PL218660B1 - Izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne wiążące ludzki CD20, związane z tym przeciwciałem transfektoma, komórka gospodarza, transgeniczne zwierzę lub roślina, kompozycja, immunokoniugat, cząsteczka bispecyficzna, wektor ekspresyjny, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie medyczne, zestaw oraz przeciwciało antyidiotypowe i jego zastosowanie - Google Patents

Izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne wiążące ludzki CD20, związane z tym przeciwciałem transfektoma, komórka gospodarza, transgeniczne zwierzę lub roślina, kompozycja, immunokoniugat, cząsteczka bispecyficzna, wektor ekspresyjny, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie medyczne, zestaw oraz przeciwciało antyidiotypowe i jego zastosowanie

Info

Publication number
PL218660B1
PL218660B1 PL402418A PL40241803A PL218660B1 PL 218660 B1 PL218660 B1 PL 218660B1 PL 402418 A PL402418 A PL 402418A PL 40241803 A PL40241803 A PL 40241803A PL 218660 B1 PL218660 B1 PL 218660B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
antibody
cells
human
antibodies
cell
Prior art date
Application number
PL402418A
Other languages
English (en)
Other versions
PL402418A1 (pl
Inventor
Jessica Teeling
Sigrid Ruuls
Martin Glennie
De Winkel Jan G. J. Van
Paul Parren
Jorgen Petersen
Ole D. M. Sc. Baadsgaard
Haichun Huang
Original Assignee
Genmab As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=32110219&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL218660(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genmab As filed Critical Genmab As
Publication of PL402418A1 publication Critical patent/PL402418A1/pl
Publication of PL218660B1 publication Critical patent/PL218660B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/08—Antiseborrheics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
    • C07K16/4258—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/686—Anti-idiotype
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)

Abstract

Niniejszym ujawniono izolowane ludzkie przeciwciała monoklonalne, które wiążą się z i hamują ludzki CD20 oraz kompozycje i cząsteczki oparte na spokrewnionych przeciwciałach. Ludzkie przeciwciała mogą być wytwarzane przez transfektoma lub w zwierzęciu transgenicznym nie będącym człowiekiem, np. w myszy transgenicznej, zdolnych do wytworzenia wielorakich izotypów ludzkich przeciwciał przez uleganie rekombinacji V-D-J i przełączaniu izotypowemu. Ujawnione zostały również kompozycje farmaceutyczne obejmujące ludzkie przeciwciała, zwierzęta transgeniczne nie będące ludźmi i hybrydoma wytwarzające ludzkie przeciwciała, oraz terapeutyczne i diagnostyczne sposoby zastosowania ludzkich przeciwciał.

