PT94559B

PT94559B - Processo para a preparacao de uma sonda de acido nucleico hidrofobica

Info

Publication number: PT94559B
Application number: PT94559A
Authority: PT
Inventors: Thomas Horn; Michael Urdea
Original assignee: Chiron Corp
Priority date: 1989-06-30
Filing date: 1990-06-29
Publication date: 1997-07-31
Also published as: JPH05500749A; CA2019939C; IE902390A1; US5552280A; DE69032847D1; IE902390L; JP2593245B2; EP0405913A3; CA2019939A1; PT94559A; WO1991000288A1; US5702893A; DE69032847T2; ATE174926T1; EP0405913B1; EP0405913A2

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Campo do invento

Este invento situa-se nos campos dos ensaios bioquímicos e da quimica dos ácidos nucleicos. Em particular, o mesmo diz respeito a novos multimeros de ácidos nucleicos possuindo porção(Oes) hidrofóbica(s) para ligação a substratos.

Antecedentes do invento

A hibridização de ácidos nucleicos é de utilização comum em pesquisas bioquímicas, biomédicas, e genéticas. A hibridização de ácidos nucleicos encontrou aplicação comercial em ensaios de diagnóstico clinico.

	Os	ensaios	de hibridização	de ácidos	nucleicos
contêm	os	elementos	básicos de um ácido	nucleico	de cadeia
simples	a	analizar	(DNA ou RNA) que é	hibridizado	com uma
sonda	de	ácido nucleico marcada; os	duplexes	marcados

resultantes são detectados. Os marcadores podem ser tanto radiactivos, como não-radioactivos. Este esquema geral tem sofrido diversas modificações, de forma a facilitar a separação, de outros materiais, dos duplexes a detectar, e/ou amplificar o sinal que é detectado.

Os ensaios de detecção de anticorpos usando um ácido nucleico podem ser efectuados, por exemplo, em cúpulas de placas de microtitulaçâo. Distinguindo-se dos imunoensaios, nos quais um antigénio, ou anticorpo, peptidico é passivamente adsorvido, à superfície de poliestireno através de interacção hidrofóbica, os ácidos nucleicos não se ligam de forma eficiente a uma superfície de substrato como o poliestireno. Apesar deste problema, um método referido (Pisetsky e Peters, J.Immunol.Meth. £1:187-200 (1981); veja-se também a Patente norte-americana com o no de série 4.493.899 (ligação a sefarose)) envolveu a ligação de grandes fragmentos de DNA a placas de microtitulaçâo, de forma a medir os anticorpos séricos contra DNA, que são sintomáticos de uma doença auto-imune (o lúpus eritematoso). Outro método de ligar DNA a uma cúpula de placa de microtitulaçâo usou irradiação UV para sensibilizar a superfície de poliestireno (Zovali e Stollar,J.Immunol.Meth. £0:105-110 (1986)).

Apesar destes métodos terem tido sucesso em ensaios de detecção de anticorpos, não foram tão úteis em ensaios de hibridização de ácidos nucleicos. Isto deve-se a que num imunoensaio a interacção entre um anticorpo e um antigénio envolve cerca de 5 aminoácidos, o que representa uma porção muito pequena da molécula. Por contraste, a hibridização de

ácidos nucleicos envolve 6 a 300.000, ou mais, nucleótidos. Frequentemente, é necessária toda a extensão da sonda de ácido nucleico para obter a máxima sensibilidade e especificidade, tal como quando sâo hibridizados polinucleotidos inteiros e sâo detectadas pequenas diferenças na hibridizaçâo.

Os métodos conhecidos para ligar ácidos nucleicos a substratos nâo encontram utilidade em ensaios de hibridizaçâo de ácidos nucleicos porque a ligação do ácido nucleico ao substrato é nâo-especifica (veja-se Figura 1). Estas porções e extensões aleatórias de ácido nucleico, que se ligam ao substrato, deixam de estar disponíveis para a hibridizaçâo. O problema nâo se restringe a cúpulas de placas de microtitulação de poliestireno; foram encontradas dificuldades semelhantes na ligação de DNA a nitrocelulose.

