KR20080031001A - Ｃｄ20에 대한 항체 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항원 CD20에 직접 결합하는 항체 및 상기 항체의 용도에 관한 것이다. 특히, 완전한 인간 단클론 항체는 항원 CD20에 직접 결합한다. 중쇄와 경쇄 면역글로블린 분자, 특히 프레임웍 부위(framework site) 및/또는 상보성 결정부위(complementarity determining regions, CDRs), 특히, FR1 에서 FR4 또는 CDR1 에서 CDR3에 걸친 연속된 중쇄와 경쇄 서열에 상응하는 서열을 포함하는 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 개시된다. 또한, 이러한 단클론 항체 및 면역글로블린 분자를 발현하는 하이브리도마 또는 다른 세포주가 개시된다.

항 CD20 단클론 항체, 항체 의존성 세포독성, 보체 의존성 세포독성

Description

ＣＤ20에 대한 항체 및 그의 용도{Antibodies Directed to CD20 and Uses Thereof}

본 출원은 본 명세서에 참조문헌으로 포함된 2005년 6월 2일자 미합중국 가특허출원 제 60/686,992호에 대한 35 U.S.C §119에 따른 우선권을 주장한다.

본 발명은 CD20에 대한 단클론 항체 및 그의 용도에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 CD20에 대한 완전한 인간 단클론 항체 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 여러 측면들은 이러한 항체들을 발현하는 하이브리도마 또는 다른 세포주들에 관련이 있다. 상기 항체는 CD20+ 세포의 활성 및/또는 존재 및/또는, CD20의 과발현 및/또는 활성과 관련된 질병의 진단 및 치료에 유용하다.

CD20은 298개 아미노산을 가지는 33,000MW의 당인산단백질(glyco-phosphoprotein)이다. 인간의 CD20 유전자는 1653개의 염기쌍을 포함한다. 5'비해독부위(untranslated region, UTR)는 147개의 염기쌍을 포함한다. 암호화 서열은 893개 염기쌍을 포함하는 반면, 3'비해독부위는 613개 염기쌍을 포함한다.

CD20은 B 림프구 계통(B lymphocyte lineage)의 정상 및 종양세포의 표면에 서만 높은 농도로 발현되고, B 세포가 활성화되는 동안에는 수용체로서 기능한다고 추측된다. 간세포(stem cell)나 B 세포 전구세포(progenitor)에는 외관상으로 CD20 항원이 결핍되어 있다. CD20은 아미노산 서열로 예측된 바로, 세포질(cytoplasm) 내에 존재하는 단백질의 아미노 말단(amino terminal)과 카복시 말단(carboxy terminal)을 가지는, 4개의 막투과영역(membrane spanning domain)을 포함하는 소수성이 매우 높은 단백질이다. 짧은 친수성 부위는 142 내지 185 잔기(residue)에 위치하며, 세포 표면에 노출될 수 있다.

33, 35 및 37 kDa의 분자량을 가지는 인간 CD20의 3개 동형(isoform)은 하나의 단백질에 대한 차별적인 인산화(differential phosphorylation)의 결과이다. CD20은 공지된 다른 단백질과의 상동성(homology)이 없으며, 막투과부위(transmembrane region)에서 높은 유사성(similarity)을 가져, 인간과 마우스 서열 사이에서 73%의 상동성을 갖는다.

CD20은 특히 C 말단 src 키나제 결합 단백질(C-terminal src kinase-binding protein, Cbp), CD40 및 주조직 적합복합체 제 Ⅱ 단백질(major histocompatibility complex Class II protein, MHC Ⅱ) 등의 다른 단백질들과 밀접하게 관련되어 있다. 몇몇 경우에, CD20에 결합하는 항체는 물질이 지질대(lipid raft)로 빨리 수송(translocation)되도록 한다고 알려져 있다.

몇몇 회사에서는 현재 CD20 단백질을 표적으로 하는 치료제를 판매한다. 리투잔^®(Rituxan^®, Rituximab)(Genentech, South San Francisco, CA), 토시투모맙 ^®(Tositumomab^®, GlaxoSmithKline, Brentford, Middlesex, United Kingdom) 및 휴맥스-CD20(HuMax-CD20, Genmab, Copenhagen, Denmark)은 CD20 단백질을 표적으로 하는 치료용 단클론 항체 치료제이다.

발명의 요약

본 발명의 실시태양은 CD20에 특이적으로 결합하고 CD20을 발현하는 세포의 성장을 억제하는 것을 특징으로 하는 표적 결합제에 관련이 있다. 이것이 가능한 기작은, CD20이 발현된 세포의 세포자살 유도, CD20이 발현된 세포에 항체 의존성 세포독성(antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC) 유도 또는 보체 의존성 세포독성(complement dependent cytotoxicity, CDC) 유도 등에 의한 CD20+의 림프종 세포, CD20+의 백혈병 세포 및 정상 B 세포를 포함하는 CD20을 가지는 B 세포의 제거를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시태양에 따르면, 표적 결합제는 CD20과 결합하고 CD20을 발현하는 세포의 세포자살을 유도하는 완전한 인간항체이다. 본 발명의 다른 실시태양은 CD20과 결합하여 CD20을 발현하는 세포에 항체 의존성 세포독성을 유도하는 완전한 인간 단클론 항체이다. 본 발명의 또 다른 실시태양은 CD20에 결합하여 CD20을 발현하는 세포에 보체 의존성 세포독성을 유도하는 완전한 인간 단클론 항체이다.