Description

Przedmiotem wynalazku jest izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne wiążące ludzki CD20, związane z tym przeciwciałem transfektoma, komórka gospodarza, transgeniczne zwierzę lub roślina, kompozycja, immunokoniugat, cząsteczka bispecyficzna, wektor ekspresyjny, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie medyczne, zestaw oraz przeciwciało antyidiotypowe i jego zastosowanie.
Cząsteczka CD20 (zwana także ludzkim antygenem różnicowania ograniczonym do limfocytów B lub Bp35) jest transbłonowym białkiem hydrofobowym o masie molekularnej około 35 kD umieszczonym na limfocytach pre-B i dojrzałych limfocytach B (Valentine et al. (1989) J. Biol. Chem. 264(19): 11282-11287; i Einfield et al. (1988) EMBO J. 7(3):711-717). CD20 znajduje się na powierzchni ponad 90% komórek B z krwi obwodowej lub narządów limfoidalnych i ulega ekspresji w czasie wczesnego rozwoju komórek pre-B i pozostaje aż do różnicowania się komórek osocza. CD20 jest obecne zarówno na prawidłowych komórkach B, jak i nowotworowych komórkach B. W szczególności, CD20 jest wyrażane przez ponad 90% komórek B chłoniaka nieziarniczego (NHL, ang. Non-Hodgkin Lymphoma) (Anderson et al. (1984) Blood 63(6):1424-1433), ale nie stwierdza się go na macierzystych komórkach hematopoetycznych lub w innych normalnych tkankach (Tedder et al. (1985) J. Immunol. 135(2):973-979).
Region 85 aminokwasów końca karboksylowego białka CD20 znajduje się w cytoplazmie. Długość tego regionu kontrastuje z regionami innych struktur powierzchniowych komórek B, takich jak łańcuchy ciężkie IgM, IgD i IgG lub łańcuchy a lub β antygenów zgodności tkankowej klasy II, które mają stosunkowo krótkie regiony wewnątrzcytoplazmatyczne o, odpowiednio, 3, 3, 28, 15 i 16 aminokwasach (Komaromy et al. (1983) NAR 11:6775-6785). Z ostatnich 61 aminokwasów na końcu karboksylowym jedynie 2 są zasadowe, wskazując, że region ten ma silny ujemny ładunek wypadkowy. Numer dostępu w Gene Bank to NP_690605.
Uważa się, że CD20 może być zaangażowane w regulację wczesnego etapu (etapów) aktywacji procesu różnicowania komórek (Tedder et al. (1986) Eur. J. Immunol. 16:881-887) i mogłoby funkcjonować jako kanał wapniowy (Tedder et al. (1990) J. Cell. Biochem. 14D:195).
Pomimo niepewności odnośnie rzeczywistej funkcji CD20 w promowaniu proliferacji i/lub różnicowania komórek B, stanowi ono istotną cząsteczkę docelową w leczeniu za pośrednictwem przeciwciał, którego celem jest kontrola lub niszczenie komórek B zaangażowanych w choroby nowotworowe lub autoimmunizacyjne. W szczególności, ekspresja CD20 na komórkach nowotworowych, np. NHL, czyni je istotnym celem leczenia za pośrednictwem przeciwciał, aby specyficznie kierować czynniki terapeutyczne przeciwko komórkom neoplastycznym dodatnim względem CD20. Chociaż dotychczas uzyskane wyniki jasno przedstawiają CD20 jako użyteczny cel immunoterapii, pokazują także, że obecnie dostępne przeciwciała mysie lub chimeryczne nie stanowią idealnych czynników terapeutycznych.
Zgodnie z powyższym, istnieje potrzeba opracowania udoskonalonych przeciwciał terapeutycznych przeciwko CD20, efektywnych w zapobieganiu i/lub leczeniu grupy chorób, w których występują komórki wyrażające CD20.
Przedmiotem wynalazku jest zatem izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne wiążące ludzki CD20, obejmujące CDR1 VH jak przedstawiono w SEK NR ID: 25, CDR2 VH jak przedstawiono w SEK NR ID: 26, CDR3 VH jak przedstawiono w SEK NR ID: 27, CDR1 VL jak przedstawiono w SEK NR ID: 28, CDR2 VL jak przedstawiono w SEK NR ID: 29, oraz CDR3 VL jak przedstawiono w SEK
NR ID: 30.
Tak więc niniejszym dostarczone jest udoskonalone przeciwciało terapeutyczne do leczenia i/lub zapobiegania chorobom związanym z komórkami wyrażającymi CD20, włączając choroby związane z nowotworami i choroby immunologiczne, łącznie z chorobami autoimmunizacyjnymi. Przeciwciała według wynalazku są w pełni ludzkie, a więc, potencjalnie mniej immunogenne dla pacjenta.
Jak niniejszym wykazano w przykładach, ludzkie przeciwciała według wynalazku pośredniczą w zabijaniu komórek B wyrażających CD20 z wykorzystaniem licznych mechanizmów. Ludzkie przeciwciała według wynalazku indukują cytotoksyczność zależną od dopełniacza (CDC, ang. complement dependent cytotoxicity), np. przynajmniej 20%, korzystnie 30%, a korzystniej 40-50% lizy w komórkach, takich jak komórki przewlekłej białaczki B-limfocytarnej (B-CLL, ang. B-lymphocytic leukaemia) występuje za pośrednictwem CDC. Przeciwciała według wynalazku indukują apoptozę komórek wyrażających CD20. W innym wykonaniu, ludzkie przeciwciała według wynalazku indukują homotyPL 218 660 B1 pową adhezję komórek wyrażających CD20. Ponadto, ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą indukować zależną od przeciwciał cytotoksyczność komórkową (ADCC, ang. antibody dependent cellular cytotoxicity) komórek wyrażających CD20 w obecności ludzkich komórek efektorowych (np. monocytów, komórek jednojądrzastych, komórek NK i PMN). Ponadto, ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą indukować fagocytozę komórek wyrażających CD20 w obecności makrofagów. Ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku mogą działać za pomocą jednego lub większej liczby takich mechanizmów. Przykłady komórek, które można uśmiercać stosując ludzkie przeciwciała według wynalazku obejmują, lecz nie są ograniczone do komórek B wyrażających CD20, takich jak komórki B nowotworogenne i komórki B zaangażowane w choroby immunologiczne. W szczególnym wykonaniu, ludzkie przeciwciała wykorzystuje się do pośredniczenia w uśmiercaniu limfocytów B w leczeniu chłoniaka, np. chłoniaka nieziarniczego z komórek B.
Ludzkie przeciwciała według wynalazku obejmują przeciwciała IgG1 (np. IgG, κ), IgG3 (np., IgG3, κ) i IgG4 (np. IgG, κ). Jednakże inne izotypy przeciwciał są także objęte wynalazkiem, włączając IgG2, IgM, IgA1, IgA2, wydzielnicze Ig A, IgD i IgE. Przeciwciałami mogą być całe przeciwciała lub ich fragmenty wiążące antygen włączając, na przykład, Fab, F(ab')2, Fv, jednołańcuchowe fragmenty Fv lub przeciwciała bispecyficzne. Ponadto, fragmenty wiążące antygen mogą zawierać domenę wiążącą fuzji białkowych immunoglobulin obejmującą (i) polipeptyd domeny wiążącej (taki jak region zmienny łańcucha ciężkiego lub region zmienny łańcucha lekkiego) w fuzji z polipeptydem regionu zawiasowego immunoglobuliny, (ii) region stały CH2 łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w fuzji z regionem zawiasowym oraz (iii) region stały CH3 łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w fuzji z regionem stałym CH2. Takie fuzje białkowe domen wiążących immunoglobulin są ponadto ujawnione w patentach: US 2003/0118592 i US 2003/0133939.
Szczególne ludzkie przeciwciała według wynalazku obejmują te, określone jako 11B8, kodowane przez kwasy nukleinowe ludzkiego łańcucha ciężkiego i ludzkiego łańcucha lekkiego kappa obejmujące sekwencje nukleotydowe jak przedstawiono w, odpowiednio, SEK. NR ID.: 9 i SEK. NR ID.: 11. W innym wykonaniu, ludzkie przeciwciała charakteryzują się posiadaniem regionów zmiennych ludzkiego łańcucha ciężkiego i ludzkiego łańcucha lekkiego kappa obejmujących sekwencje aminokwasowe jak przedstawiono w, odpowiednio, SEK. NR ID.: 10 i SEK. NR ID.: 12.
Przeciwciała według wynalazku obejmują te, które oddysocjowują od CD20 ze stałą dysocjacji (KD) około 1-10 nM lub mniej. Takie przeciwciała obejmują także te, które nie oddziałują krzyżowo z podobnymi antygenami powierzchniowymi, a więc nie hamują ich funkcji.
Ludzkie przeciwciała przeciwko CD20 według wynalazku można scharakteryzować przez jedną lub więcej spośród następujących właściwości:
a) specyficzność w stosunku do ludzkiego CD20;
b) powinowactwo wiązania z CD20 (KD) około 10 nM lub mniej, korzystnie około 5 nM lub mniej i korzystniej około 1-3 nM lub mniej, jak ustalono wykonując test wiązania przedstawiony w Przykładzie 5 poniżej (Figura 9);
c) stałą szybkości dysocjacji (kd) od CD20 około 10-4 sek-1 lub mniej, korzystnie około 10-5 sek-1 lub mniej i korzystniej około 10-6 sek-1 lub mniej, jak ustalono wykonując test dysocjacji przedstawiony w Przykładzie 5 poniżej (Figura 9);
d) zdolność do pośredniczenia w podwyższaniu poziomu CDC komórek ujemnych pod względem CD55/59 albo dodatnich względem CD55/59;
e) zdolność translokacji do tratw lipidowych po związaniu z CD20;
f) zdolność do hamowania wzrostu komórek wyrażających CD20;
g) zdolność do indukowania apoptpozy w komórkach wyrażających CD20;
h) zdolność do indukowania homotypowej adhezji komórek wyrażających CD20;
i) zdolność do indukowania ADCC komórek, które wyrażają CD20 w obecności komórek efektorowych;
j) zdolność do przedłużania przeżycia osobnika mającego nowotworowe komórki wyrażające
CD20;
k) zdolność do zmniejszania liczby komórek wyrażających CD20; i/lub
l) zdolność do zmniejszania liczby komórek wyrażających CD20 na niskim poziomie (komórki CD20low).
Ludzkie przeciwciała przeciwko CD20 według wynalazku można derywatyzować, sprzęgać lub jednocześnie wyrażać (ko-ekspresja) z innymi czynnikami wiążącymi. W szczególnym wykonaniu, wynalazek dostarcza bispecyficznej cząsteczki obejmującej czynnik wiążący CD20 (np. ludzkie prze4
PL 218 660 B1 ciwciało przeciwko CD20 według wynalazku) i drugi czynnik wiążący dla ludzkiej komórki efektorowej, taki jak czynnik wiążący receptor Fc (np. ludzki receptor Fcy, taki jak FcyRI lub ludzki receptor Fca) albo receptor komórek T np. CD3.
Zgodnie z powyższym, niniejszy wynalazek obejmuje cząsteczki bispecyficzne wiążące zarówno ludzki CD20 i receptor Fc lub receptor komórek T np. CD3. Przykładami receptorów Fc są, na przykład, ludzki receptor IgG, np. receptor Fc-gamma (FcyR), taki jak FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), i FcyRIII (CD 16). Inne receptory, takie jak ludzkie receptory IgA (np. FcaRI) również mogą stanowić receptory docelowe. Receptor Fc korzystnie znajduje się na powierzchni komórki efektorowej, np. monocycie, makrofagu lub aktywowanej komórce jednojądrzastej. W korzystnym wykonaniu, cząsteczki bispecyficzne wiążą się z receptorem Fc w miejscu różnym od miejsca wiązania immunoglobuliny Fc (np. IgG lub IgA) receptora. Tak więc, wiązanie bispecyficznych cząsteczek nie jest blokowane przez fizjologiczne poziomy immunoglobulin.
Ludzkie przeciwciała przeciwko CD20 według wynalazku mogą być derywatyzowane, sprzęgane lub jednocześnie wyrażane z inną cząsteczką funkcjonalną, np. innym peptydem lub białkiem (np. fragmentem Fab'). Na przykład, przeciwciało według wynalazku może być funkcjonalnie sprzężone (poprzez sprzęganie chemiczne, fuzję genetyczną, wiązanie niekowalencyjne lub inaczej) z jedną lub większą liczbą jednostek cząsteczkowych, takich jak inne przeciwciało (np. z wytworzeniem przeciwciała bispecyficznego lub multispecyficznego), cytotoksyna, ligand komórkowy lub antygen (np. z wytworzeniem immunokoniugatu, takiego jak immunotoksyna). Przeciwciało według niniejszego wynalazku można sprzęgać z innymi związkami terapeutycznymi, np. izotopem radioaktywnym, niskocząsteczkowym lekiem przeciwnowotworowym, czynnikiem przeciwzapalnym lub czynnikiem immunosupresyjnym. Zatem, niniejszym ujawniono dużą różnorodność koniugatów przeciwciał, cząsteczek bispecyficznych lub multispecyficznych i fuzji białkowych, które wszystkie wiążą się z komórkami wyrażającymi CD20 i można je stosować do nakierowywania innych cząsteczek do takich komórek.
W jeszcze jednym aspekcie, wynalazek dostarcza kompozycji, np. kompozycji/ zestawów farmaceutycznych i diagnostycznych obejmujących dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, formułowanych wraz z jednym lub kombinacją ludzkich przeciwciał monoklonalnych według wynalazku. W szczególnym wykonaniu, kompozycja obejmuje kombinacje przeciwciał wiążących różne epitopy lub które wykazują różne cechy funkcjonalne, takie jak indukowanie CDC i indukowanie apoptozy.
Ludzkie przeciwciała, immunokoniugaty, cząsteczki bispecyficzne i multispecyficzne oraz kompozycje ujawnione niniejszym można stosować w różnorodnych sposobach hamowania wzrostu komórek wyrażających CD20 i/lub uśmiercania komórek wyrażających CD20 przez kontaktowanie komórek ze skuteczną ilością przeciwciała, immunokoniugatu, cząsteczki bispecyficznej/multispecyficznej lub kompozycji tak, że zahamowany jest wzrost komórki i/lub komórka zostaje uśmiercona. Metoda taka może obejmować uśmiercanie komórek wyrażających CD20 w obecności komórek efektorowych, na przykład, przez CDC, apoptozę, ADCC, fagocytozę lub przez kombinację dwóch lub większej liczby mechanizmów. Korzystnie, komórki są uśmiercane lub hamowane, bez uśmiercania czy hamowania aktywności komórek niewyrażających CD20, ale które mogą, na przykład, wyrażać pokrewne strukturalnie antygeny powierzchniowe (tj. bez reaktywności krzyżowej z pokrewnymi, ale funkcjonalnie odmiennymi antygenami powierzchniowymi). Komórki wyrażające CD20, które można hamować lub uśmiercać stosując ludzkie przeciwciała według wynalazku obejmują na przykład, nowotworogenne komórki B.
Zgodnie z powyższym, ludzkie przeciwciała według wynalazku można stosować do leczenia i/lub zapobiegania wielu chorobom, w których biorą udział komórki wyrażające CD20, przez podawanie przeciwciał pacjentom cierpiącym na takie choroby. Przykładowo, choroby które można leczyć (np. poprawić stan) lub im zapobiegać obejmują, ale nie są ograniczone do chorób nowotworowych i immunologicznych np. chorób autoimmunizacyjnych. Przykłady chorób nowotworowych, które można leczyć lub im zapobiegać obejmują chłoniaka z komórek B, np. NHL, włączając białaczkę/chłoniaka limfoblastycznego z prekursorów komórek B i nowotwory z dojrzałych komórek B, takie jak przewlekła białaczka limfatyczna z komórek B (CCL, ang. chronić lymphoblastic leukemia)/ chłoniak z małych limfocytów (SLL, ang. small lymphocytic lymphoma), białaczka prolimfocytowa z komórek B, chłoniak limfoplazmatyczny, chłoniak komórek płaszcza (MCL, ang. mantle cell lymphoma), chłoniak grudkowy (FL, ang. follicular lymphoma), łącznie z FL o niskim (ang. low-grade), średnim (ang. intermediate-grade) i dużym stopniu (ang. high-grade) złośliwości, skórny chłoniak grudkowy (ang. cutaneous follicle center lymphoma), chłoniak strefy brzeżnej z komórek B (ang. marginal zone B cell lymphoma) (typu MALT, typu węzłowego i typu śledzionowego), białaczka włochatokomórkowa (ang. hairy cell
PL 218 660 B1 leukemia), rozlany chłoniak z dużych komórek B, chłoniak Burkitta, nowotwór komórek osocza (ang. plasmacytoma), szpiczak mnogi (ang. plasma cell myeloma), potransplantacyjna choroba limfoproliferacyjna, makroglobulinemia Waldenstroma i anaplastyczny chłoniak olbrzymiokomórkowy (ALCL, ang.
anaplastic large-cell lymphoma).
Przykładami chorób immunologicznych, w które zaangażowane są komórki B wyrażające CD20, a które można leczyć lub im zapobiegać, są: łuszczyca, artropatia łuszczycowa, zapalenie skóry, układowa twardzina i stwardnienie, zapalna choroba jelita (IBD, ang. inflammatory bowel disease), choroba Crohna, wrzodziejące zapalenie okrężnicy, zespół niewydolności oddechowej (RDS, ang. respiratory distress syndrome), zapalenie opon mózgowych, zapalenie mózgu, zapalenie błony naczyniowej oka, zapalenie kłębuszków nerkowych, egzema, astma, miażdżyca tętnic, niedobór przylegania leukocytów, stwardnienie rozsiane, zespół Raynauda, zespół Sjogrena, cukrzyca młodzieńcza, choroba Reitera, choroba Behęeta, związane z kompleksami immunologicznymi zapalenie nerek, nefropatia IgA, polineuropatie IgM, immunologiczna małopłytkowość, taka jak ostra choroba Werlhofa (ostra idiopatyczna plamica małopłytkowa) i przewlekła choroba Werlhofa (przewlekła idiopatyczna plamica małopłytkowa), anemia hemolityczna, miastenia (MG, ang. myasthenia gravis), zapalenie nerek w toczniu rumieniowatym układowym, liszaj rumieniowaty układowy, reumatoidalne zapalenie stawów (RA, ang. rheumatoid arthritis), atopowe zapalenie skóry, pęcherzyca, choroba Gravesa-Basedowa, zapalenie tarczycy Hashimoto, ziarniniak Wegenera, zespół Omenna, przewlekła niewydolność nerek, ostra zakaźna mononukleoza, choroby związane z HIV i wirusami opryszczki. Kolejnymi przykładami są: zespół ostrej ciężkiej niewydolności oddechowej i zapalenie naczyniówki i siatkówki. Jeszcze kolejnymi przykładami są choroby i zaburzenia powodowane przez zakażenie komórek B przez wirusa, takiego jak wirus Epsteina-Barr (EBV, ang. Epstein-Barr Virus).
Osobnik, któremu podaje się przeciwciało według wynalazku może dodatkowo być traktowany czynnikiem chemioterapeutycznym, naświetlaniem lub czynnikiem modulującym, np. wzmacniającym lub hamującym ekspresję lub aktywność receptora Fc, np. receptora Fca lub receptora Fcy, takim jak cytokina. Typowymi cytokinami podawanymi w czasie leczenia są czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF, ang. granulocyte colony-stimulating factor), czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów (GM-CSF, ang. granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), interferon γ (IFN-γ) i czynnik martwicy nowotworu (TNF). Typowe czynniki terapeutyczne obejmują, między innymi, czynniki przeciwnowotworowe, takie jak doksorubicyna, cisplatyna, bleomycyna, karmustyna, chlorambucyl i cyklofosfamid.
W jeszcze innym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza sposobu wykrywania in vitro obecności CD20 w próbce lub u osobnika np. w celu diagnozowania chorób związanych z CD20, korzystnie na wczesnym etapie. Może to być także użyteczne do monitorowania choroby i efektów leczenia oraz do ustalenia i dopasowania dawki przeciwciał do podania. Metodę wykrywania można także prowadzić in vivo, na przykład stosując technikę obrazowania, taką jak PET (pozytonowa tomografia emisyjna) lub SPECT (komputerowa tomografia emisyjna pojedynczych fotonów). Sposób według wynalazku realizuje się przez kontaktowanie badanej próbki, ewentualnie równocześnie z kontaktowaniem próbki kontrolnej, z ludzkimi przeciwciałami monoklonalnymi według wynalazku w warunkach pozwalających na tworzenie kompleksu między przeciwciałem i CD20. Następnie wykrywa się powstałe kompleksy (np. przy użyciu FACS lub techniką Western blot). Gdy używana jest próbka kontrolna jednocześnie z próbka badaną, kompleks wykrywa się w obu próbkach i każda istotna statystycznie różnica w tworzeniu się kompleksu pomiędzy próbkami wskazuje na obecność CD20 w próbce badanej.
W jeszcze innym aspekcie, wynalazek dostarcza transgenicznego zwierzęcia innego niż człowiek, takiego jak mysz transgeniczna, które wyraża ludzkie przeciwciała monoklonalne wiążące CD20. W szczególnym wykonaniu, transgeniczne zwierzę inne niż człowiek jest myszą transgeniczną zawierającą genom obejmujący transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego i transgen ludzkiego łańcucha lekkiego kodujące całe lub część przeciwciała według wynalazku. Transgeniczne zwierzę inne niż człowiek można immunizować oczyszczonym lub wzbogaconym preparatem antygenu CD20 i/lub komórkami wyrażającymi CD20. Korzystnie, transgeniczne zwierzę inne niż człowiek, np. transgeniczna mysz, ma zdolność wytwarzania licznych izotypów ludzkich przeciwciał monoklonalnych wobec CD20 (np. IgG, IgA i/lub IgM) dzięki rekombinacji V-D-J i przełączanie izotypów. Przełączanie izotypów może zachodzić np. przez klasyczne lub nieklasyczne przełączanie izotypów.
Zgodnie z powyższym, możliwe jest izolowanie komórek B ze zwierzęcia transgenicznego innego niż człowiek jak opisano wyżej, np. myszy transgenicznej, która wyraża ludzkie przeciwciała przeciwko CD20. Izolowane komórki B można następnie unieśmiertelniać przez fuzję z komórką
PL 218 660 B1 unieśmiertelnioną, aby otrzymać źródło (np. hybrydoma) ludzkich przeciwciał przeciwko CD20. Takie hybrydoma (tj. wytwarzające ludzkie przeciwciała przeciwko CD20) także włącza się w zakres wynalazku.
Jak niniejszym zilustrowano, przeciwciała według wynalazku można otrzymać bezpośrednio z hybrydoma, które wyrażają przeciwciało lub mogą zostać sklonowane i ulegać ekspresji dzięki rekombinacji w komórkach gospodarza (np. komórkach CHO, NS/0 lub komórkach limfocytarnych). Dalszymi przykładami komórek gospodarzy są mikroorganizmy takie jak E. coli i grzyby, takie jak drożdże. Alternatywnie, mogą być wytwarzane dzięki rekombinacji przez zwierzę inne niż człowiek lub roślinę. Zgodnie z powyższym, niniejszym opisano sposoby wytwarzania ludzkich przeciwciał monoklonalnych wiążących się z CD20. Sposób taki obejmuje immunizację transgenicznego zwierzęcia innego niż człowiek, np. transgenicznej myszy, jak wcześniej opisano (np. mającej genom obejmujący transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego i transgen ludzkiego łańcucha lekkiego kodujący całe lub część przeciwciała przeciwko CD20), oczyszczonym lub wzbogaconym preparatem ludzkiego antygenu CD20 i/lub komórkami wyrażającymi ludzki CD20. Otrzymuje się wtedy komórki B (np. komórki B śledziony) zwierzęcia i poddaje fuzji z komórkami szpiczaka, aby otrzymać nieśmiertelne komórki hybrydoma wydzielające ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko CD20.
W jeszcze innym aspekcie, wynalazek dostarcza cząsteczek kwasów nukleinowych kodujących ludzkie przeciwciała przeciwko CD20 (np. ich regiony zmienne), jak też zrekombinowanych wektorów ekspresyjnych zawierających kwasy nukleinowe według wynalazku i komórek gospodarzy transfekowanych tymi wektorami. Sposoby wytwarzania przeciwciał przez hodowanie tych komórek gospodarzy zostały niniejszym opisane. Poszczególne kwasy nukleinowe dostarczone przez wynalazek obejmują sekwencje nukleotydowe przedstawione w SEK. NR ID.: 9 oraz SEK. NR ID.: 11, kodujące odpowiednio łańcuchy ciężkie i lekkie ludzkich przeciwciał przeciwko CD20 - 11B8.
Inne cechy i korzyści z bieżącego wynalazku będą jasne na podstawie następującego szczegółowego opisu i zastrzeżeń.
Krótki opis rysunków
Figura 1 przedstawia wektor pCONylf/zmienny ciężki stosowany do wytwarzania rekombinowanych, ludzkich przeciwciał monoklonalnych 2F2 i 11B8.
Figura 2 przedstawia wektor pCONK/zmienny lekki stosowany do wytwarzania rekombinowanych 2F2 i 11B8.
Figura 3 przedstawia wektor do klonowania dwóch (pCONy1f/K2F2) stosowany do wytwarzania rekombinowanych 2F2 i 11B8.
Figura 4 jest wykresem porównującym wiązanie ludzkich przeciwciał monoklonalnych 2F2, 7D8 i 11B8 z komórkami Raji, Daudi i NS/0 transfekowanymi CD20 i rodzicielskich komórek NS/0 przy użyciu cytometrii przepływowej.
Figury 5A i 5B przedstawia wiązanie 2F2 z PBMC od trzech ludzkich dawców za pomocą cytometrii przepływowej.
125
Figura 6 jest wykresem porównującym powinowactwo wiązania znakowanego 125I 2F2 i zna125 kowanego 125I 11B8 z komórkami Ramos-EHRB.
125 125
Figury 7A i 7B przedstawiają wiązanie znakowanego 125I 2F2 i znakowanego 125I 11B8 w po125 równaniu ze znakowanym 125I rituximabem (chimerowe przeciwciało przeciwko CD20 IDEC) i zna125 kowanym 125I B1 (określenie B1 odnosi się do nieznakowanej postaci Bexxar™, który jest znakowa125 nym 125I mysim przeciwciałem przeciwko ludzkiemu CD20, Coulter) z komórkami Ramos-EHRB (A) i komórkami Daudi (B).
125
Figura 8 jest wykresem porównującym szybkość dysocjacji znakowanego 125I 11B8, znakowa125 125 125 nego 125I 2F2, znakowanego 125Irituximabu (RIT) i znakowanego 125I B1.
Figura 9 przedstawia szybkość dysocjacji fragmentów F(ab')2 z 2F2, 11B8 i rituximabu w komórkach Ramos-EHRB.
Figury 10A i 10B przedstawiają CDC przeciwciał 2F2T, 11B8T, 7D8, rituximabu i izotypowego przeciwciała kontrolnego (HuMab-KLH) w komórkach Daudi (A) i SU-DHL-4 (B) w różnych punktach czasowych (funkcyjna szybkość dysocjacji, ang. functional off-rate) stosując cytometrię przepływową.
Figury 11A i 11B przedstawiają kinetykę CDC indukowanej przez 2F2 i rituximab w różnych liniach komórkowych wyznaczoną przez cytometrię przepływową.
Figury 12A-D przedstawiają CDC indukowane przez 2F2q wobec różnych linii komórkowych jako funkcję stężenia dopełniacza (normalna surowica ludzka, (NHS, ang. normal human serum) przy dwóch różnych stężeniach przeciwciał stosując cytometrię przepływową.
PL 218 660 B1
Figury 13A-D przedstawiają zależną od stężenia indukcję CDC przez 2F2 i rituximab w różnych liniach komórkowych stosując cytometrię przepływową.
Figury 14A i 14B przedstawiają zależną od stężenia indukcję CDC przez 2F2, 2F2T, 11B8T, B1 i rituximab w komórkach Daudi (A) i Raji (B).
Figury 15A i 15C są wykresami porównującymi CDC komórek Daudi (komórki wyrażające niskie poziomy CD55/59) wywołaną przez ludzkie przeciwciała monoklonalne 2F2, 7D8 i 11B8 oraz rituximab; (A) przedstawia procent lizy komórek niepłukanych, a (B) przedstawia procent lizy komórek płukanych przed dodaniem surowicy.
Figury 16A i 16B są wykresami porównującymi CDC komórek Raji (komórki wyrażające wysoki poziom CD55/59) wywołaną przez ludzkie monoklonalne przeciwciała 2F2, 7F8 i 11B8 oraz rituximab; (A) przedstawia procent lizy komórek nieblokowanych przeciwciałami przeciwko CD55 i przeciwko CD59, a (B) przedstawia procent lizy komórek blokowanych przeciwciałami przeciwko CD55 i przeciwko CD59.
Figury 17A-C przedstawiają rolę CD55 i CD59 w CDC indukowanej 2F2 i rituximabem w komórkach Raji. (A) przedstawia procent zlizowanych komórek po dodaniu przeciwciał przeciwko CD55, (B) przedstawia procent zlizowanych komórek po dodaniu przeciwciał przeciwko CD59, (C) przedstawia procent zlizowanych komórek po dodaniu obu przeciwciał przeciwko CD55 i przeciwko CD59.
Figury 18A-D przedstawiają wiązanie czynnika C1q dopełniacza przez 2F2 i rituximab w różnych liniach komórkowych jak to zostało oznaczone stosując cytometrię przepływową.
Figury 19A-D przedstawiają unieruchamianie fragmentu czynnika C4c dopełniacza przez 2F2 i rituximab w różnych liniach komórkowych, jak zostało to oznaczone z zastosowaniem cytometrii przepływowej.
Figura 20 przedstawia lizę komórek ARH-77 przez 2F2, rituximab i 11B8T w obecności PMN, MNC, osocza lub pełnej krwi.
Figura 21 przedstawia lizę komórek B-CLL przez 2F2, rituximab i 11B8T w obecności PMN, MNC, osocza lub pełnej krwi.
Figura 22 przedstawia lizę komórek HCL (białaczka włochatokomórkowa) przez 2F2, rituximab i 11B8T w obecności PMN, MNC, osocza lub pełnej krwi.
Figura 23 przedstawia lizę komórek B-ALL przez 2F2, rituximab i 11B8T w obecności PMN, MNC, osocza lub pełnej krwi.
Figura 24 przedstawia lizę komórek chłoniaka grudkowatego (FL) przez 2F2, rituximab i 11B8T w obecności PMN, MNC, osocza lub pełnej krwi.
Figura 25 przedstawia lizę komórek chłoniaka komórek płaszcza przez 2F2, rituximab i 11B8T w obecności PMN, MNC, osocza lub pełnej krwi.
Figura 26 przedstawia zależną od stężenia lizę komórek ARH-77 przez 2F2 i rituximab w obecności pełnej krwi.
Figura 27 przedstawia lizę komórek ARH-77 za pośrednictwem MNC przez 2F2T, 11B8T i rituximab.
Figura 28 przedstawia lizę komórek Raji za pośrednictwem MNC przez 2F2T, 11B8T i rituximab.
Figury 29 A, B i C są wykresami przedstawiającymi odkładanie CD20 w tratwach lipidowych przy inkubacji z 2F2, 7D8 lub 11B8 z badania przy użyciu analizy FRET i oznaczeniu nierozpuszczalności Triton-X.
Figura 30 przedstawia odkładanie CD20 w tratwach lipidowych przy inkubacji z 2F2, rituximabem lub 11B8T w badaniu przy użyciu analizy FRET.
Figura 31 przedstawia proporcję CD20 pozostającego w nierozpuszczalnej frakcji tratw po traktowaniu Tritonem X-100 (TX) i inkubacji z 2F2, rituximabem lub 11B8T.
Figura 32 przedstawia dystrybucję CD20 między frakcje raftowe (obecność tratw) i nieraftowe (bez tratw) błony przy stymulacji komórek Daudi za pomocą 2F2, rituximabu lub 11B8T.
Figury 33A-G przedstawiają apoptozę komórek Daudi wywołaną przez 2F2, 7D8 i 11B8 w badaniu z zastosowaniem cytometrii przepływowej.
Figura 34 przedstawia indukcję apoptozy w komórkach Raji wywołaną przez 2F2, 11B8T, rituximab lub B1 w badaniu z zastosowaniem cytometrii przepływowej.
Figura 35A przedstawia indukcję apoptozy komórek Daudi wywołaną przez 2F2T, 11B8T, rituximab i B1 w badaniu z zastosowaniem cytometrii przepływowej.
PL 218 660 B1
Figura 35B przedstawia wczesny i późny etap apoptozy komórek Daudi wywołanej przez ludzkie monoklonalne przeciwciała 2F2T, 11B8T, rituximab i B1 w badaniu z zastosowaniem cytometrii przepływowej.
Figury 36A-E przedstawiają homotypową adhezję komórek Ramos-EHRB wywołaną przez 2F2, 7D8 i 11B8 w badaniu z zastosowaniem mikroskopii świetlnej.
Figura 37 przedstawia homotypową adhezję komórek Daudi wywołaną przez 2F2, rituximab i B1 w badaniu z zastosowaniem mikroskopii świetlnej.
Figura 38 jest wykresem przedstawiającym procent przeżycia myszy SCID, którym wstrzyknięto komórki Daudi i leczono 2F2 lub 7D8.
Figura 39 przedstawia procent przeżycia myszy SCID, którym wstrzyknięto komórki Tanoue i leczono 2F2, rituximabem lub B1.
Figura 40 przedstawia procent przeżycia myszy SCID, którym wstrzyknięto komórki Daudi i leczono różnymi stężeniami 2F2 i rituximabu.
Figura 41 przedstawia procent przeżycia myszy SCID, którym wstrzyknięto komórki Daudi i leczono 11B8T lub B1.
Figura 42 przedstawia obrazowanie bioluminescencencyjne komórek nowotworu w myszach
SCID 39 dnia (31 dni po traktowaniu 10 μg B1, rituximabem, 11B8T, 2F2T lub hulgGI). Bioluminescencja jest reprezentowana na czerwono (ciemne regiony mysie) (intensywność światła > 50 fotonów na 5 min) na czarno-białym obrazie ciała myszy.
Figura 43 przedstawia masę guza w każdej myszy zmierzoną dnia 25, 32, 39 i 46 po podaniu dnia 8 10 μg B1, rituximabu, 11B8T, 2F2T lub hulgG1 przez integracje sygnałów świetlnych nad powierzchnią ciała.
Figury 44A-C przedstawiają analizę za pomocą cytometrii przepływowej komórek CD20+ we krwi obwodowej makaka jawajskiego, po dożylnym podaniu 2F2 lub rituximabu przy różnym dawkowaniu, 4 x 1,25 mk/kg (A), 4 x 6,25 mg/kg (B) lub 4 x 12,50 mg/kg (C).
Figury 45A-C przedstawiają analizę za pomocą cytometrii przepływowej komórek CD21+ we krwi obwodowej makaka jawajskiego po dożylnym podaniu 2F2 lub rituximabu przy różnym dawkowaniu, 4 x 1,25 mk/kg (A), 4 x 6,25 mg/kg (B) lub 4 x 12,50 mg/kg (C).
Figury 46A-C przedstawiają analizę za pomocą cytometrii przepływowej komórek CD20+ w węzłach chłonnych makaka jawajskiego po dożylnym podaniu 2F2 lub rituximabu przy różnym dawkowaniu, 4 x 1,25 mk/kg (A), 4 x 6,25 mg/kg (B) lub 4 x 12,50 mg/kg (C).
Figury 47A-C przedstawiają analizę za pomocą cytometrii przepływowej komórek wyrażających CD20lowCD23+CD40high w krwi obwodowej makaka jawajskiego po dożylnym podaniu 2F2 lub rituximabu przy różnym dawkowaniu, 4 x 1,25 mk/kg (A), 4 x 6,25 mg/kg (B) lub 4 x 12,50 mg/kg (C).
Figury 48A-E przedstawiają wiązanie rituximabu (A), 2F2 (B), 11B8 (C), B1 (D), lub przeciwciała kontrolnego dla izotypu (E) z komórkami CHO wyrażającymi CD20 typu dzikiego (WT, ang. wild type), zmutowanego CD20 (AxP) lub obu CD20 WT i zmutowanego CD20 (AxP), jak określono z zastosowaniem cytometrii przepływowej.
Figury 49A-F przedstawiają procent wiązania 2F2, 11B8T, B1 lub rituximabu ze zmutowanym P172S względem CD20 WT (A), procent wiązania 2F2T, 11B8T, B1, CAT (CAT 13.6E12, mysie monoklonalne przeciwciało IgG2A przeciwko CD20, Diatec.Com), przeciwciała kontrolnego dla izotypu (KLH) lub rituximabu ze zmutowanym CD20 (AxP) względem CD20 WT (B), procent wiązania 2F2, 11B8T, B1 lub rituximabu z mutantem N166D względem CD20 WT (C), procent wiązania 2F2T, CAT lub rituximabu z mutantem N166D względem CD20 WT (D), procent wiązania 2F2T, 2F2, 11B8T, B1 lub rituximabu z mutantem N163D względem CD20 WT (E) i procent wiązania 2F2T, CAT lub rituximabu z mutantem N163D względem CD20 WT (F).
Figura 50 przedstawia wiązanie 2F2T, 7D8 i przeciwciała kontrolnego dla izotypu jak określono testem ELISA z trzema przeciwciałami antyidiotypowymi anty-2F2 sab 1.1, anty-2F2 sab 1.2 i anty-2F2 sab 1.3 otrzymanymi przeciwko 2F2.
Figura 51 przedstawia wiązanie 11B8T jak określono testem ELISA z przeciwciałami antyidiotypowymi anty-11B8T sab 2.2, anty-118T sab 2.3, anty-118T sab 2.4, anty-11B8T sab 2.5 i anty-11B8T sab 2.6 otrzymanymi przeciwko 11B8T, ale niewiążące się z antyidiotypowymi przeciwciałami przeciwko 2F2.
Figury 52A-C przedstawiają zależne od dawki wiązanie 2F2T jak określono w teście ELISA z trzema przeciwciałami antyidiotypowymi anty-2F2 sab 1.1(A), anty-2F2 sab 1.2(B) i anty-2F2 sab 1.3(C) otrzymanymi przeciwko 2F2.
PL 218 660 B1
Figura 53 przedstawia sekwencję aminokwasową (SEK. NR ID.: 2) regionu V łańcucha ciężkiego i sekwencję aminokwasową (SEK. NR ID.: 4) regionu V łańcucha lekkiego (kappa) ludzkiego przeciwciała monoklonalnego 2F2 z zaznaczonymi regionami CDR.
Figura 54 przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK. NR ID.: 1) regionu V łańcucha ciężkiego i sekwencję nukleotydową (SEK. NR ID.: 3) regionu V łańcucha lekkiego (kappa) ludzkiego przeciwciała monoklonalnego 2F2.
Figura 55 przedstawia sekwencję aminokwasową (SEK. NR ID.: 6) regionu V łańcucha ciężkiego i sekwencję aminokwasową (SEK. NR ID.: 8) regionu V łańcucha lekkiego (kappa) ludzkiego przeciwciała monoklonalnego 7D8 z zaznaczonymi regionami CDR.
Figura 56 przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK. NR ID.: 5) regionu V łańcucha ciężkiego i sekwencję nukleotydową (SEK. NR ID.: 7) regionu V łańcucha lekkiego (kappa) ludzkiego przeciwciała monoklonalnego 7D8.
Figura 57 przedstawia sekwencję aminokwasową (SEK. NR ID.: 10) regionu V łańcucha ciężkiego i sekwencję aminokwasową (SEK. NR ID.: 12) regionu V łańcucha lekkiego (kappa) ludzkiego przeciwciała monoklonalnego 11B8 z zaznaczonymi regionami CDR.
Figura 58 przedstawia sekwencję nukleotydową (SEK. NR ID.: 9) regionu V łańcucha ciężkiego i sekwencję nukleotydową (SEK. NR ID.: 11) regionu V łańcucha lekkiego (kappa) ludzkiego przeciwciała monoklonalnego 11B8.
Szczegółowy opis wynalazku
Rozwiązania według wynalazku umożliwiają stosowanie udoskonalonych terapii opartych na przeciwciałach do leczenia i diagnozowania licznych zaburzeń związanych z komórkami wyrażającymi CD20. Terapie tu ujawnione wykorzystują izolowane ludzkie przeciwciała monoklonalne specyficznie wiążące się z epitopem obecnym na CD20. Izolowane ludzkie przeciwciała monoklonalne objęte niniejszym wynalazkiem obejmują przeciwciała IgA, IgG1-4, IgE, IgM i IgD.
W jednym wykonaniu przeciwciało jest przeciwciałem IgG1, bardziej szczegółowo izotypem IgG1,K lub IgG1,X. W innym wykonaniu, przeciwciało jest przeciwciałem IgG3, bardziej szczegółowo izotypem IgG3,K lub IgG3,X. W jeszcze innym wykonaniu przeciwciało jest przeciwciałem IgG4, bardziej szczegółowo izotypem IgG4,K lub IgG4,X. W jeszcze innym wykonaniu przeciwciało jest przeciwciałem IgA1 lub IgA2.
W jeszcze innym wykonaniu przeciwciało jest przeciwciałem IgM.
W jednym wykonaniu, ludzkie przeciwciała są wytwarzane przez transgeniczne zwierzę inne niż człowiek, np. transgeniczną mysz zdolną do wytwarzania licznych izotypów ludzkich przeciwciał monoklonalnych dla CD20 przez przechodzenie rekombinacji V-D-J i przełączanie izotypów. Zgodnie z powyższym, aspekty wynalazku obejmują nie tylko przeciwciała, fragmenty przeciwciał i ich kompozycje farmaceutyczne, ale także transgeniczne zwierzęta inne niż człowiek, transfekowane komórki gospodarza transfektoma i hybrydoma wytwarzające przeciwciała monoklonalne. Takim zwierzęciem transgenicznym może także być królik transgeniczny do wytwarzania przeciwciał poliklonalnych, taki jak ujawniono w US 2003/0017534. Zgodnie z powyższym, wynalazek także obejmuje ludzkie przeciwciała poliklonalne specyficznie wiążące się z CD20. Przeciwciała tu ujawnione mogą być przeciwciałami poliklonalnymi wiążącymi się z epitopem na CD20 (i) który nie obejmuje lub nie wymaga obecności aminokwasowej reszty prolinowej w pozycji 172; (ii) który nie obejmuje lub nie wymaga obecności aminokwasowej reszty alaninowej w pozycji 170 lub prolinowej w pozycji 172; (iii) który obejmuje lub wymaga obecności aminokwasowej reszty asparaginowej w pozycji 163 i asparaginowej w pozycji 166; (iv) który nie obejmuje lub nie wymaga obecności aminokwasowej reszty prolinowej w pozycji 172, ale który obejmuje lub wymaga obecności aminokwasowej reszty asparaginowej w pozycji 163 i asparaginowej w pozycji 166, lub (v) który nie obejmuje lub nie wymaga obecności aminokwasowej reszty alaninowej w pozycji 170 lub prolinowej w pozycji 172, ale obejmuje lub wymaga obecności aminokwasowej reszty asparaginowej w pozycji 163 i asparaginowej w pozycji 166.
Ludzkie przeciwciała monoklonalne mogą mieć jedną lub większą liczbę następujących charakterystyk: (i) wiążą się z mutantem CD20 P172S (prolina w pozycji 172 zmutowana do seryny) z co najmniej takim samym powinowactwem jak z ludzkim CD20; (ii) wiążą się z mutantem AxP (alanina w pozycji 170 zmutowana do seryny i prolina w pozycji 172 zmutowana do seryny) z co najmniej takim samym powinowactwem jak z ludzkim CD20; (iii) wykazują obniżone wiązanie o 50% lub więcej z mutantem N166D (asparagina w pozycji 166 zmutowana do kwasu asparaginowego) w porównaniu z ludzkim CD20 przy stężeniu przeciwciała wynoszącym 10 μg/ml i/lub (iv) wykazują obniżone wiąza10
PL 218 660 B1 nie o 50% lub więcej z mutantem N163D (asparagina w pozycji 163 zmutowana do kwasu asparaginowego) w porównaniu z ludzkim CD20 przy stężeniu przeciwciała 10 μg/ml.
Ludzkie przeciwciała monoklonalne mogą wiązać się z epitopem w małej pierwszej pętli zewnątrzkomórkowej ludzkiego CD20 lub z nieciągłym epitopem CD20. Ludzkie przeciwciała monoklonalne tu ujawnione wiążą się z nieciągłym epitopem na CD20, który ma część pierwszej małej pętli zewnątrzkomórkowej i część drugiej pętli zewnątrzkomórkowej. W jeszcze dalszym wykonaniu, wynalazek dotyczy ludzkich przeciwciał monoklonalnych wiążących się z nieciągłym epitopem na CD20 zawierającym reszty AGIYAP pierwszej małej pętli zewnątrzkomórkowej i reszty MESLNFIRHTPYI drugiej pętli zewnątrzkomórkowej.
Sposoby wykorzystywan ia przeciwciał według wynalazku do wykrywania komórki wyrażającej CD20 są objęte przez wynalazek. Sposoby stosowania przeciwciał według wynalazku do blokowania lub hamowania aktywności indukowanej przez CD20, np. aktywności proliferacyjnej i/lub różnicującej także są dostarczane i są użyteczne w leczeniu zaburzeń związanych z CD20, takich jak choroby nowotworowe (np. chłoniak z komórek B) i choroby autoimmunizacyjne (np. RA, choroba Crohna i ziarniak Wegenera).
Aby niniejszy wynalazek mógł być lepiej zrozumiany, niniejszym zdefiniowano pewne terminy. Dodatkowe definicje są podane w całym szczegółowym opisie.
Terminy „CD20 i „antygen CD20 stosuje się niniejszym wymiennie i obejmują każdy wariant, izoformy i homologi gatunkowe ludzkiego CD20 naturalnie wyrażanego przez komórki lub wyrażanego na komórkach transfekowanych genem CD20. Wiązanie przeciwciała według wynalazku z antygenem CD20 pośredniczy w uśmiercaniu komórek wyrażających CD20 (np. komórek nowotworowych) przez inaktywację CD20. Uśmiercanie komórek wyrażających CD20 może zachodzić przez jeden lub większą liczbę następujących mechanizmów:
cytotoksyczność zależna od dopełniacza (CDC) komórek wyrażających CD20; apoptoza komórek wyrażających CD20;
fagocytoza komórek efektorowych komórek wyrażających CD20; lub cytotoksyczność komórkowa komórek efektorowych zależna od przeciwciał (ADCC) komórek wyrażających CD20.
Synonimy CD20 rozpoznawane w dziedzinie obejmują antygen CD20 limfocytów B, powierzchniowy antygen limfocytów B B1, Leu-16, BM5 i LF5.
W znaczeniu tu stosowanym termin „hamuje wzrost (np. w odniesieniu do komórek) ma na celu objęcie każdego mierzalnego obniżenia wzrostu komórek kontaktowanych z przeciwciałem przeciwko CD20 w porównaniu ze wzrostem takich samych komórek niekontaktowanych z przeciwciałem przeciwko CD20, np. hamowanie wzrostu hodowli komórkowej o co najmniej 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% lub 100%. Taki spadek wzrostu komórek może zachodzić przez różnorodne mechanizmy np. fagocytozę komórek efektorowych, ADCC, CDC i/lub apoptozę.
Termin „tratwa („raft) odnosi się do mikrodomen błonowych bogatych w sfingolipidy i cholesterol ulokowanych w zewnętrznej warstwie plazmatycznej błony komórkowej. Zdolność pewnych białek do asocjowania w obręb takich domen może powodować działanie białka. Na przykład, translokacja cząsteczek CD20 do tratw lipidowych, po związaniu przez ludzkie przeciwciała według wynalazku tworzy w błonach komórkowych kompleksy przeciwciało-antygen CD20 o dużej gęstości. Takie kompleksy przeciwciało-antygen o dużej gęstości mogą umożliwiać efektywną aktywację systemu dopełniacza podczas CDC.
Termin „przeciwciało w stosowanym tu znaczeniu, obejmuje całe przeciwciała i dowolne fragmenty wiążące antygen (tj. „część wiążąca antygen) lub ich pojedynczy łańcuch. „Przeciwciało odnosi się do glikoproteiny obejmującej przynajmniej dwa łańcuchy ciężkie (H) i dwa lekkie (L) powiązane ze sobą wiązaniami dwusiarczkowymi, lub jej części wiążącej antygen. Każdy łańcuch ciężki składa się z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (VH) i regionu stałego łańcucha ciężkiego. Każdy łańcuch lekki składa się z regionu zmiennego łańcucha lekkiego (VL) i regionu stałego łańcucha lekkiego. Regiony VH i VL można następnie podzielić na regiony hiperzmienne, określane jako CDR (ang. complementarity determining region), poprzeplatane regionami bardziej konserwatywnymi, określanymi jako regiony zrębowe FR (ang. framework region). Każdy VH i VL jest skomponowany z trzech CDR i czterech FR, ułożonych w następującej kolejności od końca aminokwasowego do karboksylowego: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Regiony zmienne łańcuchów ciężkich i lekkich zawierają domeny wiążące oddziałujące z antygenem. Regiony stałe przeciwciał mają pośredniczyć w wiązaniu
PL 218 660 B1 immunoglobuliny z tkankami gospodarza lub czynnikami, włączając liczne komórki układu odpornościowego (np. komórki efektorowe) i pierwszy dopełniacz (C1q) klasycznego układu dopełniacza.
Stosowany niniejszym termin „część wiążąca antygen przeciwciała (lub prościej „część przeciwciała) odnosi się do jednego lub większej liczby fragmentów przeciwciała, które zachowują zdolność specyficznego wiązania się z antygenem (np. CD20). Wykazano, że fragmenty pełniej długości przeciwciała mogą wykazywać funkcję wiązania antygenu przez przeciwciało. Przykłady fragmentów wiążących objętych terminem „część wiążąca antygen przeciwciała obejmują (i) fragment Fab, monowalencyjny fragment składający się z domen VL, VH, CL i CH1; (ii) fragment F(ab')2 - biwalencyjny fragment składający się z dwóch fragmentów Fab połączonych mostkiem dwusiarczkowym w regionie zawiasowym; (iii) fragment Fd składający się z domen VH i CH1; (iv) fragment Fv składający się z domen VL i VH pojedynczego ramienia przeciwciała; (v) fragment dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546) składający się z domeny VH; (vi) izolowany CDR i (vii) kombinację dwóch lub większej liczby CDR, które optymalnie mogą być połączone syntetycznym linkerem. Następnie, chociaż dwie domeny fragmentu Fv, VH i VL są kodowane przez odrębne geny, można je połączyć stosując metody rekombinacyjne, za pomocą syntetycznego linkera umożliwiającego im występowanie w postaci pojedynczego łańcucha białkowego, w którym regiony VL i VH są sparowane tworząc cząsteczki monowalencyjne (znane jako pojedynczy łańcuch Fv (scFv); patrz np., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; i Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Takie przeciwciała jednołańcuchowe również są objęte terminem „część wiążąca antygen przeciwciała. Kolejnym przykładem jest fuzja białkowa domeny wiążącej immunoglobuliny obejmująca (i) polipeptyd domeny wiążącej w fuzji z polipeptydem zawierającym region zawiasowy immunoglobuliny, (ii) stały region CH2 łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w fuzji z regionem zawiasowym i (iii) stały region CH3 łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w fuzji ze stałym regionem CH2. Polipeptyd domeny wiążącej może być regionem zmiennym łańcucha ciężkiego lub regionem zmiennym łańcucha lekkiego. Fuzje białkowe domen wiążących immunoglobuliny są bliżej przedstawione w US 2003/0118592 i US 2003/0133939. Takie fragmenty przeciwciał otrzymuje się stosując konwencjonalne techniki znane specjalistom w dziedzinie, a fragmenty są przesiewane pod kątem użyteczności w ten sam sposób co niemodyfikowane przeciwciała.
Termin „epitop oznacza determinantę białkową zdolną do specyficznego wiązania z przeciwciałem. Epitopy zwykle składają się z chemicznie aktywnych powierzchniowych grup cząsteczek, takich jak aminokwasy lub łańcuchy boczne cukrów i zwykle mają specyficzną strukturę trójwymiarową, jak również specyficzną charakterystykę ładunków. Epitopy konformacyjne i niekonformacyjne rozróżnia to, że wiązanie z pierwszymi, ale nie z drugimi zanika w obecności rozpuszczalników denaturujących.
Termin „epitop nieciągły w stosowanym tu znaczeniu oznacza epitop konformacyjny na antygenie białkowym tworzony z co najmniej dwóch oddzielnych regionów w pierwszorzędowej sekwencji białka.
Termin „cząsteczka bispecyficzna ma na celu obejmować każdy czynnik, np. białko, peptyd lub kompleks białkowy lub peptydowy, który ma dwie różne specyficzności wiążące. Na przykład, cząsteczka może wiązać się lub oddziaływać z (a) antygenem powierzchni komórki i (b) receptorem Fc na powierzchni komórki efektorowej. Termin „cząsteczka multispecyficzna lub „cząsteczka heterospecyficzna ma na celu uwzględnienie każdego czynnika np. białka, peptydu lub kompleksu białkowego lub peptydowego, który ma więcej niż dwie różne specyficzności wiążące. Na przykład, cząsteczka może wiązać się lub oddziaływać z (a) antygenem powierzchniowym komórki, (b) receptorem Fc na powierzchni komórki efektorowej i (c) przynajmniej jednym innym składnikiem. Zgodnie z powyższym, niniejszym dostarczono cząsteczki bispecyficzne według wynalazku, oraz ujawniono trójspecyficzne, tetraspecyficzne i inne multispecyficzne cząsteczki, które są skierowane na antygeny powierzchniowe komórki, takie jak CD20 i inne cele, takie jak receptory Fc na komórkach efektorowych.
Termin „przeciwciała bispecyficzne obejmuje także diciała (ang. diabody). Diciała są dwuwartościowymi, bispecyficznymi przeciwciałami, w których domeny VH i VL są wyrażane na jednym łańcuchu polipeptydowym, ale z zastosowaniem linkera, który jest zbyt krótki by pozwalał na tworzenie par między dwoma domenami tego samego łańcucha, zmuszając w ten sposób domeny do tworzenia par z domenami komplementarnymi innego łańcucha i tworzenie dwóch miejsc wiązania antygenu (patrz np., Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123).
PL 218 660 B1
Termin „ludzkie pochodne przeciwciała odnosi się do każdej modyfikowanej formy przeciwciała, np. koniugatu przeciwciała i innego czynnika lub przeciwciała.
W stosowanym tu znaczeniu ludzkie przeciwciało „pochodzi od szczególnej sekwencji linii zarodkowej, jeśli przeciwciało otrzymuje się z układu wykorzystującego ludzkie sekwencję immunoglobulinowe, np. przez immunizację transgenicznej myszy niosącej geny ludzkiej immunoglobuliny lub przez przesiewanie ludzkiego banku genów immunoglobulin, przy czym wybrane przeciwciało jest co najmniej w 90%, a bardziej korzystnie w co najmniej 95% i jeszcze bardziej korzystnie w co najmniej 96%, 97%, 98% lub 99% identyczne pod względem sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową kodowaną przez gen immunoglobuliny linii zarodkowej. Zazwyczaj, ludzkie przeciwciało pochodzące ze szczególnej sekwencji linii zarodkowej będzie wykazywać nie więcej niż 10 różnic aminokwasowych, bardziej korzystnie nie więcej niż 5, a nawet bardziej korzystnie nie więcej niż 4, 3, 2 lub 1 różnicę aminokwasową względem sekwencji aminokwasowej kodowanej przez gen immunoglobuliny linii zarodkowej.
W stosowanym tu znaczeniu, termin „heteroprzeciwciała odnosi się do dwóch lub większej liczby przeciwciał, ich pochodnych lub regionów wiążących przeciwciało połączonych ze sobą, z których przynajmniej dwa mają różne specyficzności. Te różne specyficzności obejmują specyficzność wiążącą dla receptora Fc lub komórki efektorowej i specyficzność wiązana antygenu lub epitopu na komórce docelowej, np. komórce nowotworu.
Termin „ludzkie przeciwciało, jak się niniejszym stosuje, ma na celu obejmować przeciwciała zawierające regiony stałe i zmienne pochodzące od sekwencji immunoglobulin ludzkiej linii zarodkowej. Ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą obejmować reszty aminokwasowe niekodowane przez sekwencję immunoglobuliny ludzkiej linii zarodkowej (np. mutacje wprowadzone przez mutagenezę losową lub specyficzną względem miejsca in vitro lub przez somatyczne mutacje in vivo). Jednakże termin „ludzkie przeciwciało, jak się niniejszym stosuje, nie ma na celu uwzględnienia przeciwciał, których sekwencje CDR pochodzące z linii zarodkowej innego gatunku ssaka, takiego jak mysz, zostały wprowadzone do ludzkich sekwencji zrębowych.
Terminy „przeciwciało monoklonalne lub „kompozycja przeciwciała monoklonalnego stosuje się niniejszym w odniesieniu do preparatu cząsteczek przeciwciał o pojedynczym składzie cząsteczkowym. Kompozycja przeciwciała monoklonalnego wykazuje pojedynczą specyficzność wiążącą i powinowactwo do szczególnego epitopu. Zgodnie z powyższym, termin „ludzkie przeciwciało monoklonalne odnosi się do przeciwciał wyrażających pojedynczą specyficzność wiążącą i ich regiony zmienne i stałe pochodzą z sekwencji immunoglobuliny ludzkiej linii zarodkowej. W jednym wykonaniu, ludzkie przeciwciała monoklonalne są wytwarzane przez hybrydoma zawierające komórki B otrzymane z transgenicznych lub transchromosomalnych zwierząt niebędących człowiekiem, np. myszy transgenicznej, mającej genom obejmujący transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego i transgen ludzkiego łańcucha lekkiego w fuzji w komórce nieśmiertelnej.
Termin „ludzkie przeciwciało rekombinowane, jak się niniejszym stosuje, obejmuje wszystkie ludzkie przeciwciała które są wytwarzane, wyrażane, tworzone lub izolowane środkami rekombinacyjnymi, takie jak (a) przeciwciała izolowane ze zwierząt (np. myszy) transgenicznych lub transchromosomalnych pod względem ludzkich genów immunoglobulin lub przygotowanych z nich hybrydoma (opisane dalej w Sekcji I poniżej), (b) przeciwciała izolowane z komórek gospodarza transformowanych tak, aby wyrażały przeciwciała, np. z transfektoma, (c) przeciwciała izolowane z rekombinacyjnej, kombinatoryjnej ludzkiej biblioteki przeciwciał i (d) przeciwciała wytwarzane, wyrażane, tworzone lub izolowane jakimkolwiek innym sposobem, który obejmuje składanie ludzkich sekwencji genów immunoglobulin do innych sekwencji DNA. Takie rekombinowane ludzkie przeciwciała mają regiony zmienne i stałe pochodzące od ludzkich sekwencji źródłowych. W pewnych wykonaniach, jednakże, takie rekombinowane ludzkie przeciwciała mogą być poddane mutagenezie in vitro (lub gdy stosuje się zwierzę transgeniczne względem ludzkich sekwencji Ig, mutagenezie somatycznej in vivo) a więc sekwencje aminokwasowe regionów VH i VL przeciwciał rekombinowanych, są sekwencjami, które, gdy pochodzą z i są pokrewne ludzkim źródłowym sekwencjom VH i VL mogą naturalnie nie występować w źródłowym repertuarze ludzkich przeciwciał in vivo.
Termin „transfektoma jak się niniejszym stosuje, obejmuje rekombinowane eukariotyczne komórki gospodarza wyrażające przeciwciała, takie jak komórki CHO, NS/0, HEK293, komórki roślinne lub grzybów włączając komórki drożdży.
W stosowanym niniejszym znaczeniu, „przeciwciało heterologiczne definiuje się w odniesieniu do transgenicznego organizmu, który nie jest człowiekiem, wytwarzającym takie przeciwciało. Termin ten
PL 218 660 B1 odnosi się do przeciwciała mającego sekwencję aminokwasową lub kodującej sekwencji kwasu nukleinowego odpowiadającym tym znajdującym się w organizmie zwierzęcia transgenicznego nie będącego człowiekiem, oraz zasadniczo z gatunku innego niż transgeniczne zwierzę inne niż człowiek.
W stosowanym niniejszym znaczeniu „przeciwciało heterohybrydowe odnosi się do przeciwciała mającego łańcuchy lekki i ciężki pochodzące z różnych organizmów. Na przykład, przeciwciało mające ludzki łańcuch ciężki połączony z mysim łańcuchem lekkim jest przeciwciałem heterohybrydowym. Przykłady przeciwciał heterohybrydowych obejmują przeciwciała chimerowe i humanizowane omówione powyżej.
Określenie „przeciwciała izolowane w stosowanym tu znaczeniu w zamierzeniu odnosi się do przeciwciał, które są zasadniczo wolne od innych przeciwciał mających inne specyficzności antygenowe (np. przeciwciało izolowane, wiążące się specyficznie z CD20 jest zasadniczo wolne od przeciwciał specyficznie wiążących antygeny inne niż CD20). Przeciwciało izolowane, które swoiście wiąże się z epitopem, izoformą lub wariantem ludzkiego CD20 może jednakże wykazywać reaktywność krzyżową względem innych pokrewnych antygenów, np. z innych gatunków (np. z gatunkowymi homologami CD20). Co więcej, przeciwciało izolowane może być zasadniczo wolne od innego materiału komórkowego i/lub związków chemicznych. W jednym wykonaniu według wynalazku, kombinacje „izolowanych przeciwciał monoklonalnych mających różne specyficzności są łączone w dobrze zdefiniowaną kompozycję.
W znaczeniu tu stosowanym, „wiązanie specyficzne odnosi się do wiązania przeciwciała z góry określonym antygenem. Typowo, przeciwciało wiąże się z powinowactwem odpowiadającym KD około 1x10-7 lub mniej i wiąże się z góry określonym antygenem z powinowactwem odpowiadającym KD co najmniej o dwa rzędy wielkości niższym niż jego powinowactwo dla wiązania się z antygenem niespecyficznym (np. BSA, kazeina) lub innym z góry określonym antygenem lub blisko spokrewnionym antygenem. Frazy „przeciwciało rozpoznające antygen i „przeciwciało specyficzne dla antygenu stosuje się niniejszym wymiennie z terminem „przeciwciało specyficznie wiążące się z antygenem.
W znaczeniu tu stosowanym termin „kd (sek-1) w zamierzeniu odnosi się do stałej szybkości dysocjacji szczególnego oddziaływania przeciwciało-antygen. Powyższą wartość określa się również jako wartość koff.
-1 -1
W znaczeniu tu stosowanym termin „ka (M-1 x sek-1) odnosi się w zamierzeniu do stałej szybkości asocjacji szczególnego oddziaływania przeciwciało-antygen.
W znaczeniu tu stosowanym termin „KD (M) odnosi się w zamierzeniu do stałej równowagi dysocjacji szczególnego oddziaływania przeciwciało-antygen.
Termin „KA (M-1), jak się niniejszym stosuje, ma na celu odnosić się do stałej równowagi asocjacji szczególnego oddziaływania przeciwciało-antygen i otrzymuje się go przez dzielenie ka przez kd.
W znaczeniu tu stosowanym, „izotyp odnosi się do klasy przeciwciał (np. IgM lub IgG1) kodowanej przez geny regionu stałego łańcucha ciężkiego.
W znaczeniu tu stosowanym, „przełączanie izotypów odnosi się do zjawiska, przez które klasa lub izotyp przeciwciała zmienia się z jednej klasy Ig w inną klasę Ig.
W znaczeniu tu stosowanym, „nieprzełączony izotyp odnosi się do klasy izotypowej łańcucha ciężkiego, która jest wytwarzana, gdy nie zaszła zamiana izotypów; gen CH kodujący nieprzełączony izotyp jest typowo pierwszym genem CH zaraz po funkcjonalnie przearanżowanym genie VDJ. Przełączanie izotypów klasyfikuje się jako klasyczną lub nieklasyczną zamianę izotypów. Klasyczne przełączanie izotypów zachodzi przez zdarzenia rekombinacyjne angażujące co najmniej jeden region sekwencji ulegający zamianie w transgenie. Nieklasyczne przełączanie izotypów może zachodzić przez na przykład, rekombinację homologiczną między ludzkim δμ i ludzkim Σμ (delecja związana z δ). Alternatywny mechanizm przełączania nieklasycznego, taki jak intertransgenowa i/lub interchromosomowa rekombinacja, między innymi, może zajść i spowodować przełączenie izotypu.
W znaczeniu tu stosowanym, termin „sekwencja przełączenia odnosi się do tych sekwencji DNA odpowiedzialnych za zamianę rekombinacyjną. Sekwencja „dawcy przełączenia, typowo region zamiany μ, będzie w kierunku 5' (tj. przed) regionem konstruktu wycinanego w czasie rekombinacyjnej zamiany. Region „akceptora przełączenia będzie pomiędzy wycinanym regionem konstruktu, a zastępującym regionem stałym (np. γ, ε itp.). Jako, że nie ma specyficznego miejsca, gdzie zawsze zachodzi rekombinacja, końcowa sekwencja genu typowo nie będzie przewidywalna na podstawie konstruktu.
Jak się niniejszym stosuje, „wzór glikozylacji definiuje się jako wzór jednostek węglowodanowych kowalencyjne związanych z białkiem, bardziej specyficznie z białkiem immunoglobuliny (prze14
PL 218 660 B1 ciwciałem). Wzór glikozylacji przeciwciała heterologicznego można scharakteryzować jako zasadniczo podobny do wzorów glikozylacji naturalnie występujących na przeciwciałach wytwarzanych przez gatunki zwierząt transgenicznych, które nie są człowiekiem, przy czym specjalista w dziedzinie rozpozna wzór glikozylacji przeciwciała heterologicznego jako będący bardziej podobnym do wspomnianego wzoru glikozylacji w gatunku zwierzęcia transgenicznego innego niż człowiek, niż do gatunku z którego pochodzą geny CH transgenu.
Termin „występujący naturalnie w znaczeniu tu stosowanym względem obiektu, odnosi się do faktu, że obiekt można znaleźć w naturze. Na przykład, jako występujący naturalnie należy uznać polipeptyd lub sekwencję polinukleotydową obecną w organizmie (włączając wirusy), które można wyizolować z naturalnego źródła i które nie były celowo modyfikowane przez człowieka w laboratorium.
Termin „rearanżowane w znaczeniu tu stosowanym, odnosi się do konfiguracji locus łańcucha ciężkiego lub lekkiego immunoglobuliny, przy czym segment V pozycjonuje się tuż za segmentem D-J lub J w konformacji kodującej zasadniczo kompletne domeny VH lub VL, odpowiednio. Rearanżowane locus genu immunoglobuliny (przeciwciała) można identyfikować przez porównanie z DNA linii zarodkowej; locus rearanżowane będzie miało co najmniej jeden rekombinowany element homologii heptamer/nonamer.
Termin „nierearanżowane lub „konfiguracja zarodkowa w znaczeniu tu stosowanym w odniesieniu do segmentu V dotyczy konfiguracji, w której segment V nie jest rekombinowany, tak aby znajdować się tuż za segmentem D lub J.
Termin „cząsteczka kwasu nukleinowego w znaczeniu tu stosowanym, ma na celu obejmować cząsteczki DNA i RNA. Cząsteczka kwasu nukleinowego może być jednoniciowa lub dwuniciowa, ale korzystnie stanowi dwuniciowy DNA.
Termin „izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego w znaczeniu tu stosowanym w odniesieniu do kwasów nukleinowych kodujących całe przeciwciała lub części przeciwciał (np. VH, VL, CDR3) wiążące się z CD20 ma na celu objęcie cząsteczki kwasu nukleinowego, w której sekwencja nukleotydowa kodująca nietknięte przeciwciało lub część przeciwciała jest wolna od innych sekwencji nukleotydowych kodujących całe przeciwciała lub części przeciwciał wiążących antygeny inne niż CD20, które to inne sekwencje mogą naturalnie otaczać kwas nukleinowy. W jednym wykonaniu, ludzkie przeciwciała przeciwko CD20 obejmują sekwencje nukleotydowe lub aminokwasowe 11B8, jak też regiony zmienne łańcucha ciężkiego (VH) i łańcucha lekkiego (VL) o sekwencjach przedstawionych w SEK. NR ID.: 9 i SEK. NR ID.: 11 odpowiednio.
Jak niniejszym ujawniono, sekwencje przedstawione w SEK. NR ID.: 1-30 mogą obejmować „konserwatywne modyfikacje sekwencji, tj. modyfikacje sekwencji nukleotydowych lub aminokwasowych które nie wpływają i nie zmieniają znacząco charakterystyki wiązania przeciwciała kodowanego przez sekwencję nukleotydową lub zawierających sekwencję aminokwasową. Takie konserwatywne modyfikacje sekwencji obejmują substytucje nukleotydowe i aminokwasowe, insercje i delecje. Modyfikacje można wprowadzać do SEK. NR ID.: 1-30 stosując standardowe techniki znane w dziedzinie, takie jak ukierunkowana mutageneza i mutageneza za pomocą PCR. Konserwatywne podstawienia aminokwasowe obejmują takie, w których reszty aminokwasowe zastępuje się resztami aminokwasowymi o podobnych łańcuchach bocznych. W dziedzinie zdefiniowano rodziny aminokwasów mających podobne łańcuchy boczne. Te rodziny obejmują aminokwasy o zasadowych łańcuchach bocznych (np. lizyna, arginina, histydyna), kwasowych łańcuchach bocznych (np. kwas asparaginowy, kwas glutaminowy), nienaładowanych polarnych łańcuchach bocznych (np. glicyna, asparagina, glutamina, seryna, treonina, tyrozyna, cysteina, tryptofan), niepolarnych łańcuchach bocznych (np. alanina, walina leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina), beta-rozgałęzionych łańcuchach bocznych (np. treonina, walina izoleucyna) i aromatycznych łańcuchach bocznych (np. tyrozyna, fenyloalanina, tryptofan, histydyna). Tak więc przewidywana nieistotna reszta aminokwasowa w ludzkim przeciwciele przeciwko CD20 korzystnie zastępowana jest inną resztą aminokwasową z tej samej rodziny łańcuchów bocznych.
Następnie, niniejszym ujawniono przeciwciała, w których dokonano zmian w regionie Fc w celu zmiany funkcjonalnych lub farmakokinetycznych właściwości przeciwciał. Takie zmiany mogą powodować spadek lub wzrost siły wiązania C1q i CDC lub wiązania FcyR i ADCC. Substytucje mogą zostać, na przykład, przeprowadzone w jednej lub większej liczbie reszt aminokwasowych w pozycjach 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 i 322 regionu stałego łańcucha ciężkiego, aby spowodować zmianę
PL 218 660 B1 w funkcji efektorowej podczas gdy zachowana jest zdolność wiązania antygenu w porównaniu z przeciwciałem niemodyfikowanym, patrz US 5,624,821 i US 5,648,260.
Czas półtrwania przeciwciał in vivo można także poprawić przez modyfikację epitopu receptora odzyskiwania (ang. slavage receptor) stałej domeny Ig lub stałej domeny podobnej do Ig, w taki sposób, że cząsteczka nie zawiera nietkniętej domeny CH2 lub nietkniętego regionu Ig Fc, patrz US 6,121,022 i US 6,194,551. Czas półtrwania in vivo można dalej zwiększyć przez wprowadzenie mutacji w regionie Fc, np. przez podstawienie treoniny za leucynę w pozycji 252, przez podstawienie treoniny za serynę w pozycji 254 lub przez podstawienie treoniny za fenyloalaninę w pozycji 256, patrz US 6,277,375.
Ponadto, w celu zmiany funkcji efektorowej przeciwciał można modyfikować wzór glikozylacji przeciwciał. Na przykład, przeciwciała można wyrażać w transfektoma, które nie dodają jednostki fukozy normalnie połączonej z Asn w pozycji 297 regionu Fc w celu wzmocnienia powinowactwa regionu Fc wobec Fcylll, co z kolei spowoduje wzrost ADCC przeciwciał w obecności komórek NK, patrz Shield et al. (2002) JBC, 277:26733. Następnie, modyfikację glikozylacji można przeprowadzić w celu modyfikacji CDC.
Alternatywnie w innym wykonaniu, mutacje można wprowadzić losowo w całej lub w części sekwencji kodującej przeciwciało przeciwko CD20, jak na przykład, poprzez mutagenezę saturacyjną, Powstałe zmodyfikowane przeciwciała przeciwko CD20 można przeszukać pod kątem aktywności wiążącej.
Zatem, przeciwciała kodowane przez (region zmienny łańcucha lekkiego i ciężkiego) sekwencje nukleotydowe tutaj przedstawione i/lub zawierające (region zmienny łańcucha lekkiego i ciężkiego) sekwencje aminokwasowe tutaj przedstawione (tj. SEK. NR ID.: 1-30) obejmują zasadniczo podobne przeciwciała kodowane lub zawierające podobne sekwencje zmodyfikowane konserwatywnie. Dalsze omówienie w jaki sposób zasadniczo podobne przeciwciała można tworzyć w oparciu o częściowe sekwencje (tj. sekwencje regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i lekkiego) przedstawione w SEK. NR ID.: 1-30 poniżej.
Dla kwasów nukleinowych, termin „zasadnicza homologia wskazuje, że dwa kwasy nukleinowe, lub ich wskazane sekwencje, gdy są optymalnie dopasowane i porównane są identyczne w około 80% nukleotydów, zwykle co najmniej około 90% do 95% i bardziej korzystnie co najmniej 98% do 99,5% nukleotydów, z właściwymi insercjami lub delecjami nukleotydowymi. Alternatywnie, zasadnicza homologia istnieje gdy segmenty hybrydyzują w wybiórczych warunkach hybrydyzacji z nicią komplementarną.
Dla sekwencji nukleotydowych i aminokwasowych, termin „homologia wskazuje stopień identyczności między dwiema sekwencjami kwasu nukleinowego lub aminokwasowymi, gdy są optymalnie dopasowane i porównane z odpowiednimi delecjami i insercjami. Alternatywnie, zasadnicza homologia istnieje gdy segmenty hybrydyzują w selektywnych warunkach hybrydyzacji z nicią komplementarną.
Procent identyczności między dwiema sekwencjami jest funkcją liczby identycznych pozycji wspólnych dla sekwencji (tj.% homologii = liczba identycznych pozycji/całkowita liczba pozycji x 100), uwzględniając liczbę przerw i długość każdej przerwy, którą trzeba wprowadzić dla optymalnego dopasowania dwóch sekwencji. Porównanie sekwencji i ustalenie procentu identyczności między dwoma sekwencjami można przeprowadzić stosując algorytmy matematyczne, jak opisano w nieograniczających przykładach poniżej.
Procent identyczności między dwiema sekwencjami nukleotydowymi można ustalić stosując program GAP w pakiecie oprogramowania GCG (dostępny na http://www.gcg.com), stosując macierz NWSgapdna.CMP i wagę przerwy 40, 50, 60, 70 lub 80 i długość wagi 1,2, 3, 4, 5 lub 6. Procent identyczności między dwiema sekwencjami nukleotydowymi lub aminokwasowymi można także ustalić stosując algorytm E. Meyersa i W. Millera (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)), który włączono do programu ALIGN (wersja 2.0), stosując tabelę wag aminokwasów PAM120, karę za długość przerwy 12 i karę za przerwę 4. Dodatkowo, procent identyczności między dwiema sekwencjami aminokwasowymi można ustalić stosując algorytm Needlemana i Wunscha (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)), który włączono do programu GAP w pakiecie oprogramowania GCG (dostępny na http://www.gcg.com), stosując albo macierz Blossum 62 albo PAM250 i wagę przerwy 16, 14, 12, 10, 8, 6, lub 4 i długość przerwy 1, 2, 3, 4, 5, lub 6.
Sekwencję kwasów nukleinowych i białek według wynalazku można następnie wykorzystywać jako „sekwencję poszukiwawczą (ang. query sequence) do prowadzenia poszukiwania w publicznych
PL 218 660 B1 bazach danych by, na przykład, zidentyfikować sekwencje pokrewne. Takie przeszukiwanie można przeprowadzić stosując programy NBLAST i XBLAST (wersja 2.0) Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Przeszukiwanie nukleotydowe można przeprowadzić za pomocą programu NBLAST, wartość = 100, długość słowa = 12 by otrzymać homologiczne sekwencje nukleotydowe do cząsteczek kwasów nukleotydowych tu ujawnionych. Białka można przeszukiwać stosując program XBLAST wartość = 50, długość słowa = 3 by otrzymać sekwencje aminokwasowe homologiczne do cząsteczek białek według wynalazku. By otrzymać dopasowanie z przerwami do celów porównywania można wykorzystać Gapped BLAST jak opisano w Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Przy wykorzystywaniu programów BLAST i Gapped BLAST, można stosować parametry domyślne odpowiednich programów (np. XBLAST i NBLAST). Patrz http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Kwasy nukleinowe mogą być obecne w całych komórkach, w lizacie komórkowym lub w częściwo oczyszczonej lub zasadniczo czystej formie. Kwas nukleinowy jest „izolowany lub „uzyskany zasadniczo czysty, gdy jest oczyszczony z innych składników komórkowych lub innych zanieczyszczeń, np. innych komórkowych kwasów nukleinowych lub białek, za pomocą standardowych technik włączając działanie czynnikiem alkalicznym/SDS, wirowanie w CsCl, chromatografię kolumnową, elektroforezę w żelu agarozowym i inne dobrze znane w dziedzinie. Patrz F. Ausubel, et al., red., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987).
Kompozycje kwasów nukleinowych, podczas gdy często mają sekwencję natywną (za wyjątkiem modyfikacji miejsc restrykcyjnych i podobnych), z cDNA, genomowego lub ich mieszaniny, można poddawać mutacjom zgodnie ze standardowymi technikami, aby uzyskać sekwencje genów. Dla sekwencji kodujących mutacje te mogą wpływać na sekwencje aminokwasowe w pożądany sposób. Szczególnie, sekwencje DNA zasadniczo homologiczne do lub pochodzące od natywnych V, D, J, stałych, przełączonych i innych takich sekwencji opisanych niniejszym są rozważane (przy czym „pochodzący wskazuje, że sekwencja jest identyczna lub modyfikowana z innej sekwencji).
Kwas nukleinowy jest „funkcjonalnie połączony, gdy jest umieszczony w funkcjonalnym związku z inną sekwencją kwasu nukleinowego. Na przykład, promotor lub wzmacniacz jest funkcjonalnie połączony z sekwencją kodującą jeśli wpływa na transkrypcję sekwencji. W odniesieniu do transkrypcji sekwencji regulatorowych, funkcjonalnie połączony oznacza, że sekwencje DNA połączone są przylegająco, a gdy konieczne jest połączenie dwóch regionów kodujących białka, połączone są przylegaj ąco i w ramce odczytu. Dla sekwencji przełączanych, połączony funkcjonalnie oznacza, że sekwencje te są zdolne do powodowania zamiany rekombinacyjnej.
Termin „wektor w stosowanym tu znaczeniu, ma w zamierzeniu odnosić się do cząsteczki kwasu nukleinowego zdolnej do transportowania innego kwasu nukleinowego z którym został połączony. Jednym typem wektora jest „plazmid, który odnosi się do kolistej, dwuniciowej pętli DNA, w którą można wligować dodatkowe segmenty DNA. Innym typem wektora jest wektor wirusowy, gdzie dodatkowe segmenty DNA można wligować do genomu wirusa. Pewne wektory mają zdolność autonomicznej replikacji w komórkach gospodarza, do których zostały wprowadzone (np. wektory bakteryjne mające bakteryjne miejsce początku replikacji i episomalne wektory ssacze). Inne wektory (np. nieepisomalne wektory ssacze) można integrować do genomu komórki gospodarza po wprowadzeniu do komórki gospodarza i wtedy ulegają replikacji wraz z genomem gospodarza. Co więcej, pewne wektory mają zdolność kierowania ekspresją genów, z którymi są funkcjonalnie połączone. Takie wektory są niniejszym określane jako „rekombinacyjne wektory ekspresyjne (lub prościej, „wektory ekspresyjne). Ogólnie, wektory ekspresyjne użyteczne w technikach rekombinowania DNA są często w formie plazmidów. W niniejszym opisie „plazmid i „wektor mogą być używane zamiennie jako, że plazmid jest najczęściej stosowaną formą wektora. Jednakże, wynalazek ma na celu włączenie innych form wektorów ekspresyjnych, takich jak wektory wirusowe (np. retrowirusy o uszkodzonej replikacji, adenowirusy i wirusy towarzyszące adenowirusom), które pełnią odpowiednie funkcje.
Termin „rekombinowana komórka gospodarza (lub prościej „komórka gospodarza) w znaczeniu tu stosowanym ma w zamierzeniu ujęcie komórki do której wprowadzono rekombinowany wektor ekspresyjny. Zrozumiane być powinno, że te terminy mają na celu nie tylko szczególną komórkę, ale też jej potomstwo. Ponieważ pewne modyfikacje mogą nastąpić w następnych generacjach w wyniku albo mutacji albo wpływu środowiska, takie potomstwo może, w rzeczywistości, nie być identyczne z komórką rodzicielską, ale wciąż wchodzić w zakres terminu „komórka gospodarza w stosowanym tu znaczeniu. Rekombinowane komórki gospodarza obejmują na przykład, transfektoma, takie jak komórki CHO, NS/0 i komórki limfocytarne.
PL 218 660 B1
W znaczeniu tu stosowanym „osobnik obejmuje każde zwierzę będące człowiekiem lub inne niż człowiek. Termin „zwierzę inne niż człowiek obejmuje wszystkie kręgowce, np. ssaki i nie będące ssakami, takie jak naczelne, które nie są ludźmi, owca, pies, krowa, kura, płazy, gady itd.
Termin „transgeniczne zwierzę inne niż człowiek odnosi się do zwierzęcia innego niż człowiek posiadającego genom zawierający jeden lub większą liczbę transgenów ludzkiego łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego lub transchromosomy (albo zintegrowane albo niezintegrowane z naturalnym genomowym DNA zwierzęcia) i które są zdolne do pełnej ekspresji ludzkich przeciwciał. Na przykład, transgeniczna mysz może mieć transgen ludzkiego łańcucha lekkiego oraz albo transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego albo transchromosom ludzkiego łańcucha ciężkiego, tak że mysz wytwarza ludzkie przeciwciała przeciwko CD20, gdy zostanie immunizowana antygenem CD20 i/lub komórkami wyrażającymi CD20. Transgen ludzkiego łańcucha lekkiego może być wintegrowany w chromosomowy DNA myszy, jak w przypadku transgenicznych myszy, np. HuMAB, takich jak myszy HCo7 lub HCo12, lub transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego może być utrzymywany ekstrachromosomalnie, jak w przypadku myszy transchromosomowych (np. KM) jak opisano w WO 02/43478. Takie myszy transgeniczne i transchromosomowe są zdolne do wytwarzania licznych izotypów ludzkich przeciwciał monoklonalnych dla CD20 (np. IgG, IgA i/lub IgE) przez przechodzenie rekombinacji V-D-J i przełączanie izotypów.
Różnorodne aspekty wynalazku opisano poniżej szczegółowo.
I. Wytwarzanie ludzkich przeciwciał na CD20
Ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku można wytwarzać z zastosowaniem licznych technik, włączając konwencjonalną metodologię przeciwciał monoklonalnych, np. standardową technikę hybrydyzacji komórek somatycznych Kohlera i Milsteina, Nature 256: 495 (1975). Chociaż korzystne są procedury hybrydyzacji komórek somatycznych, w zasadzie można stosować inne techniki wytwarzania przeciwciała monoklonalnego, np. transformację wirusową lub nowotworową limfocytów B lub techniki prezentacji na fagu stosując biblioteki ludzkich genów przeciwciał.
Korzystny system zwierzęcy do przygotowywania hybrydoma wydzielających ludzkie przeciwciała monoklonalne jest systemem mysim. Wytwarzanie hybrydoma w myszy jest bardzo dobrze znaną procedurą. Protokoły immunizacji i techniki izolacji immunizowanych splenocytów do fuzji są znane w dziedzinie. Znani są także partnerzy fuzji (np. mysie komórki szpiczaka) i procedury prowadzenia fuzji.
W korzystnym wykonaniu, ludzkie przeciwciała monoklonalne skierowane wobec CD20 można wytworzyć stosując transgeniczne lub transchromosomowe myszy niosące części ludzkiego układu odpornościowego zamiast systemu mysiego. Te transgeniczne i transchromosomowe myszy obejmują myszy określane jako myszy HuMAb i KM, odpowiednio, lub razem jako „myszy transgeniczne.
