2593245 B2 JP 2593245B2 JP 2510135 A JP2510135 A JP 2510135A JP 51013590 A JP51013590 A JP 51013590A JP 2593245 B2 JP2593245 B2 JP 2593245B2
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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、生化学アッセイおよび核酸化学の分野に関
する。さらに詳細には、本発明は、基材に結合するため
の疎水性部分（複数の部分の場合も有り得る）を有する
新規な核酸に関する。
発明の背景 核酸ハイブリダイゼーションは、生化学、生医学、お
よび遺伝的研究、において通常用いられている。核酸ハ
イブリダイゼーションは、臨床的診断アッセイにおい
て、商業的応用が行われている。
核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、基本的要素
である一本鎖の分析用核酸（DNAあるいはRNAのいづれ
か）を含み、標識された核酸プローブとハイブリダイゼ
ーションし；得られる標識二本鎖を検出する。この一般
的方法には、無関係な物質の中から検出されるべき二本
鎖を分離し易くするための、および／あるいは、検出さ
れる信号を増幅するための、種々の改変型がある。
核酸を用いた抗体検出アッセイを、例えば、マイクロ
タイターディッシュウェル中で行い得る。ペプチド抗原
あるいは抗体が疎水的相互作用を介してポリスチレン表
面に「受動的に吸着される」、免疫アッセイと異なり、
核酸はポリスチレンの様な基材表面には効果的に結合し
ない。この問題があるにも関わらず、報告された一つの
方法（PisetskyおよびPeters（1981）の、J.Immunol.Me
th.41:187−200;および米国特許第4,493,899号（セファ
ローズ結合））では、自己免疫性疾患である紅斑性狼瘡
（lupus erythematosus）に特徴的なDNAに対する血清抗
体を測定するために、DNAの大きな断片をマイクロタイ
ターディッシュに結合させている。DNAをマイクロタイ
ターディッシュウェルに結合させる他の方法では、ポリ
スチレン表面を活性化するために紫外線照射を行ってい
る。ZovaliおよびStollar（1986）の、J.Immunol.Meth.
90:105−110。
これらの方法は抗体検出アッセイでは有効であるが、
核酸ハイブリダイゼーションアッセイではそれほど有効
ではない。免疫アッセイでは、抗原と抗体との間の相互
作用は分子の非常に小さい部分である約５アミノ酸しか
含まないことが、この理由である。対照的に、核酸ハイ
ブリダイゼーションは、６から300,000あるいはそれ以
上の核酸を含み得る。全ポリヌクレオチドをハイブリダ
イゼーションし、ハイブリダイゼーション中の小さな違
いを検出する場合などに、しばしば核酸プローブの全長
が最大の感度および特異性のために必要とされる。
核酸を基材に結合させるための既知の方法は、核酸の
基材への結合が非特異的であるため、核酸ハイブリダイ
ゼーションアッセイでは有用ではない（図１を参照）。
基材と結合したこれらのランダムな部分の核酸およびラ
ンダムな長さの核酸は、ハイブリダイゼーションには使
用し得ない。この問題は、ポリスチレンマイクロタイタ
ーディッシュウェルだけに限定されない。DNAをニトロ
セルローズへ結合させるときに、類似の問題が起こる。
発明の開示 本発明では、疎水性の部分をポリヌクレオチドに結合
させ、このことにより疎水性部分でポリヌクレオチドを
基材と結合し、アッセイ用に全長を使用できる様に残す
（図２を参照）。ポリヌクレオチドの一つの端に疎水性
の結合部位を提供することで、このポリヌクレオチド
は、ポリヌクレオチド自身ではなく結合部位で、基材と
結合する。このことは、より多くのポリヌクレオチドが