본 발명의 일부 실시태양에 따르면, 항체는 CD20에 결합하여, 라모스 세포(Ramos cell)를 이용한 표준 CellTiterGlo 생존율 분석에서 약 0.5㎍/ml 미만의 EC₅₀으로 CD20을 발현하는 세포의 세포자살을 유도한다. 본 발명의 실시태양에 따르면, 항체 또는 항체에서 항원에 결합하는 일부분은 라모스 세포를 이용한 표준 CellTiterGlo 생존율 분석에서 B 세포의 세포자살을 유도하기 위하여, 약 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05, 0.04, 0.03 또는 0.02㎍/ml 미만의 EC₅₀을 갖는다. 본 발명의 일부 실시태양에 따르면, 상기 항체 또는 항체에서 항원에 결합하는 일부분은 CD20에 결합하고, 라모스 세포를 이용한 표준 알라마 블루(Alamar Blue) 생존율 분석에서 약 0.2㎍/ml 미만의 EC₅₀ 값으로 CD20을 발현하는 세포의 세포자살을 유도한다. 본 발명의 실시태양에 따르면, 상기 항체 또는 항체에서 항원에 결합하는 일부분은 라모스 세포를 이용한 알라마 블루 생존율 분석에서 약 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05 또는 0.04㎍/ml 미만의 EC₅₀값을 갖는다.

본 발명의 또 다른 실시태양은 본 명세서에 개시된 표적 결합제 또는 항체와 결합하기 위하여 경쟁하는 항체이다.

본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 항체는 12nM이하의 Kd값으로 CD20과 결합한다. 또 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 상기 항체는 10nM, 9nM, 8nM, 7nM, 6nM, 5nM, 4nM, 3nM, 2nM 또는 1nM 미만의 Kd값으로 결합한다. 본 발명의 실시태양에 따르면, 상기 항체는 500pM, 100pM, 30pM, 20pM, 10pM 또는 5pM의 Kd값으로 결합한다. 상기의 친화도(affinity) 및/또는 결합력(avidity)은 FMAT, FACS, KinExA^® 및/또는 BIACORE^®를 이용하여 측정할 수 있다.

본 발명의 실시태양에 따르면, 상기 항체는 표 8에 개시된 서열 중 하나의 상보성 결정부위(complementarity determining region, CDR) 서열을 가지는 중쇄(heavy chain) 아미노산 서열을 포함한다. 당업자의 일반적인 기술로 CDR을 용이하게 결정할 수 있다(참조: Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제 5판, NIH Publication, 91-3242, Bethesda, MD(1991), vol. 1-3). 본 발명의 일 실시태양은 CD20에 결합하고, GYSFTSYWIG(서열번호 201)의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 상보성 결정부위 1을 포함하는 표적 결합제이다.

본 발명의 또 다른 실시태양은 CD20에 결합하고, 표 9에 개시된 서열 중 하나를 포함하는 상보성 결정부위를 가지는 경쇄(light chain) 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 본 발명의 일부 실시태양에 따르면, 상기 항체는 완전한 인간 단클론 항체이다. 따라서, 일 실시태양은 CD20에 결합하고, KISNRFS(서열번호 202)의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 상보성 결정부위 2를 포함하는 표적 결합제이다.

본 발명의 추가적 실시태양은 CD20에 결합하고, 표 8에 개시된 상보성 결정부위 서열 중 하나를 가지는 중쇄 아미노산 서열과 표 9에 개시된 상보성 결정부위 서열 중 하나를 가지는 경쇄 아미노산 서열로 구성된 항체이다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 항체는 완전한 인간 단클론 항체이다. 몇몇의 실시태양에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 항체 중 어느 하나와 같은 에피토프(epitope)와 결합하는 항체를 제공한다.

본 발명의 일부 실시태양에 따르면, 단클론 항체 또는 상기 항체의 항원 결합부위가 제공되고, 여기서 상기 항체와 결합부위는 서열번호 2의 서열을 가지는 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 실시태양에 따르면, 상기 항체 또는 그의 결합부위는 또한, 서열번호 4의 서열을 가지는 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시태양은 서열번호 30의 서열을 가지는 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 단클론 항체 또는 항체의 항원 결합부위이다. 본 발명의 실시태양에 따르면, 상기 항체 또는 항체의 결합부위는 서열번호 32의 서열을 가지는 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시태양은 서열번호 46의 서열을 가지는 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 단클론 항체 또는 항체의 항원 결합부위이다. 본 발명의 실시태양에 따르면, 상기 항체 또는 항체의 결합부위는 서열번호 48의 서열을 가지는 경쇄 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명의 추가적 실시태양은 상기 항체가 CD20에 특이적으로 결합하고, 표준집단(canonical class) 1에 유사한 중쇄 상보성 결정부위를 포함하는 항체인 인간 단클론 항체를 포함한다. 상기 항체는 표준집단 2에 유사한 중쇄 상보성 결정부위 2, 표준집단 4에 유사한 경쇄 상보성 결정부위, 표준집단 1에 유사한 경쇄 상보성 결정부위 2 및 표준집단 1에 유사한 경쇄 상보성 결정부위 또한 포함한다.