Mysz HuMAb zawiera ludzkie miniloci genów immunoglobulin kodujące nieprzearanżowane sekwencje immunoglobulin ludzkiego łańcucha ciężkiego (μ i γ) i łańcucha lekkiego κ, wraz z ukierunkowanymi mutacjami inaktywującymi endogenne loci łańcuchów μ i κ (Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859). Zgodnie z powyższym, mysz przejawia zredukowaną ekspresję mysich IgM i κ i w odpowiedzi na immunizację, wprowadzone ludzkie transgeny łańcucha ciężkiego i lekkiego przechodzą przełączanie klas i mutacje somatyczne z wytworzeniem monoklonalnych przeciwciał IgG o silnym powinowactwie (Lonberg, N. et al. (1994), wyżej; omówione w Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. i Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93, oraz Harding, F. i Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764: 536-546). Przygotowanie myszy HuMAb szczegółowo opisano w Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; Lonberg, N. i Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93; Harding, F. i Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. Patrz również US 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; i 5,770,429; wszystkie na rzecz Lonberg i Kay, jak też US 5,545,807 na rzecz Surani et al.; WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 i WO 01/09187.
Mysz KM zawiera transchromosom ludzkiego łańcucha ciężkiego i transgen ludzkiego łańcucha lekkiego kappa. Endogenne mysie geny łańcuchów lekkiego i ciężkiego także podległy przerwaniu w myszach KM tak, że immunizacja myszy prowadzi do wytwarzania raczej ludzkich niż mysich im18
PL 218 660 B1 munoglobulin. Konstrukcję myszy KM i ich zastosowanie do wytwarzania ludzkich immunoglobulin opisano szczegółowo w WO 02/43478.
Immunizacje
Aby otrzymać w pełni ludzkie monoklonalne przeciwciała wobec CD20, myszy transgeniczne lub transchromosomowe zawierające ludzkie geny immunoglobulin (np. myszy HCo12, HCo7 lub KM) można immunizować wzbogaconym preparatem antygenu CD20 i/lub komórek wyrażających CD20 jak opisano, na przykład, w Lonberg et al. (1994), powyżej; Fishwild et al. (1996), powyżej, i WO 98/24884. Alternatywnie mysz można immunizować DNA kodującym ludzkie CD20. Korzystnie mysz będzie w wieku 6-16 tygodni podczas pierwszej infuzji. Na przykład, wzbogacony preparat (5-50 gg) antygenu CD20 można zastosować do immunizacji myszy HuMAb śródotrzewnowo. W przypadku gdy użycie do immunizacji oczyszczonego lub wzbogaconego preparatu antygenu CD20 nie doprowadzi do przeciwciał, myszy także można immunizować komórkami wyrażającymi CD20, np. linią komórkową, by zapoczątkować odpowiedź immunologiczną.
Skumulowane doświadczenie z różnymi antygenami wykazało, że myszy transgeniczne HuMAb najlepiej odpowiadają gdy są pierwotnie immunizowane śródotrzewnowo (IP, ang. intraperitoneally) lub podskórnie (SC, ang. subcutaneously) komórkami wyrażającymi CD20 w kompletnym adiuwancie Freunda, a następnie immunizowane IP co drugi tydzień (aż do 10) komórkami wyrażającymi CD20 w PBS. Odpowiedź immunologiczną można monitorować w czasie trwania protokołu immunizacji za pomocą próbek osocza otrzymywanych z krwawień poza oczodołowych. Osocze można badać za pomocą analizy FACS (jak opisano poniżej) i myszy o wystarczających mianach ludzkich przeciwciał przeciwko CD20 można użyć do fuzji. Myszy można wzmocnić dożylnie komórkami wyrażającymi CD20 trzy dni przed uśmierceniem i usunięciem śledziony.
Otrzymywanie hybrydoma wytwarzających ludzkie przeciwciała monoklonalne wobec CD20
Aby otrzymać hybrydoma wytwarzające ludzkie przeciwciała monoklonalne wobec ludzkiego CD20, splenocyty i komórki węzłów chłonnych z immunizowanych myszy można izolować i poddawać fuzji z odpowiednią, unieśmiertelnioną linią komórkową, taką jak mysia linia szpiczaka. Uzyskiwane hybrydoma można następnie przeszukiwać pod kątem wytwarzania przeciwciał specyficznych wobec antygenu. Na przykład, jednokomórkowe zawiesiny limfocytów śledziony z immunizowanych myszy można poddać fuzji z niewydzielniczymi komórkami mysimi szpiczaka SP2/0-Ag8.653 (ATCC, CRL 5
1580) z 50% PEG (wag./obj.). Komórki można wysiać z gęstością 1 x 105 komórek na studzienkę na płytce mikrotitracyjnej o płaskim dnie i dwa tygodnie inkubować w pożywce selekcyjnej zawierającej zwykłe odczynniki - 10% surowica płodowa do klonwania, 5-10% czynnik do klonowania hybrydoma (IGEN) i IX HAT (Sigma). Po około 2 tygodniach komórki można hodować w pożywce, w której HAT zastąpiono HT. Pojedyncze studzienki można przeszukiwać stosując test ELISA na przeciwciała zawierające ludzki łańcuch lekki kappa i analizę FACS, stosując komórki wyrażające CD20, w kierunku specyficzności względem CD20. Gdy nastąpi intensywny wzrost hybrydoma, pożywkę można zwykle obserwować po 10-14 dniach. Hybrydoma wydzielające przeciwciała można przesiać, ponownie przeszukać i jeśli są wciąż pozytywne względem ludzkich IgG, przeciwciała monoklonalne przeciwko CD20 można subklonować co najmniej dwukrotnie przez ograniczające rozcieńczanie. Stabilne subklony można następnie hodować in vitro z wytworzeniem przeciwciała w pożywce do hodowli tkankowej do charakteryzacji.
Otrzymywanie transfektoma wytwarzających ludzkie przeciwciała monoklonalne wobec CD20
Ludzkie przeciwciała według wynalazku można także wytwarzać w komórkach gospodarza transfektoma, na przykład, za pomocą kombinacji technik rekombinacji DNA i transfekcji genów, jak jest dobrze znane w dziedzinie (Morrison, S. (1985) Science 229:1202).
Na przykład, w jednym wykonaniu, interesujące gen(y), np. ludzkie geny przeciwciał można wligować w wektor ekspresyjny, taki jak eukariotyczny plazmid ekspresyjny przykładowo stosowany w systemie ekspresji GS opisanym w WO 87/04462, WO 89/01036 i EP 338 841 lub inne systemy ekspresji dobrze znane w dziedzinie. Oczyszczony plazmid ze sklonowanymi genami można wprowadzić do eukariotycznych komórek gospodarza, takich jak komórki CHA, komórki NS/0 czy komórki HEK293 lub alternatywnie inne komórki eukariotyczne, jak komórki pochodzenia roślinnego, grzyby czy komórki drożdży. Sposoby stosowane do wprowadzania tych genów mogą być metodami opisanymi w dziedzinie, takimi jak elektroporacja, przy użyciu lipofektyny, lipofektaminy lub innych. Po wprowadzeniu tych genów przeciwciał do komórek gospodarza, komórki wyrażające przeciwciała można identyfikować i selekcjonować. Komórki te reprezentują transfektoma, które można amplifikować pod względem poziomu ekspresji oraz których skalę wytwarzania przeciwciał można zwiększyć.
PL 218 660 B1
Przeciwciała rekombinowane można izolować i oczyszczać z takich nadsączy hodowlanych i/lub komórek.
Dalsze sposoby rekombinacyjne wytwarzania ludzkich przeciwciał monoklonalnych wobec
CD20
Alternatywnie, klonowane geny przeciwciał można wyrażać w innych systemach ekspresyjnych, włączając komórki prokariotyczne, tj. mikroorganizmy, takie jak E. coli, w celu wytwarzania jednołańcuchowych przeciwciał Fv, komórki glonów, jak też komórki owadów. Następnie, przeciwciała można wytwarzać w zwierzętach, nie będących ludźmi, takimi jak mleko owiec i królików czy jaja kurze lub w roślinach transgenicznych. Patrz np. Verma, R., et al. (1998). Antibody engineering: Comparison of bacterial, yeast, insect and mammalian expression systems. J. Immunol. Meth. 216:165-181; Pollock, et al. (1999). Transgenic milk as a method for the production of recombinant antibodies. J.Immunol.Meth. 231:147-157; i Fischer, R., et al. (1999). Molecular farming of recombinant antibodies in plants. Biol.Chem. 380:825-839.
Zastosowanie częściowych sekwencji przeciwciał do wyrażania nienaruszonych przeciwciał
Przeciwciała oddziaływają z antygenem docelowym przede wszystkim poprzez reszty aminokwasowe znajdujące się w sześciu regionach CDR łańcuchów lekkiego i ciężkiego. Z tego powodu, sekwencje w obrębie CDR są bardziej różnorodne między pojedynczymi przeciwciałami niż sekwencje poza regionami CDR. Ponieważ sekwencje CDR odpowiadają za większość oddziaływań antygen-przeciwciało, możliwe jest wyrażanie rekombinowanych przeciwciał naśladujących właściwości naturalnie występujących przeciwciał poprzez konstrukcję wektorów ekspresyjnych zawierających sekwencje CDR ze specyficznych, naturalnie występujących przeciwciał, wstawione w sekwencje zrębowe z innego przeciwciała o różnych właściwościach (patrz np., Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; i Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci.. U.S.A. 86:10029-10033). Takie sekwencje zrębowe można otrzymać z publicznych baz DNA zawierających sekwencje genów przeciwciał linii zarodkowych. Te sekwencje linii zarodkowych będą różnić się od dojrzałych sekwencji genu przeciwciała, ponieważ nie będą zawierać całkowicie złożonych genów zmiennych tworzonych przez łączenie V(D)J w czasie dojrzewania komórek B. Sekwencje genów linii zarodkowej będą także różnić się od sekwencji drugorzędowego repertuaru przeciwciał o wysokim powinowactwie u osobnika równomiernie wzdłuż regionu zmiennego. Na przykład, mutacje somatyczne są względnie rzadkie na końcu aminokwasowym regionu zrębowego 1 i na końcu karboksylowym regionu zrębowego 4. Następnie wiele mutacji somatycznych nie zmienia znacząco właściwości wiązania przeciwciała. Z tego powodu nie jest konieczne otrzymanie całej sekwencji DNA poszczególnego przeciwciała w celu odtworzenia nienaruszonego rekombinowanego przeciwciała mającego właściwości wiązania podobne do oryginalnego przeciwciała (patrz WO 99/45962). Częściowe sekwencje łańcucha ciężkiego i lekkiego obejmujące regiony CDR typowo wystarczają do tego celu. Częściowych sekwencji używa się do ustalenia, które źródłowe segmenty genu zmiennego i łączącego uczestniczyły w genach zmiennych rekombinowanego przeciwciała. Sekwencje źródłowe używa się do wypełnienia brakujących części regionów zmiennych. Sekwencje liderowe łańcucha ciężkiego i lekkiego są cięte w czasie dojrzewania białka i nie mają wkładu we właściwości ostatecznego przeciwciała. By dodać brakujące sekwencje, klonowane sekwencję cDNA można kombinować z syntetycznymi oligonukleotydami poprzez ligację lub amplifikacje PCR. Alternatywnie, cały region zmienny można syntetyzować jako zestaw krótkich zachodzących na siebie oligonukleotydów, które można złożyć przez amplifikację PCR otrzymując całkowicie syntetyczny klon regionu zmiennego. Ten proces ma pewne korzyści, takie jak eliminacja lub włączenie szczególnych miejsc restrykcyjnych, lub optymalizacja szczególnych kodonów.
Sekwencje nukleotydowe transkryptów łańcucha ciężkiego i lekkiego z hybrydoma stosuje się do zaprojektowania zestawu zachodzących na siebie syntetycznych oligonukleotydów, aby otrzymać syntetyczne sekwencje V o identycznych właściwościach kodowania przeciwciał jak sekwencje naturalne. Syntetyczne sekwencje łańcucha ciężkiego i kappa mogą różnić się od sekwencji naturalnych na trzy sposoby: ciągi powtarzalnych zasad nukleotydów są przerywane by ułatwić syntezę oligonukleotydów i amplifikację PCR; włączone są optymalne miejsca inicjacji translacji zgodnie z zasadami Kozak (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266:19867-19870) i powyżej miejsc inicjacji translacji wstawione są miejsca Hindlll.
Dla obu regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i lekkiego zoptymalizowane sekwencję nici regionu kodującego i odpowiadającego mu regionu niekodującego podzielono na 30-50 nukleotydowe fragmenty mniej więcej w połowie odpowiadającego, niekodującego oligonukleotydu. Tak więc dla
PL 218 660 B1 każdego łańcucha oligonukleotydy można złożyć w dwuniciowe zestawy obejmujące zestawy 150-400 nukleotydów. Pule następnie używa się jako matrycy do amplifikacji PCR produktów o 150-400 nukleotydach. Typowo pojedynczy region zmienny zostanie podzielony na dwie pule, które zostaną oddzielnie zamplifikowane, aby uzyskać dwa zachodzące na siebie produkty PCR. Pożądane także może być włączenie zachodzącego fragmentu regionu stałego łańcucha ciężkiego lub lekkiego (włączając miejsce BbsI lekkiego łańcucha kappa lub Agel ciężkiego łańcucha gamma) do amplifikacji PCR z wytworzeniem fragmentów, które można łatwo wklonować do konstruktu wektora ekspresyjnego.
Zrekonstruowane regiony zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego łączy się następnie z klonowanym promotorem, sekwencją liderową, sekwencją inicjacji translacji, regionem stałym, regionem 3' nie ulegającym translacji, sekwencjami poliadenylacji i terminacji transkrypcji z wytworzeniem konstruktów wektora ekspresyjnego. Konstrukty ekspresyjne łańcucha ciężkiego i lekkiego można włączyć do jednego wektora, kotransfekować, transfekować seryjnie lub oddzielnie do komórek gospodarza, które następnie poddaje się fuzji z wytworzeniem komórek gospodarza wyrażających oba łańcuchy.
Plazmidy stosowane do konstrukcji wektorów ekspresyjnych dla ludzkich IgGK opisano poniżej. Plazmidy konstruowano tak, że sekwencje cDNA łańcucha ciężkiego V i lekkiego V kappa amplifikowane w PCR można stosować do rekonstrukcji całkowitych minigenów łańcucha ciężkiego i lekkiego. Plazmidy te można stosować do wyrażania całkowicie ludzkich lub chimerowych przeciwciał IgG1,K lub IgG4,K. Podobne plazmidy można skonstruować do ekspresji innych izotypów łańcucha ciężkiego lub do ekspresji przeciwciał obejmujących łańcuchy lekkie lambda.
Tak więc, strukturalne cechy ludzkich przeciwciał przeciwko CD20, np. 11B8, wykorzystuje się do wytworzenia pokrewnych strukturalnie przeciwciał przeciwko CD20 zachowujących co najmniej jedną właściwość funkcjonalną przeciwciała według wynalazku, taką jak wiązanie z CD20. Bardziej szczegółowo, jeden lub większa liczba regionów CDR 11B8 może być rekombinacyjnie złączona ze znanymi regionami zrębowymi i CDR, aby otrzymać metodami inżynierii rekombinacyjnej dodatkowe, ludzkie przeciwciała przeciwko CD20.
Zgodnie z powyższym, niniejszym ujawniono sposób przygotowania przeciwciała przeciwko CD20 obejmującego:
przygotowanie przeciwciała zawierającego (1) regiony zrębowe ludzkiego łańcucha ciężkiego i ludzkie CDR łańcucha ciężkiego, przy czym co najmniej jeden CDR ludzkiego łańcucha ciężkiego obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji aminokwasowych CDR przedstawionych na Figurze 57 (lub odpowiadających reszt aminokwasowych w SEK. NR ID.: 25-27) i (2) regiony zrębowe ludzkiego łańcucha lekkiego i ludzkie CDR łańcucha lekkiego, przy czym co najmniej jeden CDR ludzkiego łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną z sekwencji aminokwasowych CDR przedstawionych na Figurze 57 (lub odpowiadających reszt aminokwasowych w SEK. NR ID.: 28-30), a przeciwciała zachowują zdolność do wiązania CD20.
Zdolność przeciwciała do wiązania CD20 można ustalić stosując standardowe oznaczenia wiązania, takie jak przedstawione w przykładach (np. analiza FACS)
Od kiedy dobrze wiadomo w dziedzinie, że domeny CDR3 łańcucha lekkiego i ciężkiego pełnią szczególnie istotną rolę w specyficzności/powinowactwie wiązania przeciwciała względem antygenu, rekombinowane przeciwciała według wynalazku przygotowane jak przedstawiono wyżej, korzystnie obejmują CDR3 łańcucha ciężkiego i lekkiego 11B8. Przeciwciała następnie mogą obejmować CDR 2 przeciwciała 11B8. Przeciwciała ponadto mogą obejmować CDR 1 przeciwciała 11B8. Zgodnie z powyższym, takie przeciwciało przeciwko CD20 obejmuje (1) regiony zrębowe ludzkiego łańcucha ciężkiego, region CDR1 ludzkiego łańcucha ciężkiego, region CDR2 ludzkiego łańcucha ciężkiego i region CDR3 ludzkiego łańcucha ciężkiego, przy czym region CDR3 jest CDR3 11B8 jak przedstawiono na Figurze 57 (lub odpowiadających im resztach aminokwasowych SEK. NR ID.: 27 i (2) regiony zrębowe ludzkiego łańcucha lekkiego, region CDR1 ludzkiego łańcucha lekkiego, region CDR2 ludzkiego łańcucha lekkiego i region CDR3 ludzkiego łańcucha lekkiego, przy czym region CDR3 jest CDR3 11B8 jak przedstawiono na Figurze 57 (lub odpowiadających im resztach aminokwasowych SEK. NR ID.: 30), a przeciwciało wiąże CD20. Przeciwciało może następnie obejmować CDR1 łańcucha ciężkiego i/lub CDR1 łańcucha lekkiego CDR1 11B8.
Korzystnie CDR1, 2 i/lub 3 poddanych inżynierii przeciwciał opisanych powyżej obejmują dokładne sekwencje aminokwasowe jak te niniejszym ujawnione dla 11B8.
Jednakże, specjalista w dziedzinie doceni, że możliwe będą pewne odstępstwa od dokładnych sekwencji CDR 11B8, przy jednoczesnym zachowaniu zdolności przeciwciała do efektywnego wiązania CD20 (np. substytucje konserwatywne). Zgodnie z powyższym, przeciwciało poddane inżynierii
PL 218 660 B1 może być skomponowane z jednego lub większej liczby CDR, które są, na przykład, w 90%, 95%, 98% lub 99,5% identyczne z jednym lub większą liczbą CDR 11B8.
Dodatkowo do prostego wiązania CDR, przeciwciała poddane inżynierii, takie jak opisane powyżej można selekcjonować pod kątem retencji lub innych właściwości funkcjonalnych przeciwciał według wynalazku takich jak:
(1) niska szybkość dysocjacji od CD20 (2) wysokie powinowactwo wiązania z CD20 (3) wiązanie z unikalnym epitopem na CD20 i/lub wiązanie w specyficznej orientacji z CD20 i/lub wiązanie ze specyficzną formą CD20 (4) pośredniczenie w wysokim poziomie CDC w komórkach ujemnych lub dodatnich względem CD55/59 (5) translokacja do tratw lipidowych przy wiązaniu z CD20 (6) hamowanie wzrostu komórek wyrażających CD20 (7) indukcja apoptozy komórek wyrażających CD20 (8) indukcja homotypowej adhezji komórek wyrażających CD20 (9) przedłużone przeżycie osobnika, u którego występują komórki nowotworowe wyrażające
CD20 (10) pośredniczenie w ADCC nakierowanym na CD20 po zmieszaniu z odpowiednimi komórkami efektorowymi (11) zdolność do usuwania komórek wyrażających CD20 i/lub (12) zdolność do usuwania komórek wyrażających niski poziom CD20 (CD20low)
Charakteryzacja wiązania ludzkich przeciwciał monoklonalnych z CD20
By oczyścić ludzkie przeciwciała przeciwko CD20, wybrane hybrydoma można hodować w dwulitrowych kolbach z mieszadłem (ang. spinner flask) do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych. Nadsącze można flitrować i zatężać przez chromatografię powinowactwa z zastosowaniem podłoża białko A - Sepharose (dla przeciwciał izotypu IgG1) (Pharmacia, Piscataway, NJ) lub Sepharose opłaszczona anty-ludzkim IgG lub białko G - Sepharose w przypadku przeciwciał izotypu IgG3. W celu zapewnienia czystości wymywane IgG można sprawdzać za pomocą elektroforezy żelowej i wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Roztwór buforu można zamienić na PBS i stężenie określić przy OD280 stosując stałą ekstynkcji 1,43. Przeciwciała monoklonalne można porcjować i przechowywać w -80°C.
Aby ustalić czy wybrane ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko CD20 wiążą się z unikalnymi epitopami można zastosować mutagenezę ukierunkowaną lub nieukierunkowaną.
W celu ustalenia izotypu oczyszczonych przeciwciał można przeprowadzić analizę ELISA. Studzienki płytki mikrotitracyjnej można opłaszczać 10 μg/ml anty-ludzkich Ig przez noc w 4°C. Po blokowaniu 5% BSA, płytki poddaje się reakcji z 10 μg/ml przeciwciał monoklonalnych lub oczyszczonymi kontrolami izotypów, w różnych temperaturach przez 2 godziny. Studzienki można poddawać reakcji z sondami swoistymi wobec ludzkich IgG1, IgG2, IgG3 lub IgG4 albo IgM skoniugowanymi z fosfatazą alkaliczną. Po płukaniu, płytki wywołuje się substratem pNPP (1 mg/ml) i analizuje przy OD 405-650.
Aby wykazać obecność przeciwciał przeciwko CD20 w surowicach immunizowanych myszy lub wiązanie przeciwciał monoklonalnych z żywymi komórkami wyrażającymi CD20 można zastosować cytometrię przepływową. Pokrótce, linie komórkowe wyrażające CD20 (hodowane w standardowych warunkach) miesza się z różnymi stężeniami przeciwciał monoklonalnych w PBS zawierającym 0,1% BSA i 0,02% azydek sodu i inkubuje w 4°C przez 30 min. Po płukaniu, komórki poddaje się reakcji z wyznakowanymi fluoresceiną przeciwciałami przeciwko ludzkim IgG w tych samych warunkach co wcześniejsze barwienie przeciwciał. Próbki można analizować cytometrią przepływową z wykorzystaniem aparatury FACS stosując właściwości światła i bramkowania, aby wyłapać pojedyncze żywe komórki. Można zastosować alternatywne oznaczenie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (dodatkowo lub zamiast oznaczenia cytometrii przepływowej). Komórki można barwić dokładnie jak opisano wyżej i badać metodą mikroskopii fluorescencyjnej. Metoda ta pozwala na wizualizację pojedynczych komórek, ale może mieć obniżoną czułość w zależności od gęstości antygenu.
Ludzkie IgG przeciwko CD20 można dalej badać pod kątem reaktywności z antygenem CD20 analizą Western blot. Pokrótce, ekstrakty komórkowe z komórek wyrażających CD20 można przygotować i poddać elektroforezie w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS). Po elektroforezie, rozdzielone antygeny będą przenoszone na błony nitrocelulozowe, blokowane 20% mysią surowicą i traktowane badanymi przeciwciałami monoklonalnymi. Wiązanie ludzkich IgG można wy22
PL 218 660 B1 kryć stosując anty-ludzkie IgG z fosfatazą alkaliczną i wywołując tabletkami substratu BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).
Fagocytarne i zabójcze dla komórek aktywności ludzkich przeciwciał monoklonalnych wobec
CD20
Oprócz specyficznego wiązania CD20, ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko CD20 można testować na ich zdolność do pośredniczenia w fagocytozie i zabijaniu komórek wyrażających CD20. Badanie aktywności przeciwciał monoklonalnych in vitro stanowi wstępne badanie przesiewowe poprzedzające test in vivo. Pokrótce, komórki cechujące się różnokształtnością jąder (polimorfonuklearne) (PMN, ang. polymorphonuclear), komórki NK, monocyty lub inne komórki efektorowe od zdrowych dawców można oczyścić przez wirowanie w gradiencie gęstości Ficoll Hypaque, a następnie zanieczyszczające erytrocyty poddać lizie. Przemywane PMN można zawiesić w RPMI uzupełnionym
10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą cielęcą i zmieszać z wyznakowanymi 51Cr komórkami wyrażającymi CD20 w różnych stosunkach komórek efektorowych do komórek nowotworowych (komórki efektorowe: komórki nowotworowe). Oczyszczone ludzkie IgG przeciwko CD20 można następnie dodać w różnych stężeniach. Obojętne ludzkie IgG można stosować jako kontrolę ujemną. Oznaczenia można prowadzić przez 4 do 20 godzin w 37°C zależnie od użytego typu komórek efekto51 rowych. Próbki można oznaczać pod kątem cytolizy przez pomiar uwalniania 51Cr do nadsączu hodowlanego. Przeciwciała monoklonalne przeciwko CD20 można także testować w kombinacjach by ustalić czy cytoliza wzmaga się przy zastosowaniu licznych przeciwciał monoklonalnych.
Ludzkie przeciwciała monoklonalne wiążące się z CD20 także można testować w modelu in vivo (np. na myszach), aby ustalić ich wydajność w kontrolowaniu wzrostu komórek nowotworowych wyrażających CD20. Przeciwciała te można selekcjonować w oparciu na przykład, o następujące, nie wykluczające innych, kryteria:
1. wiązanie z żywymi komórkami wyrażającymi CD20;
2. niska szybkość dysocjacji od CD20;
3. wysokie powinowactwo wiązania z CD20;
4. wiązanie z unikalnym epitopem na CD20 i/lub wiązanie w specyficznej orientacji z CD20 i/lub wiązanie ze specyficzną formą CD20;
5. opsonizacja komórek wyrażających CD20;
6. pośredniczenie w hamowaniu wzrostu, fagocytozy i/lub zabijaniu komórek wyrażających CD20 w obecności ludzkich komórek efektorowych;
7. zdolność do indukcji CDC komórek negatywnych lub pozytywnych pod względem CD55/CD59;
8. zdolność do indukcji adhezji homotypowej;
9. zdolność do indukcji translokacji do tratw lipidowych pod wpływem wiązania CD20;
10. zdolność do indukcji apoptozy;
11. zdolność do indukcji ADCC na komórkach wyrażających CD20;
12. zdolność do zmniejszania liczby komórek wyrażających CD20; i/lub
13. zdolność do zmniejszania liczby komórek wyrażających niskie poziomy CD20 (komórki CD20low).
Korzystne ludzkie przeciwciała według wynalazku spełniają jedno lub większą liczbę powyższych kryteriów.
Ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko CD20 można testować na zdolność do pośredniczenia w CDC stosując różne znane techniki. Na przykład, surowicę dla dopełniacza można otrzymać z krwi zdrowych osobników, którą można żwirować i zebrać. W celu ustalenia aktywności CDC róż51 nych mAB, można zastosować różne metody. Można mierzyć uwalnianie 51Cr albo można oznaczać przepuszczalność błony za pomocą testu wykluczania jodku propidyny (PI, ang. propidium iodide). Pokrótce, komórki docelowe można płukać i zawiesić w RPMI - 1% BSA z gęstością 1 x 106/ml. Można dodawać różne stężenia mAb do komórek i pozwolić im na wiązanie się przez 10-15 min w temperaturze pokojowej (RT). Następnie można dodać surowicy do ostatecznego stężenia 20% (obj./obj.), a komórki inkubować w 37°C przez 45 min. Wszystkie komórki z każdej próbki można dodać do roztworu PI w probówce do FACS. Mieszaninę można oznaczać natychmiast za pomocą cytometrii przepływowej stosując cytometr przepływowy FACScalibur i analizować stosując oprogramowanie CellQuest pro (BD Biosciences, Mountain View, CA).
Aby zbadać zdolność do inicjowania apoptozy, ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko CD20 można, na przykład, inkubować z komórkami nowotworowymi dodatnimi pod względem CD20,
PL 218 660 B1 np. Daudi w 37°C przez około 20 godzin. Komórki można zebrać, zawiesić w buforze do wiązania Aneksyna-V-FITC (BD biosciences), i znakować Aneksyną V-FITC (BD biosciences) przez 15 min w ciemności w 4°C. Wszystkie komórki z każdej próbki można dodać do roztworu PI (10 gg/ml w PBS) w probówce do FACS i oznaczać natychmiast cytometrią przepływową (jak wyżej).
W szczególnej postaci wykonania, ludzkie przeciwciała monoklonalne stosuje się w kombinacji, np. jako kompozycje farmaceutyczne obejmujące dwa lub większą liczbę przeciwciał monoklonalnych przeciwko CD20. Na przykład, ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko CD20 mające różne, ale uzupełniające się aktywności można łączyć w jednym sposobie leczenia, aby osiągnąć zamierzony efekt leczniczy lub diagnostyczny. W korzystnym wykonaniu, kompozycja obejmuje ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko CD20 pośredniczące w CDC w kombinacji z innymi ludzkimi przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko CD20 indukującymi apoptozę. W innym wykonaniu, kompozycja obejmuje ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko CD20 pośredniczące przy bardzo wydajnym zabijaniu komórek docelowych w obecności komórek efektorowych, w kombinacji z innym ludzkim przeciwciałem monoklonalnym przeciwko CD20 hamującym wzrost komórek wyrażających CD20.
II. Wytwarzanie transgeniecznych zwierząt innych niż człowiek, generujących ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko CD20
W jeszcze innym aspekcie wynalazek dostarcza transgenicznych zwierząt innych niż człowiek, takich jak transgeniczne myszy, zdolnych do wyrażania ludzkich przeciwciał specyficznie wiążących się z CD20. W szczególnym wykonaniu, wynalazek dostarcza transgenicznej myszy o genomie obejmującym ludzki transgen łańcucha ciężkiego, tak, że mysz wytwarza ludzkie przeciwciała przeciwko CD20 po immunizacji komórkami wyrażającymi CD20. Transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego, może być włączony w chromosomowy DNA myszy, jak w przypadku myszy transgenicznej, np. HuMAb, jak niniejszym szczegółowo opisano i poparto przykładami. Alternatywnie, transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego może być utrzymywany transchromosomalnie, jak w przypadku myszy transchromosomowych (np. KM), jak opisano w WO 02/43478. Takie zwierzęta transgeniczne i transchromosomowe są zdolne do wytwarzania licznych izotypów ludzkich przeciwciał monoklonalnych wobec CD20 (np. IgG, IgA i/lub IgE) w wyniku rekombinacji V-D-J/V-J i przełączania izotypów. Opracowanie transgenicznego lub transchromosomowego zwierzęcia innego niż człowiek, odpowiadającego na obcą stymulację antygenową za pomocą repertuaru heterologicznyeh przeciwciał, wymaga, żeby transgeny heterologicznych immunoglobulin zawarte w zwierzęciu transgenicznym poprawnie funkcjonowały w czasie rozwoju komórek B. To obejmuje na przykład, zamianę izotypów transgenu heterologicznego łańcucha ciężkiego. Zgodnie z powyższym transgeny konstruuje się tak, aby zamianę izotypów mogła indukować jedna lub większa liczba następujących charakterystyk genów przeciwciał: (1) wysoki poziom i ekspresja specyficzna dla komórek, (2) funkcjonalna rearanżacja genów, (3) aktywacja i odpowiedź na wykluczenie alleliczne, (4) ekspresja wystarczającego repertuaru początkowego, (5) transdukcja sygnału, (6) hipermutacja somatyczna i (7) dominacja locus transgenicznego przeciwciała w czasie odpowiedzi immunologicznej.
Nie wszystkie kryteria muszą być spełnione. Na przykład, w tych wykonaniach według wynalazku, gdzie endogenne loci immunoglobulinowe zwierzęcia transgenicznego są poddane funkcjonalnemu przerwaniu, transgen nie musi aktywować wykluczenia allelicznego. Następnie, w tych wykonaniach, gdzie transgen obejmuje funkcjonalnie przearanżowany gen łańcucha ciężkiego i/lub łańcucha lekkiego immunoglobulin, niezbędne nie jest drugie kryterium dotyczące rearanżacji genu, przynajmniej dla transgenu, który już jest po rearanżacji. Podstawy immunologii molekularnej, patrz Fundamental Immunology, drugie wydanie (1989), Paul William E., red., Raven Press, N.Y.
W pewnych wykonaniach, transgeniczne i transchromosomowe zwierzęta inne niż człowiek stosuje się do generowania ludzkich przeciwciał monoklonalnych według wynalazku włączając rearanżowane, nierearanżowane lub kombinację rearanżowanych i niereanżowanych transgenów heterologicznych łańcuchów ciężkich i lekkich immunoglobulin w linii zarodkowej zwierzęcia transgenicznego. Każdy z transgenów łańcucha ciężkiego obejmuje przynajmniej jeden gen CH. Dodatkowo, transgen łańcucha ciężkiego może zawierać funkcjonalne sekwencje zamiany izotypów, zdolne do wspierania zamiany przeciwciał heterologicznego transgenu kodującego liczne CH w komórkach B zwierzęcia transgenicznego. Takie sekwencje zamiany mogą być tymi, które naturalnie występują w locus immunoglobulinowym linii zarodkowej gatunków, które stanowią źródło transgenów CH, lub sekwencje zamiany, mogą pochodzić z tych, które występują u gatunku, który ma przyjąć konstrukt transgenowy (zwierzęcia transgenicznego). Na przykład, konstrukt ludzkiego transgenu stosowany do uzyskania myszy transgenicznej może wytwarzać wyższą częstość przypadków przełączania izotypów, jeśli za24
PL 218 660 B1 wiera sekwencje przełączania podobne do tych, które występują naturalnie w locus łańcucha ciężkiego myszy, jako, że zasadniczo mysie sekwencje zamiany są zoptymalizowane, aby działać z mysim enzymatycznym systemem przełączania rekombinazy, podczas gdy ludzkie sekwencje przełączania nie są. Sekwencje przełączania można izolować i klonować standardowymi technikami klonowania, albo można syntetyzować de novo z zachodzących na siebie syntetycznych oligonukleotydów zaprojektowanych w oparciu o opublikowane informacje o sekwencji odnoszącej się do sekwencji regionu zmiennego immunoglobulin (Mills et al., Nuci. Acids Res. 15:7305-7316 (1991); Sideras et al., Intl. Immunol. 1:631-642 (1989)). Dla każdego z następujących zwierząt transgenicznych, funkcjonalnie przereanżowany heterologiczny transgen łańcucha ciężkiego i lekkiego immunoglobuliny znajduje się w znaczącej frakcji komórek B zwierzęcia transgenicznego (co najmniej 10%).
Transgeny stosowane do generowania zwierząt transgenicznych innych niż człowiek według wynalazku, obejmują transgen łańcucha ciężkiego składający się z DNA kodującego co najmniej jeden segment zmienny genu - segment V (ang. variable), jeden segment D (ang. diversity) genu, jeden segment łączący genu - segment J (ang. joining) i co najmniej jeden segment stały genu. Transgen łańcucha lekkiego immunoglobuliny zawiera DNA kodujące co najmniej jeden segment V, jeden segment D genu, jeden segment J genu i co najmniej jeden segment stały genu. Segmenty genu kodujące segmenty genów łańcucha ciężkiego i lekkiego są heterologiczne względem zwierzęcia transgenicznego i pochodzą z lub odpowiadają DNA kodującemu segmenty genów łańcucha ciężkiego i lekkiego immunoglobulin z gatunku niebędącego transgenicznym zwierzęciem innym niż człowiek. Transgen można konstruować tak, że indywidualne segmenty genu są nierearanżowane, tj. nie są rearanżowane tak, aby kodowały funkcjonalny łańcuch lekki lub ciężki immunoglobuliny. Takie transgeny nierearanżowane wspierają rekombinację segmentów genów V, D i J (rearanżacja funkcjonalna) i korzystnie wspierają włączanie całego lub fragmentu segmentu genu regionu D w powstały łańcuch ciężki immunoglobuliny w obrębie zwierzęcia transgenicznego podczas ekspozycji na antygen CD20.
W alternatywnym wykonaniu, transgeny obejmują nierearanżowane „mini-locus. Takie transgeny typowo obejmują zasadnicze części segmentów C, D i J, jak też podzestaw segmentów genu V. W takich konstruktach transgenów, różnorodne sekwencje regulatorowe, np. promotory, wzmacniacze, regiony przełączania klas, sekwencje dawcy i biorcy do składania przy obróbce RNA, sygnały rekombinacji i podobne, obejmują odpowiednie sekwencję pochodzące z heterologicznego DNA. Takie sekwencje regulatorowe można włączyć do transgenu z tego samego lub pokrewnych gatunków zwierzęcia innego niż człowiek. Na przykład, segmenty ludzkich genów immunoglobulin można łączyć w transgenie z sekwencją wzmacniacza gryzoni do użycia w myszy transgenicznej. Alternatywnie, do transgenu można włączyć syntetyczne sekwencje regulatorowe, przy czym takie syntetyczne sekwencje regulatorowe nie są homologiczne z funkcjonalną sekwencją DNA znaną z tego, że naturalnie występuje w genomach ssaków. Syntetyczne sekwencje regulatorowe projektuje się zgodnie z regułami najwyższej zgodności, takich jak, na przykład, te określające najbardziej dopuszczalne sekwencje, miejsca akceptora składania lub motyw promotora/wzmacniacza. Na przykład, minilocus obejmuje fragment locus genomowego immunoglobuliny o co najmniej jednej wewnętrznej (tj. nie w części terminalnej) delecji kawałka DNA, która nie jest niezbędna (np. sekwencji przerywających, intronu lub jego części) w porównaniu do naturalnie występującego źródłowego locus IG.
Korzystne transgeniczne i transchromosomowe zwierzęta, które nie są człowiekiem, np. myszy, będą wykazywać wytwarzanie przeciwciał o znaczącym repertuarze, idealnie znacząco podobnych do ludzkich po dopasowaniu ilości.
Repertuar będzie idealnie przypominał ten wykazywany przez człowieka po dopasowaniu ilości, zwykle z różnorodnością wynoszącą co najmniej 10%, korzystnie 25 do 50% lub więcej. Ogólnie, co najmniej tysiąc różnych immunoglobulin (idealnie IgG), korzystnie 104 do 106 lub więcej, wytwarzanych będzie w zależności od liczby różnych regionów V, J i D wprowadzonych do genomu myszy i kierowanych przez dodatkową różnorodność generowania przez losowe dodawanie nukleotydów w regionach łączenia przy rearanżacji segmentów V(-D-)J genu. Zazwyczaj, immunoglobuliny będą przejawiać powinowactwo (KD) dla wcześniej wybranych antygenów poniżej 10-7 M, na przykład poniżej 10-8 M, 10-9 M lub 10-10 M lub nawet niższe.
Transgeniczne i transchromosomowe zwierzęta inne niż człowiek, np. myszy jak opisano wyżej można immunizować, na przykład, komórkami wyrażającymi CD20. Alternatywnie, transgeniczne zwierzęta można immunizować DNA kodującym ludzki CD20. Zwierzęta będą wtedy wytwarzać komórki B przechodzące przełączanie izotypowe przez rekombinację przełączania (przełączanie cis, ang. cis-switching) i wyrażać immunoglobuliny reagujące z CD20. Immunoglobuliny mogą być ludzkimi
PL 218 660 B1 przeciwciałami (nazywanymi także „przeciwciałami o ludzkiej sekwencji), gdzie polipeptydy łańcuchów ciężkiego i lekkiego są kodowane przez ludzkie sekwencje transgenów, które mogą zawierać sekwencje wytworzone przez mutacje somatyczne i połączenia regionu V, jak też sekwencje kodowane linii zarodkowych; te ludzkie przeciwciała można także określać jako zasadniczo identyczne z sekwencją polipeptydową kodowaną przez ludzkie segmenty genów VL i JL lub VH, DH i JH, mimo, że inne niż sekwencje linii zarodkowych mogą być obecne w wyniku mutacji somatycznych i różniących się połączeń rekombinacyjnych V-J i V-D-J. Regiony zmienne każdego łańcucha przeciwciała są typowo w 80 procentach podobne do segmentów łańcuchów V, J, a w przypadku łańcuchów ciężkich - D ludzkich linii zarodkowych; często co najmniej w 85 procentach podobne do ludzkich sekwencji linii zarodkowych obecnych w transgenie; najczęściej w 90 lub 95 procentach lub bardziej podobne do ludzkich sekwencji linii zarodkowych obecnych w transgenie. Jednakże, jako że sekwencje pierwotne wprowadza się przez mutacje somatyczne i łączenie VJ i VDJ, przeciwciała o ludzkich sekwencjach będą często mieć pewne sekwencje regionu zmiennego, które nie są kodowane przez segmenty VD lub J genów ludzkich, jak znajdowane w ludzkim transgenie (transgenach) w linii zarodkowej myszy. Typowo takie sekwencje nie będące sekwencjami linii zarodkowych (lub pojedyncze pozycje nukleotydowe) będą zbierać się w regionie lub blisko regionu CDR lub w regionach znanych z grupowania mutacji somatycznych.
Komórki B mogą pochodzić z niebędących ludźmi zwierząt transgenicznych lub transchromosomowych, jak niniejszym opisano. Komórki B można wykorzystać do uzyskania hybrydoma wyrażających ludzkie przeciwciała monoklonalne wiążące się z wysokim powinowactwem z ludzkim CD20 (np. o stałej równowagi dysocjacji (KD niższej niż 10-7 M). Tak więc, ujawniono niniejszym hybrydoma wytwarzające ludzkie przeciwciała o powinowactwie (KD) poniżej 10-7 M, takie jak przeciwciała o powinowactwie poniżej 10-8 M, 10-9 M lub 10-10 M lub nawet niżej przy określeniu za pomocą analizy Scatcharda komórek wyrażających CD20 stosując monoklonalne przeciwciała znakowane radioaktywnie lub przez ustalenie połowicznego stężenia wiązania stosując analizę FACS.
Przeciwciało monoklonalne obejmuje ludzką sekwencję łańcucha lekkiego skomponowaną z (1) regionu zmiennego łańcucha lekkiego mającego sekwencję polipeptydu zasadniczo identyczną z sekwencją polipeptydu kodowaną przez segment genu ludzkiego VL i JL oraz (2) region stały łańcucha lekkiego kodowany przez segment gen ludzkiego CL; i ludzką sekwencję łańcucha ciężkiego skomponowaną z (1) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego o sekwencji polipeptydu zasadniczo identycznej z sekwencją polipeptydu kodowaną przez gen segmentu ludzkiego VH, regionu D i segmentu ludzkiego JH oraz (2) region stały łańcucha lekkiego kodowany przez segment ludzkiego genu CH.
Rozwój ludzkich przeciwciał monoklonalnych o wysokim powinowactwie przeciwko CD20 można ułatwić metodą rozszerzenia repertuaru segmentów regionów zmiennych genów ludzkich w niebędącym człowiekiem zwierzęciu transgenicznym, które ma genom obejmujący zintegrowany transgen ludzkich immunoglobulin, przy czym metoda ta obejmuje wprowadzenie do genomu transgenu V obejmującego segmenty genu regionu V nieobecne w rzeczonym zintegrowanym transgenie ludzkich immunoglobulin. Często, region V transgenu jest sztucznym chromosomem drożdży obejmującym część układu segmentów genu ludzkiego VH lub VL (VK), który może naturalnie zachodzić w genomie człowieka lub może być składany osobno metodami rekombinacji, łącznie z nieuporządkowaniem (ang. out-of-order) lub pominięciem segmentów genu V. Często co najmniej pięć lub więcej funkcjonalnych segmentów genu V zawiera się na YAC. W tym przypadku, możliwe jest otrzymanie zwierzęcia transgenicznego wytworzonego metodą rozszerzania repertuaru V, przy czym zwierzę wyraża łańcuch immunoglobulinowy obejmujący sekwencję regionu zmiennego kodowane przez segment genu V obecny w transgenie regionu V i regionu C kodowanym przez ludzki transgen Ig. Metodą rozszerzania repertuaru V, można otrzymać transgeniczne zwierzęta o co najmniej 5 różnych genach V; jak też zwierzęta o co najmniej 24 genach V lub więcej. Pewne segmenty genów V mogą nie być funkcjonalne (np. pseudogeny i podobne); te segmenty można zachować lub selektywnie usunąć metodami rekombinacyjnymi dostępnymi specjaliście w dziedzinie jeśli jest to pożądane.
Gdy przearanżowano mysią linię zarodkową, tak aby zawierała funkcjonalny YAC o rozszerzonym repertuarze segmentu V, zasadniczo nieobecny w ludzkim transgenie zawierającym segmenty genu J i C, cechę tę można przekazywać i hodować w innych tłach genetycznych, obejmujących tła, w których funkcjonalny YAC zawierający rozszerzony repertuar segmentu V hoduje się w linii zarodkowej zwierzęcia innego niż człowiek mającej różny ludzki transgen Ig. Liczne funkcjonalne YAC mające rozszerzony repertuar segmentu V można hodować w linii zarodkowej, aby współdziałały
PL 218 660 B1 z ludzkim transgenem Ig (lub licznymi ludzkimi transgenami Ig). Chociaż są one niniejszym nazywane transgenami YAC, transgeny te gdy są włączone w genom mogą zasadniczo nie posiadać sekwencji drożdżowych, takich jak sekwencje wymagane do autonomicznej replikacji w drożdżach; takie sekwencje można ewentualnie usuwać metodami inżynierii genetycznej (np. trawienia restrykcyjnego i elektroforezy żelowej w polu pulsacyjnym lub inną odpowiednią metodą), które po replikacji w drożdżach nie są dalej potrzebne (tj. przed wprowadzeniem do mysich komórek ES lub mysiej prozygoty). Metody przekazywania cechy ekspresji ludzkiej sekwencji immunoglobulin, obejmują hodowanie transgenicznego zwierzęcia mającego ludzki transgen (transgeny) Ig i ewentualnie także funkcjonalny YAC zawierający rozszerzony repertuar segmentu V. Oba segmenty genu VH i VL mogą być obecne na YAC. Zwierzę transgeniczne może być krzyżowane z innym pożądanym tłem pożądanym przez praktyka, włączając tła posiadające inne ludzkie transgeny, obejmując ludzkie transgeny Ig i/lub transgeny kodujące inne ludzkie białka limfocytów. Wynalazek także dostarcza ludzkich sekwencji immunoglobulin o wysokim powinowactwie wytwarzanych przez mysz transgeniczną z transgenem YAC z rozszerzonym repertuarem regionu V. Chociaż dalej opisuje się korzystne wykonanie transgenicznego zwierzęcia według wynalazku, rozważa się inne wykonania, sklasyfikowane w trzech kategoriach:
I. Transgeniczne zwierzęta zawierające transgeny immunoglobulin nierearanżowanego łańcucha ciężkiego i rearanżowanego łańcucha lekkiego;
II. Transgeniczne zwierzęta zawierające transgeny immunoglobulin nierearanżowanego łańcucha ciężkiego i nierearanżowanego łańcucha lekkiego; oraz
III. Transgeniczne zwierzęta zawierające transgeny immunoglobulinowe rearanżowanego łańcucha ciężkiego i nierearanżowanego łańcucha lekkiego.
W obrębie tych kategorii zwierząt transgenicznych, korzystny porządek preferencji jest następujący II>I>III, przy czym endogenne geny łańcucha lekkiego (lub co najmniej gen K) usunięto przez rekombinacje homologiczną (lub inną metodą) i I>II>III, przy czym endogenne geny łańcucha lekkiego nie zostały usunięte i muszą zostać zdominowane przez wykluczenie alleliczne.
III. Cząsteczki bispecyficzne/multispecyficzne wiążące się z CD20
Ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko CD20 można derywatyzować lub łączyć z innymi cząsteczkami funkcjonalnymi, np. innym peptydem lub białkiem (np. fragmentem Fab'), aby uzyskać cząsteczkę bispecyficzna według wynalazku lub multispecyficzną wiążącą liczne miejsca wiązania lub epitopy docelowe. Na przykład, przeciwciało według wynalazku może być funkcjonalnie połączone (np. poprzez sprzęganie chemiczne, fuzję genetyczną, asocjację niekowalencyjną lub w inny sposób) z jedną cząsteczką wiążącą, taką jak inne przeciwciało, peptyd lub mimetyk wiążący.
Zgodnie z powyższym, niniejszym ujawniono cząsteczki bispecyficzne i multispecyficzne obejmujące co najmniej jedną pierwszą specyficzność wiążącą dla CD20 i drugą specyficzność wiążącą dla drugiego epitopu docelowego. W szczególnym wykonaniu według wynalazku, drugi epitop docelowy jest receptorem Fc, na przykład, ludzkim FcyRI (CD64) lub ludzkim receptorem Fca (CD89), lub receptorem komórki T, np. CD3. Tak więc bispecyficzne i multispecyficzne cząsteczki są zdolne do wiązania zarówno z komórkami efektorowymi wyrażającymi FcyR, FcaR lub FceR (np. monocytami, makrofagami lub komórkami PMN) i z komórkami docelowymi wyrażającymi CD20. Te cząsteczki bispecyficzne i multispecyficzne kierują komórki wyrażające CD20 do komórek efektorowych i, jak ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku, początkują zależne od receptora Fc aktywności komórek efektorowych, takie jak fagocytoza komórek wyrażających CD20, zależna od przeciwciał cytotoksyczność komórkowa (ADCC), uwalnianie cytokin lub wytwarzanie anionu nadtlenkowego.
Cząsteczki bispecyficzne i multispecyficzne mogą ponadto obejmować trzecią specyficzność wiążącą, dodatkową względem specyficzności wiążącej wobec Fc i specyficzności wiążącej wobec CD20. Trzecia specyficzność wiążąca może być częścią czynnika anty-wzmacniającego (EF, ang. anti-enhancement factor), np. cząsteczką wiążącą się z powierzchnią białka zaangażowanego w aktywność cytotoksyczną i w ten sposób zwiększającą odpowiedź immunologiczną przeciwko komórce docelowej. „Część czynnika anty-wzmacniającego może być przeciwciałem, funkcjonalnym fragmentem przeciwciała lub ligandem wiążącym się z żądaną cząsteczką, np. antygenem lub receptorem, i w ten sposób powodując wzmocnienie efektu determinant wiążących dla receptora Fc lub antygenu komórki docelowej. „Część czynnika anty-wzmacniającego może wiązać receptor Fc lub antygen na komórce docelowej. Alternatywnie, część czynnika anty-wzmacniającego może wiązać się z jednostką różną od tej, do której wiążą się pierwsza i druga specyficzność. Na przykład, część czynnika anty-wzmacniającego może wiązać cytotoksyczne komórki T (np. przez CD2, CD3, CD8, CD28,
PL 218 660 B1
CD4, CD40, ICAM-1 lub inne komórki układu odpornościowego, które prowadzą do zwiększonej odpowiedzi immunologicznej przeciwko komórce docelowej).
W jednym wykonaniu, cząsteczki bispecyficzne i multispecyficzne obejmują jako specyficzność wiążącą co najmniej jedno przeciwciało, włączając np. Fab, Fab', F(ab')2, Fv, lub pojedynczy łańcuch Fv. Przeciwciało może także być dimerem łańcucha lekkiego lub ciężkiego lub jakimkolwiek minimalnym jego fragmentem takim jak Fv lub konstrukt pojedynczego łańcucha jak opisano w Ladner et al. US 4,946,778. Przeciwciało może także być domeną wiążącą fuzji białkowej immunoglobuliny jak przedstawiono w US 2003/0118592 i US 2003/0133939.
W jednym wykonaniu cząsteczki bispecyficzne i multispecyficzne obejmują specyficzność wiążącą dla FcyR i FcaR obecnych na powierzchni komórki efektorowej i drugą specyficzność wiążącą dla antygenu komórki docelowej np. CD20.
W jednym wykonaniu, specyficzność wiążąca dla receptora Fc jest dostarczana przez ludzkie przeciwciało monoklonalne, którego wiązanie nie jest blokowane przez ludzką immunoglobulinę G (IgG). Jak się niniejszym stosuje, termin „receptor IgG odnosi się do każdego z ośmiu genów łańcucha γ na chromosomie 1. Geny te w całości kodują dwanaście transbłonowych lub rozpuszczalnych izoform receptora pogrupowanych w trzy klasy receptorów Fcγ: FcγRI (CD64), FcγRII(CD32) i FcγRIII (CD 16). W jednym korzystnym wykonaniu receptor Fcγ jest ludzkim Fcγ o wysokim powinowactwie.
Wytwarzanie i charakterystykę tych korzystnych przeciwciał monoklonalnych opisał Fanger et al. w WO 88/00052 i US 4,954,617. Te przeciwciała wiążą się z epitopem FcγRI, FcγRII lub FcγRIII w miejscu różnym od miejsca wiązania Fcγ i dlatego ich wiązanie nie jest zasadniczo blokowane przez fizjologiczne stężenia IgG. Specyficznymi przeciwciałami przeciwko FcγRI użytecznymi w rozwiązaniach według wynalazku są mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 i mAb 197. W innych wykonaniach, przeciwciało przeciwko receptorowi Fcγ jest humanizowane z przeciwciała monoklonalnego 22 (H22). Wytwarzanie i określanie charakterystyki przeciwciała H22 zostało opisane w Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 i WO 94/10332. Linia komórkowa wytwarzająca przeciwciało H22 została zdeponowana w American Type Culture Collection 4 listopada 1992 pod oznaczeniem HA022CL1 i ma numer dostępu CRL 11177.
W jeszcze jednym korzystnym wykonaniu, specyficzność wiążąca dla receptora Fc jest dostarczona przez przeciwciało wiążące się z ludzkim receptorem IgA, np. receptorem Fc-alfa (FcaRI (CD89)), którego wiązanie korzystnie nie jest blokowane przez ludzką Immunoglobulinę A (IgA). Określenie „receptor IgA ma na celu objęcie produktu genu jednego genu a (FcaRI) na chromosomie 19. Wiadomo, że ten gen koduje kilka izoform transbłonowych o alternatywnym składaniu intronów o 55 do 110 kDa. FcaRI (CD89) jest konstytutywnie wyrażany na monocytach/makrofagach, granulocytach kwaso- i obojętnochłonnych, ale nie na populacjach komórek nieefektorowych. FcaRI ma średnie powinowactwo do IgA1 i IgA2, które wzrasta po ekspozycji na cytokiny, takie jak G-CSF lub GM-CSF (Morton, H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440). Opisano cztery specyficzne wobec FcaRI przeciwciała monoklonalne, określone jako A3, A59, A62 i A77, które wiążą FcaRI poza domeną wiążącą ligand IgA (Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148:1764).
FcaRI i FcγRI są korzystnymi receptorami wyzwalającymi reakcję do zastosowania w rozwiązaniach według wynalazku, ponieważ są (1) wyrażane pierwotnie na odpornościowych komórkach efektorowych, np. monocytach, PMN, makrofagach i komórkach dendrytycznych; (2) wyrażane na wysokim poziomie (np. 5000-100000 na komórkę); (3) pośrednikami aktywności cytotoksycznych (np. ADCC, fagocytozy); (4) pośredniczą w wzmocnionej prezentacji antygenów włączając antygeny własne.
W innym wykonaniu, cząsteczka bispecyficzna składa się z dwóch ludzkich przeciwciał monoklonalnych według wynalazku, które mają komplementarne aktywności funkcjonalne, tak, że jedno przeciwciało działa głównie przez indukcję CDC, a inne przeciwciało działa głównie przez indukowanie apoptozy, np. 2F2 w kombinacji z 11B8.
W innych wykonaniach, cząsteczki bispecyficzne i multispecyficzne dalej obejmują specyficzności, które rozpoznają, np. wiążą się z antygenem komórki docelowej, np. CD20. W korzystnym wykonaniu, specyficzność wiążąca jest dostarczana przez ludzkie przeciwciało monoklonalne według wynalazku.
„Przeciwciało specyficzne dla komórki efektorowej w znaczeniu tu stosowanym odnosi się do przeciwciała lub funkcjonalnego fragmentu przeciwciała wiążącego receptor Fc komórek efektorowych. Korzystne przeciwciała do zastosowania według wynalazku wiążą receptor Fc komórek docelowych w miejscu, które nie jest wiązane przez endogenne immunoglobuliny.
PL 218 660 B1
W znaczeniu tu stosowanym określenie „komórka efektorowa odnosi się do komórki odpornościowej zaangażowanej w fazę efektorową odpowiedzi immunologicznej, w odróżnieniu od fazy rozpoznawczej i aktywacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Przykładowymi komórkami odpornościowymi są komórki o pochodzeniu szpikowym i limfoidalnym, np. limfocyty (np. komórki B i T, włączając cytolityczne komórki T (CTL), komórki zabójcy, komórki naturalni zabójcy, makrofagi, monocyty, eozynofile, neutrofile, komórki cechujące się różnokształtnością jąder, granulocyty, komórki tuczne i bazofile. Niektóre komórki efektorowe wyrażają specyficzne receptory Fc i wykazują specyficzne funkcje immunologiczne. W korzystnych wykonaniach, komórka efektorowa jest zdolna do indukcji zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej (ADCC), np. neutrofil zdolny do indukcji ADCC. Na przykład, monocyty, makrofagi wyrażające FcR są zaangażowane w specyficzne zabijanie komórek docelowych i prezentowanie antygenów innym składnikom układu odpornościowego, lub wiązanie z komórkami prezentującymi antygeny. W innych wykonaniach, komórka efektorowa może poddawać fagocytozie docelowy antygen, docelową komórkę lub mikroorganizm. Wyrażanie szczególnego FcR na komórce efektorowej może być regulowane przez czynniki humoralne, takie jak cytokiny. Na przykład, stwierdzono, że wyrażanie FcyRI jest zwiększane przez interferon gamma (IFN-γ). Taka wzmocniona ekspresja zwiększa aktywność cytotoksyczną komórek niosących FcγRI skierowaną przeciwko czynnikom docelowym. Komórka efektorowa odpowiada za fagocytozę lub lizę antygenu docelowego lub komórki docelowej.
„Komórka docelowa może oznaczać każdą niepożądaną komórkę osobnika (np. człowieka lub zwierzęcia), w kierunku której można skierować kompozycję (np. ludzkie przeciwciało monoklonalne, cząsteczkę bispecyficzną lub multispecyficzną). W korzystnych wykonaniach, komórka docelowa jest komórką wyrażającą lub nadmiernie wyrażającą CD20. Komórki wyrażające CD20 typowo obejmują komórki B i nowotwory komórek B.
Podczas gdy korzystne są przeciwciała monoklonalne, innymi przeciwciałami, które można zaangażować do cząsteczek bispecyficznych i multi specyficznych są mysie, chimerowe i humanizowane przeciwciała monoklonalne. Takie mysie, chimerowe i humanizowane przeciwciała monoklonalne można przygotować stosując techniki znane w dziedzinie.
Cząsteczki bispecyficzne i multispecyficzne można otrzymać stosując techniki chemiczne (patrz np. D. M. Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807), techniki typu „Polydoma (patrz US 4,474,893, dla Reading), lub techniki rekombinacji DNA.
W szczególności cząsteczki bispecyficzne i multispecyficzne można przygotować przez koniugację ustalonych aktywności wiążących np. specyficzności przeciwko FcR i przeciwko CD20, stosując metody znane w dziedzinie i opisane w dostarczonych niniejszym przykładach. Na przykład, każda specyficzność wiążąca cząsteczki bispecyficznej lub multispecyficznej może zostać wytworzona oddzielnie i następnie sprzężona z inną. Gdy specyficzności wiążące są białkami lub peptydami, można stosować liczne czynniki sieciujące. Przykładami czynników sieciujących są Białko A, karbodiimid, N-sukcynoimidylo-S-acetylotiooctan (SATA), kwas 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoesowy) (DTNB), o-fenylenodimaleimid (oPDM), N-sukcynoimidylo-3-(2-pirydyloditio)propionian (SPDP) i sulfosukcynoimidylo 4-(N-maleimidometylo)-cykloheksano-1-karboksylan (sulfo-SMCC) (patrz np. Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Inne metody obejmują te opisane przez Paulusa (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132); Brennan et al. (Science (1985) 229:81-83), i Glennie et al. (J. Immunol. (1987) 139: 2367-2375). Korzystnymi czynnikami sprzęgającymi są SATA i sulfo-SMCC, oba dostępne z Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Gdy specyficzności wiążące są przeciwciałami, mogą być one sprzęgane za pomocą wiązania sulfhydrylowego C-końcowego regionu zawiasowego dwóch łańcuchów ciężkich. W szczególnie korzystnym wykonaniu, przed koniugacją region zawiasowy modyfikuje się by zawierał nieparzystą, korzystnie jedną, liczbę reszt sulfhydrylowych.
Alternatywnie, obie specyficzności wiążące mogą być kodowane przez ten sam wektor i wyrażane i składane w tej samej komórce gospodarza. Technika ta jest szczególnie korzystna, gdy cząsteczkami bispecyficznymi i multispecyficznymi są mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 lub ligand x fuzja białkowa. Cząsteczką bispecyficzną lub multispecyficzną, np. cząsteczką bispecyficzną według wynalazku, może być cząsteczka jednołańcuchowa, taka jak jednołańcuchowe przeciwciało bispecyficzne, bispecyficzna cząsteczka jednołańcuchowa obejmująca jedno przeciwciało jednołańcuchowe i determinantę wiążącą lub cząsteczkę bispecyficzną obejmującą dwie determinanty wiążące. Cząsteczki bispecyficzne i multispecyficzne mogą także być cząsteczkami jednołańcuchowymi lub mogą obejmować co najmniej dwie cząsteczki jednoniciowe. Sposoby przygotowaPL 218 660 B1 nia cząsteczek bi- i multispecyficznych opisano na przykład, w: US 5,260,203; US 5,455,030; US
4,881,175; US 5,132,405; US 5,091,513; US 5,476,786; US 5,013,653; US 5,258,498; i US
5,482,858.
Wiązanie cząsteczek bispecyficznych i multispecyficznych z ich specyficznymi czynnikami docelowymi można potwierdzić w teście ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay), przez oznaczenie radioimmunologiczne (RIA, ang. radioimmunoassay), analizę FACS, test biologiczny (np. hamowanie wzrostu) lub oznaczenie techniką Western blot. Każde z tych oznaczeń zasadniczo wykrywa obecność będących przedmiotem zainteresowania kompleksów białko-przeciwciało przez wykorzystanie wyznakowanego czynnika (np. przeciwciała) specyficznego wobec tego kompleksu. Na przykład, kompleksy FcR-przeciwciało można wykrywać stosując przeciwciało, lub fragment przeciwciała, sprzężone z enzymem, które rozpoznaje i specyficznie wiąże się z kompleksami FcR-przeciwciało. Alternatywnie, kompleksy można wykrywać stosując którekolwiek z licznych oznaczeń immunologicznych. Na przykład, przeciwciało można znakować radioaktywnie i stosować w oznaczeniu radioimmunologicznym (RIA, patrz na przykład, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, Marzec, 1986). Izotop radioaktywny można wykrywać za pomocą takich środków jak użycie licznika γ lub licznika scyntylacyjnego, albo z zastosowaniem autoradiografii.
IV. Immunokoniugaty
W innym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy ludzkiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko CD20 sprzężonego z grupą terapeutyczną, taką jak cytotoksyna, lek (np. immunosupresor) lub izotop radioaktywny. Takie koniugaty są niniejszym określane jako „immunokoniugaty. Immunokoniugaty obejmujące jedną lub większą liczbę cytotoksyn określa się jako „immunotoksyny. Cytotoksyny lub czynniki cytotoksyczne obejmują każdy czynnik, który jest szkodliwy (np. zabija) dla komórki. Przykłady obejmują taksol, cytochalazynę B, gramicydynę D, bromek etydyny, emetynę, mitomycynę, etopozyd, tenipozyd, winkrystynę, winblastynę, kolchicynę, doksorubicynę, daunorubicynę, dihydroksyantracynodion, mitoksantron, mitramycynę, aktynomycynę D, 1-dehydrotestosteron, glukokortykoidy, prokainę, tetrakainę, lidokainę, propranolol i puromycynę oraz ich analogi i homologi.
Odpowiednie czynniki terapeutyczne do tworzenia immunokoniugatów według wynalazku obejmują, ale nie ograniczają się do antymetabolitów (np. metotreksat, 6-merkaptopuryna, 6-tioguanina, cytarabina, fludarabina, 5-fluorouracyl, dekarbazyna), czynników alkilujących (np. mechloroetamina, thioepa chlorambucyl, melfalan, karmustyna (BSNU) i lomustyna (CCNU), cyklofosfamid, busulfan, dibromomannitol, streptozotocyna, mitomycyna C, oraz cis-dichlorodiaminoplatyna (II) (DDP), cisplatyna), antracyklin (np. daunorubicyna (dawniej daunomycyna) i doksorubicyna), antyblotyków (np. daktynomycyna (dawniej aktynomycyna), bleomycyna, mitramycyna i antramycyna (AMC)), oraz czynników przeciwmitotycznych (np. winkrystyna i winblastyna). W korzystnym wykonaniu, czynnik terapeutyczny jest czynnikiem cytotoksycznym lub czynnikiem radiotoksycznym. W innym wykonaniu, czynnik terapeutyczny jest immunosupresorem. W jeszcze innym wykonaniu, czynnik terapeutyczny stanowi GM-CSF. W korzystnym wykonaniu, czynnik terapeutyczny jest doksorubicyną, cisplatyną, bleomycyną, siarczanem, karmustyną, chlorabucylem, cyklofosfamidem lub rycyną A.
Przeciwciała według wynalazku także mogą być sprzęgane z izotopem radioaktywnym, np. jodem 131, itrem 90, indem 111, aby otrzymać radiofarmaceutyki cytotoksyczne do leczenia chorób związanych z CD20, takich jak rak. Koniugaty przeciwciał według wynalazku można stosować do modyfikacji określonej odpowiedzi biologicznej i lecznicza grupa funkcyjna powinna być opracowana w sposób nie ograniczony do klasycznych czynników terapeutycznych. Na przykład, grupa terapeutyczna może być białkiem lub polipeptydem o pożądanej aktywności biologicznej. Takie białka mogą obejmować, na przykład, toksyny aktywne enzymatycznie lub ich fragmenty aktywne, takie jak abryna, rycyna A, egzotoksyna Pseudomonas, toksyna dyfterytu; białko, takie jak czynnik martwicy nowotworu lub interferon-γ; lub czynniki modyfikujące odpowiedź biologiczną, takie jak limfokiny, interleukina-1 („IL-1), interleukina-2 („IL-2), interleukina-6 („IL-6), czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów („GM-CSF), czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów („G-CSF), lub inne czynniki wzrostowe.
Techniki koniugacji takich grup terapeutycznych z przeciwciałami są dobrze znane, patrz, np. Arnon et al., „Monoclonal Antibodies For Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy, w Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (red.), str. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., „Antibodies For Drug Delivery, w Controlled Drug Delivery (Wyd. 2), Robinson et al. (eds.), str. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, „Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer The30
PL 218 660 B1 rapy: A Review, w Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pinchera et al. (Red.), str. 475-506 (1985); „Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy, w Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (red.), str. 303-16 (Academic Press 1985) i Thorpe et al., „The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates, Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).
W dalszym wykonaniu, ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku są związane z linkerem-chelatorem, np. tiuksetanem, co pozwala na sprzężenie przeciwciała z izotopem radioaktywnym.
V. Kompozycje farmaceutyczne
W innym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza kompozycji, np. kompozycji farmaceutycznej, zawierającej jeden lub kombinację ludzkich przeciwciał monoklonalnych według wynalazku. Kompozycje farmaceutyczne można formułować z nośnikami lub rozcieńczalnikami dopuszczalnymi farmaceutycznie, jak też z jakimikolwiek znanymi adiuwantami i zaróbkami zgodnie z konwencjonalnymi technikami, takimi jaki te ujawnione w The Science and Practice of Pharmacy, Wyd. 19, Gennaro, red., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. W jednym wykonaniu, kompozycja obejmuje kombinacje licznych (np. dwóch lub więcej) izolowanych ludzkich przeciwciał według wynalazku, działających za pomocą różnych mechanizmów, np. jedno przeciwciało działa przede wszystkim przez indukcję CDC w kombinacji z innym przeciwciałem, które działa przede wszystkim poprzez indukcje apoptozy.
Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można także podawać w leczeniu kombinowanym, tj. w kombinacji z innymi czynnikami. Na przykład, leczenie kombinowane może obejmować kompozycję według wynalazku z co najmniej jednym czynnikiem przeciwzapalnym lub co najmniej jednym czynnikiem immunosupresyjnym. W jednym wykonaniu, takie czynniki terapeutyczne obejmują jeden lub większą liczbę czynników przeciwzapalnych, takich jak leki steroidowe lub NSAID (niesteroidowe leki przeciwzapalne, ang. nonsteroidal anti-inflammatory drug). Korzystne czynniki obejmują, na przykład, aspirynę i inne salicylany, inhibitory Cox-2, takie jak rofekoksib (Vioxx) i celekoksib (Celebrex), NSAID, takie jak ibuprofen (Motrin, Advil), fenoprofen (Nalfon), naproksen (Naprosyn), sulindak (Clinoril), diklofenak (Voltaren), piroksikam (Feldene), ketoprofen (Orudis), diflunisal (Dolobid), nabumeton (Relafen), etodolak (Lodine), oksaprozyna (Daypro) i indometacyna (Indocin).
W innym wykonaniu, takie czynniki terapeutyczne obejmują jeden lub więcej DMARD, takich jak: metotreksat (Rheumatrex), hydroksychlorochina (Plaquenil), sulfasalazyna (Asulfidine), inhibitory syntezy pirymidyny, np. leflunomid (Arava), czynniki blokujące receptor IL-1 np., anakinra (Kineret), oraz czynniki blokujące TNF-α np. etanercept (Enbrel), infliximab (Remicade) i adalimumab.
W innym wykonaniu, takie czynniki terapeutyczne obejmują jeden lub większą liczbę czynników immunosupresyjnych, takich jak cyklosporyna (Sandimmune, Neoral) i azatiopiryna (Imural).
W jeszcze innym wykonaniu, takie czynniki terapeutyczne obejmują jeden lub większą liczbę czynników chemioterapeutycznych, takich jak doksorubicina (Adriamycin), cisplatyna (Platinol), bleomycyna (Blenoxane), karmustyna (Gliadel), cyklofosfamid (Cytoxan, Procytox, Neosar) oraz chlorambucyl (Leukeran).
W innym wykonaniu, ludzkie przeciwciała według wynalazku można podawać w kombinacji z chlorambucylem i prednizonem; cyklofosfamidem i prednizonem; cyklofosfamidem, winkrystyną i prednizonem; cyklofosfamidem, winkrystyną, doksorubicyną i prednizonem; fludrabiną i antracykliną; lub w kombinacji z innymi powszechnie stosowanymi schematami wielolekowymi dla NHL, jak opisano np. w Non-Hodgkin's Lymphomas: Making sense of Diagnosis, Treatment, and Options, Lorraine Johnston, 1999, O'Reilly and Associates, Inc.
W jeszcze innym wykonaniu, ludzkie przeciwciała można podawać w połączeniu z radioterapią i/lub autologicznymi obwodowymi komórkami macierzystymi lub transplantacją szpiku kostnego.
W jeszcze innym wykonaniu, ludzkie przeciwciała można podawać w kombinacji z jednym lub większą liczbą przeciwciał wybranych spośród przeciwciał przeciwko CD25, przeciwciał przeciwko CD 19, przeciwciał przeciwko CD21, przeciwciał przeciwko CD22, przeciwciał przeciwko CD37, przeciwciał przeciwko CD38, przeciwciał przeciwko IL6R, przeciwciał przeciwko IL8, przeciwciał przeciwko IL15, przeciwciał przeciwko IL15R, przeciwciał przeciwko CD4, przeciwciał przeciwko CD11a, (np. efalizumab), przeciwciał przeciwko alfa-4/beta-1 integrynie (VLA4) (np. natalizumab) i CTLA4-Ig.
W innym szczególnym wykonaniu, ludzkie przeciwciała można podawać w kombinacji z przeciwciałem przeciwko CD25 do leczenia pemfigoidu pęcherzowego, np. u pacjentów z reakcją przeszczep-przeciwko-gospodarzowi.
PL 218 660 B1
W innym szczególnym wykonaniu, ludzkie przeciwciała monoklonalne podaje się z jednym lub większą liczbą przeciwciał wybranych spośród przeciwciał przeciwko CD19, przeciwciał przeciwko CD21, przeciwciał przeciwko CD22, przeciwciał przeciwko CD37, przeciwciał przeciwko CD38 do leczenia chorób złośliwych.
W jeszcze innym szczególnym wykonaniu, ludzkie przeciwciała podaje się w kombinacji z jednym lub większą liczbą przeciwciał wybranych spośród przeciwciał przeciwko IL6R, przeciwciał przeciwko IL8, przeciwciał przeciwko IL15, przeciwciał przeciwko IL15R, przeciwciał przeciwko CD4, przeciwciał przeciwko CD11a, (np. efalizumab), przeciwciał przeciw-alfa-4/beta-1 integrynie (VLA4) (np. natalizumab) i CTLA4-Ig do leczenia chorób zapalnych.
W jeszcze dalszym wykonaniu, ludzkie przeciwciała można podawać w kombinacji z przeciwciałem przeciwko C3b(i) w celu wzmocnienia aktywacji dopełniacza.
W znaczeniu tu stosowanym określenie „nośnik dopuszczalny farmaceutycznie obejmuje jakikolwiek i wszystkie rozpuszczalniki, środki dyspersyjne, środki powlekające, czynniki antybakteryjne i przeciwgrzybicze, czynniki izotoniczne i opóźniające absorpcję i tym podobne, które są zgodne fizjologicznie. Korzystnie, nośnik jest odpowiedni do podania dożylnego, domięśniowego, podskórnego, pozajelitowo, do kręgosłupa lub śródskórnego (np. poprzez wstrzyknięcie lub infuzję). Zależnie od drogi podania, składnik aktywny, tj. przeciwciało, cząsteczka bispecyficzna lub multispecyficzna, mogą być opłaszczone materiałem chroniącym składnik przed działaniem kwasów i innych warunków naturalnych mogących inaktywować składnik.
„Farmaceutycznie dopuszczalna sól odnosi się do soli, która zachowuje aktywność biologiczną macierzystego składnika i nie powoduje żadnych niepożądanych efektów toksykologicznych (patrz np. Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Przykłady takich soli obejmują sole kwasowe i zasadowe. Sole addycyjne z kwasem obejmują te, otrzymane z nietoksycznych kwasów nieorganicznych, takich jak chlorowodorowy, azotowy, fosforowy, siarkowy, bromowodorowy, jodowodorowy, fosforawy i tym podobne, jak też od nietoksycznych kwasów organicznych, takich jak kwasy alifatyczne mono i dikarboksylowe, podstawione resztą fenylową kwasy alkanowe, kwasy hydroksyalkanowe, kwasy aromatyczne, alifatyczne i aromatyczne kwasy sulfonowe. Kwasy addycyjne z zasadą obejmują te, otrzymane z metali ziem alkalicznych, takich jak sód, potas, magnez, wapń i podobne, jak też z nietoksycznych amin organicznych, takich jak N,N'-dibenzyloetylenodiamina, N-metyloglukamina, chloroprokaina, cholina, dietanoloamina, etylenodiamina, prokaina i podobne.
Kompozycję według wynalazku można podawać stosując liczne metody znane w dziedzinie. Docenione zostanie przez specjalistę w dziedzinie, że droga i/lub sposób podawania będzie się różnił w zależności od pożądanych rezultatów. Składniki aktywne można preparować z nośnikami, które chronią składnik przed szybkim uwalnianiem, w preparaty o kontrolowanym uwalnianiu, włączając implanty, plastry przezskórne i systemy dostarczania będące mikrokapsułkami. Można stosować polimery biodegradowalne i biokompatybilne, takie jak etylen - octan winylu, polibezwodniki, kwas poliglikolowy, kolagen, poliortoestry i kwas polimlekowy. Sposoby wytwarzania takich preparatów są ogólnie znane specjalistom w dziedzinie. Patrz np. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, red., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
Aby podać składnik według wynalazku wybraną drogą podawania, konieczne może być opłaszczanie związku lub jednoczesne podawanie związku z materiałem zapobiegającym jego inaktywacji. Na przykład, związek można podawać osobnikowi w odpowiednim nośniku, na przykład, liposomach lub rozcieńczalniku. Rozcieńczalniki dopuszczalne farmaceutycznie obejmują sól fizjologiczną i wodne buforowane roztwory. Liposomy obejmują emulsje woda-w-oleju-w-wodzie CGF, jak też konwencjonalne liposomy (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).
Nośniki dopuszczalne farmaceutycznie obejmują sterylne roztwory wodne lub dyspersje oraz sterylne proszki do późniejszego przygotowania sterylnych roztworów lub dyspersji do zastrzyków. Wykorzystanie takich środków i czynników do substancji farmaceutycznie czynnych jest znane w dziedzinie. Rozważane jest zastosowanie dowolnego konwencjonalnego środka lub czynnika w kompozycjach farmaceutycznych, z wyjątkiem tych niekompatybilnych ze związkiem aktywnym. Uzupełniające związki aktywne można także włączyć do kompozycji.
Kompozycje terapeutyczne, typowo muszą być sterylne i stabilne w warunkach wytwarzania i przechowywania. Kompozycję można formułować jako roztwór, mikroemulsję, liposom lub inną uporządkowaną strukturę odpowiednią dla dużych stężeń leku. Nośnik może być rozpuszczalnikiem lub środkiem dyspergującym zawierającym na przykład, wodę, etanol, poliol (na przykład glicerol, glikol propylenowy i ciekły glikol polietylenowy i podobne) i stosowne ich mieszaniny. Odpowiednią płynność
PL 218 660 B1 można utrzymać przez, na przykład, zastosowanie czynników powlekających, takich jak lecytyna, przez utrzymanie odpowiedniego rozmiaru cząstki w przypadku dyspersji i przez zastosowanie środków powierzchniowo czynnych. W wielu przypadkach korzystne będzie włączenie do kompozycji czynników izotonicznych, na przykład, cukrów, polialkoholi, takich jak mannitol, sorbitol lub chlorku sodu. Przedłużoną absorpcję kompozycji do zastrzyków można uzyskać przez włączenie do kompozycji czynnika opóźniającego absorpcję, na przykład, soli monostearynianowych i żelatyny.
Sterylne roztwory do zastrzyków można przygotowywać przez włączanie składnika aktywnego, w wymaganej ilości, do odpowiedniego rozpuszczalnika z jednym lub kombinacją wyżej wymienionych składników, w zależności od potrzeb, a następnie sterylizować przez mikrofiltrację. Ogólnie, dyspersje przygotowuje się przez włączanie składnika aktywnego do sterylnego nośnika zawierającego podstawowy środek dyspergujący i inne wymagane składniki spośród wymienionych wyżej. W przypadku sterylnych proszków do przygotowania sterylnych roztworów do zastrzyków, korzystnymi sposobami przygotowywania są suszenie próżniowe i suszenie przez zamrażanie (liofilizacja), dzięki czemu uzyskuje się proszek z aktywnym składnikiem i jakimkolwiek pożądanym dodatkowym składnikiem z roztworu wcześniej sterylizowanego przez filtrację.
Schematy dawkowania są dostosowane tak, aby osiągnąć optymalną pożądaną odpowiedź (np. odpowiedź terapeutyczną. Na przykład, można podać pojedynczy bolus, można podać kilka dawek podzielonych w pewnym czasie lub dawkę można proporcjonalnie zmniejszać lub zwiększać zgodnie ze wskazaniami zaistniałej sytuacji terapeutycznej. Szczególnie korzystne jest formułowanie kompozycji pozajelitowych w postaci dawki jednostkowej w celu ułatwienia podawania i zapewnienia jednorodności dawkowania. Postać dawki jednostkowej, w znaczeniu tu stosowanym, odnosi się do fizycznie rozdzielonych jednostek, dopasowanych jako dawki jednostkowe dla leczonego osobnika; każda jednostka zawiera wcześniej ustaloną ilość składnika aktywnego obliczoną tak, aby dawała pożądany efekt terapeutyczny w połączeniu z wymaganym nośnikiem farmaceutycznym. Właściwości form dawek jednostkowych według wynalazku wynikają z i są bezpośrednio zależne od (a) unikalnej charakterystyki składnika aktywnego i szczególnego efektu terapeutycznego, który ma zostać osiągnięty i (b) ograniczeń wynikających z dziedziny łączenia takich jak składników aktywnych do leczenia wrażliwości u osobników.
Przykłady farmaceutycznie dopuszczalnych przeciwutleniaczy obejmują (1) przeciwutleniacze rozpuszczalne w wodzie, takie jak kwas askorbinowy, chlorowodorek cysteiny, disiarczan sodu, pirosiarczyn sodu, siarczyn sodu i podobne; (2) przeciwutleniacze rozpuszczalne, takie jak palmitynian askorbylowy, hydroksyanizol butylowany (BHA), hydroksytoluen butylowany (BHT), lecytyna, galusan propylu, alfa-tokoferol i tym podobne, oraz (3) czynniki chelatujące metale, takie jak kwas cytrynowy, EDTA, sorbitol, kwas winowy, kwas fosforowy i tym podobne.
