KR20130045914A - 만성 림프구성 백혈병(cll) 생체지표 - Google Patents

만성 림프구성 백혈병(cll) 생체지표 Download PDF

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Abstract

본원은 만성 림프구성 백혈병(CLL) 생체지표를 기재한다. 특히, 본 발명은 CLL에서 환자 선택을 위한 생체지표로서의 miRNA151 3p, miRNA409 3p, PTK2, 및/또는 PI3K, 뿐만 아니라 치료 방법, 제품, 및 이의 제조 방법, 진단 키트, 및 이에 대한 광고 방법에 관한 것이다.

Description

만성 림프구성 백혈병(CLL) 생체지표{CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA (CLL) BIOMARKERS}
본 발명은 만성 림프구성 백혈병(CLL: chronic lymphocytic leukemia) 생체지표에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 CLL에서 환자 선택을 위한 생체지표로서의 miRNA151 3p, miRNA409 3p, PTK2, 및 PI3K 뿐만 아니라, 치료 방법, 제품 및 이의 제조 방법, 진단 키트, 및 이에 대한 광고 방법에 관한 것이다.
관련 출원
본원은 2010년 8월 3일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/370,403호 및 2011년 2월 7일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/440,162호(이들의 내용은 참고로 전체가 인용되어 있음)에 대한 우선권을 35 USC § 119하에 주장한다.
만성 림프구성 백혈병(CLL)은 서구 사회에서 성인 백혈병의 가장 흔한 형태이다. 많은 다른 B-세포 악성종양과 마찬가지로, CLL은 CD20 표면 항원의 발현을 특징으로 하고, 이로 인해 항-CD20 치료법의 대상이 될 수 있다. 단일클론성 키메라성 항-CD20 항체인 리툭시맵(rituximab)은 여포성 NHL[마커스(Marcus) 등의 문헌 "J Clin Oncol. 26:4579-4586 (2008)"; 히데만(Hiddemann) 등의 문헌 "Blood 106:3725-3732 (2005)"] 및 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL: diffuse large B-cell lymphoma)[코이피어(Coiffier) 등의 문헌 "N. Engl J. Med. 346:235-242 (2002)"; 포기어(Feugier) 등의 문헌 "J Clin Oncol . 23(18):4117-4126 (2005)"]을 앓는 환자에 대해 무진행 생존율(PFS: Progression Free Survival) 및 총 생존율(OS: Overall Survival)에 있어서 상당한 이점을 보여주었다. 게다가, 리툭시맵에 의한 화학면역치료법은 또한 치료되지 않은 환자 및 재발된/난치성 환자의 경우 화학치료법만 사용한 경우에 비해 CLL에서 PFS를 연장시키고[할커(Hallek) 등의 문헌 "Blood, ASH Annual Meeting Abstract, 112: 325 (2008)"; 로박(Robak) 등의 문헌 "Blood, ASH Annual Meeting Abstracts, 112:lba-l (2008)" 참조], 더욱 최근에는 총 생존율을 연장시키는 것으로 제시되었다[할커 등의 문헌 "Blood , ASH Annual Meeting Abstracts, 114: Abstract 535 (2009)" 참조].
리툭시맵이 B-세포를 제거하는 작용 기작은 항체 의존성 세포독성(ADCC: antibody dependent cellular cytotoxicity)[골레이(Golay) 등의 문헌 "Blood 95(12):3900-3908 (2000)"], 보체 의존성 세포독성(CDC: complement dependent cytotoxicity)[골레이 등의 문헌 "Blood 95(12):3900-3908 (2000)"; 하르준파(Harjunpaa) 등의 문헌 "Scand J Immunol . 51(6):634-641(2000)"] 및 직접적인 세포자멸사유발(proapoptotic) 효과[호프마이스터(Hofmeister) 등의 문헌 "Blood Cells Mol Dis . 6(2):133-143 (2000)"]를 포함한다.
항-CD20 항체 리툭시맵의 작용 기작이 알려졌지만, CD20 항체-기제 치료법에 대한 반응 또는 저항성을 예측하도록 하는 질환 또는 숙주 관련된 인자에 대한 지식이 여전히 부족하다. CLL에서 다수의 인자는 질환의 예후에 영향을 주는 것으로 입증되었음이 문헌을 통해 공개되었다. 이들 인자로는 세포유전학적 및 분자적 일탈, IgVH 유전자자리의 돌연변이 상태, ZAP70 및 CD38 발현 및 그 외 인자들이 포함된다[모레노(Moreno) 및 몬세라트(Monserrat)의 문헌" Blood Reviews 22:211-219 (2008)"에서 검토됨].
그러나, 이들 지표 중 어느 것도 이제까지 CLL에서 항-CD20 항체-기제 치료법에 대한 참된 예측 결과를 제시하지 못했다. 게다가, 다른 NHL 독립체에서의 작용 기작과 연관된 Fcγ 수용체 다형현상[카트론(Cartron) 등의 문헌 "Blood 99(3):754-758 (2002)"; 웽(Weng) 및 레비(Levy)의 문헌 "J Clin Oncol . 21(21):3940-7 (2003)"]은 CLL에서 항-CD20-기제 치료법의 결과에 영향을 주는 것으로 보이지 않았다[파라그(Farag) 등의 문헌 "Blood 103:1472-1474 (2004)"; 도르난(Dornan) 등의 문헌 "Blood ( ASH Annual Meeting Abstracts ) 114: 2338 (2009)"].
이 연구의 목적은 표준 화학치료법[플루다라빈(fludarabine)/사이클로포스파미드; FC] 또는 FC + 리툭시맵(R-FC)으로 치료되는 제어되고 랜덤화된 실험으로 치료된 환자들의 거대 통계집단에서 예측가능한 생체지표를 발견하고, 게놈 데이터와 임상적 결과의 연관성을 보여주기 위한 것이었다.
마이크로RNA(miRNA)는 mRNA의 안정성 및 번역 둘 다에 영향을 줌으로써 다세포 유기체에서 유전자 발현의 전사후 조절에 연관되는 짧은(17개 내지 27개 뉴클레오티드) 비-코딩성(non-coding) RNA이다. miRNA는 표적 mRNA에 결합하여 이의 번역을 저해하거나 분해를 촉진시키고, 이로써 생물학적 진행에 영향을 줄 수 있다. miRNA151 3p는 PTK2의 인트론성인(intronic), 염색체 8 상에서 발견되는 마이크로RNA이다. miRNA151 3p에 관한 문헌은 다음과 같다: 플시(Fulci) 등의 문헌 "Genes, Chromosomes & Cancer 48 (12): 1069-1082 (2009)"; 아기레(Agirre) 등의 문헌 "Mol. Cancer Res . 6 (12): 1830-1840 (2008)"; 딩(Ding) 등의 문헌 "Nat . Cell Biol. 12(4): 390-399 (2010)"; 카와하라(Kawahara) 등의 문헌 "EMBO 8(8): 763-769 (2007)".
비손(Visone) 등의 문헌 "Blood 114(18): 3872-3879 (2009)"은 CLL에서 핵형(karyotype)-특이적 miRNA 특징에 관한 것이다.
본 발명은 만성 림프구성 백혈병(CLL)에서 치료법에 대한 예측 반응으로서의 생체지표 miRNA151 3p, miRNA409 3p, PTK2, 및 PI3K를 식별함에 관한 것이다.
제1 실시태양에 따라서, 본 발명은 CLL을 앓는 환자에서 miRNA151 3p, miRNA409 3p, 및 PTK2로부터 선택된 하나 이상의 생체지표의 양이 상승되었을 경우 CLL 약제를 치료 효과량으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, CLL을 앓는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 이러한 CLL 약제의 예로는 하기 약제가 포함된다:
- FAK 신호전달 및/또는 동형 부착(homotypic adhesion)을 유도하는 CLL 약제;
- B-세포 길항물질, 예컨대 CD20 항체, 예를 들어 인간화된, 인간, 또는 키메라성 항-CD20 항체
- 제I 유형의 항-CD20 항체
- 제II 유형의 항-CD20 항체
- 항-CD20 항체, 예컨대 리툭시맵, 오파투뮤맵(ofatumumab), GA101, SBI-087, 벨투추맵(veltuzumab), 및 AME-133.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 CLL을 앓는 환자에서 miRNA151 3p, miRNA409 3p, 및 PTK2로부터 선택된 하나 이상의 생체지표의 양이 상승되었을 경우 치료 효과량의 리툭시맵, 플루다라빈 및 사이클로포스파미드의 배합물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, CLL을 앓는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
게다가, 본 발명은 CLL을 앓는 환자에서 miRNA151 3p, miRNA409 3p, 및 PTK2로부터 선택된 하나 이상의 생체지표의 양이 감소되었을 경우 리툭시맵 이외의 CLL 약제를 치료 효과량으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, CLL을 앓는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 CLL을 앓는 환자로부터의 샘플에서 miRNA151 3p, miRNA409 3p, PTK2, 및 PI3K로부터 선택된 생체지표의 발현을 결정하는 단계, 및 생체지표의 발현 수준에 기초하여 CLL 약제를 선택하는 단계를 포함하는, CLL을 앓는 환자를 위한 치료법을 선택하는 방법에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 암 샘플이 생체지표를 상승된 수준에서 발현할 경우 환자는 CLL 약제(예를 들어 FAK 신호전달 또는 동형 부착을 유도하는 약제, 또는 B-세포 길항물질, 예컨대 CD20 항체인 약제)로 치료하도록 선택된다. 또 다른 실시태양에서, 암 샘플이 생체지표를 낮은 수준에서 발현할 경우 환자는 리툭시맵 이외의 CLL 약제로 치료하도록 선택된다.
또한, 본 발명은 CLL 환자로부터의 샘플에서 miRNA151 3p, miRNA409 3p, PTK2, 및 PI3K로부터 선택된 생체지표의 발현을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함하는 진단 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체중의 CLL 약제, 및 이러한 CLL 약제가 miRNA151 3p, miRNA409 3p, PTK2, 및 PI3K로부터 선택된 하나 이상의 생체지표의 발현에 기초하여 CLL을 앓는 환자를 치료하기 위한 것임을 지시하는 포장 삽입물을 함께 포장된 채로 포함하는 제품에 관한 것이다.
관련된 양태에서, 본 발명은 CLL 약제를 포함하는 약학 조성물, 및 이러한 약학 조성물이 miRNA151 3p, miRNA409 3p, PTK2, 및 PI3K로부터 선택된 하나 이상의 생체지표의 발현에 기초하여 CLL을 앓는 환자를 치료하기 위한 것임을 지시하는 포장 삽입물을 포장물에서 조합하는 단계를 포함하는 제품의 제조 방법에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명은 miRNA151 3p, miRNA409 3p, PTK2, 및 PI3K로부터 선택된 하나 이상의 생체지표의 발현에 기초하여 CLL을 앓는 환자를 치료하기 위한 약제의 용도를 표적 청중에게 홍보하는 단계를 포함하는, CLL 약제를 광고하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 CLL을 앓는 환자에서 PI3K 생체지표가 감소되었을 경우 CLL 약제를 치료 효과량으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, CLL을 앓는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명은, 한 양태에서, CLL을 앓는 환자에서 PI3K 생체지표가 감소되었을 경우 환자에게 치료 효과량의 리툭시맵, 플루다라빈 및 사이클로포스파미드의 조합물을 투여하는 단계를 포함하는, CLL을 앓는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
게다가, CLL을 앓는 환자에서 PI3K 생체지표가 상승하였을 경우 리툭시맵 이외의 CLL 약제를 치료 효과량으로 투여하는 단계를 포함하는, CLL을 앓는 환자를 치료하는 방법이 제공된다.
도 1a는 miRNA151 3p 발현(어레이(array)에 기초함) 및 치료법에 관한 무진행 생존율(PFS)을 도시한다.
도 1b는 miRNA151 3p 발현(qRT-PCR에 기초함) 및 치료법에 관한 PFS를 도시한다.
도 2a는 miRNA409 3p 발현(어레이에 기초함) 및 치료법에 관한 PFS를 도시한다.
도 2b는 miRNA409 3p 발현(qRT-PCR에 기초함) 및 치료법에 관한 PFS를 도시한다.
도 3은 치료 및 PTK2 발현에 관한 어피메트릭스(AFFYMETRIX:등록상표) 엑손(Exon) 1.0 ST PFS를 도시한다.
도 4는 치료 및 PTK2 발현에 관한 어피메트릭스(등록상표) U133+2 PFS를 도시한다.
도 5는 치료 및 PTK2 발현에 관한 qRT-PCR:PFS를 도시한다.
도 6은 miRNA151 3p에 의한 3'UTR의 표적화를 도시한다. HeLa 세포는 방법 부분에 기재된 바와 같이 miRNA151 3p 또는 NTC로 형질감염되었다. 각 구조물의 miRNA151 3p에 의한 억제는 NTC로 정규화되었다. 데이터는 3개의 생물 복제물로부터 유도된다. 통계적 유의성은 2측 스튜던트 t-테스트(2-sided Student's t-test)로 결정되었다. **P<0.01, *P<0.05.
도 7은 치료 및 PIK3R3 발현에 의해 계층화된 환자에서의 PFS를 도시한다(고: >= 중앙 =4; 저: <4).
도 8a 내지 8c는 PIK3R3 발현에 관한 결과 연관성을 도시한다: PIK3R3 발현 하위군의 FCR 대 FC 치료 효과(도 8a); FC 아암(arm)에서의 PIK3R3 발현의 예후적 효과(도 8b); 및 FCR 아암에서의 PIK3R3 발현의 효과(도 8c). 지표 컷오프(cutoff)는 특정화된 사분위수에서의 또는 연속적인 변수로서의 PIK3R3 발현을 지칭한다.
I. 정의
"만성 림프구성 백혈병" 또는 "CLL"은 백혈구(림프구)의 암을 지칭한다. 본원에서 CLL의 예는 "제1 선의" 또는 "치료되지 않은" CLL(즉, 여기서 CLL 환자는 CLL 치료를 위해 이전에 치료받지 않았음), "이전에 치료된 CLL"(여기서 CLL 환자는 CLL을 위해 이전에 치료를 받았음), "난치성" CLL(여기서 환자는 CLL을 위한 치료법에 난치성임), "재발성 CLL"(여기서 환자는 CLL을 위해 이전에 치료받은 후 재발되었음)을 포함한다.
본원에서, "환자"는 인간 환자이다. 환자는 "CLL 환자", 즉 CLL의 하나 이상의 증후를 겪거나 겪을 위험이 있는 환자일 수 있다. 더욱이, 환자는 이전에 치료된 CLL 환자일 수 있다.
본원의 목적을 위해, "이전에 치료된" CLL 환자는 CLL 치료법, 예컨대 클로람부실(chlorambucil)[프레드니손(prednisone)/프레드니솔론(prednisolone)과 함께 또는 이들의 부재하에], 플루다라빈(또는 다른 뉴클레오시드 유사체), 및/또는 알킬레이터(alkylator)-함유 조합 섭생을 비롯한 치료법을 이전에 받았다. 이러한 이전에 치료된 CLL 환자는 임의적으로 이전 알킬화제에 대해 감수성이거나 난치성이지만, 플루다라빈에 감수성인 것이 바람직하다(예를 들어 6개월 이상 지속되는 반응을 달성한다).
"난치성" CLL은 항-종양제, 예컨대 화학치료제가 CLL 환자에게 투여되는 경우조차도 진행된다. 난치성 암의 예는 뉴클레오시드 유사체(예를 들어 플루다라빈), 사이클로포스파미드; 플루다라빈 및 사이클로포스파미드(FC); 클로람부실; 프레드니손 또는 프레드니솔론; 사이클로포스파미드, 빈크리스틴(vincristine), 프레드니솔론(CHOP), 또는 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니솔론(CVP)을 포함하는 알킬레이터-함유 조합 치료법; 알렘투추맵(alemtuzumab)[캄패쓰(Campath)] 등중 임의의 하나 이상의 치료에 대해 난치성인 암이다.
"CLL 약제"는 CLL을 치료하는데 효과적인 약물이다. CLL 약제의 예로는 이하 주지된 화학치료제 및 화학치료 섭생이 포함된다; B 세포 길항물질, 예컨대 CD20 항체(예를 들어 리툭시맵 또는 오파투뮤맵 등), CD22 항체, 및 CD79b 항체; 정맥내 면역 글로불린; CD52 항체(예를 들어 알렘투추맵); 알킬화제[예를 들어 클로람부실, 벤다무스틴(bendamustine), 또는 사이클로포스파미드]; 뉴클레오시드 유사체 또는 대사길항물질(예를 들어 플루다라빈), 플루다라빈 및 사이클로포스파미드(FC); 프레드니손 또는 프레드니솔론; 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니솔론(CHOP), 또는 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니솔론 (CVP) 등을 포함하는 알킬레이터-함유 조합 치료법. 한 실시태양에서, CLL 약제는 FAK 신호전달 및/또는 동형 응집을 유도한다.
"FAK 신호전달"은 FAK의 상향조절 또는 활성화(예를 들어 FAK의 Tyr397의 인산화반응을 경유함)를 지칭하고, 예를 들면 하류 신호전달 분자, 예컨대 Src 키나아제(kinase), 성장 인자 수용체 결합 단백질 2 어댑터(adaptor) 단백질(Grb2), 및/또는 FAK 활성화에 기인한 Ras/미토겐-활성화된 단백질 키나아제 경로의 활성화를 포함한다. FAK 신호전달을 유도하는 CLL 약제 또는 B-세포 길항물질(예를 들어 CD20 항체)을 식별하는 방법은 알토몬테(Altomonte) 등의 문헌 "J. Cell . Physiol 200: 272-274 (2004)"에 기재되어 있다.
"동형 부착" 또는 "동형 응집"은 동일한 세포의 서로에 대한 상호작용 및 부착을 지칭하고, 이는 프로그램화된 세포 사멸을 유도할 수 있다. 동형 응집을 유도하는 CLL 약제 또는 B-세포 길항물질(예를 들어 CD20 항체)을 식별하는 방법은 이바노브(Ivanov) 등의 문헌 "J. Clin . Invest. 119(8): 2143-2159 (2009)" 또는 알토몬테(Altomonte) 등의 문헌 "J. Cell . Physiol 200: 272-274 (2004)"에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다.
용어 "생체지표" 또는 "지표"는 본원에 사용될 경우 일반적으로 유전자, mRNA, 단백질, 탄수화물 구조물, 또는 당지질을 비롯한 분자를 지칭하고, 조직 또는 세포의 내부 또는 위에서의 또는 분비된 이들의 발현은 공지된 방법(또는 본원에 개시된 방법)에 의해 검출될 수 있고 예측되거나, 치료 섭생에 대한 세포, 조직 또는 환자의 반응성에 대하여 예측(또는 예측 보조)하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 특히 흥미로운 생체지표는 PTK2, miRNA151 3p, 및 miRNA409 3p이다.
"단백질-티로신 키나아제 2" 또는 "PTK2"는 본원에 사용될 때 초점 부착 키나아제 1(FADK 1:focal adhesion kinase 1)로도 공지된 인간 단백질 티로신 키나아제 2(PTK2)를 지칭한다. 본원의 목적을 위해, "PTK2"는 PTK2를 코딩하는 DNA 또는 mRNA, 뿐만 아니라 코딩된 PTK2 단백질, 및 샘플에서 PTK2의 검출을 용이하게 하는 이들의 임의의 단편 또는 부분을 지칭한다. PTK2 서열은 하기로부터 공개적으로 이용가능하다:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene&cmd=Retrieve&dopt=Graphics&list uids =5747, 또는
http://www.uniprot.org/uniprot/Q05397.
PTK2는 또한 FAK; FADK; FAK1; FRNK; ppl25FAK; PTK2로 공지되어 있다. PTK2 유전자는 세포외 기질 성분의 존재하에 성장하는 세포들 사이에서 형성되는 초점 부착에 집중되는 것으로 밝혀진 세포질성 단백질 티로신 키나아제를 코딩한다. 코딩된 단백질은 단백질 티로신 키나아제의 초점 부착 키나아제(FAK) 하위계열의 일원이지만, 다른 하위계열로부터의 키나아제와의 상당한 서열 유사성이 결여되어 있다. 이러한 유전자의 활성화는 특정 중성 펩타이드에 대한 반응 또는 세포외 기질과의 세포 상호작용에 대한 반응에서 개시되는 세포내 신호 변환 경로 및 세포 성장에서 중요한 초기 단계일 수 있다. 4개의 상이한 이소형(isoform)을 코팅하는 4개 이상의 전사 변형체가 상기 유전자에 대해 발견되었지만, 이들중 단지 2개의 전장 성질이 결정되었다. 본원에서 용어 "PTK2"는 이소형 1, 2, 3, 및 4(각각 Q05397-1, -2, -3, 및 -4)를 비롯한 이의 각각의 이소형을 포함한다. PTK2 DNA, mRNA, 및/또는 단백질은 본 발명에 따라 평가될 수 있다.
"포스포이노시티드(phosphoinositide) 3-키나아제" 및 "PI3K"는 인간 포스포이노시티드 3-키나아제, 및 이의 서브유닛을 지칭한다. PI3K는 포스포이노시티드의 이노시톨 고리의 3'OH를 인산화시킬 수 있는 지질 키나아제이다. PI3K는 본원에서 제I 부류(제IA 부류 및 제IB 부류), 제II 부류, 및 제III 부류 PI3K를 포함한다. 한 실시태양에서, PI3K는 제I 부류 PI3K이고, 임의적으로, PI3K는 이의 조절 서브유닛, 예컨대 조절 서브유닛 3(PIK3R3)을 포함한다. 본원의 목적을 위해, PI3K(및 동의어)는 PI3K를 코딩하는 DNA 또는 mRNA, 또는 PI3K 단백질(PI3K의 서브유닛 포함), 뿐만 아니라 샘플에서 PI3K의 검출을 용이하게 하는 이들의 임의의 단편 또는 부분을 지칭한다. PI3K DNA, mRNA, 및/또는 단백질, 뿐만 아니라 PI3K 활성화는 본 발명에 따라 평가될 수 있다. 이와 같이, "감소된 PI3K 생체지표"는 P13K 생체지표의 감소된 양 및/또는 활성을 지칭하고, "상승된 PI3K 생체지표"는 P13K 생체지표의 증가된 양 및/또는 활성을 지칭한다.
"포스포이노시티드-3-키나아제, 조절 서브유닛 3(감마)", "PIK3R3", 및 "p55-감마"는 PI3K 촉매적 서브유닛(110 kDa)과 상호작용 할 수 있는 PI3K의 인간 조절 서브유닛 3을 지칭한다. 예를 들면, 데이(Dey) 등의 문헌 "Gene 209(1-2): 175-83 (1998)", 인그함(Ingham) 등의 문헌 "J. Biol . Chem . 276(15): 12257-65 (2001)", 및 "UniProtKB/Swiss-Prot: P55G HUMAN. Q92569"를 참조한다. PIK3R3 이소형은 상기 정의에 명백히 포함된다. 본원의 목적을 위해, PIK3R3(및 동의어)은 PIK3K3을 코딩하는 DNA 또는 mRNA, 또는 PIK3R3 단백질, 뿐만 아니라 샘플에서 PIK3R3의 검출을 용이하게 하는 이들의 임의의 단편 또는 부분을 지칭한다. PIK3R3 DNA, mRNA, 및/또는 단백질, 및/또는 PIK3R3 활성화(또는 PIK3R3을 포함하는 PI3K의 활성화)는 본 발명에 따라 평가될 수 있다.
"마이크로RNA" 또는 "miRNA"는 mRNA의 안정성 및 번역 둘다에 영향을 줌으로써 다세포 유기체에서 유전자 발현의 전사후 조절에 연관되는 짧은(일반적으로 약 15개 내지 30개 뉴클레오티드) 비-코딩 RNA이다.
"miRNA151 3p"는 본원에 사용될 때 하기 서열을 포함하는 miRNA를 지칭한다: CUAGACUGAAGCUCCUUGAGG(서열 번호 1). 또한 다음을 참조한다:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/442893 및 http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_entry.pl?acc=MI0000809. miRNA151 3p는 PTK에 인트론성이고 이와 함께 공동-발현된다. 본원의 목적을 위해, 이 용어는 샘플에서 miRNA151 3p의 검출을 용이하게 하는 DNA 또는 mRNA, 및 이들의 단편 또는 부분을 포함한다.
