PT1255716E - Síntese de segmentos - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "SÍNTESE DE SEGMENTOS" A invenção relaciona-se com o âmbito do reconhecimento ou detecção molecular de sitios de ligação ou epitopos descontínuos ou conformacionais correspondentes a ou interagindo com uma molécula ligante, em particular em relação a interacções proteína-proteína ou proteína-ligando.

Interacções entre moléculas ligantes, que geralmente são biomoléculas, e os seus ligandos correspondentes, são centrais para a vida. As células carregam ou contêm moléculas receptoras que interagem ou se ligam a uma hormona, a um péptido, a um fármaco, a um antigénio, a uma molécula efectora ou a qualquer outra molécula receptora; as enzimas ligam-se ao seu substrato; as moléculas de anticorpos ligam-se a um antigénio, o ácido nucleico a uma proteína, etc. Por "interagir ou ligar-se" quer dizer-se que a molécula ligante e o ligando se aproximam um do outro dentro do campo das forças moleculares, e podem influenciar as propriedades um do outro. Esta aproximação leva a molécula ligante e o seu ligando através de vários estádios de reconhecimento molecular compreendendo graus crescentes de intimidade e efeito mútuo: eles ligam-se.

As moléculas ligantes possuem esta capacidade de ligação porque compreendem sítios de ligação distintos permitindo o reconhecimento do ligando em questão. 0 ligando, por sua vez, tem um sítio de ligação correspondente, e apenas quando os dois sítios de ligação podem interagir através essencialmente de complementaridade espacial, as duas 2 moléculas podem ligar-se. Nem é necessário dizer que, nas moléculas que têm três dimensões, os sitios de ligação têm uma natureza tridimensional, frequentemente uma ou mais projecções ou protuberâncias na superfície de um sítio de ligação correspondem a uma ou mais bolsas ou depressões no outro, um encaixe chave-fechadura tridimensional, por vezes numa variedade de encaixe induzido.

Por vezes, uma dessas protuberâncias compreende uma única ansa da molécula em questão, e é apenas esta protuberância que forma essencialmente o sítio de ligação. Nesse caso é frequente designar estes sítios de ligação como compreendendo um sítio de ligação linear ou contínuo, em que uma mera parte linear da molécula em questão é essencialmente responsável pela interacção de ligação. Esta terminologia é amplamente usada para descrever por exemplo reacções anticorpo-antigénio em que o antigénio compreende parte de uma sequência de proteína, um péptido linear. Frequentemente se fala sobre um epitopo linear ou contínuo, pelo que o sítio de ligação (epitopo) da molécula antigénica é formado por uma ança de amino ácidos ligados consecutivamente. No entanto, sítios de ligação contínuos semelhantes (em que o epitopo e o sítio de ligação são usados de modo intercambiável) podem ser encontrados com interacções receptor-antigénio (tal como com um receptor de célula B) , com interacções receptor-ligando tais como com receptores de hormonas e seus agonistas ou antagonistas, com interacções receptor-citoquina ou por exemplo com interacções enzima-substrato ou receptor-fármaco, em que uma parte linear da molécula é reconhecida como o sítio de ligação, etc. Mais frequentemente, no entanto, essa protuberância ou protuberâncias e depressões compreendem várias partes distintas da molécula em questão, e são 3 essencialmente as partes combinadas que formam o sitio de ligação. Comummente, designa-se esse sitio de ligação compreendendo partes distintas da molécula em questão como um sitio de ligação ou epitopo descontinuo ou conformacional. Por exemplo, sitios de ligação em proteínas possuindo não só uma estrutura primária (a sequência de aminoácidos da molécula da proteína) mas também uma estrutura secundária e terciária (o enrolamento da molécula em hélices alfa ou folhas beta e a sua forma geral) , e por vezes até mesmo uma estrutura quaternária (a interacção com outras moléculas de proteínas) podem compreender nas suas protuberâncias ou depressões essenciais sequências de péptidos curtos ou de aminoácidos que se dispõem bem distantes na estrutura primária mas que se enrolam ficando bem próximos no sítio de ligação.

Devido ao papel central que as moléculas ligantes e os seus ligandos desempenham na vida, existe um interesse crescente na testagem ou na identificação da natureza ou das características do sítio de ligação. Não há apenas interesse na natureza exacta da interacção específica entre a molécula ligante e o ligando em questão, por exemplo de modo a substituir ou suplementar as moléculas ligantes ou os ligandos quando necessário; há também interesse em saber aproximadamente as características da interacção, de modo a encontrar e conceber análogos, agonistas, antagonistas ou outros compostos que imitem o sítio de ligação ou o ligando envolvidos. São conhecidos métodos versáteis e rápidos para testar ou para identificar epitopos ou sítios de ligação contínuos. A maior parte, se não todas as técnicas de detecção de ácidos nucleicos, e bibliotecas genéticas que as usam, implicam 4 hibridização de uma porção de ácidos nucleicos essencialmente continua com uma sequência de ácidos nucleicos complementar, seja de DNA, RNA ou PNA. Tem sido dada pouca atenção aos métodos que permitem a identificação rápida e clara de sitios de ligação descontínuos de natureza essencialmente de ácidos nucleicos. Embora existam imensos sitios desses, há que pensar apenas na falta de entendimento à volta dos sitios de ligação ribossomal onde as proteínas ribossomais se ligam a tRNA, de sitios de regulação em sequências promotoras, de interacções entre polimerases e replicases entre DNA e RNA, etc., não existem bibliotecas moleculares que forneçam acesso fácil a esses sitios. Um trabalho anterior no âmbito dos péptidos é a WO 84/03564, relacionada com um método de detectação ou determinação de sequências de aminoácidos ou péptidos antigenicamente activos numa proteína. Este trabalho, tendo em conta a chamada tecnologia Pepscan, pela qual um grande número de péptidos diferentes é sintetizado ligando um primeiro aminoácido a um segundo com uma ligação peptídica, etc., e numa segunda posição ainda no formato de teste outro primeiro aminoácido é ligado a um segundo, etc., após o que os péptidos sintetizados são testados com a molécula ligante em questão, permite a determinação de todos os determinantes antigénicos contínuos ou epitopos contínuos com importância numa sequência de péptidos ou proteínas. A tecnologia Pepscan em senso lato permite também a testagem ou identificação de péptidos (embora lineares) essencialmente idênticos, análogos ou que simulam sítios de ligação ou ligandos de várias naturezas (mimitopos, Geyssen et al, Mol. Immunol. 23:709-715, 1986). A tecnologia Pepscan permite a identificação de sequências de péptidos lineares que interagem com moléculas 5 receptoras, enzimas, anticorpos, etc., de uma forma rápida e clara, permitindo testar muitos péptidos em relação à sua reactividade com as moléculas ligantes em questão com um esforço relativamente pequeno. A ordem de magnitude da capacidade de testagem tendo sido desenvolvida com tecnologia Pepscan (e.g. também devido à miniaturização dos formatos de teste, ver por exemplo a WO 93/09872) permite adicionalmente a testagem aleatória de um grande número de péptidos conduzindo a formatos químicos combinatórios automatizados, em que um grande número de moléculas ligantes está a ser testado num padrão (aleatório se desejado) em relação à sua reactividade com uma biblioteca molecular de péptidos sintéticos representando potenciais sítios de ligação ou ligandos contínuos, permitindo a detecção rápida de moléculas particularmente relevantes entre dezenas de milhares de combinações de moléculas testadas.

No entanto, para a testagem de sítios de ligação descontínuos ou conformacionais para uma molécula ligante, não existem formatos semelhantes ou tão versáteis como a tecnologia Pepscan. Tentativas para identificar epitopos descontínuos através de tecnologia Pepscan são incómodas. Geralmente não é suficiente estender meramente a síntese dos péptidos de teste ligando mais aminoácidos ao péptido existente, e confiar que alguns desses péptidos mais longos formados desse modo se enrolem de modo a que pelo menos duas partes distintas sejam apresentadas numa forma descontínua e sejam reconhecidas por uma molécula ligante. Não há maneira de verificar de um modo rápido e claro que a ligação é de facto através de um sítio de ligação descontínuo, pode ser que seja apenas uma só ansa mais comprida a responsável pela ligação. 6 São fornecidas algumas possibilidades adicionais testando sequências de péptidos sintéticos que foram concebidas para compreender duas partes previamente identificadas de um sitio de ligação, sendo cada parte essencialmente linear e sendo parte de um péptido linear maior. Um trabalho anterior sobre isto foi feito por Atassi e Zablocki (J. Biol. Chem 252:8784, 1977) que descreveram que resíduos da superfície espacialmente ou conformacionalmente contíguos (que de outro modo estão distantes na sequência) de um sítio antigénico da lisozima da clara do ovo foram ligados através de ligações peptídicas num único péptido que não existe na lisozima mas tenta simular uma região da superfície daquela. No entanto, a técnica deles, chamada de síntese de simulação de superfície, requer previamente o conhecimento pormenorizado da estrutura tridimensional da proteína em estudo e a identificação química total dos resíduos que constituem o sítio de ligação, assim como os seus requisitos direccionais e espaçamento conformacional exactos.

Do mesmo modo, Dimarchi et al (Science 232:339-641, 1986) descrevem um péptido sintético longo com 38 a 40 aminoácidos consistindo em duas regiões peptidil separadas previamente identificadas de uma proteína de revestimento de vírus. O péptido foi sintetizado usando tecnologia comum de síntese de péptidos (Merrifield et al., Biochemistry 21, 5020, 1982) adicionando aminoácidos subsequentes com uma ligação peptídica num péptido sempre em crescimento resultando num péptido em que as duas regiões peptidil foram ligadas por um espaçador diprolina que funciona presumivelmente como indicação de uma alteração estrutural secundária, fornecendo desse modo um epitopo ou um sítio de ligação com duas partes. 7

No entanto, é claro que se tem que conhecer previamente a sequência das (apenas neste caso) duas partes relevantes, de modo a fornecer o sítio de ligação descontínuo desejado, isso exclui a praticabilidade de fornecer (desejavelmente de modo aleatório) um conjunto de sítios de ligação descontínuos meramente potenciais para testagem em larga escala. Para além disso, a principal desvantagem destas estratégias é que mais uma vez apenas epitopos lineares ou regiões de ligação dominantes dos epitopos descontínuos podem ser simulados adequadamente. Para a síntese completa de um sítio de ligação descontínuo, todas as partes contribuintes têm que estar dispostas na conformação adequada para alcançar ligação de elevada afinidade, pelo que, partes individuais de sítios de ligação descontínuos têm que ser ligadas.