Descrição do invento

No presente invento, um polinucleótido é ligado a uma porção hidrofóbica, permitindo assim que o polinucleótido se ligue a um substrato através da porção hidrofóbica, deixando todo o seu comprimento disponível para ensaios (vejase Figura 2). Ao ser proporcionado um ponto de ligação hidrofóbico numa das extremidades do polinucleótido, este liga-se ao substrato pelo ponto de ligação, em vez de se ligar pela sua própria cadeia. Isto aumenta a sensibilidade e flexibilidade dos ensaios de ácidos nucleicos, uma vez que permite que uma porção maior do polinucleótido esteja disponível para hibridizaçâo. E, igualmente, proporcionada uma maior flexibilidade na concepção do ensaio, uma vez que os

polinucleótidos se podem ligar a diversas superfícies, tais como placas de microtitulaçâo, nylon, nitrocelulose, vidro, e outros materiais submetiveis a adsorção passiva.

presente invento dirige-se a uma sonda polinucleotidica de captura para ligação a um polinucleõtido alvo numa amostra, em que a dita sonda de captura compreende uma porção hidrofóbica, capaz de se ligar nâo-covalentemente a um substrato, e em que a dita porção hidrofóbica está ligada a uma sequência polinucleotidica complementar do dito nucleótido alvo.

Outro aspecto do presente invento é o de proporcionar métodos para sintetizar e incorporar funções moleculares hidrofóbicas em polinucleótidos. Estas funções tornam hidrofóbica uma porção do polinucleõtido, tornando-o assim capaz de se ligar a substratos, como cúpulas de placas de microtitulaçâo, compostas por poliestireno.

Outro aspecto do presente invento consiste em métodos de utilização dos polinucleótidos possuindo funções moleculares hidrofóbicas, tal como em ensaios de detecção e ensaios de purificação.

Breve descrição das figuras

A Figura 1 ilustra, em diagrama, a ligação de DNA usando a activação do substrato por UV, tal como descrito em técnicas anteriores.

A Figura 2 representa, em diagrama, o método do invento.

Modos de realização do invento

Definições

Os termos grupo hidrofóbico e porção hidrofóbica são aqui usados intermutavelmente, e referem-se a qualquer grupo capaz de se ligar covalentemente a uma sequência polinucleotidica, e de se ligar não-covalentemente a um substrato, permanecendo ligado ao substrato durante as condições da reacção. A porção hidrofóbica pode também incluir uma região de espaçador ou linker, intermediária entre a porção hidrofóbica e a sequência polinucleotidica. 0 espaçador ou linker pode compreender um polipéptido, molécula orgânica, oligonucleótido, ou outro linker adequado.

termo oligonucleótido, tal como aqui é usado, refere-se a uma pequena sequência polinucleotidica de dois até cerca de 10 nucleótidos.

termo polinucleótido, tal como aqui é usado, refere-se a uma molécula que pode ser composta por RNA, DNA, nucleótidos modificados, ou combinações destes, mas que normalmente será formada por DNA de cadeia simples. 0 comprimento do polinucleótido será geralmente de cerca de 12 até cerca de 150 nucleótidos, mais comumente de cerca de 20 nucleótidos. 0 limite superior é determinado pelo comprimento de polinucleótido que pode ser sintetizado; o limite inferior é determinado pela sensibilidade requerida no ensaio.

termo marcador, tal como aqui é usado, refere-se a qualquer átomo ou molécula que possa proporcionar um sinal detectável (de preferência, quantificável), e que possa ser ligado a um polinucleótido. Os marcadores podem proporcionar um sinal detectável de fluorescência, radioactividade, colorimetria, difracçâo ou absorção de raios-X, magnetismo, actividade enzimática, e semelhantes. Marcadores adequados incluem fluoróforos, cromóforos, átomos radioactivos, reagentes de grande densidade electrónica, enzimas, e ligandos possuindo parceiros de ligação especifica. 0 termo parceiros de ligação especifica designa moléculas capazes de se ligarem a uma molécula de ligando com um elevado grau de especificidade. Por exemplo, um anticorpo monoclonal (MAb) e o seu antigénio especifico; biotina e avidina ou estreptovidina;

IgG e proteina	A, bem como outros pares	receptor-ligando
conhecidos	pelos	especialistas. Os enzimas	são	tipicamente
detectados	pela	sua actividade enzimática.	Por	exemplo, a
peroxidase	de rábano (HRP) é geralmente detectada	através da

sua capacidade para converter a 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) num pigmento azul, quantificável com um espectrofotómetro. Esta descrição não pretende categorizar os diversos marcadores em grupos distintos, uma vez que o mesmo marcador pode funcionar em mais do que uma modalidade. Por 125 exemplo, ο I pode funcionar como marcador radioactivo, ou como um reagente de grande densidade electrónica. A HRP pode também funcionar como uma enzima, ou como um antigénio para um