Jako kompozycje terapeutyczne, preparaty według wynalazku obejmują te odpowiednie do podawania doustnego, donosowego, miejscowego (włączając dopoliczkowe i podjęzykowe), doodbytniczego, dopochwowego i/lub pozajelitowego. Preparaty mogą występować w wygodnej postaci dawki jednostkowej i można je przygotowywać którąkolwiek z metod znanych w dziedzinie farmacji. Ilość składnika aktywnego, który można łączyć z materiałem nośnika z wytworzeniem pojedynczej postaci dawkowania, będzie się różniła w zależności od leczonego osobnika i szczególnego sposobu podawania. Ilość składnika aktywnego, który można łączyć z materiałem nośnika z wytworzeniem pojedynczej postaci dawkowania ogólnie będzie ilością kompozycji dającą efekt terapeutyczny. Zasadniczo, ze stu procent, ilość ta będzie się zawierać od 0,01 procent do około dziewięćdziesięciu dziewięciu procent składnika aktywnego, korzystnie od około 0,1 procent do około 70 procent, bardziej korzystnie od około 1 procenta do około 30 procent.
Preparaty według wynalazku odpowiednie do podawania dopochwowego także obejmują krążki maciczne, tampony, kremy, żele, pasty, pianki lub rozpylacze zawierające odpowiednie nośniki znane w dziedzinie. Postacie dawkowania do miejscowego lub przezskórnego podawania kompozycji według wynalazku obejmują pudry, rozpylacze, maści, pasty, kremy, lotiony, żele roztwory, plastry i inhalatory. Składnik aktywny można mieszać w warunkach sterylnych z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem i z wymaganymi konserwantami, buforami lub propelentami.
Określenia „podawanie pozajelitowe i „podawano pozajelitowo w znaczeniu tu stosowanym oznaczają sposoby podawania inne niż dojelitowe i miejscowe, zwykle poprzez zastrzyki i obejmują, bez ograniczeń, zastrzyki i infuzje dożylne, domięśniowe, dotętnicze, dooponowe, wewnątrztorebkowe, wewnątrzgałkowe, dosercowe, śródskórne, wewnątrzotrzewnowe, przeztchawicze, podskórne,
PL 218 660 B1 podnaskórkowe, wewnątrzprzedsionkowe, podtorebkowe, podpajęczynówkowe, wewnątrzkanałowe, nadtwardówkowe i wewnątrzmostkowe.
Przykładami odpowiednich nośników wodnych i niewodnych, które można wykorzystać w kompozycjach farmaceutycznych według wynalazku są woda, etanol, poliole (takie jak glicerol, glikol propylenowy i podobne) i odpowiednie ich mieszaniny, oleje roślinne, takie jak oliwa z oliwek i nadające się do zastrzyków estry organiczne, takie jak oleinian etylu. Odpowiednią płynność można utrzymać, na przykład, przez zastosowanie materiałów powlekających, takich jak lecytyna, zachowanie odpowiedniego rozmiaru cząstki w przypadku dyspersji i zastosowanie substancji powierzchniowo czynnych.
Kompozycje takie mogą także zawierać adiuwanty, takie jak konserwanty, czynniki zwilżające, czynniki emulgujące i czynniki dyspersyjne. Zapobieganie obecności mikroorganizmów można zapewnić zarówno poprzez procedury sterylizacji (wyżej), jak i przez włączenie różnych czynników przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybiczych, na przykład, parabenu, chlorobutanolu, fenolu, kwasu sorbinowego i podobnych. Pożądane również może być włączenie do kompozycji czynników izotonicznych, takich jak cukry, chlorek sodu i podobne. Dodatkowo, przedłużoną absorpcję kompozycji do zastrzyków można uzyskać przez włączenie do kompozycji czynnika opóźniającego absorpcję, na przykład, soli monostearynianowych i żelatyny.
W jednym wykonaniu ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku podaje się w formie krystalicznej przez zastrzyk podskórny Yang et al. (2003) PNAS, 100(12):693-6939.
Gdy składniki według wynalazku podaje się jako środki farmaceutyczne, ludziom lub zwierzętom, można je podawać same albo jako kompozycję farmaceutyczną zawierającą na przykład 0,01 do 99,5% (bardziej korzystnie 0,1 do 90%) składnika aktywnego w kombinacji z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
Niezależnie od wybranej drogi podania, związki według wynalazku, które można stosować w odpowiedniej postaci uwodnionej, i/lub kompozycje farmaceutyczne według wynalazku formułuje się w dopuszczalnych farmaceutycznie postaciach dawkowania konwencjonalnymi metodami znanymi specjalistom w dziedzinie.
Rzeczywiste poziomy dawkowania składników aktywnych w kompozycjach farmaceutycznych mogą się różnić tak, aby otrzymać ilość składnika aktywnego, która jest skuteczna w osiąganiu pożądanej odpowiedzi terapeutycznej dla konkretnego pacjenta, kompozycji, sposobu podawania, jednocześnie nie będąc toksyczną dla pacjenta. Wybrany poziom dawkowania zależał będzie od licznych czynników farmakokinetycznych, włączając aktywność szczególnej stosowanej kompozycji według wynalazku, rodzaj stosowanego estru, soli lub amidu, drogę podawania, czas podawania, szybkość wydalania szczególnego stosowanego związku, czas trwania leczenia, stosowanie innych leków, składniki i/lub materiały stosowane w kombinacji ze szczególnym stosowanym związkiem, wiek, płeć, masę, kondycję, ogólny stan zdrowia i wcześniejszą historię choroby leczonego pacjenta i podobnych czynników dobrze znanych w dziedzinie medycyny.
Lekarz lub weterynarz o podstawowych umiejętnościach w dziedzinie może łatwo ustalić i zalecić efektywną ilość wymaganej kompozycji farmaceutycznej. Na przykład, lekarz lub weterynarz może zacząć dawkowanie stosowanych związków według wynalazku w kompozycji farmaceutycznej na poziomie niższym niż wymagany do uzyskania pożądanego efektu terapeutycznego i stopniowo zwiększać dawkowanie do osiągnięcia pożądanego efektu. Ogólnie, odpowiednią dawką dobową kompozycji według wynalazku będzie taka ilość składnika, która jest najniższą dawką skuteczną do uzyskania efektu terapeutycznego. Taka efektywna dawka będzie ogólnie zależeć od wyżej opisanych czynników. Korzystne jest podawanie dożylnie, domięśniowe, dootrzewnowe, lub podskórne, korzystnie podane blisko miejsca docelowego. Jeśli jest to pożądane, efektywną dawkę dzienną można podawać jako dwie, trzy, cztery, pięć, sześć lub więcej poddawek podawanych oddzielnie w odpowiednich odstępach w ciągu dnia, ewentualnie w postaci dawek jednostkowych. Podczas gdy możliwe jest podawanie samego składnika według wynalazku, korzystne jest podawanie składnika jako preparatu farmaceutycznego (kompozycji).
W jednym wykonaniu, ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku można podawać przez infuzję w dawkach tygodniowych 10 do 500 mg/m2, np. 200 do 400 mg/m2. Takie podawanie można powtarzać np. 1 do 8 razy, tak jak 3 do 5 razy. Podawanie można prowadzić przez stałą infuzję przez czas od 2 do 24 godzin, np. od 2 do 12 godzin.
PL 218 660 B1
W innym wykonaniu, ludzkie przeciwciała monoklonalne podaje się przez powolną stałą infuzję przez długi okres, na przykład przez więcej niż 24 godziny, w celu zmniejszenia toksycznych działań ubocznych.
W jeszcze innym wykonaniu ludzkie przeciwciała monoklonalne podaje się w tygodniowych dawkach od 250 mg do 2000 mg, na przykład, 300 mg, 500 mg, 700 mg, 1000 mg, 1500 mg lub 2000 mg aż do 8 razy, np. 4 do 6 razy. Podawanie można prowadzić przez stałą infuzję przez czas od 2 do 24 godzin, np. od 2 do 12 godzin. Taki schemat dawkowania można powtórzyć raz lub więcej razy jeśli to potrzebne, na przykład, po 6 lub 12 miesiącach. Dawkowanie można ustalić lub dostosować przez pomiar ilości krążących przeciwciał monoklonalnych przeciwko CD20 po podaniu w próbce biologicznej poprzez zastosowanie przeciwciał antyidiotypowych, skierowanych na przeciwciała przeciwko CD20.
W jeszcze innym wykonaniu, ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku podaje się w terapii podtrzymującej, jak np. raz w tygodniu przez okres 6 miesięcy lub dłużej.
W jeszcze innym wykonaniu, ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku można podawać stosując schemat obejmujący jedną infuzję ludzkiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko CD20, po której następuje infuzja ludzkiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko CD20 sprzężonego z izotopem radioaktywnym. Schemat można powtórzyć np. 7 do 9 dni później.
Kompozycje farmaceutyczne można podawać za pomocą urządzeń medycznych znanych w dziedzinie. Na przykład, w korzystnym wykonaniu, kompozycję terapeutyczną według wynalazku można podawać za pomocą bezigłowego urządzenia do zastrzyków podskórnych, jak urządzenia ujawnione w US 5,399,163; US 5,383,851; US 5,312,335; US 5,064,413; US 4,941,880; US 4,790,824; lub US 4,596,556. Przykłady dobrze znanych implantów i modułów użytecznych w niniejszym wynalazku obejmują: US 4,487,603, który ujawnia implantowaną pompę do mikroinfuzji do rozprowadzania leku w kontrolowanym tempie; US 4,486,194, ujawniający urządzenie terapeutyczne do podawania leków przez skórę; US 4,447,233, ujawniający pompę infuzyjną do dostarczania leku w precyzyjnym tempie infuzji; US 4,447,224 ujawniający implantowany aparat do infuzji o zmiennym przepływie do stałego dostarczania leku; US 4,439,196, ujawniający osmotyczny system dostarczania leku mający przedziały wielokomorowe i US 4,475,196, ujawniający osmotyczny system dostarczania leku. Wiele innych takich implantów, systemów dostarczania i modułów jest znane specjalistom w dziedzinie.
W pewnych wykonaniach, ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku można formułować by zapewnić prawidłową dystrybucję in vivo. Na przykład, bariera krew-mózg (BBB, ang. bloodbrain barrier) wyklucza wiele składników wysoce hydrofilowych. Aby zapewnić, że czynniki terapeutyczne według wynalazku przekroczą BBB (jeśli zajdzie taka potrzeba), można je formułować, na przykład, w liposomach. Metody wytwarzania liposomów opisano np. w US 4,522,811; US 5,374,548; i US 5,399,331. Liposomy mogą obejmować jedną lub większą liczbę związków, które są wybiórczo transportowane do specyficznych komórek lub narządów, aby w ten sposób wzmocnić dostarczanie leku (patrz np. V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Przykładowe związki kierujące obejmują foliany lub biotynę (patrz, np. US 5,416,016 na rzecz Low et al.); mannozydy (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); przeciwciała (P.G Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor powierzchniowy białka A (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134), którego różne rodzaje mogą obejmować preparaty według wynalazku, jak też składowe cząsteczek według wynalazku; p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); patrz także K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273. W jednym wykonaniu wynalazku, składniki terapeutyczne według wynalazku formułuje się w liposomach; w bardziej korzystnym wykonaniu, liposomy zawierają związek kierujący. W najkorzystniejszym wykonaniu, składniki terapeutyczne w liposomach dostarcza się w bolusie do miejsca bliskiego pożądanemu obszarowi, np. miejscu stanu zapalnego lub infekcji albo miejscu nowotworu. Kompozycja musi być płynna w stopniu, który umożliwia posługiwanie się strzykawką. Musi ona być stabilna w warunkach wytwarzania i przechowywania oraz musi być chroniona przed działaniami zanieczyszczającymi mikroorganizmów, takich jak bakterie i grzyby.
W dalszym wykonaniu, ludzkie przeciwciała monoklonalne według wynalazku można formułować tak, aby zapobiec lub zredukować ich transport przez łożysko. Można to osiągnąć technikami znanymi w dziedzinie, np. przez PEGylację przeciwciał lub zastosowanie fragmentów F(ab')2. Można poczynić dalsze odniesienia do „Cunningham-Rundles C, Zhuo Z, Griffith B, Keenan J. (1992) BiologiPL 218 660 B1 cal activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates. Resistance to enzymatic degradation. J Immunol Methods. 152:177-190 i do „Landor M. (1995) Maternal-fetal transfer of immunoglobulins, Ann Allergy Asthma Immunol 74:279-283. Jest to szczególnie odpowiednie gdy przeciwciała stosuje się do leczenia lub zapobiegania powtarzalnym spontanicznym poronieniom.
„Terapeutycznie skuteczne dawkowanie do leczenia nowotworów można mierzyć przez obiektywne odpowiedzi nowotworu, które mogą być albo całkowite albo częściowe. Odpowiedź całkowitą (CR, ang. complete response) definiuje się jako brak klinicznych, radiologicznych czy innych dowodów choroby. Odpowiedź częściowa (PR, ang. partial response) jest wynikiem większej niż 50% redukcji całkowitej masy nowotworu. Mediana czasu postępu jest miarą charakteryzującą trwałość przedmiotowej odpowiedzi nowotworu.
„Terapeutycznie skuteczne dawkowanie do leczenia nowotworów można także mierzyć przez jego zdolność do stabilizacji postępu choroby. Zdolność składnika do hamowania raka można oceniać w modelowym systemie zwierzęcym pozwalającym na przewidywanie wydajności dla nowotworów ludzkich. Alternatywnie, tę właściwość kompozycji można ocenić przez badanie zdolności składnika do hamowania wzrostu komórek lub apoptozy poprzez oznaczenia in vitro znane specjaliście w dziedzinie. Efektywna terapeutycznie ilość składnika terapeutycznego może zmniejszać rozmiar nowotworu lub w inny sposób usuwać objawy u osobnika. Specjalista w dziedzinie zdolny będzie do ustalenia takiej ilości w oparciu o czynniki, takie jak rozmiar osobnika i ciężkość objawów osobnika oraz szczególną kompozycję i wybraną drogę podawania.
„Terapeutycznie skuteczne dawkowanie dla reumatoidalnego zapalenia stawów, korzystnie będzie prowadzić do Wstępnej Definicji Poprawy Stanu ACR20 (ang. ACR20 Preliminary Definition of Improvement) u pacjentów, bardziej korzystnie do Wstępnej Definicji Poprawy Stanu ACR50 (ang. ACR50 Preliminary Definition of Improvement), a nawet bardziej korzystnie do Wstępnej Definicji Poprawy Stanu ARC70 (ang. Preliminary Definition of Improvement ARC 70).
Wstępną Definicję Poprawy Stanu ACR20 definiuje się jako: > 20% poprawę w Zliczaniu Tkliwych Stawów (TCJ) (ang. Tender Joint Count) i Zliczaniu Spuchniętych Stawów (SWJ) (ang. Swollen Joint Count) i > 20% poprawę w 3 spośród 5 testów: Ocena Bólu przez Pacjenta (VAS) (ang. Patient Pain Assessment), Ogólna Ocena Pacjenta (VAS) (ang. Patient Global Assessment), Ogólna Ocena Lekarza (VAS) (ang. Physician Global Assessment), Samoocena Niepełnosprawności Pacjenta (HAQ) (ang. Patent Self-Assessed Disability), Reakcja Ostrej Fazy (CRP lub ESR) (ang. Acute Phase Reactant).
ACR50 i ACR70 definiuje się w taki sam sposób zakładając odpowiednio > 50% i > 70% poprawę. Dalsze szczegóły można znaleźć w Felson et al., American College of Rheumatology Preliminary Definition of Improvement in Rheumatoid Arthritis; Arthritis Rheumatism (1995) 38: 727-735.
Kompozycja musi być sterylna i ciekła w stopniu umożliwiającym dostarczenie kompozycji w strzykawce. Jako dodatek do wody, nośnik może być izotonicznym buforowanym roztworem soli fizjologicznej, etanolem, poliolem (na przykład, glicerolem, glikolem propylenowym i ciekłym glikolem polietylenowym i tym podobnymi) i odpowiednimi ich mieszaninami. Odpowiednią płynność można utrzymać, na przykład, przez zastosowanie materiałów powlekających, takich jak lecytyna, przez zachowanie odpowiedniego rozmiaru cząstki w przypadku dyspersji i przez zastosowanie substancji powierzchniowo czynnych. W wielu przypadkach korzystne jest włączenie do kompozycji czynników izotonicznych, na przykład cukrów, polialkoholi, takich jak mannitol lub sorbitol oraz chlorku sodu. Przedłużoną absorpcję kompozycji do zastrzyków można osiągnąć poprzez włączenie do kompozycji czynnika opóźniającego absorpcję, na przykład, monostearynianu glinu lub żelatyny.
Gdy składnik aktywny jest odpowiednio chroniony, jak opisano wyżej, składnik można podawać doustnie, na przykład, z obojętnym rozcieńczalnikiem lub przyswajalnym jadalnym nośnikiem.
VI. Zastosowania i techniki według wynalazku
Ludzkie przeciwciała (włączając immunokoniugaty, czynniki bispecyficzne, kompozycje według wynalazku i inne czynniki niniejszym opisane pochodne) mają liczne zastosowania terapeutyczne i diagnostyczne in vitro i in vivo, włączając diagnostykę i leczenie zaburzeń, w których występują komórki wyrażające CD20. Na przykład, przeciwciała można podawać do hodowli komórkowych np. in vitro lub ex vivo, lub osobnikom ludzkim, np. in vivo, aby leczyć, zapobiegać i diagnozować liczne schorzenia. W znaczeniu tu stosowanym termin „osobnik ma na celu obejmować człowieka i zwierzęta inne niż człowiek odpowiadające na ludzkie przeciwciała przeciwko CD20. Korzystne osobniki obejmują ludzkich pacjentów z zaburzeniami, które można skorygować lub złagodzić przez hamowanie lub kontrolowanie komórek B (normalnych lub złośliwych).
PL 218 660 B1
Na przykład, w jednym wykonaniu, ludzkie przeciwciała według wynalazku można stosować do leczenia osobnika z chorobą nowotworową, np. chorobą charakteryzującą się obecnością komórek nowotworowych wyrażających CD20, włączając, na przykład, chłoniaka z komórek B, np. NHL. Przykłady chorób nowotworowych, które można leczyć lub im zapobiegać obejmują chłoniaka z komórek B, np. NHL, włączając białaczkę/chłoniaka limfoblastycznego prekursorów komórek B i nowotwory dojrzałych komórek B, takie jak przewlekła białaczka limfoblastyczna z komórek B (CLL, ang. Chronic lymphoblastic leukemia)/ mały chłoniak limfocytarny (SLL, ang. small lymphocytic lymphoma), białaczka prolimfatyczna z komórek B, chłoniak limfoplazmatyczny, chłoniak komórek płaszcza (MCL, ang. mantle cell lymphoma), chłoniak grudkowy (FL, ang. follicular lymphoma), włączając niski średni i duży FL, skórny chłoniak centralny grudkowy, chłoniak strefy brzeżnej cewy nerwowej z komórek B (typu MALT, typu węzłowego i typu śledzionowego), białaczka włochatokomórkowa, rozproszony chłoniak dużych komórek B, chłoniak Burkitta, szpiczak, szpiczak mnogi, potransplantacyjna choroba limfoproliferacyjna, makroglobulinemia Waldenstroma i anaplastyczny chłoniak dużych komórek (ALCL, ang. anaplastic large-cell lymphoma).
Dalszymi przykładami chłoniaków nieziarniczych są granulocytoza podobna do chłoniaka, pierwotny chłoniak wysiękowy, wewnątrzżylny chłoniak dużych komórek B, śródpiersiowy chłoniak dużych komórek, choroby łańcuchów ciężkich (włączając choroby γ, μ i δ), chłoniaki indukowane leczeniem czynnikami immunosupresyjnymi, takie jak chłoniak indukowany cyklosporyną i chłoniak indukowany metotreksatem.
W dalszym wykonaniu ludzkie przeciwciała według wynalazku można stosować do leczenia chłoniaka typu Hodgkina.
Przykładami chorób immunologicznych, w które zaangażowane są komórki B wyrażające CD20, które można leczyć lub im zapobiegać są: łuszczyca, artropatia łuszczycowa, zapalenie skóry, twardzina układowa i stwardnienie, zapalna choroba jelita (IBD, ang. inflammatory bowel disease), choroba Crohna, wrzodziejące zapalenie okrężnicy, zespół ostrego wyczerpania oddechowego, zapalenie mózgu, zapalenie błony naczyniowej oka, zapalenie kłębuszków nerkowych, egzema, astma, miażdżyca tętnic, niedobór przylegania leukocytów, stwardnienie rozsiane, zespół Raynauda, zespół Sjogrena, cukrzyca młodzieńcza, choroba Reitera, choroba Behęeta, immunologiczne złożone zapalenie nerek, nefropatia IgA, polineuropatia IgM, immunologiczna małopłytkowość, taka jak ostra choroba Werlhofa i przewlekła choroba Werlhofa, anemia hemolityczna, miastenia gravis, zapalenie nerek w toczniu rumieniowatym układowym, liszaj rumieniowaty układowy, reumatoidalne zapalenie stawów (RA, ang. rheumatoid arthritis), atopowe zapalenie skóry, pęcherzyca, choroba Gravesa, zapalenie tarczycy Hashimoto, ziarniak Wegenera, zespół Omenna, przewlekła niewydolność nerek, ostra infekcyjna mononukleoza, choroby związane z HIV i wirusami herpes. Kolejnymi przykładami są ciężki zespół ostrego wyczerpania oddechowego i zapalenie naczyniówki i siatkówki. Jeszcze kolejnymi przykładami są choroby i zaburzenia powodowane lub zachodzące za pośrednictwem zakażenia komórek B przez wirusa, takiego jak wirus Epsteina-Barra (EBV, ang. Epstein-Barr virus).
Dalsze przykłady chorób zapalnych, immunologicznych i/lub autoimmunizacyjnych, w których autoprzeciwciała i/lub nadmierna aktywność komórek B są dominujące i które można leczyć i/lub zapobiegać obejmują następujące:
zapalenia naczyń i inne choroby naczyń, takie jak zapalenie wielu naczyń włosowatych, zespół Churga-Straussa i inne zapalenia naczyń związane z ANCA, guzkowate zapalenie tętnic, samoistne krioglobulinemiczne zapalenie naczyń, leukocytoklastyczne zapalenie tętnic skórnych, choroba Kawasaki, zapalenie tętnic Takayasu, wielkokomórkowe zapalenie stawów, plamica Henocha-Schonleina, pierwotne lub izolowane zapalenie tętnic mózgowych, rumień guzowaty, skrzepowe zamykające zapalenie naczyń (włączając hemolityczny zespół moczowy), i wtórne zapalenie naczyń, włączając skórne zapalenie leukocytoklastyczne naczyń (np. wtórne dla zapalenia wątroby typu B, typu C, Waldenstroma, nowotworów komórek B, reumatoidalnego zapalenia stawów, zespołu Sjogrena lub układowego liszaja rumieniowatego); dalszymi przykładami są rumień guzowaty, alergiczne zapalenie naczyń, zapalenie tkanki podskórnej, choroba Webera-Christiana, plamica hiperglobulinemiczna i choroba Buergera;
zaburzenia skóry, takie jak kontaktowe zapalenie skóry, linijna dermatoza IgA, bielactwo nabyte, pioderma zgorzelinowa, pęcherzowe oddzielanie się naskórka, pęcherzyca (włączając pemfigoid bliznowaty i pemfigoid pęcherzowy), łysienie plackowate (włączając łysienie uniwersalne i łysienie na całym ciele), opryszczkowe zapalenie skóry, rumień wielopostaciowy i przewlekła pokrzywka autoimmunizacyjna (włączając obrzęk naczyniowo-nerwowy i pokrzywkowe zapalenie naczyń),
PL 218 660 B1 niedobory krwinek o podłożu immunologicznym, takie jak niedobór neutrofili i aplazja czerwonych krwinek;
schorzenia tkanki łącznej takie jak liszaj CNS, tarczowaty liszaj rumieniowaty, zespół CREST, mieszana choroba tkanki łącznej, zapalenie wielomięśniowe/zapalenie skórnomięśniowe, zapalenie mięśni z ciałami wtrętowymi, skrobiawica wtórna, krioglobulinemia typu I i typu II, fibromialgia, zespół przeciwciał fosfolipidowych, hemofilia wtórna, nawracające zapalenie wielochrząstkowe, sarkoidoza, zespół zesztywnienia i gorączka reumatyczna; dalsze przykłady obejmują eozynochłonne zapalenie powięzi;
choroby stawów takie jak zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, młodzieńcze przewlekłe zapalenie stawów, choroba Stilla dorosłych, zespół SAPHO; dalszymi przykładami są zapalenie stawów krzyżowo-biodrowych, odczynowe zapalenie stawów, choroba Stilla i dna moczanowa;
zaburzenia hematologiczne, takie jak anemia aplastyczna, pierwotna anemia hemolityczna (włączając zespół zimnej aglutyniny), anemia hemolityczna wtórna względem CLL lub uogólnionego liszaja rumieniowatego, zespół POEMS, anemia złośliwa i plamica hiperglobulinemiczna Waldemstroma; dalsze przykłady obejmują agranulocytozę, neutropenię autoimmunizacyjną, chorobę Franklina, chorobę Seligmanna, chorobę łańcucha μ, zespół paraneoplastyczny wtórny względem grasiczaka i chłoniaków oraz wytwarzanie inhibitora czynnika VIII.
zaburzenia układu wydzielania wewnętrznego, takie jak endokrynopatia wielogruczołowa i choroba Addisona; dalszymi przykładami są hipoglikemia autoimmunizacyjna, autoimmunizacyjna niedoczynność tarczycy, insulinowy zespół autoimmunizacyjny, zapalenie tarczycy de Quervaina i insulinooporność powodowana przez przeciwciała wobec receptora insuliny;
zaburzenia wątrobowo - żołądkowojelitowe, takie jak celiaklia, choroba Whipple'a, pierwotna żółciowa marskość wątroby, przewlekłe aktywne zapalenie wątroby i pierwotne żółciowe zapalenie wątroby; dalszym przykładem jest autoimmunizacyjne zapalenie żołądka;
nefropatie, takie jak szybkie postępujące zapalenie kłębuszków nerkowych, popaciorkowcowe zapalenie nerek, zespół Goodpasture'a, błoniaste zapalenie kłębuszków nerkowych i krioglobulinemiczne zapalenie nerek; dalszym przykładem jest zapalenie submikroskopowe MCD (ang. minimal change disease);
zaburzenia neurologiczne, takie jak neuropatie autoimmunizacyjne, zapalenie kilku nerwów w różnych częściach ciała (ang. mononeritis multiplex), zespół miasteniczny Lamberta-Eatona, pląsawica Sydenhama, wiąd rdzenia i zespół Guillaina-Barre'a; dalszymi przykładami są mielopatia/tropikalny kurczowy niedowład kończyn dolnych, miastenia gravis, ostra zapalna polineuropatia demielizacyjna i przewlekła zapalna polineuropatia demielinizacyjna;
zaburzenia serca i płuc; takie jak włókniejące zapalenie pęcherzyków płucnych, zarostowe zapalenie oskrzelików, aspergilloza alergiczna, mukowiscydoza, zespół Lofflera, zapalenie mięśnia sercowego i zapalenie osierdzia; dalszymi przykładami są zapalenie płuc powodowane nadwrażliwością i zespół paraneoplastyczny wtórny względem raka płuc;
zaburzenia alergiczne, takie jak astma oskrzelowa i zespół nadmiaru IgE; dalszym przykładem jest przejściowe zaćmienie wzroku;
zaburzenia okulistyczne, takie jak idiopatyczne zapalenie naczyniówki i siatkówki;
choroby zakaźne, takie jak zakażenie parwowirusowe B (włączając zespół „hands-and-socks); i zaburzenia ginekologiczno - położnicze, takie jak wielokrotne poronienia, wielokrotne utraty płodu i wewnątrzmaciczne opóźnienie wzrostu; dalszym przykładem jest zespól paraneoplastyczny wtórny względem nowotworów ginekologicznych;
zaburzenia męskiego układu rozrodczego, takie jak zespól neoplastyczny wtórny względem nowotworów jader;
zaburzenia związane z transplantacją, takie jak odrzucenie przeszczepu allogenicznego i heterogenicznego i reakcja przeszczep przeciwko gospodarzowi.
W jednym wykonaniu, choroba jest zaburzeniem zapalnym, immunologicznym i/lub autoimmunologicznym wybranym spośród wrzodziejącego zapalenia okrężnicy, choroby Crohna, cukrzycy młodzieńczej, stwardnienia rozsianego, immunologicznej małopłytkowości, takiej jak ostra choroba Werlhofa i przewlekła choroba Werlhofa, anemii hemolitycznej (łącznie z autoimmunizacyjną anemią hemolityczną), miastenii gravis, stwardnienia układowego i pęcherzycy zwykłej.
W innym wykonaniu, ludzkie przeciwciała według wynalazku można stosować do wykrywania poziomu CD20 lub poziomów komórek zawierających CD20 na powierzchni błony, które to poziomy można następnie wiązać z konkretnymi objawami choroby. Alternatywnie, przeciwciała można stoso38
PL 218 660 B1 wać do pozbawiania lub oddziaływania z funkcją komórek wyrażających CD20, wskazując w ten sposób, że te komórki są ważnymi pośrednikami choroby. Można to osiągnąć przez kontaktowanie próbki badanej i kontrolnej z przeciwciałem przeciwko CD20 w warunkach umożliwiających tworzenie kompleksu między przeciwciałem i CD20. Wszelkie utworzone kompleksy między przeciwciałem i CD20 są wykrywane, a ich ilość z próbki badanej porównuje się z próbką kontrolną.
Ludzkie przeciwciała według wynalazku można wstępnie badać w kierunku aktywności wiążącej związanej z zastosowaniem terapeutycznym lub leczniczym in vitro. Na przykład, przeciwciała można testować stosując oznaczenia za pomocą cytometrii przepływowej opisane w poniższych Przykładach. Co więcej, można oznaczyć aktywność przeciwciał w wyzwalaniu co najmniej jednej efektorowej aktywności komórkowej, włączając hamowanie wzrostu i/lub zabijanie komórek wyrażających CD20. Na przykład, można oznaczyć zdolność przeciwciał do wyzwalania CDC i/lub apoptozy. Protokoły oznaczania CDC, adhezji homotypowej, grupowania molekularnego lub apoptozy opisano poniżej w przykładach.
Ludzkie przeciwciała według wynalazku mają także dodatkową użyteczność w leczeniu i Diagnostyce licznych chorób związanych z CD20. Na przykład, ludzkie przeciwciała można stosować do wywoływania in vivo lub in vitro jednej lub większej liczby następujących aktywności biologicznych: hamowania wzrostu i/lub różnicowania komórki wyrażającej CD20; zabijania komórki wyrażającej CD20; pośredniczenia w fagocytozie lub ADCC komórki wyrażającej CD20 w obecności ludzkich komórek efektorowych; pośredniczenia w CDC komórki wyrażającej CD20 w obecności dopełniacza; pośredniczenia w apoptozie komórki wyrażającej CD20; indukcji adhezji homotypowej i/lub indukcji translokacji do tratw lipidowych po związaniu z CD20.
W szczególnym wykonaniu, ludzkie przeciwciała stosuje się in vivo do leczenia, zapobiegania lub diagnozowania licznych chorób związanych z CD20. Przykładami chorób związanych z CD20 są, między innymi, chłoniak z komórek B, np. NHL, i choroby immunologiczne, np. choroby autoimmunizacyjne, takie jak wymienione powyżej.
W szczególnym wykonaniu, przeciwciała według wynalazku stosuje się do leczenia lub zapobiegania NHL, jako, że przeciwciała zmniejszają liczbę komórek nowotworowych niosących CD20.
Chłoniak nieziarniczy jest typem chłoniaka z komórek B. Chłoniaki, np. chłoniaki z komórek B, są grupą pokrewnych raków, które powstają gdy limfocyt (komórka krwi) staje się złośliwy. Normalną funkcją limfocytów jest obrona organizmu przed czynnikami inwazyjnymi: drobnoustrojami, wirusami, grzybami, a nawet rakiem. Jest wiele podtypów i etapów dojrzewania limfocytów i z tego wynika istnienie wielu typów chłoniaków. Podobnie jak komórki normalne, złośliwe limfocyty mogą przemieszczać się do wielu części organizmu. Typowo, komórki chłoniaków tworzą nowotwór w układzie limfatycznym: szpiku kostnym, węzłach chłonnych, śledzionie i krwi. Jednakże komórki te mogą migrować do innych narządów. Pewne typy chłoniaków mają zwyczaj rosnąć w miejscach gdzie rezydują normalne wersje komórek. Na przykład, powszechne dla nowotworów pęcherzykowych NHL jest rozwijanie się w węzłach chłonnych.
CD20 zwykle jest wyrażane w podwyższonym stopniu w nowotworowych (tj. tworzących nowotwór) komórkach B związanych z NHL. Zgodnie z powyższym, przeciwciała wiążące CD20 według wynalazku można stosować do obniżania liczby prowadzących do NHL komórek nowotworowych niosących CD20, a więc można stosować do zapobiegania lub leczenia tej choroby.
Ludzkie przeciwciała (np. ludzkie przeciwciała monoklonalne, cząsteczki bispecyficzne) według wynalazku można także stosować do blokowania lub hamowania innych efektów CD20. Na przykład, wiadomo, że CD20 jest wyrażane na limfocytach B i zaangażowane w proliferację i/lub różnicowanie tych komórek. Jako, że limfocyty działają jako immunomodulatory, CD20 jest ważnym celem terapii opartej o przeciwciała skierowanej na limfocyty B, np. do inaktywacji lub zabijania limfocytów B zaangażowanych w chorobę autoimmunizacyjną. Takie zaburzenia autoimmunizacyjne obejmują, na przykład, wymienione powyżej choroby.
Odpowiednie drogi podawania kompozycji przeciwciał (np. ludzkich przeciwciał monoklonalnych, cząsteczek bispecyficznych oraz immunokoniugatów) według wynalazku in vivo i in vitro są dobrze znane w dziedzinie i mogą być wybrane przez specjalistę w dziedzinie. Na przykład, kompozycje przeciwciał można podawać przez zastrzyki (np. dożylnie lub podskórnie). Odpowiednie dawkowanie stosowanych cząsteczek zależeć będzie od wieku i masy osobnika oraz stężenia i/lub sposobu formułowania kompozycji przeciwciał. Następnie, można ustalić masę nowotworu i wykorzystać do obliczenia odpowiedniego dawkowania.
PL 218 660 B1
Jak opisano wcześniej, ludzkie przeciwciała przeciwko CD20 według wynalazku można podawać jednocześnie z jednym lub większą liczbą czynników terapeutycznych, np. z czynnikiem cytotoksycznym, czynnikiem radiotoksycznym lub czynnikiem immunosupresyjnym. Przeciwciało można sprzęgać z czynnikiem (jako immunokompleks) lub można podawać oddzielnie od czynnika. W tym drugim przypadku (podawanie oddzielne), przeciwciało można podawać przed, po lub równocześnie z czynnikiem lub można podawać jednocześnie z innymi znanymi terapiami, np. terapią przeciwnowotworową np. naświetlaniem. Takie czynniki terapeutyczne obejmują, między innymi, czynniki przeciwnowotworowe, takie jak doksorubicyna, cisplatyna, bleomycyna, karmustyna, chlorambucyl i cyklofosfamid. Jednoczesne podawanie ludzkich przeciwciał przeciwko CD20 według wynalazku z czynnikami chemioterapeutycznymi dostarcza dwóch czynników przeciwnowotworowych działających za pomocą różnych mechanizmów wzmacniających efekt cytotoksyczny wobec ludzkich komórek nowotworowych. Takie jednoczesne podawanie może rozwiązać problemy spowodowane rozwinięciem lekooporności lub zmiany antygenowości komórek nowotworowych, które mogłyby uczynić je niereaktywnymi względem przeciwciała.
Komórki efektorowe specyficzne względem celu, np. komórki efektorowe związane z kompozycjami według wynalazku (np. ludzkie przeciwciała, cząsteczki bispecyficzne) można także stosować jako czynniki terapeutyczne. Komórki efektorowe do nakierowywania mogą być ludzkimi leukocytami, takimi jak makrofagi, neutrofile lub monocyty. Inne komórki obejmują eozynofile, komórki „naturalni mordercy i inne komórki niosące receptory dla IgG lub IgA. Jeśli jest to pożądane, komórki efektorowe można pozyskać od osobnika, który ma być leczony. Komórki efektorowe nakierowane na cel można podawać jako zawiesinę komórek w dopuszczalnym fizjologicznie roztworze. Liczba komórek podawanych może być rzędu 108 do 109, ale będzie się wahać w zależności od przeznaczenia terapeutycznego. Ogólnie, ilość będzie wystarczająca do uzyskania lokalizacji komórki docelowej, np. nowotworu wyrażającego CD20, i wywołania śmierci komórki przez np. fagocytozę. Drogi podawania także mogą się różnić.
Terapię komórkami efektorowymi nakierowanymi na cel można przeprowadzić w połączeniu z inną techniką usuwania komórek docelowych. Na przykład, terapię przeciwnowotworową wykorzystującą kompozycje (np. ludzkie przeciwciała, cząsteczki bispecyficzne) według wynalazku i/lub komórki efektorowe uzbrojone w te kompozycje, można stosować w połączeniu z chemioterapią. Dodatkowo, kombinowaną immunoterapię można zastosować do skierowania dwóch różnych efektorowych populacji cytotoksycznych w celu odrzucenia komórek nowotworowych. Na przykład, przeciwciała przeciwko CD20 połączone z anty-FcyRI lub anty-CD3 można stosować w powiązaniu z czynnikami specyficznie wiążącymi receptory IgG lub IgA.
Cząsteczki bispecyficzne według wynalazku można także stosować do modulowania poziomów FcγR lub FcaR na komórkach efektorowych, przez przykrycie i eliminację receptorów na powierzchni komórki. Do tego celu można także stosować mieszaniny receptorów przeciwko Fc.
Kompozycję (np. ludzkie przeciwciała, cząsteczki bispecyficzne) według wynalazku, które mają miejsca wiązania dopełniacza, takie jak wiążące dopełniacz części IgG1, -2, -3 lub IgM, można także stosować w obecności dopełniacza. W jednym wykonaniu, ex vivo traktowanie populacji komórek zawierającej komórki docelowe z czynnikiem wiążącym według wynalazku i odpowiednimi komórkami efektorowymi można uzupełnić przez dodanie dopełniacza lub surowicy zawierającej dopełniacz. Fagocytozę komórek docelowych opłaszczonych czynnikiem wiążącym można poprawić przez wiązanie białek dopełniacza. W innym wykonaniu komórki docelowe opłaszczone kompozycjami (np. ludzkimi przeciwciałami, cząsteczkami bispecyficznymi) według wynalazku można także poddać lizie przez dopełniacz. W jeszcze innym wykonaniu, kompozycje według wynalazku nie aktywują dopełniacza.
Kompozycje (np. ludzkie przeciwciała, cząsteczki bispecyficzne) według wynalazku można także podawać razem z dopełniaczem. Zgodnie z powyższym, w zakresie wynalazku znajdują się kompozycje obejmujące ludzkie przeciwciała, cząsteczki bispecyficzne, oraz surowice lub dopełniacz. Kompozycje te są korzystne dlatego, że komplement znajduje się w pobliżu ludzkich przeciwciał, cząsteczek multispecyficznych lub bispecyficznych. Alternatywnie ludzkie przeciwciała i cząsteczki bispecyficzne według wynalazku oraz dopełniacz lub surowicę można podawać oddzielnie. Wiązanie kompozycji według wynalazku z komórkami docelowymi powoduje translokację kompleksu antygen CD20-przeciwciało do tratw lipidowych błony komórkowej. Taka translokacja powoduje tworzenie kompleksów przeciwciało-antygen o dużej gęstości, które mogą efektywnie aktywować i/lub wzmacniać CDC.
Niniejszym opisano zestawy zawierające kompozycje przeciwciał według wynalazku (np. ludzkie przeciwciała i immunokoniugaty) oraz instrukcje stosowania. Zestaw może dalej zawierać jeden
PL 218 660 B1 lub większą liczbę czynników dodatkowych, takich jak reagent immunosupresyjny, czynnik cytotoksyczny lub czynnik radiotoksyczny albo jedno lub większą liczbę dodatkowych ludzkich przeciwciał (np. ludzkie przeciwciało o komplementarnej aktywności).
Zgodnie z powyższym, pacjentom leczonym kompozycjami przeciwciał według wynalazku można dodatkowo podawać (przed, jednocześnie lub po podaniu ludzkiego przeciwciała według wynalazku) inny czynnik terapeutyczny, taki jak czynnik cytotoksyczny lub radiotoksyczny, wzmacniający lub zwiększający terapeutyczną skuteczność ludzkich przeciwciał.
Osobnika można dodatkowo leczyć czynnikiem modulującym, np. wzmacniającym lub hamującym, ekspresję aktywności receptorów Fcy lub Fca, przez na przykład, leczenie osobnika cytokiną. Korzystne cytokiny do podawania w czasie leczenia cząsteczką multispecyficzną obejmują czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF), czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów (GM-CSF), interferon-γ (IFN-γ) i czynnik martwicy nowotworu (TNF).
Kompozycje (np. ludzkie przeciwciała, cząsteczki bispecyficzne) według wynalazku można także stosować do nakierowania do komórek wyrażających FcγR lub CD20, na przykład, do znakowania takich komórek. Do takiego zastosowania, czynnik wiążący można połączyć z cząsteczką, którą można wykrywać. Tak więc wynalazek dostarcza sposobów lokalizowania ex vivo lub in vitro komórek wyrażających receptory Fc, takie jak FcγR lub Cd20. Wykrywalnym znacznikiem może być, np., izotop radioaktywny, związek fluorescencyjny, enzym lub kofaktor enzymu.
W szczególnym wykonaniu, wynalazek dostarcza sposobów wykrywania obecności antygenu CD20 w próbce, lub pomiaru ilości antygenu CD20, obejmujących kontaktowanie próbki badanej i próbki kontrolnej z ludzkim przeciwciałem monoklonalnym specyficznie wiążącym CD20 w warunkach pozwalających na tworzenie się kompleksu przeciwciała lub jego fragmentu z CD20. Następnie wykrywa się tworzenie kompleksu, przy czym różnica w tworzeniu kompleksu między próbką badaną w porównaniu do próbki kontrolnej wskazuje na obecność CD20 w próbce badanej.
Niniejszym opisano sposoby leczenia zaburzeń, w które zaangażowane są komórki wyrażające CD20 u osobnika, np. chłoniaka nieziarniczego lub reumatoidalnego zapalenia stawów, przez podawanie osobnikowi opisanych wyżej ludzkich przeciwciał. Takie przeciwciała i ich pochodne stosuje się do hamowania związanych z pewnymi chorobami aktywności indukowanych przez CD20, np. proliferacji i/lub różnicowania. Przez kontaktowanie przeciwciała z CD20 (np. przez podanie przeciwciała osobnikowi) zdolność CD20 do indukcji takich aktywności jest hamowana, zatem choroba związana z tymi aktywnościami jest leczona.
Zgodnie z powyższym, niniejszym opisano sposób leczenia lub zapobiegania zaburzeniu nowotworogennemu angażującemu komórki wyrażające CD20, np. NHL. Sposób obejmuje podawanie osobnikowi kompozycji przeciwciała według wynalazku w ilości efektywnej do leczenia lub zapobiegania zaburzeniu. Kompozycję przeciwciała można podawać samą lub wraz z innym czynnikiem terapeutycznym, takim jak czynnik cytotoksyczny lub radiotoksyczny, działającym w połączeniu lub równolegle z kompozycją przeciwciała leczącego lub zapobiegającego chorobom angażującym komórki wyrażające CD20. W szczególnie korzystnym wykonaniu, rozwiązania według wynalazku umożliwiają leczenie chłoniaka nieziarniczego.
Niniejszym opisano także sposoby leczenia lub zapobiegania chorobie autoimmunizacyjnej angażującej komórki wyrażające CD20, np. wyżej wymienionym chorobom. Sposób obejmuje podawanie osobnikowi kompozycji przeciwciała według wynalazku w ilości efektywnej do leczenia lub zapobiegania zaburzeniu. Kompozycję przeciwciała można podawać samą lub wraz z innym czynnikiem terapeutycznym, takim jak immunosupresor, działającym w połączeniu lub równolegle z kompozycją przeciwciała leczącego lub zapobiegającego chorobom angażującym komórki wyrażające CD20.
We wciąż innym wykonaniu wynalazek dostarcza sposobu wykrywania obecności lub oznaczania ilości komórek wyrażających CD20 in vitro, chociaż możliwe jest również prowadzenie analogicznych sposobów in vivo. Sposób taki obejmuje (i) podanie osobnikowi kompozycji (np. cząsteczki bispecyficznej) według wynalazku sprzężonej z wykrywalnym znacznikiem, (ii) ekspozycję osobnika na środki wykrywania wspomnianego znacznika w celu identyfikacji obszarów zawierających komórki wyrażające CD20.
W jeszcze innym wykonaniu, immunokoniugaty według wynalazku można stosować do kierowania składników (np. czynników terapeutycznych, znaczników, cytotoksyn, radiotoksyn, immunosupresorów itp.) do komórek wyrażających na swojej powierzchni CD20 przez łączenie takich składników z przeciwciałem. A zatem, opisano tu sposoby lokalizacji ex vivo i in vitro komórek wyrażających CD20, takich jak komórki Reeda-Sternberga (np. z wykrywalnym znacznikiem, takim jak izotop radioPL 218 660 B1 aktywny, związek fluorescencyjny, enzym lub kofaktor enzymu). Alternatywnie, immunokoniugaty można stosować do zabijania komórek wyrażających CD20 na swojej powierzchni, przez kierowanie cytotoksyn lub radiotoksyn do CD20.
Niniejszy wynalazek dalej ilustrują następujące przykłady, które nie powinny być uważane za ograniczające.
P r z y k ł a d y
Linie komórek B stosowane w przykładach
Linia komórkowa Pochodzenie Otrzymana z
Daudi Negroidalny Chłoniak Burkitta ECACC (85011437)
ARH-77 Białaczka IgG komórek plazmatycznych DSMZ (ACC 512)
DOHH Nawracający chłoniak immunoblastyczny komórek B DSMZ (ACC 47)
Raji Negroidalny Chłoniak Burkitta ECACC (85011429)
SU-DHL-4 B-NHL, rozproszony chłoniak histiocytarny DSMZ (ACC 495)
Ramos-EHRB Chłoniak Burkitta ECACC (85030804)
Tanoue Ludzka białaczka komórek B DSMZ (ACC 399)
Linie komórek B Daudi, ARH-77, DOHH, Raji, Ramos-EHRB, i komórki Tanoue hodowano
w pożywce do hodowli RPMI 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą (FCS, ang. fetal calf serum) (Optimum C241, Wisent Inc., st. Bruno, Canada), 2 mM L-glutaminą, 100 IU/ml penicyliną, 100 μg/ml streptomycyną i 1 mM pirogronianem sodu (wszystkie Gibco BRL, Life Technologies, Paisley, Scotland).
Linię komórek B SU-DHL-4 hodowano w tej samej pożywce ale bez pirogronianu sodu.
Hodowle utrzymywano w 37°C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2, rozdzielano i zbierano przy 80-90% konfluencji. Pożywkę odświeżano dwa razy w tygodniu. W tym czasie komórki rozdzielano i wysiewano do gęstości 1-1,5 x 106 komórek/ml by zapewnić przeżywalność i optymalny wzrost.
P r z y k ł a d 1 Wytwarzanie ludzkich przeciwciał przeciwko CD20
Myszy HCo7 i KM: Używając myszy HCo7 i KM wyrażających ludzkie geny przeciwciał przygotowano całkowicie ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko CD20. W szczepie myszy KM, gen endogennego, mysiego łańcucha lekkiego kappa poddano homozygotycznemu przerwaniu (dysrupcja genu), jak opisano w Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820 i gen endogennego, mysiego łańcucha ciężkiego kappa poddano homozygotycznemu przerwaniu, jak opisano w Przykładzie 1 publikacji PCT WO 01/09187. Ten szczep myszy niesie transgen ludzkiego łańcucha lekkiego kappa, KCo5, jak opisano w Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. Ten szczep myszy niesie także transchromosom ludzkiego łańcucha ciężkiego złożony z fragmentu hCF (SC20) chromosomu 14, jak opisano w WO 02/43478.
Myszy HCo7 wykazują przerwanie JKD w genach endogennego łańcucha lekkiego (kappa) (jak opisano w Chen et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830), przerwanie CMD w genach endogennego łańcucha ciężkiego (jak opisano w Przykładzie 1 WO 01/14424), transgen KCo5 ludzkiego łańcucha lekkiego kappa (jak opisano w Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851), i transgen HCo7 ludzkiego łańcucha ciężkiego (jak opisano w US 5,770,429).
Immunizacja myszy HC07 i KM: Myszy HCo7 i KM szczepiono komórkami NS/0 transfekowanymi ludzkim CD20. W pierwszym szczepieniu, mieszano 1 x 107 komórek na mysz w 150 μl PBS z pełnym adiuwantem Freunda 1:1 i wstrzykiwano dootrzewnowo (i.p., ang. intraperitoneally). Kolejne szczepienia i.p. prowadzano stosując podobną ilość komórek bez adiuwanta. Trzy i dwa dni przed fuzją myszom podawano dożylnie dawkę przypominającą 0,5 x107 komórek zawieszonych w PBS.
Obecność przeciwciał skierowanych przeciwko ludzkiemu CD20 w surowicy myszy monitorowano za pomocą cytometrii przepływowej stosując analizę FACS, wykorzystując komórki NS/0 transfekowane ludzkim CD20 jak i ujemne pod względem CD20 rodzicielskie komórki NS/0.
Otrzymywanie hybrydoma wytwarzających ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko CD20:
Mysie splenocyty izolowano z myszy HCo7 i KM i poddawano fuzji za pomocą PEG z mysią linią komórkową szpiczaka stosując standardowe protokoły. Uzyskane hybrydoma przeszukiwano pod kątem wytwarzania ludzkich IgG,k za pomocą ELISA i na specyficzność względem CD20 stosując komórki
PL 218 660 B1
NS/0 i SKBR3 transfekowane ludzkim CD20 za pomocą analizy FACS. Zawiesiny zawierające pojedyncze komórki limfocytów śledziony z immunizowanych myszy poddawano fuzji z jedną czwartą liczby niewydzielniczych mysich komórek szpiczaka SP2/0 (ATCC, CRL 1581) za pomocą 50% PEG 5 (Sigma). Komórki następnie wysiewano w stężeniu około 1 x 105 na studzienkę na płaskodennych płytkach mikrotitracyjnych, po czym następowała około dwutygodniowa inkubacja w pożywce selekcyjnej zawierającej 10% płodową surowicę bydlęcą, 10% pożywkę kondycjonową P388D1 (ATCC, CRL TIB-63), 3-5% origen (IGEN) w DMEM (Mediatech, CRL 10013, o wysokim stężeniu glukozy, L-glutaminy i pirogronianu sodu) plus 5 mM HEPES, 0,055 mM 2-merkaptoetanol, 50 mg/ml gentamycynę i 1 x HAT (Sigma, CRL P-7185). Po 1-2 tygodniach komórki hodowano w pożywce, w której HAT zastąpiono HT. Pojedyncze studzienki następnie przeszukiwano z zastosowaniem cytometrii przepływowej w kierunku ludzkich przeciwciał monoklonalnych IgG przeciwko CD20. Gdy nastąpił silny wzrost hybrydoma, pożywkę monitorowano zwykle po 10-14 dniach. Hybrydoma wydzielające przeciwciała przesiewano, przeszukiwano ponownie i jeśli wciąż były pozytywne względem ludzkich przeciwciał monoklonalnych IgG przeciwko CD20 subklonowano je przez ograniczające rozcieńczanie. Stabilne subklony następnie hodowano in vitro z wytworzeniem niewielkich ilości przeciwciał w pożywce do hodowli tkankowej do charakteryzacji. Wybrano jeden klon z każdej hybrydoma, który zachował reaktywność komórek rodzicielskich (za pomocą FACS). Dla każdego klonu utworzono bank komórek składający się z 5-10 probówek przechowywanych w ciekłym azocie.
Dobór ludzkich przeciwciał monoklonalnych wiążących CD20/pierwotne przeszukiwanie:
By ustalić izotyp przeciwciał, przeprowadzono ELISA izotypowe. Studzienki płytki mikrotitracyjnej opłaszczono 1 μg/ml mysiego przeciwciała przeciwko ludzkiemu łańcuchowi lekkiemu, 50 μl/studzienkę w PBS inkubowano przez noc w 4°C. Po blokowaniu 5% kurzą surowicą, płytki poddawano reakcji z supernatantem i oczyszczoną kontrolą izotypową. Płytki następnie inkubowano w temperaturze otoczenia przez 1-2 godziny. Studzienki dalej poddawano reakcji z sondą specyficzną dla któregoś z ludzkich IgG1, IgG2, IgG3 lub IgG4 sprzężoną z peroksydazą chrzanową. Płytki wywoływano i analizowano jak opisano wyżej.
Utworzono cztery linie hybrydoma. Trzy z fuzji myszy KM i jedną z fuzji myszy HCo7, wyrażające następujące przeciwciała:
2F2: ludzkie monoklonalne przeciwciało IgG1,K o sekwencji nukleotydowej SEK. NR ID.: 1 i 2 i sekwencji aminokwasowej SEK. NR ID.: 2 i 4.
4C9: ludzkie monoklonalne przeciwciało IgG1,K przeciwciało o dokładnie takiej samej sekwencji aminokwasowej SEK. NR ID.: 2 i 4.
7D8: ludzkie monoklonalne przeciwciało IgG1,K o sekwencji nukleotydowej SEK. NR ID.: 5 i 7 i sekwencji aminokwasowej SEK. NR ID.: 6 i 8.
11B8: ludzkie monoklonalne przeciwciało IgG3,K o sekwencji nukleotydowej SEK. NR ID.: 9 i 11 i sekwencji aminokwasowej SEK. NR ID.: 10 i 12.
Określenie „2F2 w znaczeniu tu stosowanym oznaczenia oba przeciwciała pochodzące z klonu hybrydoma 2F2 i identyczne przeciwciała pochodzące z klonu hybrydoma 4C9.
Przeciwciała według wynalazku można poddać zamianie na inne izotypy, przez dobór transgenicznego lub transchromosomowego innego niż człowiek zwierzęcia z którego pochodzą. W jednym wykonaniu wynalazku, ludzkie monoklonalne przeciwciało 11B8 IgG3,K można poddać zamianie na ludzkie monoklonalne izotypu IgG1,K o dokładnie takich samych sekwencjach VH i VL. W innym wykonaniu przeciwciało 2F2 IgG1,K lub przeciwciało 7D8 IgG1,K można poddać zamianie na ludzkie przeciwciało monoklonalne izotypu IgG2, IgG4, IgA1, IgA2 lub IgE o dokładnie takich samych sekwencjach
VH i VL.
P r z y k ł a d 2 Sekwencjonowanie ludzkich przeciwciał przeciwko CD20
Sekwencjonowanie regionów Vh i
Przygotowanie RNA przygotowano całkowity RNA z 5x106 komórek wszystkich linii komórkowych hybrydoma HuMab CD20 (2F2, 7D8 i 11B8) za pomocą zestawu RNeasy (Qiagen, Westburg, Leusden, Holandia) zgodnie z instrukcją producenta.
Przygotowanie cDNA2F2 i 7D8: Komplementarny DNA 5'-RACE-Ready (cDNA) z RNA przygotowano 1 μg całkowitego RNA stosując zestaw SMART RACE cDNA Amplification (Clonetech), zgodnie z instrukcją producenta.
Regiony VH i VL amplifikowano stosując korzystny zestaw HF 2 PCR Kit (Clonetech, BD) i następujące startery:
Vk RACE2 5'GCA GGC ACA CAA CAG AGG CAG TTC CAG ATT TC przyłącza się w C kappa
PL 218 660 B1
VH RACE2 5'GCT GTG CCC CCA GAG GTG CTC TTG GAG G przyłącza się w CH1 Przygotowanie cDNA 11B8: komplementarny DNA (cDNA) do RNA z komórek 11B8 przygotowywano z 3 gg całkowitego RNA za pomocą AMV Reverse Transcriptase z buforem (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany), oligo d(T)15 (Promega, Madison, WI, USA), dNTP (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) i RNAsin (Promega) zgodnie z instrukcją producenta (2000, wersja 3).
Startery do PCR stosowane do amplifikacji regionów VH i VL do klonowania:
Stosowane pary starterów:
VH: startery FR1 5'
AB62
AB63
AB65 startery Vh liderowe 5'
AB85 AB86 AB87 AB88 AB 89 starter Vh 3'
AB90
VK: starter FR1 5'
AB 8 AB9 AB 10 AB 11 AB 12 AB 13 AB 14 starter Vk liderowe 5'
AB 123
AB 124 AB 125 AB 126 starter Vk 3'
CAg gTK CAg CTg gTg CAg TC SAg gTg CAg CTg KTg gAg TC gAg gTg CAg CTg gTg CAg TC
ATg gAC Tgg ACC Tgg AgC ATC ATg gAA TTg ggg CTg AgC Tg ATg gAg TTT ggR CTg AgC Tg ATg AAA CAC CTg Tgg TTC TTC ATg ggg TCA ACC gCC ATC CT
TgC CAg ggg gAA gAC CgA Tgg
RAC ATC CAg ATg AYC CAg TC gYC ATC YRg ATg ACC CAg TC gAT ATT gTg ATg ACC CAg AC gAA ATT gTg TTg ACR CAg TC gAA ATW gTR ATg ACA CAg TC gAT gTT gTg ATg ACA CAG TC gAA ATT gTg CTg ACT CAg TC
CCC gCT Cag CTC CTg ggg CTC CTg CCC TgC TCA gCT CCT ggg gCT gC CCC AgC gCA gCT TCT CTT CCT CCT gC ATg gAA CCA Tgg AAg CCC CAg CAC AgC
AB16 Cgg gAA gAT gAA gAC AgA Tg gdzie K = T lub G, S = C lub G, R = A lub G, Y = C lub T, i W = A lub T.
Warunki PCR stosowane do amplifikacji regionów VH i VL do klonowania 2F2 i 7D8: Reakcję łańcuchową polimerazy (PCR, ang. polymerase chain reaction) przeprowadzano mieszaniną polimerazy HF (Clonetech) na termocyklerze Cycler T1 (Biometra, Westburg).
Warunki reakcji PCR:
94°C 30 sek. 5 cykli
72°C 1 min
94°C 30 sek.
70°C 30 sek. 5 cykli 72°C 1 min
94°C 30 sek.
68°C 30 sek. 27-30 cykli 72°C 1 min.
Warunki PCR stosowane do amplifikacji regionów VH i VL do klonowania 11B8: Reakcję łańcuchową polimerazy przeprowadzano mieszaniną polimerazy AmpliTaq (Perkin Elmer) na termocyklerze Cycler T1 (Biometra, Westburg, Leusden, Holandia).
Protokół do reakcji PCR:
94°C 2 min cykli 94°C 30 sek.
65°C 30 sek., minus 1°C na cykl 72°C 30 sek.
PL 218 660 B1 cykli 94°C 30 sek.
55°C 30 sek.
72°C 30 sek.
72°C 10 min schłodzić do 4°C.
Klonowanie VH i VL w pGEMT-Vector System II (2F2, 7D8, i 11B8): Po analizie produktów PCR na żelu agarozowym, produkty oczyszczano za pomocą zestawu QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen, Westburg, Leusden, Holandia). Dwa niezależnie amplifikowane produkty PCR dla każdego regionu VH i VL klonowano w wektorze pGEMT-Vector System II (Promega) zgodnie z instrukcjami producenta (1999, wersja 6).
Po transformacji do E. coli JM 109, pojedyncze kolonie przeszukiwano za pomocą kolonijnego PCR stosując T7 i startery SP6, 30 cykli w 55°C. Plazmidowy DNA z kolonii izolowano stosując zestaw do minilizy Qiaprep Spin (Qiagen). W celu dalszej analizy regionów VH i VL przeprowadzono trawienie Nco1/Not1 (NE Biolabs, Westburg, Leusden, Holandia) i analizę na żelu agarozowym.
Sekwencjonowanie (2F2, 7D8 i 11B8): Regiony V sekwencjonowano po klonowaniu w pGEMTVector System II. Sekwencjonowanie prowadzono w Baseclear (Leiden, Holandia). Sekwencje analizowano przez dopasowanie z sekwencjami linii zarodkowej genu V w Vbase (www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/intro.htm) http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase-ok.php?menu=901.
Otrzymane sekwencje przedstawiono na Figurach 53-58.
P r z y k ł a d 3 Wytwarzanie zrekombinowanych 2F2 i 11B8 w linii komórkowej GS-NS/0
2F2T: Regiony zmienne łańcucha lekkiego i ciężkiego przeciwciała 2F2 amplifikowano techniką PCR ze standardowego wektora do klonowania pGem-5Zf (Promega), stosując startery obejmujące optymalną sekwencję Kozak i odpowiednie miejsca restrykcyjne do klonowania fragmentów w wektorach pCON-/1f i PCONk regionu stałego GS (Lonza).
Po amplifikacji, fragmenty oczyszczano i trawiono enzymami restrykcyjnymi i ligowano z dwoma wektorami. Fragment zmienny łańcucha ciężkiego trawiono Hind III i Bsi WI i ligowano do wektora pCON-/1f, który trawiono Hind III i Bsi WI, oraz defosforylowano fosfatazą alkaliczną. Fragment zmienny łańcucha lekkiego trawiono Hind III i Apa I i ligowano do wektora PCONk trawionego Hind III i ApaI, i defosforylowanego alkaliczną fosfatazą. Wektory pCON/H/zmienny ciężki i PCONK/zmienny lekki przedstawiono na Figurach 1 i 2, odpowiednio. Transformowane kolonie E. coli sprawdzano stosując kolonijny PCR i 2 pozytywne kolonie dla konstruktu łańcucha ciężkiego (HC) i łańcucha lekkiego (LC) hodowano w celu izolacji plazmidu. Wyizolowane plazmidy dla tych 4 kolonii sekwencjonowano w celu potwierdzenia sekwencji. Oba klony HC i jeden LC miały prawidłową sekwencję.
Dwa konstrukty HC i jeden LC połączono, aby uzyskać dwie kombinacje LC-HC i przejściowo transformowano do komórek CHO-K1, w celu sprawdzenia konstruktów pod kątem prawidłowego wytwarzania przeciwciała 2F2. Osiągnięto prawidłowe poziomy wytwarzania wobec wszystkich kombinacji, w tym eksperymencie ekspresyjnym i wybrano po 1 klonie każdego konstruktu HC i LC do konstrukcji wektora dwugenowego.
Zastosowano standardowe procedury, aby włączyć konstrukty HC i LC do dwugenowego wektora do klonowania, oznaczonego pCON-/1f/K2F2, przez ligację całkowitej kasety ekspresyjnej z wektora łańcucha ciężkiego pCO^1f/zmienny-ciężki do wektora łańcucha lekkiego, pCONK/zmiennylekki. Wektor pCON-/1f/K2F2 przedstawiono na Figurze 3.
Konstrukt ten testowano funkcjonalnie przez przejściową transfekcję komórek CHO-K1 i wykazano prawidłowe poziomy ekspresji.
Regiony zmienne plazmidu pCON-/1f/K2F2 sekwencjonowano, aby potwierdzić prawidłową sekwencję.
Przygotowano plazmid liniowy do stabilnej transfekcji przez trawienie pCON-/1f/K2F2 unikalnym enzymem restrykcyjnym Pvu I, tnącym poza regionem niezbędnym do ekspresji. Całkowitą linearyzację potwierdzono przez elektroforezę w żelu agarozowym i DNA oczyszczono i przechowywano do użycia w -20°C.
Przeprowadzono sześć transfekcji komórek gospodarza NS/0 przez elektroporację plazmidowego DNA, stosując powyższy plazmid liniowy DNA. Po transfekcji, komórki rozdzielono do płytek o 96 studzienkach i inkubowano. Dodano pożywkę selekcyjną (zawierającą 10% dializowaną płodową surowicę cielęcą (dFCS) i 10 μM GS-inhibitora, L-metioninosulfoksyminy, lecz bez glutaminy) i płytki obserwowano, aby ustalić kiedy umierają komórki nietransfekowane pozostawiając ogniska komórek transfekowanych. Dalsze szczegóły dotyczące układów wektorów GS przedstawiono w WO 87/04462.
PL 218 660 B1
Transfekowane płytki inkubowano przez około trzy tygodnie, aby pozwolić na utworzenie się kolonii. Uzyskane kolonie badano mikroskopowo, aby ocenić czy ich rozmiar jest odpowiedni do oznaczenia (pokrywają więcej nić 60% dna studzienki) i, że tylko jedna kolonia jest obecna w każdej studzience. Supernatanty z 436 transfektantów przeszukiwano za pomocą testu IgG,K-ELISA pod kątem złożonego przeciwciała. Wykorzystując te dane, wybrano 111 transfektantów do dalszego postępowania i oceny w statycznej hodowli. Hodowle wybranych linii komórkowych namnożono i adaptowano do pożywki zawierającej niski poziom surowicy (zawierającej BSA (albuminę surowicy bydlęcej) i dodany 1% dFCS) i przeprowadzono dalszą ocenę produktywności w hodowli statycznej (ELISA i pomiar poziomu konfluencji). 65 najlepiej ocenionych kolonii wybrano do dalszego postępowania. Wstępną ocenę produktywności wybranych linii komórkowych przeprowadzono w hodowli zawiesinowej w kolbie do wytrząsania kolejnych partii (ang. batch shake fiask) w pożywce zawierającej niski poziom surowicy (zawierającej BSA i dodany 1% dFCS). W oparciu o stężenie zebranych przeciwciał (za pomocą ELISA) i dopuszczalną charakterystykę wzrostu, do dalszej oceny w pożywce pozbawionej surowicy, stosując hodowlę zawiesinową w kolbie do wytrząsania wybrano 30 linii komórkowych. 10 linii komórkowych wykazujących najwyższe stężenie przeciwciał dalej oceniano w duplikatach hodowli zawiesinowej w kolbie do wytrząsania w pożywce bez surowicy. Stężenia produktu ustalono podczas zbierania określono przez HPLC białka A, zgodnie z dobrze znanymi standardowymi metodami. Wszystkie linie komórkowe wytwarzały przeciwciało 2D2 (oznaczone 2F2T) z dobrą wydajnością w zakresie 671-1333 mg/l, jak ustalono przez HPLC z białkiem A.
11B8T: W podobny sposób otrzymano linię komórkową GS-NS/0 do rekombinacyjnego wytwarzania 11B8 (oznaczonego 11B8T) dokonując następujących drobnych modyfikacji procedury transfekcji.
Przeprowadzono cztery transfekcje komórek gospodarza NS/0 przez elektroporację plazmidowego DNA, stosując powyższy plazmid liniowy DNA. Po mikroskopowej ocenie uzyskanych kolonii, w celu sprawdzenia czy ich rozmiar jest odpowiedni do oznaczania (pokrywają więcej niż 60% dna studzienki) i potwierdzenia, że w każdej studzience jest obecna tylko jedna kolonia, supernatanty z 596 transfektantów przeszukiwano pod kątem złożonego przeciwciała za pomocą testu IgG,KELISA. Wykorzystując te dane, wybrano 100 transfektantów do dalszego postępowania i oceny w statycznej hodowli. Hodowle wybranych linii komórkowych namnożono i adaptowano do pożywki zawierającej niski poziom surowicy (zawierającej BSA (albuminę surowicy bydlęcej) i dodany 1% dFCS) i prowadzono dalszą ocenę produktywności w hodowli statycznej (ELISA i pomiar poziomu konfluencji). 60 najlepiej ocenionych kolonii wybrano do dalszego postępowania, a także 13 dodatkowych linii komórkowych, dla których niedostępne były dane dotyczące produktywności. Wstępną ocenę produktywności wybranych linii komórkowych przeprowadzono w hodowli zawiesinowej w kolbie do wytrząsania w pożywce zawierającej niski poziom surowicy (zawierającej BSA i dodany 1% dFCS). W oparciu o stężenie zebranych przeciwciał (za pomocą ELISA) i dopuszczalną charakterystykę wzrostu, do dalszej oceny, w pożywce pozbawionej surowicy stosując hodowlę zawiesinową w kolbie do wytrząsania, wybrano 10 linii komórkowych. Stężenia produktu przy zbieraniu ustalono przez HPLC białka A zgodnie z dobrze znanymi metodami standardowymi. Na tej podstawie odrzucono jedną linię komórkową. Uzyskane 9 linii komórkowych wytwarzało przeciwciało 11B8 (oznaczone 11B8T) z dobrą wydajnością w zakresie 354-771 mg/l, jak ustalono przez HPLC z białkiem A.
P r z y k ł a d 4 Porównanie rekombinowanego 2F2 pochodzącego z transfektoma i hybrydoma
Stosując elektroforezę w żelu (SDS-PAGE i elektroforezę w natywnym żelu agarozowym) wykazano, że 2F2 i 2F2T mają taki sam rozmiar i jedynie w niewielkim stopniu różni je ładunek elektryczny.
Następnie, 2F2 i 2F2T wiążą się z komórkami NS/0 i Raji transfekowanymi CD20 z podobnym powinowactwem, jak mierzono w cytometrii przepływowej za pomocą FACScalibur™ (Becton Dickinson, San Diego, CA, USA).
Obserwowano brak wiązania z nietransfekowanymi komórkami NS/0, wykazując w ten sposób specyficzność 2F2 i 2F2T. 2F2 i 2F2T także indukują CDC w sposób zależny od stężenia w tym samym stopniu w komórkach ARH-77 (białaczka IgG komórek plazmatycznych), komórkach Daudi, komórkach DOHH (oporny chłoniak immunoblastycznych komórek B powstały z grudkowego chłoniaka centroblasycznego/centrolitycznego, DSMZ, Braunschweig, Germany) i komórkach Raji, co wykazano przez pomiar lizy komórek (liczbę komórek pozytywnych wobec PI) w cytometrii przepływowej
PL 218 660 B1 (FACScalibur). W drugim eksperymencie, stężenia 2F2 i 2F2T utrzymywano na stałym poziomie, podczas gdy dodawano różne stężenia surowicy. Nie zaobserwowano istotnych różnic między 2F2 i 2F2T.
Na koniec 2F2 i 2F2T związane z CD20, który jest zasocjowany z komórką, silnie i w tym samym stopniu wiązały czynnik C1q dopełniacza. Eksperyment prowadzono w komórkach Daudi, komórkach DOHH i komórkach Raji stosując przeciwciała poliklonalne przeciwko C1q sprzężone z fluoresceiną do wykrywania wiązania C1q.
P r z y k ł a d 5 Charakterystyka wiązania ludzkich przeciwciał przeciwko CD20
Wiązanie z różnymi liniami komórkowymi: Komórki NS/0, NS/0 transfekowane ludzkim CD20, Daudi i Raji inkubowano przez 30 min w 4°C z nadsączem komórkowym zawierającym ludzkie przeciwciała 2F2, 7D8 i 11B8, po czym inkubowano z przeciwciałem anty-ludzkie IgG sprzężonym z FITC. Wiązanie oceniano cytometrią przepływową stosując cytometr przepływowy FACscalibur. Intensywności fluorescencji porównywano z kontrolą negatywną stanowiącą dopasowane izotypowo próbki. Jak przedstawiono na Figurze 4, wszystkie trzy przeciwciała wiązały komórki NS/0 transfekowane ludzkim CD20 podczas gdy nie obserwowano wiązania z rodzicielskimi, nietransfekowanymi komórkami NS/0. Wszystkie trzy przeciwciała wiązały się także z dwoma różnymi liniami chłoniaka komórek B Burkitta (Raji i Daudi) wskazując, że 2F2, 7D8 i 11B8 są specyficzne dla CD20. Nadsącz zawierający 7D8 lub 11B8 testowano w warunkach nienasycenia, a więc obserwowano niższe intensywności fluorescencji w porównaniu z 2F2.
Wartość EC50 dla 2F2, jak ustalono cytometrię przepływową: W celu ustalenia powinowactwa 2F2 do CD20 wyrażanego na ludzkich komórkach B, sporządzono krzywą wiązania 2F2 używając izolownaych PBMC od trzech ludzkich dawców i bramkując komórki negatywne względem CD3. Izolowane PBMC inkubowano przez 1 godzinę z zakresem stężeń znakowanego FITC 2F2 i analizowano za pomocą FACS oraz ustalano średnią intensywność fluorescencji (MFI, ang. mean fluorescence intensity). Wartości MFI przedstawiono na Figurach 5A i 5B jako funkcję stężenia przeciwciała. Wartości EC50 wyliczano z zastosowaniem Graph Pad Prism 3.02 z regresją nieliniową. Wartość EC50 dla 2F2 u ludzi była podobna dla wszystkich trzech dawców ze średnią (± odchylenie standardowe) 287 ± 12.7 ng/ml (1,9 ± 0,1 nM).
125
Wiązanie wyznakowanych 125I przeciwciał monoklonalnych (mAb) z komórkami wyrażającymi
CD20: mAb jodowano stosując lodobeads (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Wyznakowane 125I mAb seryjnie rozcieńczano i inkubowano z komórkami Ramos-EHRB (2 godziny w 37°C) w obecności azydku
125 sodu i 2-deoksyglukozy w celu zapobiegania endocytozie. Związane z komórkami i wolne 125I mAb następnie rozdzielano przez wirowanie przy 14000 x g przez 2 min przez mieszaninę olejów ftalanowych, pozwalając na szybkie rozdzielenie bez zaburzania równowagi wiązania. Osadzone komórki wraz ze związanymi przeciwciałami następnie zliczano za pomocą licznika gamma (Wallac UK Ltd, Milton Keynes, UK).
Jak przedstawiano na Figurze 6 2F2 i 11B8 wykazują podobną KD (lub podobne punkty saturacji) wskazując, że oba przeciwciała wiążą się z podobnym powinowactwem. Jednakże 11B8 ulega wysyceniu na niższym poziomie niż 2F2 wskazując, że rozpoznaje inną formę CD20. Zgadza się to także z dalszym eksperymentem wykazującym, że podobna liczba cząsteczek przeciwciał 2F2 i rituximabu wiąże się z CD20 na komórkach Ramos-EHRB i komórkach Daudi, jak wykazano przez 5 podobne poziomy saturacji wiązania (około 2-3 x 105 cząsteczek przeciwciała na komórkę). 11B8 i B1, 5 w odróżnieniu, ulegają wysyceniu w połowie tego poziomu i tylko około 1-2 x 105 cząsteczek przeciwciała wiąże się z komórkami Ramos-EHRB (Figura 7A) i komórkami Daudi (Figura 7B).
Aby wykluczyć możliwość, że przeciwciała jodowane wiążą się przez receptory Fc, krzywe wiązania potwierdzono przez zastosowanie fragmentów F(ab')2 przeciwko CD20. I znowu, podobna liczba fragmentów F(ab')2 F2F i rituximabu związała oba rodzaje komórek Ramos-EHRB i Daudi. Także w tych eksperymentach, liczba cząsteczek przeciwciał 2F2 związanych z komórkami Ramos-EHRB i komórkami Daudi ulega wysyceniu w około dwukrotnie większej liczbie niż liczba cząsteczek 11B8 i B1 związanych z komórkami.
Szybkość dysocjacji: Aby ustalić szybkość dysocjacji mAb, komórki Ramos-EHRB (końcowa ob125 jętość 1 ml w obecności azydku/2DOG) inkubowano przez 2 godziny w 37°C z 2 μg/ml I mAb w celu uzyskania maksymalnego wiązania. Po wirowaniu w mikrowirówce (2000 rpm przez 2 min) nadsącz usuwano, osad szybko zawieszano w 1 ml pożywki i natychmiast przenoszono do 9 ml pożywki w 37°C w 15 ml probówce o stożkowym dnie. Przez następne 2 godziny 0,4 ml próbki pobierano w różnych punktach czasowych i rozdzielano na olejach ftalanowych, w celu ustalenia poziomu wyPL 218 660 B1 znakowanych radioaktywnie mAb pozostających na powierzchni komórki. Jak przedstawiono na Figurze 8, oba 2F2 i 11B8 dysocjowały od CD20 znacząco wolniej niż rituximab lub B1.
Szybkości dysocjacji fragmentów F(ab)2 przeciwko CD20: Komórki Ramos-EHRB wysycano 125 μg/ml znakowanych I fragmentów F(ab)2 2F2, 11B8, i rituximabem, odpowiednio. Komórki Ramos-EHBR płukano i inkubowano w obecności dużego stężenia niewyznakowanego przeciwciała. Maksymalne (początkowe) wiązanie z komórkami Ramos-EHRB ustawiono jako 100%. W kilku punktach czasowych przez następne 3 godziny po załadowaniu, pobierano 0,4 ml próbek i rozdzielano na olejach ftalanowych w celu ustalenia poziomu wyznakowanych radioaktywnie mAb pozostających na powierzchni komórki. Jak można zobaczyć na Figurze 9, 2F2 i 11B8 dysocjowały znacznie wolniej z powierzchni CD20 niż riruximab. W 90 min, około 50% cząsteczek F(ab)2 rituximabu było związane z komórką, podczas gdy połowa cząsteczek F(ab)2 2F2 oddysocjowała po 3 godzinach. Wartości kd (koff) dla 2F2, 11B8T, i rituximabu obliczano następująco:
F(ab)2 2F2: kd = In 2/t1/2 (sek) = In 2/10800 (sek) = 6,4 x 10-5 sek-1
F(ab)2 11B8T: kd = In 2/t1/2 (sek) = In 2/9000 (sek) = 7,7 x 10-5 sek-1
F(ab)2 rituximab: kd = ln 2/t1/2 (sek) = ln 2/5400 (sek) = 1,3 x 10-5 sek-1
Funkcjonalna szybkość odłączania mAb przeciwko CD20: Wpływ wolnej dysocjacji 2F2 w porównaniu do rituximabu oceniano w funkcjonalnym oznaczeniu CDC. Do tego celu, komórki Daudi lub SU-DHL4 inkubowano wstępnie z 10 μg/ml mAB przeciwko CD20 lub przeciwciałem będącym kontrolą izotypową, płukano i inkubowano w pożywce do różnych punktów czasowych. W tych punktach czasowych po rozpoczęciu oznaczenia, próbki inkubowano z komplementem (normalna surowica ludzka 10% obj./obj.), a następnie inkubowano przez dalsze 45 min 37°C. Potem, określano lizę komórek przez FACS za pomocą metody barwienia PI (jodkiem propidyny). % zlizowanych komórek (pozytywnych względem PI) przedstawiono na Figurze 10A (komórki Daudi) lub Figurze 10B (komórki SU-DHL4) w funkcji czasu inkubacji. 2F2 indukowało silną CDC w obu liniach komórkowych i wciąż powodowało lizę do 90% komórek po 6 godzinach, wskazując, że wysycenie CD20 komórek pozostało wystarczająco wysokie w większości komórek do indukcji zależnej od dopełniacza lizy. Rituximab, dla odróżnienia i zgodnie z powyższymi badaniami szybkości dysocjacji, dysocjował szybko od komórek i nie indukował specyficznej lizy w czasie 6 godzinnego okresu inkubacji. 11B8 stosowano jako kontrolę i nie indukowało ono CDC.
P r z y k ł a d 6 CDC ludzkich przeciwciał przeciwko CD20
Przygotowanie surowicy: Surowicę do wywołanej dopełniaczem lizy przygotowywano przez pobranie krwi od żywych ochotników do probówek „autosep gel i „clot activator vacutainer (BD biosciences, Rutherford, NJ), które utrzymywano w temperaturze pokojowej przez 30-60 min, a następnie wirowano przy 3000 rpm przez 5 min. Surowice zbierano i przechowywano w -80°C.
Cytometria przepływowa: Do cytometrii przepływowej używano cytometru przepływowego FACScalibur z oprogramowaniem CellQuest pro (BD Biosciences, Mountain View, CA). Zbierano co najmniej 5000 zdarzeń do analizy przy wykluczeniu resztek komórkowych przez dopasowanie progu rozpraszania w kierunku czołowym i bocznym (FCS, ang. forward sideward scatter).
Kinetyka CDC: w pierwszym zestawie eksperymentów (n=3) ustalano kinetykę CDC pięciu różnych linii komórek B, tj. Daudi, Raji, DOHH i ARH77 przez dodanie 10 μg/ml 2F2, rituximabu i kontrolnego przeciwciała IgG, odpowiednio na 10 min przed dodaniem ludzkiej surowicy. W kilku odstępach czasowych (do jednej godziny) po indukcji CDC, komórki zawieszano w roztworze PI i przez cytometrię przepływową mierzono lizę komórek (liczbę komórek pozytywnych względem PI). Wyniki zaprezentowano na Figurach 11A (komórki ARH-77), 11B (komórki Daudi) 11C (komórki Raji, 11D (DOHH) i 11E (SU-DHL-4). Jak widać, dodanie przeciwciał indukowało lizę komórek w ciągu 5 min. Co interesujące, dodanie 2F2 powodowało znaczącą lizę komórek w więcej niż 80% we wszystkich pięciu liniach komórek B. Rituximab indukował więcej niż 80% lizy komórek tylko w liniach komórkowych SO-DHL-4 i Daudi, podczas gdy liza komórek linii komórkowej DOHH wynosiła ~50%, a w li-niach komórkowych ARH-77 i Raji mniej niż 20%. Lizy nie obserwowano przy przeciwciałach kontrolnych IgG (dane przedstawione tylko na Figurze 11B).
Miareczkowanie CDC surowicy: W oddzielnym zestawie eksperymentów (n=5) NHS (normalna ludzka surowica) miareczkowano w dwóch różnych stężeniach przeciwciał 0,5 μg/ml i 5 μg/ml. Komórki inkubowano wstępnie z 2F2 lub rituximabem przez 10 minut przed dodaniem zakresu stężeń NHS. W 45 min po indukcji CDC, komórki zawieszano w roztworze PI. Lizę komórek (liczba komórek pozytywnych dla PI) mierzono za pomocą cytometrii przepływowej. Figury 12A-D przedstawiają procent zlizowanych (pozytywnych względem PI) komórek w funkcji stężenia NHS. Figura 12A przedstawia lizę komórek
PL 218 660 B1
Daudi, Figura 12B przedstawia lizę komórek ARH-77, Figura 12C lizę komórek DOHH, a Figura 12D lizę komórek Raji. Zwiększoną lizę komórek obserwowano wraz ze wzrostem stężenia NHS. Dodanie 2F2 powodowało maksymalną lizę komórek Daudi przy najwyższym stężeniu NHS i przeciwciał. Rituximab indukował około 50% lizy komórek Daudi przy najwyższym stężeniu NHS.
W komórkach ARH-77 tylko najwyższe stężenie NHS i 2F2 prowadziło do około 75% lizy komórek. Niższe stężenia były niewystarczające do indukcji lizy komórek ARH-77. Rituximab nie był zdolny do indukcji lizy komórek ARH-77 w tym eksperymencie.
2F2 miało zdolność do indukcji zależnej od stężenia NHS lizy komórek DOHH zarówno przy wysokim jak i niskim stężeniu, podczas gdy rituximab nie był zdolny do indukcji lizy w tych warunkach.
Na koniec, 2F2 indukowało zależną od stężenia NHS lizę komórek Raji, co było widoczne jedynie przy zastosowaniu 5 μg/ml mAb. Lizy nie obserwowano dla rituximabu.
W tych eksperymentach nie obserwowano lizy dla przeciwciała będącego kontrolą izotypową.
Miareczkowanie CDC przeciwciał: Aby zmierzyć zdolność przeciwciał przeciwko CD20 do indukcji CDC w niskich stężeniach, przeprowadzono eksperyment, gdzie przeciwciała rozcieńczano (n=6). Różne linie komórkowe inkubowano wstępnie z zakresem stężeń 2F2 i rituximabu, odpowiednio przez 10 min przed dodaniem NHS. Po 45 minutach inkubacji w 37°C (kiedy zachodzi maksymalna liza) komórki zawieszano w roztworze PI i lizę komórek (liczba komórek pozytywnych dla PI) mierzono za pomocą cytometrii przepływowej. Figury 11A (komórki Daudi), 13B (komórki DOHH), 13C (ARH-77) i 13D (komórki Raji) przedstawiają procent zlizowanych (pozytywnych względem PI) komórek w funkcji stężenia przeciwciał. Oba 2F2 i rituximab indukowały zależny od stężenia wzrost lizy. 2F2 indukowało ponad 80% lizę komórek Daudi przy dodaniu 2 μg/ml, podczas gdy rituximab nie osiągał tego poziomu nawet po dodaniu 10 μg/ml. Następnie 2F2 indukowało więcej niż 80% lizę komórek DOHH przy 0,4 μg/l, podczas gdy minimalną lizę obserwowano dla rituximabu przy tym stężeniu. Maksymalną lizę komórek DOHH dla rituximabu (-30% wszystkich analizowanych komórek) osiągano przy 10 μg/ml. Indukcja lizy komórek ARH-77 i Raji przez 2F2 była niższa, ale wciąż ~70% lizę osiągano przy stężeniu przeciwciał 10 μg/ml. Przy najwyższym stężeniu rituximab indukował lizę tylko dla ~23% komórek ARH-77 i -6% komórek Raji.
W podobnym eksperymencie 2F2, 2F2T, 11B8T i rituximab badano w kierunku zdolności do indukowania CDC linii komórkowych Daudi i Raji, patrz Figury 14A i 14B. Także w tym eksperymencie ponad 80% lizy komórek Daudi obserwowano dla (pochodzącego z transfektoma) 2F2T przy 10 μg/ml, podczas gdy rituximab osiągał zaledwie 60% lizy nawet przy 10 μg/ml, Figura 14A. Liza komórek Daudi przez 2F2T była jednakowa jak liza otrzymana przez pochodzące z hybrydoma 2F2.
Liza komórek Raji była trudniejsza, ale znowu oba 2F2 i 2F2T indukowały lizę komórek Raji w podobnym stopniu (Figura 14B). Rituximab nie był w stanie zaindukować CDC komórek Raji, co pozostaje w zgodzie z eksperymentem przedstawionym na Figurze 13D.
Jak można zaobserwować z Figur 14A i 14B ani komórki Daudi ani Raji nie były wrażliwe na CDC pod wpływem 11B8. B1 indukowało lizę komórek Daudi, ale tylko w niewielkim stopniu i nie było zdolne do indukcji lizy komórek Raji.
Aktywność CDC przeciwciał przeciwko CD20 w komórkach Daudi: Aby ustalić aktywność CDC każdego przeciwciała, za pomocą analizy komórek wybarwionych jodkiem propidyny (PI) z zastosowaniem FACS oceniano podwyższoną przepuszczalność błony. Pokrótce, komórki Daudi płukano i zawieszano w RPMF/1% BSA z gęstością 1 x 106 komórek/ml. Dodawano różne stężenia ludzkich przeciwciał monoklonalnych do komórek Daudi i pozwalano na wiązanie CD20 na komórkach przez 15-20 min w temperaturze pokojowej. Następnie, dodawano surowicę jako źródło dopełniacza do końcowego stężenia 20% (obj./obj.) i mieszaninę inkubowano przez 45 min w 37°C. Komórki następnie przechowywano w 4°C do czasu analizy. Każdą próbkę (150 μθ dodawano następnie do 10 μl roztworu PI (10 μg/ml w PBS) w probówce do FACS. Mieszaninę natychmiast oceniano cytometrią przepływową. Jak przedstawiono na Figurze 15A, 2F2 i 7D8 wykazywały większą aktywność CDC w porównaniu do rituximabu.