Quinze anos depois de Dimarchi, Reineke et al (Nature Biotechnology, 17:271-275, 1999) forneceram uma simulação sintética de um sítio de ligação descontínuo numa citoquina e um método para encontrar esse sítio de ligação descontínuo que permitiu alguma flexibilidade e, de algum modo, testagem em maior escala, em que colecções de péptidos consideráveis posicionalmente derivados de duas regiões separadas da citoquina foram exibidas em membranas de celulose contínuas, e substituídas no processo para encontrar o melhor péptido ligante. Após a selecção dos "melhores reactores" de cada região, estes foram combinados de modo a dar origem a outra colecção de péptidos sintéticos (compreendendo péptidos designados duotopos) que sofreram novamente muitas séries de substituições. 8

Reineke et al fornecem por este meio a síntese de cadeias de péptidos compreendendo duotopos, embora, mais uma vez seleccionados após identificação prévia das partes constituintes putativas, com tecnologia Pepscan, não permitindo, desse modo, a testagem de sítios de ligação descontínuos de forma rápida e clara.

No entanto, conforme indicado acima, domínios de proteínas ou pequenas moléculas que simulam sítios de ligação estão a desempenhar um papel cada vez maior na descoberta de fármacos, diagnóstico e biotecnologia. A procura de moléculas específicas que se ligam a um sítio de ligação e simulam, ou antagonizam a acção de um ligando natural foi iniciada em muitos laboratórios. Conforme indicado acima, as tentativas de encontrar essas estruturas em bibliotecas moleculares sintéticas falha frequentemente devido à natureza essencialmente descontínua e à complementaridade espacial da maioria dos sítios de ligação. Deste modo, para a maioria dos casos em que o sítio de ligação pode ser essencialmente descontínuo são necessários meios e métodos melhorados para identificar estes sítios, e em particular são necessários meios e métodos que permitam testar sítios de ligação descontínuos em que as referidas partes não precisam necessariamente de ser seleccionadas através de identificação prévia como partes constituintes putativas ou simplesmente experimentais do sítio de ligação descontínuo desejado, mas possuem apenas a potencialidade de serem parte daquele sítio por serem uma molécula com características mais ou menos distintas per se. A invenção fornece um método para produzir uma biblioteca molecular compreendendo fornecer essa biblioteca com grande 9 número de moléculas em que as referidas moléculas foram produzidas essencialmente através de ligação de segmentos, ou seja ligando péptidos ou ácidos nucleicos (tri, oligo ou multiméricos) , em vez de sintetizar sequencialmente as referidas moléculas, o é que feito tradicionalmente. A invenção fornece portanto uma biblioteca molecular que, embora também ajustada para detectar ou rastrear os sítios de ligação contínuos, está agora particularmente ajustada para detectar ou rastrear sítios de ligação descontínuos, em particular em relação a interacções de ligação molécula-ligando como por exemplo interacções proteína-proteína, proteína-ácido nucleico e ácido nucleico-ácido nucleico.

Os referidos ácidos nucleicos ou péptidos podem evidentemente ser seleccionados aleatoriamente a partir de qualquer conjunto de tri- ou oligonucleótidos, ou tri- ou oligopéptidos, mas por vezes pode ser preferível incluir pelo menos um segmento específico no referido ácido nucleico ou péptido, específico no sentido de ter sido seleccionado de entre partes distintas ou segmentos conhecidos das biomoléculas, tais como partes de genes, proteínas, enzimas, ácidos nucleicos ou fragmentos únicos destes, proteínas envolvidas na regulação ascendente ou descendente da tradução, t-RNAs, SNRPs, anticorpos, antigénios, receptores, proteínas de transporte, factores de transcrição, sequências promotoras tais como, mas não necessariamente restritas a, elementos de sequência TATA bem conhecidos, sítios repressores, sítios operadores e outros elementos de controlo, polimerases, replicases, em resumo, a partir de partes distintas ou segmentos conhecidos de moléculas ligantes conhecidas ou que parecem estar envolvidos na ligação por via de um sítio de ligação descontínuo. Esses segmentos conhecidos ou partes deles 10 podem evidentemente ser já conhecidos como partes constituintes de um sitio de ligação descontinuo, no entanto, essencialmente não é necessária a identificação prévia propriamente dita, uma vez que o rastreio destes sitios com um grande número de moléculas de acordo com a invenção permite a identificação rápida e clara dos referidos segmentos constituintes ou de partes destes. O rastreio desse tipo de biblioteca pode ser facilmente imaginado quando as moléculas da biblioteca diferem apenas no facto dos segmentos constituintes serem escolhidos de forma sobreponivel, pelo que um primeiro segmento de uma biomolécula distinta é ligado a um segundo, e a um terceiro, e a um quarto segmento, e um segundo é ligado a um terceiro e a um quarto, etc., se necessário até que todos os segmentos possíveis da referida biomolécula tenham sido ligados dois a dois (ou três a três, ou até mais) , o que permite o rastreio sistemático da referida biomolécula. No entanto, é evidente que a ligação de modo sobreponivel não é necessária, a ligação de segmentos aleatória também irá fornecer informação valiosa sobre os sítios de ligação. A invenção fornece portanto um método para produzir um grande número de moléculas para identificação ou detecção de um sítio de ligação capaz de interagir com uma molécula ligante, e portanto para a identificação de uma molécula como uma molécula ligante, compreendendo esse método a produção de pelo menos uma das referidas moléculas, preferencialmente a maior parte, mais preferido essencialmente todas as moléculas referidas, ligando pelo menos um primeiro ácido nucleico ou um péptido a um segundo ácido nucleico ou péptido, em que os referidos primeiro e 11 segundo ácido nucleico ou péptido, compreendem pelo menos um trinucleótido ou tripéptido.

As bibliotecas existente, sendo por exemplo de natureza de ácidos nucleicos (contendo uma estrutura principal repetitiva de nucleótidos, nucleósidos ou ácidos nucleicos de péptidos, ou combinações destes) ou aminoácidos (contendo uma estrutura principal repetitiva de aminoácidos) têm geralmente em comum o facto de compreenderem moléculas oligoméricas ou multiméricas, tais como porções de ácidos nucleicos ou aminoácidos, que foram produzidas ligando sequencialmente, de modo repetitivo, um monómero (e.g. um nucleótido ou um aminoácido) a outro, até se obter uma molécula (essencialmente polimérica) com o comprimento desejado.

Essencialmente, as bibliotecas de ácidos nucleicos existentes compreendem ácidos nucleicos que são sintetizados sequencialmente, através da adição de um nucleótido ou nucleósido de cada vez à porção em crescimento, e as bibliotecas de péptidos existentes compreendem péptidos que são sintetizados sequencialmente, através da adição de um aminoácido de cada vez à porção em crescimento, até se atingir o comprimento desejado. No caso dos ácidos nucleicos, os referidos monómeros são essencialmente seleccionados a partir de um conjunto limitado de nucleótidos bem conhecidos, no caso dos péptidos, os referidos monómeros são seleccionados essencialmente a partir de conjuntos de aminoácidos bem conhecidos. Não são usados apenas monómeros que ocorrem naturalmente, nucleótidos sintéticos, tais como moléculas de ácido nucleico peptidico (PNA), ou aminoácidos que não ocorrem naturalmente, ou mesmo D-aminoácidos, são 12 rotineiramente usados como monómeros através dos quais as moléculas essencialmente poliméricas são geradas ou produzidas, usando um método essencialmente de acordo com a sintese sequencial dos polimeros a partir de moléculas monoméricas na natureza. A invenção permite o reconhecimento de que a utilização essencialmente de segmentos diméricos ou ainda maiores (tri-, oligo- ou multiméricos) , ou seja de maneira diferente em relação à sintese sequencial de ácidos nucleicos ou proteínas conforme ocorre essencialmente na natureza, apresenta vantagens distintas. Não só fornece um método mais rápido para chegar a uma molécula composta por vários segmentos, como fornece também uma mistura rápida e eficiente de segmentos para gerar um conjunto de moléculas para a biblioteca desejada. Aqui, um segmento compreendendo um dimero consiste pelo menos num dímero mas pode também ser por exemplo um trimero, ou qualquer outro multimero, ligando monómeros de qualquer natureza, conforme necessário. Claro que quando se ligaram dois segmentos, podem ser ligados segmentos adicionais.

Numa forma de realização, para aumentar mais a rapidez de sintese, ou para permitir seleccionar segmentos desejados distintos, a invenção fornece um método em que o referido primeiro segmento compreende também um dimero, e num método ainda mais preferido, segmentos adicionais compreendem também dimeros. Numa forma de realização preferida, o referido dimero compreende um dinucleótido ou um dipéptido, mas é evidente que também podem ser usados outros dimeros. A invenção é melhor explicada na descrição pormenorizada em que muitos dos exemplos são relativos a bibliotecas compreendendo moléculas em que cada um dos referidos 13 segmentos compreende um péptido, tal como um tri-, um penta-, um octa- ou um nonapéptido; no entanto, é também fornecido pela invenção o uso de segmentos de natureza variada; e.g. em que um compreende um ácido nucleico e outro compreende um péptido, para melhor simultar os sitios de ligação que são encontrados por exemplo em complexos de ácido nucleico-proteina.

Numa forma de realização preferida, como por exemplo mostrado nos exemplos, a invenção fornece um método em que o referido primeiro péptido é ligado ao referido segundo péptido por uma ligação tioéter, embora a invenção não seja limitada a isso. Segmentos de nucleótidos/nucleósidos podem ser ligados por exemplo por ligações covalentes ou ligados por enzimas de "splicing" ou por ligases, ou sobrepondo um primeiro segmento e um segundo segmento essencialmente com uma cadeia de nucleótidos relativamente curta que é parcialmente complementar aos dois segmentos. A invenção fornece portanto uma biblioteca molecular permitindo a testagem, identificação, caracterização ou detecção de um sitio de ligação continuo ou descontinuo capaz de interagir com uma molécula ligante, tendo essa biblioteca sido fornecida com uma grande quantidade de moléculas, compreendendo cada molécula das referidas moléculas preferencialmente um primeiro ácido nucleico ou péptido ligado a um segundo ácido nucleico ou péptido em que pelo menos o segundo ácido nucleico ou péptido já existia como um dimero ou um multimero. Preferencialmente, cada ácido nucleico ou péptido ou partes destes com capacidade de serem uma potencial parte individual de um sitio de ligação descontinuo, em que preferencialmente pelo menos um de um primeiro e um segundo ácido nucleico ou 14 péptido ou parte destes representa uma potencial parte individual de um sitio de ligação descontinuo. Uma biblioteca desse tipo pode existir por exemplo como uma biblioteca molecular sintética feita por segmentos de ligação químicos.

Com isto a invenção fornece a síntese de moléculas compreendendo segmentos separados representando potencialmente pelo menos duas partes distintas de um sítio de ligação descontínuo, em que as referidas partes não são necessariamente seleccionadas após identificação prévia de potenciais partes constituintes, permitindo deste modo a testagem de sítios de ligação descontínuos de maneira rápida e clara.