본원에서 사용되는 "miRNA409 3p"는 하기 서열을 포함하는 RNA를 지칭한다: GAAUGUUGCUCGGUGAACCCCU(서열 번호 2). 또한 다음을 참조한다:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/574413 또는 http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_entry.pl?acc=MI0001735. 본원의 목적을 위해, 이 용어는 샘플에서 miRNA409 3p의 검출을 용이하게 하는 DNA 또는 mRNA, 및 이들의 단편 또는 부분을 포함한다.
"환자 샘플"은 CLL 환자로부터 수득된 유사한 세포의 수집물을 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 근원은 신선한, 냉동된 및/또는 보존된 기관 또는 조직 샘플, 또는 생검 또는 흡인으로부터의 고체 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성성분; 체액, 예컨대 뇌 척수액, 양수액, 복막액, 또는 세포간질액; 피험체의 임신 또는 발달중 임의의 시점으로부터의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 자연적으로 조직과 혼합되지 않는 화합물, 예컨대 보존제, 응고방지제, 완충제, 고정제, 영양제, 항생제 등을 포함할 수 있다. 본원에서 종양 샘플의 예로는, 제한되지 않지만, 종양 생검, 순환(circulating) 종양 세포, 혈청 또는 혈장, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC: Peripheral Blood Mononuclear Cell), 순환 혈장 단백질, 복수액, 1차 세포 배양액 또는 종양으로부터 유도되거나 종양-유사 특성을 나타내는 세포주, 뿐만 아니라 보존된 종양 샘플, 예컨대 포르말린-고정된 종양 샘플, 파라핀-함침된 종양 샘플 또는 동결된 종양 샘플이 포함된다. 한 실시태양에서, 샘플은 CD19-강화된 PBMC를 비롯하여 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 포함한다.
약제로의 치료에 대한 환자의 "효과적인 반응" 또는 환자의 "반응성" 및 이와 유사한 단어는 CLL 약제의 투여시 CLL 위험이 있거나 이를 앓는 환자에게 부여되는 임상적 또는 치료적 이점을 지칭한다. 이러한 이점은 다음중 임의의 하나 이상의 이점을 포함한다: 생존율(총 생존율 및 무진행 생존율 포함) 연장; 객관적 반응(완전 반응 또는 부분 반응 포함) 발생; 또는 CLL 징후 또는 증후의 개선 등. 한 실시태양에서, 생체지표는, 생체지표를 동일한 수준에서 발현하지 않는 환자에 비해 약제로 치료된 경우 무진행 생존율(PFS)이 더 클것으로 예상되는 환자를 식별하기 위해 사용된다. 본원에서 생체지표의 발생 정도는 효과적으로 예측하거나, 이러한 효과적인 반응을 고감도로 예측한다.
"생존율"은 생존한 채로 남아있는 환자를 지칭하고, 총 생존율 뿐만 아니라 무진행 생존율을 포함한다.
"총 생존율"은 진단 또는 치료시점으로부터 규정된 기간, 예컨대 1년, 5년 등 동안 생존한 채로 남아있는 환자를 지칭한다.
"무진행 생존율"은 암이 진행되지 않거나 악화되지 않고 생존한 채로 남아있는 환자를 지칭한다.
"생존율 연장"은 치료되지 않은 환자에 비해(즉 약제로 치료되지 않은 환자에 비해), 또는 생체지표가 지정된 수준으로 발현되지 않은 환자에 비해, 및/또는 승인된 항-종양제(예컨대 플루다라빈 및 사이클로포스파미드, FC의 화학치료법 섭생)로 치료된 환자에 비해 치료된 환자에서 총 생존율 또는 무진행 생존율이 증가함을 의미한다
"객관적 반응"은 완전 반응(CR: complete response) 또는 부분 반응(PR: partial response)을 포함하는 측정가능한 반응을 지칭한다.
"완전 반응" 또는 "CR"은 치료에 반응하여 암의 모든 징후가 사라짐을 의도한다. 이는 암이 치유되었음을 항상 의미하는 것은 아니다.
"부분 반응" 또는 "PR"은 치료에 대한 반응으로 하나 이상의 종양 또는 병변의 크기의 감소, 또는 생체내 암의 정도의 감소를 지칭한다.
CLL 환자에 대한 증가된 임상적 이점과 연관된 생체지표의 "양" 또는 수준은 생물 샘플에서 검출가능한 수준이다. 이들은 당분야의 숙련가에게 공지된 방법으로 측정될 수 있고, 또한 본 발명에 의해 개시된다. 평가되는 생체지표의 발현 수준 또는 양은 치료에 대한 반응을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
용어 "발현의 수준" 또는 "발현 수준"은 대개 상호교환적으로 사용되고, 일반적으로 생물 샘플에서의 폴리뉴클레오티드, mRNA, 또는 아미노산 생성물 또는 단백질의 양을 지칭한다. "발현"은 일반적으로 유전자-코딩된 정보가 세포에 존재하고 작동하는 구조물로 전환되는 과정을 지칭한다. 그러므로, 본 발명에 따라서 유전자의 "발현"은 폴리뉴클레오티드로의 전사, 단백질로의 번역, 또는 단백질의 번역후 변형을 지칭할 수 있다. 전사된 폴리뉴클레오티드, 번역된 단백질, 또는 번역후 변형된 단백질의 단편은, 또한 이들이 선택적 이어맞추기(alternative splicing)에 의해 생성된 전사물 또는 분해된 전사물로부터 유래되었는지, 단백질의 번역후 과정, 예를 들어 단백질분해로부터 유래되었는지와 무관하게, 발현된 것으로 간주될 것이다. "발현된 유전자"는 mRNA로서 폴리뉴클레오티드로 전사되고 이어서 단백질로 번역된 유전자, 뿐만 아니라 RNA로 전사되지만 단백질로 번역되지 않는 유전자(예를 들면, miRNA)를 포함한다.
생체지표의 "상승된" 또는 "높은" 양 또는 수준은 환자 모집단, 예를 들어 CLL을 앓는 환자의 모집단, 또는 CLL 환자의 하위모집단(예를 들어 이전에 치료된 CLL 환자)에서 생체지표의 중앙값 양과 동일하거나 이에 비해 큰 양을 지칭한다. 예를 들면, 이러한 양은 50% 내지 약 100%, 예를 들어 약 75 내지 100%의 백분율 범위일 수 있다.
생체지표의 "감소된" 또는 "낮은" 양 또는 수준은 환자 모집단에서 생체지표의 중앙값 양에 비해 낮은 양을 지칭하고, 예를 들면, 이러한 양은 0% 내지 약 49%, 예를 들어 약 0 내지 25%의 백분율 범위일 수 있다.
"발현에 기초하여"라는 어구는 본원에 사용될 때 본원에서 하나 이상의 생체지표의 발현 수준에 대한 정보가 치료 결정, 포장 삽입물에 제공되는 정보, 또는 마케팅/홍보 지침 등을 알리기 위해 사용됨을 의미한다. 생체지표 발현 수준이 상승된 경우, 환자는 CLL 약제, 예컨대 B-세포 길항물질, 예를 들어 CD20 항체, 예컨대 리툭시맵으로 치료될 수 있다. 생체지표 발현 수준이 감소된 경우, 환자는 리툭시맵 이외의(또는 항-CD20 항체 이외의) CLL 약제로 치료될 수 있다.
"B-세포 표면 지표" 또는 "B-세포 표면 항원"은 본원에서 이에 결합되는 길항물질로 표적화될 수 있는 B 세포 표면상에서 발현되는 항원이다. 예시적인 B-세포 표면 지표로는 CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 및 CD86 백혈구 표면 지표가 포함된다(설명을 위해, 문헌 "The Leukocyte Antigen Facts Book, 2nd Edition. 1997, ed. Barclay et al. Academic Press, Harcourt Brace & Co., New York"을 참조한다). 다른 B-세포 표면 지표로는 RP105, FcRH2, B-세포 CR2, CCR6, P2X5, HLA-DOB, CXCR5, FCER2, BR3, BAFF, BLyS, Btig, NAG14, SLGC16270, FcRHl, IRTA2, ATWD578, FcRH3, IRTA1, FcRH6, BCMA, 및 239287이 포함된다. 한 실시태양에서, B-세포 표면 지표는 CD20, CD22, 또는 CD79b이다.
"CD20" 항원, 또는 "CD20"은 말초 혈액 또는 림프 기관으로부터의 B 세포의 90% 보다 더 많은 표면 상에서 발견되는 약 35-kDa의 비-글리코실화된 인단백질이다. CD20은 정상 B 세포 뿐만 아니라 악성 B 세포 상에 존재하지만, 줄기 세포 상에서는 발현되지 않는다. 문헌에 나타난 CD20에 대한 다른 명칭으로는 "B-림프구-제한된 항원" 및 "Bp35"가 포함된다. CD20 항원은 예를 들면 클락(Clark) 등의 문헌 "Proc. Natl . Acad . Sci. (USA), 82: 1766 (1985)"에 기재되어 있다.
"B-세포 길항물질"은 B-세포 표면 지표 또는 B-세포 특이적 생존 또는 증식 인자에 결합될 경우, 예를 들어 B 세포에 의해 유발되는 체액 반응을 감소시키거나 방지함으로써 포유동물에서 B 세포를 파괴 또는 고갈시키고/시키거나, B-세포 생존 및/또는 하나 이상의 B-세포 기능에 간섭하는 분자이다. 길항물질은 이로 치료된 포유동물에서 B 세포를 고갈(즉, 순환 B-세포 수준을 감소)시키는 것이 바람직하다. 이러한 고갈은 다양한 기작, 예컨대 ADCC 및/또는 CDC, B-세포 증식의 억제 또는 B-세포의 직접적 용해 및/또는 B-세포 사멸의 유도(예를 들어 세포자살을 통해)를 경유하여 달성될 수 있다. 길항물질은 세포자살에 대한 당분야에 공지된 다양한 방법, 및 B 세포의 고갈, 및 증식과 성장의 지연 또는 중단, 또는 B 세포의 생존에 대한 다른 측정법에 의해 스크리닝될 수 있다.
"B-세포 표면 지표에 결합하는 항체" 또는 "B-세포 표면 지표로의 항체"는, 예를 들어 B 세포에 의해 유발되는 체액 반응을 감소시키거나 방지함으로써, B-세포 표면 지표에 결합될 경우 포유동물에서 B 세포를 파괴 또는 고갈시키고/시키거나 하나 이상의 B-세포 기능을 간섭하는 분자이다. 항체는 이로 치료된 포유동물에서 B 세포를 고갈(즉, 순환 B-세포 수준을 감소)시키는 것이 바람직하다. 이러한 고갈은 항체-의존성 세포-중재된 세포독성(ADCC) 및/또는 보체-의존성 세포독성(CDC), B-세포 증식의 억제, 및/또는 B-세포 사멸의 유도(예를 들어 세포자살을 통해)와 같은 다양한 기작을 경유하여 달성될 수 있다. 한 실시태양에서, 항체는 인간 CD20에 결합하는 항체이다.
항-CD20 항체의 예로는 다음이 포함된다: 키메라성 항-CD20 항체, 예컨대 리툭시맵(이하 참조); 인간 항-CD20 항체, 예컨대 오파투뮤맵[덴마크의 젠맵(Genmab) 판매; 또한 글렌니(Glennie) 및 반 데 윈켈(van de Winkel)의 문헌 "Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003)"; 크래그(Cragg) 등의 문헌 "Blood 101: 1045-1052 (2003)"; 국제 특허출원 공개공보 제WO 2004/035607호; 및 제WO 2005/103081호 참조]; 인간화된 항-CD20 항체, 예컨대 인간화된 2H7(이하 참조) 또는 벨투추맵(hA20)[골든버그(Goldenberg) 등의 문헌 "Blood 113(5): 1062-1070 (2009)"]; 글리코실화 변형 항체, 예로서 2분화된 푸코스 제거된(afucosylated) Fc 영역-탄수화물을 갖는 글리코실화 변형체, 예컨대 GA101(이하 참조); 소 모듈 면역약제(SMIP: Small Modular ImmunoPharmaceutical) 또는 단일-쇄 항체, 예컨대 SBI-087; 이트륨-[90]-표지된 2B8 뮤린(murine) 항체 지정된 "Y2B8" 또는 바이오겐 이덱 인코포레이티드(Biogen Idec, Inc.)로부터 시판되는 "이브리투모맵 티우세탄(Ibritumomab Tiuxetan)"[제발린(ZEVALIN: 등록상표)](예를 들어, 미국 특허 제5,736,137호; 1993년 6월 22일자로 승인 번호 HB11388하에 ATCC에 의해 기탁된 2B8); 임의적으로 131I로 표지되어 "131I-B1" 또는 "요오드 I131 토시투모맵(tositumomab)" 항체[벡사(BEXXAR: 등록상표)](코릭사(Corixa)로부터 시판됨)를 생성하는, "토시투모맵"으로도 지칭되는 뮤린 IgG2a "B1"(또한 예를 들어, 미국 특허 제5,595,721호 참조); 뮤린 단일클론성 항체 "1F5"[예를 들어, 프레스(Press) 등의 문헌 "Blood 69(2):584-591 (1987)"] 및 이의 변형체, 예로서 "골격구조 덧대어진(framework patched)" 또는 인간화된 1F5(예를 들어, 국제 특허출원 공개공보 제WO 2003/002607호[렁(Leung, S.)]; ATCC 기탁 HB-96450); US 제2004/0093621호[쉬타라(Shitara) 등]에 기재된 Fc 영역에 결합된 착체 N-글리코시드-연결된 당 쇄를 갖는 항체; 국제 특허출원 공개공보 제WO 2006/106959호[누마자키(Numazaki) 등, 바이오메딕스 인코포레이티드(Biomedics Inc.)]에 기재된, CD20 항원의 세포외 에피토프에 높은 결합 친화도를 갖는 키메라화된 또는 인간화된 단일클론성 항체; CD20에 결합하는 단일클론성 항체 및 항원-결합 단편[예를 들어, 국제 특허출원 공개공보 제WO 2005/000901호, 테더(Tedder) 등], 예컨대 HB20-3, HB20-4, HB20-25, 및 MB20-11; CD20에 결합하는 단일-쇄 단백질, 예로서 제한되지 않지만, TRU-015(예를 들어, US 제2005/0186216호[레드베터(Ledbetter) 및 하이덴-레드베터(Hayden-Ledbetter)]); US 제2005/0202534호(하이덴레드베터 및 레드베터); US 제2005/0202028호(하이덴레드베터 및 레드베터); US 제2005/136049호(레드베터 등); US 제2005/0202023호[하이덴-레드베터 및 레드베터; 터비온 팜 인코포레이티드(Trubion Pharm Inc.)]); CD20-결합 분자, 예컨대 항체의 AME 시리즈, 예를 들면, 국제 특허출원 공개공보 제WO 2004/103404호; US 제2005/0025764호; 및 US 제2006/0251652호[왓킨스((Watkins) 등, 어플라이드 몰레큘라 에볼류션 인코포레이티드(Applied Molecular Evolution, Inc.)]에 제시된 바와 같은 AME-133 항체, 및 예를 들면, 국제 특허출원 공개공보 제WO 2005/070963호[알란(Allan) 등, 어플라이드 몰레큘라 에볼류션 인코포레이티드]에 제시된 바와 같은 Fc 돌연변이를 갖는 항-CD20 항체; CD20-결합 분자, 예컨대 국제 특허출원 공개공보 제WO 2005/016969호 및 US 제2005/0069545호[카르(Carr) 등]에 기재된 분자; 예를 들면, 국제 특허출원 공개공보 제WO 2005/014618호[창(Chang) 등]에 제시된 바와 같은 이중특이적 항체; 예를 들어, 국제 특허출원 공개공보 제WO 2006/130458호[가지트(Gazit) 등, 암겐(Amgen)/아스트라제네카(AstraZeneca)]에 기재된 바와 같은 CD20에 대한 전체 인간 항체;예를 들면, 국제 특허출원 공개공보 제WO 2006/126069호[모라왈라(Morawala), 아베스타 겐그레인 테크롤로지스 피브이티-리미티드(Avestha Gengraine Technologies Pvt Ltd.)]에 기재된 바와 같은 CD20에 대한 항체; A20 항체 또는 이의 변형체, 예컨대 키메라성 또는 인간화된 A20 항체(각각 cA20, hA20) 및 IMMUN-106[예를 들어, US 제2003/0219433호, 이뮤노메딕스(Immunomedics)]; 및 국제 백혈구 판정 워크샵(International Leukocyte Typing Workshop)으로부터 입수가능한 단일클론성 항체 L27, G28-2, 93-1B3, B-Cl 또는 NU-B2[예를 들어, 발렌틴(Valentine) 등의 문헌 "Leucocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987)"].
"제I 유형"의 CD20 항체는 강력한 보체-의존성 세포독성(CDC) 및 항체-의존성 세포독성(ADCC)을 통해 세포 사멸을 중재한다. 제I 유형의 항-CD20 항체의 예로는 리툭시맵, 벨투추맵, 오크렐리추맵, 오파투뮤맵, 및 AME-133이 포함된다.
"제II 유형"의 CD20 항체는 동시적인 포스파티딜세린 노출에 의한 카스파제(caspase)-독립적 세포자살을 통해 표적 세포 사멸을 개시하고 제I 유형의 항-CD20 항체에 비해 더 강한 동형 부착 및 ADCC를 나타낸다. 제II 유형의 항체는 CD20을 지질 뗏목(lipid raft)으로 편재화시키지 않는다. 제II 유형의 항-CD20 항체의 예로는 토시투모맵(B1), 11B8, AT80 및 인간화된 B-Lyl 항체가 포함된다.
"리툭시맵"은 B 세포 상의 CD20 항원에 결합하고 생체내에서 B 세포를 고갈시키는 키메라성 IgGl 항-CD20 항체이다. 그의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 명백히 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제7,381,560호에 개시되어 있다. 리툭시맵은 미국에서 제네테크(Genentech)로부터 리툭산(RITUXAN: 등록상표)이라는 상품명하에 시판되고, 다른 나라에서는 로슈(Roche)로부터 맵테라(MABTHERA: 등록상표)라는 상품명하에 시판된다. 리툭시맵을 코딩하는 핵산은 1992년 11월 10일자로 ATCC에 의해 기탁 번호 제69119호로 기탁되었다. 리툭시맵의 생물 활성은, CD20 결합에 대해 표적 세포에서의 신호전달을 관여시켜 성장 억제 및 (비고전적) 세포자살("직접 세포 사멸"로 지칭됨), 보체-의존성 세포독성(CDC), 및 Fcγ 수용체(FcγR)를 나타내는 세포, 예컨대 FcγRIIIa-발현 NK 세포 및 대식세포에 의해 중재된 항체-의존성 세포독성(ADCC)을 유도하는 것으로 이해된다.
용어 "인간화된 B-Lyl 항체" 및 "GA101"은 뮤린 단일클론성 항-CD20 항체 B-Lyl의 인간화된 변형체를 기재하는, 국제 특허출원 공개공보 제WO 2005/044859호 및 제WO 2007/031875호에 개시된 바와 같은 인간화된 IgG1 B-Lyl 항체를 지칭한다. 더군다나, 인간화된 B-Lyl 항체는 국제 특허출원 공개공보 제WO 2005/044859호, 제WO 2004/065540호, 제WO 2007/031875호, 우마나(Umana) 등의 문헌 "Nature Biotechnol . 17 (1999) 176-180 (1999)", 및 제W0 1999/54342호에 기재된 절차에 따라서 Fc 영역에서 글리코조작되는(glycoengineered(GE)) 것이 바람직하다. 푸코스 제거된 글리코-조작된 인간화된 B-Lyl(B-HH6-B-KV1 GE)이 본 발명의 한 실시태양에서 바람직하다. 이러한 글리코조작된 인간화된 B-Lyl 항체는 Fc 영역에서 글리코실화의 변경된 패턴을 갖고, 바람직하게는 푸코스 잔기의 수준이 감소된다. 바람직하게는 푸코스의 양은 Asn297에서 올리고당의 총 양의 60% 이하이다(한 실시태양에서 푸코스의 양은 40% 내지 60%이고, 또 다른 실시태양에서 푸코스의 양은 50% 이하이며, 또 다른 실시태양에서 푸코스의 양은 30% 이하이다). 더군다나 Fc 영역의 올리고당은 이등분되는 것이 바람직하다. 이들 글리코조작된 인간화된 B-Lyl 항체는 증가된 ADCC를 갖는다.
순수하게 본원의 목적을 위해 별도로 지시되지 않는 한, "2H7" 또는 "2H7 항체"는 US 제2006/0034835호 및 국제 특허출원 공개공보 제WO 2004/056312호[두 공보 모두 로우맨(Lowman) 등]; US 제2006/0188495호[바론(Barron) 등]; 및 US 제2006/0246004호[아담스(Adams) 등]에 기재된 가변성 도메인 서열을 포함하는 인간화된 항-CD20 항체를 지칭한다. 간단하게, 뮤린 항-인간 CD20 항체, 2H7(또한 본원에서 m2H7로 지칭됨, 뮤린에 대한 m)의 인간화는 일련의 부위-유도된 돌연변이생성 단계에서 실행되었다. 뮤린 2H7 항체 가변성 영역 서열, 및 마우스 V 및 인간 C를 갖는 키메라성 2H7은, 예를 들어, 미국 특허 제5,846,818호 및 제6,204,023호에 기재되어 있다. 2H7의 CDR 잔기는 뮤린 2H7 가변성 도메인의 아미노산 서열(미국 특허 제5,846,818호에 개시됨)을 공지된 항체의 서열과 비교하여 식별되었다[카밧(Kabat) 등의 문헌 "Sequences of Proteins of Immunological Interest, Ed. 5 (Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)"]. 경쇄 및 중쇄를 위한 CDR 영역은 서열 과가변성에 기초하여 규정되었다(상기 카밧의 문헌). 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 뮤린 2H7 CDR 영역중 6개 모두를 플라스미드 pVX4 상에 함유된 컨센서스(consensus) 서열 VκI,VHIII(VL 카파 하위군 I, VH 하위군 III)에 상응하는 인간 Fab 골격구조내로 도입하기 위해 부위-유도된 돌연변이생성[쿤켈(Kunkel)의 문헌 "Proc . Natl . Acad . Sci . ( USA ), 82:488-492 (1985)"]이 사용되었다(국제 특허출원 공개공보 제WO 2004/056312호의 도 2 참조). V 영역의 추가의 변형(CDR 및/또는 FR)은 부위-유도된 돌연변이생성에 의해 파지미드(phagemid) pVX4에서 제조되었다. 전장 IgG의 발현을 위한 플라스미드는 키메라성 2H7 Fab 뿐만 아니라 인간화된 Fab 버전(version) 2 내지 6의 VL 및 VH 도메인을 포유동물 세포 발현에 대해 이전에 기재된 pRK 벡터내로 서브클로닝함으로써 작성되었다[고만(Gorman) 등의 문헌 "DNA Prot . Eng . Tech., 2:3-10 (1990)"]. 오크렐리추맵은 본원에서 인간화된 2H7 항체의 한 예이다.