W drugim eksperymencie, komórki znakowano ludzkimi przeciwciałami monoklonalnymi jak wyżej, następnie płukano i inkubowano w PBS przez 45 minut w 37°C przed dodaniem ludzkiej surowicy. Zapewniło to, że tylko przeciwciało związane z komórką w czasie dodawania surowicy było zdolne do aktywacji dopełniacza do lizy komórki. Jak przedstawiono na Figurze 15B osłabioną aktywność CDC stwierdzono dla rituximabu w porównaniu do 2F2 i 7D8 wskazując, że płukanie komórek przed dodaniem surowicy nie wpływa na ludzkie przeciwciała (2F2 i 7D8).
PL 218 660 B1
Aktywność CDC przeciwciał przeciwko CD20 w komórkach Raji: Aktywność CDC oceniano w komórkach Raji, które mają względnie dużą powierzchniową ekspresję CD55 i CD59, a co z tego wynika są bardziej odporne na atak dopełniacza. Ludzkie przeciwciała dodawano do komórek Raji i pozwalano na wiązanie przez 15 min. Ludzką surowicę (20%) dodawano i mieszaninę inkubowano przez 45 min w 37°C. Jak przedstawiono na Figurze 16A, rituximab był nieefektywny w pośredniczeniu CDC komórek Raji, podczas gdy znaczące poziomy lizy komórek zaszły w komórkach Raji opsonizowanych 2F2 lub 7B8. Zgodnie z powyższym, 2F2 i 7D8 mają unikalną zdolność do lizy komórek docelowych dodatnich pod względem CD55/59.
W oddzielnym eksperymencie, komórki Raji inkubowano wstępnie z wysycającymi stężeniami mAb przeciwko CD55 (stężenie końcowe 5 gg/ml) i przeciwko CD59 (stężenie końcowe 5 gg/ml), aby zablokować wpływ cząsteczek obronnych tego dopełniacza. Następnie dodawano ludzkie przeciwciała przeciwko CD20 wraz z surowicą (20%) jak wyżej na 45 min w 37°C. Jak przedstawiono na Figurze 16B, blokowanie cząsteczek CD55 i CD59 powodowało niemal 100% lizę komórek Raji przez ludzkie przeciwciała 2F2 lub 7D8, podczas gdy obserwowano zaledwie 25% wzrost lizy komórek gdy stosowano rituximab.
Rola inhibitorów dopełniacza I - ekspresja cząsteczek powierzchniowych: Jako, że inhibitory dopełniacza, takie jak CD55 i CD59, zdają się pełnić ważną rolę we wrażliwości na CDC indukowane rituximabem, przeprowadzono eksperyment mający na celu ustalenie ekspresji tych cząsteczek w liniach komórek B będących przedmiotem badań (Raji, Daudi, DOHH, ARH-77, i SU-DHL-4).
Komórki barwiono sprzężonymi z FITC przeciwciałami anty-CD55, anty-CD59 i anty-CD20, a ekspresję cząsteczek analizowano metodą cytometrii przepływowej. Wyniki przedstawiono poniżej w Tabeli 1.
T a b e l a 1
Ekspresja CD20 CD55 CD59
ARH-77 ++ ++++ ++
Raji + ++ +++
DOHH ++ +++ ++
SU-DHL-4 +++ + ++
Daudi ++ + +
Rola inhibitorów dopełniacza II - blokowanie CD55 i CD59: Aby dalej badać rolę CD55 i CD59 w CDC indukowanej przez przeciwciało przeciwko CD20, przed indukcją CDC obie cząsteczki inhibitorów CDC blokowano specyficznymi przeciwciałami (n=3). Stosowano komórki Raji, ponieważ sam 2F2 5 indukował tylko częściową lizę. Komórki Raji (1 x 105 komórek/50 gl) inkubowano wstępnie z zakresem stężeń 2F2 i rituximabu wraz z przeciwciałami przeciwko CD55 (5 gg/ml) lub przeciwko CD59 (5 gg/ml) przez 10 min, przed dodaniem połączonej NHS (20%). 45 min po indukcji CDC, komórki zawieszano w roztworze PI. Lizę komórek (liczbę komórek pozytywnych względem PI) mierzono w cytometrii przepływowej. Figury 17A-C przedstawiają procent zlizowanych (pozytywnych względem PI) komórek w funkcji stężenia przeciwciał oraz jeden eksperyment reprezentatywny dla wszystkich trzech eksperymentów. Figura 17A przedstawia inkubację komórek Raji z przeciwciałem przeciwko CD55, Figura 17B inkubację komórek Raji z przeciwciałem przeciwko CD59, a Figura 17C inkubację komórek Raji z przeciwciałami przeciwko CD55 i CD59.
Jak można zobaczyć na Figurze 17A, dodanie przeciwciała przeciwko CD55 nie wpływało na CDC indukowane 2F2 lub rituximabem. Dodanie przeciwciała przeciwko CD59 zwiększało wrażliwość komórek na oba: 2F2 i rituximab o ~30% (Figura 17B).
Dodanie obu: przeciwko CD55 i CD59 dalej wzmacniało lizę komórek indukowaną przeciwko CD20 o ~30% (Figura 17C).
Rola czynników dopełniacza jak ustalono przez cytometrię przepływową I - wiązanie C1q: Przeciwciała przeciwko CD20 (2F2 i rituximab) i kontrolne przeciwciało izotypowe dodano do różnych linii komórek B. Po 10 min inkubacji, dodano NHS (1% obj./obj.). Po dalszej inkubacji przez 10 min w 37°C i płukaniu komórek, nadsącz usunięto i osad komórek inkubowano z przeciwciałem przeciwko C1q sprzężonym z FITC. Dane pokazują średnią intensywność fluorescencji komórek wybarwionych C1q i są zaprezentowane na Figurach 18A (Daudi), 18B (ARH-77), 18C (DOHH), i 18D (Raji) (n=6). Wyniki
PL 218 660 B1 wskazują zależny od stężenia przeciwciała wzrost w wiązaniu C1q przez 2F2, niezależnie od badanej linii komórek B. Co więcej, wiązanie C1q przez 2F2 było zawsze wyższe niż wiązanie przez rituximab we wszystkich badanych liniach. Nie zaobserwowano wzrostu średniej fluorescencji dla kontrolnego przeciwciała izotypowego (dane nie przedstawione).
Rola czynników dopełniacza jak ustalono przez cytometrię przepływową II - aktywacja dopełniacza drogą klasyczną: Unieruchomienie C4c na komórkach opłaszczonych przeciwciałami jest wskaźnikiem aktywacji dopełniacza drogą klasyczną. Przeciwciała przeciwko CD20 (2F2 i rituximab) i kontrolne przeciwciało izotypowe dodano do różnych linii komórek B. Po 10 min inkubacji, dodano NHS (1 obj./obj.%). Po dalszej inkubacji i płukaniu komórek, nadsącz usunięto i osad komórek inkubowano z przeciwciałem przeciwko C4c sprzężonym z FITC. Dane pokazują średnią intensywność fluorescencji komórek wybarwionych C4c i są zaprezentowane na Figurach 19A (Daudi), 18B (ARH-77), 18C (DOHH), i 18D (Raji) (n=6). Unieruchomienie czynnika dopełniacza C4c do 2F2 pokazano we wszystkich badanych liniach komórek B (n=3) z maksimum osiągniętym dla ~1 μg/ml przeciwciała. Unieruchomienie C4c po wiązaniu 2F2 było znacznie wyższe niż po rituximabie, niezależnie od badanej linii komórkowej. Nie zaobserwowano wzrostu średniej fluorescencji dla kontrolnego przeciwciała izotypowego (dane nieprzedstawione).
CDC w surowicy inaktywowanej termicznie: Komórki (komórki Daudi, komórki ARH-77 lub komórki Raji) i przeciwciała (rituximab, 2F2, 2F2T, 11B8, i kontrolne przeciwciało izotypowe HuMab-KLH IgG1) inkubowano wstępnie z zakresem stężeń przeciwciał przeciwko CD20 przez 10 min, zanim dodano NHS (aktywna lub inaktywowana termicznie w łaźni wodnej w 57°C przez 30 min). W 45 min po indukcji CDC, komórki zawieszono w roztworze PI. Lizę komórek (liczbę komórek pozytywnych względem PI) mierzono w cytometrii przepływowej. Lizy komórek nie zaobserwowano w obecności surowicy inaktywowanej termicznie, niezależnie od linii komórkowej i stosowanego przeciwciała przeciwko CD20; w obecności surowicy inaktywowanej termicznie nie obserwowano CDC.
P r z y k ł a d 7 ADCC ludzkich przeciwciał przeciwko CD20
Test ADCC I
Wzbogacanie ludzkich neutrofili: Komórki polimorfojądrzaste (neutrofile, PMN, ang. polymorphonuclear cell) uzyskiwano z heparynizowanej próbki pełnej krwi. Krew dwukrotnie rozcieńczono w RPMI 1640, rozwarstwiano na Ficoll (Lymphocyte Separation Medium 1077 g/ml, 710 g, RT, 20 min; BioWhittaker, kat. 17-829E, nr 0148 32) i wirowano przy 2000 rpm przez 20 minut. Warstwę komórek jednojądrzastych usuwano, a erytrocyty znajdujące się w osadzie zawierającym neutrofile poddawano lizie hipotonicznej za pomocą zimnego roztworu NH4CI (155 mM NH4CI, 10 mM NaHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,4). Pozostałe neutrofile dwukrotnie przemywano i zawieszano w RPMI 1640 z dodatkiem 10% FCS (RPMI-10).
Wzbogacanie ludzkich jednojądrzastych komórek krwi obwodowej. Ludzką krew rozcieńczono dwukrotnie w RPMI 1640 i komórki krwi rozwarstwiono na Ficoll (Lymphocyte Separation Medium 1077 g/ml, 710 g, RT, 20 min; BioWhittaker, Cambrex Bio Science Verviers, Verviers, Belgia, kat. 17-829E, nr partii 0148 32). Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (MNC, ang. mononuclear cell) zebrano z interfazy, przemyto i zawieszono w pożywce hodowlanej RPMI 1640 z dodatkiem 10% FCS, 2 mM L-glutaminy, 5 U/ml penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny (wszystkie z BioWhittaker), do którego dodano 25 mM HEPES (BioWhittaker).
Przygotowanie testu ADCC: Docelowe limfocyty B (świeżo izolowane limfocyty B lub komórki z linii limfocytów B) znakowano za pomocą 20 uCi Cr (Amersham Biosciences, Uppsala, Szwecja) przez 2 godziny. Po dokładnym płukaniu w RPMI-10, komórki doprowadzano do gęstości 1 x 105 komórek/ml. Pełną krew lub izolowane komórki efektorowe (50 ul; MNC, PMN) lub osocze (50 ul), uczulające przeciwciała (50 ul), i RPMI-10 (50 ul) dodawano do płytek okrągłodennych mikrotitracyjnych (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Niemcy). Testy rozpoczynano dodając komórki docelowe (50 ul) do końcowej objętości 200 ul. Dla izolowanych komórek efektorowych stosunek komórek efektorowych do docelowych (E:T; ang. effector to target) wynosił 40:1. Dla próbek pełnej krwi stosowano ilość 33% obj./obj. odpowiadającą stosunkowi komórek efektorowych do docelowych wynoszącemu około 40:1. Po inkubacji (3 godziny, 37°C) reakcje zatrzymywano przez wirowanie, i w potrójnych po51 wtórzeniach mierzono uwalnianie 51Cr w zliczeniach na minutę (cpm) stosując licznik scyntylacyjny. Procent cytotoksyczności komórkowej obliczano stosując następujący wzór:
% lizy specyficznej = (cpm doświadczalne - cpm bazowe)/(cpm maksymalne - cpm bazowe) x 100 w którym maksymalne uwalnianie 51Cr określano dodając do komórek docelowych kwas nadchlorowy (końcowe stężenie 3%), a bazowe uwalnianie mierzono bez obecności uczulających przeciwciał i komórek efektorowych.
PL 218 660 B1
Statystyka: Dane analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA, a następnie za pomocą porównań wielokrotnych testem Tukey post-hoc. Analizę prowadzono za pomocą
Graph Pad Prism (wersja 3.02 dla Windows, Graph Pad Software, San Diego, CA, USA).
Liza komórek ARH-77: W pierwszym zestawie doświadczeń jako komórki docelowe stosowano komórki ARH-77 (Fig. 20). Dodanie 2F2 (n=3), rituximabu (n=3) lub 11B8T (n=1) powodowało zależną od MNC lizę komórek ARH-77 wynoszącą około 50%. Nie obserwowano specyficznej lizy w obecności neutrofili. Dodanie osocza (w celu oceny roli dopełniacza) indukowało lizę komórek ARH-77 po inkubacji z 2F2, ale nie po inkubacji z rituximabem (p<0,05, 2F2 w porównaniu z próbką bez przeciwciała, ANOVA) lub 11B8T. W obecności pełnej krwi liza komórek ARH-77 zwiększała się po inkubacji z 2F2 (p<0,05, 2F2 w porównaniu z rituximabem i 2F2 w porównaniu z próbką bez przeciwciała, ANOVA), ale nie z rituximabem. Specyficzna liza indukowana przez rituximab była w rzeczywistości bardzo niska w obecności pełnej krwi. 11B8T indukowało lizę komórek wynoszącą około 25% (n=1) w obecności pełnej krwi. Przy braku przeciwciał obserwowano niespecyficzną lizę w wysokości 10-15%.
Liza komórek B-CLL: W drugim zestawie doświadczeń komórki przewlekłej białaczki limfatycznej B-komórkowej (B-CLL, ang. chronic B-lymphocytic leukaemia) otrzymane od pacjentów z przewlekłą białaczką limfatyczną B-komórkową B-CLL (n=12) subklonowano przez 5 pasaży, a następnie używano w doświadczeniach jako komórki docelowe (Fig. 21). Pod nieobecność przeciwciał nie obserwowano specyficznej lizy, ale dodanie 2F2, 11B8T lub rituximabu (10 ng/ml) zwiększało specyficzną lizę zależną od MNC do 10-20% (p<0,001, ANOVA). Inkubacja komórek docelowych z osoczem i 2F2 indukowała specyficzną lizę komórek B-CLL, podczas, gdy nie obserwowano specyficznej lizy dla 11B8T lub rituximabu (p<0,001, ANOVA). Co więcej, 2F2 powodowało specyficzną lizę komórek B-CLL po inkubacji z pełną krwią. Nie obserwowano specyficznej lizy komórek B-CLL po inkubacji z pełną krwią dla 11B8T (p<0,01, ANOVA) lub rituximabu (p<0,001, ANOVA). Nie obserwowano specyficznej lizy w obecności neutrofili.
Ponieważ rituximab wywoływał skuteczną ADCC, ale nie CDC badanych komórek nowotworowych, jest możliwe, że indukowana przez pełną krew liza limfocytów B w obecności 2F2 jest zależna od dopełniacza.
Liza komórek białaczki włochatokomórkowej (HCL): W trzecim zestawie doświadczeń oceniano lizę komórek HCL (ang. hairy cell leukaemia) w obecności 2F2, 11B8T, lub rituximabu przez ADCC lub w obecności osocza lub pełnej krwi. Dane przedstawiono na Figurze 22. Podczas, gdy neutrofile nie powodowały ADCC niezależnie od użytego przeciwciała monoklonalnego, 11B8T indukowało zależną od MNC lizę komórek HCL skuteczniej niż 2F2 (p<0,001, ANOVA) czy rituximab (p<0,05, ANOVA). 2F2 i rituximab nie indukowały zależnej od MNC lizy komórek HCL. Zależna od osocza liza komórek ulegała silnemu wzmocnieniu przez 2F2, w porównaniu z rituximabem (p<0,05, ANOVA), 11B8T (p<0,01, ANOVA) czy pod nieobecność przeciwciała (p<0,001, ANOVA). Kiedy badano lizę indukowaną przez przeciwciało przeciwko CD20 w obecności pełnej krwi, 2F2 indukowało całkowitą lizę komórek, działało silniej, niż rituximab (p<0,01, ANOVA), 11B8T czy w przypadku próbki bez przeciwciał (p<0,001, ANOVA).
Liza komórek B-ALL: Stosując komórki pochodzące od dwóch pacjentów zbadano spowodowaną 2F2 i rituximabem indukcję lizy komórek B-ALL przez ADCC lub dopełniacz (Figura 23). Podobnie, jak to zaobserwowano w poprzednich doświadczeniach, 2F2 i rituximab indukowały zależną od MNC ADCC komórek B-ALL w podobnym stopniu. Jednak ponownie stwierdzono, że 2F2 indukowało zależną od osocza i od pełnej krwi lizę komórek B-ALL, podczas, gdy rituximab jej nie indukował.
Liza komórek chłoniaka grudkowego: Kiedy badano lizę komórek chłoniaka grudkowego (n=2), wyłonił się inny obraz (Figura 24). Zaobserwowano niewielką zależną od PMN lizę komórek pod wpływem 2F2, i stwierdzono, że ani 2F2 ani rituximab nie indukują ADCC zależnej od MNC. 11B8T indukował zależną od MNC lizę wynoszącą około 20%. Choć rituximab indukował lizę zależną od osocza na stosunkowo wysokim poziomie, całkowitą zależną od osocza lizę obserwowano pod wpływem 2F2. Także w przypadku pełnej krwi obserwowano całkowitą lizę dla 2F2, podczas, gdy dla rituximabu obserwowano 70% lizę. Dla 11B8T obserwowano minimalną lizę zależną od osocza i od pełnej krwi.
Liza komórek pierwotnego chłoniaka z komórek płaszcza: Specyficzną lizę komórek chłoniaka z komórek płaszcza było trudniej zaindukować (n=1, Figura 25). Dla 2F2, 11B8T i rituximabu obserwowano brak lub minimalną lizę po dodaniu PMN lub MNC i przeciwciał monoklonalnych przeciwko CD20. Jednakże 2F2 indukowało około 40%) lizę w obecności osocza lub pełnej krwi, podczas, gdy dla rituximabu lizie ulegało jedynie 10-20% komórek. 11B8T nie indukowało lizy komórek chłoniaka z komórek płaszcza.
Zależna od stężenia przeciwciał liza komórek ARH-77 w pełnej krwi: W dalszych doświadczeniach (n=4) analizowano zależność od dawki w indukcji ADCC w komórkach ARH-77 w obecności
PL 218 660 B1 pełnej krwi. Jak przedstawiono na Figurze 26, miareczkowanie 2F2 indukowało zależny od dawki wzrost procentowy specyficznej lizy (p<0,05: dawka-efekt, dwuczynnikowa ANOVA) komórek ARH-77. Dla rituximabu nie obserwowano specyficznej lizy komórek ARH-77.
Test ADCC II
6
Przygotowanie komórek docelowych znakowanych 51Cr: Komórki ARH-77 i komórki Raji (3 x 106 ko51 mórek) zbierano w RPMI++, wirowano (1500 rpm; 5 min), zawieszano w 140 μl Cr (Chromium-51; CJS11-1 mCi, partia 12; 140 μl do około 100 μ^) i inkubowano (37°C w łaźni wodnej; 1 godzina). Po opłukaniu (1500 rpm, 5 min, w PBS, 3x) komórki ponownie zawieszano w RPMI++ i zliczano za pomocą barwienia barwnikiem Trypan Blue. Komórki doprowadzano do gęstości 2x106 komórek/ml.
Przygotowanie komórek efektorowych: Świeże jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (MNC) izolowano z 40 ml heparynizowanej krwi przy użyciu Ficoll (Bio Whittaker; podłoże do oddzielania limfocytów, kat. 17-829E) według wskazówek producenta. Po zawieszeniu w RPMI++ komórki zliczano za pomocą barwienia barwnikiem Trypan Blue i doprowadzano do gęstości 1x106 komórek/ml.
Przygotowanie ADCC: 50 μl RPMI++ pipetowano do 96-studzienkowych płytek i dodawano μl komórek docelowych znakowanych Cr. Następnie dodawano 50 μl przeciwciała rozcieńczonego w RPMI++ (końcowe stężenia 10, 1, 0,1, 0,01 μg/ml). Komórki inkubowano (temp. pokojowa, 10 min), i dodawano 50 μl komórek efektorowych, uzyskując stosunek komórek efektorowych do docelowych równy 50:1 (aby ocenić maksymalną lizę, zamiast komórek efektorowych dodawano 50 μl 5% Triton-X-100). Komórki wirowano (500 rpm, 5 min) i inkubowano (37°C, 5% CO2, 4 godziny). Po żwirowaniu komórek (1500 rpm, 5 min), 100 μl supernatantu zbierano do probówek Micronic i zliczano w liczniku gamma. Procent lizy specyficznej obliczano w następujący sposób:
% lizy specyficznej = (cpm próbki - cpm samych komórek docelowych)/(cpm maksymalnej lizy - cpm samych komórek docelowych) x 100
Statystyka: Dane analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA, a następnie za pomocą porównań wielokrotnych testem Tukey post-hoc. Analizę przeprowadzono za pomocą Graph Pad Prism (wersja 3.02 dla Windows, Graph Pad Software, San Diego, CA, USA).
Zależna od stężenia przeciwciał liza komórek ARH-77 i Raji: 2F2T i 11B8T przebadano pod kątem ich zdolności do indukcji ADCC w komórkach ARH-77 i Raji (n=3) w porównaniu z rituximabem.
W ADCC komórek ARH-77 obserwowano zależność dawka-efekt dla przeciwciał monoklonalnych przeciwko CD20 przy wykorzystaniu MNC jako komórek efektorowych (Figura 27). Zarówno 2F2T, jak i 11B8T indukowały specyficzną lizę komórek ARH-77, z maksimum (50%) przy 10 μg/ml przeciwciała. Rituximab indukował zaledwie 25% lizę komórek docelowych. Dodanie kontroli izotypowej (HuMab-KLH) nie indukowało ADCC. Pod nieobecność MNC nie obserwowano specyficznej lizy (dane nieprzedstawione).
Kiedy jako komórki docelowe stosowano komórki Raji, otrzymano podobny wynik, jak w przypadku komórek ARH-77 (Figura 28). Zarówno 2F2T, jak i 11B8T indukowały zależną od MNC lizę komórek Raji, choć w niskich stężeniach 2F2T wydawał się mieć silniejsze działanie niż 11B8T. Maksymalna liza dla 2F2T i 11B8T wynosiła około 35%. Rituximab indukował zależną od MNC lizę komórek Raji, choć tylko 20% komórek docelowych było wrażliwe na rituximab. Dodanie przeciwciała stanowiącego kontrolę izotypową (HuMab-KLH) nie indukowało ADCC. Pod nieobecność MNC nie obserwowano specyficznej lizy (dane nieprzedstawione).
P r z y k ł a d 8 Analiza FRET i rozpuszczalność w Triton-X
Przygotowanie przeciwciał monoklonalnych skoniugowanych z Cy3 i Cy5 do transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET): Przeciwciała monoklonalne bezpośrednio skoniugowano z dwufunkcyjnymi pochodnymi estrowymi imidu kwasu bursztynowego (ang. NHS-ester) Cy3 i Cy5 (Amserham Biosciences UK Ltd) zgodnie ze wskazówkami producenta. Pokrótce, przeciwciała monoklonalne dializowano w 0,1 M buforze węglan/wodorowęglan (pH 9). Następnie rozpuszczono barwnik w H2O, natychmiast dodano do 1 mg przeciwciał i inkubowano w temperaturze pokojowej w ciemności przez 45 minut. Znakowane przeciwciała monoklonalne oddzielono od nieskoniugowanego barwnika za pomocą chromatografii żelowej, używając kolumny PD10-Sephadex G25 zrównoważonej PBS. Stosunki molarne sprzęgania określono spektrofotometrycznie od ε552 = 150/mM/cm dla Cy3, ε650 = 250/mM/cm dla Cy5, i ε280 = 170/mM/cm dla białka, i mieściły się między 5- a 8-krotnym nadmiarem barwnik:białko.
Analiza FRET (ang. fluorescence resonance energy transfer): Komórki Daudi zawieszono w gęstości 5 x 106 komórek/ml w PB S/0,1% BSA, po czym do zawiesiny komórek dodano połączone równomolarnie donorowe przeciwciała monoklonalne skoniugowane z (Cy3) i akceptorowe skoniugoPL 218 660 B1 wane z (Cy5) (końcowe stężenie 10 μg/ml). Komórki inkubowano przez 30 minut w ciemności, w 4°C lub 37°C. Każde doświadczenie obejmowało komórki znakowane przeciwciałami monoklonalnymi skoniugowanymi z donorem i akceptorem po inkubacji wstępnej z 20-krotnym nadmiarem molarnym nieskoniugowanych przeciwciał, i komórki znakowane przeciwciałami monoklonalnymi skoniugowanymi z donorem i akceptorem w obecności równomolarnej ilości niewyznakowanych przeciwciał monoklonalnych. Aby ocenić wiązanie znakowanych antygenów, prowadzono pomiar FRET za pomocą cytometrii przepływowej używając FACScalibur (BD Biosciences). Badano intensywność fluorescencji przy 585 nm (FL2) i 650 nm (FL3), wzbudzanej przy 488 nm, oraz intensywność fluorescencji przy 661 nm (FL4), wzbudzanej przy 635 nm i wykorzystywano do wyliczenia FRET zgodnie z poniższym równaniem, przy czym A to akceptor (Cy5), a D to donor (Cy3). Wszystkie otrzymane wartości skorygowano względem autofluorescencji, używając następującego wzoru:
FRET = FL3(D,A)-FL2(D,A)/a-FL4(D,A)/b w którym a = FL2(D)/FL3(D), a b = FL4(A)/FL3(A).
Parametry poprawki otrzymano wykorzystując dane uzyskane z komórek z pojedynczym znakowaniem, a w celu ustawienia odcięcia danych od zanieczyszczeń i martwych komórek wykorzystano boczne rozproszenie światła. FRET między pochodnymi przeciwciał donorowych i akceptorowych na podwójnie znakowanych komórkach wyrażono jako zwiększoną emisję akceptora przy 488 nm. Większe wartości FRET wskazują bliższą fizyczną asocjację przeciwciał znakowanych donorem i akceptorem lub wyższą gęstość przeciwciał znakowanych akceptorem w sąsiedztwie przeciwciał znakowanych donorem.
Ocena antygenu związanego z tratwami za pomocą badania rozpuszczalności w Triton X-100 (TX): Sposób wykorzystujący cytometrię przepływową w oparciu o rozpuszczalność w Triton X-100 (TX) w niskich temperaturach zastosowano do szybkiej oceny obecności antygenu w mikrodomenach tratw, jak to poprzednio opisano. Pokrótce, komórki Daudi płukano RPMI/1% BSA i zawieszano w gęstości 2,5 x 106/ml. Komórki (100 μθ inkubowano następnie z 10 μg/ml przeciwciała monoklonalnego skoniugowanego z FITC przez 15 minut w 37°C, przemywano zimnym PBS/1% BSA/20 mM azydek sodu (PBS-BS), i dzielono próbkę na pół. Wszystkie próbki trzymano na lodzie do końca testu. Jedną połowę trzymano na lodzie, aby móc ocenić 100% poziomu antygenu powierzchniowego, zaś drugą traktowano 0,5% TX przez 15 minut na lodzie, aby ocenić proporcje antygenu pozostającego w nierozpuszczalnej frakcji tratw. Komórki przechowywano następnie w 4°C do końca testu, płukano jednokrotnie PBS-BS, zawieszano w PBS-BS i oceniano za pomocą cytometrii przepływowej. Aby ocenić konstytutywny poziom asocjacji tratw z docelowymi antygenami, komórki traktowano najpierw 0,5% TX przez 15 minut na lodzie i płukano w PBS-BS przed związaniem z przeciwciałami monoklonalnymi znakowanymi FITC.
Jak przedstawiono na Figurze 29A, 29B, i 29, analiza transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET) wskazuje grupowanie CD20 na skutek inkubacji z 2F2 lub 7D8. Nie obserwowano takiego grupowania na skutek inkubacji z 11B8. Wyniki te są zgodne z danymi z traktowania TX, por. Figura 29C, (np., 2F2 i 7D8, w przeciwieństwie do 11B8 pozostają w nierozpuszczalnej frakcji komórki po związaniu) i wspierają hipotezę, że 2F2 i 7D8, po związaniu, powodują translokację CD20 do przedziału tratw lipidowych w błonie limfocytu B.
Jak przedstawiono na Figurze 30 (wartości FRET i SEM z trzech doświadczeń, przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA, a następnie za pomocą porównań wielokrotnych testem Tukey post-hoc), analiza FRET wskazuje na grupowanie dla rituximabu i 2F2, podczas gdy nie obserwowano grupowania dla 11B8T. Te dane są zgodne z danymi otrzymanymi po traktowaniu 0,5% TX przed wiązaniem z przeciwciałami monoklonalnymi znakowanymi FITC, jak to przedstawiono na Figurze 31 (n=2).
Przygotowanie frakcji tratw lipidowych i Western blotting: Innym sposobem badania asocjacji CD20 z tratwami lipidowymi jest badanie dystrybucji CD20 między frakcjami błony z tratwami i frakcjami bez tratw, przy użyciu sposobu frakcjonowania za pomocą gradientu sacharozy, jak to ujawniono w Deans, J.P., et al., J. Biol. Chem., 1998. 273(1): str. 344-348, używając Optiprep (Sigma) zamiast sacharozy. Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko CD20 (10 μg/ml) wiązały się do komórek Daudi (1 x107) przez 20 minut w 37°C. Po tej inkubacji komórki peletowano, dwukrotnie przemywano PBS i lizowano w lodowato zimnym buforze do lizy (1,0% TX w roztworze soli buforowanym MES (25 mM MES, pH 6,5, 150 mM NaCl, 1 mM fenylometylosulfonylofluorek, 5 μg/ml aprotynina, 5 μg/ml leupeptyna, 10 mM EDTA). Osad komórkowy zawieszono dokładnie i inkubowano przez 20 minut na lodzie. Następnie lizat mieszano z 400 μl zimnego 60% Optiprep (Sigma). Na próbkę
PL 218 660 B1 nałożono 600 μl każdego z 35%, 30%, 25%, 20%, 0% Optiprep w buforze do lizy. Gradienty wirowano przy 40000 rpm w 4°C przez 18 godzin. Sześć frakcji od góry zebrano, poddano elektroforezie w 4-15% żelu SDS-PAGE, przeniesiono na membrany nitrocelulozowe i inkubowano z pierwszorzędowym przeciwciałem (mysia surowica poliklonalna anty-CD20; Serotec, UK), a następnie z drugorzędowym przeciwciałem skoniugowanym z HRP (królicze, antymysie-HRP; Jackson, Bar Harbor, Maine, USA). Sygnał na membranie wizualizowano przy użyciu substratu o przedłużonej trwałości Supersignal West Dura (Pierce, Woburn, MA, USA).
Wyniki przedstawiono na Figurze 32. Jak można zobaczyć, cząsteczki CD20 znajdują się jedynie we frakcji 5 o wysokiej gęstości (komórki nietraktowane). Komórki traktowane rituximabem pokazują wyraźne przesunięcie w rozkładzie CD20 ze znaczącą częścią we frakcjach błonowych 2 i 3 o niskiej gęstości, razem z frakcją, w której oczekuje się błonowych tratw lipidowych. Komórki traktowane 2F2 również wykazywały to przesunięcie do frakcji 2 i 3. W przeciwieństwie do tego, komórki traktowane 11B8T przez 20 minut charakteryzowały się podobną dystrybucją, co komórki nietraktowane, z cząsteczkami CD20 we frakcji 5. Tak więc wiązanie do 2F2 i rituximabu indukuje przesunięcie cząsteczek CD20 do frakcji błonowych o niskiej gęstości, podczas, gdy wiązanie do 11B8T nie powoduje takiego przesunięcia.
P r z y k ł a d 9 Apoptoza komórek z linii chłoniaka Burkitta pod wpływem ludzkich przeciwciał przeciwko CD20
Apoptoza: Komórki Daudi w gęstości 0,5 x 106 w 1 ml pożywki do hodowli tkankowej umieszczono w 24-studzienkowych płaskodennych płytkach z 1 lub 10 μg/ml przeciwciał monoklonalnych lub przeciwciał kontrolnych i inkubowano w 37°C. Po 20 godzinach komórki zbierano, przemywano w buforze wiążącym Anneksyna-V-FITC (BD biosciences) i znakowano Anneksyną-V-FITC (BD biosciences) przez 15 minut w ciemności w 4°C. Komórki trzymano w 4°C do momentu analizy. Każdą próbkę (150 μθ dodawano do 10 μl roztworu PI (10 μg/ml w PBS) w probówkach do FACS. Mieszanie natychmiast analizowano metodą cytometrii przepływowej za pomocą cytometru FACScalibur wyposażonego w oprogramowanie CellQuest Pro (BD Biosciences, Mountain View, CA). Do każdej analizy zbierano co najmniej 10000 zdarzeń.
Indukcja apoptozy w komórkach Daudi: Komórki Daudi inkubowano przez 20 godzin w obecności ludzkich przeciwciał przeciwko CD20 (1 μg/ml) (bez dodatku drugorzędowego przeciwciała tworzącego wiązania krzyżowe). Indukcję apoptozy oceniano za pomocą barwienia Annexin V/PI stosując cytometrię przepływową.
Jak przedstawiono na Figurze 33A-G, 11B8 wyraźnie indukuje apoptozę (podobnie do tej indukowanej przez przeciwciała przeciwko IgM). 2F2 i 7D8 nie indukowały apoptozy komórek Daudi. Jako kontrolę stosowano indukujące apoptozę mysie przeciwciało przeciwko CD20, AT80.
Indukcja apoptozy w komórkach Raji: Indukcję apoptozy w komórkach Raji badano w zakresie stężeń przeciwciał monoklonalnych przeciwko CD20. Figura 34 przedstawia procent komórek pozytywnych na barwienie anneskyną-V. Jak można zobaczyć na Figurze 34, pozytywna kontrola - mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkim CD20, B1, indukowało zależne od stężenia zwiększenie apoptozy komórek Raji z maksimum około 70% dla stężenia przeciwciała wynoszącego 10 μg/ml. Także 11B8 było silnym induktorem apoptozy, powodując apoptozę komórek Raji z maksimum wynoszącym 53,4% przy stężeniu przeciwciała 10 μg/ml. Z drugiej strony 2F2 i rituximab wykazywały bardzo słabe działanie indukujące apoptozę w komórkach Raji, powodując nieznacznie zwiększony poziom apoptozy w porównaniu z poziomami dla kontroli negatywnej.
Indukcja apoptozy w komórkach Daudi: Taki sam obraz rysuje się, kiedy jako komórek docelowych używa się komórek Daudi po dodaniu 1,0 μg/ml przeciwciał monoklonalnych przeciwko CD20 (Figura 35A i 35B). Dane na Figurze 35A przedstawiają całkowitą liczbę komórek pozytywnych w barwieniu anneksyną-V, a dane na Figurze 35B (oś X pokazuje aneksynę-V, a oś Y pokazuje PI) pokazują procent komórek Daudi we wczesnych stadiach apoptozy (pozytywne na aneksynę-V i negatywne na PI) i w późnych stadiach apoptozy (pozytywne na aneksynę-V i PI). Ponownie zarówno B1 (65,9%), jak i 11B8T (56,3%) okazały się silnymi induktorami apoptozy (Figura 36), kiedy stosowano je w stężeniu 1,0 μg/ml. Dodanie 2F2T powodowało niski poziom apoptotycznych komórek Daudi (17%). Dodanie rituximabu powodowało około 29% apoptozy komórek Daudi. Dodanie jako kontroli izotypowej przeciwciała HuMab-KLH nie indukowało apoptozy komórek Daudi (6%).
P r z y k ł a d 10 Homotypowa adhezja komórek z ludzkimi przeciwciałami przeciwko CD20
Homotypowa agregacja koreluje z indukcją apoptozy. Tak więc zbadano, czy przeciwciała monoklonalne przeciwko CD20 mogą indukować homotypową agregację limfocytów B.
PL 218 660 B1
Homotypowa agregacja komórek Ramos-EHRB: Komórki Ramos-EHRB (0,5 x 106 w 1 ml pożywki do hodowli tkankowych) inkubowano w 37°C przez 4 godziny w obecności przeciwciał przeciwko CD20 11B8, 2F2 oraz 7D8 (bez przeciwciała tworzącego wiązania krzyżowe) i oceniano indukcję adhezji homotypowej za pomocą mikroskopii świetlnej (jak to opisano powyżej).
Jak przedstawiono na Figurze 36A-E, 11B8 powodowało znaczną agregację komórek Ramos-EHRB (podobnie do agregacji powodowanej przez mysie przeciwciało przeciwko CD20, AT80). 2F2 i 7D8 nie indukowały homotypowej agregacji komórek Ramos.
Homotypowa agregacja komórek Daudi: Komórki Daudi umieszczano w 24-studzienkowych płaskodennych płytkach z 1 lub 10 μg/ml przeciwciał monoklonalnych przeciwko CD20 lub przeciwciał kontrolnych i inkubowano w 37°C przez 4 godziny. Stopień agregacji homotypowej oceniano przy użyciu mikroskopii świetlnej. Jak przedstawiono na Figurze 37, 2F2 niemal nie indukowało agregacji homotypowej komórek Daudi przy 1,0 μg/ml (i 10 μg/ml, dane niepokazane). Rituximab powodował niewielką agregację homotypową komórek Daudi. W przeciwieństwie do tego przeciwciało B1 było silnym induktorem agregacji homotypowej.
P r z y k ł a d 11 Immunoterapia z zastosowaniem ludzkich przeciwciał przeciwko CD20
Terapia wysokimi dawkami (100 μg) 2F2 i 7D8 u myszy SCID, którym podano komórki Daudi: Myszy SCID otrzymano z Harlan UK Ltd., Blackthorn, Oxon, UK, mnożono i hodowano w warunkach wolnych od patogenów. Komórki Daudi (2,5 x 106) wstrzykiwano dożylnie do żyły ogonowej kohort 12-16-tygodniowych myszy SCID, a 7 dni później wstrzykiwano 100 μg 2F2 lub 7D8 w to samo miejsce. Zwierzęta uśmiercano po pojawieniu się paraliżu kończyn, zgodnie z zaleceniami komisji etycznej. Jak przedstawiono na Figurze 38, terapia 2F2 lub 7D8 powoduje przedłużenie życia myszy.
Terapia wysokimi dawkami (100 μ) 2F2 i rituximabem myszy SCID, którym podano komórki Tanoue: Komórki Tanoue (2,5 x 106 w 200 μl PBS) wstrzykiwano dożylnie do żyły ogonowej kohort 12-16-tygodniowych myszy SCID (Harlan UK Ltd., Blackthorn, Oxon, UK), a 7 dni później wstrzykiwano 100 μg (w 200 μl PBS) przeciwciał monoklonalnych przeciwko CD20 w to samo miejsce. W tym doświadczeniu 2F2 porównywano z rituximabem i B1. Zwierzęta uśmiercano po wystąpieniu paraliżu kończyn. Wyniki przedstawiono na Figurze 39. W dniu 39 zmarły pierwsze dwie myszy kontrolne, a do 54 dnia zmarły wszystkie myszy w tej grupie. Tylko jedna mysz po terapii 2F2 zmarła w tym czasie. Czas przeżycia dla innych myszy w tej grupie był znacząco przedłużony. Jedna mysz zmarła 81 dni po wstrzyknięciu komórek guza, a pozostałe myszy (60% wszystkich) przeżyły zakończenie doświadczenia 100 dni po wstrzyknięciu guza. W przeciwieństwie do tego, rituximab przedłużył czas życia tylko dla 2 spośród 5 myszy (zmarły 66 i 83 dni po podaniu komórek guza), a żadna z myszy nie dożyła do końca eksperymentu. W grupie B1 czas przeżycia myszy SCID był podobny do tego w grupie 2F2, przy czym dwie myszy zmarły 48 dnia, a jedna mysz 76 dnia. W tej grupie 40% myszy żyło w momencie zakończenia eksperymentu.
Zależna od dawki odpowiedź na terapię za pomocą 2F2 i rituximabu u myszy SCID, którym podano komórki Daudi: Aby ocenić skuteczność 2F2 w porównaniu z rituximabem w ochronie przeciwko nowotworzeniu, przeprowadzono miareczkowanie dawki w terapii myszy SCID traktowanych nowotworowymi komórkami Daudi. W komórkach Daudi poziom ekspresji CD20 jest wyższy niż w komórkach Tanoue i są one bardziej wrażliwe na uśmiercanie in vitro. 10 grup myszy SCID (po 4 w grupie) i 1 grupa kontrolna (5 myszy SCID) otrzymały zastrzyki 2,5 x 106 komórek Daudi (w 200 μl PBS) dożylnie w dniu 0, a następnie podawano im 20, 5, 2, 0,5 lub 0,1 μg (w 200 μl PBS) rituximabu, 2F2 lub PBS (kontrola) dożylnie w dniu 7. Zwierzęta uśmiercano po wystąpieniu paraliżu tylnych kończyn. Wyniki przedstawiono na Figurze 40.
W grupie kontrolnej wszystkie myszy zmarły w ciągu 26-29 dni. Jednakże dla 2F2 obserwowano jasną zależność dawka-efekt (Figura 40, górny wykres). Podczas, gdy dla dawek 0,1 μg i 0,5 μg 2F2 nie obserwowano żadnego efektu, tak niewielka dawka, jak 2 μg 2F2 znacząco zwiększała przeżycie do dnia 41,5 ng 2F2 zwiększało przeżycie do dnia 47, a 20 ng 2F2 zwiększało czas przeżycia nawet do dnia 50.
W przeciwieństwie do tego, rituximab nawet w najwyższej badanej dawce 20 μg jedynie w nieznacznym stopniu zwiększał czas przeżycia, a więc przy niższych badanych stężeniach nie obserwowano zależności dawka-efekt (Figura 40, dolny wykres).
Terapia myszy SCID z nowotworami z komórek Daudi za pomocą 11B8T i B1: Komórki Daudi (2,5 x 106) w 200 μl PBS wstrzykiwano dożylnie do żyły ogonowej kohort 12-16-tygodniowych myszy SCID, a po 7 dniach podawano im 100 μg 11B8 lub B1 w 200 μl PBS tą samą drogą. Zwierzęta zabijano po wystąpieniu paraliżu kończyn tylnych. W grupie myszy kontrolnych, którym podano PBS, wszystkie myszy zmarły w czasie 35-53 dni (Figura 41). Terapia 11B8T mocno chroniła myszy, które
PL 218 660 B1 umierały dopiero między 72 a 98 dniem po podaniu komórek nowotworowych. W grupie traktowanej B1 większość myszy przeżyła do dnia 98, a 40% myszy przeżyło zakończenie eksperymentu, tj. dzień 100.
P r z y k ł a d 12 Ocena przeciwciał przeciwko CD20 w modelu ksenoprzeszczepu komórek Daudi wyrażających lucyferazę w myszach SCID
Terapeutyczną skuteczność przeciwciał przeciwko CD20 oceniono w mysim modelu, w którym rozproszony wzrost ludzkich nowotworowych limfocytów B obserwuje się za pomocą zewnętrznego obrazowania optycznego. W tym modelu komórki nowotworowe są transfekowane lucyferazą ze świetlika. Po podaniu myszom lucyferyny (Molecular Probes, Leiden, Holandia) znakowane komórki można wykryć in vivo za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego, stosując kamerę CCD o wysokiej czułości, por. Wetterwald et al. (2002) American Journal of Pathology, 160(3): 1143-1153.
Komórki Daudi transfekowano lucyferazą gWIZ z Gene Therapy Systems (San Diego, CA) i hodowano w RPMI z dodatkiem 10% FCS, penicyliny/streptomycyny, pirogronianu sodu i 1 gg/ml puromycyny (Sigma). Komórki analizowano pod kątem ekspresji lucyferazy (wyrażanej w RLU/1 x 105 komórek) w luminometrze i pod kątem ekspresji CD20 za pomocą FACS. 2,5 x 106 transfekowanych lucyferazą komórek Daudi/mysz podawano dożylnie myszom SCID. Osiem dni po wszczepieniu myszy poddano terapii obejmującej pojedynczą dawkę (10 gg) 2F2T, 11B8T, rituximabu, B1 lub przeciwciała - kontroli izotypowej (hulgG1) (6 myszy na grupę terapeutyczną). Przed obrazowaniem myszy znieczulano przez podanie dootrzewnowo mieszaniny ketamina/ksylazyna/atropina. Syntetyczną D-Lucyferynę (sól sodowa, Molecular Probes) podawano dootrzewnowo w dawce 25 mg/ml. Następnie myszy umieszczano w światłoszczelnym pojemniku i po 3 minutach rozpoczynano obrazowanie za pomocą chłodzonego ciekłym azotem detektora CCD VersArray 1300B (Roper Scientific). Fotony emitowane z lucyferazy liczono w czasie ekspozycji równym 5 minut. Jako odnośniki wykonano białoczarne obrazy podczas naświetlania. Do zbierania danych i analizy obrazu stosowano oprogramowanie Meta Vue (Universal Imaging Corp). Statystycznie znaczące różnice między grupami ustalono używając jednoczynnikowej analizy wariancji z testem post-hoc Newmana-Keulsa stosując GraphPad PRISM wersja 3.02 (Graphpad Software Inc).
Obrazowanie od strony grzbietowej przeprowadzano w tygodniowych odstępach. W 8 dniu, dniu terapii, emisję światła wykryto tylko w miejscach wszczepienia w ogonie. Powstawanie guzów w odległych miejscach wykryto 14 dnia u wszystkich myszy z grupy kontroli izotypowej (hulgG1) i u jednej myszy z grupy, która otrzymała rituximab. W następnych tygodniach emisja światła stale wzrastała. Figura 42 przedstawia obrazy wszystkich myszy wykonane 39 dnia (31 dni po terapii), w których bioluminescencja pokazana w kolorze czerwonym (ciemne obszary myszy) (intensywność światła > 50 fotonów na 5 minut) nałożona jest na czarno-białe obrazy ciała myszy. Masa guza u każdej myszy została zmierzona 25, 32, 39, i 46 dnia przez integrację sygnałów świetlnych na powierzchni ciała, por. Figura 43. Najszybszy wzrost guzów obserwowano w grupie kontroli izotypowej. Terapia rituximabem dawała znaczące hamowanie wzrostu guzów. Jednakże hamowanie wzrostu guzów przez 2F2T, 11B8T i B1 jest znacząco silniejsze (poziom istotności - patrz Tabela 2 poniżej).
T a b e l a 2
Poziomy istotności różnic w zintegrowanej intensywności światła między grupami w różnych punktach czasowych
Dzień 25 Dzień 32 Dzień 39 Dzień 46
B1 vs rituximab P > 0,05 P < 0,05 P < 0,01 P < 0,001
B1 vs 11B8T P > 0,05 P > 0,05 P > 0,05 P > 0,05
B1 vs 2F2T P > 0,05 P > 0,05 P > 0,05 P > 0,05
B1 vs hulgG1 P < 0,001 P < 0,001 P < 0,001
rituximab vs 11B8T P > 0,05 P < 0,05 P < 0,01 P < 0,001
rituximab vs 2F2T P > 0,05 P > 0,05 P > 0,05 P < 0,001
rituximab vs hulgG1 P < 0,001 P > 0,05 P < 0,05
11B8Tvs2F2T P > 0,05 P > 0,05 P > 0,05 P > 0,05
118Tvs hulgG1 P < 0,001 P < 0,001 P < 0,001
2F2Tvs hulgG1 P < 0,001 P < 0,01 P < 0,01
PL 218 660 B1
P r z y k ł a d 13 Badania wstępne i farmakokinetyczne u makaka jawajskiego (Macaca fascicularis)
Celem badania było określenie wzoru farmakokinetycznego i efektów farmakologicznych 2F2 u makaków jawajskich (około 2-letnich; zakres wagi 2,1-2,6 kg) po podawaniu raz dziennie wlewu dożylnie (przez żyłę odpiszczelową) przez 4 kolejne dni. W badaniach porównywano również farmakologiczne efekty rituximabu, aby ocenić jego równoważny potencjał. W tym celu 6 samców i 6 samic makaka jawajskiego przypisano do 6 grup otrzymujących 2F2 lub rituximab w różnych dawkach wynoszących 1,25, 6,25 i 12,5 mg/kg/dzień w stałej objętości 10 ml/kg przez 4 kolejne dni, w sumie odpowiednio 5, 25 i 50 mg/kg. Po zakończeniu podawania ostatniej dawki zwierzęta zatrzymano na obserwacji po terapii przez 130 dni. Czynności i procedury stosowane podczas tego badania są zgodne z zasadami Dobrej Praktyki Laboratoryjnej OECD przedstawionymi przez Departament Zdrowia Zjednoczonego Królestwa. Wszystkie zwierzęta w regularnych odstępach czasu poddawano obserwacji mającej na celu wykrycie oznak pogorszenia zdrowia lub reakcji na terapię, oraz badaniu lekarskiemu. Podczas trwania badań przeprowadzano też badania laboratoryjne hematologii, krzepnięcia, chemii klinicznej i analizę moczu. Próbki krwi i biopsję węzłów chłonnych otrzymywane z powierzchniowych węzłów chłonnych używano do analizy za pomocą cytometrii przepływowej podczas dawkowania i obserwacji po terapii. Za pomocą cytometrii przepływowej analizowano następujące fenotypy komórek: CD3, CD4, CD8, CD20 i CD21. Po zakończeniu okresu obserwacji po terapii zwierzęta uśmiercano i przeprowadzano szczegółową sekcję.
Nie zaobserwowano szkodliwych objawów klinicznych ani żadnych zmian, które uznano by za związane z terapią 2F2 lub rituximabem. Figury 44 i 45 przestawiają analizę cytometryczną komórek niosących odpowiednio CD20 i CD21 we krwi obwodowej zwierząt poddawanych terapii. Figura 46 przedstawia analizę cytometryczną komórek niosących CD20 w węzłach skłonnych. Analiza obu fenotypów razem podczas badania wskazuje na silną i skuteczną utratę limfocytów B po podaniu 2F2 i rituximabu w dawce 6,25 mg/kg/dzień (25 mg/kg w sumie) oraz 12,5 mg/kg/dzień (50 mg/kg w sumie). Dodatkowo dane wskazują, że ponowne pojawienie się komórek niosących CD20 w węzłach chłonnych i krwi obwodowej zwierząt otrzymujących 2F2 rozpoczęło się około 75 dnia po podaniu 25 mg/kg lub 50 mg/kg, tzn. znacząco później, niż u zwierząt, którym podawano rituximab.
Co więcej, Figury 47A-C przedstawiają analizę cytometryczną subpopulacji komórek wyrażających CD20lowCD23+CD40high we krwi obwodowej (Y. Vugmeyster et al. (2003) Cytometry 52A:101-109).
Komórki krwi obwodowej otrzymane od małp traktowanych 2F2 lub rituximabem w dawkach 1,25 mg/kg (Figura 47A), 6,25 mg/kg (Figura 47B), i 12,5 mg/kg (Figura 47C) raz dziennie przez wlew dożylny przez 4 kolejne dni inkubowano z mysimi przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko ludzkim CD20 znakowanymi FITC (Coulter) w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie dodawano kulki do zliczania razem z PBS i przemywano dwukrotnie komórki (300 g przez 10 minut), po czym natychmiast przeprowadzano analizę subpopulacji komórek wyrażających CD20lowCD23+CD40high w porównaniu z CD20highCD23+CD40low za pomocą cytometru przepływowego (Beckman Coulter). Wyniki dla komórek CD20lowCD23+CD40high podano w komórkach na ul. Jak można zobaczyć na Figurze 47, 2F2 w porównaniu z rituximabem indukowało całkowite i dłużej trwające usuwanie komórek CD20lowCD23+CD40high.
P r z y k ł a d 14 Mapowanie epitopów za pomocą ukierunkowanej mutagenezy
Badania nad mapowaniem epitopów za pomocą ukierunkowanej mutagenezy wykazały, że alanina na pozycji 170 (A170) i prolina na pozycji 172 (P172) w drugiej pętli pozakomórkowej są istotne dla rozpoznawania ludzkiego CD20 przez znane przeciwciała przeciwko CD20. W badaniach prowadzonych przez Deans i wsp. (M.J. Polyak, et al., Blood, (2002) 99(9): str. 3256-3262; M.J. Polyak, et al., J. Immunol., (1998) 161(7): str. 3242-3248) wiązanie wszystkich badanych przeciwciał monoklonalnych przeciwko CD20 zanikało po zmianie A170 i P172 na odpowiadające im reszty mysiego CD20, czyli S170 i S172. Jednakże stwierdzono również pewną heterogenność w rozpoznawaniu epitopu AxP, ponieważ większość przeciwciał, tak jak rituximab, rozpoznaje mysie CD20 z S170 i S172 zmutowanymi do ludzkiej sekwencji A170xP172, podczas gdy niektóre potrzebują dodatkowych mutacji położonych w stronę N-końca zaraz za sekwencją AxP. Aby zbadać, czy motyw A170xP172 jest ważny również w wiązaniu przeciwciał według wynalazku, sekwencję AxP zmutowano do sekwencji SxS przy użyciu ukierunkowanej mutagenezy (mutant AxP = A170S, P172S), komórki transfekowano DNA mutanta AxP oraz dzikiego typu (WT) CD20 i porównano wiązanie przeciwciał monoklonalnych do nich.
PL 218 660 B1
Przygotowano również dalsze mutanty, P172S (prolina na pozycji 172 zamieniona na serynę), N166D (asparagina na pozycji 166 zamieniona na kwas asparaginowy), oraz N163D (asparagina na pozycji 163 zamieniona na kwas asparaginowy), za pomocą ukierunkowanej mutagenezy, aby ocenić, czy zmutowane reszty aminokwasowe odgrywają istotną rolę w wiązaniu przeciwciał według wynalazku.
Aby to zbadać, skonstruowano wektor ekspresyjny CD20 przez namnażanie sekwencji kodującej CD20 przy użyciu odpowiednich starterów wprowadzających miejsca restrykcyjne i doskonałą sekwencję Kozak dla uzyskania optymalnej ekspresji. Namnożony fragment poddano trawieniu i ligacji z wektorem ekspresyjnym pEE13.4. Po transformacji E. coli przetestowano kolonie pod kątem obecności wstawki, i wybrano dwa klony do sekwencjonowania w celu potwierdzenia właściwej sekwencji. Uzyskany wektor nazwano pEE13.4CD20HS.
Przeprowadzono mutagenezę, aby wprowadzić mutację AxP i 20 mysich mutacji w regionach zewnątrzkomórkowej pętli ludzkiego CD20. Mutagenezę potwierdzono przez trawienie enzymami restrykcyjnymi i sekwencjonowanie. Następnie przeprowadzono przejściową transfekcję komórek CHO (dla mutacji AxP) lub HEK293F uzyskanymi wektorami, i przeprowadzono analizę cytometryczną 24 lub 48 godzin po transfekcji.
Oligonukleotydowe startery PCR: Syntezę i pomiar ilości oligonukleotydowych starterów przeprowadzono w Isogen BV (Maarssen, Holandia). Startery zawieszono w wodzie w stężeniu 100 pmol^l i przechowywano w -20°C. Tabela 3 przedstawia startery PCR i startery do sekwencjonowania.
Ocena optycznej gęstości kwasów nukleinowych: Optyczną gęstość kwasów nukleinowych oceniano za pomocą Ultrospec 2100 pro Classic (Amersham Biosciences, Uppsala, Szwecja) zgodnie z zaleceniami producenta. Stężenie DNA mierzono za pomocą analizy OD260nm, gdzie jedna jednostka OD26onm = 50 μ9/ηί. Roztwór wzorcowy był identyczny z roztworem użytym do rozpuszczenia kwasów nukleinowych.
Izolowanie plazmidowego DNA z hodowli E. coli: Plazmidowe DNA izolowano z hodowli E. coli za pomocą zestawów firmy Qiagen zgodnie z zaleceniami producenta (Westburg BV, Leusden, Holandia). Do preparatyki wektora na dużą skalę używano zestawów „Hi-Speed plasmid Maxi kit lub „Hi-Speed plasmid Midi kit (Qiagen). Do preparatyki na małą skalę (tj. 2 ml hodowli E coli) używano zestawu „Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen), a wymywanie DNA prowadzono w 50 μl TE (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM).
Amplifikacja PCR: Reakcje PCR przeprowadzano zgodnie ze wskazówkami producenta dla polimerazy DNA Pfu-Turbo Hotstart (Stratagene, Amsterdam, Holandia). Każda reakcja o objętości 20 μl zawierała 1 x bufor do reakcji PCR, 200 uM mieszaniny dNTP, po 6,7 pmol obu starterów, około 1 ng matrycowego DNA i 1 jednostkę polimerazy DNA Pfu-Turbo Hotstart. Reakcje PCR przeprowadzano w termocyklerze gradientowym T-gradient Thermocycler 96 (Biometra GmbH, Goettingen, Germany) używając programu składającego się z 30 cykli: +95°C przez 2 minuty, następnie 30 cykli: +95°C po 30 sekund, annealing: gradient 45-65°C przez 30 sekund i wydłużanie: +72°C przez 2 minuty, następnie końcowe wydłużanie 10 minut w 72°C, a następnie przechowywanie w 4°C. Ukończone reakcje analizowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
Elektroforeza w żelu agarozowym: Elektroforezę w żelu agarozowym prowadzano według Sambrook (Molecular Cloning Laboratory Manual, trzecie wydanie) używając 50 ml żeli, w buforze 1 x Tris/kwas octowy/EDTA (TAE). DNA wizualizowano przez barwienie żelu bromkiem etydyny i obserwację w świetle UV. Obrazy żeli uzyskiwano za pomocą aparatu CCD i systemu analizy obrazu (GeneGnome; Syngene, Cambridge, UK).
Trawienie enzymami restrykcyjnymi: Enzymy restrykcyjne otrzymano z New England Biolabs (Beverly, MA) i używano zgodnie z zaleceniami producenta. Na ogół 100 ng trawiono 5 jednostkami enzymu(ów) w odpowiednim buforze w końcowej objętości 10 μ!. Objętości reakcji odpowiednio zwiększano. Mieszaninę reakcyjną w trakcie trawienia inkubowano przez co najmniej 60 minut w temperaturze zalecanej przez producenta.
Dla fragmentów wymagających podwójnego trawienia enzymami restrykcyjnymi, które mają niezgodne wymagania względem buforu lub temperatury, trawienia przeprowadzano po kolei tak, aby zapewnić korzystne warunki dla każdego enzymu po kolei.
Traktowanie fosfatazą alkaliczną: Fosfatazę alkaliczną z krewetek (USB, Cleveland, OH) stosowano zgodnie z zaleceniami producenta. Fosfataza alkaliczna usuwa grupy 5'-fosforanowe z końców fragmentów DNA, zapobiegając w ten sposób ich samozamykaniu. Ma to szczególne
PL 218 660 B1 znaczenie, kiedy samozamykanie się fragmentu DNA może powodować powstanie wektora zdolnego do replikacji. Enzym jest aktywny w większości buforów do trawień restrykcyjnych i był odpowiednio dodawany do reakcji. Po trawieniu inaktywowano enzym przez podnoszenie temperatury do 70°C na 15 min.
Oczyszczanie produktów reakcji PCR i trawień restrykcyjnych: Oczyszczanie prowadzano za pomocą zestawu Mini-Elute PCR Purification Kit (firmy Qiagen), zgodnie z zaleceniami producenta. Pokrótce, próbki DNA rozcieńczano w 5 objętościach buforu wiążącego I (Qiagen) i nanoszono na kolumnę do minielucji umieszczoną w mikroprobówce wirowniczej typu Eppendorf. Probówkę z kolumną wirowano w stołowej mikrowirówce laboratoryjnej. Kolumnę dwukrotnie płukano buforem II (Qiagen): po nałożeniu buforu probówkę z kolumną wirowano, a żwirowany płyn wylewano. Kolumnę suszono przez wirowanie bez buforu. Elucję DNA prowadzono przez dodanie buforu do elucji na kolumnę, a eluat zbierano za pomocą wirowania. Ilość wyizolowanego DNA określano za pomocą spektroskopii UV, a jakość za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
Izolowanie fragmentów DNA z żelu agarozowego: Gdy było to konieczne (tj. w przypadku występowania wielu fragmentów), strawione próbki DNA rozdzielano przez elektroforezę, a potrzebny fragment wycinano z żelu i odzyskiwano za pomocą zestawu do ekstrakcji z żelu QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen), zgodnie z zaleceniami producenta. Pokrótce, prążki DNA wycinano z żelu agarozowego i rozpuszczano w odpowiednim buforze w +55°C. Dodawano żywicę QIAEX II i inkubowano 5 minut. Żywicę QIAEX II peletowano za pomocą krótkiego wirowania (1 min, 14000 g, RT) i dwukrotnie płukano 500 μl buforem do płukania PE. Uzyskany na końcu osad suszono w komorze i prowadzano wymywanie DNA w odpowiedniej objętości TE i temperaturze (w zależności od długości fragmentu DNA).
Ligacja fragmentów DNA: Ligację prowadzono przy użyciu zestawu Quick Ligation Kit (New England Biolabs) zgodnie z zaleceniami producenta. Dla każdej ligacji DNA wektora mieszano z około 3-krotnym molarnym nadmiarem wstawki DNA, tak że całkowita ilość DNA była mniejsza niż 200 ng w 10 μ!, przy czym dodawano wodę w celu uzyskania końcowej objętości. Do tego dodawano 10 μl buforu 2 x Quick Ligation Buffer i 1 μl ligazy Quick T4 DNA Ligase, po czym mieszaninę ligacyjną inkubowano 5-30 minut w temperaturze pokojowej.
Transformacja bakterii wektorami DNA: Próbki DNA używano do transformacji kompetentnych komórek One Shot DH5a-TlR E. coli (Invitrogen, Breda, Holandia) za pomocą szoku cieplnego według zaleceń producenta. Pokrótce, 1-5 μl roztworu DNA (zazwyczaj 2 μl mieszaniny ligacyjnej DNA) dodawano do porcji kompetentnych komórek bakteryjnych i inkubowano mieszaninę na lodzie przez 30 minut. Następnie komórki poddawano szokowi cieplnemu przez przeniesienie do łaźni wodnej do temperatury 42°C na 30 sekund, a następnie dalszą inkubację na lodzie przez 5 minut. Komórkom pozwolono odpocząć przez inkubację w nieselekcyjnej pożywce hodowlanej (SOC) przez 1 godzinę z wytrząsaniem w 37°C, a następnie wysiewano je na płytki z agarem zawierające odpowiedni czynnik selekcyjny (ampicylina, 50 μg/ml). Płytki inkubowano przez 16-18 godzin w +37°C lub dopóki nie pojawiły się widoczne kolonie bakteryjne.
Test przesiewowy kolonii bakteryjnych za pomocą PCR: Kolonie bakteryjne poddawano testowi przesiewowemu na obecność wektorów zawierających pożądane sekwencję za pomocą testu przesiewowego kolonii opartego na PCR. 20 μl reakcji PCR zawierającej 0,5 objętości HotStarTaq Master Mix (Qiagen), po 4 pmol obu starterów, oraz wodę dodawano do probówki PCR. Kolonię lekko dotykano czubkiem 20 μl końcówki do pipety automatycznej, zanurzano w 2 ml LB w probówce (w celu hodowli bakterii zawierających odpowiedni plazmid) i zawieszano w 20 μl mieszaniny PCR. PCR prowadzano w termocyklerze T-gradient Thermocycler 96 (Biometra) stosując składający się z 35 cykli program: +95°C przez 15 minut, następnie 35 cykli: +94°C przez 30 sekund, annealing: 55°C przez 30 sekund i wydłużanie: +72°C przez 2 minuty, następnie końcowe wydłużanie 10 minut w 72°C, a następnie przechowywanie w 4°C. Ukończone reakcje analizowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Tabela 3 przedstawia szczegóły dotyczące par starterów używanych do PCR na koloniach.
Sekwencjonowanie DNA Próbki plazmidowego DNA wysyłano do AGOWA (Berlin, Niemcy) w celu przeprowadzenia analizy sekwencji. Sekwencję analizowano za pomocą pakietu oprogramowania VectorNTI (Informax, Frederick, MD, USA).
PL 218 660 B1
T a b e l a 3
Nazwa Zastosowanie Dłu- gość Sekwencja Oligo
CD20P172S mutageneza CD20 36 TGGGGAGTTTTTCTCAGAGGAATTCGATGGTTCACAGT- TGTA
CD20N166D mutageneza CD20 39 TGTAACAGTATTGGGTAGATGGG
CD20N163D mutageneza CD20 36 AATCATGGACATACTTAATATTA
cd20exfor konstrukcja CD20 41 TATAGCCCGGGGCCGCCACCATGACAACACCCAGA- AATTCA
cd20exrev konstrukcja CD20 38 GCGTCTCATGTACATTAAGGAGAGCTGTCATTTTCTAT
pee13.4seqrev2 PCR kolonii 23 TCGGACATCTCATGACTTTCTTT
pConKseq1 PCR kolonii 23 GTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGC
cd20hsapmutr (AxP) mutageneza CD20 42 TGGGGAGTTTTTCTCAGAGGAATTCGATGGTTCACAGT- TGTA
cd20hsapmutf (AxP) mutageneza CD20 42 TACAACTGTGAACCATCGAATTCCTCTGAGAAAAACT- CCCCA
CD20seq2 sekwencjonowanie CD20 23 TGTAACAGTATTGGGTAGATGGG
cd20seq1 sekwencjonowanie CD20 23 AATCATGGACATACTTAATATTA
Mutageneza: Mutagenezę przeprowadzono używając zestawu do ukierunkowanej mutagenezy QuikChange® XL (kat. 200517-5, Lot 1120630, Stratagene Europa) zgodnie z zaleceniami producenta.
Produkty reakcji mutagenezy zatężano za pomocą strącania etanolem albo transformowano nimi komórki kompetentne E. coli OneShot DH5a-TlR albo elektroporowano komórki elektrokompetentne ElectroTen-Blue®. Przed transfekcją kolonie sprawdzano za pomocą kolonijnego PCR i trawienia restrykcyjnego.
Transfekcja komórek HEK293F: Komórki HEK293F otrzymano z Invitrogen i transfekowano zgodnie z zaleceniami producenta, używając 293fectin. Komórki HEK293F użyto dla wszystkich sekwencji z pojedynczymi mutacjami.
Transfekcja komórek CHO: Komórki CHO doprowadzone do około 95% konfluencji transfekowano przejściowo dzikim typem CD20, zmutowanym cDNA, lub mieszaniną obu konstruktów, stosując lipofektaminę 2000 (M668-019, Invitrogen, Breda, Holandia). W tym celu 24 μg wytrąconego DNA rozcieńczano (1 μg/μl) w 500 μl Optimem, w stosunkach AxP 100%:WT 0%; AxP 33,3%:WT 66,6%; AxP 66,6%:WT 33,3%; AxP 0%:WT 100%. Dla każdej transfekcji 24 μl lipofektaminy rozcieńczano w 500 μl Optimem. Następnie rozcieńczoną lipofektaminę inkubowano (RT, 5 minut) i łączono rozcieńczone DNA z rozcieńczoną lipofektaminą. Po delikatnym wymieszaniu i inkubacji roztworu (RT, 20 minut), 1000 μl mieszaniny DNA/lipofektamina dodawano do komórek CHO, dokładnie mieszano inkubowano 48 godzin w 37°C, 5% CO2. Dwa dni po transfekcji komórki CHO dwukrotnie płukano buforem FACS (PBS z dodatkiem 0,1% BSA i 0,002% NaN3). Komórki CHO traktowano trypsyną/EDTA (Gibco BRL, Life Technologies, Paisley, Szkocja) i zdejmowano z płytek do hodowli.
Wiązanie przeciwciał przeciwko CD20: Komórki HEK293F i CHO zawieszano w PBS w gęstości x 10 /ml i dodawano do okrągłodennych płytek (1 x 10 /studzienkę). Następnie dodawano 50 μl przeciwciał monoklonalnych CD20 w serii rozcieńczeń 10, 5, 2,5 lub 0 μg na studzienkę (4°C, 30 minut). Po płukaniu w buforze FACS (PBS z dodatkiem 0,1% BSA i 0,002% NaN3) komórki analizowano w cytometrze przepływowym (Becton Dickinson, San Diego, CA, USA) zbierając 5000 zdarzeń na próbę przy dużej szybkości przepływu.
Jak można zobaczyć na Figurze 48A-E, wszystkie przeciwciała monoklonalne przeciwko CD20 wiążą się wydajnie do komórek CHO wyrażających CD20 WT. Jak oczekiwano, rituximab nie wiązał mutanta AxP (Fig. 48A), a B1 słabo wiązał tego mutanta (Figura 48D). W przeciwieństwie do tego,
PL 218 660 B1 zarówno 2F2 jak i 11B8 równie dobrze wiązały CD20 WT i mutanta AxP (Figura 48B i Figura 48C).
Miareczkowanie ilości CD20 WT na powierzchni miareczkowało wiązanie rituximabu i B1. Zarówno
2F2, jak i 11B8 ponownie były niewrażliwe na obecność lub brak mutacji.
To badanie wskazuje, że wiązanie 2F2 i 11B8 do ludzkiego CD20 jest niewrażliwe na mutacje na pozycjach aminokwasowych 170 i 172. Tak więc 2F2 i 11B8 reprezentują nową klasę przeciwciał monoklonalnych CD20 rozpoznającą nowy epitop CD20.
Figura 49A przedstawia procent wiązania 2F2, 11B8T, B1 i rituximab do mutanta P172S w porównaniu z WT CD20, Figura 49B przedstawia procent wiązania 2F2T, 11B8T, B1, CAT (CAT 13.6E12, mysie monoklonalne przeciwciało IgG2A przeciwko CD20, Diatec.Com), przeciwciała - kontroli izotypowej (KLH), lub rituximabu do zmutowanego CD20 (AxP) w porównaniu z CD20 WT.
Dla mutanta, w którym asparaginę na pozycji 166 zastąpiono kwasem asparaginowym (CD20N166D), 2F2 wykazywało bardzo słabe wiązanie, podczas, gdy B1, rituximab i 11B8T wykazywały wiązanie, patrz Figura 49C. W podobnym doświadczeniu CAT 13.6E12 i rituximab wiązały CD20N166D, podczas, gdy 2F2T wykazywały jedynie bardzo słabe wiązanie, patrz Figura 49D. Dla mutanta, w którym asparaginę 163 zastąpiono kwasem asparaginowym (CD20N163D), ponownie rituximab, 11B8T i B1 wiązały CD20N163D, podczas, gdy 2F2 i 2F2T wykazywały jedynie bardzo słabe wiązanie, patrz Figura 49E. W podobnym doświadczeniu CAT 13.6E12 i rituximab wiązały CD20N163D, podczas, gdy 2F2T wykazywało jedynie bardzo słabe wiązanie, patrz Figura 49F.
Te doświadczenia wskazują, że 2F2 i 11B8 wiążą inne epitopy.
P r z y k ł a d 15 Mapowanie epitopów za pomocą techniki Pepscan
Synteza peptydów: Peptydowe 7-, 9- i 15-mery zsyntetyzowano za pomocą standardowych sposobów. W niektórych przypadkach chemiczne łączenie fragmentów 15-merowego peptydu pomaga w identyfikacji sekwencji aminokwasowych potencjalnie nieciągłych epitopów. Peptydowe 7-, 9-, i 15-mery, które mogły stanowić potencjalne miejsca wiązania lub epitopy zaangażowane w wiązanie 2F2 lub 11B8 do ludzkiej cząsteczki CD20 zsyntetyzowano zgodnie ze znanymi sposobami (H.M. Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3998; J.W. Slootstra et al. (1996) Mol. Divers. 1:87; i WO 01/60769). 9- i 15-mery syntetyzowano jako pętle i przeprowadzano test przesiewowy za pomocą kart mini-PEPSCAN rozmiaru karty kredytowej (455 peptydów/karta). We wszystkich pętlach peptydowych aminokwasy położone w różnych pozycjach zastąpiono cysteiną (tj., acetylo-XCXXXXXXXXXXXCX-minikarta). Peptydy syntetyzowano używając standardowej metody chemii Fmoc, a deprotekcję przeprowadzano stosując kwas trifluorooctowy (TFA) ze zmiataczami wolnych rodników. Następnie peptydy po deprotekcji poddawano reakcji na mikromacierzach z 0,5 mM roztworem 1,3-bis(bromometylo)benzenu w wodorowęglanie amonu (20 mM, pH 7,9), z dodatkiem acetonitrylu (1:1 (obj./obj.)). Całkowicie zanurzone w roztworze mikromacierze delikatnie wytrząsano przez 30-60 minut. Na końcu mikromacierze intensywnie płukano nadmiarem dejonizowanej H2O i sonikowano w buforze rozrywającym zawierającym 1% dodecylosiarczan sodu i 0,1% β-merkaptoetanol w PBS (pH 7,2) w 70°C przez 30 minut, a następnie sonikowano w dejonizowanej H2O przez kolejne 45 minut. Następnie mikropłytki były gotowe do testu przesiewowego za pomocą testu ELISA.
Test Pepscan ELISA 455-studzienkowe karty z polietylenu formatu karty kredytowej, zawierające kowalencyjnie związane peptydy, inkubowano z surowicą (rozcieńczoną 1:1000 w roztworze blokującym, który zawiera 5% końskiej surowicy (obj./obj.) i 5% albuminy jaja kurzego (wag./obj.)) (4°C, przez noc). Po płukaniu peptydy inkubowano z antyludzkimi przeciwciałami znakowanymi peroksydazą (rozcieńczenie 1:1000, 1 godzina, 25°C), a po opłukaniu dodawano substrat peroksydazy, siarczan 2,2'-azyno-di-3-etylobenzotiazoliny i 2 nl/ml 3% H2O2. Po godzinie mierzono postęp reakcji barwnej. Reakcję barwną w teście ELISA oceniano ilościowo za pomocą aparatu CCD i systemu do obróbki obrazu. Układ składał się z aparatu CCD i obiektywu 55 mm (Sony CCD Video Camera XC-77RR, obiektyw Nikon micro-nikkor 55 mm f/2.8), adaptora do aparatu (Sony Camera adaptor DC-77RR) i pakietu oprogramowania do obróbki obrazu Optimas, wersja 6.5 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD 20910, U.S.A.). Optimas wymaga komputera z procesorem klasy Pentium II.
Absorbancję (wartości OD) dla peptydów dla różnych stężeń przeciwciał przedstawiają Tabela 4 i Tabela 5 poniżej.
PL 218 660 B1
Tabela 4
PL 218 660 B1
T a b e l a 5
11B8 10 ug/ml 7D8 10 ug/ml Rituximab 10 ug/ml 2F2 10 ug/ml
PCINIYNAEPANPCE 118 163 152 65
YCNIYNAEPANPSCK 287 181 2418 86
ICIYNAEPANPSECN 138 192 142 78
NCYNAEPANPSEKCS 93 121 2649 49
ICNAEPANPSEKNCP 115 165 3283 43
YCAEPANPSEKNSCS 106 188 3770 65
NCEPANPSEKNSPCT 159 183 3476 61
ACPANPSEKNSPSCQ 146 148 250 77
ECANPSEKNSPSTCY 134 179 188 68
Jak pokazuje Tabela 4, 11B8 wykazywało wiązanie do AGIYAP w pierwszej małej pętli zewnątrzkomórkowej ludzkiego CD20 zarówno w stężeniu 10 ug/ml, jak i 100 ug/ml, podczas, gdy inne badane przeciwciała nie wykazywały znaczącego wiązania do AGIYAP.
Co więcej, 11B8 wykazywało wiązanie do MESLNFIRAHTPYI w drugiej pętli zewnątrzkomórkowej ludzkiego CD20 zarówno w stężeniu 10 ug/ml, jak i 100 ug/ml, podczas, gdy inne badane przeciwciała nie wykazywały znaczącego wiązania do MESLNFIRAHTPYI.
Jak pokazuje Tabela 5, rituximab wykazywał wiązanie do EPANPSEK w drugiej pętli zewnątrzkomórkowej ludzkiego CD20 zarówno w stężeniu 1 ug/ml, jak i 10 ug/ml, podczas, gdy inne badane przeciwciała nie wykazywały znaczącego wiązania do EPANPSEK.
P r z y k ł a d 16 Przeciwciała antyidiotypowe
Uzyskiwanie przeciwciał antyidiotypowych: Mysie przeciwciała antyidiotypowe uzyskano immunizując myszy Balb/C za pomocą 2F2 lub 11B8T i uzyskując hybrydoma ze śledziony tych myszy przez fuzję z komórkami szpiczaka NSl stosując standardowe metody. Uzyskano następujące przeciwciała antyidiotypowe: anty-2F2 sab 1.1, anty-2F2 sab 1.2, anty-2F2 sab 1.3, anty-11B8T sab 2.2, anty-11B8T sab 2.3, anty-11B8T sab 2.4, anty-11B8T sab 2.5 i anty-11B8T sab 2.6. Przeprowadzono testy pod kątem ich specyficznego wiązania do 2F2T, 7D8 i 11B8T. Płytki ELISA opłaszczono oczyszczonym 2F2T, 7D8 lub 11B8T (rozcieńczonym w PBS do końcowego stężenia 1-2 ug/ml, 37°C, 2 godziny). Płytki blokowano PBS zawierającym 0,05% Tween-20 i 2% kurzą surowicę (RT, 1 godzina). Następnie płytki inkubowano z supernatantami z hodowli wytwarzających przeciwciała antyidiotypowe (końcowe stężenie doprowadzone do 1-10 ug/ml, RT, 2 godziny). Związane mysie przeciwciała antyidiotypowe wykrywano za pomocą króliczego przeciwciała przeciwko mysim IgG, skoniugowanego z HRP (Jackson ImmunoResearch).
Jak przedstawiono na Figurze 50, anty-2F2 sab 1.1, anty-2F2 sab 1.2 i anty-2F2 sab 1.3 wiążą się do 2F2T i 7D8, ale nie do 11B8T lub niezwiązanych przeciwciał ludzkich stanowiących kontrolę izotypową. Ponieważ 2F2T i 7D8 wykazują się silną homologią w regionie sekwencji VL i VH, oczekiwano reakcji przeciwciał antyidiotypowych przeciwko 2F2 z 7D8.
Fig. 51 pokazuje, że anty-11B8T sab 2.2, anty-11B8T sab 2.3, anty-11B8T sab 2.4, anty-11B8T sab 2.5, oraz anty-11B8T sab 2.6 wszystkie w podobnym stopniu wiążą się do 11B8T.
Przeciwciała antyidiotypowe jako narzędzie immunodiagnostyczne: Przeciwciała antyidiotypowe specyficzne dla 2F2/7D8 i 11B8T mogą być stosowane jako narzędzie immunodiagnostyczne służące do wykrywania i mierzenia poziomu ludzkich przeciwciał monoklonalnych przeciwko CD20 w próbkach laboratoryjnych lub od pacjentów. Może to być użyteczne w badaniu farmakokinetyki przeciwciał przeciwko CD20 lub oceny i dopasowywania dawkowania przeciwciał przeciwko CD20, oraz do monitorowania choroby i efektów terapii u pacjenta. Jako przykład takiego testu płytki ELISA opłaszczono 4 ug/ml anty-2F2 sab 1.1, anty-2F2 sab 1.2 lub anty-2F2 sab 1.3. Płytki blokowano PBS zawierającym 0,05% Tween-20 i 2% kurzą surowicę (RT, 1 godzina). Następnie płytki inkubowano z serią rozcieńczeń 2F2T (10000-9,77 ng/ml, RT, 2 godziny). Związane 2F2T wykrywano za pomocą mysiego przeciwciała przeciwko ludzkim IgG, skoniugowanego z HRP. Jak przedstawiono na Figurze 52A-C, obserwowano zależne od dawki wiązanie 2F2T.
PL 218 660 B1
Lista sekwencji <110> Genmab, Inc. et al.
<12O> Ludzkie monoklonalne przeciwciało przeciwko CD20 <130> GMI-055PC <150> US 60/419,163 <151> 2002-10-17 <150> US 60/460,028 <1E1> 2002-04-02 <160> 57 <l70> FastSEQ dla Windows wersja 4.0 <210> 1 <211> 424 <212> DNA <213 > Homo sapiens <400> 1 atggagttgg gtgcagctgg tgtgcagcct gggaagggcc gactctgtga caaatgaaca tacggcaact tcag gactgagctg
Lggagtctgg ctggattcac tggagtgggt agggccgatt gtctgagagc actactacgg gattttcctt gggaggcttg ctttaatgat cfccaactatt caccatctcc tgaggacacg tatggacgtc ttggctattt gtacagcctg tatgccatgc agttggaata agagacaacg gccttgtatt tggggccaag taaaaggtgt gcaggtccci actgggtccg gtggttccat ccaagaagtc actgtgcaaa ggaccacggt ccagtgtgaa 60 gagactctcc 120 gcaagctcca 180 aggctatgcg 240 cctgtatctg 300 agatatacag 360 caccgtctcc 420
424 <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Glu Val Gin Leu Val Giu Ser Giy Gly Giy Leu Vai Gin Pro Giy Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Aan Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Giy Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr
C3 t V I iJ O\J
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Asp ile Gin Tyr dy Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
PL 218 660 B1 <210> 3 <211> 382 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 180 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgatcac cttcggccaa 360 gggacacgac tggagattaa ac 382 <210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4
Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
-η Ί /~ι Ί , - T 1 Λ γ-, 7> a _ Τ'ϊΤ- Λ
Tyr Abp Ala ser Asn Arg AIS inr *j±y ± iC rtl'y pne ΰθΓ La J.y
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Ile
85 90 95
Thr Phe aiy Gin Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 5 <211> 424 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atggagttgg gactgagctg gattttcctt ttggctattt taaaaggtgt ccagtgtgaa 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg acaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac ctttcatgat tatgccatgc actgggtccg gcaagctcca 180 gggaagggcc tggagtgggt ctcaactatt agttggaata gtggtaccat aggctatgcg 240 gactctgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaactc cctgtatctg 300 caaatgaaca gtctgagagc tgaggacacg gccttgtatt actgtgcaaa agatatacag 360 tacggcaact actactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 420 tcag 424
PL 218 660 B1 <210 > 6 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Asp Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe His Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Giy Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr ile Ser Trp Asn Ser Gly Thr Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr cys
85 90 95
Ala Lys Asp Ile Gin Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 12 0
<210> 7 <211> 382 <212 > DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 50 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggocagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 180 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300 ^□.□.CJSltt t tSJ C3~(ttt3tt3 C tCjUCHCJCHCJ C^t3^C33Ct CJCJ CCCJ31C3C CttCC[<JCC33 36Q gggacacgac tggagattaa ac 382 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8
Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro
1 5
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg
20
Leu Ala Trp Tyr Gin rt Ί Ulll Lys Pif O
35 40
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
50 55
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
70
Ala Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Ala 25 Ser Gin Ser Val Ser 30 Ser Tyr
m η Ί ~ ma P± O Λ Licu Leu Τ Ί -LIC
«.j- y 45
Gly Ile Pro Ala 60 Arg Phe Ser Gly
Leu Thr Ile 75 Ser Ser Leu Glu Pro 80
PL 218 660 B1
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Ile 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Ary Leu Glu Ile Lys 100 105 ’ <210> 9 <211> 433 <212> DNA <213 > Homo sapiens <400> 9 atggagttgg ggctgagctg ggttttcctt gttgctatat taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gttcagctgg tgcagtctgg gggaggcttg gtacatcctg gggggtccct gagactctcc 120 tgtacaggct ctggattcac cttcagttac catgctatgc attgggttcg ccaggctcca 180 ggaaaaggtc tggaatgggt atcaattatt gggactggtg gtgtcacata ctatgcagac 240 tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gacaatgtca agaactcctt gtatcttcaa 300 atgaacagcc tgagagccga ggacatggct gtgtattact gtgcaagaga ttactatggt 360 gcggggagtt tttatgacgg cctctacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 420 accgtctcct cag 433 <210> 10 <211> 125 <212> PRT <213> Horno sapiens <400> 10
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr His
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ile Ile f?1 \r --J Thr Gly m \7 --J Va 1 Thr Tvr Tvr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn val Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Tyr Tyr Gly Ala Gly Ser Phe Tyr Asp Gly Leu Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 11 <211> 382 <212> DNA <213 > Homo sapiens <400> 11 atggaagccc cagcacagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120
PL 218 660 B1 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 180 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcgact ggccgctcac tttcggcgga 360 gggaccaagg tggagatcaa ac 382 <210> 12 <211> 107 <212> PRT <213> Hornu sapiens <400> 12
Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Gys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 50
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gir. Arg Ser Aap Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13
Asp Tyr Ala Met His 1 s <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14
Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15
Gly c η i n -- tc <211> 13 <212> PRT c213> Homo sapiens
PL 218 660 B1 <400> 15
Asp Ile Gin Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Cly Met Asp Val 15 10 <210> 16 <211> 11 <212 > PRT <213 > Iiomo sapiens <400> 16
Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 15 10 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 18 <211> 9 <212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 18
Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Ile Thr 1 5 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19
Asp Tyr Ala Met His <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213 > Homo sapiens <;ίu v £.\i
Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Thr Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15
Gly
PL 218 660 B1 <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21
Asp Ile Gin Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 15 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22
Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 15 10 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213 > Homo sapiens <4Q0> 23
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr I 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24
Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Ile Thr 1 5 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25
Tyr His Ala Met His <210> 26 <211 > 16 <212> PRT <213> Homo sapiens
PL 218 660 B1 <400> 26
Ile Ile Gly Thr Gly Gly Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly <210> 27 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27
Asp Tyr Tyr Gly Ala Gly Ser Phe Tyr Asp Gly Leu Tyr Gly Met Asp vai <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28
Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 15 10 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30
Gin Gin Arg Ser Asp Trp Pro Leu Thr 1 5 ’
<210> 31
<211> 32
<212> DNA
<213> Sekwencja
<220>
<223> starter
PL 218 660 B1
PL 218 660 B1
PL 218 660 B1
PL 218 660 B1
PL 218 660 B1 <210 52 <211> 27 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> starter <400> 52 atggaaccat ggaagcccca gcacagc 27 <210 53 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> starter <400 53 cgggaagatg aagacagatg 20 <210> 54 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400 54
Met 1 Glu Leu Gly Leu 5 Ser Trp Val Phe Leu 10 Val Ala Ile Leu Glu 15 Gly
Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val His
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Gly Thr Gly G-y Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
85 90 95
Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg
115
<210 55 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400 55
Met 1 Glu Ala Pro Ala 5 Gin Leu Leu Phe Leu 10 Leu Leu Leu Trp Leu 15 Pro
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser
20 25 30
PL 218 660 B1
Leu Ser Pro 35 Gly Glu Arg Ala Thr 40 Leu Ser Cys Arg Ala 45 Ser Gin Ser
Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro
50 55 60
Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser
100 105 110
Asn Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
130 135
<210> Ξ6 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56
Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Ile Phe Leu Leu Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin
20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Asp Asp Tyr Ala Met His Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser ile Gly Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ile Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
115 120 125
Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
13C 135 140
<210> 57 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57
Met 1 Glu Ala Pro Ala 5 Gin Leu Leu Phe Leu 10 Leu Leu Leu Trp Leu 15 Pro
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser
20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser
35 40 45
Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro
50 55 60
PL 218 660 B1
Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser
100 105 110
Asn Trp Pro Ile Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
115 120 125
Zastrzeżenia patentowe