Deste modo, a invenção permite agora identificar sítios de ligação descontínuos de moléculas receptoras que interagem ou se ligam a esse sítio de contacto com uma hormona, um péptido, um fármaco, um antigénio, uma molécula efectora ou com outra molécula receptora, de enzimas que se ligam ao seu substrato, de moléculas de anticorpo que se ligam a um sítio de ligação num antigénio, um ácido nucleico que se liga a uma proteína, etc. Noutra forma de realização da invenção, todos os segmentos compreendem um péptido, em que os referidos segmentos se ligam preferencialmente através de um ligante ou ligação não-peptídica estável (não naturalmente) existente. Deste modo é sintetizada uma grande quantidade de péptidos diferentes ligando um primeiro segmento de péptido a um segundo, e assim sucessivamente, e numa segunda posição do teste ou do formato da biblioteca é ligado ainda outro primeiro segmento de péptido a um segundo, e assim sucessivamente, após o que os péptidos sintetizados são testados cada um 15 com a molécula ligante em questão, permitindo a determinação de um determinante antigénico descontínuo ou de um epitopo descontínuo relevante numa sequência de péptido ou proteína. 0 referido segmento de péptido compreende pelo menos 2 aminoácidos, e pode em princípio ser tão comprido quanto desejado, e.g. contendo cem aminoácidos ou mesmo mais. Numa prática preferida, o referido segmento de péptido compreende desde 3 até 30, preferencialmente desde 4 até 20, ainda mais preferencialmente desde 5 ou 6 até 12 até 15 aminoácidos, tal como 9 ou 12 aminoácidos. Claro que segmentos separados não têm necessariamente que ter comprimentos iguais.

Além disso, os segmentos de péptidos a serem ligados podem ser seleccionados aleatoriamente, ou sob orientação de uma(s) sequência(s) conhecida(s) de péptido ou proteína. A selecção aleatória fornece uma biblioteca aleatória de acordo com a invenção. A selecção a partir de sequências de péptido ou proteína conhecidas é útil por exemplo quando se pretende descobrir se um sítio de ligação descontínuo é composto por sítios ou partes distintos presentes em proteínas ou péptidos distintos, por exemplo num complexo de proteínas ao qual uma molécula ligante específica se pode ligar. A selecção de vários segmentos de péptidos a partir de uma sequência de proteína ou de péptido conhecida é útil quando se pretende descobrir se um sítio de ligação descontínuo é compostos por sítios ou partes distintos presentes numa proteína ou num péptido, por exemplo numa proteína dobrada à qual uma molécula ligante específica se pode ligar. A selecção de segmentos de péptidos pode ser feita seleccionando péptidos sobreponíveis provenientes de uma sequência conhecida. Os péptidos sobreponíveis podem ter por exemplo todos os aminoácidos em comum excepto um ou 16 dois, preferencialmente que se sobreponham de modo contiguo, ou que se possam sobrepor com apenas um ou com muitos aminoácido. Para um rastreio rápido de sítios de ligação descontínuos numa proteína conhecida, é útil por exemplo seleccionar segmentos de nonapéptidos a partir da referida sequência de proteína, da qual se tem por exemplo uma sobreposição de 5 aminoácidos de comprimento em relação a outro segmento de péptido. É igualmente útil, no entanto, seleccionar segmentos de tripéptidos a partir da referida sequência tendo uma sobreposição de apenas um aminoácido, e usar três, ou ainda mais segmentos na construção da molécula do sítio de ligação putativo ao qual a molécula ligante a ser testada se pode ligar.

Evidentemente, essas estratégias de selecção são igualmente aplicáveis a segmentos de natureza diferente, os segmentos de ácidos nucleicos, compreendendo um determinado número de nucleótidos, tal como 5, 7, 9, etc., podem ser seleccionados a partir de sequências de ácidos nucleicos conhecidas compreendendo procurar sítios de ligação descontínuos, e cada segmento é seleccionado a partir de uma determinada posição na referida sequência de ácidos nucleicos, também de forma sobreponível se desejado. 0 referido segmento de ácidos nucleicos compreende pelo menos 2 nucleótidos (sejam DNA, RNA ou PNA, ou seus equivalentes funcionais), e em princípio pode ser tão longo quanto desejado, e.g. contendo cem nucleótidos ou mesmo mais. Numa prática preferida, o referido segmento nucleico compreende desde 3 até 30, preferencialmente desde 4 até 20, ainda mais preferencialmente desde 5 ou 6 até 12 até 15 nucleótidos, tal como 9 ou 12 nucleótidos. Claro que segmentos separados não têm necessariamente que ter 17 comprimento igual e, conforme dito anteriormente, podem até ser de natureza diferente, e.g. péptido com DNA.

Agui uma ligação peptidica está a ser definida como uma ligação amida entre o grupo alfa-amina de um aminoácido ou péptido e um grupo alfa-carboxilo de outro aminoácido ou péptido. Uma ligação não-peptídica compreende quaisquer outra ligação amida ou ligações não amida. As ligações ou uniões podem ser formadas usando muitas combinações de estratégias, por exemplo, de química dos péptidos ou nucleótidos e reacções de ligação selectiva conforme conhecido na técnica. A quimica da ligação foi publicada, por exemplo, por grupos de Kent (Ph. E. Dawson et al., Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation, Science 266 (1994) 776-779), Tam (J.P. Tam et al., Peptide

Synthesis using Unprotected Peptides through Orthogonal Coupling Methods, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92 (1995) 12485-12489/ C.F. Liu et al, Orthogonal Ligation of

Unprotected Peptide Segments through Pseudoproline Formation for the Synthesis of HIV-1 Protease Analogs, J. Am. Chem. Soc. 118 (1996) 307-312/ L. Zhang & J.P. Tam

Thiazolidone Formation as a General and Site-specific Conjugation Method for Synthetic Peptides and Proteins,

Analytical Biochemistry 233 (1996) 87-93), e Mutter (G.

Tuchscherer & M. Mutter, Protein Design as a Challenge for Peptide Chemists, J. Peptide Science 1 (1995) 3-10/ S.E. Cervigni et al, Template-assisted Protein Design: Chimeric TASP by Chemoselective Ligation, Peptides: Chemistry, Structure and Biology, P.T.P Kaumaya & R.S. Hodges eds, Mayflower (1996) 555-557).

Estratégias possíveis para a formação de ligações conforme fornecido preferencialmente pela invenção são por exemplo: 18 1. A referida ligação com um segmento ou segmentos é formada usando uma agente ligante homo- ou hetero-bifuncional (S.S. Wong: Chemistry of Protein Conjugation and CrossLinking, CRC Press Inc, Boca Raton, Florida USA 1991) . Nesta construção um grupo reactivo num segmento é usado para reagir com uma parte do agente ligante bifuncional, facilitando deste modo a reacção da segunda parte do agente ligante com um grupo reactivo de um segundo segmento. Por exemplo, um ligante como o MBS (éster N-hidroxissuccinimida de ácido m-maleinimidobenzoico) pode ser usado para reagir por via do seu éster activo (succinimida) com um grupo amina de um segmento e por via do seu grupo maleinimida com um grupo tiol livre de um segundo segmento. Preferencialmente, nesta estratégia não devem estar presentes outros grupos amina ou tiol livres no primeiro segmento e preferencialmente não devem estar presentes outros grupos tiol livres no segundo segmento. Para tal, os grupos amina ou tiol que devem estar envolvidos na reacção podem ser desprotegidos selectivamente, por exemplo, usando uma grupo protector de cadeia lateral que pode ser clivado por um reagente moderado como o ácido trifluoroacético 1%, que deixa outros grupos protectores de cadeia lateral intactos. 2. A referida ligação é formada através da introdução de um aminoácido modificado na síntese de um ou mais segmentos. Os aminoácidos podem ser modificados, por exemplo, através da introdução de um grupo especial na cadeia lateral ou no grupo alfa-amina. Uma modificação do grupo alfa-amina conduz a um péptido modificado na estrutura principal ou amida (ver por exemplo Gillon et al., Biopolymers, 31:745-750, 1991). Por exemplo, este grupo pode ser um grupo maleinimida no grupo amina da cadeia lateral da lisina. No final da síntese do péptido 19 este grupo irá reagir rápida e selectivamente com o grupo tiol de um segundo segmento. Tam et al. (PNAS 92:12485-12489, 1995) descreveram uma síntese de um péptido com um resíduo de lisina que foi modificado na cadeia lateral com um resíduo de serina protegido. Após desprotecção e oxidação selectiva usando periodato, a função beta-hidroxi, alfa-amina da serina foi convertida numa função aldeído que poderia ser ligada selectivamente com outro segmento possuindo tiol. Também as ligações da estrutura principal do péptido podem ser usadas para ligar segmentos, através de grupos ligados aos grupos amida do péptido, (Bitan et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans.1: 1501-1510, 1997; Bitan e Gilon, Tetrahedon, 51:10513-10522, 1995; Kaljuste e Unden, Int. J. Pept. Prot. Res. 43:505-511, 1994). 3. Ainda outro modo de formar a referida ligação é sintetizar um segmento, tal como um péptido, com uma terminação N modificada. Por exemplo, um grupo alfa-haloacetamida N-terminal pode ser introduzido no final da síntese. Este grupo reage rápida e selectivamente com um segundo segmento, i.e. outro péptido, que contém um grupo tiol. Por exemplo, o primeiro segmento é sintetizado com uma bromoacetamida N-terminal e o segundo segmento com uma cisteína. Embora a maior parte dos grupos alfa-haloacetamida, como cloro-, bromo- ou iodoacetamida irá reagir com grupos tiol, nos casos em que é necessária uma rápida junção, o grupo bromoacetamida é preferido devido à sua facilidade de introdução e reacção rápida e selectiva com grupos tiol.

Além disso, a invenção fornece a possibilidade de considerar a ligação em qualquer posição do primeiro e/ou do segundo segmento ou dos consecutivos. Por exemplo, em 20 relação aos segmentos de péptidos, são sintetizados conjuntos de péptidos nos quais uma cisteina ou uma lisina modificada de cadeia lateral, em que ambos os aminoácidos são capazes de se ligar selectivamente a outro segmento, mudam uma a uma da posição de aminoácido N-terminal para a posição de aminoácido C-terminal. Combinações destas possibilidades vão, mais uma vez conduzir a novas bibliotecas conforme fornecido pela invenção.