MAb. Adicionalmente, podem combinar-se marcadores para atingir um determinado efeito. Os MAbs e avidina também requerem marcadores, de modo que se pode marcar um polinucleótido com biotina, e detectar a sua presença com avidina marcada ou com 125

I, ou com um MAb anti-biotina marcado com HRP. Um MAb marcado, dirigido contra DNA de cadeia dupla (ou RNA hibridizado) pode detectar directamente a presença de hibridização, sem ser necessário marcar os ácidos nucleicos. Outros esquemas possíveis serão facilmente evidentes para os especialistas comuns, e são considerados equivalentes dentro do alcance do invento aqui descrito.

Método geral

Síntese do polinucleótido e do grupo hidrofóbico

Qualquer polinucleótido pode ser modificado com as porções hidrofóbicas do presente invento. Os polinucleótidos úteis possuirão, ou serão suspeitos de possuir, a sequência particular de ácido nucleico desejada. 0(s) ácido(s) nucleico(s) pode(m) ser obtido(s) a partir de fontes naturais, ou pode(m) ser sintetizado(s) por meios conhecidos dos especialistas.

Foram descritos métodos gerais para sintetizar derivados não carregados de nucleótidos, para facilitar a passagem através das membranas celulares. Miller et al♦, Biochem., 25:5092-97 (1986); Agris et al., Biochem., 25:626875 (1986). Estes derivados de nucleótidos empregam, frequentemente , um grupo metilo, protector, o qual não é particularmente estável, face aos agentes desprotectores usados para remover as outras funções protectoras que são tipicamente usadas na sintese de DNA.

Os polinucleótidos para utilização com o presente invento podem ser lineares ou ramificados. Estes

polinucleótidos podem ter unidades idênticas, repetitivas, de oligonucleótidos de cadeia simples, ou unidades diferentes de oligonucleôtidos de cadeia simples. A sequência, comprimento, e composição de, pelo menos uma das unidades, permitirá a ligação a uma sequência de nucleótidos de cadeia simples com interesse, tal como um produto para análise ou um polinucleótido ligado a este. Para atingir as apropriadas especificidade de ligação e estabilidade, a unidade polinucleótidica pode ter um comprimento de, pelo menos dois, habitualmente pelo menos seis, mais habitualmente cerca de 12, e mais comumente cerca de 22-40 nucleótidos. A unidade polinucleotidica deve ser suficientemente longa para se hibridizar de forma especifica com um polinucleótido alvo.

Polinucleótidos específicos incluem os que são usados como sondas de captura em ensaios de sandwich em fase de solução, tal como descrito no pedido co-pendente de patente norte-americana com o no de série 06/807.642 depositado em de 11 de Dezembro de 1985, cuja descrição é aqui incorporada para referência. A ligação destes oligonucleótidos ao substrato por uma extremidade (ou 3', ou 5') usando os grupos hidrofóbicos do invento, resulta na disponibilização, para hibridização, do comprimento total da cadeia.

Alternativamente, o polinucleótido pode ser um multimero possuindo uma estrutura linear ou ramificada, tal como mostrado no pedido co-pendente de patente norte-americana com o no de série 340.031, depositado em 18 de Abril de 1989. A descrição desta e de outras aplicações copendentes relacionadas, são aqui incorporadas para referência.

Não está contemplado um método único para preparar o polinucleótido para utilização no presente invento. 0 polinucleótido pode ser preparado por técnicas de cross-linking químico, sintese quimica directa, clonagem, sintese enzimática, uma combinação destas, ou qualquer outra metodologia adequada. Quando preparadas por clonagem, as sequências de ácido nucleico que codificam para o multimero completo, ou para fragmentos deste, podem ser produzidas na forma de cadeia simples ou dupla, através de procedimentos convencionais de clonagem. Alternativamente, o polinucleótido pode ser produzido usando como molde um polinucleótido possuindo uma sequência de bases complementar da sequência do alvo. Se o polinucleótido é de cadeia dupla, as cadeias têm que ser separadas antes de poderem ser usadas.