ハイブリダイゼーションに使用できる様にし、核酸アッ
セイの感度および適応性を増す。マイクロタイターディ
ッシュ、ナイロン、ニトロセルローズ、ガラス、および
他の受動生の吸着物質の様な、多くの表面にポリヌクレ
オチドを結合させ得るので、アッセイの設計においてよ
り多くの適応性が提供される。
本発明は、試料中の標的ポリヌクレオチドと結合させ
るための、ポリヌクレオチド捕捉プローブに関する。こ
こで、該捕捉プローブは、基材と非共有結合し得る疎水
性部分を有し、該疎水性部分は、該標的ヌクレオチドに
相補的なポリヌクレオチド配列に結合する。
本発明の他の観点は、疎水性分子官能基の、合成法お
よびポリヌクレオチドへの導入法に関する。これらの官
能基は、ポリヌクレオチドの一部を疎水性にし、そのこ
とにより、ポリスチレンマイクロタイターディッシュウ
ェルの様な基材との結合を可能とする。
本発明の他の観点は、検出アッセイおよび精製アッセ
イの様な、疎水性分子官能基を有するポリヌクレオチド
を用いる方法に関する。
図面の簡単な説明 図１は、先行技術に開示されている、基材のUV照射を
用いたDNA結合を、図示したものである。
図２は、本発明の方法を、図示したものである。
発明を実施するための方法 定義 本明細書では、「疎水性基」および「疎水性部分」と
いう用語は、互換可能に用いられ、そして、ポリヌクレ
オチド配列と共有結合可能であって、反応条件下にある
間は基材との結合を保持する様に非共有結合的に基材と
結合している、全ての基を指す。疎水性の部分にはさら
に、この疎水性部分とポリヌクレオチド配列との間の、
スペーサーあるいはリンカー領域を含み得る。このスペ
ーサーあるいはリンカーは、ポリペプチド、有機分子、
オリゴヌクレオチド、あるいは他の適切なリンカーを含
み得る。
本明細書では、用語「オリゴヌクレオチド」とは、２
個から約10個のヌクレオチドの短いポリヌクレオチド配
列を指す。
本明細書では、用語「ポリヌクレオチド」とは、RN
A、DNA、改変されたヌクレオチド、あるいはそれらの組
み合わせを含んだ分子を指すこともあるが、通常は一本
鎖のDNAを指す。ポリヌクレオチドの長さは、通常は約1
2個から約150個のヌクレオチドであり、約20個のヌクレ
オチドの場合が最も一般的である。上限は、合成するこ
とのできるポリヌクレオチドの長さにより決定され；下
限は、そのアッセイに必要な感度により決定される。
本明細書では、用語「標識」とは、検出可能な（好ま
しくは定量可能な）信号を提供し得る全ての原子あるい
は分子で、ポリヌクレオチドに結合可能なものを指す。
標識は、蛍光、放射活性、比色分析、Ｘ−線回析あるい
はＸ−線吸収、磁性、酵素活性等の検出可能な信号を提
供する。適切な標識には、蛍光団、発色団、放射活性原
子、電子造影剤（electron−dense reagents）、酵素、
および特異的結合対を有するリガンドが含まれる。「特
異的結合対」は、高い度合の特異性でリガンドに結合し
得る分子である。例えば、モノクローナル抗体（MAb）
とその特異的な抗原；ビオチンとアビジンあるいはスト
レプトアビジン;IgGとプロテインＡ、および、当該分野
での既知の他のリセプター−リガンド対である。酵素は
典型的には、それらの酵素活性により検出される。例え
ば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）は、3,3′,5,
5′−テトラメチルベンジジン（TMB）を青い色素に変換
する能力により検出され、分光光度計により定量でき
る。同じ標識を一つ以上の様式で機能させ得るため、こ
の記述は種々の標識を明確なグループに分類することを
意味しない。例えば、125Iは、放射活性標識あるいは電
子造影剤として使用し得る。HRPは、酵素あるいはMAbに
対する抗原として使用し得る。さらに、所望する効果を
得るために標識を組み合わせ得る。MAbおよびアビジン
の場合は、ポリヌクレオチドをビオチンで標識し、その
存在を125IあるいはHRPで標識されたMAbのいづれかで標