Claims (41)

1. Izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne wiążące ludzki CD20, obejmujące CDR1 VH jak przedstawiono w SEK NR ID: 25, CDR2 VH jak przedstawiono w SEK NR ID: 26, CDR3 VH jak przedstawiono w SEK NR ID: 27, CDR1 VL jak przedstawiono w SEK NR ID: 28, CDR2 VL jak przedstawiono w SEK NR ID: 29, oraz CDR3 VL jak przedstawiono w SEK NR ID: 30.
2. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że jest wybrane z grupy składającej się z przeciwciał IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, wydzielniczych IgA, IgD i IgE.
3. Przeciwciało według zastrz. 2, znamienne tym, że jest przeciwciałem IgG1.
4. Przeciwciało według zastrz. 2, znamienne tym, że jest przeciwciałem IgG3.
5. Przeciwciało według zastrz. 2, znamienne tym, że jest przeciwciałem IgG4.
6. Przeciwciało według zastrz. 2, znamienne tym, że jest przeciwciałem IgA1 lub IgA2.
7. Przeciwciało według dowolnego z zastrz. 1-6, znamienne tym, że jest kodowane przez kwasy nukleinowe ludzkiego łańcucha ciężkiego i ludzkiego łańcucha lekkiego kappa obejmujące sekwencje nukleotydowe ich regionów zmiennych jak przedstawiono w SEK. NR ID.: 9 i SEK. NR ID.: 11, odpowiednio.
8. Przeciwciało według dowolnego z zastrz. 1-6, znamienne tym, że regiony zmienne ludzkiego łańcucha ciężkiego i ludzkiego łańcucha lekkiego kappa obejmują sekwencje aminokwasowe przedstawione w SEK. NR ID.: 10 i SEK. NR ID.: 12, odpowiednio.
9. Przeciwciało według dowolnego z zastrz. 1-6, znamienne tym, że regiony zmienne ludzkiego łańcucha ciężkiego i ludzkiego łańcucha lekkiego kappa są co najmniej w 90% homologiczne, korzystnie co najmniej w 95% homologiczne i korzystniej co najmniej w 98% lub co najmniej w 99% homologiczne z sekwencjami aminokwasowymi przedstawionymi w SEK. NR ID.: 10 i SEK. NR ID.: 12 odpowiednio.
10. Przeciwciało według dowolnego z zastrz. 1-9, znamienne tym, że jest nienaruszonym przeciwciałem wybranym z grupy składającej się z nienaruszonego przeciwciała IgG1, nienaruszonego przeciwciała IgG2, nienaruszonego przeciwciała IgG3, nienaruszonego przeciwciała IgG4, nienaruszonego przeciwciała IgM, nienaruszonego przeciwciała IgA1, nienaruszonego przeciwciała IgA2, nienaruszonego przeciwciała wydzielniczego IgA, nienaruszonego przeciwciała IgD i nienaruszonego przeciwciała IgE, przy czym przeciwciało jest glikozylowane w komórkach eukariotycznych.
11. Przeciwciało według dowolnego z zastrz. 1-9, znamienne tym, że jest fragmentem przeciwciała lub przeciwciałem jednołańcuchowym.
12. Przeciwciało według dowolnego z zastrz. 1-11, znamienne tym, że obejmuje ponadto łącznik chelatorowy do przyłączenia izotopu radioaktywnego.
13. Transfektoma zawierająca kwasy nukleinowe kodujące ludzki łańcuch lekki i ludzki łańcuch ciężki, która wytwarza wykrywalną ilość przeciwciała określonego w dowolnym z zastrz. 1-11.
14. Eukariotyczne lub prokariotyczne komórki gospodarza wytwarzające ludzkie przeciwciało monoklonalne o regionach zmiennych łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego obejmujących sekwencje aminokwasowe przedstawione w SEK. NR ID.: 10 i SEK. NR ID.: 12, odpowiednio.
15. Inne niż człowiek transgeniczne zwierzę lub roślina wytwarzające ludzkie przeciwciało monoklonalne o regionach zmiennych łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego obejmujących sekwencje aminokwasowe przedstawione w SEK. NR ID.: 10 i SEK. NR ID.: 12, odpowiednio.
16. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera ludzkie przeciwciało określone w dowolnym z zastrz. 1-12 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
17. Kompozycja według zastrz. 16, znamienna tym, że obejmuje ponadto czynnik terapeutyczny.
PL 218 660 B1
18. Immunokoniugat zawierający przeciwciało określone w dowolnym z zastrz. 1-12 połączone z czynnikiem cytotoksycznym, izotopem radioaktywnym lub lekiem.
19. Cząsteczka bispecyficzna zawierająca przeciwciało określone w dowolnym z zastrz. 1-12 i specyficzność wiążącą wobec ludzkiej komórki efektorowej.
20. Cząsteczka bispecyficzna zawierająca przeciwciało określone w dowolnym z zastrz. 1-12 i specyficzność wiążącą wobec ludzkiego receptora Fc lub specyficzność wiążącą wobec receptora komórek T, takiego jak CD3.
21. Wektor ekspresyjny zawierający sekwencję nukleotydową kodującą region zmienny łańcucha ciężkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK. NR ID.: 10 oraz region zmienny łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK. NR ID.: 12.
22. Zastosowanie przeciwciała określonego w jednym z zastrz. 1-12, kompozycji określonej w zastrz. 16 lub 17, immunokoniugatu określonego w zastrz. 18, cząsteczki bispecyficznej określonej w zastrz. 19 albo 20, lub wektora ekspresyjnego określonego w zastrz. 21 do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania chorobie lub zaburzeniu związanemu z komórkami wyrażającymi CD20, przy czym chorobą tą jest chłoniak z komórek B.
23. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że chorobą jest nieziarniczy chłoniak z komórek B.
24. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że choroba jest wybrana z grupy obejmującej: białaczkę/chłoniak limfoblastyczny z prekursorów komórek B i nowotwory z dojrzałych komórek B, takie jak przewlekła białaczka limfatyczna z komórek B (CCL)/chłoniak z małych limfocytów (SLL), białaczka prolimfocytowa z komórek B, chłoniak limfoplazmatyczny, chłoniak z komórek płaszcza (MCL), chłoniak grudkowy (FL), pierwotny skórny chłoniak grudkowy, chłoniak strefy brzeżnej z komórek B (typu MALT, typu węzłowego i typu śledzionowego), białaczka włochatokomórkowa, rozlany chłoniak z dużych komórek B, chłoniak Burkitta, nowotwór komórek osocza, szpiczak, szpiczak mnogi, potransplantacyjna choroba limfoproliferacyjna, makroglobulinemia Waldenstroma i anaplastyczny chłoniak olbrzymiokomórkowy (ALCL).
25. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że chorobą jest chłoniak grudkowy (FL).
26. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że chorobą jest przewlekła białaczka limfatyczna z komórek B (CCL)/chłoniak z małych limfocytów (SLL).
27. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że choroba jest wybrana z grupy obejmującej: ziarniniakowatość limfoidalną, pierwotnego chłoniaka wysiękowego, wewnątrzżylnego chłoniaka z dużych komórek B, śródpiersiowego chłoniaka olbrzymiokomórkowego z komórek B, chorobę łańcuchów ciężkich (łącznie z chorobą γ, μ, i a), chłoniaki indukowane terapią czynnikami immunosupresyjnymi, takie jak chłoniak indukowany cyklosporyną i chłoniak indukowany metotreksatem.
28. Zastosowanie przeciwciała określonego w jednym z zastrz. 1-12, kompozycji określonej w jednym z zastrz. 16 lub 17, immunokoniugatu określonego w zastrz. 18, cząsteczki bispecyficznej określonej w zastrz. 19 albo 20, lub wektora ekspresyjnego określonego w zastrz. 21 do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania chorobie lub zaburzeniu immunologicznemu związanemu z komórkami wyrażającymi CD20, przy czym choroba jest wybrana z grupy składającej się z: łuszczycy, artropatii łuszczycowej, zapalenia skóry, układowej twardziny i stwardnienia, zapalnej choroby jelita (IBD), choroby Crohna, wrzodziejącego zapalenia okrężnicy, zespołu niewydolności oddechowej, zapalenia opon mózgowych, zapalenia mózgu, zapalenia błony naczyniowej oka, zapalenia kłębuszków nerkowych, egzemy, astmy, miażdżycy tętnic, niedoboru przylegania leukocytów, stwardnienia rozsianego, zespołu Raynauda, zespołu Sjogrena, cukrzycy młodzieńczej, choroby Reitera, choroby Behęeta, związanego z kompleksem immunologicznym zapalenia nerek, nefropatii IgA, polineuropatii IgM, immunologicznej małopłytkowości, takiej jak ostra idiopatyczna plamica małopłytkowa (ostra choroba Werlhofa) i przewlekła idiopatyczna plamica małopłytkowa (przewlekła choroba Werlhofa), anemii hemolitycznej, miastenii, zapalenia nerek w toczniu rumieniowatym układowym, liszaja rumieniowatego układowego, reumatoidalnego zapalenia stawów (RA), atopowego zapalenia skóry, pęcherzycy, choroby Gravesa-Basedowa, zapalenia tarczycy Hashimoto, ziarniniaka Wegenera, zespołu Omenna, przewlekłej niewydolności nerek, ostrej zakaźnej mononukleozy, chorób związanych z HIV i wirusami opryszczki.
29. Zastosowanie według zastrz. 28, znamienne tym, że choroba jest reumatoidalnym zapaleniem stawów (RA).
30. Zastosowanie przeciwciała określonego w jednym z zastrz. 1-12, kompozycji określonej w jednym z zastrz. 16 lub 17, immunokoniugatu określonego w zastrz. 18, cząsteczki bispecyficznej
PL 218 660 B1 określonej w zastrz. 19 lub 20, lub wektora ekspresyjnego określonego w zastrz. 21 do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania chorobie lub zaburzeniu zapalnemu, immunologicznemu i/lub autoimmunizacyjnemu wybranym spośród: wrzodziejącego zapalenia okrężnicy, choroby Crohna, cukrzycy młodzieńczej, stwardnienia rozsianego, immunologicznej małopłytkowości, takiej jak ostra choroba Werlhofa i przewlekła choroba Werlhofa, anemii hemolitycznej, miastenii, stwardnienia układowego i pęcherzycy zwykłej.
31. Zastosowanie według zastrz. 30, znamienne tym, że choroba jest zaburzeniem zapalnym, immunologicznym i/lub autoimmunizacyjnym wybranym spośród: zapalnej choroby jelita (IBD), wrzodziejącego zapalenia okrężnicy, choroby Crohna i stwardnienia rozsianego.
32. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 22-31, znamienne tym, że ponadto lek jest przeznaczony do podawania osobnikowi wraz z oddzielnym podawaniem innego czynnika leczniczego.
33. Zastosowanie według zastrz. 32, znamienne tym, że czynnikiem leczniczym jest czynnik cytotoksyczny lub czynnik radiotoksyczny.
34. Zastosowanie według zastrz. 32, znamienne tym, że czynnikiem leczniczym jest immunosupresor.
35. Zastosowanie według zastrz. 32, znamienne tym, że czynnikiem leczniczym jest immunologiczny czynnik modulujący, taki jak cytokina lub chemokina.
36. Zastosowanie według zastrz. 32, znamienne tym, że czynnik leczniczy jest wybrany z grupy składającej się z doksorubicyny, cisplatyny, bleomycyny, karmustyny, chlorambucylu i cyklofosfamidu.
37. Zastosowanie według zastrz. 32, znamienne tym, że czynnik leczniczy jest wybrany z grupy składającej się z przeciwciał przeciwko CD25, przeciwciał przeciwko CD 19, przeciwciał przeciwko CD21, przeciwciał przeciwko CD22, przeciwciał przeciwko CD37, przeciwciał przeciwko CD38, przeciwciał przeciwko IL6R, przeciwciał przeciwko IL8, przeciwciał przeciwko IL15, przeciwciał przeciwko IL15R, przeciwciał przeciwko CD4, przeciwciał przeciwko CD11a, przeciwciał przeciwko 4/beta-1 integrynie (VLA4), CTLA4-Ig i przeciwciał przeciwko C3b(i).
38. Sposób wykrywania in vitro obecności antygenu CD20 lub komórki wyrażającej CD20 w próbce, znamienny tym, że obejmuje:
kontaktowanie próbki z przeciwciałem określonym w jednym z zastrz. 1-12 w warunkach pozwalających na utworzenie kompleksu między przeciwciałem a CD20; oraz wykrywanie tworzenia się kompleksu.
39. Zestaw do wykrywania obecności antygenu CD20 lub komórki wyrażającej CD20 w próbce, znamienny tym, że zawiera przeciwciało określone w jednym z zastrz. 1-12.
40. Przeciwciało antyidiotypowe wiążące się z przeciwciałem określonym w dowolnym z zastrz. 1-12.
41. Zastosowanie przeciwciała antyidiotypowego określonego w zastrz. 40 do wykrywania poziomu ludzkiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko CD20 w próbce.
PL402418A 2002-10-17 2003-10-17 Izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne wiążące ludzki CD20, związane z tym przeciwciałem transfektoma, komórka gospodarza, transgeniczne zwierzę lub roślina, kompozycja, immunokoniugat, cząsteczka bispecyficzna, wektor ekspresyjny, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie medyczne, zestaw oraz przeciwciało antyidiotypowe i jego zastosowanie PL218660B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US41916302P 2002-10-17 2002-10-17
US46002803P 2003-04-02 2003-04-02