Numa forma de realização preferida, a invenção fornece um grande número de moléculas em que as referidas moléculas podem ser consideradas posicionalmente ou espacialmente, e.g. na forma de um arranjo, se desejado ajudado por localização dirigida por computador e/ou reconhecimento de uma molécula específica ou conjunto de moléculas dentro das dimensões (e.g. plano ou superfície) do suporte da grande quantidade de moléculas usadas. Num arranjo, as referidas moléculas são por exemplo consideradas consoante as suas posições na grelha ou na matriz. por via da

Uma forma de realização preferida da invenção permite adicionalmente uma melhoria da síntese no que respeita ao número de elementos, por exemplo, num suporte sólido por cm2. Para facilitar a produção de muitos elementos possíveis, contendo por exemplo moléculas que compreendem pelo menos dois segmentos de péptidos de uma proteína, são feitos muitos milhares de elementos peptídicos. Por exemplo, quando todos os elementos, em que ambos os segmentos têm por exemplo 12 aminoácidos de comprimentos, são derivados de uma pequena proteína com um comprimento de 100 resíduos de aminoácidos são necessários, já estão feitos 89 x 89 = 7921 elementos peptídicos, se os segmentos estiverem ligados apenas, por exemplo, 21 terminação C do primeiro segmento e da terminação N do segundo segmento usando apenas um tipo de ligação. Para uma proteína com um comprimento de 1000 resíduos de aminoácidos são feitos pelo menos 989 x 989 = 978121 elementos. Para testagem eficiente com ELISA deste número de elementos, são preferidas elevadas densidades de elementos num suporte sólido. São fornecidas pela invenção elevadas densidades de elementos num suporte sólido, em que, por exemplo, (uma camada de) um primeiro segmento com um grupo bromoacetamida na terminação N é sintetizado numa superfície com, por exemplo, 1 cm2. Nesta superfície do suporte funcionalizada com péptidos são colocados em forma de manchas ou em grelha, um conjunto de por exemplo 10, preferencialmente 50, preferencialmente 100, ou mais segmentos do segundo péptido contendo um grupo tiol livre, de forma a serem considerados posicionalmente ou espacialmente, originando, imensos elementos peptídicos diferentes após ligação. Preferencialmente, o referido suporte é fornecido com uma superfície em que fragmentos ou pixels estão intercalados com áreas materialmente distintas dos referidos pixels, o chamado arranjo de pixels. Em particular, a invenção fornece um suporte (aqui também chamado um arranjo de pixels) em que o material da superfície do suporte tem uma natureza variada ou descontínua no que diz respeito à hidrofilicidade. Nesse tipo de suporte para um microarranjo de alta densidade conforme fornecido aqui, os fragmentos ou pixels com hidrofilicidade relativa estão preferencialmente intercalados com áreas de hidrofobicidade relativa. É evidente que não é necessário haver um limite pronunciado entre os fragmentos e a área envolvente, é suficiente que existam descontinuidades ou diferenças materiais distintas entre o centro de um fragmento e a linha média da área envolvente, havendo uma alteração material mais ou menos 22 gradual no meio. Os fragmentos e as áreas envolventes podem estar no formato estrito de matriz ou de grelha, mas isto não é necessário. Em geral, os fragmentos são um pouco menores, mas preferencialmente pelo menos uma ou duas dimensões menores que o tamanho da circunferência das goticulas ou manchas, posicionados, das moléculas do primeiro membro que, numa fase posterior, serão colocadas na superfície do suporte, que é preferencialmente pelo menos 3-5, e mais preferencialmente pelo menos 10-20 e.g. fragmentos hidrofilicos cabem dentro da circunferência de uma solução de um primeiro membro aplicada posteriormente, quer seja um ácido nucleico ou um péptido ou qualquer outra (bio-)molécula ou combinação destes. É claro que o encaixe um a um do fragmento na goticula ou na mancha é também possivel, mas não é necessário, mesmo quando o fragmento é maior que a mancha, assim como não é necessário aplicar ou colocar os fragmentos num padrão excessivamente regular. Quando se coloca uma goticula ou um ponto, o carácter hidrofóbico intercalado da superfície do suporte vai limitar a difusão de qualquer solução aquosa e deste modo também, mais uma vez numa fase posterior, a difusão de uma solução de um substrato opticamente detectável (seja como precipitado ou como solução) formado depois da reacção enzimática que ocorreu quando um primeiro membro foi ligado a um segundo membro de um par ligante, pelo que a presença de um fragmento ou fragmentos relativamente hidrofílico(s) no interior da referida circunferência da goticula ou do ponto permite que o referido substrato seja completamente localizado ou detectável. A aplicação em manchas, por exemplo, pode ser feita usando tecnologia piezo de gotejamento a pedido, ou usando válvulas solenoide miniatura. A aplicação em grelha, por 23 exemplo, pode ser feita usando um conjunto de agulhas individuais que recolhem quantidades de sub-microlitros da solução de segmentos, da placa de microtitulação, contendo soluções compreendendo os segundos segmentos. Após a reacção de ligação, a subsequente desprotecção e lavagem extensivaa do suporte para remover péptidos desemparelhados origina pelo menos uma densidade de elementos peptidicos tão elevada como 10 a 50, ou mesmo 100 a 200, ou até 50 a 1000 manchas por cm2. Esta densidade permite o rastreio de um grande número de elementos peptidicos possíveis das referidas proteínas por ligação a um anticorpo. Por exemplo: numa forma de realização preferida são feitos 20000 a 100.000 elementos em 1000 cm2, tipicamente a superfície é depois examinada em relação a ligações em ELISA com 100 mL de solução de anticorpos, contendo 1-10 pg de anticorpo/mL. Por exemplo, detecção por fluorescência directa ou indirecta localiza elementos que se ligam a anticorpos. A detecção por fluorescência directa com métodos de detecção por análise confocal permite, por exemplo, a detecção de anticorpos nas manchas gerados com as goticulas de solução peptidica numa gama de sub-nanolitros, tornando possíveis ainda maiores densidades de elementos. É claro que as bibliotecas de ácidos nucleicos podem ser feitas de maneira semelhante.

Para além disso, a invenção fornece um suporte sólido, preferencialmente um suporte em arranjo de matriz descontinua como explicado a seguir, compreendendo um grande número de moléculas de acordo com a invenção, em que o suporte sólido permite a apresentação de um potencial sitio de ligação ou um epitopo descontínuo ou conformacional a uma molécula ligante, em que o referido suporte sólido foi fornecido com um grande número de 24 moléculas, sendo cada molécula das referidas moléculas uma possível representante do sítio de ligação ou do epitopo e por exemplo compreender pelo menos um primeiro péptido ou nucleótido ligado covalentemente por um espaçador a um segundo péptido ou nucleótido, compreendendo esse referido espaçador pelo menos uma ligação não peptídica. Numa forma de realização preferida, o referido suporte sólido compreende pelo menos uma densidade de manchas ou de pontos (e.g. elemento peptídico ou sítio de ligação putativo) tão elevada como 10, 20 ou 50, ou mesmo 100, 200 ou até 500 ou mesmo 1000 manchas por cm2, preferencialmente em que as referidas manchas ou os pontos são considerados posicionalmente ou espacialmente. A invenção fornece ainda um método para rastrear, i.e. testar, identificar, caracterizar ou detectar um sítio de ligação descontínuo capaz de interagir com uma molécula ligante, compreendendo rastear um grande número de moléculas conforme fornecido pela invenção com moléculas ligantes, tal como, existem por exemplo, anticorpos, receptores solúveis, os quais contêm uma cauda Fc ou um marcador para detecção, receptores em células, moléculas biotiniladas ou moléculas fluorescentes. Em particular, a invenção fornece um método para rastrear um sítio de ligação descontínuo capaz de interagir com uma molécula ligante, compreendendo rastrear uma biblioteca de acordo com a invenção com pelo menos uma molécula ligante e detectar ligações entre um membro da referida biblioteca e a referida molécula ligante. Numa forma de realização preferida, a referida ligação é detectada imunologicamente, através por exemplo de técnicas de ELISA. 25

Para além disso, a invenção combina as vantagens do arranjo de alta densidade (testando muitos eventos de ligação de uma só vez) e ensaios ligados a enzima (muito sensível) permitindo detectar mais sítios de ligação descontínuos mais rapidamente. São aqui fornecidos sistemas de microarranjo que permitem trabalhar com ensaios ligados a enzima para detectar a molécula de interesse em suportes de alta densidade. Essa testagem de altas densidades de elementos num suporte sólido num ensaio ligado a enzima é fornecida pela invenção, em que por exemplo um primeiro membro é fornecido ou sintetizado na superfície do suporte numa densidade de, por exemplo, 10 ou preferencialmente 50, mas mais vantajosamente preferencialmente 100, ou mais, tal como 200-500 ou mesmo 1000 manchas por centímetro quadrado. Esses primeiros membros do par ligante são, por exemplo, dispostos em manchas ou em grelha, numa forma que se possa considerar posicionalmente ou espacialmente, originando muitos elementos diferentes no suporte com os quais pode reagir um segundo membro ou uma molécula ligante. É claro que as manchas se podem sobrepor, desde que a colecção constituinte das moléculas de primeiro membro sejam possíveis de considerar espacialmente e sejam distintas. A disposição em manchas pode, por exemplo, ser feita usando tecnologia piezo de gotejamento a pedido, ou usando válvulas solenoides miniatura. A disposição em grelha pode, por exemplo, ser feita usando um conjunto de agulhas individuais que recolhem quantidades de sub-microlitros da solução de segmentos da placa de microtitulação, contendo soluções que compreendem os primeiros membros. Aquando da testagem dos péptidos, após a reacção de ligação, a subsequente desprotecção e lavagem extensiva do suporte para remover péptidos desemparelhados origina pelo menos uma densidade de elementos peptídicos tão elevada como 25 a 26 50, ou mesmo 100 a 200, ou até 500 a 1000 manchas por cm2. Esta densidade permite rastear um grande número de possíveis elementos peptídicos das referidas proteínas para ligação a um anticorpo. Por exemplo: numa forma de realização preferida são feitos 25000 a 100.000 elementos em 1000 cm2, tipicamente a superfície é depois rasteada em relação a ligações por ensaio ligado a enzima - seja directamente ou indirectamente, em que um substrato fluorescente é gerado com 100 mL de solução sonda marcada com enzima, contendo 1 - 10 pg de sonda/mL e subsequente desenvolvimento de um substrato opticamente detectável com técnicas estabelecidas. Por exemplo, a detecção por fluorescência directa ou indirecta localiza elementos que se ligam a anticorpos. A detecção por fluorescência directa com métodos de detecção por análise confocal permite, por exemplo, a detecção de anticorpos nas manchas geradas com as gotículas de solução peptídica numa gama de sub-nanolitros, tornando possíveis ainda maiores densidades de elementos. É claro que as bibliotecas de ácidos nucleicos podem ser feitas de maneira semelhante, usando sondas de ácidos nucleicos marcadas com enzimas.