"폴리머라아제(polymerase) 연쇄 반응" 또는 "PCR"의 기술은 본원에 사용될 경우 일반적으로 1987년 7월 28일자로 허여된 미국 특허 제4,683,195호에 기재된 바와 같이 핵산, RNA 및/또는 DNA의 소량의 특정 조각이 증폭되는 절차를 지칭한다. 일반적으로, 흥미로운 영역의 말단 또는 그 이상의 서열 정보는 올리고뉴클레오티드 프라이머가 고안되도록 이용될 필요가 있고; 이들 프라이머는 증폭되는 주형의 반대 가닥과 서열면에서 동일하거나 유사할 것이다. 2개의 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드는 증폭된 물질의 말단과 일치할 수 있다. PCR은 총 게놈 DNA, 및 총 세포 RNA로부터 전사된 cDNA, 박테라오파지 또는 플라스미드 서열 등으로부터 특정 RNA 서열, 및 특정 DNA 서열을 증폭하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로 물리스(Mullis) 등의 문헌 "Cold Spring Harbor Symp . Quant . Biol., 51 : 263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989)"을 참조한다. 본원에 사용될 경우, PCR은 핵산 시험 샘플을 증폭시키기 위한 핵산 폴리머라아제 반응 방법의 일예일 뿐만 아니라, 공지된 핵산(DNA 또는 RNA)의 프라이머로서의 용도를 포함하고, 핵산 폴리머라아제를 이용하여 핵산의 특정 조각을 증폭 또는 생성하거나, 또는 특정 핵산에 상보적인 핵산의 특정 조각을 증폭 또는 생성하는 것으로 고려된다.
"정량적 실시간 폴리머라아제 연쇄 반응" 또는 "qRT-PCR(quantitive Real Time PCR)"은 PCR의 형태를 지칭하는데, 여기서 PCR 생성물의 양은 PCR 반응에서 각 단계에 측정된다. 이러한 기법은 크로닌(Cronin) 등의 문헌 "Am . J. Pathol. 164(1):35-42 (2004)]; 및 마(Ma) 등의 문헌 "Cancer Cell 5:607-616 (2004)"을 비롯한 다양한 문헌에 기재되어 있다.
용어 "마이크로어레이(microarray)"는 기판 상에서 하이브리드화 어레이 요소, 바람직하게는 폴리뉴클레오티드 탐침자의 정돈된 배열을 지칭한다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 단수 또는 복수로 사용될 경우, 일반적으로 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 지칭한다. 이와 같이, 예를 들면, 본원에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는, 제한없이, 단일- 및 2중-가닥 DNA, 단일- 및 2중-가닥 영역을 포함하는 DNA, 단일- 및 2중-가닥 RNA, 및 단일- 및 2중-가닥 영역을 포함하는 RNA, 단일-가닥, 더 전형적으로는 2중-가닥이거나 단일- 및 2중-가닥 영역을 포함하는 RNA 및 DNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함한다. 게다가, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 본원에 사용될 경우 RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 둘다를 포함하는 3중-가닥 영역을 지칭한다. 이러한 영역중의 가닥은 동일한 분자로부터 또는 상이한 분자로부터일 수 있다. 이 영역은 하나 이상의 분자 모두를 포함할 수 있지만, 전형적으로 분자의 일부 영역만을 포함한다. 3중-나선 영역의 분자중 하나는 종종 올리고뉴클레오티드이다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 특별히 cDNA를 포함한다. 이 용어는 하나 이상의 변형된 염기를 함유하는 RNA 및 DNA(cDNA를 포함함)를 포함한다. 이와 같이, 안정성을 위해 또는 다른 이유로 변형된 주쇄를 갖는 DNA 또는 RNA는 이 용어가 본원에서 의도된 바와 같은 "폴리뉴클레오티드"이다. 더욱이, 비통상적 염기, 예컨대 이노신, 또는 변형된 염기, 예컨대 3중 수소화된 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA는 본원에 정의된 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오티드"내에 포함된다. 전반적으로, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 변형되지 않은 폴리뉴클레오티드의 모든 화학적으로, 효소적으로, 및/또는 대사적으로 변형된 형태, 뿐만 아니라 단일 세포 및 복합 세포를 비롯한 세포 및 바이러스의 DNA 및 RNA 특징의 화학적 형태를 내포한다.
용어 "올리고뉴클레오티드"는 비교적 짧은 폴리뉴클레오티드를 지칭하고, 제한없이, 단일-가닥 데옥시리보뉴클레오티드, 단일- 또는 2중-가닥 리보뉴클레오티드, RNA:DNA 하이브리드 및 2중-가닥 DNA가 포함된다. 올리고뉴클레오티드, 예컨대 단일-가닥 DNA 탐침자 올리고뉴클레오티드는, 종종 화학적 방법에 의해, 예를 들면 시판되는 자동화된 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 합성된다. 그러나, 올리고뉴클레오티드는 시험관내 재조합 DNA-중재된 기법을 비롯한 다양한 다른 방법에 의해서, 및 세포와 유기체에서 DNA를 발현시킴으로써 제조될 수 있다.
하이브리드화 반응의 "엄격성(stringency)"은 당분야의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 일반적으로 탐침자 길이, 세척 온도, 및 염 농도에 따른 실험적 계산이다. 전반적으로, 더 긴 탐침자는 적절한 어닐링(annealing)을 위해 더 높은 온도를 필요로 하는 반면, 더 짧은 탐침자는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 하이브리드화는 일반적으로 상보성 가닥이 이의 용융 온도 미만의 환경에 존재할 경우 변성된 DNA를 재어닐링할 수 있는 능력에 좌우된다. 탐침자와 하이브리드성 서열 사이의 원하는 상동성의 정도가 높을 수록, 사용될 수 있는 상대 온도는 더 높다. 결과로서, 더 높은 상대 온도는 반응 조건을 더 엄격하게 만드는 반면, 더 낮은 온도는 덜 엄격하게 만든다. 하이브리드화 반응의 엄격성에 대한 추가의 세부사항 및 설명을 위해, 아수벨(Ausubel) 등의 문헌 "Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)"을 참조한다.
본원에 정의된 바와 같은 "엄격한 조건" 또는 "고도의 엄격한 조건"은, 전형적으로: (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도 및 높은 온도를 사용하고, 예를 들면 0.015 M 염화 나트륨/0.0015 M 시트르산 나트륨/0.1% 도데실 황산 나트륨을 50℃에서 사용하거나; (2) 하이브리드화 동안 변성화제, 예컨대 포름아미드, 예를 들면, 50%(v/v) 포름아미드를 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜(Ficoll)/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충액과 함께 750 mM 염화 나트륨, 75 mM 시트르산 나트륨에 의해 pH 6.5에서 42℃에서 사용하거나; 또는 (3) 50% 포름아미드, 5×SSC(0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산 나트륨), 50 mM 인산나트륨(pH 6.8), 0.1% 피로인산 나트륨, 5×덴하르트(Denhardt)의 용액, 초음파처리된 연어 정액 DNA(50 &gr;g/㎖), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 황산을 42℃에서 0.2×SSC(염화 나트륨/시트르산 나트륨)에서 및 55℃에서 50% 포름아미드에서 세척하면서 42℃에서 사용하고, 이후 55℃에서 EDTA를 함유하는 0.1×SSC로 구성된 매우 엄격한 세척액으로 세척한다.
"적당히 엄격한 조건"은 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌 "Molecular Cloning : A Laboratory Manual , New York: Cold Spring Harbor Press, 1989"에 기재된 바와 같이 식별될 수 있고, 상기 기재된 것에 비해 덜 엄격한 세척 용액 및 하이브리드화 조건(예를 들어, 온도, 이온 강도 및 % SDS)의 사용을 포함한다. 적당히 엄격한 조건이 일예는, 하룻밤 37℃에서 20% 포름아미드, 5×SSC(150 mM NaCl, 15 mM 트리시트르산 나트륨), 50 mM 인산나트륨(pH 7.6), 5×덴하르트의 용액, 10% 덱스트란 황산, 및 20 ㎎/㎖의 변성된 전단된 연어 정액 DNA를 포함하는 용액중에서 항온처리하고; 이후, 1×SSC에서 여액을 약 37 내지 50℃에서 세척하는 것이다. 숙련가는 인자들, 예컨대 탐침자 길이 등을 수용하기에 필요한 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 인식할 것이다.
"화학치료제"는 암의 치료에 유용한 화학 화합물이다. 화학치료제의 예로는 알킬화제, 예컨대 티오테파(thiotepa) 및 사이클로포스파미드[사이톡산(CYTOXAN: 등록상표)]; 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판(busulfan), 임프로설판(improsulfan) 및 피포설판(piposulfan); 아지리딘(aziridine), 예컨대 벤조도파(benzodopa), 카보쿠온(caboquone), 메투레도파(meturedopa), 및 우레도파(uredopa); 에틸렌이민 및 메틸아멜아민(methylamelamine), 예로서 알트레타민(altretamine), 트리에틸렌멜라민(trietylenemelamine), 트리에틸렌포스포르아미드(trietylenephosphoramide), 트리에틸렌티오포스포르아미드(triethiylenethiophosphoramide) 및 트리메틸올로멜라민(trimethylolomelamine); 아세토게닌스(acetogenins)[특히 불라타신(bullatacin) 및 불라타시논(bullatacinone)]; 델타-9-테트라하이드로카나비놀(tetrahydrocannabinol)[드로나비놀(dronabinol), 마리놀(MARINOL: 등록상표)]; 베타-라파콘(beta-lapachone); 라파콜(lapachol); 콜키신스(colchicines); 베툴린산(betulinic acid); 캄토테신(camptothecin)(합성 유사체 토포테칸(topotecan)[하이캄틴(HYCAMTIN: 등록상표)], CPT-11[이리노테칸(irinotecan), 캄토사르(CAMPTOSAR: 등록상표)], 아세틸캄토테신, 스코폴렉틴(scopolectin), 및 9-아미노캄토테신(aminocamptothecin)); 브리오스타틴(bryostatin); 칼리스타틴(callystatin); CC-1065[이의 아도젤레신(adozelesin), 카르젤레신(carzelesin) 및 비젤레신(bizelesin) 합성 유사체 포함]; 포도필로톡신(podophyllotoxin); 포도필린산(podophyllinic acid); 테니포시드(teniposide); 크립토피신(cryptophycin)(구체적으로 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴(dolastatin); 듀오카마이신(duocarmycin)(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘로이테로빈(eleutherobin); 판크라티스타틴(pancratistatin); 사코딕타인(sarcodictyin); 스폰기스타틴(spongistatin); 질소 머스터드(nitrogen mustard), 예컨대 클로람부실(chlorambucil), 클로나파진(chlornaphazine), 콜로로포스파미드(cholophosphamide), 에스트라무스틴(estramustine), 이포스파미드(ifosfamide), 메클로르에타민(mechlorethamine), 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드(mechlorethamme oxide hydrochloride), 멜팔란(melphalan), 노벰비킨(novembichin), 페네스테린(phenesterine), 프레드니무스틴(prednimustine), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라실 머스타드; 니트로스우레아(nitrosurea), 예컨대 카무스틴(carmustine), 클로로조토신(chlorozotocin), 포테무스틴(fotemustine), 로무스틴(lomustine), 니무스틴(nimustine), 및 라니무스틴(ranimnustine); 항생제, 예컨대 에네딘(enediyne) 항생제[예를 들어, 칼케아미신(calicheamicin), 특별히 칼케아미신 감마 1I 및 칼케아미신 오메가 I1, 예를 들어, 니콜라우(Nicolaou) 등의 문헌 "Angew . Chem Intl . Ed . Engl., 33: 183-186 (1994))" 참조]; CDP323, 경구 알파-4 인테그린(integrin) 억제제; 다이네미신(dynemicin), 예로서 다이네미신 A; 에스페라미신(esperamicin); 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin) 발색단 및 관련된 색소단백질 에네디인(enediyne) 항생성 발색단, 아클라시노마이신(aclacinomysin), 악티노마이신(actinomycin), 어쓰라마이신(authramycin), 아자세린(azaserine), 블레오마이신(bleomycin), 칵티노마이신(cactinomycin), 카라비신(carabicin), 카르미노마이신(carminomycin), 카르지노필린(carzinophilin), 크로모마이시니스(chromomycinis), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 데토루비신(detorubicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르로이신, 독소루비신(doxorubicin)[예로서 아드리마이신(ADRIAMYCIN: 등록상표), 모폴리노-독소루비신, 시아노모폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포솜 주입물(독실(DOXIL: 등록상표)), 리포솜성 독소루비신 TLC D-99(마이오세트(MYOCET: 등록상표)), 페길화된 리포솜성 독소루비신(카엘릭스(CAELYX: 등록상표)), 및 데옥시옥소루비신], 에피루비신(epirubicin), 에소루비신(esorubicin), 이다루비신(idarubicin), 마르셀로마이신(marcellomycin), 미토마이신(mitomycin), 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산(mycophenolic acid), 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycin), 페플로마이신(peplomycin), 포트피로마이신(potfiromycin), 퓨로마이신(puromycin), 쿠엘라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린(streptonigrin), 스트렙토조신(streptozocin), 투베르시딘(tubercidin), 우베니멕스(ubenimex), 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin); 대사길항물질, 예컨대 메토트렉세이트(methotrexate), 겜시타빈(gemcitabine)[겜자르(GEMZAR: 등록상표)], 테가푸르(tegafur)[우프토랄(UFTORAL: 등록상표)], 캅테시타빈(capecitabine)[젤로다(XELODA: 등록상표)], 에포틸론(epothilone), 및 5-플루오로우라실(5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데노프테린(denopterin), 메토트렉세이트(methotrexate), 프테로프테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(trimetrexate); 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린(thiamiprine), 티오구아닌(thioguanine); 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈(ancitabine), 아자시티딘(azacitidine), 6-아자우리딘(azauridine), 카모푸르(carmofur), 사이타라빈(cytarabine), 디데옥시우리딘(dideoxyuridine), 독시플루리딘(doxifluridine), 에노시타빈(enocitabine), 플록수리딘(floxuridine); 항-아드레날린제, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토테인(mitotane), 트릴로스테인(trilostane); 폴산 보충제, 예컨대 프롤린산(frolinic acid); 아세글라톤(aceglatone); 알도포스파미드 글리코시드(aldophosphamide glycoside); 아미노레불린산(aminolevulinic acid); 에닐우라실(eniluracil); 암사크린(amsacrine); 베스트라부실(bestrabucil); 비산트렌(bisantrene); 에다트렉세이트(edatraxate); 데포파민(defofamine); 데메콜신(demecolcine); 디아지쿠온(diaziquone); 엘포르니틴(elfornithine); 엘리프티늄(elliptinium) 아세테이트; 에토글루시드(etoglucid); 질산 갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난(lentinan); 로니다이닌(lonidainine); 마이탄시노이드(maytansinoid), 예컨대 마이탄신(maytansine) 및 안사미토신(ansamitocin); 미토구아존(mitoguazone); 미토잔트론(mitoxantrone); 모피단몰(mopidanmol); 니트라에린(nitraerine); 펜토스타틴(pentostatin); 페나메트(phenamet); 피라루비신(pirarubicin); 로소잔트론(losoxantrone); 2-에틸하이드라지드; 프로카바진(procarbazine); PSK(등록상표) 다당류 착체[제이에이치에스 내츄럴 프로덕츠(JHS Natural Products), 오레곤주 유겐 소재]; 라족산(razoxane); 리족신(rhizoxin); 시조피란(sizofiran); 스피로게르마늄; 테뉴아존산(tenuazonic acid); 트라이지쿠온(triaziquone); 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(trichothecene)[특히 T-2 톡신, 베라쿠린(verracurin) A, 로리딘(roridin) A 및 안구이딘(anguidine)]; 우레탄; 다카바진(dacarbazine); 만노무스틴(mannomustine); 미토브로니톨(mitobronitol); 미토락톨(mitolactol); 피포브로만(pipobroman); 가사이토신(gacytosine); 아라비노시드("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드(taxoid), 예를 들어, 파클리탁셀(paclitaxel)[탁솔(TAXOL: 등록상표)], 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제형[아브락산(ABRAXANE: 상표)], 및 도세탁셀(docetaxel)[탁소테레(TAXOTERE: 등록상표)]; 클로란부실(chloranbucil); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 제제, 예컨대 시스플라틴(cisplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 및 카보플라틴(carboplatin); 빈카(vinca)(이는 튜불린 중합체가 미세소관을 형성하는 것을 방지함), 예로서 빈블라스틴(vinblastine)[벨반(VELBAN: 등록상표)], 빈크리스틴[온코빈 (ONCOVIN: 등록상표)], 빈데신(vindesine)[엘디신(ELDISINE: 등록상표), 필데신(FILDESIN: 등록상표)], 및 비노렐빈(vinorelbine)[나벨빈(NAVELBINE: 등록상표)]; 에토포시드(etoposide)(VP-16); 이포스파미드(ifosfamide); 미토잔트론(mitoxantrone); 류코보빈(leucovovin); 노반트론(novantrone); 에다트렉세이트(edatrexate); 다우노마이신(daunomycin); 아미노프테린(aminopterin); 이반드로네이트(ibandronate); 토포이소머라아제(topoisomerase) 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸로니틴(DMFO: difluorometlhylornithine); 레티노이드(retinoid), 예컨대 레티노산, 예로서 벡사로텐(bexarotene)[타그레틴(TARGRETIN: 등록상표)]; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트(clodronate)[예를 들면, 보네포스(BONEFOS: 등록상표) 또는 오스택(OSTAC: 등록상표)], 에티드로네이트(etidronate)[디드로칼(DIDROCAL: 등록상표)], NE-58095, 졸레드론산(zoledronic acid)/졸레드로네이트(zoledronate)[조메타(ZOMETA: 등록상표)], 알렌드로네이트(alendronate)[포사맥스(FOSAMAX: 등록상표)], 파미드로네이트(pamidronate)[아레디아(AREDIA: 등록상표)], 틸루드로네이트(tiludronate)[스켈리드(SKELID: 등록상표)], 또는 리세드로네이트(risedronate)[악토넬(ACTONEL: 등록상표)]; 트록사시타빈(troxacitabine)(1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 사이토신 유사체); 안티센스(antisense) 올리고뉴클레오티드, 구체적으로 비정상적 세포 증식에 내포된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드, 예컨대, PKC-알파, Raf, H-Ras, 및 표피 생장 인자 수용체(EGF-R: epidermal growth factor receptor); 백신, 예컨대 테라토프(THERATOPE: 등록상표) 백신 및 유전자 치료법 백신, 예를 들면, 알로벡틴(ALLOVECTIN: 등록상표) 백신, 류벡틴(LEUVECTIN: 등록상표) 백신, 및 백시드(VAXID: 등록상표) 백신; 토포이소머라아제(topoisomerase) 1 억제제[예를 들어, 루토테칸(LURTOTECAN: 등록상표)]; rmRH[예를 들어, 아바렐릭스(ABARELLX: 등록상표)]; BAY439006[소라페닙(sorafenib); 베이어]; SU-11248[화이자(Pfizer)]; 페리포신(perifosine), COX-2 억제제[예를 들어 셀레콕시브(celecoxib) 또는 에토리콕시브(etoricoxib)], 프로테오솜(proteosome) 억제제(예를 들어 PS341); 보르테조밉(bortezomib)[벨케이드(VELCADE: 등록상표)]; CCI-779; 티피파닙(tipifarnib)(R11577); 오라페닙(orafenib), ABT510; Bcl-2 억제제, 예컨대 오블리메센(oblimersen) 나트륨[제나센스(GENASENSE: 등록상표)]; 피잔트론(pixantrone); EGFR 억제제(이하 정의 참조); 티로신 키나아제 억제제(이하 정의 참조); 및 상기 임의의 물질의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 둘 이상의 상기 물질의 조합, 예컨대 CHOP(사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 프레드니솔론의 조합된 치료의 약어), 및 폴폭스(FOLFOX)(5-FU 및 류코보빈(leucovovin)과 조합된 옥살리플라틴[엘록사틴(ELOXATIN: 상표)]에 의한 치료 섭생의 약어)가 포함된다.
본원에서, 화학치료제로는 암의 성장을 촉진시킬 수 있는 호르몬의 영향을 조절하거나, 감소시키거나, 차단하거나, 억제하는 작용을 하는 "항-호르몬제" 또는 "내분비 치료제"가 포함된다. 이들은 그 자체로 호르몬일 수 있고, 예로서 제한되지 않지만: 혼합된 작용물질/길항물질 프로필을 갖는 항에스트로겐제, 예로서 타목시펜(tamoxifen)[놀바덱스(NOLVADEX: 등록상표)], 4-하이드록시타목시펜(hydroxytamoxifen), 토레미펜(toremifene)[파레스톤(FARESTON: 등록상표)], 이독시펜(idoxifene), 드롤록시펜(droloxifene), 랄록시펜(raloxifene)[에비스타(EVISTA: 등록상표)], 트리옥시펜(trioxifene), 케옥시펜(keoxifene), 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절자(SERM: selective estrogen receptor modulator), 예컨대 SERM3; 작용물질 특성이 없는 순수 항-에스트로겐, 예컨대 풀베스트란트(fulvestrant)[파슬로덱스(FASLODEX: 등록상표)], 및 EM800(이러한 제제는 에스트로겐 수용체(ER: estrogen receptor) 이량체화를 차단하고, DNA 결합을 억제하고, ER 교체를 증가시키고/시키거나 ER 수준을 저해함); 방향화효소 억제제, 예로서 스테로이드성 방향화효소 억제제, 예컨대 포메스테인(formestane) 및 엑세메스테인(exemestane)[아로마신(AROMASIN: 등록상표)], 및 비스테로이드성 방향화효소 억제제, 예컨대 아나스트라졸(anastrazole)[아리미덱스(ARIMIDEX: 등록상표)], 레트로졸(letrozole)[페마라(FEMARA: 등록상표)] 및 아미노글루테티미드(aminoglutethimide)가 포함되고, 다른 방향화효소 억제제는 보로졸(vorozole)[리비소르(RIVISOR: 등록상표)], 메게스트롤(megestrol) 아세테이트[메가세(MEGASE: 등록상표)], 파드로졸(fadrozole), 및 4(5)-이미다졸; 루테닌화 호르몬-방출 호르몬 작용제, 예로서 류프롤리드(leuprolide)[루프론(LUPRON: 등록상표) 및 엘리가드(ELIGARD: 등록상표)], 고세렐린(goserelin), 부세렐린(buserelin), 및 트립테렐린(tripterelin); 성 스테로이드, 예로서 프로게스틴(progestine), 예컨대 메게스트롤(megestrol) 아세테이트 및 메드록시프로게스테론(medroxyprogesterone) 아세테이트, 에스트로겐, 예컨대 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol) 및 프레마린(premarin), 및 안드로겐/레티노이드(retinoid), 예컨대 플루옥시메스테론(fluoxymesterone), 모든 트랜스레티노산 및 펜레티니드(fenretinide); 오나프리스톤(onapristone); 항-프로게스테론제; 에스트로겐 수용체 하향-조절제(ERD: estrogen receptor down-regulator); 항-안드로겐제, 예컨대 플루타미드(flutamide), 닐루타미드(nilutamide) 및 비칼루타미드(bicalutamide); 및 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 상기 임의의 유도체; 뿐만 아니라 상기 물질의 둘 이상의 조합을 포함한다.
본원에서 화학치료제 또는 화학치료법 섭생의 특정 예로는: 알킬화제(예를 들어 클로람부실, 벤다무스틴, 또는 사이클로포스파미드); 뉴클레오시드 유사체 또는 대사길항물질(예를 들어 플루다라빈), 플루다라빈 및 사이클로포스파미드(FC); 프레드니손 또는 프레드니솔론; 알킬레이터-포함 조합 치료법, 예로서 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니솔론(CHOP), 또는 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니솔론(CVP) 등이 포함된다.
"표적 청중"은 마케팅 또는 광고에 의해서와 같이, 특별히 특정 용도, 치료 또는 지시를 위해, 특정 약제를 홍보하거나 홍보하려고 하는 사람들의 모임 또는 기관으로서, 예컨대 개별 환자, 환자 모집단, 신문, 의학 문헌 및 잡지 구독자, 텔레비전 또는 인터넷 시청자, 라디오 또는 인터넷 청취자, 의료진, 제약회사 등이다.
"포장 삽입물"은, 포장된 제품과 조합되는 지시사항, 용법, 투여량, 투여법, 사용금지사유, 기타 치료 제품에 관한 정보, 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 관한 경고문 등을 포함하는, 치료 제품의 상업적 포장물에 관례상 포함되는 설명서를 지칭한다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 광범위한 범위로 사용되고 다양한 항체 구조물을 내포하고, 제한되지 않지만, 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 단일클론성 항체, 다중클론성 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편이 포함된다.