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL402418A1 PL402418A1 (pl) 2013-05-27
PL218660B1 true PL218660B1 (pl) 2015-01-30

Family

ID=32110219

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL376351A PL216630B1 (pl) 2002-10-17 2003-10-17 Izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne wiążące ludzki CD20, związane z tym przeciwciałem transfektoma, komórka gospodarza, transgeniczne zwierzę lub roślina, kompozycja, immunokoniugat, cząsteczka bispecyficzna, wektor ekspresyjny, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie medyczne, zestaw oraz przeciwciało antyidiotypowe i jego zastosowanie
PL402418A PL218660B1 (pl) 2002-10-17 2003-10-17 Izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne wiążące ludzki CD20, związane z tym przeciwciałem transfektoma, komórka gospodarza, transgeniczne zwierzę lub roślina, kompozycja, immunokoniugat, cząsteczka bispecyficzna, wektor ekspresyjny, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie medyczne, zestaw oraz przeciwciało antyidiotypowe i jego zastosowanie

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL376351A PL216630B1 (pl) 2002-10-17 2003-10-17 Izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne wiążące ludzki CD20, związane z tym przeciwciałem transfektoma, komórka gospodarza, transgeniczne zwierzę lub roślina, kompozycja, immunokoniugat, cząsteczka bispecyficzna, wektor ekspresyjny, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie medyczne, zestaw oraz przeciwciało antyidiotypowe i jego zastosowanie

Country Status (25)

Country Link
US (3) US8529902B2 (pl)
EP (4) EP1558648B1 (pl)
JP (3) JP4662473B2 (pl)
KR (7) KR100932340B1 (pl)
CN (3) CN1729203B (pl)
AT (1) ATE540978T1 (pl)
AU (1) AU2003301445A1 (pl)
BR (1) BRPI0315295C1 (pl)
CA (2) CA2502552C (pl)
CY (2) CY1112750T1 (pl)
DK (2) DK3284753T3 (pl)
EA (2) EA201492217A1 (pl)
ES (3) ES2524694T3 (pl)
FR (1) FR21C1028I1 (pl)
HK (1) HK1077590A1 (pl)
HU (2) HUE046695T2 (pl)
IL (2) IL167851A (pl)
LT (2) LT3284753T (pl)
LU (1) LU92041I2 (pl)
MX (1) MXPA05004022A (pl)
NZ (2) NZ568769A (pl)
PL (2) PL216630B1 (pl)
PT (2) PT1558648E (pl)
SI (1) SI1558648T1 (pl)
WO (1) WO2004035607A2 (pl)