識されたアビジンで検出できる様に、さらなる標識を必
要とする。dsDNA（あるいはハイブリダイゼーションさ
れたRNA）に対する標識MAbを用いると、核酸を標識する
ことなくハイブリダイゼーションの存在を、直接検出で
きる。他の可能な方式も当業者には明白であり、それら
もここに開示した本発明の範囲内で等価と見なされる。
一般的方法 ポリヌクレオチドおよび疎水性基の合成 全てのポリヌクレオチドは、本発明の疎水性部分で改
変し得る。有用なポリヌクレオチドは、所望の特定の核
酸配列を含んでいるかあるいは含むことが予測される。
この核酸（あるいは複数の核酸）は、天然の材料から調
製され得るか、あるいは当該分野で既知の手段により合
成され得る。
細胞膜を通過できる様に、荷電していないヌクレオチ
ド誘導体を合成する一般的方法が報告されている。Mill
er（1986）らの、Biochem.25:5092−5097;Agris（198
6）らの、Biochem25:6268−6275。これらのヌクレオチ
ド誘導体は、DNA合成に典型的に使用される他の保護基
の除去に用いる脱保護剤に対しては特別に安定ではな
い。メチル保護基をしばしば有している。
本発明で使用するポリヌクレオチドは、直鎖あるいは
分枝鎖のポリヌクレオチドのいづれかで有り得る。これ
らのポリヌクレオチドは、全く同じ一本鎖オリゴヌクレ
オチドユニットの繰り返し、あるいは、異なる一本鎖オ
リゴヌクレオチドユニットを有し得る。少なくとも一つ
のユニットの、配列、長さ、および組成が、被分析物あ
るいは被分析物と結合したポリヌクレオチドの様な、対
象とする一本鎖ヌクレオチド配列への結合を可能とす
る。適切な結合の特異性および安定性を得るために、ポ
リヌクレオチドユニットは、少なくとも２個、通常は少
なくとも６個、さらに通常には12個、そして最も一般的
には約22個から40個、のヌクレオチドの長さである。こ
のポリヌクレオチドユニットは、標的ポリヌクレオチド
と特異的にハイブリダイゼーションするために充分長く
なければならない。
特異的ポリヌクレオチドには、本発明と共通に本特許
譲渡人に所有されている1985年12月11日付の、米国特許
出願第06/807,624号、現在では米国特許第4,868,105号
に開示されている様な、液相サンドイッチアッセイ中で
捕捉プローブとして使用されるものを含む、この開示を
ここでは参考文献として援用する。本発明の疎水性基を
用いて、これらのオリゴヌクレオチドを一端で（３′あ
るいは５′のいづれかで）基材に結合させると、ハイブ
リダイゼーションに全長が使用できる。
あるいは、1989年４月18日付けの、本発明と共通に本
特許譲渡人に所有されている係属中の米国特許出願第34
0,031号に示されている様に、このポリヌクレオチド
は、直鎖あるいは分枝鎖の構造を有するマルチマーであ
り得る。この出願および関係する係属出願を本明細書で
は参考文献として援用する。
本発明で使用するポリヌクレオチドを調製するための
方法は、単一であると意図していない。ポリヌクレオチ
ドは、化学的架橋技術、直接の化学合成、クローニン
グ、酵素的組立、それらの組み合わせ、あるいは他の適
切な方法論を用いて、調製できる。クローニングで調製
する場合、一般的なクローニング方法で、完全なマルチ
マーをコードする核酸配列あるいはその断片を、一本鎖
あるいは二本鎖にできる。あるいは、標的配列に相補的
な塩基配列を有するポリヌクレオチドを鋳型として用
い、このポリヌクレオチドを調製し得る。このポリヌク
レオチドが二本鎖の場合には、使用前に鎖を分離しなけ
ればならない。
鎖の分離は、独立した工程としてあるいは合成と同時
に、なされる。例えば、物理的、化学的、あるいは酵素
的な手段を含む適切な変性方法により、鎖の分離は行わ
れる。核酸鎖を分離する物理的な方法の一つは、完全
（99％よりも多く）に変性するまで核酸を加熱すること
を含んでいる。熱変性は典型的には、約80から105℃の
範囲で、約１分から10分の間で、行われる。鎖の分離は