A separação de cadeias é realizada ou como um passo separado, ou simultaneamente com a sintese. Por exemplo, a separação de cadeias pode ser conseguida por qualquer método de desnaturação adequado, incluindo meios fisicos, químicos, ou enzimáticos. Um meio fisico de separação de cadeias de

J ácido nucleico envolve o aquecimento do ácido nucleico até que este esteja completamente (mais de 99%) desnaturado. A desnaturação por calor é tipicamente realizada no intervalo de temperaturas de cerca de 80 a 105°C, durante um periodo de cerca de 1 a 10 minutos. A separação de cadeias também pode ser induzida enzimaticamente por uma helicase, ou por uma enzima capaz de exibir actividade de helicase, e.g., a enzima RecA, que tem actividade de helicase, e que se sabe desnaturar DNA, na presença de riboATP. As condições adequadas

D'¹ para separação de cadeias usando helicases foram descritas por Kuhn Hoffmann-Berling, CSH-Quantitative Biology,. 43:63 (1978), e técnicas para usar a RecA encontram-se revistas em C. Radding, Ann.Rev.Genetics, 16:405-36 (1982).

Podem ser clonados polinucleótidos de cadeia simples usando vectores fágicos de cadeia simples convencionais, tal como ο M13. Podem ligar-se fragmentos, enzimaticamente ou quimicamente, para formar o polinucleótido. Se forem enzimaticamente ligados, pode ser usada uma ligase, tal como a DNA-ligase T4. Se o nucleótido se destinar a cross-linking quimico, as unidades individuais podem ser sintetizadas com um ou mais ácidos nucleicos derivatizados de forma a possuirem grupos funcionais que proporcionam locais de ligação para cross-linking ou ramificação; alternatívamente, pode ocorrer derivatização para proporcionar locais de ligação, após a sintese. Um procedimento preferido de cross-linking quimico encontra-se descrito no pedido co-pendente de patente norteamericana com o no de série 945.876, depositado 23 de Dezembro de 1986, cuja descrição é aqui incorporada para referência.

Quando preparados por síntese quimica directa, os polinucleótidos (qne podem conter ácidos nucleicos derivatizados cujos grupos funcionais estão bloqueados) são construídos através de técnicas convencionais de sintese polinucleotidica. Se são utilizados ácidos nucleicos derivatizados, os grupos funcionais são desbloqueados, e as unidades oligonucleotidicas são sintetizadas a partir do(s) local (locais) desbloqueado(s).

Alternativamente, podem preparar-se polinucleótidos através de outros métodos conhecidos pelos especialistas, como, por exemplo, na patente norte-americana com o no de série 4.603.195, cuja descrição é aqui incorporada para referência.

Acredita-se que muitas porções hidrofóbicas diferentes possam ser utilizadas e ligadas a uma sequência polinucleotidica no presente invento. Podem usar-se diversos esquemas de modificação para atingir caracteristicas semelhantes de ligação. De maneira geral, no entanto, a porção hidrofóbica possuirá várias caracteristicas gerais. Quando ligada de forma covalente à sequência polinucleotidica, a porção hidrofóbica deverá poder ligar-se de forma não covalente a um substrato, e manter-se ligada sob as condições de reacção (i.e., sob condições de lavagem e hibridação). Com o objectivo de conseguir uma tal ligação ao substrato, o número de grupos hidrofõbicos que necessitam estar ligados ao polinucleótido estarão, de maneira geral, compreendidos no intervalo de um a cerca de dez, de preferência de cerca de três a sete, e, mais preferencialmente, de cerca de cinco. No entanto, já que a função da porção hidrofóbica é a de proporcionar um método para ancorar de forma não covalente um polinucleótido ao substrato, os exactos número e mistura de porções hidrofóbicas não são criticos, desde que tal função seja cumprida.

De maneira geral, a porção hidrofóbica será essencialmente não polar, não mais do que moderadamente solúvel em água ou soluções aquosas, e tem uma estrutura central no intervalo de C12 até cerca de Csq, a qual pode ser

linear, ramificada, ciclica ou aromática. Esta estrutura central pode compreender, por exemplo (sem limitação), porções aromáticas, como naftaleno, antraceno, ou fenantreno; porções cíclicas, como decahidronaftaleno; e porções lineares ou ramificadas, como eicosano. A porção hidrofóbica possuirá pelo menos um grupo funcional capaz de se ligar covalentemente, ou que possa ser modificado de modo a se ligar covalentemente, a uma sequência polinucleotidica.