Para além disso, a invenção fornece um suporte para um microarranjo adequado para testar a ligação de uma molécula de primeiro membro, em que o referido primeiro membro é fornecido por síntese de segmentos, dentro de um arranjo ou biblioteca de moléculas ligantes de primeiros membros experimentais com umas moléculas ligantes de segundo membro, em que o referido suporte é fornecido com uma superfície em que os fragmentos estão intercalados entre as áreas que são materialmente distintas em relação aos referidos fragmentos. Em particular, a invenção fornece um suporte (aqui também chamado arranjo de matriz descontínua) 27 em que o material de superfície do suporte é de natureza variada ou descontinua no que diz respeito à hidrofilicidade. Nesse suporte para um microarranjo de alta densidade conforme fornecido aqui, os fragmentos com hidrofilicidade relativa são preferencialmente intercalados com áreas de hidrofobicidade relativa. É evidente que não é necessário haver um limite pronunciado entre os fragmentos e a área envolvente, é suficiente se existirem descontinuidades ou diferenças materiais distintas entre o centro de um fragmento e a linha média da área envolvente, pelo que há uma alteração material mais ou menos gradual no meio. Os fragmentos e as áreas envolventes podem ter o formato estrito de matriz ou de grelha, mas tal não é necessário. Em geral, os fragmentos são um pouco menores, mas preferencialmente pelo menos uma ou duas dimensões menpres que o tamanho da circunferência das goticulas ou manchas colocadas, das moléculas de primeiro membro que numa fase posterior serão colocadas na superfície do suporte, em que preferencialmente pelo menos 3-5, e mais preferencialmente pelo menos 10-20 e.g. fragmentos hidrofilicos cabem dentro da circunferência de uma solução de um primeiro membro colocada em manchas posteriormente, seja um ácido nucleico ou um péptido ou qualquer outra (bio)molécula ou combinação destes. É claro que o encaixe um a um do fragmento na goticula ou na mancha é também possivel, mas não é necessário, mesmo quando o fragmento é maior que a mancha, assim como não é necessário aplicar ou colocar os fragmentos num padrão excessivamente regular. Quando se coloca uma goticula ou uma mancha, o carácter hidrofóbico intercalado da superfície do suporte vai limitar a difusão de qualquer solução aquosa e deste modo também, mais uma vez numa fase posterior, a difusão de uma solução de um substrato opticamente detectável (seja como 28 precipitado ou como solução) formado depois da reacção enzimática que ocorreu quando um primeiro membro foi ligado a um segundo membro de um par ligante, pelo que a presença de um fragmento ou fragmentos relativamente hidrofilico(s) no interior da referida circunferência da goticula ou da mancha permite que o referido substrato seja completamente localizado ou detectável. Os fragmentos preferidos conforme aqui fornecidos podem também ser descritos como pixels dentro da mancha onde finalmente o substrato fluorescente ou opticamente detectável será colocado. É claro que, se desejado, os fragmentos podem ser hidrofóbicos quando a área envolvente é relativamente hidrofilica, quando por exemplo soluções ou marcadores (opticamente detectáveis) são testados de uma natureza mais hidrofóbica.

Numa forma de realização preferida, o referido suporte conforme aqui fornecido compreende pelo menos uma densidade de manchas ou de pontos (e.g. uma colecção de moléculas de primeiro membro tais como um ácido nucleico ou um elemento peptídico) tão alta como 25 ou 50, ou mesmo 100, 200 ou até 500 ou mesmo 1000 manchas por cm2 preferencialmente em que as referidas manchas ou os pontos podem ser considerados posicionalmente ou espacialmente, em que cada mancha ou ponto referidos cobre pelo menos um fragmento, mas preferencialmente desde 3-5, ou mesmo desde 5-15 ou mais fragmentos ou pixels.

Para começar, o tamanho do fragmento hidrofílico pode ser, modificado seleccionando o material de suporte apropriado, tal como polietileno ou polipropileno ou outro material de plástico relativamente hidrofóbico, ou fornecendo-o com fragmentos do tamanho desejado, e.g. utilizando tecnologia de impressão. Abaixo, é produzida uma superfície de suporte 29 a partir de uma superfície de polipropileno relativamente hidrofóbica sobre a qual estão enxertos que formam os fragmentos relativamente hidrofílicos. É preferido fazer os enxertos com ácido poliacrílico, o qual tem uma natureza hidrofílica excelentemente adequada. 0 tamanho do fragmento pode ser influenciado seleccionando a aspereza adequada de um material de partida de polietileno ou polipropileno, em que a referida aspereza pode ser modulada por areamento ou polimento, ou por qualquer outro método mecânico (impressão) ou químico (gravação) para modular uma superfície sobre a qual serão gerados os fragmentos hidrofílicos. É claro que quanto menor for o tamanho do fragmento hidrofílico, menores podem ser as gotículas a aplicar, preferencialmente no máximo do tamanho em que pelo menos um fragmento caia dentro da circunferência das gotículas aplicadas. A invenção também fornece um método para determinar a ligação de uma molécula de primeiro membro dentro de uma biblioteca de moléculas ligantes de primeiro membro experimentais com uma molécula ligante de segundo membro compreendendo o uso de um suporte de acordo com a invenção, em particular um método compreendendo fornecer o referido suporte com manchas compreendendo as referidas moléculas ligantes de primeiro membro experimentais, fornecendo uma molécula ligante de segundo membro e detectando a ligação de uma molécula de primeiro membro com a referida molécula ligante do segundo membro.

Preferencialmente, a referida ligação é detectada com um marcador opticamente detectável em que, por exemplo, o referido marcador compreende um fluoróforo, directamente ou indirectamente marcado a uma sonda tal como um ácido nucleico ou um anticorpo, permitindo deste modo um suporte de acordo com a invenção a ser usado em qualquer tipo de 30 microarranjo; a prevenção da difusão é sempre bem-vinda para evitar ou contornar problemas tais como excesso de sinal, no entanto, numa forma de realização preferida, a invenção fornece um método em que os pares ligantes são detectados por via de técnicas de ensaio ligado a enzima, que de outro modo a difusão ou escoamento seriam muito mais dificeis de ultrapassar, sendo uma vantagem adicional o facto da detecção enzimática ser muito mais sensível, permitindo desse modo incluir menos cópias de moléculas de primeiro membro experimentais a ser colocadas numa mancha, diminuindo assim em geral o tamanho da mancha, permitindo assim aumentar a densidade das manchas, sem ter que perder sensibilidade. A detecção enzimática pode ser até 10-1000 vezes mais sensível do que a detecção de sondas directamente marcadas.

Combinações adequadas de enzima-substrato e métodos para usar num método de acordo com a invenção são encontrados por exemplo na US 4931223 em que são divulgados processos nos quais a luz de diferentes comprimentos de onda é libertada simultaneamente a partir de dois ou mais compostos de 1,2-dioxetano quimiluminescentes enzimaticamente decomponíveis, sendo os referidos compostos configurados através da inclusão de uma luz diferente emitindo fluoróforo em cada uma emite luz dos referidos comprimentos de onda diferentes, decompondo cada um dos referidos compostos por meio de uma enzima diferente. Também, Bronstein et al. BioTechniques 12 #5 (Maio 1992) pp. 748-753 "Improved Chemiluminescent Western Blotting Procedure" sugere um método de ensaio no qual um membro de um par ligante específico é detectado por meio de uma reacção opticamente detectável que inclui a reacção, com uma enzima, de um dioxetano de modo a que a enzima cliva um 31 grupo do dioxetano clivável por enzima para formar um substituinte carregado negativamente ligado ao dioxetano, em que o substituinte carregado negativamente provoca a decomposição do dioxetano para formar uma substância luminescente. Cano et al. J. App. Bacteriology 72 (1992) forneceram um exemplo de hibridização de ácido nucleico com um substrato de fosfatase alcalina fluorescente, que pode também ser usado vantajosamente na invenção, e Evangelista et al. Anal. Biochem. 203 (1992) mostram fosfatos salicilicos substituídos por alquilo e arilo como reagentes de detecção em ensaios de hibridização de DNA com fluorescência amplificada por enzima. Na presente descrição pormenorizada é feito uso de um substrato fluorescente para detecção à base de fosfatase alcalina em manchas de proteínas, para uso com equipamento de análise de fluorescência tal como instrumentos de Storm ou Fluorlmage de Dinâmica Molecular, geralmente conhecidos como Vistra ECF e geralmente apenas considerados adequados para uso em aplicações de Western blotting, blotting por pontos e blotting por ranhuras. A reacção enzimática da fosfatase alcalina desfosforila o referido substrato ECF para produzir um produto fluorescente que seja, conforme aqui mostrado, detectável num método de acordo com a invenção. No entanto, não só é aqui fornecida a detecção com base na fosfatase alcalina, como a invenção fornece também um método de acordo com a invenção em que é usado um substrato para avaliação de enzimas glicosidicas compreendendo um derivado de fluoresceina tal como conhecido da US5208148, que contém um carácter lipofílico e que para esse fim irá preferencialmente estar presente nas áreas hidrofóbicas da superfície. 32

Para além disso, a invenção fornece uma molécula sintética compreendendo um sitio de ligação (i.e. localizado na molécula de primeiro membro detectada ou seus derivados) ou uma molécula ligante compreendendo um sitio de ligação identificável ou obtenível por um método de acordo com a invenção. Para além disso, é fornecido o uso de um suporte ou de um método de acordo com a invenção para identificar ou obter uma molécula sintética compreendendo um sitio de ligação ou para identificar ou obter uma molécula ligante capaz de se ligar a um sitio de ligação, e o uso desta molécula obtida para interferir ou afectar a ligação a uma molécula ligante.

Detectando a ligação a um membro específico da referida biblioteca, a invenção fornece o referido membro, uma molécula sintética compreendendo um sítio de ligação descontínuo identificável ou identificado ou obtenível ou obtido através de um método de acordo com a invenção. Deste modo, a invenção fornece o uso de uma biblioteca de acordo com a invenção, uso de um suporte sólido de acordo com a invenção, ou o uso de um método de acordo com a invenção para identificar ou obter uma molécula sintética compreendendo um sitio de ligação descontínuo ou uma molécula ligante capaz de se ligar a isso. Uma vez que são agora fornecidos sítios de ligação descontínuos, essas moléculas sintéticas podem ser usadas vantajosamente in vitro ou in vivo para encontrar uma molécula ligante, e para conseguir e/ou afectar a ligação a uma molécula ligante, por exemplo para interagir ou ligar-se a moléculas receptoras que normalmente interagem ou se ligam a uma hormona, um péptido, um fármaco, um antigénio, a uma molécula efectora, a um agonista, a um antagonista, ou a outra molécula receptora; a enzimas que normalmente se 33 ligam ao seu substrato; a moléculas de anticorpos, a ácidos nucleicos, a proteínas, em resumo, a biomoléculas. A invenção é explicada adicionalmente na descrição pormonorizada sem limitar a invenção.