また、ヘリカーゼ酵素により、あるいは、例えば、ヘリ
カーゼ活性を有する酵素RecA、DNAを変性することが知
られているリボATPの様なヘリカーゼ活性を示し得る酵
素により、酵素的に行われ得る。ヘリカーゼ酵素を用い
る鎖の分離に適した条件は、Kuhn Hoffmann−Berling
の、CSH-Quantitative Biology, 43:63（1978）に記載さ
れ、そしてRecAを用いる技術は、C.Raddingの、Ann. Re
v. Genetics，16:405−36（1982）に総説されている。
一本鎖ポリヌクレオチドは、M13の様な普通の一本鎖
ファージベクターを用いてクローンし得る。断片を酵素
的あるいは化学的につないで、ポリヌクレオチドを形成
する。酵素的につなぐ場合には、T4 DNAリガーゼの様な
リガーゼが使用し得る。ヌクレオチドを化学的に架橋す
る場合には、各ユニットは、架橋あるいはブランチング
用の結合部位を提供する官能基を有するように誘導体化
された一つあるいはそれ以上の核酸から；あるいは、合
成後に結合部位が現れるような誘導体化により、合成し
得る。好ましい化学的架橋方法は、1986年12月23日付け
の、本発明と共通に本特許譲渡人に所有されている係属
中の米国特許出願第945,876号に記載されており、この
開示を本明細書では参考文献として援用する。
直接の化学合成で調製する場合には、ポリヌクレオチ
ド（官能基をブロックした誘導体化核酸を含み得る）
は、従来のポリヌクレオチド合成技術により作られる。
誘導体化核酸を用いる場合には、官能基のブロックを取
り、そしてブロックを取った部位（あるいは複数の部
位）の外側から、オリゴヌクレオチドユニットを合成す
る。
あるいは、例えば、その内容を本明細書では参考文献
として援用する、米国特許第4,603,195号の様な、当該
分野で既知の他の方法により、ポリヌクレオチドを調製
し得る。
本発明のポリヌクレオチド配列には、多くの異なった
疎水性部分が使用し得、そして結合し得ると考えられ
る。多くの改変方式が、同様の結合特性を得るために使
用し得る。しかし、一般に、疎水性部分は種々の一般的
特性を有し得る。ポリヌクレオチド配列と共有結合した
ときに、この疎水性部分は基材と非共有結合的に結合し
得、そして反応条件下で結合を保持する（例えば、洗浄
およびハイブリダイゼーションの条件下で）。基材への
この様な結合を達成するために、ポリヌクレオチドに結
合させる必要のある疎水性基の数は、一般的に１個から
約10個の範囲、好ましくは約３個から７個、最も好まし
くは約５個である。しかしながら、この疎水性部分の機
能は基材へポリヌクレオチドをつなぐ方法を提供するこ
とであるため、正確な数および疎水性部分の混合は、こ
の機能が達成されていれば重要ではない。
一般に、疎水性部分は、本質的に非極性で、水あるい
は水性の溶液に微溶性以上でなく、そして、C12からC50
の範囲の、直鎖、分枝鎖、あるいは芳香族の、核構造を
有する。この核構造は、例えば（これらに制限されるこ
となく）、ナフタレン、アントラセン、あるいはフェナ
ンスレンの様な芳香族部分；デカヒドロナフタレンの様
な環状の部分；および、エイコサンの様な直鎖あるいは
分枝鎖の部分を含み得る。疎水性の部分は、ポリヌクレ
オチド配列に対して、少なくとも一つの共有結合可能な
官能基を有するか、あるいは、共有結合し得る用に改変
されている。
所望であれば、本発明のポリヌクレオチドは標識され
得る。標識には、例えば、32P-ATPおよびキナーゼを用
いて、ポリヌクレオチドの５′末端に放射標識すること
が含まれ得る。蛍光染料、電子造影剤、酵素、特異的結
合対を有するリガンドなどの、他の適切な標識も使用し
得る。
標識が用いられているかどうかに関わらず、本発明の
ポリヌクレオチドを疎水性部分に結合すると、所望の結
果を得るために必要なアッセイの種類に依存した、種々
の異なるアッセイの様式で使用され得る。例えば、（疎
水性基に結合した）ポリヌクレオチドは基材と結合させ