"항체 단편"은 손상되지 않은 항체가 결합하는 항원에 결합하는 손상되지 않은 항체의 일부를 포함하는 손상되지 않은 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예로는, 제한되지 않지만, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디(diabody); 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자(예를 들어 scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다.
"친화도 성숙된" 항체는, 변형을 갖지 않는 모 항체에 비해 하나 이상의 과가변성 영역(HVR: hypervariable region)에서 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는 하나 이상의 변형을 갖는 항체를 지칭한다.
기준 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 검정에서 기준 항체의 그의 항원으로의 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 지칭하고, 역으로 기준 항체는 경쟁 검정에서 항체의 그의 항원으로의 결합을 50% 이상 차단한다. 예시적인 경쟁 검정은 본원에 제공된다. 한 실시태양에서, 항체는 리툭시맵, 오파투뮤맵, GA101, SBI-087, 벨투추맵, 또는 AME-133과 동일한 에피토프에 결합한다.
용어 "키메라성" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 근원 또는 종으로부터 유도되는 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분이 상이한 근원 또는 종으로부터 유도되는 항체를 지칭한다.
항체의 "부류"는 그의 중쇄에 의해 소유되는 불변성 도메인 또는 불변성 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5가지 주요 부류인 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하고, 이들중 몇몇은 추가로 하위부류(이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2으로 나눠진다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변성 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ으로 지칭된다.
용어 "세포독성제"는 본원에 사용될 경우 세포 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 일으키는 물질을 지칭한다. 세포독성제로는, 제한되지 않지만, 방사성 동위원소(예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학치료제 또는 약물(예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리미신, 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입 제제); 성장 억제제; 효소 및 이의 단편, 예컨대 핵용해(nucleolytic) 효소; 항생제; 독소, 예컨대 소분자 독소, 또는 박테리아, 균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소(이의 단편 및/또한 변형물 포함); 및 이후 기재되는 다양한 항종양제 또는 항암제가 포함된다.
"효과자 기능"은 항체 이소형에 따라 상이한, 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물 활성을 지칭한다. 항체 효과자 기능의 예로는: Clq 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체(예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화가 포함된다.
용어 "Fc 영역"은 본원에서 불변성 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 규정하기 위해 사용된다. 이 용어는 고유의 서열 Fc 영역 및 변형 Fc 영역을 포함한다. 한 실시태양에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복실-말단으로 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 라이신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 특정화되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변성 영역중 아미노산 잔기의 번호매김은 카밧 등의 문헌 "Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991"에 기재된 바와 같이, EU 색인으로 불리는 EU 번호매김 체제에 따른다.
"골격구조" 또는 "FR"은 과가변성 영역(HVR) 잔기 이외의 가변성 도메인 잔기를 지칭한다. 가변성 도메인의 FR은 일반적으로 다음의 4가지 FR 도메인을 포함한다: FR1, FR2, FR3, 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 하기 서열의 VH(또는 VL)에서 보여진다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "손상되지 않은 항체", 및 "전체 항체"는 본원에서 상호교환적으로 고유의 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체 또는 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 사용된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나, 인간 항체 레파토리(repertoiry) 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 이용하는 인간 이외의 근원으로부터 유도된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 소유하는 항체이다. 인간 항체에 대한 이러한 정의는 인간 이외의 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 특별히 배제한다.
"인간화된" 항체는 인간 이외의 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라성 항체를 지칭한다. 특정 실시태양에서, 인간화된 항체는 실질적으로 모든 적어도 하나의, 전형적으로 2개의 가변성 도메인을 포함하고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR(예를 들어, CDR)은 인간 이외의 항체의 HVR에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 FR에 상응한다. 인간화된 항체는 임의적으로 인간 항체로부터 유도된 항체 불변성 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체의 "인간화된 형태", 예를 들어, 인간 이외의 항체는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다.
용어 "과가변성 영역" 또는 "HVR"은 본원에 사용될 경우, 서열이 과가변성이고/이거나 구조적으로 한정된 루프(loop)("과가변성 루프")를 형성하는 항체 가변성 도메인의 각각의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 고유의 4개-쇄 항체는 6개의 HVR을 포함한다; VH에 3개(H1, H2, H3), VL에 3개(L1, L2, L3). HVR은 일반적으로 과가변성 루프로부터 및/또는 "상보성 결정 영역"(CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하고, 후자는 가장 높은 서열 가변성이고/이거나 항원 인식에 연관된다. 예시적인 과가변성 루프는 아미노산 잔기 26 내지 32(L1), 50 내지 52(L2), 91 내지 96(L3), 26 내지 32(H1), 53 내지 55(H2), 및 96 내지 101(H3)에서 초래된다[코티아(Chothia) 및 레스크(Lesk)의 문헌 "J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987)"]. 예시적인 CDR(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 24 내지 34, L2의 50 내지 56, L3의 89 내지 97, H1의 31 내지 35B, H2의 50 내지 65, 및 H3의 95 내지 102에서 초래된다(카밧 등의 문헌 "Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)"]. VH에서의 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 과가변성 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원에 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR(specificity determining residue)"을 포함한다. SDR은 약자화된-CDR, 또는 a-CDR로 불리는 CDR의 영역내에 포함된다. 예시적인 a-CDR(a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-Hl, a-CDR-H2, 및 a-CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 31 내지 34, L2의 50 내지 55, L3의 89 내지 96, H1의 31 내지 35B, H2의 50 내지 58, 및 H3의 95 내지 102에서 초래된다[알마그로(Almagro) 및 프란손(Fransson)의 문헌 "Front . Biosci . 13:1619-1633 (2008)" 참조]. 달리 지시되지 않는 한, 가변성 도메인중 HVR 잔기 및 기타 잔기(예를 들어, FR 잔기)는 본원에서 상기 카밧 등의 문헌에 따라 번호매김된다. 한 실시태양에서, CD20 항체는 본원에서 리툭시맵, 오파투뮤맵, GA101, SBI-087, 벨투추맵, 또는 AME-133의 HVR을 포함한다.
"면역컨주게이트(immunoconjugate)"는 하나 이상의 이종성 분자, 예로서 제한되지 않지만, 세포독성제에 컨주게이트되는 항체이다.
용어 "단일클론성 항체"는 본원에 사용될 경우 실질적으로 동종성인 항체의 모집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 모집단을 구성하는 개별 항체는 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합하지만, 예를 들어, 자연 발생 돌연변이를 함유하거나 단일클론성 항체 제제의 생산 동안 야기된 가능한 변형 항체는 제외하고, 이러한 변형체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 전형적으로 상이한 결정자(에피토프)에 대해 유도되는 상이한 항체를 포함하는 다중클론성 항체 제제와 대조적으로, 단일클론성 항체 제제의 각각의 단일클론성 항체는 항원 상의 단일한 결정자에 대해 유도된다. 이와 같이, 한정어 "단일클론성"은, 항체의 실질적으로 동종성인 모집단으로부터 수득된 항체의 특성을 지시하고, 이는 임의의 특정 방법에 의해 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론성 항체는 다양한 기법에 의해 제조될 수 있고, 제한되지 않지만, 하이브리도마(hybridoma) 방법, 재조합 DNA 방법, 파아지-표시 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자자리의 전부 또는 일부를 포함하는 형질감염 동물을 이용하는 방법이 포함되고, 이러한 방법 및 단일클론성 항체를 제조하는 다른 예시적인 방법은 본원에 기재되어 있다.
"네이키드(naked) 항체"는 이종성 잔기(예를 들어, 세포독성 잔기) 또는 방사성표지에 컨주게이트되지 않는 항체를 지칭한다. 네이키드 항체는 약학 제제에 존재할 수 있다.
"고유의 항체"는 다양한 구조를 갖는 자연 발생 면역글로불린을 지칭한다. 예를 들면, 고유의 IgG 항체는 디설파이드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된 약 150,000 달톤의 이종성사량체 당단백질이다. N-말단에서 C-말단까지, 각각의 중쇄는 3개의 불변성 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)이 뒤따르는 가변성 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변성 도메인으로도 불리는 가변성 영역(VH)을 갖는다. 유사하게, N-말단에서 C-말단까지, 각각의 경쇄는 불변성 경쇄(CL) 도메인이 뒤따르는 가변성 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변성 도메인으로도 불리는 가변성 영역(VL)을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변성 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2가지 유형중 하나로 할당된다.
용어 "포장 삽입물"은, 지시사항, 용법, 투여량, 투여법, 조합 치료법, 사용금지사유에 관한 정보, 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 관한 경고문 등을 포함하는, 치료 제품의 상업적 포장물에 관례상 포함되는 설명서를 지칭한다.
용어 "약학 제형"은 약제의 생물 활성이 효과적이도록 허용하는 형태로 존재하고, 제형이 투여될 피험체에 허용가능하지 않게 독성인 추가의 성분을 포함하지 않는 멸균 제제를 지칭한다.
"멸균" 제형은 무균성이거나 모든 살아있는 미생물 및 이들의 포자가 존재하지 않는다.
"키트"는 적어도 하나의 시약, 예를 들어, CLL 치료를 위한 약제, 또는 본 발명의 생체지표 유전자 또는 단백질을 특이적으로 검출하는 탐침자를 포함하는 임의의 제조품(예를 들어 포장물 또는 용기)이다. 제조품은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 유닛(unit)으로서 홍보되거나, 분배되거나, 시판되는 것이 바람직하다.
"약학적으로 허용가능한 담체"는 피험체에게 무독성인, 활성 구성성분 이외의 약학 제형중의 구성성분을 지칭한다. 약학적으로 허용가능한 담체로는, 제한되지 않지만, 완충제, 부형제, 안정화제, 또는 보존제가 포함된다.
II . CLL 약제
한 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 하나 이상의 생체지표의 발현에 기초하여 CLL 약제로 치료될 수 있는 환자를 선택함에 관한 것이다. CLL 약제의 예로는, 제한되지 않지만, 하기 약제가 포함된다:
- 상기 주지된 화학치료제 및 화학치료 섭생, 예로서, 특히, 알킬화제(예를 들어 클로람부실, 벤다무스틴, 또는 사이클로포스파미드); 뉴클레오시드 유사체 또는 대사길항물질(예를 들어 플루다라빈), 플루다라빈 및 사이클로포스파미드(FC); 프레드니손 또는 프레드니솔론; 알킬레이트-함유 조합 치료법, 예로서 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니솔론(CHOP), 또는 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니솔론(CVP) 등.
- B 세포 길항물질, 예컨대 CD20 항체(예를 들어 리툭시맵, 오파투뮤맵, GA101, SBI-087, 벨투추맵, 및 AME-133 등), CD22 항체 또는 CD79b 항체;
- 정맥내 면역글로불린;
- CD52 항체(예를 들어 알렘투추맵); 및
- CLL 치료를 위해 개발중인, 또는 승인된 기타 약제 또는 이의 조합.
한 실시태양에서, CLL 약제는 FAK 신호전달 및/또는 동형 응집을 유도하는 약제이다. CLL 약제는 임의적으로 다음으로부터 선택된다: B-세포 길항물질, B-세포 항체, CD20 항체, 제I 유형의 CD20 항체, 제II 유형의 CD20 항체, CD22 항체, CD79b 항체 등.
한 실시태양에서(여기서 생체지표 발현 수준은 중앙값 미만임), CLL 약제는 리툭시맵 이외의 것이다.
한 실시태양에서, 약제는, 예를 들어 CD20에 대해 유도되거나 이에 결합되는 항체이다. 항체는 본원에서 단일클론성 항체, 예로서 키메라성 항체, 인간화된 항체 또는 인간 항체를 포함한다. 한 실시태양에서, 항체는 항체 단편, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디, 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시태양에서, 항체는 전장 항체, 예를 들어, 손상되지 않은 IgG1 항체 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 이소형이다.
한 실시태양에서, 항체, 예를 들어 본원의 방법에서 사용된 항체는 하기 1 내지 6 단원에 기재된 바와 같은 임의의 특징을 단독으로 또는 조합하여 혼입할 수 있다:
1. 항체 단편
특정 실시태양에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편으로는, 제한되지 않지만, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 및 scFv 단편, 및 이후 기재된 기타 단편이 포함된다. 특정 항체 단편에 대한 검토를 위해, 허드슨(Hudson) 등의 문헌 "Nat . Med . 9: 129-134 (2003)"을 참조한다. scFv 단편에 대한 검토를 위해, 예를 들어, 플룩툰(Pluckthun)의 문헌 "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)"을 참조하고; 또한 국제 특허출원 공개공보 제WO 93/16185호; 및 미국 특허 제5,571,894호 및 제5,587,458호를 참조한다. 인양(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 논의를 위해, 미국 특허 제5,869,046호를 참조한다.
디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들면, EP 제404,097호; 국제 특허출원 공개공보 제WO 1993/01161호; 허드슨 등의 문헌 "Nat . Med. 9: 129-134 (2003)"; 및 홀린거(Hollinger) 등의 문헌 "Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 6444-6448 (1993)"을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 허드슨 등의 문헌 "Nat . Med . 9: 129-134 (2003)"에 기재되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변성 도메인의 전체 또는 일부, 또는 경쇄 가변성 도메인의 전체 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시태양에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다[도만티스 인코포레이티드(Domantis, Inc.), 매사추세츠주 왈탐 소재; 예를 들어, 미국 특허 제6,248,516 B1호 참조].
항체 단편은 다양한 기법, 예로서 제한되지 않지만 손상되지 않은 항체의 단백질분해적 소화, 뿐만 아니라 본원에 기재된 바와 같은 재조합 숙주 세포(예를 들어 이. 콜라이(E. coli) 또는 파아지)에 의한 생산에 의해 제조될 수 있다.
2. 키메라성 항체 및 인간화된 항체
특정 실시태양에서, 본원에 제공된 항체는 키메라성 항체이다. 특정 키메라성 항체는, 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호; 및 모리슨(Morrison) 등의 문헌 "Proc. Natl . Acad . Sci . USA , 81 :6851-6855 (1984)"에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라성 항체는 인간 이외의 가변성 영역(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 래빗, 또는 인간 이외의 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유도된 가변성 영역) 및 인간 불변성 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라성 항체는 강(class) 또는 아강이 모 항체의 강 또는 아강에서 변경된 "강 스위칭된(class switched)" 항체이다. 키메라성 항체는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시태양에서, 키메라성 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 인간 이외의 항체는 인간에 대한 면역원성을 감소시키도록 인간화되는 반면, 인간 이외의 모 항체의 특이성 및 친화도는 보유한다. 일반적으로, 인간화된 항체는 하나 이상의 가변성 도메인을 포함하고, 여기서 HVR, 예를 들어, CDR(또는 이의 일부)는 인간 이외의 항체로부터 유도되고, FR(또는 이의 일부)는 인간 항체 서열로부터 유도된다. 인간화된 항체는 임의적으로 인간 불변성 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 몇몇 실시태양에서, 인간화된 항체에서 몇몇 FR 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화도를 복원하거나 개선시키기 위해, 인간 이외의 항체(예를 들어, HVR 잔기가 유도되어진 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화된 항체 및 이의 제조 방법은, 예를 들어, 알마그로(Almagro) 및 프란손(Fransson) 등의 문헌 "Front . Biosci . 13: 1619-1633 (2008)"에 검토되어 있고, 추가로, 예를 들어, 리에치만(Riechmann) 등의 문헌 "Nature 332:323-329 (1988)"; 퀸(Queen) 등의 문헌 "Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 86: 10029-10033 (1989)"; 미국 특허 제5,821,337호, 제7,527,791호, 제6,982,321호, 및 제7,087,409호; 카쉬미리(Kashmiri) 등의 문헌 "Methods 36:25-34 (2005)"(SDR(a-CDR) 그래프팅에 대해 기재); 파들란(Padlan)의 문헌 "Mol . Immunol. 28:489-498 (1991)"("재보수(resurfacing)"에 대해 기재); 달'아쿠아(Dall'Acqua) 등의 문헌 "Methods 36:43-60 (2005)"("FR 셔플링(shuffling)"에 대해 기재); 및 오스바우른(Osbourn) 등의 문헌 "Methods 36:61-68 (2005)" 및 클림카(Klimka) 등의 문헌 "Br . J. Cancer, 83:252-260 (2000)"(FR 셔플링에 대한 "안내된 선택" 접근에 대해 기재)에 기재되어 있다.
인간화를 위해 사용될 수 있는 인간 골격구조 영역으로는 제한되지 않지만: "최적-정합(best-fit)" 방법을 사용하여 선택된 골격구조 영역[예를 들어, 심스(Sims) 등의 문헌 "J. Immunol . 151:2296 (1993)" 참조]; 경쇄 또는 중쇄 가변성 영역의 특정 하위군의 인간 항체의 컨센서스(consensus) 서열로부터 유도된 골격구조 영역[예를 들어, 카터(Carter) 등의 문헌 "Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 89:4285 (1992)"; 및 프레스타(Presta) 등의 문헌 "J. Immunol , 151 :2623 (1993)" 참조]; 인간 성숙(체세포적으로 성숙된) 골격구조 영역 또는 인간 생식계열 골격구조 영역[예를 들어, 알마그로 및 프란손의 문헌 "Front . Biosci. 13: 1619-1633 (2008) 참조"]; 및 스크리닝 FR 라이브러리로부터 유도된 골격구조 영역[예를 들어, 바카(Baca) 등의 문헌 "J. Biol . Chem . 272: 10678-10684 (1997)" 및 로속(Rosok) 등의 문헌 "J. Biol . Chem . 271 :22611-22618 (1996)" 참조]이 포함된다.
리툭시맵은 CD20에 결합하는 키메라성 항체의 일예이다. CD20에 결합하는 인간화된 항체의 예로는 GA101, SBI-087, AME-133 및 벨투추맵이 포함된다.
3. 인간 항체
특정 실시태양에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당분야에 공지된 다양한 기법을 사용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 반 디지크(van Dijk) 및 반 데 윈켈(van de Winkel)의 문헌 "Curr . Opin . Pharmacol . 5: 368-74 (2001)" 및 론베르그(Lonberg)의 문헌 "Curr . Opin . Immunol. 20:450-459 (2008)"에 기재되어 있다.
인간 항체는 손상되지 않은 인간 항체, 또는 항원 챌린지(challenge)에 대한 반응으로 인간 가변성 영역을 갖는 손상되지 않은 항체를 생산하도록 변형된 형질감염 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내생성 면역글로불린 유전자자리를 대체하거나, 염색체밖에 존재하거나 동물의 염색체내로 무작위로 조립된 인간 면역글로불린 유전자자리의 전부 또는 일부를 포함한다. 이러한 형질감염 마우스에서, 내생성 면역글로불린 유전자자리는 일반적으로 비활성화되었다. 형질감염 동물로부터 인간 항체를 수득하기 위한 방법을 검토하기 위해, 론버그의 문헌 "Nat . Biotech . 23: 1117-1125 (2005)"을 참조한다. 또한, 예를 들어, 제노마우스(XENOMOUSE: 상표) 기술을 기재하는 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호; 후맵(HUMAB: 등록상표) 기술을 기재하는 미국 특허 제5,770,429호; 케이-엠 마우스(K-M MOUSE: 등록상표) 기술을 기재하는 미국 특허 제7,041,870호, 및 벨로시마우스(VELOCIMOUSE: 등록상표) 기술을 기재하는 미국 특허출원 공개공보 US 제2007/0061900호를 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 손상되지 않은 항체로부터의 인간 가변성 영역은, 예를 들어, 상이한 인간 불변성 영역과 조합함으로써 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마에 기초한 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 단일클론성 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다[예를 들어, 코즈보(Kozbor)의 문헌 "J. Immunol, 133: 3001 (1984)"; 브로더(Brodeur) 등의 문헌 "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)"; 및 뵈르너(Boerner) 등의 문헌 "J. Immunol., 147: 86 (1991)" 참조]. 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체는 또한 리(Li) 등의 문헌 "Proc . Natl . Acad. Sci . USA , 103:3557-3562 (2006)"에 기재되어 있다. 추가의 방법은, 예를 들면, 미국 특허 제7,189,826호(하이브리도마 세포주로부터의 단일클론성 인간 IgM 항체의 생산을 기재함) 및 니(Ni)의 문헌 "Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)"(인간-인간 하이브리도마를 기재함)에 기재된 방법을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술[트리오마(Trioma) 기술]은 또한 볼머스(Vollmers) 및 브란드레인(Brandlein)의 문헌 "Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005)" 및 볼머스 및 브란드레인의 문헌 "Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005)"에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유도된 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된Fv 클론 가변성 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 이어서 이러한 가변성 도메인 서열은 원하는 인간 불변성 도메인과 조합될 수 있다. 인간 항체를 항체 라이브러리로부터 선택하는 기법은 하기에 기재되어 있다.
오파투뮤맵은 CD20에 결합하는 인간 항체의 예이다.
4. 라이브러리-유도된 항체
본 발명의 항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체를 위해 조합적 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 예를 들면, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 원하는 결합 특징을 갖는 항체를 위해 이러한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 다양한 방법이 당분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 후겐붐(Hoogenboom) 등의 문헌 "Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)"에 검토되어 있고, 추가로, 예를 들어, 맥카퍼티(McCafferty) 등의 문헌 "Nature 348:552-554"; 클랙슨(Clackson) 등의 문헌 "Nature 352: 624-628 (1991)"; 마크스(Marks) 등의 문헌 "J. Mol . Biol . 222: 581-597 (1992)"; 마크스 및 브라드베리(Bradbury)의 문헌 "Methods in Molecular Biology 248: 161-175" (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)"; 시드후(Sidhu) 등의 문헌 "J. Mol . Biol . 338(2): 299-310 (2004)"; 리(Lee) 등의 문헌 "J. Mol . Biol . 340(5): 1073-1093 (2004)"; 펠라우스(Fellouse)의 문헌 "Proc . Natl . Acad . Sci . USA 101(34): 12467-12472 (2004)"; 및 리(Lee) 등의 문헌 "J. Immunol . Methods 284(1-2): 119-132(2004)"에 기재되어 있다.
특정 파아지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)에 의해 별도로 클로닝되고, 파아지 라이브러리에서 무작위로 재조합되고, 이는 이어서 윈터(Winter) 등의 문헌 "Ann . Rev . Immunol ., 12: 433-455 (1994)"에 기재된 바와 같이 항원-결합 파아지를 위해 스크리닝될 수 있다. 파아지는 전형적으로 항체 단편을, 단일-쇄 Fv(scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 표시한다. 면역화된 근원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 작성할 필요없이 면역원에 대해 높은 친화성을 갖는 항체를 제공한다. 다르게는, 그리프쓰(Griffiths) 등의 문헌 "EMBO J, 12: 725-734 (1993)"에 기재된 바와 같이 임의의 면역화없이 비-자가 항원 내지 자가 항원에 이르는 넓은 범위로 항체의 단일 근원을 제공하기 위해 순수한(naive) 레퍼토리가 클로닝될 수 있다(예를 들어, 인간으로부터). 최종적으로, 순수한 라이브러리는 또한 후겐붐 및 윈터의 문헌 "J. Mol . Biol , 227: 381-388 (1992)"에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 구획을 클로닝하고, 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 고 가변성 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내에서 재배열을 달성함으로써 합성적으로 제조될 수 있다. 인간 항체 파아지 라이브러리를 기재하는 특허 공보로는, 예를 들면: 미국 특허 제5,750,373호, 및 미국 특허출원 공개공보 제2005/0079574호, 제2005/0119455호, 제2005/0266000호, 제2007/0117126호, 제2007/0160598호, 제2007/0237764호, 제2007/0292936호, 및 제2009/0002360호가 포함된다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 고려된다.