Se desejado, os polinucleótidos do presente invento podem ser marcados. Os marcadores podem incluir, por exemplo, marcação radioactiva na extremidade 5' do polinucleótido 32 usando P-ATP e quinase. Podem ser usados outros marcadores adequados, tal como pigmentos fluorescentes, reagentes de grande densidade electrónica, enzimas, ligandos possuindo parceiros de ligação especifica, etc.

Assim que os polinucleótidos do presente invento estejam ligados a porções hidrofóbicas, quer sejam usados marcadores ou não, estão disponíveis para serem usados numa variedade de diferentes esquemas de ensaio, dependendo do tipo de ensaio que é necessário para atingir os efeitos desejados. Por exemplo, o polinucleótido (ligado a um grupo hidrofóbico) pode estar ligado ao substrato. Este substrato pode compreender diversos materiais numa variedade de formas. Os materiais do substrato podem compreender poliestireno, nylon, nitrocelulose, ou vidro. 0 substrato pode ser formado, sem limitação, por placas de microtitulação ou outras, fibras, tubos, esferas, varetas, cúpulas, filtros, membranas, etc.

polinucleótido, que está ligado ao substrato, pode ser sobre-revestido para reduzir o número de ligações não especificas. 0 sobre-revestimento pode ser feito utilizando diversas moléculas, como a albumina sérica bovina (BSA), DNA de esperma de salmão, etc.

Pode ser utilizado qualquer número de métodos de ensaio, estando os métodos preferidos descritos nos pedidos co-pendentes de patente norte-americana com os números de série 340.031 (supra), e 06/807.624, depositado em 11 de Dezembro de 1985, cuja descrição é aqui incorporada para referência, ou por ensaio directo de sandwich.

Os seguintes exemplos do invento são oferecidos como meio de ilustração, não devendo ser entendidos como limitativos.

Exemplos

A forma preferencial de realização deste invento usa um grupo protector hidrofóbico, o qual é relativamente estável face aos processos químicos normais de desprotecção do grupo fosfito (e, subsequentemente, fosfato) de um nucleótido de timidina. A incorporação de cinco residuos não carregados de 3'-0-[2-(l-naftil)etoxi]-fosforiltimidina à extremidade 5' da sonda de captura, CACCACTTTCTCCAAAGAAG, torna esta última suficientemente hidrofóbica para permitir a sua ligação à superfície de uma placa de microtitulaçâo.

Preparação do nucleótido hidrofóbico (A) Dissolveram-se 3,95 g (23 mMol) de 2-(l13 naftaleno)etanol (comercialmente disponível, e.g., através da Aldrich Chemical Co.) em 180 ml de acetonitrilo, e a mistura foi evaporada à secura, sob vácuo, para remover toda a humidade do 2-(1-naftaleno)etanol. 0 resíduo foi dissolvido em 100 ml dé acetonitrilo anidro e, então, adicionado gota a gota a uma solução, mantida em agitação, de PCI3 (8,7 ml, 100 mMol) em 100 ml de acetonitrilo, sob atmosfera de árgon, sendo o balão simultaneamente arrefecido até 0°C. Foi, então, removido o banho de gelo, e a agitação foi mantida durante uma hora, a 20°C. Foram removidos o solvente e o excesso de PCI3, sob vácuo, através da co-evaporação repetida com CH3CN (3x 100 ml), obtendo-se 5,5 g de 2-(1-naftaleno)etoxidiclorofosfina não purificada (JL) .

(1)

Este produto não purificado foi dissolvido em 50 ml de CH3CN anidro, sob atmosfera de árgon, e foi adicionada N,Ndiisopropiltrimetilsililamina [Aldrich] (27 mMol, 1,8 g, 4,8 ml), gota a gota, sob agitação, a 20°C, mantendo-se a agitação ainda durante uma hora, a 20°C. 0 solvente foi removido por acção do vácuo e os resíduos voláteis foram removidos por coevaporação com acetonitrilo anidro (2x 100 ml) para a obtenção do produto com rendimento quantitativo (20 mMol). A 2-(l14

naftaleno) etoxicloro-N,N-diisopropilaminofosfina não purificada (2) foi usada sem recorrer a purificação posterior.