得る。この基材は、種々の形態の多くの材質を含み得
る。基材材質は、ポリスチレン、ナイロン、ニトロセル
ロース、あるいはガラスを含み得る。この基材は、マイ
クロタイターあるいは他のディッシュ、ファイバー、チ
ューブ、ビーズ、ディップスティック、ウェル、フィル
ター、膜などに、これらに制限されることなく、成形し
得る。
基材に結合した、このポリヌクレオチドは、非特異的
結合を減少させるためにオーバーコートし得る。オーバ
ーコートは、ウシ血清アルブミン（BSA）、サケ精子DNA
などの多くの分子を用いて行い得る。
かなり多くのアッセイ方法が使用し得、好ましい方法
は、本発明と共通に本特許譲渡人に所有されている係属
中の、米国特許出願第340,031号（前出）、この開示を
本明細書では参考文献として援用する、米国特許第4,86
8,105号、に開示されているものか、あるいは直接のサ
ンドイッチアッセイである。
以下の実施例は、本発明の説明のために提示されてお
り、本発明を制限するものではない。
実施例 本発明の好ましい実施態様では、チミヂンヌクレオチ
ドのホスファイト（その後、ホスフェートとなる）に対
する通常の脱保護化学反応に対して比較的安定な疎水性
保護基を使用する。捕捉プローブCACCACTTTCTCCAAAGAAG
の５′末端へ、５個の３′−０−［２−（１ナフチル）
エトキシ］−フォスフォリルチミジン残基を導入する
と、マイクロタイターディッシュ表面に結合させるため
に充分な疎水性となった。
疎水性核酸の調製 （Ａ）２−（１−ナフタレン）エタノール（例えば、Al
drich Chemical Co.から市販されている）（3.95g、23m
mole）を180mlのアセトニトリルに溶解し、そして減圧
下で乾燥するまでエバポレーションし、２−（１−ナフ
タレン）エターノルから水分を除去した。この残渣を10
0mlの乾燥したアセトニトリルに溶解し、そして次にア
ルゴン雰囲気下で、フラスコを０℃に冷却しながら、攪
拌している100mlのアセトニトリルに溶解したPCl3（8.7
ml、100mmole）溶液へ、滴下しながら加えた。次にアイ
スバスを取り除き、攪拌を１時間、20℃で続けた。Ch3C
N（３×100ml）と繰り返し減圧下で共沸させることで、
溶媒および過剰のPCl3を除去し、5.5gの粗２−（１−ナ
フタレン）エトキシジクロロホスフィン（１）を得た。
この粗生成物をアルゴン雰囲気下で50mlの乾燥CH3CN
に溶解し、20℃で攪拌しながら、N,N−ジイソプロピル
トリメチルシリルアミン［Aldrich］（27mmole、1.8g、
4.8ml）を滴下し加え、そして、20℃で１時間攪拌を続
けた。次に溶媒を減圧下で除去し、そして揮発性の残渣
を乾燥したアセトニトリル（２×100ml）と共沸させ除
去し、定量的収量（20mmole）で生成物を得た。この粗
２−（１−ナフタレン）エトキシクロロ−N,N−ジイソ
プロピルアミノホスフィン（２）をさらなる精製なしに
用いた。
N,N−ジイソプロピルエチルアミン（18mmole、3.1m
l）を含んだ50mlのCH2Cl2に溶解した５′−ジメトキシ
トリチルチミジン（9mmole）を外部のアイスバスで０℃
に冷却した。このフラスコをアルゴンガスでフラッシュ
し、攪拌しながら約５分かけて、30mlのCH2Cl2に溶解し
た12mmoleの（２）を、滴下した。攪拌を30分間続け
た。TLC分析は反応が完全であることを示した。次に、5
00mlの酢酸エチルを加え、そして組み合わされた有機層
を、80％飽和のNaCl水溶液（２×500ml）で洗浄した。
この有機層を固体Na2SO4上で30分間乾燥した後、この溶
液を濾過し、乾燥するまでエバポレーションした。得ら
れた残渣を100mlのトルエンに溶解し、そして次に、乾
燥するまでエバポレーションした。この処理をアセトニ
トリルで繰り返した。得られた泡状の物質を40mlのトル
エンに溶解し、攪拌しながら素早く、ドライアイスで外
部から冷却された600mlのヘキサン溶液に加えた。沈殿