Legenda das figuras

Fig. 1. A) Resultados de ELISA de uma biblioteca de elementos de uma proteína, sintetizados em poços de 3 pL de uma placa de microtitulação de 455 poços testados contra um anticorpo monoclonal específico para proteína (anticorpo monoclonal 01) que se liga à hormona folículo-estimulante humana (hFSH). Elemento 1: sequência[1-11]-Cys ligada a bromoacetamida-sequência[14-25]; elemento 2: sequência[2-12]-Cys ligada a bromoacetamida-sequência[15-26]; etc. É mostrado o péptido de reacção. É parte da hFSH conforme ilustrado na Fig. 1B. B) Modelo tridimensional da hFSH. O epitopo identificado é mostrado a preto. C) análise de substituição do epitopo identificado. Os aminoácidos essenciais são parte de ambas as partes dos péptidos.

Fig. 2. A) Microturização de manchas de elementos peptídicos. Os elementos foram testados em relação ao mesmo anticorpo monoclonal 01 como foi testado na figura 1. A ligação foi tornada visível usando detecção por flourescência indirecta. O péptido 1, sequência [139-150] com uma bromoacetamida N-terminal, foi sintetizado na superfície completa. O elemento peptídico 6-1 é o mesmo que o elemento 125 na figura 1. Os péptidos 2 até 8, contendo um resíduo de cisteína, foram aplicados em diferentes volumes variando desde 1 pL até 0,25 nL usando tecnologia piezo de gotejamento a pedido. Em I são mostradas as sequências; em II são mostradas as manchas; em III são mostrados os controlos, à esquerda um teste com o anticorpo 34 monoclonal 03 que reconhece o péptido ADSLYTYPVATQ que está presente em todo o quadrado, à direita o anticorpo monoclonal 01 que não reconhece ADSLYTYPVATQ mas requer os péptidos mais longos conforme mostrado pelas manchas em I. B) Modelo tridimensional da hFSH. O epitopo identificado é mostrado a preto.

Fig. 3. A) Apresentação esquemática de uma análise 24-mer "padrão" em minicartões tipo cartão de crédito. 12345678901 (bloco de construção 2) e NOPQRSTUVWXY (bloco de construção 1) representam sequências sucessivas derivadas de uma proteina. Ambos os blocos de construção são ligados por via de uma ponte tioéter, formada pela reacção de uma função tiol livre de um residuo de cisteina (C) C-terminal no bloco de construção 2 e um grupo bromoacetamida ($) na terminação N do bloco de construção 1. Nesta análise, ambas as sequências são alteradas simultaneamente através de passos de um residuo de aminoácido através da sequência completa da proteina para obter a biblioteca completa. SS = Suporte sólido. B) Exemplo de trabalho com anticorpo monoclonal 02 anti-hFSH C) Modelo tridimensional da hFSH. O epitopo identificado é mostrado a preto.

Fig. 4. A) Apresentação esquemática de uma análise de matriz posicionai completa. Esta análise é semelhante às análises mostradas na fig. 5, no entanto, nenhum residuo de cisteina foi adicionado a uma das terminações do segundo bloco de construção, mas em vez disso cada residuo da sequência do segundo bloco de construção foi substituído um a um por um residuo de cisteina. B) Exemplo de trabalho com anticorpo monoclonal 02 anti-hFSH. C) Modelo tridimensional da hFSH. O epitopo identificado é mostrado a preto. 35

Fig. 5. Exemplo de trabalho de união de um péptido longo (24-mer) que é reconhecido pelo anticorpo monoclonal 01 anti-hFSH a todos os 15-mers sobreponiveis cobrindo a hFSH. O exemplo ilustra que todos os péptidos foram ligados.

Fig. 6. A) Apresentação esquemática de uma análise de matriz completa "cabeça-com-cauda". 12345678901 e ABCDEFGHIJK representam sequências derivadas de uma proteína, ou apresentação Esquemática de uma análise de matriz completa "cauda-com-cauda". Neste caso o resíduo de cisteína está posicionado na terminação N do segundo bloco de construção, conduzindo a uma orientação invertida ou "cauda-com-cauda" de ambos os blocos de construção. Ambas as sequências são ligadas conforme descrito anteriormente. Nesta análise, ambas as sequências são alteradas independentemente através da sequência da proteína completa, gerando uma biblioteca de todas as combinações de sequências possíveis. B) Lista de todos os péptidos 12-mer sobreponiveis (derivados da hFSH) contendo um grupo bromoacetamida N-terminal. C) Lista de todos os péptidos 11-mer sobreponiveis (derivados da hFSH) com uma cisteína adicional C- ou N-terminal. D) Análise de matriz completa, i.e. após a ligação de TODAS as sequências listadas na fig. 6B a TODAS as sequências listadas na fig. 6C, exemplificado pelos cartões 145-155 e é mostrada uma imagem completa de todos os valores de ligação de todos os ca. 40.000 péptidos (abaixo). É mostrado o melhor péptido de ligação.

Fig. 7. A) Apresentação esquemática de uma análise de múltiplos blocos de construção. 12345678901 (bloco de construção 1), NOPQRSTUVWXY (bloco de construção 2) e BCDEFGHIJKLM (bloco de construção 3) representam sequências sucessivas derivadas de uma proteína. Os blocos de 36 construção foram ligados por via de uma ponte tioéter, formada por reacção de uma função tiol livre a um resíduo de cisteína (C) C-terminal no bloco de construção 1 e um grupo bromoacetamida ($) na terminação N do bloco de construção 2, etc., conforme descrito no exemplo 3. Nesta análise, todas as sequências são subsequentemente alteradas simultaneamente através da sequência de proteína completa para obter a biblioteca completa. B) Exemplo de trabalho obtido com anticorpo monoclonal-02 anti-hFSH. C) Os valores de ligação e a lista dos péptidos ligados uns aos outros. D) Um quadrado com todo o pormenor. 0 péptido br-CKELVYETVRVPG foi unido à cisteína do cartão 06. Para este cartão os péptidos 1 até 36 foram aplicados em manchas com pinos de grelha. Os valores de ligação são mostrados a seguir. Química em resumo: A superfície de polipropileno (PP) foi irradiada com radiação gama (neste caso 50kGy) na presença de CuS04 e neste caso ácido acrílico a 12%. O PP funcionalizado com ácido carboxílico foi tratado com Boc-HMDA/DCC/HOBt e o tratamento subsequente com ácido trifluoroacético (TFA) originou uma superfície com grupos amina. A esta superfície de PP funcionalizada com grupos amina, foi ligado N-Fmoc-S-tritil-L-cisteína (Fmoc-Cys-(Trt)-OH) usando DCC e HOBt. Subsequentemente o grupo Fmoc foi removido, seguido de acetilação do grupo amina. O tratamento da superfície com TFA (com trietilsilano e água como renovadores) originou uma superfície funcionalizada com tiol. Péptidos contendo bromoacetilo (ou outro tiol reactivo) foram deixados reagir com os grupos tiol da superfície de PP em 0,015M de NaHCCç (pH 7-8, reacção durante a noite). Subsequentemente, os grupos -StBu (dos resíduos de Cys protegidos com S-t-butiltio) dos péptidos ligados foram removidos usando NaBH4 (14mg/mL em 0,015M de NaHC03 pH 7-8, 30 min., 30°C), gerando novos grupos tiol 37 nos péptidos. Um segundo conjunto de péptidos contendo Bromoacetilo (ou outro tiol reactivo)foram deixados ligar-se ao primeiro conjunto, fazendo elementos peptídicos. Este processo pode ser repetido muitas vezes usando conjuntos diferentes de péptidos bromoacetilados.

Fig. 8. A) Apresentação esquemática de uma analise de proteínas de interacção 1, 2 e 3. ABCDEFGHIJK e ABCDEFGHIJK representam duas sequências independentes de duas proteínas diferentes combinadas com um elemento. I: uma análise de matriz destes blocos de construção foi testada em relação a uma terceira proteina completa marcada. II: uma análise de matriz dos blocos de construção das proteínas do HIV e a proteina CCR5 foi testada em relação a uma proteina CD4 solúvel marcada. B) Exemplo de trabalho em minicartões com partes de hormonas e/ou receptor. É mostrado um exemplo com péptidos biotinilados derivados da hFSH em todos os 30-mer sobreponiveis cobrindo o receptor de hFSH.

Fig. 9. A) Apresentação esquemática de uma análise de matriz combinada com uma proteina completa. Os elementos são analisados com uma outra proteina marcada em solução. B) Exemplo de trabalho com toda a proteina glicose oxidase unida à cisteina da superfície. A proteína foi detectada com um anticorpo monoclonal anti-glicose oxidase. 0 diâmetro dos pinos da grelha usados é também mostrado.

Fig. 10. A) Apresentação esquemática de uma análise de DNA/RNA. Os elementos foram analisados com uma proteína marcada, por exemplo uma proteína regulatória, ou outra cadeia de DNA ou PNA (em cima) , ou alternativamente são analisados péptidos sobreponiveis como RNA, DNA ou PNA biotinilados (em baixo) . B) Exemplo de trabalho com DNA 38 biotinilado no elemento de dois PNAs. Química em resumo: Detecção da ligação do DNA Biotinilado pelo elemento de dois PNAs. Num sistema de minipoços, a superfície de polipropileno (PP) dos minipoços foi funcionalizada com grupos carboxilo usando irradiação gama (12kGy) na presença de CuS04 e ácido acrílico a 6%. Subsequentemente, a superfície de PP foi funcionalizada com grupos amina (usando BocHMDA/DCC/HOBt com subsequente remoção do grupo Boc com TFA). A seguir os grupos amina foram convertidos em grupo tiol através da ligação de Fmoc-Cys-(Trt) usando DCC/HOBt, remoção do grupo Fmoc, acetilação do grupo amina seguida pela remoção do Trt por TFA/trietilsilano. A esta superfície de PP funcionalizada com grupos tiol foi ligado um PNA (PNA1) que contém na terminação N um grupo bromoacetilo e na terminação C um Cys-S-tBu extra (o grupo Bromo do PNA reage com o grupo tiol da superfície). Após a remoção do S-tBu (usando NaBH4) do Cys-S-tBu, o PNA ligado tem um grupo tiol na extremidade C. Um segundo PNA (PNA2) contendo um grupo Bromoacetilo na terminação N é ligado ao primeiro PNA (o grupo bromo do PNA2 reage com o grupo tiol do PNA1. PNA1= Br GAGGCCTGCT-Cys-S-tBu, PNA2=Br-ATGGCACTTC. Desta forma, o elemento GAGGCCTGCTespaçador ATGGCACTTC é feito na superfície de PP. 0 espaçador entre ο PNA1 e o PNA2 tem aproximadamente o comprimento de um nucleótido de PNA. A Figura 10B mostra a ligação de um DNA biotinilado (3'-TATTCTCCGGACGAGTACCGTGAAGGGTC-Biotina-5') ao elemento PNA. 0 DNA biotinilado ligado foi detectado usando Estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano e ABTS. C e D) Exemplo de trabalho da análise com PNA biotinilado em péptidos sobreponíveis ilustrado por uma lista de péptidos derivados de um "dedo de zinco". A superfície de polipropileno foi irradiada com radiação gama (50 kGy) na presença de ácido acrílico a 12%. A matriz de "dedo de 39 zinco" foi testada em relação à ligação ao Dna: A matriz de "dedo de zinco" foi incubada (na presença de 0, lmg/mL de DNA de esperma de arenque) durante a noite com 5'Biotina-AGCGTGGGCGT-3' hibridizado com 3-'Biotina-CGCACCCGCAT-5' (5 ug/mL). Após enxaguar, a matriz foi tratada com

Estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina (na presença de Albumina de Soro Bovino a 1%). O enxaguamento e o tratamento subsequente da matriz com Vistra ECF (conforme descrito) permitiu visualizar a ligação entre Dna e os elementos peptidicos do "dedo de zinco". A ligação com 5'Biotina-AGCGTGGGCGT-3' a péptidos de "dedo de zinco". (B, o ácido 4-aminobutírico, é uma substituição para o residuo de cisteina) . E) Exemplo de trabalho da análise com PNA biotinilado em péptidos sobreponíveis ilustrados por uma lista de péptidos derivados de um "dedo de zinco". A superfície de polipropileno foi irradiada com radiação gama (12 kGy) na presença de ácido acrílico a 6%. A matriz de "dedo de zinco" foi testada em relação à ligação ao Dna: A matriz de "dedo de zinco" foi incubada (na presença de 0,lmg/mL de DNA de esperma de arenque) durante a noite com 5'Biotina-AGCGTGGGCGT-3' hibridizada com 3-'Biotina- CGCACCCGCAT-5 ' (20 ug/mL). Após enxaguamento, a matriz foi tratada com Estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina (na presença de Albumina de Soro Bovino a 1%) . O enxaguamento e tratamento subsequente da matriz com Vistra ECF (conforme descrito) permitiu visualizar a ligação entre Dna e os elementos peptidicos do "dedo de zinco". A ligação de com 5'Biotina-AGCGTGGGCGT-3' a péptidos de "dedo de zinco". (B, o ácido 4-aminobutírico, é uma substituição para o resíduo de cisterna).

Fig. 11. Ilustração da ligação de bromoacetamida e cisteina em solução. O gráfico mostra a análise de Massa dos 40 péptidos antes e depois da ligação mostrando que ambos os péptidos foram ligados a um péptido mais comprido: Uma solução de lmg/mL (em NaHC03 0,03M) de um péptido contendo um grupo bromo BrADSLYTYPVATQamida foi adicionada a uma solução de lmg/mL (em H20) de um péptido contendo tiol AcetilVYETVRVPGCamida. A reacção foi monitorizada usando reagente Ellmans (que determina os grupos tiol livres). A reacção foi finalizada dentro de 2,5 horas. A análise de HPLC revela o produto AcetilVYETVRVPGCamida-(tioéter)-ADSLYTYPVATQamida conforme determinado com MS-Quattro.

Fig. 12. Apresentação esquemática de uma análise de proteina intracelular.

Descrição detalhada

SÍNTESE DE ELEMENTOS PEPTÍDICOS

Um péptido com um grupo bromoacetamida N-terminal foi sintetizado à superfície de um suporte sólido contendo grupos amina livres. O péptido ainda continha os grupos protectores de cadeia lateral dos resíduos de aminoácidos. Um segundo péptido contendo um resíduo de cisteína, o qual foi desprotegido e clivado de outro suporte sólido reagiu com o péptido de bromoacetamida no primeiro suporte sólido. O elemento formado foi desprotegido, mas não clivado do suporte, e pôde ser usado no ELISA.

Um suporte de polipropileno ou de polietileno, ou de outro material adequado, foi enxertado, por exemplo, com ácido poliacrílico. Como exemplo: um suporte de polipropileno numa solução de ácido acrílico a 6 % em água, contendo CuS04, foi irradiado usando radiação gama numa dose de 12 kGy. O suporte sólido enxertado contendo grupos de ácido carboxílico foi funcionalizado com grupos amina por via da 41 ligação da t-butiloxicarbonil-hexametilenodiamina (Boc-HMDA) usando diciclohexilcarbodiimida (DCC) com N-hidroxibenzotriazole (HOBt) e subsequente clivagem dos grupos Boc usando ácido trifluoroacético. A síntese do péptido Fmoc padrão foi usada para sintetizar péptidos no suporte sólido funcionalizado com aminas. Após a clivagem do grupo Fmoc do último aminoácido e lavagem, o ácido bromoacético foi ligado usando DCC ou DCC/HOBt. Se só fosse usado DCC, o péptido conteria um grupo bromoacetamida reactivo a tiol, no entanto, se fosse usado DCC/HOBt para ligar o ácido bromoacético, o péptido essencialmente não conteria o grupo bromo, mas sim outro grupo reactivo capaz de reagir eficientemente com os grupos tiol formando desse modo a mesma ligação tioéter entre os segmentos. A ligação/união de um segundo péptido a um péptido sintetizado num suporte sólido: os péptidos foram sintetizados em pinos de polietileno enxertados com polihidrometilmetacrilato (poli-HEMA). Este polímero de enxerto foi feito com irradiação de radiação gama dos pinos de polietileno numa solução de HEMA a 20% em metanol/água 80/20 ou 70/30 numa dose de 30-50 kGy. O suporte funcionalizado pode ser usado para a síntese de 1 ymol de péptido/cm2 depois da ligação de β-alanina e um ligante de ácido lábil Fmoc-2,4-dimetoxi-4'-(carboximetiloxi)-benzidrilamina (Rink). Os péptidos foram sintetizados usando química de Fmoc padrão e o péptido foi desprotegido e clivado da resina usando ácido trifluoroacético como renovadores. O péptido clivado contendo um resíduo de cisteína numa concentração de cerca de lmg/mL reagiu com o péptido ligado ao suporte sólido descrito acima num tampão de 42 água/bicarbonato de sódio a um pH de cerca de 7-8, formando assim um elemento, parcialmente protegido, de dois péptidos ligados covalentemente por via de um tioéter e ligados através da terminação C ao suporte sólido. 0 elemento descrito acima foi desprotegido seguindo procedimentos padrão usando combinações de ácido trifluoroacético/renovador. Os elementos desprotegidos no suporte sólido foram extensamente lavados usando tampões desreguladores, contendo dodecilsulfato de sódio e β-mercaptoetanol e limpeza ultrassónica e foram usados directamente no ELISA. A limpeza subsequente nos tampões desreguladores permite a testagem repetidamente em relação a outros anticorpos no ELISA. A Figura 1 mostra um exemplo dos resultados de ELISA do rastreio de uma única biblioteca de elementos, consistindo num segmento de dodecapéptido ligado por via do seu resíduo de cisteína adicionado à terminação C a um segundo segmento bromoacetilado na terminação N, analisando uma sequência de proteína por meio de um único resíduo de aminoácido. 0 péptido de bromoacetamida foi ligado covalentemente a um suporte sólido de polipropileno/ácido poliacrílico funcionalizado em poços de 3 pL conforme descrito acima. As sequências contendo cisteína foram sintetizadas e clivadas dos pinos de polietileno funcionalizados conforme descrito acima. Conforme mostrado na figura 1, foi observada elevada ligação no ELISA para os elementos à volta da posição 125, o que consiste nos segmentos [125-136] e [139-150], ligados por via de uma ligação tioéter. Um PEPSCAN linear convencional de dodecapéptidos ou 15-péptidos não mostrou qualquer ligação numa reacção em relação ao mesmo anticorpo monoclonal. 43

Numa superfície de um suporte sólido os péptidos foram sintetizados com um grupo bromoacetamida na terminação N conforme descrito acima. Neste suporte funcionalizado com péptidos, foi aplicado numa mancha um segundo segmento peptídico contendo um grupo tiol livre usando tecnologia drop-on-demand piezo, usando um aparelho de microdosagem e uma autopipeta piezo (Auto Drop-Micropipette AD-K-501) (Microdrop Gesellschaft fur Mikrodosier Systeme GmbH. Alternativamente, a colocação em manchas ou em grelha foi feita usando válvulas solenoides miniatura (INKX 0502600A; the Ice Company) ou pinos de moagem de base de endurecimento preciso (Genomic Solutions, diâmetros 0,4, 0,6, 0,8 ou 1,5 mm). A subsequente desprotecção do elemento e a lavagem extensiva para remover péptidos não ligados originou elementos dipeptídicos na área das manchas. A figura 2 mostra a ligação do mesmo anticorpo como foi testado na figura 1 com elementos que consistem em dois segmentos peptídicos, gerados com volumes diferentes dos péptidos 2 até 8 nas manchas, variando desde 1 pL - 0,25 nL (eixo dos x) . Dentro do quadrado, toda a superfície foi coberta com o péptido 1, o qual foi sintetizado directamente nesta superfície, apenas as manchas contêm elementos. O eixo dos y mostra elementos diferentes, consistindo no péptido 1 com o péptido 2 até 8. Os péptidos 2 até 8 são dodecapéptidos sobreponíveis, enquanto que o péptido 1 é a sequência [139-150] da mesma proteína conforme descrito na figura 1. A figura 2 mostra que os elementos peptídicos gerados com as gotículas da solução peptídica na gama dos nanolitros, se ligam o suficiente ao anticorpo para detecção, usando 44 neste caso detecçao por fluorescência indirecta. As manchas geradas com 0,25 nL - 50 nL são inferiores a 1 mm2. Deste modo, a densidade dos elementos peptídicos pode ser até 100-1000 manchas por cm2.

Exemplos de uso

As proteínas e os péptidos podem ser rastreados usando por exemplo anticorpos, receptores solúveis, que contêm uma cauda Fc ou um marcador para detecção, moléculas biotiniladas ou moléculas fluorescentes. Blocos de construção alternativos podem ser, por exemplo, hidratos de carbono, aminoácidos não naturais, PNAs, DNAs, lipidos, moléculas contendo mimetizadores da ligação peptídica. Nos exemplos, o $ é usado como um símbolo para a ligação de tioéter formada pela reacção do grupo tiol de um resíduo de cisterna de um bloco de construção com uma bromoacetamida na terminação N ou na cadeia lateral de um resíduo de lisina de outro bloco de construção. Este símbolo pode também ser usado para outras químicas de ligação conforme descrito.