C,Y

ΤΎ

CH,

<2>

Foi arrefecida até 0°C, em banho externo de gelo, uma solução de 5'-dimetoxitritiltimidina (9 mMol) em 50 ml de CH2CI2 contendo N,N-diisopropiletilàmina (18 mMol, 3,1 ml). 0 balão foi submetido a um fluxo rápido de argon, e adicionaramse 12 mMol de (2) em 30 ml de CH2CI2Z gota a gota, com agitação, durante cerca de 5 minutos. A agitação prosseguiu durante 30 minutos. A análise por TLC mostrou que a reacção estava completa. Adicionaram-se, então, 500 ml de acetato de etilo, e a fase orgânica combinada foi lavada com uma solução aquosa saturada de NaCl a 80% (2 x 500 ml). Após a secagem da fase orgânica, (por acção de Na2SC>4 sólido, durante 30 minutos), a solução foi filtrada e evaporada à secura. 0 residuo resultante foi dissolvido em 100 ml de tolueno e, então, evaporado até à secura. 0 tratamento foi repetido, usando acetonitrilo. A emulsão resultante foi dissolvida em 40 ml de tolueno e adicionada a uma solução, em agitação rápida, de 600 ml de hexano, externamente arrefecida por meio de gelo seco. 0 precipitado foi rapidamente recolhido por filtração, e seco durante 18 horas, a pressão reduzida, para produzir 6,35g de pó branco de 5'-dimetoxitritiltimidina-3'-0-2-(115 naftaleno)etoxi-N,N'-diisopropilaminofosfina (3J (rendimento de 83%).

(B) substituindo

Procedendo como na pãrte (A) acima, mas a 5'-dimetoxitritilcitidina, . 5'dimetoxitritilguanosina, ou 5'-dimetoxitritiladenosina, sâo preparados os nucleótidos hidrofóbicos correspondentes.

(C) Procedendo como na parte (A) acima, mas substituindo a 5'-dimetoxitritilcitidina, 5'dimetoxitritilguanosina, 5'-dimetoxitritiladenosina, ou 5'dimetoxitritiluridina, são preparados os correspondentes ribonucleótidos hidrofóbicos 2'-O-protegidos.

Preparação da sonda hidrofóbica de captura

Foi usada uma solução de 3 (0,1 M em acetonitrilo) para preparar 5'-HO(T-P*)5=CACCACTTTCTCCAAAGAAG*-3'(4), [em que Ρ* = OPO2

I

0-2-(l-naftaleno)etil] em suporte sólido, usando os processos quimicos padronizados do fosforamidito.

ο

CACCACTTTCTCCAAAGAAG-3 '

A desprotecção foi realizada com DCA a 2,5% em CH2Cl2r durante 2 minutos, tiofenol/trietilamina/dioxano (v/v/v; 1:1:2) durante 1 h, a 20°C, e, finalmente, NH4OH aquoso concentrado, durante 24 h, a 20°C. O produto foi evaporado à secura. A análise por PAGE de uma pequena aliquota evidenciou uma banda principal e algumas bandas mais pequenas. 0 material completamente desprotegido foi usado para revestimento de placas de microtitulação, sem purificação posterior.

Técnica de revestimento de placas de microtitulação

Método A: Foi adicionada uma aliquota de 50 μΐ de uma solução contendo 2 nMol da sonda de captura em 1 ml de MES a 50 mM (pH = 5,4), 1 x PBS (pH = 7), ou borato de sódio a 0,1 M (pH = 9,3), às cúpulas de microtitulação Microlite I, brancas, ou às de Immulon II, transparentes (ambas da Dynatech Inc., Chantilly, VA). Após 18 horas à temperatura ambiente, a

placa foi lavada com 0,1 x SSC, 0,1% SDS. Após incubação com uma aliquota adicional de 380 μΐ da solução de lavagem, a placa foi lavada por várias vezes com 1 x PBS.

Verificação da capacidade de ligação às placas de microtitulação

Uma sequência 5', marcada com P, complementar da sonda de captura, foi preparada por técnicas padronizadas e colocada em 1 x HM (0,1% SDS, 4 x SSC, DNA de esperma de salmão sonicado, a 1 mg/ml, poli-A a 1 mg/ml, BSA a 10 mg/ml), a uma concentração de 200 pMol/ml. Foi colocada uma aliquota de 50 μΐ em cada cúpula, mantendo-se a placa a 55°C durante 1 hora. Foi igualmente empregue uma cúpula de controlo que não fora revestida com DNA.