5. 다중특이적 항체
특정 실시태양에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 단일클론성 항체이다. 특정 실시태양에서, 결합 특이성중 하나는 CD20에 대한 것이고, 나머지는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시태양에서, 이중특이적 항체는 CD20의 2개의 상이한 에피토프에 결합한다. 이중특이적 항체는 또한 CD20을 발현하는 세포에 세포독성제를 편재화시키기 위해 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하는 기법으로는, 제한되지 않지만, 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동-발현[밀스타인(Milstein) 및 쿠엘로(Cuello)의 문헌 "Nature 305: 537 (1983)", 국제 특허출원 공개공보 제WO 93/08829호, 및 트라우네커(Traunecker) 등의 문헌 "EMBO J. 10: 3655 (1991)" 참조], 및 "놉-인-홀(knob-in-hole)" 조작(예를 들어, 미국 특허 제5,731,168호 참조)이 포함된다. 다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기적 조정 효과를 조작함으로써(국제 특허출원 공개공보 제WO 2009/089004A1호); 둘 이상의 항체 또는 단편을 가교결합시킴으로써[예를 들어, 미국 특허 제4,676,980호, 및 브렌난(Brennan) 등의 문헌 "Science , 229: 81 (1985)" 참조]; 이중특이적 항체를 생산하기 위해 로이신 지퍼(zipper)를 사용함으로써[예를 들어, 코스텔니(Kostelny) 등의 문헌 "J. Immunol ., 148(5): 1547-1553 (1992)" 참조]; 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위해 "디아바디" 기술을 사용함으로써[예를 들어, 홀린거(Hollinger) 등의 문헌 "Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 90:6444-6448 (1993)" 참조]; 단일-쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용함으로써[예를 들어, 그루버(Gruber) 등의 문헌 "J. Immunol, 152:5368 (1994)" 참조]; 예를 들어, 투트(Tutt) 등의 문헌 "J. Immunol . 147: 60 (1991)"에 기재된 바와 같은 삼중특이적 항체를 제조함으로써 제조될 수 있다.
"옥토퍼스(Octopus) 항체"를 비롯하여, 3개 이상의 작용성 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체 또한 본원에 포함된다(예를 들어 US 제2006/0025576A1호 참조).
항체 또는 단편은 본원에서 또한 CD20에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF", 뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원을 포함한다(예를 들면, US 제2008/0069820호 참조).
6. 항체 변형체
특정 실시태양에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변형체가 고려된다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 요망될 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변형체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열내로 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형으로는, 예를 들면, 항체의 아미노산 서열로부터의 결실, 및/또는 이로의 삽입 및/또는 이들내의 잔기의 치환이 포함된다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 최종 작성물에 나타나도록 이루어질 수 있고, 단 최종 작성물은 원하는 특징, 예를 들어, 항원-결합 특징을 가져야 한다.
특정 실시태양에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변형체가 제공된다. 치환성 돌연변이생성을 위해 흥미로운 부위로는 HVR 및 FR이 포함된다. 아미노산 치환은 원하는 활성, 예를 들어, 유지되고/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC를 위해 스크리닝된 생성물 및 흥미로운 항체내로 도입될 수 있다.
치환 변형체의 한 유형은 모 항체(예를 들어 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 과가변성 영역 잔기를 치환함을 포함한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택된 생성 변형체는 모 항체에 비해 특정한 생물 특성(예를 들어, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)에 있어서 변경(예를 들어, 개선)될 것이고/것이거나, 모 항체의 특정한 생물 특성을 실질적으로 보유할 것이다. 예시적인 치환성 변형체는 친화도 돌연변이된 항체이고, 이는 예를 들어, 파아지 디스플레이에 기초한 친화도 돌연변이 기법, 예컨대 본원에 기재된 기법을 사용하여 편리하게 생성될 수 있다. 간단히, 하나 이상의 HVR 잔기는 돌연변이되고, 변형 항체는 파아지상에 표시되고, 특정 생물 활성(예를 들어 결합 친화도)을 위해 스크리닝된다.
아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기로부터 100개 이상의 잔기를 포함하는 폴리펩티드까지 다양한 길이의 아미노- 및/또는 카복실-말단 축합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체가 포함된다. 항체 분자의 다른 삽입성 변형으로는 효소(예를 들어 ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드로의 항체의 N- 또는 C-말단으로의 축합이 포함된다.
특정 실시태양에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가 또는 감소시키도록 변경된다. 항체로의 글리코실화 부위의 첨가 또는 이의 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 고유의 항체는 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297로의 N-결합에 의해 일반적으로 결합된 분지화된 2촉각(biantennary) 올리고당을 전형적으로 포함한다. 예를 들어, 롸이트(Wright) 등의 문헌 "TIBTECH 15:26-32 (1997)"을 참조한다. 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들어, 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc: N-acetyl glucosamine), 갈락토스, 및 시알산, 뿐만 아니라 2촉각 올리고당 구조의 "줄기"에 있는 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항체중 올리고당의 변형은 특정한 개선된 특성을 갖는 항체 변형체를 생성하기 위해 이루어진다.
한 실시태양에서, Fc 영역에 부착된(직접적으로 또는 간접적으로) 푸코스가 없는 탄수화물 구조를 갖는 항체 변형체가 제공된다. 예를 들면, 이러한 항체중 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%이다. 푸코스의 양은 예를 들면 국제 특허출원 공개공보 제WO 2008/077546호에 기재된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정되는 경우, Asn 297에 부착된 모든 당구조물(예를 들어, 착체, 하이브리드 및 고 만노스 구조물)의 합에 대한, Asn297에서의 당 쇄 내의 푸코스의 평균 양을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 영역에서 대략 297 위치(Fc 영역 잔기의 Eu 번호매김)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 또한 항체중 작은 서열 변형에 기인하여 297 위치의 약 ± 3의 아미노산 상류 또는 하류, 즉 294 내지 300 위치에 위치될 수 있다. 이러한 푸코실화 변형체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공고공보 US 제2003/0157108호[프레스타(Presta, L.)]; US 제2004/0093621호[교와 하코 고교 캄파니 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)]를 참조한다. "푸코스 제거된" 또는 "푸코스-부족" 항체 변형체에 관한 문헌의 예로는: US 제2003/0157108호; 국제 특허출원 공개공보 제WO 2000/61739호; 국제 특허출원 공개공보 제WO 2001/29246호; US 제2003/0115614호; US 제2002/0164328호; US 제2004/0093621호; US 제2004/0132140호; US 제2004/0110704호; US 제2004/0110282호; US 제2004/0109865호; 국제 특허출원 공개공보 제WO 2003/085119호; 제WO 2003/084570호; 제WO 2005/035586호; 제WO 2005/035778호; 제WO 2005/053742호; 제WO 2002/031140호; 오카자키(Okazaki) 등의 문헌 "J. Mol . Biol . 336: 1239-1249 (2004)"; 야만-오누키(Yamane-Ohnuki) 등의 문헌 "Biotech . Bioeng. 87: 614 (2004)"이 포함된다. 푸코스 제거된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예로는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포[리프카(Ripka) 등의 문헌 "Arch . Biochem . Biophys. 249:533-545 (1986)"; 미국 특허출원 공개공보 제2003/0157108 A1호(프레스타); 및 국제 특허출원 공개공보 제WO 2004/056312 A1호[아담스(Adams) 등, 특히 실시예 11], 및 넉아웃(knockout) 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실전이효소 유전자, FUT8, 넉아웃 CHO 세포[예를 들어, 야만 오누키 등의 문헌 "Biotech . Bioeng. 87: 614 (2004)"; 칸다(Kanda, Y.) 등의 문헌 "Biotechnol . Bioeng ., 94(4):680-688 (2006)"; 및 국제 특허출원 공개공보 제WO 2003/085107호 참조]가 포함된다.
2등분된 올리고당을 갖는 항체 변형체가 추가로 제공되고, 예를 들어, 여기서 항체의 Fc 영역에 부착된 2촉각 올리고당은 GlcNAc에 의해 2등분된다. 이러한 항체 변형체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변형체의 예는, 예를 들어, 국제 특허출원 공개공보 제WO 2003/011878호[진-마이렛(Jean-Mairet) 등]; 미국 특허 제6,602,684호[우마나(Umana) 등]; 및 US 제2005/0123546호(우마나 등)에 기재되어 있다. Fc 영역에 결합된 올리고당에서 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변형체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변형체는 CDC 기능이 개선될 수 있다. 이러한 항체 변형체는, 예를 들어, 국제 특허출원 공개공보 제WO 1997/30087호[파텔(Patel) 등]; 국제 특허출원 공개공보 제WO 1998/58964호[라주(Raju, S.)]; 및 국제 특허출원 공개공보 제WO 1999/22764호(라주)에 기재되어 있다.
GA101은 CD20에 결합하는 항체 글리코실화 변형체의 일예이다.
특정 실시태양에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역내로 도입될 수 있고, 이로써 Fc 영역 변형체를 생성한다. Fc 영역 변형체는 아미노산 변형(예를 들어 치환)을 하나 이상의 아미노산 위치에 갖는 인간 Fc 영역 서열(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함한다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 생체내 항체 반감기가 중요하지만 특정 효과자 기능(예컨대 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 유해한 적용분야를 위해 바람직한 후보로 만드는, 몇몇(그러나 전부는 아님) 효과자 기능을 갖는 항체 변형체를 고려한다.
효과자 기능이 감소된 항체로는 하나 이상의 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329의 치환을 갖는 항체가 포함된다(미국 특허 제6,737,056호). 이러한 Fc 돌연변이체로는 2개 이상의 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327에서 치환된 Fc 돌연변이체가 포함되고, 예로서 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는, 소위 "DANA" Fc 돌연변이체가 있다(미국 특허 제7,332,581호).
FcR로의 결합이 향상되거나 감소된 특정 항체 변형체가 기재되어 있다[미국 특허 제6,737,056호; 국제 특허출원 공개공보 제WO 2004/056312호, 및 쉴즈(Shields) 등의 문헌 "J. Biol Chem . 9(2): 6591-6604 (2001)" 참조].
특정 실시태양에서, 항체 변형체는 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, Fc 영역의 298, 333, 및/또는 334 위치에서의 치환(잔기의 EU 번호매김)을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 예를 들어 미국 특허 제6,194,551호, 국제 특허출원 공개공보 제WO 99/51642호, 및 이두소기에(Idusogie) 등의 문헌 "J. Immunol . 164: 4178-4184 (2000)"에 기재된 바와 같이, 변경된(즉, 향상되거나 감소된) Clq 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 일으키는 변형이 Fc 영역에서 이루어진다.
모 IgG의 태아로의 전달에 책임이 있는 신생아 Fc 수용체(FcRn)로의 결합이 개선되고 반감기가 증가된 항체[구이어(Guyer) 등의 문헌 "J. Immunol . 117:587 (1976)" 및 김(Kim) 등의 문헌 "J. Immunol. 24:249 (1994)"]는 US 제2005/0014934A1호[힌톤(Hinton) 등]에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn으로의 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 내부에 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변형체로는, 다음의 하나 이상의 Fc 영역 잔기에서 치환된 변형체가 포함되고: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434; 예를 들어, Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 변형체이다(미국 특허 제7,371,826호).
또한 Fc 영역 변형체의 다른 예에 관한 던칸(Duncan) 및 윈터(Winter)의 문헌 "Nature 322:738-40 (1988)"; 미국 특허 제5,648,260호; 미국 특허 제5,624,821호; 및 국제 특허출원 공개공보 제WO 94/29351호를 참조한다.
특정 실시태양에서, 시스테인 조작된 항체, 예를 들어, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 "티오MAbs"을 생성하는 것이 요망될 수 있다. 구체적인 실시태양에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 발생된다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올 기는 항체의 접근가능한 부위에 위치하고 항체를 다른 잔기, 예컨대 약물 잔기 또는 연결기-약물 잔기에 컨주게이트하여 본원에 추가로 기재된 바와 같은 면역컨주게이트를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시태양에서, 임의의 하나 이상의 다음의 잔기가 시스테인으로 치환된다: 경쇄의 V205(카밧 번호매김); 중쇄의 A118(EU 번호매김); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 번호매김). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어, 미국 특허 제7,521,541호에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
특정 실시태양에서, 본원에 제공된 항체는 당분야에 공지되고 쉽게 이용가능한 추가의 비단백질성 잔기를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 잔기로는, 제한되지 않지만 수용성 중합체가 포함된다. 수용성 중합체의 비제한적인 예로는, 제한되지 않지만, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 그의 수중 안정성에 기인하여 제작시 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지되거나 분지되지 않을 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있고, 하나 보다 많은 중합체가 부착된다면, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 전반적으로, 유도체화를 위해 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은, 제한되지 않지만, 개선될 항체의 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건하에서 치료에 사용될 것인지의 여부 등을 비롯한 고려사항에 기초하여 결정될 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 잔기 및 항체의 컨주게이트가 제공된다. 한 실시태양에서, 비단백질성 잔기는 탄소 나노튜브(nanotube)이다[캄(Kam) 등의 문헌 "Proc . Natl . Acad . Sci . USA 102: 11600-11605 (2005)"]. 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 제한되지 않지만, 통상적인 세포에 해를 주지 않지만 항체-비단백질성 잔기에 근접한 세포가 사멸되는 온도로 비단백질성 잔기를 가열하는 파장이 포함된다.
한 실시태양에서, 약제는 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학치료제 또는 약물, 성장 억제제, 독소(예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 곰팡이, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사성 동위원소에 컨주게이트된 항체(예컨대 CD20 항체)를 포함하는 면역컨주게이트이다.
한 실시태양에서, 면역컨주게이트는 항체-약물 컨주게이트(ADC)이고, 여기서 항체는 하나 이상의 약물, 예로서 제한되지 않지만 메이탄시노이드(maytansinoid)(미국 특허 제5,208,020호, 제5,416,064호 및 유럽 특허 EP 제0 425 235 B1호 참조); 아우리스타틴(auristatin), 예컨대 모노메틸아우리스타틴 약물 잔기 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)(미국 특허 제5,635,483호, 제5,780,588호, 및 제7,498,298호 참조); 돌라스타틴(dolastatin); 칼키아미신 또는 이의 유도체[미국 특허 제5,712,374호, 제5,714,586호, 제5,739,116호, 제5,767,285호, 제5,770,701호, 제5,770,710호, 제5,773,001호, 및 제5,877,296호; 힌만(Hinman) 등의 문헌 "Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)"; 및 로데(Lode) 등의 문헌 "Cancer Res . 58:2925-2928 (1998)" 참조]; 안트라사이클린(anthracycline), 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신[크라츠(Kratz) 등의 문헌 "Current Med . Chem . 13:477-523 (2006)"; 제프레이(Jeffrey) 등의 문헌 "Bioorganic & Med . Chem . Letters 16:358-362 (2006)"; 토고브(Torgov) 등의 문헌 "Bioconj . Chem . 16:717-721 (2005)"; 나기(Nagy) 등의 문헌 "Proc . Natl . Acad . Sci . USA 97:829-834 (2000)"; 두보우치크(Dubowchik) 등의 문헌 "Bioorg . & Med . Chem . Letters 12: 1529-1532 (2002)"; 킹(King) 등의 문헌 "J. Med . Chem. 45:4336-4343 (2002)"; 및 미국 특허 제6,630,579호 참조]; 메토트렉세이트; 빈데신; 탁세인, 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀(paclitaxel), 라로탁셀(larotaxel), 테세탁셀(tesetaxel), 및 오르타탁셀(ortataxel); 트리코테센(trichothecene); 및 CC1065에 컨주게이트된다.
또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 효소 활성 독소 또는 이의 단편, 예로서 제한되지 않지만 디프테리아(diphtheria) A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄[슈도모나스 아레루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터], 리신(ricin) A 쇄, 아브린(abrin) A 쇄, 모데신(modeccin) A 쇄, 알파-사르신(alpha-sarcin), 알레우리데스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴(dianthin) 단백질, 파이토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 차란티아(momordica charantia) 억제제, 큐르신(curcin), 크로틴(crotin), 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌(gelonin), 미토겔린(mitogellin), 레스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin), 및 트리코테센(tricothecene)에 컨주게이트된 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 방사성컨주게이트를 형성하기 위해 방사성 원자에 컨주게이트된 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소는 방사성컨주게이트의 생산을 위해 이용가능하다. 예로는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다. 방사성컨주게이트가 검출을 위해 사용될 경우, 이는 신티그래프(scintigraphic) 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들면 tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명(NMR: nuclear magnetic resonance) 영상화[또한, 자기 공명 영상화(magnetic resonance imaging: mri)로도 공지됨]를 위한 스핀 표지, 예컨대 다시 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 플루오르-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성제의 컨주게이트는 다양한 2작용성 단백질 커플링제, 예컨대 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 2작용성 유도체(예컨대 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르(예컨대 디석신이미딜 수베레이트), 알데히드(예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예컨대 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물(예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 리신 면역독소는 비테타(Vitetta) 등의 문헌 "Science 238: 1098 (1987)"에 제시된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드의 컨주게이트화를 위한 예시적인 킬레이트화제이다. 국제 특허출원 공개공보 제W0 94/11026호를 참조한다. 연결기는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "분할가능한 연결기"일 수 있다. 예를 들면, 산-불안정성 연결기, 펩타이드분해효소-감수성 연결기, 광불안정성 연결기, 디메틸 연결기 또는 디설파이드-함유 연결기[차리((Chari) 등의 문헌 "Cancer Res. 52: 127-131 (1992)"; 미국 특허 제5,208,020호]가 사용될 수 있다.
면역컨주게이트 또는 ADC는 본원에서, 제한되지 않지만, 가교결합제, 예로서, 제한되지 않지만, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB(석신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)[이는 시판됨; 예를 들어, 피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Pierce Biotechnology, Inc)., 미국 일리노이주 락포드 소재]로 제조되는 이러한 컨주게이트를 분명히 고려한다.
III . 진단 방법
한 양태에서, 본 발명은 본원에서 CLL을 앓는 환자로부터의 샘플에서 miRNA151 3p, miRNA409 3p, PTK2, 및 PI3K로부터 선택된 생체지표의 발현(또는 활성화)을 결정하는 단계, 및 생체지표의 발현 수준에 기초하여 CLL 약제를 선택하는 단계를 포함하는, CLL을 앓는 환자를 위한 치료법을 선택하는 방법에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 생체지표의 상승된 수준은 환자를 치료하는데 사용하기 위하여 FAK 신호전달 및/또는 동형 부착을 유도하는 CLL 약제, 및/또는 B-세포 길항물질, 및/또는 CD20 항체를 선택하도록 할 것이다. 또 다른 실시태양에서, 생체지표가 감소된 수준 또는 중앙값 미만의 수준으로 존재할 경우, 환자는 리툭시맵 이외의 또는 CD20 항체 이외의 CLL 약제로 치료하도록 선택될 것이다.
생체지표에 대한 중앙 발현 수준은 생체지표 발현을 측정함과 본질적으로 동시에 결정될 수 있거나, 또는 미리 결정될 수 있다. 숙련가라면 다양한 진단 검정을 위해 환자의 모집단에서 생체지표의 중앙 발현 수준을 결정할 수 있다. 이는 하기 실시예에서 다양한 생체지표 및 생물검정을 위해 중앙 발현 수준을 제공하는 하기 표에 예시되어 있다.
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환자로부터의 샘플은 본원에서 하나 이상의 생체지표의 발현을 위해 시험된다. 조직 또는 세포 샘플의 근원은 신선한, 냉동된 및/또는 보존된 기관 또는 조직 샘플, 또는 생검 또는 흡인으로부터의 고체 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성성분; 체액, 예컨대 뇌 척수액, 양수액, 복막액, 또는 세포간질액; 피험체의 임신 또는 발달중 임의의 시점으로부터의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 자연적으로 조직과 혼합되지 않는 화합물, 예컨대 보존제, 응고방지제, 완충제, 고정제, 영양제, 항생제 등을 포함할 수 있다. 본원에서 종양 샘플의 예로는, 제한되지 않지만, 종양 생검, 종양 세포, 혈청 또는 혈장, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 순환 혈장 단백질, 복수액, 1차 세포 배양액 또는 종양으로부터 유도되거나 종양-유사 특성을 나타내는 세포주, 뿐만 아니라 보존된 종양 샘플, 예컨대 포르말린-고정된 종양 샘플, 파라핀-함침된 종양 샘플 또는 동결된 종양 샘플이 포함된다. 한 실시태양에서, 샘플은 CD19-강화된 PBMC를 비롯하여 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 포함한다.
mRNA 또는 단백질의 발현을 결정하는 다양한 방법으로는, 제한되지 않지만, 유전자 발현 프로파일링(profiling), 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)을 비롯한 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR), RNA-Seq, 마이크로어레이 분석, 유전자 발현의 순차적 분석(SAGE: serial analysis of gene expression), 매스어레이(MassARRAY), 프로테오믹스(proteomics), 면역조직화학법(IHC: immunohistochemistry) 등이 포함된다. 바람직하게는 mRNA는 정량화된다. 이러한 mRNA 분석은 바람직하게는 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR), 또는 마이크로어레이 분석의 기법을 사용하여 수행된다. PCR이 사용될 경우, PCR의 바람직한 형태는 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)이다.
유전자 발현을 결정하기 위한 다양한 예시적인 방법은 이제 더 상세히 설명될 것이다.
1. 유전자 발현 프로파일링
전반적으로, 유전자 발현 프로파일링의 방법은 다음의 2개의 큰 군으로 나눠질 수 있다: 폴리뉴클레오티드의 하이브리드화 분석에 기초한 방법, 및 폴리뉴클레오티드의 서열분석(sequencing)에 기초한 방법. 샘플에서 mRNA 발현을 정량화하는 당분야에 공지된 가장 흔히 사용되는 방법으로는 노던 블로팅(northern blotting) 및 제자리 하이브리드화[파커(Parker) 및 바네스(Barnes)의 문헌 "Methods in Molecular Biology 106:247-283 (1999)"]; RNA분해효소 보호 검정[호드(Hod)의 문헌 "Biotechniques 13:852- 854 (1992)"]; 및 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)[와이스(Weis) 등의 문헌 "Trends in Genetics 8:263-264 (1992)"]이 포함된다. 다르게는, 항체는 DNA 이중체, RNA 이중체, 및 DNA-RNA 하이브리드 이중체 또는 DNA-단백질 이중체를 비롯한 특정 이중체를 인식할 수 있는 항체가 사용될 수 있다. 서열분석에 기초한 유전자 발현 분석을 위한 대표적인 방법으로는 유전자 발현의 순차적 분석(SAGE), 및 대량 병렬 특징 서열분석(MPSS: massively parallel signature sequencing)에 의한 유전자 발현 분석이 포함된다.
2. 폴리머라아제 연쇄 반응( PCR )
상기 열거된 기법중, 감도 높고 유연성 있는 정량적 방법은 PCR이고, 이는 약물 치료의 존재 또는 부재하에 정상 조직 및 종양 조직에서 상이한 샘플 모집단에서의 mRNA 수준을 비교하여 유전자 발현 패턴을 특징화하고, 매우 관련된 mRNA를 구별하고, RNA 구조를 분석하기 위해 사용될 수 있다.
제1 단계는 표적 샘플로부터의 mRNA의 단리이다. 출발 물질은 전형적으로 인간 종양 또는 종양 세포주, 및 상응하는 정상 조직 또는 세포주 각각으로부터 단리된 전체 RNA이다. 이와 같이 RNA는 유방암, 폐암, 결장암, 전립선암, 뇌암, 간암, 신장암, 췌장암, 비장암, 갑상선암, 고환암, 난소암, 자궁암 등의 다양한 원발성 종양, 건강한 공여자로부터의 풀링된 DNA를 갖는 종양 또는 종양 세포주로부터 단리될 수 있다. mRNA의 근원이 원발성 종양이면, mRNA는, 예를 들면, 동결되거나 보관된 파라핀-함침되고 고정된(예를 들어 포르말린-고정된) 조직 샘플로부터 추출될 수 있다. mRNA 추출을 위한 일반적 방법은 당분야에 공지되어 있고, 분자 생물학의 표준책자, 예로서 아수벨 등의 문헌 "Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997)"에 개시되어 있다. 파라핀 함침된 조직으로부터 RNA 추출을 위한 방법은, 예를 들면, 루프(Rupp) 및 라커(Locker)의 문헌 "Lab Invest . 56:A67 (1987)", 및 데 안드레스(De Andres) 등의 문헌 "BioTechniques 18:42044 (1995)"에 개시되어 있다. 특히, RNA 단리는 상업적 제조업체, 예컨대 퀴아겐(Qiagen)으로부터의 정제 키트, 완충액 세트 및 단백질분해효소를 제조업체의 지시에 따라 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 배양액중 세포로부터 전체 RNA는 퀴아겐 알엔이지(Qiagen RNeasy) 미니-칼럼을 이용하여 단리될 수 있다. 다른 시판되는 RNA 단리 키트로는 매스터퓨어(MASTERPURE: 등록상표) 컴플리트(Complete) DNA 및 RNA 정제 키트[에피센터(EPICENTRE: 등록상표), 위스콘신주 매디슨 소재], 및 파라핀 블럭 RNA 단리 키트(Paraffin Block RNA Isolation Kit)[앰비온 인코포레이티드(Ambion, Inc.)]가 포함된다. 조직 샘플로부터의 전체 RNA는 RNA 스태트(Stat)-60[텔-테스트(Tel-Test)]을 사용하여 단리될 수 있다. 종양으로부터 제조된 RNA는, 예를 들면, 염화 세슘 밀도 구배 원심분리에 의해 단리될 수 있다.