Os exemplos estão divididos em dois tipos. O tipo I é realizado nos minicartões em formato de cartão de crédito (cf. Fig 1) . O tipo II é realizado usando pinos de grelha numa superfície de matriz porosa descontínua (cf. Fig. 2). Para cada exemplo o tipo é indicado entre parêntesis.

Exemplo-1 (Tipo I): Análise de 24-30-mer "padrão" de sequência linear, contendo dois blocos de construção.

Neste exemplo, as sequências consecutivas dos blocos de construção são ambas alteradas resíduo a resíduo ao longo da sequência da proteína a ser testada conforme mostrado na Fig. 3A e exemplificado nas Figs. 3B e 3C para 30-mers (na 45

Fig. 1 o exemplo é com 24-mers). A ligação -C$- entre ambos os blocos de construção substitui 0 - 2 ou mais residuos de aminoácidos da sequência da proteína nativa. Aplicações incluem conjuntos de substituição de péptidos, nos quais os resíduos de aminoácidos são substituídos sistematicamente por outros resíduos de aminoácidos (Fig. 1C), conjuntos de deleção de péptidos, nos quais os resíduos de aminoácidos são deletados sistematicamente, e conjuntos de combinação, nos quais são usados péptidos de diferentes comprimentos variando entre 2-24 resíduos de aminoácidos (neste caso bloco de construção 2, 2-40 ou mais e bloco de construção 1, 2-15 ou mais).

Examplo-2a (tipo I) : Análise posicionai com cisteína em diferentes posições.

Esta é uma análise semelhante ao exemplo 1 descrito acima, no entanto, nesta análise a cisteína é usada para substituir os resíduos de aminoácidos um por um em todas as posições do segundo bloco de construção conforme mostrado na Fig. 4A e exemplificado na Fig. 4B e 4C. A Fig. 5 ilustra a reprodutibilidade de ligar um 25-mer que liga mAb-01 a todos os 15-mers sobreponíveis.

Exemplo-2b (tipo II): análise de matriz cabeça com cauda.

No tipo I, i.e. usando os minicartões tipo cartão de crédito apenas alguns milhares de péptidos podem ser sintetizados. No tipo II, i.e. usando os pinos de grelha, muitos milhares de péptidos (na ordem dos 40.000) podem ser sintetizados simultaneamente.

Numa análise de matriz completa, a sequência N-terminal, por exemplo, da sequência [1 - 11] de uma proteína, é ligada como um bloco de construção a cada sequência de 46 péptidos sobreponíveis de uma análise completa da mesma proteína conforme mostrado na figura 6A. A seguir, a sequência [2-12] é ligada ao mesmo conjunto de sequências sobreponíveis, etc.. A ligação pode ser formada, por exemplo, através da reacção de uma cisteína na terminação C do segundo bloco de construção com uma terminação N modificada com bromoacetamida do primeiro bloco de construção. Isto significa que qualquer combinação, por exemplo, de undecapéptidos da sequência de proteína está a ser sintetizada numa posição separada conhecida do suporte sólido.

Examplo-2c (tipo II): Análise de matriz cauda com cauda.

Esta análise é a mesma análise de matriz completa do exemplo 2a, no entanto, nesta análise a cisteína do segundo bloco de construção está localizada na sua terminação N, fornecendo uma orientação invertida ou cauda com cauda de ambos os blocos de construção no elemento conforme mostrado também na figura 6A.

Ambos os exemplos 2b e 2c são ilustrados nas Figs 6B, 6C e 6D.

Examplo-3 (tipo-II) : Análise de múltiplos blocos de construção.

Neste exemplo, uma função tiol é introduzida num suporte sólido funcionalizado com amina. Isto pode ser feito através de uma reacção directa dos grupos amina com, por exemplo, iminotiolano, ou através da ligação de Fmoc-Cys(Trt)-OH, seguido da clivagem do Fmoc usando piperidina, acetilação e desprotecção do tritilo usando misturas de TFA/renovadores. Este suporte sólido funcionalizado com tiol pode reagir, por exemplo, com um péptido com 47 bromoacetamida, contendo um resíduo de cisteína protegido. Após a ligação do primeiro péptido, a cisteína pode ser desprotegida usando, por exemplo, uma mistura de TFA/renovador. 0 grupo tiol livre formado pode ser usado para ligar um segundo péptido com bromoacetamida, contendo mais uma vez uma cisteína protegida. Este procedimento pode ser repetido para fazer elementos com múltiplos blocos de construção. Muitos tipos de análises, conforme descrito nos outros exemplos, podem ser usados em combinação com esta análise de múltiplos blocos de construção. Na fig. 7A é mostrado um exemplo para a análise de três múltiplos blocos de construção. Um exemplo de trabalho com análise de dois blocos de construção é ilustrado em 7B, 7C e 7D.

Examplo-4 (tipo-I): Análise de matriz combinada, interacção entre três (ou mais) proteínas

Numa análise de matriz combinada, uma análise de matriz de duas proteínas diferentes é testada em relação a uma proteína solúvel marcada. A figura 8A mostra dois exemplos. No primeiro exemplo (fig. 8A) a proteína solúvel 1 (hormona de crescimento, GH) foi testada em relação a uma análise de matriz combinada da proteína 2 (receptor 1 da GH) e proteína 3 (receptor 2 da GH). No segundo exemplo uma parte da proteína solúvel 1 (CD-4) foi testada em relação a uma análise de matriz combinada da proteína 2 (HIV) e proteína 3 (receptor de quemoquina CCR4) . Na Fig. 8B o uso de receptores e hormonas é ilustrado usando uma parte da proteína da Hormona Folículo-Estimulante humana marcada com biotina testada para todos os 30-mers sobreponíveis cobrindo o receptor da Hormona Folículo-Estimulante humana.

Os exemplos 1 a 4 descrevem métodos usando blocos de construção de péptidos e rastreio com proteínas. Estes 48 elementos podem também ser rastreados em relação a não proteínas. Também podem ser usados blocos de construção não peptídicos. A seguir, são mostrados exemplos de proteínas inteiras em combinação com péptidos (exemplo 5) ou péptidos/proteínas em combinação com não- péptidos/proteínas, ou não-péptidos/proteínas com não-péptidos/proteínas (exemplo 6, DNA/RNA/PNA).

Examplo-5 (tipo II) : Análise de matriz combinada, interacção entre três (ou mais) proteínas

Este exemplo é semelhante ao exemplo 4. A diferença é que as sequências do bloco de construção 2, derivadas de uma proteína (ABCDEFGHIJKC etc.) são substituídas por uma proteína completa, que contém um grupo tiol adicionado para ligação (ver Fig. 9A) . Para ilustrar que podem ser usadas proteínas nativas para serem ligadas deste modo, foi usada a proteína glicose oxidase como exemplo (Fig. 9B).

Examplo-6 (tipo I e tipo-II) : análises de DNA/PNA/péptidos lineares com DNA/PNA/péptidos

Este exemplo é semelhante aos exemplos 1 a 5 com a diferença de que são usados um ou mais blocos de construção não peptídicos (DNA, RNA ou um ácido nucleico peptídico (PNA) em vez de um bloco de construção peptídico) . Os blocos de construção de nucleótidos ou PNAs são modificados com grupos que permitem a ligação dos blocos de construção como nos exemplos 1 a 5. 0 rastreio é realizado com cadeias de DNA, péptidos ou proteínas marcados (ver fig 10) . Como alternativa, cadeias de DNA ou PNA marcadas podem também ser testadas em relação a elementos peptídicos descritos nos exemplos 1 a 5. A ligação entre péptido e PNA é ilustrada nas Figs. 10B e 10C, 10D. 49

Para além de analisar as regiões de interacção de proteínas e não proteínas (DNA/RNA) no formato de ELISA, chip ou blot, também é possível usar a ligação do -C$- em bio-ensaios in vitro. Primeiro, é possível usar elementos solúveis conforme explicado no exemplo 3 como potenciais (ant)agonistas para receptores ligados à membrana. Segundo, é possível usar as proteínas de transporte de membrana tais como transportan ou penetratina para trazer qualquer das combinações de péptidos ou péptidos com PNA ou péptidos com (pequenas) proteínas acima mencionadas para dentro da célula. Na Fig. 11 é ilustrado que é possível ligar dois péptidos em solução. Neste exemplo péptidos semelhantes aos mostrados por exemplo nas Figs. IA, 1B, 2B e 3B.

Examplo-7a (tipo I): Análise de proteína intracelular ligada a Transportan inserida na membrana.

Uma proteína intracelular, como uma quinase, pode ser analisada usando péptidos sobreponíveis num suporte sólido, contendo um ligante na terminação C que pode ser clivado. Os péptidos foram sintetizados com um grupo bromoacetamida N-terminal. A seguir, um péptido de transportan inserido na membrana, contendo um marcador e um grupo tiol, foi ligado às sequências. Estes elementos foram selectivamente clivados do suporte sólido e testados num bio-ensaio. Os marcadores que podem ser usados são, por exemplo, biotina ou marcadores fluorescentes (Fig. 12) .

Examplo-7b (tipo I) : Análise de RNA, DNA ou PNA intracelulares ligados a Transportan inserido na membrana.

Para identificar sequências de PNA/DNA que podem ser usadas para bloquear a expressão de um gene particular, uma análise linear longa, ligada a um péptido inserido na 50 membrana, pode ser testada num bio-ensaio in vitro, (Fig. 12) .

Lisboa, 25 de Março de 2009

Claims (5)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para produzir um grande número de moléculas para identificação ou detecção de um sitio de ligação compreendendo gerar pelo menos uma das referidas moléculas através pelo menos da ligação de um primeiro ácido nucleico ou péptido a um segundo ácido nucleico ou péptido, em que o referido primeiro e segundo ácidos nucleicos ou péptidos compreendem pelo menos um trinucleótido ou um tripéptido.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que um primeiro péptido é ligado a um segundo péptido.

3. Método de acordo com qualquer umas das reivindicações 1 a 2, em que um primeiro péptido é ligado através de uma ligação tioéter a um segundo péptido.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que pelo menos cada um do primeiro e/ou segundo ácido nucleico ou péptido ou parte destes representa uma potencial parte de um sitio de ligação descontinuo.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, compreendendo ainda rastrear o grande número de moléculas obtidas com pelo menos uma molécula ligante potencial e detectar a ligação entre um membro do referido grande número de moléculas e a referida molécula ligante potencial. Lisboa, 25 de Março de 2009