物を濾過により素早く回収し、減圧下で18時間乾燥し、
6.35gの白い粉末状の５′−ジメトキシトリチルチミジ
ン−３′−０−２−（１−ナフタレン）エトキシ−N,N
−ジイソプロピルアミノホスフィン（３）（83％収率）
を得た。
（Ｂ）５′−ジメトキシトリチルシチジン、５′−ジメ
トキシトリチルグアノシン、あるいは５′−ジメトキシ
トリチルアデノシンに置き換えて、上述の（Ａ）の項と
同様に行い、対応する疎水性ヌクレオチドを調製する。
（Ｃ）５′−ジメトキシトリチルシチジン、５′−ジメ
トキシトリチルグアノシン、５′−ジメトキシトリチル
アデノシン、あるいは５′−ジメトキシトリチルウリジ
ンに置き換えて、上述の（Ａ）の項と同様に行い、対応
する２′−０−が保護された疎水性リボヌクレオチドを
調製する。
疎水性捕捉プローブ ３の溶液（アセトニトリル中に0.1M）を用いて、５′
−HO（Ｔ−Ｐ″）5＝CACCACTTTCTCCAAAGAAG″−３′
（４）を、 標準的ホスホアミダイト法を用いて固相担体上で調製し
た。
脱保護は、2.5％のDCAのCH2Cl2溶液で２分間、チオフェ
ノール／トリエチルアミン／ジオキサン（v/v/v;1:1:
2）で１時間20℃、次いでNH4OH水溶液で24時間20℃で行
った。この生成物は、エバポレーションして乾燥した。
少量をPAGE分析し、一つの主要バンドおよび二、三の短
いマイナーバンドが示された。この完全に脱保護された
材料を、さらなる精製無しに、マイクロタイターディッ
シュのコーティングに使用した。
マイクロタイターディッシュのコーティング方法 方法A:50mMのMES（pH＝5.4）、１×PBS（pH＝７）、あ
るいは0.1Mのホウ酸ナトリウム（pH＝9.3）、の1mlに溶
解した2nmoleの捕捉プローブのアリコート50μｌを、白
いMicrolite Iあるいは透明のImmulon II（両方とも、D
ynatech Inc.,Chantilly,VAから）に加えた。18時間後
に室温で、このプレートを、0.1×SSC、0.1％のSDSで洗
浄した。洗浄溶液のアリコートを380μｌを追加してイ
ンキュベートした後に、このプレートを、１×PBSで数
回洗浄した。
マイクロタイターディッシュの結合容量の検定 ５′に32P−標識した、捕捉プローブに対する相補体
を、標準的な方法で調製し、１×HM（0.1％のSDS、４×
SSC、1mg/mlの超音波処理したサケ精子DNA、1mg/mlのポ
リーＡ、10mg/mlのBSA）中に200pmole/mlの濃度で入れ
た。アリコート50μｌを各ウェルに入れ、55℃で１時間
セットした。DNAでコートされていない対照ウェルも用
意した。
結果コーティング方法 ウェルの種類 総計数 MES 透明 2,913 ± 661 MES 白 1,413 ± 364 PBS 透明 10,364 ± 1120 PBS 白 1,849 ± 277 ホウ酸 透明 17,573 ± 2725 ホウ酸 白 2,631 ± 106 対照 透明 160 ± 157 対照 白 677 ± 96 ホウ酸コーティング法が現在のところ最良の方法であ
る。これらのコーティング条件下では、殆ど検出できな
い量の、疎水性ヌクレオチドの付加無しに結合した、捕
捉プローブが観察された。この結合のレベルは、前出の
米国特許出願第340,031号のポリフェニルアラニルリジ
ンコーティング方法で典型的に得られた値の約10％であ
る。
方法B:コーティング方法は、コーティング反応を18時間
の換わりに36時間にした以外は、上述の方法Ａと同様に
行った。Microlite I Removawells（Dynatech）を使用
した。Neisseria gonorrhoeae pilinのアッセイ。
pilin遺伝子アッセイを、米国特許出願第340,031号
（前出）に記載されたプラスミドコントロールを用いて
行った。簡単には、EcoRIで直鎖化し、そして、正常ヒ
ト血清で希釈した、プラスミドpBR325のEcoRI部位へク