RNA가 PCR을 위한 주형으로 작용할 수 없으므로, PCR에 의한 유전자 발현 프로파일링에서 제1 단계는 RNA 주형의 cDNA로의 역전사이고, 이후 PCR 반응에서 그의 기하급수적 증폭이 수반된다. 2개의 가장 흔히 사용되는 역전사효소는 아빌로 골수아세포 바이러스 역전사효소(AMV-RT: avilo myeloblastosis virus reverse transcriptase) 및 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 역전사효소(MMLV-RT: Moloney murine leucemia virus reverse transcriptase)이다. 역전사 단계는 전형적으로 발현 프로파일링의 환경 및 목표에 따라 특정 프라이머, 무작위 6량체, 또는 올리고-dT 프라이머를 사용하여 프라이밍된다(primed). 예를 들면, 추출된 RNA는 제네앰프(GENEAMP: 상표) RNA PCR 키트[퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 미국 캘리포니아주 소재]를 사용하여 제조업체의 지시에 따라 역전사될 수 있다. 이어서 유도체화된 cDNA는 후속적인 PCR 반응에서 주형으로 사용될 수 있다. PCR 단계가 다양한 열안정성 DNA-의존성 DNA 폴리머라아제를 사용할 수 있을지라도, 이는 전형적으로 Taq DNA 폴리머라아제를 사용하고, 이는 5'-3' 뉴클레아제(nuclease) 활성을 갖지만 3'-5' 교정(proofreading) 엔도뉴클레아제(endonuclease) 활성이 결핍된다. 이와 같이, 타크만(TAQMAN: 등록상표) PCR은 전형적으로 Taq 또는 Tth 폴리머라아제의 5'-뉴클레아제 활성을 사용하여 그의 표적 앰플리콘(amplicon)에 결합된 하이브리드화 탐침자를 가수분해하지만, 동등한 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 임의의 효소가 사용될 수 있다. 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머가 PCR 반응에 전형적인 앰플리콘을 생성하기 위해 사용된다. 제3의 올리고뉴클레오티드, 또는 탐침자는 2개의 PCR 프라이머 사이에 위치된 뉴클레오티드 서열을 검출하도록 고안된다. 탐침자는 Taq DNA 폴리머라아제 효소에 의해 연장가능하지 않고 리포터(reporter) 형광 염료 및 소광제(quencher) 형광 염료로 표지된다. 리포터 염료로부터의 임의의 레이저-유도된 발광은, 두 염료가 탐침자 상에서와 같이 서로 가까이 위치할 경우 소광 염료에 의해 소광된다. 증폭 반응 동안, Taq DNA 폴리머라아제 효소는 주형-의존성 방식으로 탐침자를 분할한다. 생성된 탐침자 단편은 용액중에서 해리되고, 방출된 리포터 염료로부터의 신호는 제2 형광단의 소광 효과로부터 자유롭다. 리포터 염료의 한 분자는 합성된 각각의 새로운 분자로부터 방출되고, 비소광된 리포터 염료의 검출은 데이터의 정량적 해석을 위한 근거를 제공한다.
타크만(등록상표) PCR은 시판되는 장비, 예컨대, ABI PRISM 7700(등록상표) 서열 검출 시스템(Sequence Detection System: 등록상표)[퍼킨-엘머-어플라이드 바이오시스템스(Perkin- Elmer-Applied Biosystems), 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재], 또는 라이트사이클러(Lightcycler)[로슈 몰레큘러 바이오케미칼스(Roche Molecular Biochemicals), 독일 만하임 소재]를 사용하여 수행될 수 있다. 한 바람직한 실시태양에서, 5' 뉴클레아제 절차는 실시간 정량적 PCR 장치, 예컨대 ABI PRISM 7700(등록상표) 서열 검출 시스템 상에서 실행된다. 이 시스템은 열순환기(thermocycler), 레이저, 전하-커플링된 장치(CCD: charge-coupled device), 카메라 및 컴퓨터로 구성된다. 시스템은 샘플을 열순환기 상의 96-웰 포맷에서 증폭시킨다. 증폭동안, 레이저-유도된 형광 신호는 실시간 섬유 광케이블에서 96 웰에 대해 수집되고, CCD에서 검출된다. 시스템은 기기를 운행하고 데이터를 분석하기 위한 소프트웨어를 포함한다.
5'-뉴클레아제 검정 데이터는 초기에 Ct로서, 또는 역치 주기로 표시된다. 상기 논의된 바와 같이, 형광 값은 매 주기동안 기록되고, 증폭 반응에서 그 지점으로 증폭된 생성물의 양을 나타낸다. 형광 신호가 통계적으로 유의적인 것으로 처음 기록되는 시점은 역치 주기(Ct)이다.
샘플-대-샘플 변화의 오차 및 효과를 최소화하기 위해, PCR은 대개 내부 표준물을 사용하여 수행된다. 이상적 내부 표준물은 상이한 조직에서 일정한 수준에서 발현되고, 실험적 처리에 의해 영향받지 않는다. 유전자 발현의 패턴을 정규화하기 위해 가장 빈번히 사용되는 RNA는 항존 유전자 글리세르알데히드-3-포스페이트-탈수소효소(GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase) 및 P-액틴(actin)을 위한 mRNA이다.
PCR 기법의 더 최근의 변형은 이중-표지된 플루오르성 탐침자[즉, 타크만(등록상표) 탐침자]를 통한 PCR 생성물 축적을 측정하는 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)이다. 실시간 PCR은 정량적 경쟁적 PCR과 둘 다 경쟁적이고, 여기서 각각의 표적 서열을 위한 내부 경쟁자는 정규화를 위해 사용되고, 정량적 경쟁적 PCR은 PCR용 샘플, 또는 항존 유전자내에 포함된 정규화 유전자를 사용한다. 추가의 세부사항을 위해, 예를 들어 헬드(Held) 등의 문헌 "Genome Research 6:986-994 (1996)"을 참조한다.
고정된, 파라핀-함침된 조직을 RNA 근원으로 사용하는 프로파일링 유전자 발현을 위한 대표적인 프로토콜의 단계, 예로서 mRNA 단리, 정제, 프라이머 연장 및 증폭은 다양한 공개된 문헌에 제공되어 있다[예를 들면: 고드프레이(Godfrey) 등의 문헌 "J. Molec . Diagnostics 2: 84-91 (2000)"; 스펙트(Specht) 등의 문헌 "Am . J. Pathol. 158: 419-29 (2001)"]. 간단히, 대표적인 과정은 파라핀-함침된 종양 조직 샘플의 약 10 마이크로그램 두께 구획을 절단함으로써 시작된다. 이어서 RNA는 추출되고, 단백질 및 DNA는 제거된다. RNA 농축물을 분석한 후, 필요하다면 RNA 수선 및/또는 증폭 단계가 포함될 수 있고, RNA는 PCR이 수반되는 유전자 특이적 촉진자를 사용하여 역전사될 수 있다.
본 발명의 한 양태에 따라서, PCR 프라이머 및 탐침자는 증폭된 유전자에 존재하는 인트론 서열에 기초하여 고안된다. 이러한 실시태양에서, 프라이머/탐침자 고안의 제1 단계는 유전자내의 인트론 서열의 설계이다. 이는 공개적으로 이용가능한 소프트웨어, 예컨대 켄트(Kent, W.)[Genome Res. 12(4):656-64 (2002)]에 의해 개발된 DNA BLAT 소프트웨어, 또는 블라스트(BLAST) 소프트웨어, 및 이의 변형 소프트웨어에 의해 수행될 수 있다. 후속적인 단계는 PCR 프라이머 및 탐침자 고안에 대한 잘 정립된 방법을 따른다.
비특이적 신호를 방지하기 위해, 프라이머 및 탐침자를 고안할 경우 인트론내의 경쟁 서열을 차폐하는 것이 중요하다. 이는 베일러 칼리지 오브 메디슨(Baylor College of Medicine)을 통해 온-라인상에서 이용가능한 리피트 마스커(Repeat Masker) 프로그램을 사용하여 쉽게 달성될 수 있는데, 이는 경쟁 요소의 라이브러리에 대해 DNA 서열을 스크리닝하고, 경쟁 요소가 차폐되는 의문(query) 서열을 되돌린다. 이어서 차폐된 인트론 서열은 임의의 시판되거나 공개적으로 이용가능한 프라이머/탐침자 고안 포장물, 예컨대 프라이머 익스프레스(Primer Express)[어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)]; MGB 어세이-바이-디자인(assay-by-design)(어플라이드 바이오시스템스); 프라이머3[일반 사용자 및 생물 프로그래머를 위해 WWW 상의 로젠(Rozen) 및 스칼렛스카이(Skaletsky) (2000) 프라이머3; 문헌 "Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols : Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, N.J., pp 365-386"]를 사용하여 프라이머 및 탐침자 서열을 고안하기 위해 사용될 수 있다.
PCR 프라이머 고안에 고려되는 인자로는 프라이머 길이, 용융 온도(Tm), 및 G/C 함량, 특이성, 상보성 프라이머 서열, 및 3'-말단 서열이 포함된다. 전반적으로, 최적의 PCR 프라이머는 일반적으로 길이가 17 내지 30개 염기이고, 약 20 내지 80%, 예컨대, 약 50 내지 60%의 G+C 염기를 포함한다. 50 내지 80℃, 예를 들어 약 50 내지 70℃의 Tm이 전형적으로 바람직하다.
PCR 프라이머 및 탐침자 고안을 위한 추가의 지침을 위해, 예를 들어 디에펜바흐(Dieffenbach) 등의 문헌["General Concepts for PCR Primer Design" in: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1995, pp. 133-155]; 이니스(Innis) 및 겔판드(Gelfand)의 문헌["Optimization of PCRs" in: PCR Protocols , A Guide to Methods and Applications, CRC Press, London, 1994, pp. 5-11]; 및 플라스테러(Plasterer, T. N.)의 문헌[Primerselect: Primer and Probe design. Methods Mol . Biol. 70:520- 527 (1997)]을 참조하고, 이의 전체 개시내용은 본원에 명백히 참고로 인용되어 있다.
3. RNA - Seq
전체 전사체 산탄 서열분석(WTSS: Whole Transcriptome Shotgun Sequencing)으로도 지칭되는 RNA-Seq는 샘플의 RNA 함량에 대한 정보를 얻기 위해 cDNA를 서열분석하는 고-처리량 서열분석 기술의 사용을 지칭한다. RNA-Seq를 기재하는 문헌은 다음을 포함한다: 왕(Wang) 등의 문헌["RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics" Nature Reviews Genetics 10 (1): 57-63 (January 2009)]; 리안(Ryan) 등의 문헌[BioTechniques 45 (1): 81-94 (2008)]; 및 마허(Maher) 등의 문헌["Transcriptome sequencing to detect gene fusions in cancer". Nature 458 (7234): 97-101 (January 2009)].
4. 마이크로어레이
차등 유전자 발현은 마이크로어레이 기법을 사용하여 식별되거나 확인될 수 있다. 이와 같이, 유방암-연관된 유전자의 발현 프로파일은 마이크로어레이 기술을 사용하여 신선한 종양 조직 또는 파라핀-함침된 종양 조직에서 측정될 수 있다. 이 방법에서, 흥미로운 폴리뉴클레오티드 서열(cDNA 및 올리고뉴클레오티드 포함)은 마이크로칩 기판 상에 플레이팅되거나, 어레이된다. 이어서 어레이된 서열은 흥미로운 세포 또는 조직으로부터의 특이적 DNA 탐침자와 하이브리드된다. PCR 방법에서와 같이, mRNA의 근원은 전형적으로 인간 종양 또는 종양 세포주, 및 상응하는 정상 조직 또는 세포주로부터 단리된 전체 RNA이다. 이와 같이 RNA는 다양한 원발성 종양 또는 종양 세포주로부터 단리될 수 있다. mRNA의 근원이 원발성 종양이라면, mRNA는 예를 들면, 매일의 임상적 실행시 일상적으로 제조되고 보존되는 동결되거나 보관된 파라핀-함침되고 고정된(예를 들어 포르말린-고정된) 조직 샘플로부터 추출될 수 있다.
마이크로어레이 기법의 특정 실시태양에서, cDNA 클론의 PCR 증폭된 삽입물은 밀집한 어레이로 기판상에 적용된다. 바람직하게는, 적어도 10,000개의 뉴클레오티드 서열이 기판에 적용된다. 마이크로칩상에 각각 10,000개 요소로 고정화된 마이크로어레이된 유전자는 엄격한 조건하에 하이브리드화하기에 적합하다. 형광 표지된 cDNA 탐침자는 흥미로운 조직으로부터 추출된 RNA의 역전사에 의해 형광 뉴클레오티드의 혼입을 통해 생성될 수 있다. 칩에 적용된 표지된 cDNA 탐침자는 어레이 상의 DNA의 각각의 스팟(spot)에 특이성을 갖고 하이브리드화된다. 비특이적으로 결합된 탐침자를 제거하기 위한 엄격한 세척 후, 칩은 공초점 레이저 현미경에 의해, 또는 또 다른 검출 방법, 예컨대 CCD 카메라에 의해 스캐닝된다. 각각의 어레이된 요소의 하이브리드화의 정량은 상응하는 mRNA 양의 평가를 허용한다. 2중 색상 형광물질에 의해, RNA의 2개의 근원으로부터 생성된 별도로 표지된 cDNA 탐침자는 어레이에 쌍을 이루는 방식으로 하이브리드화된다. 각각의 특정화된 유전자에 상응하는 2개의 근원으로부터의 전사물의 상대량은 이와 같이 동시에 결정된다. 하이브리드화의 소형화된 규모는 대량의 유전자를 위한 발현 패턴의 편리하고 신속한 평가를 가능하게 한다. 이러한 방법은 세포당 소수의 복사물로 발현되는 드문 전사체를 검출하고, 발현 수준에서 적어도 대략 2배 차이를 재현가능하게 검출하기에 필요한 감도를 갖는 것으로 제안되었다[쉐나(Schena) 등의 문헌 "Proc . Natl. Acad . Sci . USA 93(2): 106-149 (1996)"]. 마이크로어레이 분석은 시판되는 장비에 의해 제조업체의 프로토콜에 따라, 예컨대 어피메트릭스 젠칩(AFFYMETRLX GENCHIP: 상표) 기술, 또는 인사이트(Incyte)의 마이크로어레이 기술에 의해 수행될 수 있다.
유전자 발현의 대규모 분석을 위한 마이크로어레이 방법의 개발은 다양한 종양 유형에서 결과 예측 및 암 분류의 분자 지표를 위해 계통적으로 조사하는 것을 가능하게 한다.
5. 유전자 발현의 순차적 분석( SAGE )
유전자 발현의 순차적 분석(SAGE)은, 각 전사물에 대한 개별적 하이브리드화 탐침자를 제공할 필요 없이, 다수의 유전자 전사물의 동시적이고 정량적인 분석을 가능하게 하는 방법이다. 우선, 전사물을 고유적으로 식별하기에 충분한 정보를 포함하지만, 단 태그가 각 전사물내에 고유의 위치로부터 수득되는 짧은 서열 태그(약 10 내지 14 bp)가 생성된다. 이어서, 많은 전사물들이 함께 연결되어 긴 일련의 분자를 형성하고, 이는 서열분석되어 다수의 태그의 실체를 동시에 밝혀낼 수 있다. 전사물의 임의의 모집단의 발현 패턴은 개별 태그의 양을 결정하고, 각 태그에 상응하는 유전자를 식별함으로써 정량적으로 평가될 수 있다. 보다 상세한 내용을 위해, 예를 들어 벨쿨레스쿠(Velculescu) 등의 문헌 "Science 270:484-487 (1995)"; 및 벨쿨레스쿠 등의 문헌 "Cell 88:243-51 (1997)"을 참조한다.
6. 매스어레이 ( MassARRAY ) 기술
매스어레이[세퀘놈(Sequenom), 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재] 기술은 검출을 위해 질량 분석법(MS: mass spectrometry)을 사용하는 유전자 발현 분석의 자동화된, 고-처리량 방법이다. 이러한 방법에 따라서, RNA 단리, 역전사 및 PCR 증폭 후, cDNA는 프라이머 연장된다. cDNA-유도체화된 프라이머 연장 생성물이 정제되고, 말티-토프(MALTI-TOF) MS 샘플 제조에 필요한 성분들로 예비-적재된 칩 어레이 상에 분배된다. 반응에 존재하는 다양한 cDNA는 수득된 질량 스펙트럼에서 피이크 면적을 분석함으로써 정량화된다.
7. 면역조직화학법
면역조직화학 방법은 또한 본 발명의 예후적 지표의 발현 수준을 검출하기에 적합하다. 이와 같이, 각 지표에 대해 특이적인 항체 또는 항혈청, 바람직하게는 다중클론성 항혈청, 및 가장 바람직하게는 단일클론성 항체가 발현을 검출하기 위해 사용된다. 항체는, 예를 들면, 방사성 표지, 형광 표지, 합텐(hapten) 표지, 예컨대, 비오틴(biotin), 또는 효소, 예컨대 고추냉이 과산화효소 또는 알칼리성 인산가수분해효소에 의한 항체 자체의 직접적 표지에 의해 검출될 수 있다. 다르게는, 표지되지 않은 1차 항체는, 1차 항체에 특이적인 항혈청, 다중클론성 항혈청 또는 단일클론성 항체를 포함하는, 표지된 2차 항체와 함께 사용된다. 면역조직화학 프로토콜 및 키트는 당분야에 공지되어 있고 시판된다.
8. 프로테오믹스
용어 "프로테옴(proteome)"은 샘플(예를 들어 조직, 기관, 또는 세포 배양물)중에 특정 시점에 존재하는 단백질의 전체성(totality)으로 정의된다. 프로테오믹스는, 무엇 보다도, 샘플중 단백질 발현의 전체적 변화에 대한 연구를 포함한다(또한 "발현 프로테오믹스"로 지칭됨). 프로테오믹스는 전형적으로 하기 단계를 포함한다: (1) 2-D 겔 전기영동(PAGE: gel electrophoresis)에 의해 샘플중의 개별 단백질을 분리하는 단계; (2) 예를 들어 질량 분석법 또는 N-말단 서열분석에 의해, 겔로부터 회수된 개별 단백질을 식별하는 단계, 및 (3) 생물정보학(bioinformatics)을 사용하여 데이터를 분석하는 단계. 프로테오믹스 방법은 유전자 발현 프로파일링의 다른 방법에 대한 유용한 보충법이고, 단독으로, 또는 다른 방법과 함께 사용되어 본 발명의 예후적 지표의 생성물을 검출한다.
생체지표 발현은 또한 생체내 진단 검정을 사용하여, 예를 들어 검출될 분자에 결합하고 검출가능한 표지(예를 들어, 방사성 동위원소)로 태깅된 분자(예컨대 항체)를 투여하고, 표지의 편재화에 대해 환자를 외부적으로 스캐닝함으로써 평가될 수 있다.
IV . 치료 방법
한 실시태양에서, 본 발명은 CLL을 앓는 환자에서 miRNA151 3p, miRNA409 3p, 및 PTK2로부터 선택된 하나 이상의 생체지표의 양이 상승되었을 경우 또는 PI3K 생체지표가 감소된 경우, CLL 약제를 치료 효과량으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, CLL을 앓는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. CLL 약제의 예로는 본원에서 다음을 포함한다: FAK 신호전달을 유도하고/하거나 동형 부착을 유도하는 CLL 약제; B-세포 길항물질 또는 B-세포 항체; CD20 항체(인간화된, 인간, 키메라성, 제I 유형 또는 제II 유형의 항-CD20 항체, 예컨대 리툭시맵, 오파투뮤맵, GA101, SBI-087, 벨투추맵, 및 AME-133).
본 발명은 또한 CLL을 앓는 환자에서 miRNA151 3p, miRNA409 3p, 및 PTK2로부터 선택된 하나 이상의 생체지표의 양이 상승되었을 경우 또는 PI3K 생체지표가 감소된 경우, 치료 효과량의 항-CD20 항체(예를 들어 리툭시맵)를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, CLL을 앓는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명은 CLL을 앓는 환자에서 miRNA151 3p, miRNA409 3p, 및 PTK2로부터 선택된 하나 이상의 생체지표의 양이 상승되었을 경우 또는 PI3K 생체지표가 감소된 경우, 치료 효과량의 리툭시맵, 플루다라빈 및 사이클로포스파미드의 배합물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, CLL을 앓는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 CLL을 앓는 환자에서 miRNA151 3p, miRNA409 3p, 및 PTK2로부터 선택된 하나 이상의 생체지표의 양이 감소되었을 경우 또는 PI3K 생체지표가 상승된 경우, 리툭시맵 이외의 CLL 약제를 치료 효과량으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, CLL을 앓는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본원에서 치료된 환자는, 바람직하게는 생체지표 양이 상승되지 않은 환자에 비해 더 높은 무진행 생존율(PFS)로 인해 유리할 것이다.
본 발명의 CLL 약제는 단독으로 또는 다른 CLL 약제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, CD20 항체는 적어도 하나의 추가의 치료제와 함께, 예를 들어 화학치료 섭생, 예로서 특히, 알킬화제(예를 들어 클로람부실, 벤다무스틴, 또는 사이클로포스파미드), 뉴클레오시드 유사체 또는 대사길항물질(예를 들어 플루다라빈), 플루다라빈 및 사이클로포스파미드(FC), 프레드니손 또는 프레드니솔론, 알킬레이터-포함 조합 치료제, 예로서 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니솔론(CHOP), 또는 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니솔론(CVP) 등과 함께, 다른 B 세포 길항물질, 예컨대 CD20 항체(예를 들어 리툭시맵, 오파투뮤맵, GA101, SBI-087, 벨투추맵, 및 AME-133 등), CD22 항체 또는 CD79b 항체와 함께, 정맥내 면역 글로불린과 함께, 및/또는 CD52 항체(예를 들어 알렘투추맵)과 함께 투여될 수 있다. 이러한 상기 주지된 조합 치료법은 조합된 투여(여기서 2종 이상의 치료제는 동일한 제형 또는 별도의 제형에 포함됨), 및 개별 투여를 포함하고, 이 경우 제1 약제의 투여는 제2 약제의 투여 이전에, 동시에, 및/또는 이후에 이루어진다. 본 발명의 CLL 약제는 방사선 치료와 함께 사용될 수도 있다.