Families Citing this family (445)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994011026A2 (en) * 1992-11-13 1994-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
US7744877B2 (en) * 1992-11-13 2010-06-29 Biogen Idec Inc. Expression and use of anti-CD20 Antibodies
EP1974747B1 (en) * 1998-08-11 2012-06-27 Biogen Idec Inc. Combination therapies for B-cell lymphomas comprising administration of anti-CD20 antibody
MXPA01004649A (es) * 1998-11-09 2002-05-06 Idec Pharma Corp Tratamiento con anticuerpo quimerico anti-cd20 para pacientes que reciben transplantes de medula osea o celulas madre de sangre periferica.
MXPA01004648A (es) * 1998-11-09 2002-05-06 Idec Pharma Corp Tratamientro de enfermedades hematologicas malignas asociadas con celulas tumorales de la circulacion usando el anticuerpo quimerico anti-cd20.
US8557244B1 (en) 1999-08-11 2013-10-15 Biogen Idec Inc. Treatment of aggressive non-Hodgkins lymphoma with anti-CD20 antibody
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
ATE540978T1 (de) 2002-10-17 2012-01-15 Genmab As Humane monoklonale antikörper gegen cd20
DE10254601A1 (de) 2002-11-22 2004-06-03 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
ES2633311T3 (es) 2002-12-16 2017-09-20 Genentech, Inc. Variantes de inmunoglobulina y usos de las mismas
JP5416338B2 (ja) * 2003-05-09 2014-02-12 デューク ユニバーシティ Ｃｄ２０特異的抗体およびその使用方法
AR044388A1 (es) * 2003-05-20 2005-09-07 Applied Molecular Evolution Moleculas de union a cd20
MXPA06002134A (es) * 2003-08-29 2006-05-31 Genentech Inc Terapia de trastornos oculares.
PL2380911T3 (pl) 2003-11-05 2018-10-31 Roche Glycart Ag Cząsteczki wiążące antygen o zwiększonym powinowactwie wiązania z receptorem Fc oraz zwiększonej funkcji efektorowej
FR2867982B1 (fr) * 2004-03-26 2007-07-20 Jean Marie Andrieu Procede pour amplifier l'activite de vaccins therapeutiques
KR20070012408A (ko) * 2004-04-16 2007-01-25 제넨테크, 인크. Ｂ 세포 고갈을 증대시키는 방법
EP1745288A2 (en) * 2004-04-16 2007-01-24 Genentech, Inc. Assay for antibodies
EP1742660A2 (en) * 2004-04-16 2007-01-17 Genentech, Inc. Treatment of disorders
US7850962B2 (en) * 2004-04-20 2010-12-14 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against CD20
US20050271658A1 (en) * 2004-05-05 2005-12-08 Genentech, Inc. Preventing autoimmune disease
DE102004024617A1 (de) 2004-05-18 2005-12-29 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
US9228008B2 (en) 2004-05-28 2016-01-05 Idexx Laboratories, Inc. Canine anti-CD20 antibodies
AR049200A1 (es) * 2004-06-04 2006-07-05 Genentech Inc Metodo para tratar esclerosis multiple con una composicion que contiene un anticuerpo cd20
EP1763509B1 (en) * 2004-07-02 2018-02-21 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Alpha-helical mimetics
WO2006085967A2 (en) * 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
JP5055603B2 (ja) 2004-08-04 2012-10-24 メントリック・バイオテック・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 変異Ｆｃ領域
RU2411956C2 (ru) * 2004-10-05 2011-02-20 Дженентек, Инк. Способ лечения васкулита
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
FR2879204B1 (fr) 2004-12-15 2007-02-16 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps cytotoxique dirige contre les proliferations hematopoietiques lymphoides de type b.
US20080199499A1 (en) * 2005-01-12 2008-08-21 Proteonova, Inc. Method for Making Targeted Therapeutic Agents
US10206998B2 (en) 2005-01-12 2019-02-19 Proteonova, Inc. Modular targeted therapeutic agents and methods of making same
AU2006226733C9 (en) * 2005-03-23 2019-03-14 Genmab A/S Antibodies against CD38 for treatment of multiple myeloma
AR053579A1 (es) * 2005-04-15 2007-05-09 Genentech Inc Tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal (eii)
WO2006117910A1 (ja) 2005-04-28 2006-11-09 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. 抗血小板膜糖蛋白質ⅵモノクローナル抗体
JP5224707B2 (ja) * 2005-04-28 2013-07-03 持田製薬株式会社 抗血小板膜糖蛋白質ｖｉモノクローナル抗体
KR101273829B1 (ko) 2005-05-20 2013-06-11 론자 바이올로직스 피엘씨 포유류 숙주 세포에서의 재조합 항체의 고-수준 발현
FR2886298A1 (fr) * 2005-05-24 2006-12-01 Ifremer Anticorps ou fragment d'anticorps couple a un agent immunogene
JP2008541758A (ja) * 2005-06-02 2008-11-27 アストラゼネカ エービー Ｃｄ２０に対する抗体およびその使用
CA2615846A1 (en) 2005-07-21 2007-01-25 Genmab A/S Potency assays for antibody drug substance binding to an fc receptor
DK1912675T3 (en) 2005-07-25 2014-03-24 Emergent Product Dev Seattle B-cell reduction using specific and cd37-cd20-specific binding molecules
US20090215992A1 (en) * 2005-08-19 2009-08-27 Chengbin Wu Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP1762575A1 (en) 2005-09-12 2007-03-14 Ganymed Pharmaceuticals AG Identification of tumor-associated antigens for diagnosis and therapy
MY149159A (en) 2005-11-15 2013-07-31 Hoffmann La Roche Method for treating joint damage
US9726673B2 (en) 2005-11-23 2017-08-08 Genentech, Inc. Methods and compositions related to B cell assays
EP1790664A1 (en) 2005-11-24 2007-05-30 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
TWI461436B (zh) * 2005-11-25 2014-11-21 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd 人類ｃｄ１３４（ｏｘ４０）之人類單株抗體及其製造及使用方法
EP2359834B1 (en) 2006-03-15 2016-11-09 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria patients by an inhibitor of complement
ES2654040T3 (es) 2006-03-31 2018-02-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Método de modificación de anticuerpos para la purificación de anticuerpos biespecíficos
TWI390034B (zh) * 2006-04-06 2013-03-21 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Novel anti-CD98 antibody
CN105837690A (zh) 2006-06-12 2016-08-10 新兴产品开发西雅图有限公司 具有效应功能的单链多价结合蛋白
CA2656620C (en) 2006-07-04 2018-03-13 Genmab A/S Cd20 binding molecules for the treatment of copd
RS59005B1 (sr) 2006-09-26 2019-08-30 Genmab As Anti-cd38 plus kortikosteroidi plus nekortikosteroidni hemoterapeutik za tretiranje tumora
EA018836B1 (ru) * 2006-10-02 2013-11-29 Медарекс, Л.Л.К. Человеческие антитела, которые связываются с cxcr4, и их применение
US9382327B2 (en) 2006-10-10 2016-07-05 Vaccinex, Inc. Anti-CD20 antibodies and methods of use
NZ577933A (en) 2007-01-22 2011-12-22 Genentech Inc Polyelectrolyte precipitation and purification of antibodies
EP1970384A1 (en) 2007-03-14 2008-09-17 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies for treatment of cancer
PE20090190A1 (es) * 2007-03-23 2009-03-22 Smithkline Beecham Corp Combinacion de anticuerpos anti-cd20 y polipeptidos de il-18
US7960139B2 (en) 2007-03-23 2011-06-14 Academia Sinica Alkynyl sugar analogs for the labeling and visualization of glycoconjugates in cells
ES2667863T3 (es) * 2007-03-29 2018-05-14 Genmab A/S Anticuerpos biespecíficos y métodos de producción de los mismos
EP1997832A1 (en) 2007-05-29 2008-12-03 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against Claudin-18 for treatment of cancer
RU2009148597A (ru) 2007-05-29 2011-07-10 Новартис АГ (CH) Новые показания к применению при лечении антителами против il-1-бета
JP5570974B2 (ja) 2007-05-31 2014-08-13 ゲンマブ エー／エス 一価ヒト抗体を産生するトランスジェニック動物およびこれらの動物から得ることのできる抗体
EP2164873B2 (en) 2007-05-31 2018-09-12 Genmab A/S Stable igg4 antibodies
UA107557C2 (xx) 2007-07-06 2015-01-26 Композиція антитіла офатумумабу
ES2527297T3 (es) 2007-07-31 2015-01-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anticuerpos humanos para CD20 humano y método para utilizar los mismos
AU2008295140A1 (en) * 2007-09-05 2009-03-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with type I and type II anti-CD20 antibodies
US20090098118A1 (en) 2007-10-15 2009-04-16 Thomas Friess Combination therapy of a type ii anti-cd20 antibody with an anti-bcl-2 active agent
JP2011500715A (ja) 2007-10-16 2011-01-06 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド 自己免疫疾患の治療のためのＢＬｙＳ阻害剤および抗ＣＤ２０剤の組合せ
WO2009052830A1 (en) * 2007-10-22 2009-04-30 Genmab A/S Novel antibody therapies
PE20091434A1 (es) 2007-10-30 2009-10-17 Genentech Inc Purificacion de anticuerpos por cromatografia de intercambio cationico
EP2231183A2 (en) * 2007-12-21 2010-09-29 Genentech, Inc. Therapy of rituximab-refractory rheumatoid arthritis patients
EP2077281A1 (en) 2008-01-02 2009-07-08 Bergen Teknologioverforing AS Anti-CD20 antibodies or fragments thereof for the treatment of chronic fatigue syndrome
US7914785B2 (en) 2008-01-02 2011-03-29 Bergen Teknologieverforing As B-cell depleting agents, like anti-CD20 antibodies or fragments thereof for the treatment of chronic fatigue syndrome
NZ587284A (en) * 2008-03-25 2012-05-25 Roche Glycart Ag Use of a type ii anti-cd20 antibody with increased antibody dependent cellular cytotoxicity (adcc) in combination with cyclophosphamide, vincristine and doxorubicine for treating non-hodgkin' s lymphomas
JP6013733B2 (ja) 2008-04-11 2016-10-25 エマージェント プロダクト デベロップメント シアトル， エルエルシー Ｃｄ３７免疫治療薬および二機能性化学療法薬とのその組合せ
WO2009134738A1 (en) * 2008-04-29 2009-11-05 Genentech, Inc. Responses to immunizations in rheumatoid arthritis patients treated with a cd20 antibody
US8680020B2 (en) 2008-07-15 2014-03-25 Academia Sinica Glycan arrays on PTFE-like aluminum coated glass slides and related methods
WO2010014784A2 (en) 2008-08-01 2010-02-04 Bristol-Myers Squibb Company Combination of anti-ctla4 antibody with diverse therapeutic regimens for the synergistic treatment of proliferative diseases
KR102196883B1 (ko) 2008-08-14 2020-12-30 제넨테크, 인크. 고유 단백질 대체 이온 교환 막 크로마토그래피를 이용한 오염물의 제거 방법
EP2684570A1 (en) 2008-09-10 2014-01-15 F. Hoffmann-La Roche AG Compositions and methods for the prevention of oxidative degradation of proteins
AR073295A1 (es) 2008-09-16 2010-10-28 Genentech Inc Metodos para tratar la esclerosis multiple progresiva. articulo de fabricacion.
EP2166021A1 (en) 2008-09-16 2010-03-24 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies for treatment of cancer
WO2010042433A1 (en) 2008-10-06 2010-04-15 Bristol-Myers Squibb Company Combination of cd137 antibody and ctla-4 antibody for the treatment of proliferative diseases
SG10201610247QA (en) 2008-12-03 2017-02-27 Genmab As Antibody variants having modifications in the constant region
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
CA2744670C (en) * 2009-01-06 2018-05-15 Ziad Mallat A b cell depleting agent for the treatment of atherosclerosis
JP2012515217A (ja) * 2009-01-16 2012-07-05 グラクソスミスクライン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー ベンダムスチンおよび抗−ｃｄ２０抗体の組合せを用いた癌治療
KR102340685B1 (ko) 2009-02-20 2021-12-17 가니메드 파마슈티칼스 게엠베하 암의 진단 및 치료를 위한 방법 및 조성물
US20100247484A1 (en) 2009-03-31 2010-09-30 Heinrich Barchet Combination therapy of an afucosylated antibody and one or more of the cytokines gm csf, m csf and/or il3
ES2768990T3 (es) 2009-07-20 2020-06-24 Bristol Myers Squibb Co Combinación de anticuerpos anti-CTLA4 con gemcitabina para el tratamiento sinérgico de enfermedades proliferativas
CA2769595A1 (en) 2009-08-14 2011-02-17 Roche Glycart Ag Combination therapy of an afucosylated cd20 antibody with fludarabine and/or mitoxantrone
TWI409079B (zh) 2009-08-14 2013-09-21 Roche Glycart Ag 非典型岩藻醣化ｃｄ２０抗體與苯達莫斯汀（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）之組合療法
KR20120104517A (ko) 2009-09-03 2012-09-21 제넨테크, 인크. 류마티스 관절염의 치료, 진단 및 모니터링 방법
AR078161A1 (es) 2009-09-11 2011-10-19 Hoffmann La Roche Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento.
US20110070227A1 (en) * 2009-09-18 2011-03-24 Anna-Marie Novotney-Barry Treatment of Autoimmune and Inflammatory Diseases
EP2322555A1 (en) 2009-11-11 2011-05-18 Ganymed Pharmaceuticals AG Antibodies specific for claudin 6 (CLDN6)
EP3305813B1 (en) 2009-11-11 2020-01-15 Ganymed Pharmaceuticals GmbH Antibodies specific for claudin 6 (cldn6)
US11377485B2 (en) 2009-12-02 2022-07-05 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
US10087236B2 (en) 2009-12-02 2018-10-02 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
TW201129383A (en) 2010-02-10 2011-09-01 Immunogen Inc CD20 antibodies and uses thereof
US9173961B2 (en) * 2010-02-10 2015-11-03 Immunogen, Inc. CD20 antibodies and uses thereof
CN103124564B (zh) 2010-03-22 2016-11-09 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 对于稳定含有蛋白质的制剂有用的组合物和方法
EP2371864A1 (en) 2010-03-23 2011-10-05 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies for treatment of cancer
WO2011130332A1 (en) 2010-04-12 2011-10-20 Academia Sinica Glycan arrays for high throughput screening of viruses
MX353144B (es) 2010-04-20 2017-12-20 Genmab As Proteinas que contienen fc de anticuerpos heterodimericos y metodos para produccion de las mismas.
WO2011133886A2 (en) † 2010-04-23 2011-10-27 Genentech, Inc. Production of heteromultimeric proteins
CN102844049B (zh) 2010-04-27 2016-06-01 罗切格利卡特公司 无岩藻糖基化CD20抗体与mTOR抑制剂的联合疗法
MX2012012743A (es) 2010-05-03 2012-11-23 Genentech Inc Composiciones y metodos utiles para reducir la viscosidad de formulaciones que contienen proteina.
EP2568976B1 (en) 2010-05-10 2015-09-30 Academia Sinica Zanamivir phosphonate congeners with anti-influenza activity and determining oseltamivir susceptibility of influenza viruses
EP2571577A1 (en) 2010-05-17 2013-03-27 Bristol-Myers Squibb Company Improved immunotherapeutic dosing regimens and combinations thereof
EP2576621B1 (en) 2010-05-27 2019-04-10 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2
DK2580243T3 (da) 2010-06-09 2020-01-13 Genmab As Antibodies against human cd38
BR112012033002B1 (pt) 2010-06-24 2021-10-13 Genentech, Inc Composição aquosa de matéria, método de inibição de agregação induzida por agitação e método de prevenção de oxidação
EP2404936A1 (en) 2010-07-06 2012-01-11 Ganymed Pharmaceuticals AG Cancer therapy using CLDN6 target-directed antibodies in vivo
KR20130045914A (ko) 2010-08-03 2013-05-06 에프. 호프만-라 로슈 아게 만성 림프구성 백혈병(cll) 생체지표
EP3578205A1 (en) 2010-08-06 2019-12-11 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
AR082693A1 (es) 2010-08-17 2012-12-26 Roche Glycart Ag Terapia de combinacion de un anticuerpo anti-cd20 afucosilado con un anticuerpo anti-vegf
AU2011308496A1 (en) 2010-10-01 2013-05-02 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
CN103476793A (zh) 2010-11-08 2013-12-25 基因技术公司 皮下施用的抗-il-6受体抗体
TWI807362B (zh) 2010-11-30 2023-07-01 日商中外製藥股份有限公司 細胞傷害誘導治療劑
JP6157045B2 (ja) * 2010-12-06 2017-07-05 公益財団法人がん研究会 Ｃｄ２０認識モノクローナル抗体、ハイブリドーマ、ｃｄ２０の検出方法および判定方法
CA2819436A1 (en) 2010-12-16 2012-06-21 Roche Glycart Ag Combination therapy of an afucosylated cd20 antibody with a mdm2 inhibitor
US20130315901A1 (en) * 2011-01-10 2013-11-28 Glaxo Group Limited Novel uses
KR20140022815A (ko) 2011-02-28 2014-02-25 제넨테크, 인크. B-세포 길항제에 대한 반응을 예측하기 위한 생물학적 마커 및 방법
JP2014511687A (ja) 2011-03-31 2014-05-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッド 工学操作された核酸の送達および製剤
US20140170149A1 (en) 2011-04-20 2014-06-19 Genmab A/S Bispecific antibodies against her2 and cd3
JP6177231B2 (ja) 2011-04-20 2017-08-09 ゲンマブ エー／エス Ｈｅｒ２に対する二重特異性抗体
UA127584C2 (uk) 2011-05-13 2023-10-25 Астеллас Фарма Інк. Антитіла для лікування ракових захворювань, при яких експресується клаудин 6
BR122016016837A2 (pt) 2011-05-21 2019-08-27 Macrogenics Inc moléculas de ligação a cd3; anticorpos de ligação a cd3; composições farmacêuticas; e usos da molécula de ligação a cd3
EP2537933A1 (en) 2011-06-24 2012-12-26 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) An IL-15 and IL-15Ralpha sushi domain based immunocytokines
AU2012280267B2 (en) 2011-07-06 2016-04-21 Morphosys Ag Therapeutic combinations of anti-cd20 and anti-gm-csf antibodies and uses thereof
WO2013004841A1 (en) 2011-07-06 2013-01-10 Genmab A/S Modulation of complement-dependent cytotoxicity through modifications of the c-terminus of antibody heavy chains
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
CN102875678B (zh) * 2011-07-13 2014-08-06 无锡天演生物技术有限公司 全人源抗人cd20单抗分子及其应用
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
CA2846322A1 (en) * 2011-09-19 2013-03-28 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
PT3682905T (pt) 2011-10-03 2022-04-07 Modernatx Inc Nucleósidos, nucleótidos e ácidos nucleicos modificados e respetivas utilizações
JP6316195B2 (ja) 2011-10-26 2018-04-25 エランコ ティーアゲズンタイト アーゲー モノクローナル抗体および使用の方法
RS59166B1 (sr) 2011-10-27 2019-10-31 Genmab As Proizvodnja heterodimernih proteina
KR102168733B1 (ko) 2011-10-31 2020-10-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항원 결합 분자
US20130302274A1 (en) 2011-11-25 2013-11-14 Roche Glycart Ag Combination therapy
HRP20220717T1 (hr) 2011-12-16 2022-07-22 Modernatx, Inc. Modificirani pripravci mrna
ES2697676T3 (es) 2011-12-22 2019-01-25 Hoffmann La Roche Cromatografía de membrana de intercambio iónico
TW201334789A (zh) 2012-01-31 2013-09-01 Genentech Inc 抗ｉｇｅ抗體及其使用方法
CN102585000B (zh) * 2012-02-22 2013-05-29 尉军 一种肿瘤标志物cd25自身抗体及应用
US20150110779A1 (en) 2012-03-15 2015-04-23 Bristol-Myers Squibb Company Methods for predicting gastrointestinal immune-related adverse events (gi-irae) in patients treated with modulation of the co-stimulatory pathway
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
EP2834358A4 (en) 2012-04-02 2016-03-09 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES FOR THE PRODUCTION OF NUCLEAR PROTEINS
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9254311B2 (en) 2012-04-02 2016-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
US10130714B2 (en) 2012-04-14 2018-11-20 Academia Sinica Enhanced anti-influenza agents conjugated with anti-inflammatory activity
EP2662386B1 (en) 2012-05-07 2019-03-06 Astellas Pharma Inc. Antibodies that bind to PLAC1 and block interaction between PLAC1 and FGF7
WO2013167153A1 (en) 2012-05-09 2013-11-14 Ganymed Pharmaceuticals Ag Antibodies useful in cancer diagnosis
WO2013169971A1 (en) 2012-05-10 2013-11-14 Bristol-Myers Squibb Company Anti-tumor antibodies as predictive or prognostic biomarkers of efficacy and survival in ipilimumab-treated patients
ES2682761T3 (es) 2012-05-18 2018-09-21 Genentech, Inc. Formulaciones de anticuerpos monoclonales de alta concentración
EP3725810B1 (en) 2012-05-23 2022-07-06 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2013174404A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
DK3254695T3 (da) 2012-05-23 2020-11-30 Astellas Pharma Inc Kombinationsterapi, der involverer antistoffer mod claudin 18.2 til behandling af cancer
WO2013174403A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
PT2869845T (pt) * 2012-07-06 2019-12-09 Genmab Bv Proteína dimérica com mutações triplas
AU2013285355A1 (en) 2012-07-06 2015-01-29 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
EP3632462A1 (en) 2012-07-06 2020-04-08 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
CN103588882B (zh) * 2012-08-13 2015-10-28 中国抗体制药有限公司 针对人cd22抗体的抗独特型抗体及其应用
JP6302909B2 (ja) 2012-08-18 2018-03-28 アカデミア シニカＡｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ シアリダーゼの同定および画像化のための細胞透過性プローブ
US9547009B2 (en) 2012-08-21 2017-01-17 Academia Sinica Benzocyclooctyne compounds and uses thereof
US8643360B1 (en) * 2012-09-02 2014-02-04 George S. Cargill, III In-water voltage gradient detector
WO2014039855A1 (en) 2012-09-07 2014-03-13 Genentech, Inc. Combination therapy of a type ii anti-cd20 antibody with a selective bcl-2 inhibitor
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
JP6273205B2 (ja) 2012-10-05 2018-01-31 協和発酵キリン株式会社 ヘテロダイマータンパク質組成物
AU2013337926B2 (en) * 2012-10-30 2017-12-21 Esperance Pharmaceuticals, Inc. Antibody/drug conjugates and methods of use
SG11201503593UA (en) 2012-11-13 2015-06-29 Biontech Ag Agents for treatment of claudin expressing cancer diseases
BR122020024124B1 (pt) 2012-11-13 2024-01-30 Biontech Ag Agentes para tratamento de doenças cancerosas expressando claudina
WO2014075697A1 (en) 2012-11-13 2014-05-22 Biontech Ag Agents for treatment of claudin expressing cancer diseases
EP4074834A1 (en) 2012-11-26 2022-10-19 ModernaTX, Inc. Terminally modified rna
CN103173412B (zh) * 2012-12-07 2015-04-22 天津三箭生物技术有限公司 小鼠抗人cd20单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株
CN105229026B (zh) 2013-01-10 2021-07-30 根马布私人有限公司 人类IgG1 FC区变体及其用途
CN103145847B (zh) * 2013-02-05 2014-05-21 浙江大学 一种抗cd20抗体-海兔毒素偶联物及其制备方法和应用
WO2014127785A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
RS63738B1 (sr) 2013-02-20 2022-12-30 Astellas Pharma Inc Kombinovana terapija koja uključuje antitela protiv klaudina 18.2 za lečenje kancera
RU2694055C2 (ru) 2013-03-13 2019-07-09 Дженентек, Инк. Составы антител
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
FR3003171B1 (fr) * 2013-03-15 2015-04-10 Lab Francais Du Fractionnement Nouveaux medicaments comprenant une composition d'anticorps enrichie en isoforme de charge majoritaire
WO2014146672A1 (en) 2013-03-18 2014-09-25 Ganymed Pharmaceuticals Ag Therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
EP3670537A1 (en) 2013-03-18 2020-06-24 Astellas Pharma Inc. Therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
RU2015147696A (ru) 2013-04-09 2017-05-12 Бостон Байомедикал, Инк. Способы лечения злокачественной опухоли
CN105324124A (zh) 2013-04-19 2016-02-10 赛腾制药 降低的血管渗漏综合征的细胞因子衍生治疗
CN103254317B (zh) * 2013-05-08 2014-08-13 浙江大学 一种抗cd20单克隆抗体-海兔毒素偶联物及其制备方法和应用
WO2014210397A1 (en) 2013-06-26 2014-12-31 Academia Sinica Rm2 antigens and use thereof
US9981030B2 (en) 2013-06-27 2018-05-29 Academia Sinica Glycan conjugates and use thereof
IL311371B2 (en) * 2013-07-05 2024-09-01 Genmab As CD3 antibodies of human origin or chimeras
WO2015014376A1 (en) 2013-07-31 2015-02-05 Biontech Ag Diagnosis and therapy of cancer involving cancer stem cells
EP3747465A1 (en) 2013-07-31 2020-12-09 BioNTech AG Diagnosis and therapy of cancer involving cancer stem cells
DK3030575T3 (en) 2013-08-08 2018-10-22 Cytune Pharma IL-15 AND IL-15R-ALFA-SUSHI DOMAIN-BASED MODULOKINES
RS59756B1 (sr) 2013-08-08 2020-02-28 Cytune Pharma Kombinovana farmaceutska kompozicija
CN103467605B (zh) * 2013-09-05 2015-02-04 武汉友芝友生物制药有限公司 一种cd3抗原及其制备方法和用途
JP6486368B2 (ja) 2013-09-06 2019-03-20 アカデミア シニカＡｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ 改変されたグリコシル基を含む糖脂質を用いたヒトｉＮＫＴ細胞の活性化
EP3052106A4 (en) 2013-09-30 2017-07-19 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
EP3052521A1 (en) 2013-10-03 2016-08-10 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
MX2016005925A (es) 2013-11-05 2016-11-28 Cognate Bioservices Inc Combinaciones de inhibidores de punto de regulacion y terapeuticos para tratar el cancer.
WO2015069703A1 (en) 2013-11-06 2015-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Immunotherapeutic dosing regimens and combinations thereof
AU2014345712B2 (en) * 2013-11-07 2019-10-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of an anti CD20 antibody with a BTK inhibitor
ES2839087T3 (es) 2013-11-12 2021-07-05 Ogd2 Pharma Anticuerpo derivado de IGG1 humana con actividad pro-apoptótica
KR20160089532A (ko) 2013-12-17 2016-07-27 제넨테크, 인크. Pd-1 축 결합 길항제 및 항-cd20 항체를 사용하여 암을 치료하는 방법
CA2937123A1 (en) 2014-01-16 2015-07-23 Academia Sinica Compositions and methods for treatment and detection of cancers
US10150818B2 (en) 2014-01-16 2018-12-11 Academia Sinica Compositions and methods for treatment and detection of cancers
EP2910645A1 (en) 2014-02-25 2015-08-26 STRATIFYER Molecular Pathology GmbH Methods and compositions for prediction of therapeutic efficacy of cancer treatments and cancer prognosis upon antibody treatment
EP2915569A1 (en) 2014-03-03 2015-09-09 Cytune Pharma IL-15/IL-15Ralpha based conjugates purification method
TWI754319B (zh) 2014-03-19 2022-02-01 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
CN103880958B (zh) * 2014-03-27 2016-01-20 安徽大学 抗cd20抗原的抗体l4h6及其应用
EP3129767B1 (en) 2014-03-27 2021-09-01 Academia Sinica Reactive labelling compounds and uses thereof
CN103880957B (zh) * 2014-03-27 2016-01-20 安徽大学 抗cd20抗原的抗体l1h1及其应用
WO2015156268A1 (ja) 2014-04-07 2015-10-15 中外製薬株式会社 免疫活性化抗原結合分子
US20170049887A1 (en) 2014-04-25 2017-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Methods of permitting a subject to receive multiple doses of recombinant adeno-associated virus
MX2016014409A (es) 2014-05-06 2017-01-20 Genentech Inc Produccion de proteinas heteromultimericas usando celulas de mamifero.
JP6894702B2 (ja) 2014-05-13 2021-06-30 中外製薬株式会社 免疫抑制機能を有する細胞に対するｔ細胞リダイレクト抗原結合分子
EP3149045B1 (en) 2014-05-27 2023-01-18 Academia Sinica Compositions and methods relating to universal glycoforms for enhanced antibody efficacy
WO2015184004A1 (en) 2014-05-27 2015-12-03 Academia Sinica Anti-cd20 glycoantibodies and uses thereof
WO2015184002A1 (en) 2014-05-27 2015-12-03 Academia Sinica Anti-her2 glycoantibodies and uses thereof
US10118969B2 (en) 2014-05-27 2018-11-06 Academia Sinica Compositions and methods relating to universal glycoforms for enhanced antibody efficacy
CA2950433A1 (en) 2014-05-28 2015-12-03 Academia Sinica Anti-tnf-alpha glycoantibodies and uses thereof
EP3191500A4 (en) 2014-09-08 2018-04-11 Academia Sinica HUMAN iNKT CELL ACTIVATION USING GLYCOLIPIDS
JP7072384B2 (ja) 2014-09-15 2022-05-20 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗体製剤
PT3262071T (pt) 2014-09-23 2020-06-16 H Hoffnabb La Roche Ag Métodos de utilização de imunoconjugados anti-cd79b
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
CN115040532A (zh) 2014-10-10 2022-09-13 伊黛拉制药有限公司 使用tlr9激动剂与检查点抑制剂对癌症的治疗
EP3221359B1 (en) 2014-11-17 2020-05-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for tumor treatment using cd3xcd20 bispecific antibody
MX2017007097A (es) 2014-12-04 2017-09-05 Bristol Myers Squibb Co Combinacion de anticuerpos anti-cs1 y anti-muerte programada 1 (pd1) para tratar cancer (mieloma).
EP3240805A4 (en) 2014-12-15 2018-05-09 The Regents of the University of California Bispecific or-gate chimeric antigen receptor responsive to cd19 and cd20
US10865253B2 (en) 2014-12-19 2020-12-15 Genmab A/S Rodent bispecific heterodimeric proteins
CA2973159A1 (en) * 2015-01-08 2016-07-14 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20
US10495645B2 (en) 2015-01-16 2019-12-03 Academia Sinica Cancer markers and methods of use thereof
US9975965B2 (en) 2015-01-16 2018-05-22 Academia Sinica Compositions and methods for treatment and detection of cancers
CA2972072A1 (en) 2015-01-24 2016-07-28 Academia Sinica Novel glycan conjugates and methods of use thereof
EP3250588A1 (en) 2015-01-29 2017-12-06 Board of Trustees of Michigan State University Cryptic polypeptides and uses thereof
SG11201707144VA (en) * 2015-03-04 2017-09-28 Igm Biosciences Inc Cd20 binding molecules and uses thereof
US20180133327A1 (en) 2015-03-16 2018-05-17 Amal Therapeutics Sa Cell Penetrating Peptides and Complexes Comprising the Same
EP3273974A4 (en) 2015-03-26 2018-11-07 Women and Infants Hospital of Rhode Island Inc. Therapy for malignant disease
WO2016165762A1 (en) 2015-04-15 2016-10-20 Ganymed Pharmaceuticals Ag Drug conjugates comprising antibodies against claudin 18.2
WO2016165765A1 (en) 2015-04-15 2016-10-20 Ganymed Pharmaceuticals Ag Methods and compositions for prediction of therapeutic efficacy of cancer treatments and cancer prognosis
EP3289869B1 (en) * 2015-04-30 2020-10-14 Institute Of Immunology Co., Ltd. Transgenic non-human animal expressing human-specific molecules and human fc gamma receptor family
EP3294334B1 (en) 2015-05-11 2020-07-08 The Johns Hopkins University Autoimmune antibodies for use in inhibiting cancer cell growth
EP3936524A3 (en) 2015-05-11 2022-06-15 F. Hoffmann-La Roche AG Compositions and methods of treating lupus nephritis
KR101997241B1 (ko) 2015-05-21 2019-07-09 하푼 테라퓨틱스, 인크. 삼중특이성 결합 단백질 및 사용 방법
CA3176224A1 (en) 2015-05-22 2016-12-01 Translational Drug Development Llc Benzamide and active compound compositions and methods of use
KR20180015195A (ko) 2015-06-03 2018-02-12 보스톤 바이오메디칼, 인크. 암의 치료에 사용하기 위한 암 줄기능 저해제 및 면역치료제를 포함하는 조성물
EP3108897A1 (en) 2015-06-24 2016-12-28 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies against human csf-1r for use in inducing lymphocytosis in lymphomas or leukemias
BR112017024610A2 (pt) 2015-06-24 2018-07-31 F. Hoffmann-La Roche Ag anticorpos para receptor antitransferrina com afinidade especificada
JOP20200312A1 (ar) 2015-06-26 2017-06-16 Novartis Ag الأجسام المضادة للعامل xi وطرق الاستخدام
MX2017016645A (es) 2015-06-29 2018-11-09 Genentech Inc Anticuerpo anti-cd20 de tipo ii para su uso en el trasplante de órganos.
SI3313528T1 (sl) 2015-06-29 2021-11-30 Bristol-Myers Squibb Company Imunoterapevtski režim odmerjanja, ki vsebujejo pomalidomid in protitelo anti-CS1 za zdravljenje raka
US20180201693A1 (en) 2015-07-09 2018-07-19 Genmab A/S Bispecific and multispecific antibodies and method for isolation of such
MX2017016844A (es) 2015-07-16 2018-08-15 Biokine Therapeutics Ltd Composiciones y procedimientos para tratar cancer.
US10660954B2 (en) 2015-07-31 2020-05-26 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Hematopoietic stem cells in combinatorial therapy with immune checkpoint inhibitors against cancer
WO2017025871A1 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination therapy comprising anti ctla-4 antibodies
US11098079B2 (en) 2015-08-13 2021-08-24 Amgen Inc. Charged depth filtration of antigen-binding proteins
JP7002446B2 (ja) 2015-09-21 2022-03-04 アプティーボ リサーチ アンド デベロップメント エルエルシー Ｃｄ３結合ポリペプチド
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
IL258317B1 (en) 2015-10-02 2024-08-01 Hoffmann La Roche Human anti–CD20/human transferrin receptor bispecific antibodies and methods of use
KR20180083859A (ko) * 2015-10-13 2018-07-23 유레카 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 인간 cd19에 특이적인 항체 작용제 및 그의 용도
WO2017086419A1 (ja) 2015-11-18 2017-05-26 中外製薬株式会社 液性免疫応答の増強方法
EP3378487B1 (en) 2015-11-18 2022-03-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Combination therapy using t cell redirection antigen binding molecule against cell having immunosuppressing function
PL3387015T3 (pl) 2015-12-09 2022-02-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Przeciwciało anty-CD20 typu II do ograniczania tworzenia przeciwciał przeciwlekowych
EP3178848A1 (en) 2015-12-09 2017-06-14 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies
CN105348388B (zh) * 2015-12-11 2018-10-19 安徽大学 抗cd20抗原的抗体l3h3及其应用
JP7219005B2 (ja) 2015-12-28 2023-02-07 中外製薬株式会社 Ｆｃ領域含有ポリペプチドの精製を効率化するための方法
US10525137B2 (en) 2015-12-30 2020-01-07 Genentech, Inc. Formulations with reduced degradation of polysorbate
JP2019515874A (ja) 2016-03-01 2019-06-13 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 改変された細胞死誘導を有するオビヌツズマブ変異体
WO2017149018A1 (en) 2016-03-02 2017-09-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and kits for predicting the risk of relapse in patients suffering from idiopathic nephrotic syndrome
US10336784B2 (en) 2016-03-08 2019-07-02 Academia Sinica Methods for modular synthesis of N-glycans and arrays thereof
RU2746754C2 (ru) 2016-03-14 2021-04-20 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Индуцирующее повреждение клеток терапевтическое лекарственное средство, предназначенное для противораковой терапии
WO2017160599A1 (en) 2016-03-14 2017-09-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Use of cd300b antagonists to treat sepsis and septic shock
KR102413037B1 (ko) 2016-03-15 2022-06-23 메르사나 테라퓨틱스, 인코포레이티드 Napi2b 표적화된 항체-약물 접합체 및 이의 사용 방법
HRP20240510T1 (hr) 2016-03-16 2024-07-05 Amal Therapeutics Sa Kombinacija modulatora imunosne kontrolne točke i kompleksa koji sadrži peptid koji prodire u stanicu, teretni i tlr peptidni agonist za uporabu u medicini
JP2019514870A (ja) 2016-04-22 2019-06-06 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル Ｂ細胞悪性腫瘍の処置のための方法及びワクチン組成物
US20190298824A1 (en) 2016-05-04 2019-10-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Serv Albumin-binding immunomodulatory compositions and methods of use thereof
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
TW201802121A (zh) 2016-05-25 2018-01-16 諾華公司 抗因子XI/XIa抗體之逆轉結合劑及其用途
US11052148B2 (en) 2016-05-30 2021-07-06 Geo Vax, Inc. Compositions and methods for generating an immune response to hepatitis B virus
EP3252078A1 (en) 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
CN110603266A (zh) 2016-06-02 2019-12-20 豪夫迈·罗氏有限公司 用于治疗癌症的ii型抗cd20抗体和抗cd20/cd3双特异性抗体
HRP20240815T1 (hr) 2016-06-14 2024-09-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-c5 antitijela i njihove upotrebe
EP3472614A1 (en) * 2016-06-16 2019-04-24 F. Hoffmann-La Roche AG Assay and method for determining cdc eliciting antibodies
SG11201811600PA (en) 2016-06-30 2019-01-30 Oncorus Inc Pseudotyped oncolytic viral delivery of therapeutic polypeptides
CN106267406B (zh) * 2016-07-01 2019-02-01 翁炳焕 艾滋病血液净化器
EP3494140A1 (en) 2016-08-04 2019-06-12 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Ltd Anti-icos and anti-pd-1 antibody combination therapy
WO2018039274A1 (en) 2016-08-22 2018-03-01 CHO Pharma Inc. Antibodies, binding fragments, and methods of use
EP3507303A1 (en) * 2016-09-01 2019-07-10 UMC Utrecht Holding B.V. Cd20 antibodies
KR20230131498A (ko) 2016-09-21 2023-09-13 아말 테라퓨틱스 에스에이 암 치료를 위한, 세포 투과 펩타이드, 멀티 에피토프 및 tlr 펩타이드 작용제를 포함하는 융합체
WO2018054484A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Biontech Ag Bispecific trivalent antibodies binding to claudin 6 or claudin18.2 and cd3 for treatment of claudin expressing cancer diseases
US20190276549A1 (en) 2016-11-01 2019-09-12 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
US10780080B2 (en) 2016-11-23 2020-09-22 Translational Drug Development, Llc Benzamide and active compound compositions and methods of use
US11135307B2 (en) 2016-11-23 2021-10-05 Mersana Therapeutics, Inc. Peptide-containing linkers for antibody-drug conjugates
WO2018102427A1 (en) 2016-11-29 2018-06-07 Boston Biomedical, Inc. Naphthofuran derivatives, preparation, and methods of use thereof
WO2018099539A1 (en) 2016-11-29 2018-06-07 Horst Lindhofer Combination of t-cell redirecting multifunctional antibodies with immune checkpoint modulators and uses thereof
EP3548068A1 (en) 2016-12-01 2019-10-09 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited Combination therapy
BR112019011370A2 (pt) 2016-12-01 2019-10-15 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd terapia de combinação
WO2018100096A1 (en) 2016-12-01 2018-06-07 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Use of anti-uchl1 igg plasma concentration for diagnosing idiopathic steroid sensitive nephrotic syndrome
CA3045296A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Progenity, Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
WO2018114754A1 (en) 2016-12-19 2018-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with targeted 4-1bb (cd137) agonists
CA3039446A1 (en) 2016-12-20 2018-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and 4-1bb (cd137) agonists
US11168147B2 (en) 2016-12-23 2021-11-09 Novartis Ag Factor XI antibodies and methods of use
WO2018148381A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Nantcell, Inc. Maximizing t-cell memory and compositions and methods therefor
CN108395482B (zh) 2017-02-08 2021-02-05 西比曼生物科技（香港）有限公司 一种靶向cd20抗原嵌合抗原受体的构建及其工程化t细胞的活性鉴定
MX2019009346A (es) 2017-02-10 2019-10-02 Genmab Bv Variantes de polipeptidos y usos de los mismos.
WO2018160538A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Mersana Therapeutics, Inc. Combination therapies of her2-targeted antibody-drug conjugates
EP3596469A1 (en) 2017-03-12 2020-01-22 Yeda Research and Development Co., Ltd. Methods of diagnosing and prognosing cancer
WO2018167780A1 (en) 2017-03-12 2018-09-20 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of prognosing and treating cancer
EP3600416B1 (en) 2017-03-30 2023-06-07 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device
CN110914301B (zh) 2017-03-31 2024-09-06 健玛保控股有限公司 双特异性抗cd37抗体，单克隆抗cd37抗体及其使用方法
CN113896792A (zh) 2017-05-12 2022-01-07 哈普恩治疗公司 间皮素结合蛋白质
CA3062656A1 (en) 2017-05-17 2018-11-22 Boston Biomedical, Inc. Methods for treating cancer
CN110719799A (zh) 2017-06-09 2020-01-21 俄勒冈州普罗维登斯健康与服务部 Cd39和cd103在鉴定用于癌症治疗的人肿瘤反应性t细胞中的应用
CN107446046A (zh) * 2017-07-05 2017-12-08 无锡傲锐东源生物科技有限公司 抗cd20蛋白单克隆抗体及其用途
JP2020528061A (ja) 2017-07-26 2020-09-17 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト ＢＥＴ阻害剤、Ｂｃｌ−２阻害剤及び抗ＣＤ２０抗体を用いた併用療法
WO2019036855A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Adagene Inc. ANTI-CD137 MOLECULES AND THEIR USE
WO2019048040A1 (en) 2017-09-06 2019-03-14 Ganymed Pharmaceuticals Gmbh ANTIBODIES USEFUL IN THE DIAGNOSIS OF CANCER
CR20200195A (es) 2017-10-13 2020-08-14 Harpoon Therapeutics Inc Proteínas de unión a antigenos de maduraciòn de celulas b
WO2019077123A1 (en) 2017-10-20 2019-04-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) METHODS AND KITS FOR IDENTIFYING WHETHER A SUBJECT IS REACHED OR RISK OF BEING WITH AUTOIMMUNE MYOPATHY
WO2019104289A1 (en) 2017-11-27 2019-05-31 Mersana Therapeutics, Inc. Pyrrolobenzodiazepine antibody conjugates
AU2018382966A1 (en) 2017-12-14 2020-04-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of a CEA CD3 bispecific antibody and a PD-1 axis binding antagonist in a dosage regime to treat cancer
TW201929908A (zh) 2017-12-21 2019-08-01 美商梅爾莎納醫療公司 吡咯并苯并二氮呯抗體共軛物
EP3731850A4 (en) 2017-12-29 2021-12-01 Oncorus, Inc. ONCOLYTIC VIRUS DELIVERY OF THERAPEUTIC POLYPEPTIDES
EP3743440A1 (en) 2018-01-24 2020-12-02 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
BR112020018585A8 (pt) 2018-03-12 2022-12-06 Inst Nat Sante Rech Med Uso de mimeticos de restrição calórica para potencializar a quimioimunoterapia para o tratamento de câncer
WO2019175071A1 (en) 2018-03-13 2019-09-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Therapeutic combination of 4-1 bb agonists with anti-cd20 antibodies
TWI841551B (zh) 2018-03-13 2024-05-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 使用靶向4-1bb (cd137)之促效劑的組合療法
CN112839958A (zh) 2018-05-03 2021-05-25 根马布私人有限公司 抗体变体组合及其用途
EP3810109B1 (en) 2018-05-31 2024-08-07 Peloton Therapeutics, Inc. Compounds and compositions for inhibiting cd73
EP3807410A1 (en) 2018-06-15 2021-04-21 MiNA Therapeutics Limited Combination therapies comprising c/ebp alpha sarna
WO2019246312A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator
US20230009902A1 (en) 2018-06-20 2023-01-12 Progenity, Inc. Treatment of a disease or condition in a tissue orginating from the endoderm
WO2019243636A1 (en) 2018-06-22 2019-12-26 Genmab Holding B.V. Anti-cd37 antibodies and anti-cd20 antibodies, compositions and methods of use thereof
CN112513074A (zh) 2018-06-22 2021-03-16 健玛保 生产两种或更多种不同抗体的受控混合物的方法
CN112384219A (zh) * 2018-07-09 2021-02-19 千禧制药公司 Sumo-激活酶抑制剂和抗cd20抗体的施用
GB201811408D0 (en) 2018-07-12 2018-08-29 F Star Beta Ltd CD137 Binding Molecules
WO2020033791A1 (en) 2018-08-09 2020-02-13 Verseau Therapeutics, Inc. Oligonucleotide compositions for targeting ccr2 and csf1r and uses thereof
MA53495A (fr) 2018-08-31 2021-12-08 Regeneron Pharma Stratégie de dosage permettant d'atténuer le syndrome de libération de cytokines pour des anticorps bispécifiques cd3/c20
WO2020048942A1 (en) 2018-09-04 2020-03-12 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for enhancing cytotoxic t lymphocyte-dependent immune responses
CN112955172A (zh) 2018-09-17 2021-06-11 美国卫生和人力服务部 靶向cd19和cd20的双顺反子嵌合抗原受体及其用途
US20220073638A1 (en) 2018-09-19 2022-03-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and pharmaceutical composition for the treatment of cancers resistant to immune checkpoint therapy
KR20210086623A (ko) 2018-09-25 2021-07-08 하푼 테라퓨틱스, 인크. Ddl3 결합 단백질 및 사용 방법
WO2020070053A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of inhibitors of stress granule formation for targeting the regulation of immune responses
US20240252635A1 (en) 2018-10-04 2024-08-01 Genmab Holding B.V. Pharmaceutical compositions comprising bispecific anti-cd37 antibodies
EP3868784A4 (en) 2018-10-15 2022-07-27 Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University ANTIBODIES WITH INCREASED PRODUCTIVITY AND METHODS FOR THEIR PRODUCTION
AU2019367218A1 (en) * 2018-10-26 2021-06-03 TeneoFour, Inc. Heavy chain antibodies binding to CD38
EA202191175A1 (ru) 2018-10-29 2021-09-08 Мерсана Терапьютикс, Инк. Сконструированные с цистеином конъюгаты антитело-лекарственное средство, содержащие пептидсодержащие линкеры
WO2020106757A1 (en) 2018-11-19 2020-05-28 Progenity, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
JP2022507718A (ja) 2018-11-20 2022-01-18 コーネル ユニバーシティー 放射線核種の大環状錯体およびがんの放射線療法におけるそれらの使用
EP3887823B1 (en) 2018-11-28 2024-01-17 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods and kit for assaying lytic potential of immune effector cells
KR20210100668A (ko) 2018-12-06 2021-08-17 제넨테크, 인크. 항-CD79b 면역접합체, 알킬화제 및 항-CD20 항체를 포함하는 미만성 큰 B-세포 림프종의 조합 요법
US20220018835A1 (en) 2018-12-07 2022-01-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Use of cd26 and cd39 as new phenotypic markers for assessing maturation of foxp3+ t cells and uses thereof for diagnostic purposes
JP2022511112A (ja) 2018-12-11 2022-01-28 セラヴァンス バイオファーマ アール＆ディー アイピー， エルエルシー Ａｌｋ５阻害剤としてのナフチリジンおよびキノリン誘導体
WO2020127059A1 (en) 2018-12-17 2020-06-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of sulconazole as a furin inhibitor
KR20210121077A (ko) 2019-01-15 2021-10-07 인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔) 돌연변이된 인터루킨-34 (il-34) 폴리펩티드 및 요법에서의 이의 용도
WO2020169472A2 (en) 2019-02-18 2020-08-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of inducing phenotypic changes in macrophages
CN113660953A (zh) 2019-04-01 2021-11-16 豪夫迈·罗氏有限公司 用于稳定含蛋白质制剂的组合物和方法
JP2022527972A (ja) 2019-04-02 2022-06-07 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 前悪性病変を有する患者において癌を予測及び予防する方法
WO2020208060A1 (en) 2019-04-09 2020-10-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of sk2 inhibitors in combination with immune checkpoint blockade therapy for the treatment of cancer
WO2020212484A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treatment of nlrp3 inflammasome mediated il-1beta dependent disorders
CA3138045C (en) 2019-05-14 2024-02-20 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat follicular lymphoma
JP2022539248A (ja) 2019-07-02 2022-09-07 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター 組換えａｄ３５ベクター及び関連遺伝子治療改善
CN110551221B (zh) 2019-07-02 2021-03-05 广州爱思迈生物医药科技有限公司 一种双特异性抗体及其制备方法与应用
WO2021024020A1 (en) 2019-08-06 2021-02-11 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 and immune checkpoint inhibitors for treatment of cancer
AU2020336440A1 (en) * 2019-08-30 2022-03-24 Qilu Puget Sound Biotherapeutics Corporation Anti-CD20 antibodies, anti-CD37 antibodies, and mixtures thereof
JP2022548848A (ja) 2019-09-11 2022-11-22 ノバルティス アーゲー オファツムマブ治療患者における多発性硬化症以外の状態の管理
EP4230655A3 (en) 2019-09-11 2023-11-01 Novartis AG Treatment of rms by switching therapy
TW202118512A (zh) 2019-09-12 2021-05-16 美商建南德克公司 治療狼瘡性腎炎之組成物及方法
WO2021058091A1 (en) 2019-09-24 2021-04-01 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Treatment involving therapeutic antibody and interleukin-2 (il2)
EP3800201A1 (en) 2019-10-01 2021-04-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Cd28h stimulation enhances nk cell killing activities
EP4037710A1 (en) 2019-10-04 2022-08-10 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods and pharmaceutical composition for the treatment of ovarian cancer, breast cancer or pancreatic cancer
CN118557751A (zh) 2019-10-18 2024-08-30 基因泰克公司 使用抗CD79b免疫缀合物治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤的方法
US20220411529A1 (en) 2019-11-06 2022-12-29 Genmab B.V. Antibody variant combinations and uses thereof
JP2023502662A (ja) 2019-11-22 2023-01-25 セラヴァンス バイオファーマ アール＆ディー アイピー， エルエルシー Ａｌｋ５阻害剤としての置換１，５－ナフチリジンまたはキノリン
CN111100204B (zh) * 2019-11-26 2022-03-11 山东立菲生物产业有限公司 靶向cd20的抗体、其制备方法和应用
WO2021119482A1 (en) 2019-12-13 2021-06-17 Progenity, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
US20220372162A1 (en) * 2019-12-18 2022-11-24 TeneoFour, Inc. Pct/us2020/066088
CN115427814A (zh) 2020-02-21 2022-12-02 根马布有限公司 用于定量糖蛋白的方法
WO2021203131A1 (en) 2020-03-31 2021-10-07 Theravance Biopharma R&D Ip, Llc Substituted pyrimidines and methods of use
US20230151106A1 (en) 2020-04-09 2023-05-18 Novartis Ag OFATUMUMAB FOR TREATING MS WHILE MAINTAINING SERUM IgG
JP2023522691A (ja) 2020-04-21 2023-05-31 ユニバーシティ オブ ロチェスター ヒト精巣上体タンパク質４の阻害剤
JP2023524639A (ja) 2020-04-22 2023-06-13 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 患者特異的免疫療法用細胞の製造調整システム及び調整方法
EP4139359A1 (en) 2020-04-24 2023-03-01 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates
CA3176436A1 (en) 2020-05-08 2021-11-11 Tahamtan Ahmadi Bispecific antibodies against cd3 and cd20
JP2023528071A (ja) 2020-06-03 2023-07-03 エムヴィ バイオセラピューティクス エスエー Ａｔｐ加水分解酵素と免疫チェックポイントモジュレーターとの組合せ、並びにその使用
EP4165041A1 (en) 2020-06-10 2023-04-19 Theravance Biopharma R&D IP, LLC Naphthyridine derivatives useful as alk5 inhibitors
WO2021260675A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Yeda Research And Development Co. Ltd. Agents for sensitizing solid tumors to treatment
EP4178611A1 (en) 2020-07-07 2023-05-17 BioNTech SE Therapeutic rna for hpv-positive cancer
KR20230152783A (ko) 2020-07-07 2023-11-03 칸큐어 엘엘씨 Mic 항체 및 결합제 및 이의 사용 방법
US20230295146A1 (en) 2020-07-24 2023-09-21 The University Of Rochester Inhibitors of interleukin-1 receptor-associated kinases 1 and 4
CN112062855B (zh) 2020-08-26 2024-08-30 北京天诺健成医药科技有限公司 一种含有衔接器的药物治疗剂的开发和应用
WO2022043415A1 (en) 2020-08-27 2022-03-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for detecting the presence of pemphigus-specific autoantibodies in a sample
CN116782933A (zh) 2020-09-10 2023-09-19 健玛保 用于治疗弥漫性大b细胞淋巴瘤的联合疗法中的针对cd3和cd20的双特异性抗体
IL301086A (en) 2020-09-10 2023-05-01 Genmab As Bispecific antibody against CD3 and CD20 in combination therapy for the treatment of follicular lymphoma
JP2023542290A (ja) 2020-09-10 2023-10-06 ジェンマブ エー／エス 濾胞性リンパ腫を治療するための併用療法におけるｃｄ３及びｃｄ２０に対する二重特異性抗体
KR20230066583A (ko) 2020-09-10 2023-05-16 젠맵 에이/에스 미만성 대 b-세포 림프종을 치료하기 위한 조합 요법에서의 cd3 및 cd20에 대한 이중특이적 항체
CA3190349A1 (en) 2020-09-10 2022-03-17 Brian Elliott Bispecific antibodies against cd3 and cd20 for treating chronic lymphocytic leukemia
US20230312759A1 (en) 2020-09-10 2023-10-05 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
CN116547305A (zh) 2020-11-11 2023-08-04 生物技术公司 针对程序性死亡-1蛋白的单克隆抗体及其在医学中的用途
WO2022130206A1 (en) 2020-12-16 2022-06-23 Pfizer Inc. TGFβr1 INHIBITOR COMBINATION THERAPIES
TW202245808A (zh) 2020-12-21 2022-12-01 德商拜恩迪克公司 用於治療癌症之治療性ｒｎａ
WO2022135667A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Therapeutic rna for treating cancer
WO2022135666A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Treatment schedule for cytokine proteins
IL304067A (en) 2021-01-06 2023-08-01 Hoffmann La Roche Combined treatment using PD1-LAG3 bispecific antibody and CD20 T cell bispecific antibody
WO2022198192A1 (en) 2021-03-15 2022-09-22 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating lupus nephritis
EP4314082A1 (en) 2021-03-24 2024-02-07 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Bicistronic chimeric antigen receptors designed to reduce retroviral recombination and uses thereof
TW202304506A (zh) 2021-03-25 2023-02-01 日商安斯泰來製藥公司 涉及抗claudin 18.2抗體的組合治療以治療癌症
JP2024511189A (ja) 2021-03-26 2024-03-12 ビオンテック・ソシエタス・エウロパエア がんの処置における抗ｃａ１９－９抗体およびｆｏｌｆｉｒｉｎｏｘを用いた組合せ療法。
JP2024518709A (ja) 2021-04-10 2024-05-02 プロファウンドバイオ ユーエス カンパニー Ｆｏｌｒ１結合剤、そのコンジュゲートおよびこれを使用する方法
CA3216479A1 (en) 2021-04-14 2022-10-20 Novartis Ag Ofatumumab for treating multiple sclerosis in asian patients
TW202308699A (zh) 2021-04-23 2023-03-01 美商普方生物製藥美國公司 Ｃｄ７０結合劑、其結合物及其使用方法
US20240207304A1 (en) 2021-04-28 2024-06-27 Mina Therapeutics Limited Combination Therapies Comprising C/EBP Alpha saRNA
WO2022228705A1 (en) 2021-04-30 2022-11-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Dosing for combination treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and anti-cd79b antibody drug conjugate
IL307821A (en) 2021-04-30 2023-12-01 Hoffmann La Roche Dosage for treatment with BISPIFIC ANTI-CD20/ANTI-CD3 antibody
EP4333987A1 (en) 2021-05-07 2024-03-13 Viela Bio, Inc. Use of an anti-cd19 antibody to treat myasthenia gravis
CN117396232A (zh) 2021-05-12 2024-01-12 基因泰克公司 使用抗cd79b免疫缀合物治疗弥漫性大b细胞淋巴瘤的方法
WO2022251359A1 (en) 2021-05-26 2022-12-01 Theravance Biopharma R&D Ip, Llc Bicyclic inhibitors of alk5 and methods of use
WO2022253756A1 (en) 2021-06-01 2022-12-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of b cell depleting agents for the treatment of rheumatic heart disease
KR20240049794A (ko) 2021-06-07 2024-04-17 프로비던스 헬스 앤드 서비시즈 - 오레곤 Cxcr5, pd-1, 및 icos 발현 종양 반응성 cd4 t 세포 및 그의 용도
WO2022262959A1 (en) 2021-06-15 2022-12-22 Astellas Pharma Europe Bv Bispecific binding agents binding to cldn18.2 and cd3
CA3220318A1 (en) 2021-06-17 2022-12-22 Glaxosmithkline Intellectual Property Limited Anti-baff antibodies for use in a method of treatment of long covid and/or post-acute sequelae sars-cov-2 infection (pasc)
EP4367269A1 (en) 2021-07-05 2024-05-15 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Gene signatures for predicting survival time in patients suffering from renal cell carcinoma
KR20240046323A (ko) 2021-07-13 2024-04-08 비온테크 에스이 암에 대한 병용 요법에 있어서 cd40 및 cd137에 대한 다중특이 결합제
US20240336697A1 (en) 2021-08-07 2024-10-10 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat diffuse large b-cell lymphoma
EP4387999A1 (en) 2021-08-16 2024-06-26 Novartis AG Ofatumumab for treating pediatric ms
TW202333802A (zh) 2021-10-11 2023-09-01 德商拜恩迪克公司 用於肺癌之治療性rna(二)
CA3238167A1 (en) 2021-11-19 2023-05-25 Maria Leia Smith Gpc3 binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
IL314344A (en) 2022-01-28 2024-09-01 Genmab As Bispecific antibodies against CD3 and CD20 in combination therapy for the treatment of diffuse large B-cell lymphoma
WO2023144306A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
US20230414750A1 (en) 2022-03-23 2023-12-28 Hoffmann-La Roche Inc. Combination treatment of an anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and chemotherapy
WO2023198839A2 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20
WO2023198727A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Pharmaceutical compositions of anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and methods of use
WO2023201369A1 (en) 2022-04-15 2023-10-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Til expansion processes using specific cytokine combinations and/or akti treatment
WO2023217987A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 BioNTech SE Monoclonal antibodies directed against programmed death-1 protein and their use in medicine
CN116162153B (zh) * 2022-09-01 2024-09-10 复旦大学附属中山医院 一种乙肝病毒表面抗原的单克隆抗体及其应用
WO2024052356A1 (en) 2022-09-06 2024-03-14 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Inhibitors of the ceramide metabolic pathway for overcoming immunotherapy resistance in cancer
US20240174761A1 (en) 2022-11-02 2024-05-30 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20 for treating richter's syndrome
WO2024094741A1 (en) 2022-11-03 2024-05-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with anti-cd19/anti-cd28 bispecific antibody
WO2024102734A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating childhood onset idiopathic nephrotic syndrome
WO2024112571A2 (en) 2022-11-21 2024-05-30 Iovance Biotherapeutics, Inc. Two-dimensional processes for the expansion of tumor infiltrating lymphocytes and therapies therefrom
WO2024126457A1 (en) 2022-12-14 2024-06-20 Astellas Pharma Europe Bv Combination therapy involving bispecific binding agents binding to cldn18.2 and cd3 and immune checkpoint inhibitors
WO2024153636A1 (en) 2023-01-17 2024-07-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Vasorin as a biomarker and biotarget in nephrology
WO2024173607A2 (en) 2023-02-14 2024-08-22 Evolveimmune Therapeutics, Inc. Combination of bispecific antibodies and chimeric antigen receptor t cells for treatment
US20240285762A1 (en) 2023-02-28 2024-08-29 Juno Therapeutics, Inc. Cell therapy for treating systemic autoimmune diseases

Family Cites Families (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5247069A (en) 1986-06-13 1993-09-21 Oncogen Ligands and methods for augmenting B-cell proliferation
US5182368A (en) 1986-06-13 1993-01-26 Ledbetter Jeffrey A Ligands and methods for augmenting B-cell proliferation
US4954617A (en) 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
IL85035A0 (en) * 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2, Inc., Danville, Calif. Geänderte antikörper.
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
DE3856559T2 (de) 1987-05-21 2004-04-29 Micromet Ag Multifunktionelle Proteine mit vorbestimmter Zielsetzung
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US6218525B1 (en) 1988-02-25 2001-04-17 The General Hospital Corporation Nucleic acid encoding CD28
US5506126A (en) 1988-02-25 1996-04-09 The General Hospital Corporation Rapid immunoselection cloning method
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1994025585A1 (en) 1993-04-26 1994-11-10 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1992022645A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
EP0593592B1 (en) 1991-07-08 1998-03-25 The University Of Massachusetts At Amherst Thermotropic liquid crystal segmented block copolymer
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
ES2265005T3 (es) 1991-07-25 2007-02-01 Biogen Idec Inc. Anticuerpos recombinantes para terapia humana.
US6136310A (en) 1991-07-25 2000-10-24 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant anti-CD4 antibodies for human therapy
US5756096A (en) 1991-07-25 1998-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant antibodies for human therapy
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5540926A (en) 1992-09-04 1996-07-30 Bristol-Myers Squibb Company Soluble and its use in B cell stimulation
GB9223377D0 (en) 1992-11-04 1992-12-23 Medarex Inc Humanized antibodies to fc receptors for immunoglobulin on human mononuclear phagocytes
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
WO1994011026A2 (en) * 1992-11-13 1994-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
US6096878A (en) 1993-05-10 2000-08-01 Japan Tobacco Inc. Human immunoglobulin VH gene segments and DNA fragments containing the same
US5595721A (en) 1993-09-16 1997-01-21 Coulter Pharmaceutical, Inc. Radioimmunotherapy of lymphoma using anti-CD20
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
EP1978033A3 (en) 1995-04-27 2008-12-24 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US20010056066A1 (en) 1996-07-26 2001-12-27 Smithkline Beecham Corporation Method of treating immune cell mediated systemic diseases
JP2000516594A (ja) 1996-07-26 2000-12-12 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 免疫細胞介在全身性疾患の改良された治療法
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6183744B1 (en) 1997-03-24 2001-02-06 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US6306393B1 (en) 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
WO1999014353A2 (en) 1997-09-19 1999-03-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Intrabody-mediated control of immune reactions
US7947472B2 (en) 1997-12-24 2011-05-24 Vegenics Limited Expression vectors and cell lines expressing vascular endothelial growth factor D
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
WO2000003733A1 (en) 1998-07-16 2000-01-27 Vincent Marinkovich Methods and compositions for cancer treatment
EP1974747B1 (en) * 1998-08-11 2012-06-27 Biogen Idec Inc. Combination therapies for B-cell lymphomas comprising administration of anti-CD20 antibody
US6224866B1 (en) 1998-10-07 2001-05-01 Biocrystal Ltd. Immunotherapy of B cell involvement in progression of solid, nonlymphoid tumors
US20010033839A1 (en) 1999-10-04 2001-10-25 Emilio Barbera-Guillem Vaccine and immunotherapy for solid nonlymphoid tumor and related immune dysregulation
MXPA01004649A (es) 1998-11-09 2002-05-06 Idec Pharma Corp Tratamiento con anticuerpo quimerico anti-cd20 para pacientes que reciben transplantes de medula osea o celulas madre de sangre periferica.
MXPA01004648A (es) 1998-11-09 2002-05-06 Idec Pharma Corp Tratamientro de enfermedades hematologicas malignas asociadas con celulas tumorales de la circulacion usando el anticuerpo quimerico anti-cd20.
ATE311199T1 (de) * 1999-05-07 2005-12-15 Genentech Inc Behandlung von autoimmunkrankheiten mit antagonisten die oberflächenmarker von b zellen binden
WO2000074718A1 (en) 1999-06-09 2000-12-14 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of autoimmune disorders using antibodies which target b-cells
HUP0202238A3 (en) 1999-07-12 2004-05-28 Idec Pharmaceuticals Inc San D Blocking immune response to a foreign antigen using an antagonist which binds to cd20
IL147765A0 (en) 1999-07-29 2002-08-14 Medarex Inc HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO HER2/neu
US8557244B1 (en) 1999-08-11 2013-10-15 Biogen Idec Inc. Treatment of aggressive non-Hodgkins lymphoma with anti-CD20 antibody
CN101259270A (zh) 1999-08-11 2008-09-10 拜奥根Idec公司 用抗cd20抗体治疗累及骨髓的非霍奇金淋巴瘤患者
WO2001014424A2 (en) 1999-08-24 2001-03-01 Medarex, Inc. Human ctla-4 antibodies and their uses
CA2390412A1 (en) 1999-11-08 2001-05-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Treatment of b cell malignancies using anti-cd40l antibodies in combination with anti-cd20 antibodies and/or chemotherapeutics and radiotherapy
US20020028178A1 (en) 2000-07-12 2002-03-07 Nabil Hanna Treatment of B cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
US20020006404A1 (en) 1999-11-08 2002-01-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Treatment of cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
AU3327701A (en) 2000-02-03 2001-08-14 Millennium Pharm Inc Humanized anti-ccr2 antibodies and methods of use therefor
EP1125905A1 (en) 2000-02-16 2001-08-22 Pepscan Systems B.V. Segment synthesis
EP1267927A1 (en) * 2000-03-24 2003-01-02 Chiron Corporation Methods of therapy for non-hodgkin's lymphoma using a combination of an antibody to cd20 and interleukin-2
MXPA02009523A (es) * 2000-03-30 2003-02-12 Amgen Inc Moleculas similares a cd20/receptor de ige y usos de las mismas.
BR0109705A (pt) 2000-03-31 2005-01-11 Idec Pharma Corp Uso combinado de anticorpos ou antagonistas anti-citocina e anticd20 para o tratamento de linfoma de célula b
BR0110364A (pt) 2000-04-25 2003-12-30 Idec Pharma Corp Administração intratecal de rituximab para tratamento de linfomas do sistema nervoso central
JP2004512262A (ja) 2000-06-20 2004-04-22 アイデック　ファーマスーティカルズ　コーポレイション 非放射性抗ｃｄ２０抗体／放射標識抗ｃｄ２２抗体の組合せ
CA2410371C (en) 2000-06-22 2015-11-17 University Of Iowa Research Foundation Methods for enhancing antibody-induced cell lysis and treating cancer
CN1446104A (zh) 2000-07-12 2003-10-01 Idec药物公司 利用b细胞排除抗体和免疫调制抗体联合治疗b细胞恶性肿瘤的相关应用
AU2001276018A1 (en) 2000-07-20 2002-02-05 Regents Of The University Of Minnesota Radiolabeled immunotoxins
AU8470301A (en) 2000-08-03 2002-02-18 Wim-Van Schooten Production of humanized antibodies in transgenic animals
WO2002022212A2 (en) * 2000-09-18 2002-03-21 Idec Pharmaceuticals Corporation Combination therapy for treatment of autoimmune diseases using b cell depleting/immunoregulatory antibody combination
AU2002213357A1 (en) 2000-10-20 2002-05-06 Idec Pharmaceuticals Corporation Variant igg3 rituxan r and therapeutic use thereof
DE60131456T2 (de) 2000-11-30 2008-07-10 Medarex, Inc., Milpitas Transchromosomale transgen-nagetiere zur herstellung von humanen antikörpern
AU2002251692A1 (en) 2000-12-08 2002-08-19 Duke University Identification of novel ms4a gene family members expressed by hematopoietic cells
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20020159996A1 (en) 2001-01-31 2002-10-31 Kandasamy Hariharan Use of CD23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders
WO2002060485A2 (en) 2001-01-31 2002-08-08 Idec Pharmaceuticals Corporation Use of immunoregulatory antibodies in the treatment of neoplastic disorders
CA2444661A1 (en) 2001-01-31 2002-08-08 Idec Pharmaceutical Corporation Use of cd23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders
AU2002307037B2 (en) 2001-04-02 2008-08-07 Biogen Idec Inc. Recombinant antibodies coexpressed with GnTIII
ATE540978T1 (de) 2002-10-17 2012-01-15 Genmab As Humane monoklonale antikörper gegen cd20
EP2231183A2 (en) 2007-12-21 2010-09-29 Genentech, Inc. Therapy of rituximab-refractory rheumatoid arthritis patients

Also Published As

Publication number Publication date
CA2502552A1 (en) 2004-04-29
CA2502552C (en) 2019-02-12
US20040167319A1 (en) 2004-08-26
EA201492217A1 (ru) 2015-06-30
PL376351A1 (pl) 2005-12-27
PT1558648E (pt) 2012-04-23
BRPI0315295B8 (pt) 2019-08-20
JP5155968B2 (ja) 2013-03-06
LTPA2021514I1 (pl) 2021-07-26
MXPA05004022A (es) 2005-10-05
EP1558648A2 (en) 2005-08-03
BRPI0315295B1 (pt) 2018-12-26
KR20050049552A (ko) 2005-05-25
LU92041I2 (fr) 2014-01-11
KR20090088973A (ko) 2009-08-20
CN103709250B (zh) 2016-08-10
NZ581541A (en) 2011-07-29
DK3284753T3 (da) 2021-07-05
PT3284753T (pt) 2020-05-04
WO2004035607A2 (en) 2004-04-29
CN101928344B (zh) 2014-08-13
HK1077590A1 (en) 2006-02-17
AU2003301445A1 (en) 2004-05-04
BR0315295A (pt) 2005-08-30
US8529902B2 (en) 2013-09-10
EP3284753A3 (en) 2018-03-14
EA021644B1 (ru) 2015-08-31
KR100932340B1 (ko) 2009-12-16
EP1558648B1 (en) 2012-01-11
JP4662473B2 (ja) 2011-03-30
LTC3284753I2 (pl) 2022-09-12
WO2004035607A8 (en) 2004-06-17
DK1558648T3 (da) 2012-04-23
IL167851A (en) 2013-12-31
HUE046695T2 (hu) 2020-03-30
LU92041I9 (pl) 2019-01-03
CN103709250A (zh) 2014-04-09
KR20100050587A (ko) 2010-05-13
US20140093454A1 (en) 2014-04-03
EP2330130A1 (en) 2011-06-08
EP3284753B1 (en) 2019-06-05
KR20120128151A (ko) 2012-11-26
JP5767041B2 (ja) 2015-08-19
JP2010042002A (ja) 2010-02-25
ES2744275T3 (es) 2020-02-24
JP2006507844A (ja) 2006-03-09
EP2316856B1 (en) 2017-08-09
IL167851A0 (en) 2009-02-11
EP2316856A1 (en) 2011-05-04
KR20110017020A (ko) 2011-02-18
KR20110140142A (ko) 2011-12-30
KR100944575B1 (ko) 2010-02-25
EP1558648A4 (en) 2006-02-15
ES2524694T3 (es) 2014-12-11
EP3284753A2 (en) 2018-02-21
IL221193A0 (en) 2012-09-24
CA3029035C (en) 2023-03-07
PL216630B1 (pl) 2014-04-30
KR101348472B1 (ko) 2014-01-07
SI1558648T1 (sl) 2012-05-31
US20200317799A1 (en) 2020-10-08
CN1729203B (zh) 2014-02-19
CN1729203A (zh) 2006-02-01
CY1112750T1 (el) 2015-08-05
EP2330130B1 (en) 2014-08-27
HUS2100026I1 (hu) 2021-07-28
CY2012019I2 (el) 2015-08-05
JP2012005485A (ja) 2012-01-12
CN101928344A (zh) 2010-12-29
WO2004035607A3 (en) 2004-08-12
ES2380621T3 (es) 2012-05-16
PL402418A1 (pl) 2013-05-27
EA200500679A1 (ru) 2006-02-24
FR21C1028I1 (fr) 2021-08-27
NZ568769A (en) 2010-04-30
CA3029035A1 (en) 2004-04-29
ATE540978T1 (de) 2012-01-15
LT3284753T (lt) 2020-06-10
CY2012019I1 (el) 2015-08-05
BRPI0315295C1 (pt) 2021-05-25
KR20080090565A (ko) 2008-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200317799A1 (en) Human Monoclonal Antibodies Against CD20
EP1740946A2 (en) Human monoclonal antibodies against cd20
AU2011202520C1 (en) Human monoclonal antibodies against CD20
AU2019204903B2 (en) Human monoclonal antibodies against CD20
EA043675B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела против cd20