ローンされ、全体で3.2kbのHBVゲノムでなるpHE63を、
標準分析物とした。試料は三回測定し、Dynatechのマイ
クロタイターディシュルミノメーターで読んだ。
結果標的濃度 対発光量 100amole 0.78 ± 0.10 20amole 0.23 ± 0.03 ０ 0.05 ± 0.00 商業的有用性 本発明の改変されたポリヌクレオチドは、別々にある
いは既に基材と結合した形態で販売し得る。基材に結合
させた場合、これらはキットの形態で売られ、そして多
くのアッセイ方法に使用され得る。これらのアッセイに
は、臨床的診断試験および研究応用の両方を含み得る。
本発明の実施のために、以上記載した様式の当業者に
明白な改変は、以下の請求の範囲内に入るものと見なさ
れる。

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】試料中の標的ポリヌクレオチドを結合させ
    るためのポリヌクレオチド捕捉プローブであって、該捕
    捉プローブが： ガラス、ナイロン、ポリスチレン、あるいはニトロセル
    ロースからなる基材と結合可能な疎水性部分；および ポリヌクレオチド；を含有し、 該疎水性部分を該ポリヌクレオチドと結合して、該ポリ
    ヌクレオチド捕捉プローブを生成し、 ここで、該ポリヌクレオチド捕捉プローブは、該疎水性
    基により該基材と特異的に、非共有結合的に結合してい
    る、 ポリヌクレオチド捕捉プローブ。
  2. 【請求項２】請求項１に記載のポリヌクレオチド捕捉プ
    ローブを含有し、該捕捉プローブが基材と結合してい
    る、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ試薬。
  3. 【請求項３】前記疎水性部分が、スペーサーによりポリ
    ヌクレオチド配列から分離されている、請求項１に記載
    のポリヌクレオチド捕捉プローブ。
  4. 【請求項４】前記スペーサーがポリマーである、請求項
    ３に記載のポリヌクレオチド捕捉プローブ。
  5. 【請求項５】試料中の標的ポリヌクレオチドを結合する
    方法であって、該方法が： 疎水性の部分を端に有するポリヌクレオチド捕捉プロー
    ブと非共有結合的に結合した、ガラス、ナイロン、ポリ
    スチレン、あるいはニトロセルロースからなる基材を有
    していて、該疎水性部分を介して該捕捉プローブが該基
    材に結合しているアッセイ試薬を提供する工程；および 該捕捉プローブおよび該標的ポリヌクレオチドの間のハ
    イブリダイゼーションを許容する条件下で、該アッセイ
    試薬と該試料とを接触させる工程；を包含する、方法。
  6. 【請求項６】前記ハイブリダイゼーションを検出する工
    程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】前記試薬が、前記捕捉プローブと前記基材
    とを、実質的に該基材のみに結合するような条件下で、
    該基材と該捕捉プローブとを接触させることにより調製
    される、請求項５に記載の方法。
  8. 【請求項８】試料中の標的ポリヌクレオチドを精製する
    方法であって、該方法が： 疎水性の部分を端に有するポリヌクレオチド捕捉プロー
    ブと非共有結合的に結合した、ガラス、ナイロン、ポリ
    スチレン、あるいはニトロセルロースからなる基材を有
    していて、該疎水性部分を介して該捕捉プローブが該基
    材に結合しているアッセイ試薬を提供する行程； 該捕捉プローブおよび該標的ポリヌクレオチドの間のハ
    イブリダイゼーションを許容する条件下で、該アッセイ
    試薬と該試料とを接触させる行程；および 該試料の残りと該ハイブリダイズした標的ポリヌクレオ
    チドとを分離する行程； を包含する、方法。
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