약제는 본원에서 임의의 적절한 수단, 예로서 비경구, 폐내 및 비강내, 및 원할 경우 국소 치료를 위해, 병변내 투여에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입으로는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여가 포함된다. 투약은 임의의 적절한 경로에 의해, 예를 들어 주사에 의해, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의해, 투여가 단기간인지 또는 장기간인지의 여부에 부분적으로 의존하여 이루어질 수 있다. 제한되지 않지만 다양한 시점에 걸친 다중 또는 단일 투여, 볼루스(bolus) 투여, 및 맥동 주입을 비롯한 다양한 투약 계획이 본원에서 고려된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적절한 투여량(단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 함께 사용될 경우)은 치료될 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 위중성 및 경과, 항체가 예방 목적을 위해 투여되는지 치료 목적을 위해 투여되는지의 여부, 이전 치료법, 환자의 병력 및 항체에 대한 반응, 및 참여 의사의 진술에 따라 달라질 것이다. 항체는 한 시점에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적절히 투여된다. 질환의 유형 및 위중성에 따라, 항체의 약 1 ㎍/㎏ 내지 15 ㎎/㎏(예를 들어 O.1 ㎎/㎏ 내지 1O ㎎/㎏)은, 예를 들면, 1회 이상의 별도 투여에 의해서인지 연속 주입에 의해서인지와 무관하게, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 용량일 수 있다. 한 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 ㎍/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 이상의 범위일 수 있다. 수 일 이상에 걸친 반복된 투여의 경우, 증상에 따라서, 치료는 질환 증후의 원하는 저해가 초래될 때까지 유지되는 것이 알반적이다. CD20 항체를 위한 예시적인 투여량 섭생은 약 500 ㎎/㎡ 내지 약 1500 ㎎/㎡의 범위의 1주, 2주 또는 1달의 항체 투여를 포함한다. 리툭시맵을 위한 예시적인 투여량 섭생은 375 ㎎/㎡(1일), 이어서 매 28일마다 500 ㎎/㎡(2 내지 6 주기)이다. 오파투뮤맵을 위한 예시적인 투여량 섭생은: 300 ㎎의 초기 용량 후 2000 ㎎ 용량(매달); 500 ㎎ 또는 lOOO ㎎의 반복된 용량; 300 ㎎, 1주 후 1000 ㎎, 이후 11개월까지 lOOO ㎎의 주입 등이다.
그러나, 다른 투여량 섭생이 유용할 수 있다. 이러한 치료법의 진행은 통상의 기법 및 검정에 의해 쉽게 모니터링된다.
임의의 상기 제형 또는 치료 방법은 약제로서의 항체 대신에 또는 이에 더하여 면역컨주게이트를 사용하여 실행될 수 있음을 알아야 한다.
V. 제품
본 발명의 또 다른 실시태양에서, CLL을 치료하는데 사용하기 위한 제품이 제공된다. 제품은 용기 및 표지, 또는 용기 상의 또는 이와 연결된 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들면, 병, 바이알(vial), 주사기 등이 포함된다. 용기는 다양한 재료, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 활성 제제로서 CLL 약제를 포함하는 조성물을 보유 또는 함유하고, 멸균 접근 포트(access port)를 가질 수 있다(예를 들면 용기는 피하 주사침에 의해 관통가능한 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다).
제품은 약학적으로 허용가능한 희석 완충액, 예컨대 주사용 세균발육저지수(BWFI: bacteriostatic water for injection), 포스페이트-완충된 염수, 링거(Ringer) 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제품은 판매자 및 사용자 관점에서 요구되는 다른 물질, 예로서 다른 완충제, 희석제, 필터, 침 및 주사기를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 제품은 또한, 예를 들면 포장 삽입물의 형태로, 조성물이 본원에서 생체지표의 발현 수준에 기초하여 CLL을 치료하기 위해 사용됨을 나타내는 정보를 포함한다. 삽입물 또는 표지는 임의의 형태를 취할 수 있고, 예컨대 종이 또는 전자 매체, 예컨대 자기 기록 매체(예를 들어, 플로피 디스크) 또는 CD-ROM일 수 있다. 표지 또는 삽입물은 투여 형태 및 약학 조성물에 관한 다른 정보를 키트 또는 제품중에 포함할 수 있다.
본 발명의 한 실시태양에 따라서, 약학적으로 허용가능한 담체중의 CLL 약제(예를 들어 B-세포 길항물질, 또는 항-CD20 항체), 및 CLL 약제가 miRNA151 3p, miRNA409 3p, PTK2, 및 PI3K로부터 선택된 하나 이상의 생체지표의 발현에 기초하여 CLL을 앓는 환자를 치료하기 위한 것임을 나타내는 포장 삽입물을 함께 포장된 채로 포함하는 제품이 제공된다.
본 발명은 또한 CLL 약제(예를 들어 B-세포 길항물질, 또는 항-CD20 항체)를 포함하는 약학 조성물, 및 약학 조성물이 miRNA151 3p, miRNA409 3p, PTK2, 및 PI3K로부터 선택된 하나 이상의 생체지표의 발현에 기초하여 CLL를 앓는 환자를 치료하기 위한 것임을 나타내는 포장 삽입물을 포장물에서 조합하는 단계를 포함하는 제품의 제조 방법에 관한 것이다.
제품은 약학적으로 허용가능한 희석 완충액, 예컨대 주사용 세균발육저지수(BWFI), 포스페이트-완충된 염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 부가적인 용기를 추가로 포함한다. 제품은 판매자 및 사용자 관점에서 요구되는 다른 물질, 예로서 다른 완충제, 희석제, 필터, 침 및 주사기를 추가로 포함한다.
VI . 진단 키트
본 발명은 또한 본원에서 식별된 임의의 하나 이상의 생체지표(들)를 검출하기에 유용한 진단 키트에 관한 것이다. 따라서, CLL 환자로부터의 샘플에서 miRNA151 3p, miRNA409 3p, PTK2, 및 PI3K로부터 선택된 생체지표의 발현을 검출하기 위한 하나 이상의 시약을 포함하는 진단 키트가 제공된다. 임의적으로, 키트는 환자에서 생체지표를 상승된 수준에서 발현한다면 CLL 환자를 치료하기 위한 CLL 약제(예를 들어 B-세포 길항물질, 또는 항-CD20 항체)를 선택하도록 키트를 사용하는 설명서를 추가로 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 설명서는 환자가 생체지표를 감소된 수준에서 발현한다면 리툭시맵 이외의(또는 항-CD20 항체 이외의) CLL 약제를 선택하도록 키트를 사용하는 것이다. 한 실시태양에서, 예를 들어 PCR 키트중 하나 이상의 시약은 한 쌍의 DNA 프라이머, 및 탐침자(miRNA151 3p, miRNA409 3p, PTK2, 또는 PI3K 생체지표 검출용)를 포함한다.
VII . 광고 방법
본원에서 본 발명은 또한 miRNA151 3p, miRNA409 3p, PTK2, 및 PI3K로부터 선택된 하나 이상의 생체지표의 발현에 기초하여 CLL을 앓는 환자를 치료하기 위한 CLL 약제(예를 들어 B-세포 길항물질, 또는 항-CD20 항체)의 용도를 표적 청중에게 홍보하는 단계를 포함하는, CLL 약제를 광고하기 위한 방법에 관한 것이다.
광고는 일반적으로 후원자가 확인되고 메세지가 제어되는 비인적활동 매체(non-personal medium)를 통해 지불된 의사소통이다. 본원의 목적을 위한 광고는 선전, 피알(PR: public relation), 작품속 광고(product placement), 후원, 인수(underwriting), 및 판촉을 포함한다. 이 용어는 또한 본 발명을 구매, 지지 또는 승인하는 바람직한 패턴에 대한 행동을 많은 청중에게 촉구하고, 정보전달하고, 홍보하고, 동기부여하거나 달리는 변형하도록 고안된 임의의 인쇄 소통 매체에 나타난 후원된 정보 공고를 포함한다.
진단 방법의 광고 및 홍보는 본원에서 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다. 메세지를 전달하기 위해 사용되는 광고 매체의 예로는 텔레비전, 라디오, 영화, 잡지, 신문, 인터넷 및 옥외광고판이 포함되고, 예로서 방송 매체에 나오는 메세지인 방송광고가 포함된다. 광고는 또한 쇼핑카트의 좌석, 공항 도로의 벽, 및 버스의 측면 상에 있는 광고, 또는 전화 대기 메세지 또는 점포내 방송 설비로부터 들려오는 광고, 또는 시각 또는 청각 소통 매체가 위치될 수 있는 어느 곳으로부터의 광고가 포함된다.
홍보 또는 광고 수단의 보다 구체적인 예로는 텔레비전, 라디오, 영화, 인터넷, 예컨대 웹캐스트(webcast) 및 온라인 회의(webinar), 동시적인 사용자에게 도달하도록 의도된 상호작용 컴퓨터 네트워크, 고정 또는 전자 옥외광고판 및 다른 공공 사인, 포스터, 전통적 또는 전자 문헌, 예컨대 잡지 및 신문, 다른 매스컴, 프레젠테이션(presentation), 또는 예를 들어, e-메일, 전화, 인스턴트 메세지(instant message), 우편물, 택배, 대량 메일, 또는 케리어 메일(carrier mail), 개인적 방문 등에 의한 개별적 접촉이 포함된다.
사용되는 광고의 유형은 많은 인자, 예를 들면, 접근할 표적 청중, 예를 들어, 병원, 보험 회사, 클리닉, 의사, 간호사, 및 환자의 유형, 뿐만 아니라 비용 고려사항 및 관련된 관할 법률, 및 약제와 진단의 광고 준거 규제에 따라 달라질 것이다. 광고는 서비스 상호작용 및/또는 다른 데이터, 예컨대 사용자 인구 통계 자료 및 지리학적 위치에 의해 규정되는 사용자 특징에 기초하여 개별화되거나 개개인의 요구에 맞춰진다.
VIII . 생물 물질의 기탁
하기 생물 물질은 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불바드10801 소재의 ATCC(American Type Culture Collection)에 의해 기탁되었다:
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실시예
CD20 항체에 대한 CLL 의 생체지표 예측 반응
재료 및 방법
샘플:
예비처리 환자 샘플을 국제 다중심 공개-표지, 상 III 시험(international, multicenter, open-label, phase III trial)으로부터 분석하고, CLL 환자를 무작위로 R-FC(리툭시맵+플루다라빈/사이클로포스파미드) 또는 FC(플루다라빈/사이클로포스파미드) 단독으로 치료하였다. 1차 대상은 R-FC의 경우 FC 단독에 비해 우수한 무진행 생존율(PFS)을 나타내었다. 연구 프로토콜은 참여 센터에서 기관감시 위원회에 의해 승인되었고, 모든 환자는 사전동의서를 작성하여 제출하였다. 시험 고안 및 적법성 기준에 대한 세부사항은 로박(Robak) 등의 문헌 "J. Clin . Oncol. 28(10): 1756-1765 (2010)"에 기재되어 있다. 환자는 RNA의 이용성, 및 말초 혈액 샘플의 분자 유전학적 분석에 참여하겠다는 작성된 사전동의서에 기초하여 선택되었다.
CD19+ 세포에 대해 양성적으로 선택된 예비치료 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플은 n=301 환자로부터 이용가능하였다. CD19 분리를 제조업체의 프로토콜[밀테니이(Miltenyi), 독일]에 따라 자기 비드 분리에 의해 수행하였다.
RNA 단리:
인간 세포 펠릿을 퀴아겐(Qiagen)(완충액) RLT에서 균질화하였다. 전체 RNA를 어슈라겐 인코포레이티드(Asuragen, Inc.)에 의해 회사 표준 작업 절차에 따라서 마이크로RNA의 보유를 위해 최적화되고 DNA분해효소 처리 단계를 포함하는 인간 세포 펠릿 균질물로부터 단리하였다. 나노드롭(NanoDrop) ND-1000 UV 분광광도계를 사용하여 260 및 280 nm에서 흡광 판독함으로써 전체 RNA 샘플의 순도 및 양을 결정하였다. 나노 검정(Nano Assay)을 사용하여 아질런트 바이오애널라이저(Agilent Bioanalyzer) 2100 모세관 전기영동에 의해 전체 RNA의 완전한 상태를 정성분석하였다. 마이크로RNA 프로파일링을 위한 샘플 적합성을, 전체 마이크로RNA 양의 대용 측정값으로서 1 또는 2개의 특허등록된 마이크로RNA에 대한 단일플렉스(singleplex) qRT-PCR에 의해 결정하였다.
miRNA 발현 프로파일링:
디스커버레이 (등록상표) miRNA 프로파일링 서비스 플랫폼
앰비온(Ambion)으로부터 주문 제작된 어피메트릭스 제네칩(AFFYMETRIX GENECHIP: 등록상표)을 생거(Sanger) miRBase로부터 유도된 miRNA 탐침자로 고안하였고[마르쿠스(Marcus) 등의 문헌 "J Clin Oncol. 26:4579-4586 (2008)"; 히데만(Hiddemann) 등의 문헌 "Blood 106:3725-3732 (2005)"]; http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml] 및 보고문[코이퍼(Coiffier) 등의 문헌 "N. EnglJ . Med. 346:235-242 (2002)"; 포기어(Feugier) 등의 문헌 "J Clin Oncol. 23(18):4117-4126 (2005)"; 및 할레크(Hallek) 등의 문헌 "Blood , ASH Annual Meeting Abstract, 112: 325 (2008)"; 및 로박(Robak) 등의 문헌 "Blood , ASH Annual Meeting Abstracts, 112:lba-l (2008)"]에 공개되었다. 항원 탐침자 서열을 어피메트릭스(등록상표)에 의해 제공하였고, 이하 기재된 바와 같이, 배경 신호를 추정하기 위해 어피메트릭스(등록상표) 인간 엑손 어레이 상에 사용되는 더 큰 대조군 세트로부터 유도체화되었다. 어레이 상의 다른 비-miRNA 대조 탐침자를 인간 게놈에 대한 서열 상동성이 결여되도록 고안하였고, 이는 스파이크-인(spike-in) 외부 참고 대조군을 위해 사용될 수 있다.
샘플 및 어레이 처리:
miRNA 프로파일링 연구를 위한 샘플을 어슈라겐 서비시스(Asuragen Services)(텍사스주 오스틴 소재)에 의해 회사의 표준 조작 절차에 따라서 처리하였다. 샘플 품질 관리(QC: quality control) 평가를 수행하여, 전체 RNA 샘플에서 RNA 분자의 3' 말단(샘플당 400ng의 총 RNA)을 회사 표준 프로토콜에 따라 비오틴으로 표지하였다. 20X 제네칩(GENECHIP: 등록상표) 진핵생물 하이브리화 대조군을 하이브리드화로부터 생략함을 제외하고, 하이브리드화, 세척, 염색, 영상화, 및 신호 추출을 어피메트릭스(등록상표)-추천된 절차에 따라 수행하였다.
신호 처리:
앰비온(Ambion) miRChip에 대해 시행되는 신호 처리는 탐침자 특이적 신호 검출 세포, 배경 추정값 및 보정값, 상수 변수 안정화(constant variance stabilization) 및 어레이 크기조정(scaling) 또는 전역적 정규화를 포함하는 다단계 공정이다[할레크 등의 문헌 "Blood , ASH Annual Meeting Abstract, 112: 325 (2008)"]. 각각의 탐침자에 대해, G-C-부합된 항-게놈성 대조군 1세트의 중앙 신호로부터 유도된 추정된 배경 값을 차감한다. 특정 분석 실험내의 어레이는 할레크 등의 문헌 "Blood , ASH Annual Meeting Abstracts, 114: Abstract 535 (2009)"에 기재된 변수 안정화 방법에 따라 함께 정규화된다. 검출 세포는 GC-함량 부합된 항-게놈성 탐침자로부터의 신호 분포에 비교된 miRNA 탐침자 신호의 윌콕손 순위합(Wilcoxon rank-sum)에 기초한다.
통계적 분석:
통계적 가설 시험을 위해, 동일한 변수임을 가정하여 2개의-샘플 t-시험을 적용하였다. 동일한 인자의 2개 초과의 그룹 또는 수준을 갖는 실험 고안을 위해 1-방식 ANOVA를 사용하였다. 이들 시험은 다음의 2개의 기준에 기초하여 어떤 탐침자가 차등적으로 발현되는 것으로 고려되는지를 규정한다: 0.001의 디폴트(default) p-값 및 log2 차이 > 1.
어피메트릭스 (등록상표) U133 플러스 2.0:
어피메트릭스(등록상표) 인간 U133 플러스 2.0 전체 게놈 올리고뉴클레오티드 어레이를 사용하여 유전자 발현 프로파일링을 수행하였다. 어피메트릭스(등록상표) 제네칩(등록상표) 어레이 스테이션(Array Station)(GCAS)을 사용하여 제조업체의 자동화된 프로토콜에 따라 RNA 샘플 표지를 수행하였다. 간단히, 비오틴화된 cRNA를 각 샘플로부터 총 0.5 ㎍의 RNA로 출발하여 생성하였다. 2-알파, 2-베타, 및 1-감마 헤모글로빈 유전자로 구성된 5개의 진 로직(Gene Logic)의 글로빈 감소 올리고의 22.5 μΜ 혼합물 2 ㎕를 전체 RNA 반응물에 첨가하였다. 글로빈 올리고머는 제1-가닥 cDNA 합성 동안 글로빈 mRNA로부터 생성된 글로빈 cDNA의 양을 크게 감소시키는 유전자-특이적 차단제이다. 로슈(Roche)는 젠로직(GeneLogic)(미국 매릴랜드주 게인터스버그 소재)으로부터 올리고머 서열을 구입하였다.
제네칩(등록상표) 어레이 시스템(GCAS) 로봇 상에서, 표적 표지 방법을 제네칩(등록상표) HT 원-사이클 표적 표지화 키트(One-Cycle Target Labeling kit) P/N 900686으로 수행하였다. 이어서 샘플을 제조업체 프로토콜에 따라서 염색하고, 세척하고, 어피메트릭스(등록상표) 어레이로 하이브리드화하였다. 샘플을 24개의 샘플 배치에서 하이브리드화하였다. 제네칩(등록상표) 스캐너(Scanner) 3000을 사용하여 어레이를 스캐닝하였다. 어피메트릭스(등록상표) 제네칩(등록상표) 조작 소프트웨어(GCOS)를 사용하여 원 신호(raw signal) 강도를 포착하였다. 마이크로어레이 스위트(Microarray Suite) 5.0(MAS5.0) 및 익스프레션 컨솔(Expression Console)을 기본 컴퓨터 분석을 위해 사용하였다.
탐침자 세트 신호로 탐침자 강도를 요약하는 RMA 알고리즘을 통해 추가의 통계적 분석을 수행하였다[이리자리(Irizarry) 등의 문헌 "Biostatistics 4(2): 249-264 (2003)"]. 탐침자 세트 신호 강도를 분위수-분위수(quantile-quantile) 방법에 의해 정규화하였다[볼스태드(Bolstad) 등의 문헌 "Bioinformatics 19: 185-193 (2003)"]. 모든 정규화된 데이터를 log2-변환하고, 이후 분석하여 고 발현 값의 영향을 하향-칭량하였다.
품질 관리의 표준 절차를 적용한 후(상기 이리자리 등의 문헌), 최종적으로 240개의 샘플을 통계 분석을 위해 선택하였다.
U133 플러스 2.0 마이크로어레이 상에 존재하는 잠재적인 54,675 탐침자 세트중, 41,256개의 탐침자 세트는 2개 이상의 샘플에 존재하고, 여기서 존재 요청(presence call)은 MAS5.0 알고리즘에 의해 규정된다[어피메트릭스(등록상표) 통계적 알고리즘 서술 문헌(Statistical Algorithms Description Document), 2002]. 통계적 분석은 존재하는 탐침자 세트 상에서 수행하였다.
총 RNA의 어피메트릭스(등록상표) 유전자 발현 프로파일링은 전체-전사 검정(WTA: Whole-Transcript Assay) 및 유전자/엑손(Gene/Exon) 1.0 ST 어레이를 사용하여 수행하였다.
mRNA 프로파일링 연구를 위한 샘플을 회사 표준 조작 절차에 따라 아슈라겐 인코포레이티드에 의해 처리하였다. 비오틴-표지된 센스 가닥 cDNA를, 변형된 어피메트릭스 제네칩(ENECHIP: 등록상표) 전체 전사물(Whole Transcript)(WT) 센스 표적 표지화 검정(어피메트릭스(등록상표), 인코포레이티드)을 사용하여 샘플당 1 ㎍의 전체 RNA로부터 제조하였다. 중간 cRNA 및 생성 cDNA 수율을 분광광도계로 정량화하였다. cDNA의 단편화 및 표지화를 엑손 검정을 위해 5 μg을 사용하여 수행하였다. 어레이로의 하이브리드화를 어피메트릭스(등록상표) 모델 640 하이브리드화 오븐에서 45℃에서 16 시간 동안 실행하였다. 어레이를 세척하고 어피메트릭스(등록상표) FS450 플루이딕스(Fluidics) 스테이션 상에서 염색하였다. 어피메트릭스(등록상표) 제네칩(등록상표) 스캐너 3000 7G 상에서 어레이를 스캐닝하였다. 스캐닝된 모든 어레이를 위해, .DAT, .CEL, .jpg, 및 .xml 플랫 파일이 제공된다. 게다가, RMA 정규화된 데이터를, 핵심 데이터세트 및 상응하는 QC 정보[이는 곡선하 면적(AUC: Area Under the Curve) 및 폴리 A 스파이크(spike)를 비롯한 측정지표를 포획함]를 위해 제공된다.
qRT - PCR 역 전사, 증폭, 및 분석, 역전사 및 PCR 증폭:
스톡(Stock) ABI 타크만(Taqman) miRNA 검정, PCR 매스터 믹스(master mix), 및 역 전사(RT) 성분을 사용하였다. 4 ㎕ 부피중 1 ng의 총 RNA를 각각의 검정의 각각의 복제물을 위해 10 ㎕의 총 반응 부피에서 역 전사시킨다. 3 ㎕의 RT 생성물을 각각 15 ㎕의 타크만 PCR 증폭으로 전방으로 수행한다. 모든 증폭을 인증된 ABI 7900HT 실시간 열순환기 상에서 수행한다. 공지된 복사 수의 합성 miRNA는 각각의 검정 세트를 위해 양성 대조군으로서 포함된다. 각각의 복제물 세트로부터의 평균 Ct 값을 효모 tRNA에 희석된 공지된 복사 수의 합성 RNA로부터 유도된 독립적으로 발생된 표준 곡선에 비교한다. 표준 곡선을 500 내지 50,000,000개의 복사물/반응 사이의 합성 RNA 주형에 대해 생성한다. R∧2 값을 각각의 표준 곡선에 대해 보고한다.
PTK2에 대한 결과를, 대조 유전자로서 UBC를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 ABI 키트를 사용하여 qRT-PCR에 의해 확인하였다.
miRNA151 3p 및 miRNA409 3p에 대한 결과를, 제조업체의 프로토콜에 따라 ABI 키트를 사용하여 qRT-PCR 기술에 의해 확인하였다. miRNA151 3p 및 miRNA409 3p의 발현 수준을, 보편적으로 높은 발현 수준을 나타낸 대조 유전자 miRNA 150 및 miRNA 26에 비교하여 분석하였다.
통계적 분석
임상 데이터
예비처리 임상 특징, 즉 인구통계자료, 예후적 지표(del(17p), del(11q), ZAP70 및 CD38 발현, IgVH 상태와 같은 세포유전학적 일탈), 무진행 생존율(PFS)은 피셔(Fisher)의 정확도 시험, 만-휘트니(Mann-Whiteny) 시험, 또는 로그-순위 시험을 사용하여 비교되었다. 0.05 미만의 p-값이 통계적으로 유의한 것으로 고려되었다.
콕스(Cox) 회귀 모델링 및 시험
콕스 회귀 모델을 사용하는 2가지 접근법을 사용하여 생존과 연관된 유전자 및 miRNA를 식별하였다. 제1 접근법은 하기 모델을 고려하였다.
모델 A
hi(t)=exp(β1Tx+β2RNA)h0(t)
모델 B
hi(t)=exp(β1Tx+β2연령+β3비넷(Binet)+β4IgVH+β5 Del17p+β6 Del11q+β7RNA)h0(t)
여기서,
● hi(t)는 개별 i의 위험 함수이다.
● ho(t)는 기선 위험 함수이다.
● βi는 하기 설명적 변수의 계수이다.
o 연령, 비넷, IgVH, Del17p, del11q 및 Tx(이는 각각 연령, 비넷 단계, IgVH, Del17p 및 del11q 돌연변이 상태 및 치료 군을 코드화 함)
o 탐침자 세트 신호 강도를 나타내는 RNA(log-2 변형됨)
두 모델의 경우, 귀무 가설은 탐침자 세트 강도 신호 및 생존간에 상관성이 없다는 것이다.