Resultados

Técnica de revestimento Tipó de cúpula Contagens totais

MES	Transparente	2,913 ± 661
MES	Branca	1,413 ± 364
PBS	Transparente	10,364 ± 1120
PBS	Branca	1,849 ± 277
Borato	Transparente	17,573 + 2725
Borato	Branca	2,631 ± 106
Controlo	Transparente	160 + 157
Controlo	Branca	677 + 96
A técnica de	revestimento usando	borato é,

melhor método. Sob estas

realidade, o melhor método. Sob estas condições de revestimento, observa-se a ligação de quantidades indetectáveis de sonda de captura quando não se dá a adição do nucleótido hidrofóbico. Estes niveis de ligação representam aproximadamente 10% dos obtidos através da técnica de revestimento usando polifenilalanil-lisina, descrita na patente norte-americana com o no de série 340.031, supra.

Método Β: A técnica de revestimento foi efectuada tal como descrito no Método A, acima, sendo, no entanto, a reacção de revestimento levada a cabo em 36 horas, em vez de 18 horas. Foram empregues placas Microlite I Removawells (Dynatech).

Ensaio dos pili de Neisseria gonorrhoeae ensaio do gene dos pili foi realizado usando o controlo de plasmídeo descrito na patente norte-americana com o no de série 340.031 (supra). Sucintamente, o plasmideo pHE63, que é composto pelo genoma completo do HBV (com 3,2 kb), depois de ser clonado no local de restrição, pela EcoRI, do plasmideo pBR325 linearizado com EcoRI, e de ser diluido em soro humano normal, foi usado como o produto-padrão para análise. As amostras foram tratadas em triplicado e lidas num luminómetro para placas de microtitulaçâo Dynatech.

ο

Resultados

Concentração-alvo Luminescência relativa

100	atomoles	0,78	+	0,10
20	atomoles	0,23	+	0,03
	0	0,05	±	0,00

Utilidade comercial

Os polinucleótidos modificados do presente invento podem ser comercializados separadamente, ou já ligados a um substrato. Quando ligados a um substrato, eles podem ser vendidos sob a forma de kit e usados em diversas técnicas de ensaio. Estes ensaios poderão incluir tanto testes de diagnóstico clinico como aplicações à pesquisa.

Certas modificações, óbvias para os especialistas, dos modos de realização do invento acima descritos, são pretendidas como estando dentro do âmbito das reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1- Uma sonda polinucleotidica de captura para ligação a um polinucleótido alvo , numa amostra, caracterizada pelo facto de compreender; uma porção hidrofóbica capaz de se ligar a um substrato, a qual é ligada a uma sequência polinucleotidica complementar do dito polinucleótido alvo.
2- Um reagente de ensaio de hibridização de ácidos nucleicos que compreende a sonda polinucleotidica de captura , conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a sonda de captura estar ligada a um substrato.
3- Um reagente de ensaio, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o substato ser escolhido do grupo que consiste em poliestireno, vidro, nylon, ou nitrocelulose.
4- Uma sonda polinucleotidica de captura , conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizada pelo facto da porção hidrofóbica ser separada da sequência polinucleotidica mediante um espaçador (spacer).
5- Uma sonda polinucleotidica de captura , conforme reivindicado na reivindicação 4, caracterizada pelo facto do espaçador (spacer) ser um polímero.
6- Um método para ligação a um polinucleótido alvo, numa amostra, caracterizado pelo facto de compreender:

- o fornecimento de um reagente de ensaio compreendendo um substrato, tendo ligado, de forma não covalente, uma sonda polinucleotidica de captura , possuindo uma porção hidrofóbica numa extremidade, em que a referida sonda de captura é ligada ao dito substrato através da dita porção hidrofóbica,

- o contacto do referido reagente de ensaio com a dita amostra, sob condições que permitem a hibridização entre a referida sonda de captura e o referido polinucleótido alvo.
7- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 6, caracterizado pelo facto de compreender, ainda, a detecção da referida hibridização.
8- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o referido reagente ser preparado pelo contacto do referido substrato com a referida sonda de captura , sob condições nas quais a dita sonda de captura é ligada ao dito substrato, e essencialmente apenas a esse substrato.
9- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o referido polinucleótido ser purificado, caracterizado pelo facto de o referido método compreender, ainda, a fase de separação do dito polinucleótido hibridizado do restante da amostra referida.