제2 접근법은 하기 2가지 모델(C 및 D)을 사용하여, 로그-유사 비율 시험[LRT(log-Likelihood ratio) 시험]에 의해 이들을 비교하였다. 나머지에 비교된 한 치료군에서 더 나은 생존에 대해 예측하는 기선에서의 탐침자 세트 신호의 가능한 능력이 흥미로우므로, 본 발명자들은 모델 B에 탐침자 세트 신호 강도 및 치료 인자와 탐침자 세트 신호 강도의 상호작용 둘다를 포함시켰다.
모델 C
hi(t)=exp(β1Tx+β2연령+β3비넷 단계+β4IgVH+β5 Del17p)h0(t)
모델 D
hi(t)=exp(β1Tx+β2연령+β3비넷 단계+β4IgVH+β5 Del17p+β6RNA+β7Tx:RNA)h0(t)
귀무 가설은 탐침자 세트 강도 및 생존 사이에 상관성이 없다는 것이고, 대안의 가설은 두 치료군 사이의 이러한 상관성 및 차별성이 존재한다는 것이다.
2가지 시험(왈드 및 LRT)은 제시된 바와 같이 확인된 각각의 탐침자 세트에 대해 수행되었다. 수행된 다수의 시험에 기인하여, FDR(false discovery rate)에 기초한 다중 시험 절차[스토레이(Storey) 등의 문헌 "Proceedings of the National Academy of Sciences 100:9440-9445 (2003)"]를, 왈드 및 로그-유사 비율 시험 둘다에 의해 차등적으로 표현된 바와 같이 잘못 식별된 유전자(또는 miRNA)의 예측된 비율을 조절하기 위해 적용하였다. 유의적인 차이를 만들도록 10%의 FDR을 선택하였다.
중앙 PFS가 컴퓨터처리된 이러한 자료에 나타난 상이한 표 및 그래프의 경우, 컷오프로 중앙값을 사용하여 mRNA 및 miRNA 신호 강도를 분기시켰다.
miRNA 항-상관관계 및 3' UTR 루시퍼라아제 ( luciferase ) 검정
예측된 표적을 타겟스캔(TARGETSCAN) 5.1(상표)로부터 다운로드하고(http://www.targetscan.org/), 예측된 부위 보존과 무관하게, mRNA 발현 프로파일링 데이터로부터 발현을 추출하였다. miRNA 어레이 및 mRNA 어레이 데이터를 비교하고, 피어슨(Pearson) 상관관계 계수를 컴퓨터처리하여 miRNA와의 반-상관관계(anti-correlation)를 결정하였다. 유의적으로 반-상관관계된 표적들을 0.01 미만의 q-값에 의해 결정하였다. 후속적으로, 상기 역치를 충족하는 3'UTR을 3'UTR 루시퍼라아제 리포터 작성물[스위치기어 제노믹스(Switchgear Genomics)]내로 상류 클로닝하였고, 100 ng의 각각의 작성물을 96웰 플레이트에서 25 ng의 pRL-CMV, 10 nM miRNA151 3p 유사체[드하르마콘(Dharmacon)] 또는 스크램블된 유사체를 갖는 HeLa 세포(ATCC)로 형질감염시켰다. 루시퍼라아제 활성을 형질감염후 24시간째 결정하였고, 모든 데이터를 레닐라(renilla) 루시퍼라아제 형질감염 대조군 및 스크램블된 대조군 유사체로 정규화하였다. 3가지 생물학적 복제를 수행하였다. 스크램블된 대조군과 miRNA151 3p 유사체 사이의 차이에 대한 통계적 유의성을 2-측면 스튜던트의 t-시험으로 결정하였다.
결과
마이크로 RNA 데이터:
디스커버레이(등록상표) 마이크로RNA 플랫폼을 사용하여 miRNA151 3p 및 miRNA409 3p는 리툭시맵 기제 치료법에서 PFS를 위한 유의적인 예측 miRNA로서 나타났다(도 1a, 1b 및 2a, 2b, 표1, 2A, 2B).
qRT-PCR에 의한 어레이 데이터의 유효성은 miRNA151 3p 및 miRNA409 3p의 예측 유의성을 확인하였다(도 2a 및 2b, 표 1, 2A, 2B).
독립적인 예측적 유의성은, 연구 통계집단에서 예후적 유의성을 입증하는 예비치료 인자를 포함한 공동 다변수 모델(joint multivariate model)에 둘다 혼입할 경우 유지되었다(치료 FC 대 FCR, 연령, 비넷 단계, IgVH 돌연변이 상태, del(17p)).
치료: miRNA151 3p 상호작용: HR 1.09(1.01-1.17), p=0.021.
치료: miRNA409 3p 상호작용: HR 1.09(1.1-1.18), p=0.047.
동일한 모델에서 miRNA151 3p 및 miRNA409 3p의 조합은 추가의 예측적 유의성을 나타내지 않았다.
[표 1]
치료 및 miRNA151 3p, miRNA409 3p 발현에 관한 중앙 PFS
Figure pct00003
[표 2A]
CLL의 항-CD20-기제 치료법에서 PFS에 대한 miRNA151 3p의 예측적 유의성
Figure pct00004
[표 2B]
CLL의 항-CD20-기제 치료법에서 PFS에 대한 miRNA409 3p의 예측적 유의성
Figure pct00005
도 1a에 제시된 바와같이, miRNA151 3p의 중앙 발현 수준에 비해 더 높은 발현 수준의 환자는 FCR(n=75, 사례: 26, 중앙 PFS 도달되지 않음)로 치료된 경우 FC에 비해(n=76, 사례: 47, 중앙 PFS: 18.5 개월; p=0.0019) 유의적으로 더 긴 PFS를 가졌다. FCR로 처리된 환자는 초기 miRNA151 3p 수준이 중앙값보다 더 높은 경우(n=75, 사례: 26, 중앙 PFS는 도달되지 않음)가 miRNA151 3p의 중앙 발현 수준보다 더 낮은 경우(n=74, 사례: 41, 중앙 PFS 24 개월; p=0.005)에 비해 유의적으로 더 긴 PFS를 가졌다. miRNA151 3p 발현 수준과 무관하게 FC로 치료된 환자에서 PFS의 차이는 관찰되지 않았다(p=0.96). 치료법과 무관하게 중앙 miRNA151 3p 보다 낮은 발현자에서 PFS의 차이는 관찰되지 않았다(p=0.92).
도 1b에 제시된 바와 같이, miRNA151 3p의 중앙 발현 수준에 비해 더 높은 발현 수준의 환자는 FCR로 치료된 경우(n=71, 사례: 25, 중앙 PFS 도달되지 않음) FC에 비해(n=69, 사례: 41, 중앙 PFS: 20.7 개월; p=0.0027) 유의적으로 더 긴 PFS를 가졌다. FCR로 치료된 환자는 초기 miRNA151 3p 수준이 중앙값에 비해 더 높은 경우(n=71, 사례: 25, 중앙 PFS 도달되지 않음)가 miRNA151 3p의 중앙 발현 수준에 비해 더 낮은 경우(n=66, 사례: 36, 중앙 PFS 23.9 개월; p=0.0049)에 비해 유의적으로 더 긴 PFS를 가졌다. miRNA151 3p 발현 수준과 무관하게 FC로 치료된 환자에서 PFS의 차이는 관찰되지 않았다(p=0.43). 치료법과 무관하게 중앙 miRNA151 3p 보다 낮은 발현자에서 PFS의 차이는 관찰되지 않았다(p=0.55).
도 2a는 miRNA409 3p의 중앙 발현 수준 보다 더 높은 발현 수준의 환자가 FCR로 치료된 경우(n=75, 사례: 27, 중앙 PFS 도달되지 않음) FC에 비해(n=76, 사례: 43, 중앙 PFS: 18 개월; p=0.00098) 유의적으로 더 긴 PFS를 가졌음을 보여준다. FCR로 치료된 환자는 초기 miRNA409 3p 수준이 중앙값 보다 더 높을 경우(n=75, 사례: 27, 중앙 PFS 도달되지 않음)가 miRNA409 3p의 중앙 발현 수준에 비해 더 낮은 경우(n=74, 사례: 40, 중앙 PFS 24 개월; p=0.0052)에 비해 유의적으로 더 긴 PFS를 가졌다. miRNA409 3p 발현 수준과 무관하게 FC로 치료된 환자에서 PFS의 차이는 관찰되지 않았다(p=0.6). 치료법과 무관하게 중앙 miRNA409 3p 보다 낮은 발현자에서 PFS의 차이는 관찰되지 않았다(p=0.98).
도 2b는 miRNA409 3p의 중앙 발현 수준 보다 더 높은 발현 수준의 환자가 FCR로 치료된 경우(n=64, 사례: 20, 중앙 PFS 도달되지 않음) FC에 비해(n=76, 사례: 43, 중앙 PFS: 18.3 개월; p=0.0028) 유의적으로 더 긴 PFS를 가졌음을 보여준다. FCR로 치료된 환자는 초기 miRNA409 3p 수준이 중앙값 보다 더 높을 경우(n=64, 사례: 20, 중앙 PFS 도달되지 않음)가 miRNA409 3p의 중앙 발현 수준에 비해 더 낮은 경우(n=73, 사례: 41, 중앙 PFS 26.2 개월; p=0.025)에 비해 유의적으로 더 긴 PFS를 가졌다. miRNA409 3p 발현 수준과 무관하게 FC로 치료된 환자에서 PFS의 차이는 관찰되지 않았다(p=0.88). 치료법과 무관하게 중앙 miRNA409 3p 보다 낮은 발현자에서 PFS의 차이는 관찰되지 않았다(p=0.35).
mRNA 데이터:
어피메트릭스 엑손 1.0 ST 및 U 133 플러스 2.0(등록상표) 마이크로어레이 플랫폼(platform)을 사용하여, PTK2는 리툭시맵-기제 치료법에서 PFS를 위한 유의적인 예측적 차등 발현된 유전자로서 나타났다(도 3 및 4; 표 3 및 4 참조). PTK2는 예후적 인자를 포함하는 다변수 분석에서 무진행 생존율과 연관된다(치료 FC 대 FCR, 연령, 비넷 단계, IgVH 돌연변이 상태, del(17p)). 왈드 시험은 다수의 시험에 대해 보정된 후 유의적인 것으로 유지되었다(P-값=1.5×10-4 - q-값<0.1)
qRT-PCR에 의한 어레이 데이터의 유효성은 PTK2의 예측적 유의성을 확인하였다 (도 5; 표 3 및 4).
더군다나 miRNA151은 염색체 8 상의 PTK2에 인트론성이고, 아마도 동시-발현되고, 이들 발현 수준 사이의 상관관계는 매우 높다(피어슨 상관관계 계수=0.84).
[표 3]
어피메트릭스(등록상표) 어레이 플랫폼에 따른 CD19+ 세포에서의 PTK2 발현 및 치료에 관한 중앙 PFS(개월)
Figure pct00006
[표 4]
어피메트릭스(등록상표) 어레이 플랫폼에 따른 치료(FC 대 FCR)에 관한 CD19+ 세포에서의 PTK2 발현의 예측적 유의성
Figure pct00007

도 3은 PTK2의 중앙 발현 수준 보다 더 높은 발현 수준의 환자가 FCR로 치료된 경우(n=81, 사례: 28, 중앙 PFS 도달되지 않음) FC에 비해(n=69, 사례: 42, 중앙 PFS: 21.5 개월; p=0.0031) 유의적으로 더 긴 PFS를 가졌음을 보여준다. FCR로 치료된 환자는 초기 PTK2 발현 수준이 중앙값 보다 더 높은 경우(n=81, 사례: 28, 중앙 PFS 도달되지 않음)가 PTK2의 중앙 발현 수준에 비해 더 낮은 경우(n=71, 사례: 42, 중앙 PFS 20 개월; p=0.0016)에 비해 유의적으로 더 긴 PFS를 가졌다. PTK2 발현 수준과 무관하게 FC로 치료된 환자에서 PFS의 차이는 관찰되지 않았다(p=0.48). 치료법과 무관하게 중앙 PTK2 보다 낮은 발현자에서 PFS의 차이는 관찰되지 않았다(p=0.79).
도 4는 PTK2의 중앙 발현 수준 보다 더 높은 발현 수준의 환자가 FCR로 치료된 경우(n=67, 사례: 25, 중앙 PFS 42.4 개월) FC에 비해(n=52, 사례: 34, 중앙 PFS: 21.5 개월; p=0.011) 유의적으로 더 긴 PFS를 가졌음을 보여준다. FCR로 치료된 환자는 초기 PTK2 발현 수준이 중앙값 보다 더 높은 경우(n=67, 사례: 25, 중앙 PFS 42.4 개월)가 PTK2의 중앙 발현 수준에 비해 더 낮은 경우(n=55, 사례: 31, 중앙 PFS 20 개월; p=0.027)에 비해 유의적으로 더 긴 PFS를 가졌다. PTK2 발현 수준과 무관하게 FC로 치료된 환자에서 PFS의 차이는 관찰되지 않았다(p=0.53). 치료법과 무관하게 중앙 PTK2 보다 낮은 발현자에서 PFS의 차이는 관찰되지 않았다(p=0.46).
도 5는 PTK2의 중앙 발현 수준 보다 더 높은 발현 수준의 환자가 FCR로 치료된 경우(n=71, 사례: 23, 중앙 PFS 도달되지 않음) FC에 비해(n=65, 사례: 39, 중앙 PFS: 21.5 개월; p=0.0059) 유의적으로 더 긴 PFS를 가졌음을 보여준다. FCR로 치료된 환자는 초기 PTK2 발현 수준이 중앙값 보다 더 높은 경우(n=71, 사례: 23, 중앙 PFS 도달되지 않음) PTK2의 중앙 발현 수준에 비해 더 낮은 경우(n=63, 사례: 36, 중앙 PFS 20 개월; p=0.0049)에 비해 유의적으로 더 긴 PFS를 가졌다. PTK2 발현 수준과 무관하게 FC로 치료된 환자에서 PFS의 차이는 관찰되지 않았다(p=0.25). 치료법과 무관하게 중앙 PTK2 보다 낮은 발현자에서 PFS의 차이는 관찰되지 않았다(p=0.37).
miRNA151 3p의 변경된 발현 수준의 잠재적인 생물학적 결과를 평가하기 위해, 이들 miRNA의 발현을 3'UTR내에서 보존되거나 보존되지 않은 이들의 예측된 표적 유전자의 mRNA 발현과 관련시켰는데, 이는 miRNA가 mRNA 분해 수준에서 이들의 효과를 부과하는 것으로 우선적으로 고려되기 때문이다[구오(Guo) 등의 문헌 "Nature 466(7308):835-40 (2010)"].
표적 상관관계 계수를 결정하였고, 1214개 표적중 단지 23개의 예측된 표적이 miRNA151 3p와 음성적으로 관련되었다(PCC<-0.2, q-값<0.01). 이들 예측된 표적중 어느 것이 참된 표적인지를 입증하기 위해, miRNA151 3p의 유사체 또는 스크램블된 대조군을 HeLa 세포에서 발현시켰고, 24시간 후 각각의 유전자의 3 'UTR을 포함하는 루시퍼라아제 리포터 작성물의 발현을 저해하는 이들의 능력에 대해 평가하였다(도 6). 23개의 예측된 3'UTR중 18개는 적절한 벡터내로 하위클로닝될 수 있었다. 특히, 18개중 단지 5개(28%)의 3'UTR은 miRNA151 3p의 도입시 루시퍼라아제 활성에서 통계적으로 유의적인 감소를 나타내었다. 이들 결과는, miRNA151 3p가 FCR에 대한 반응을 조율할 수 있는 특정 생물학적 반응을 중개하는 선택적 조절 표적임을 암시한다. 더군다나, 이들 표적중 하나인 PIK3R3의 더 낮은 mRNA 발현은 R-FC 결과와 양성적으로 관련되었다(p=0.03, 도 7 및 8a 내지 c).
결론
본 연구의 목표는 항-CD20 항체-기제 치료법으로 치료된 CLL 환자의 결과를 예측하는 생체지표를 발견하는 것이었다. 본원에서 데이터는 miRNA151 3p 및 miRNA409 3p의 상승된 발현 수준(중앙값 초과) 뿐만 아니라 PTK2의 상승된 유전자 발현 수준(중앙값 초과)이 항-CD20-기제 치료법으로 치료된 CLL 환자에서의 연장된 PFS와 연관됨을 최초로 밝혀내었다. 마이크로어레이 플랫폼으로부터 밝혀진 사항은 qRT-PCR에 의해 입증되었다. 게다가, 예측적 유의성은 질환의 예후에 영향을 주는 것으로 공지된 인자를 사용하는 다변수 분석에서 유지되었다.
결론적으로, 본원에서 데이터는 항-CD20 항체-기제 치료법에 대한 CLL 환자의 이점 및 결과를 치료전에 예측하는 실행성을 입증하였다. miRNA151 3p 및 409 3p의 진단적 평가 및 PTK2의 mRNA 발현은 CLL 환자를 위한 가장 적절한 치료법을 선택하기 위한 유용한 도구로 작용한다. 더군다나, miRNA151 3p의 확인된 표적인 PIK3R3의 더 낮은 발현은 항-CD20 항체 결과와 양성적으로 연관되었다.
앞서 발명이 이해의 명확성을 위해 예시 및 실례로 상세히 기재되었지만, 상세한 설명 및 실시예는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 명백히 전체가 참고로 인용된다.
<110> F.Hoffmann-La Roche AG <120> CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA (CLL) BIOMARKERS <130> P4456R1-WO <140> PCT/US2011/046205 <141> 2011-08-02 <150> US 61/370,403 <151> 2010-08-03 <150> US 61/440,162 <151> 2011-02-07 <160> 2 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 cuagacugaa gcuccuugag g 21 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 gaauguugcu cggugaaccc cu 22

Claims (38)

  1. 만성 림프구성 백혈병(CLL: chronic lymphocytic leukemia)을 앓는 환자에서 miRNA151 3p, miRNA409 3p, 및 PTK2로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 생체지표의 양이 상승되었을 경우 CLL 약제를 치료 효과량으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, CLL을 앓는 환자를 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    만성 림프구성 백혈병(CLL) 약제가 FAK 신호전달 또는 동형 부착(homotypic adhesion)을 유도하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    만성 림프구성 백혈병(CLL) 약제가 B-세포 길항물질인 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    만성 림프구성 백혈병(CLL) 약제가 항-CD20 항체인 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    항-CD20 항체가 인간화된 항-CD20 항체, 인간 항-CD20 항체, 또는 키메라성(chimeric) 항-CD20 항체인 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    항-CD20 항체가 리툭시맵(rituximab), 오파투뮤맵(ofatumumab), GA101, SBI-087, 벨투추맵(veltuzumab), 및 AME-133으로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    항-CD20 항체가 리툭시맵인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서,
    환자가, 생체지표의 양이 상승되지 않은 환자에 비해 더 큰 무진행 생존율(PFS: Progression Free Survival)을 갖는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서,
    화학치료제를 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    화학치료제가 사이클로포스파미드 및 플루다라빈(fludarabine)을 포함하는 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    환자에서 miRNA151 3p의 양이 상승된 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    환자에서 miRNA409 3p의 양이 상승된 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    환자에서 PTK2의 양이 상승된 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    생체지표의 양을 유전자 발현 프로파일링(profiling)에 의해 평가하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    유전자 발현 프로파일링이 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR: polymerase chain reaction)을 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    PCR이 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR: quantitive Real Time PCR)을 포함하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항중 어느 한 항에 있어서,
    생체지표의 발현에 대해 환자로부터의 샘플을 시험하는 단계를 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    샘플이 말초 혈액 단핵 세포(PBMC: Peripheral Blood Mononuclear Cell)를 포함하는 방법.
  19. 만성 림프구성 백혈병(CLL)을 앓는 환자에서 miRNA151 3p, miRNA409 3p, 및 PTK2로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 생체지표의 양이 상승되었을 경우 치료 효과량의 리툭시맵, 플루다라빈 및 사이클로포스파미드의 조합물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, CLL을 앓는 환자를 치료하는 방법.
  20. 만성 림프구성 백혈병(CLL)을 앓는 환자에서 miRNA151 3p, miRNA409 3p, 및 PTK2로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 생체지표의 양이 감소되었을 경우 리툭시맵 이외의 CLL 약제를 치료 효과량으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, CLL을 앓는 환자를 치료하는 방법.
  21. 만성 림프구성 백혈병(CLL)을 앓는 환자로부터의 샘플에서 miRNA151 3p, miRNA409 3p, PTK2, 및 PI3K로 구성된 군에서 선택된 생체지표의 발현을 결정하는 단계, 및 생체지표의 발현 수준에 기초하여 CLL 약제를 선택하는 단계를 포함하는, CLL을 앓는 환자를 위한 치료법을 선택하는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    암 샘플이 생체지표를 상승된 수준으로 발현할 경우, 환자를 CLL 약제로 치료하도록 선택하는 방법.
  23. 제21항에 있어서,
    CLL 약제가 FAK 신호전달 또는 동종 부착을 유도하는 방법.
  24. 제21항에 있어서,
    CLL 약제가 B-세포 길항물질인 방법.
  25. 제21항에 있어서,
    CLL 약제가 항-CD20 항체인 방법.
  26. 제21항에 있어서,
    암 샘플이 생체지표를 감소된 수준으로 발현할 경우, 환자를 리툭시맵 이외의 CLL 약제로 치료하도록 선택하는 방법.
  27. 만성 림프구성 백혈병(CLL) 환자로부터의 샘플에서 miRNA151 3p, miRNA409 3p, PTK2, 및 PI3K로 구성된 군에서 선택된 생체지표의 발현을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함하는 진단 키트.
  28. 제27항에 있어서,
    CLL 환자를 치료하기 위해 CLL 약제를 선택하도록 키트를 사용하라는 설명서를 추가로 포함하는 진단 키트.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서,
    하나 이상의 시약이 한 쌍의 DNA 프라이머 및 생체지표 검출용 탐침자를 포함하는 진단 키트.
  30. 약학적으로 허용가능한 담체중의 만성 림프구성 백혈병(CLL) 약제, 및 이러한 CLL 약제가 miRNA151 3p, miRNA409 3p, PTK2, 및 PI3K로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 생체지표의 발현에 기초하여 CLL을 앓는 환자를 치료하기 위한 것임을 지시하는 포장 삽입물을 함께 포장된 채로 포함하는 제품.
  31. 만성 림프구성 백혈병(CLL) 약제를 포함하는 약학 조성물, 및 이러한 약학 조성물이 miRNA151 3p, miRNA409 3p, PTK2, 및 PI3K로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 생체지표의 발현에 기초하여 CLL을 앓는 환자를 치료하기 위한 것임을 지시하는 포장 삽입물을 포장물에서 조합하는 단계를 포함하는 제품의 제조 방법.
  32. miRNA151 3p, miRNA409 3p, PTK2, 및 PI3K로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 생체지표의 발현에 기초하여 만성 림프구성 백혈병(CLL)을 앓는 환자를 치료하는 약제의 용도를 표적 청중에게 홍보하는 단계를 포함하는, CLL 약제를 광고하는 방법.
  33. 만성 림프구성 백혈병(CLL)을 앓는 환자에서 PI3K 생체지표가 감소되었을 경우 환자에게 CLL 약제를 치료 효과량으로 투여하는 단계를 포함하는, CLL을 앓는 환자를 치료하는 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    PI3K 생체지표가 PIK3R3을 포함하는 방법.
  35. 만성 림프구성 백혈병(CLL)을 앓는 환자에서 PI3K 생체지표가 감소되었을 경우 환자에게 치료 효과량의 리툭시맵, 플루다라빈 및 사이클로포스파미드의 조합물을 투여하는 단계를 포함하는, CLL을 앓는 환자를 치료하는 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    PI3K 생체지표가 PIK3R3을 포함하는 방법.
  37. 만성 림프구성 백혈병(CLL)을 앓는 환자에서 PI3K 생체지표가 상승되었을 경우 환자에게 리툭시맵 이외의 CLL 약제를 치료 효과량으로 투여하는 단계를 포함하는, CLL을 앓는 환자를 치료하는 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    PI3K 생체지표가 PIK3R3을 포함하는 방법.



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