본 발명의 다른 실시태양은 CD20에 결합하고 VH5-51 배선(胚線, germ line) 서열로부터 유도되는 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 인간 단클론 항체를 포함한다. 본 발명의 몇몇 실시태양은 CD20에 결합하고 Vκ 경쇄를 포함하는 인간 단클론 항체를 포함한다. 본 발명의 다른 실시태양은 VH5-51 중쇄 유전자로부터 유도 또는 암호화되는 중쇄와 Vκ 경쇄의 쌍을 포함하는 단클론 항체를 포함한다. 본 발명의 몇몇 실시태양에 따르면, 상기 Vκ 경쇄 폴리펩티드는 A23 경쇄 유전자로부터 유도 또는 암호화된다.

본 발명의 또 다른 실시태양은 인간 CD20의 세포외 영역(extracellular domain)의 171 내지 179 아미노산 잔기에 결합하는 표적 결합제이다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 본 발명은 NPSEKNSPS(서열번호 196)의 펩티드를 포함하는 에피토프에 결합하는 표적 결합제를 제공한다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 본 발명은 CD20의 세포외 영역에 결합하기 위하여 170번째 알라닌(alanine)을 필요로 하지 않는 표적 결합제를 제공한다.

본 발명의 어떤 실시태양은 후술하겠지만, CD20에 특이적으로 결합하는 완전한 인간 단클론 항체 1.1.2(ATCC 등록번호: PTA-7329), 2.1.2(ATCC 등록번호: PTA-7328) 및 1.5.3(ATCC 등록번호: PTA-7330)를 포함한다.

본 발명의 어떤 실시태양에 따르면, 단클론 항체 1.1.2(ATCC 등록번호: PTA-7329), 2.1.2(ATCC 등록번호: PTA-7328) 및 1.5.3(ATCC 등록번호: PTA-7330)로 같은 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다.

본 발명의 다른 실시태양은 항체 또는 항체의 기능적인 단편(functional fragment), 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 추가적 실시태양에 따르면, 종양성 질환의 치료가 필요한 동물의 선별 및 CD20에 특이적으로 결합하는 완전한 인간 단클론 항체의 치료적 유효량(therapeutically effective dose)을 동물에 투여하는 단계를 포함하는 종양성 질환에 효과적인 치료방법을 포함한다.

치료가능한 종양성 질환, 예를 들어, B 세포 만성 림프구성 백혈병(Chronic Lymphocytic Leukemia, CLL), 소 림프구성 림프종(small lymphocytic lymphoma, SLL), B 세포 전 림프구성 백혈병(prolymphocytic leukemia), 림프 형질세포성 림프종(lymphoplasmacytic lymphoma), 외투세포 림프종(mantle cell lymphoma, MCL), 양성, 중성 및 음성을 포함하는 난포성 림프종(follicular lymphoma, FL), 피부 난포중추 림프종(cutaneous follicle center lymphoma), 가장자리 영역 B 세포 림프종(marginal zone B cell lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 형질세포종(plasmacytoma), 형질세포 골수종(plasma cell myeloma), 이식후 면역증식 질환(post-transplant lymphoproliferative disorder), 왈덴스트롬 마크로글로블린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia) 및 큰 세포 역형성 림프종(anaplastic large cell lymphoma, ALCL) 등의 전구체 B 세포 림프모구성 백혈병/림프종(precursor B cell lymphoblastic leukemia/lymphoma) 및 성숙 B 세포 신생물(mature B cell neoplasm)을 포함하는 비-호킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma, NHL) 등의 B 세포 림프종을 포함하는 림프종을 포함한다. 추가적으로, 예시적인 질환은 리투잔^® 치료 후 재발 또는 불응성 B-NHL을 포함한다.

본 발명의 추가적 실시태양은 면역계 질환의 치료가 필요한 동물의 선별 및 CD20에 특이적으로 결합하는 완전한 인간 단클론 항체의 치료적 유효량을 동물에 투여하는 단계를 포함하는 면역계 질환에 효과적인 치료방법을 포함한다.

치료가능한 면역계 질환은 크론병(Crohn's disease), 베게너 육아종(Wegener's Granulomatosis), 건선(psoriasis), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 피부염(dermatitis), 전신 피부경화증(systemic scleroderma) 및 경화증(sclerosis), 염증성 창자질환(inflammatory bowel disease, IBD), 궤양대장염(ulcerative colitis), 호흡곤란 증후군(respiratory distress syndrome), 수막염(meningitis), 뇌염(encephalitis), 포도막염(uveitis), 사구체신염(glomerulonephritis), 습진(eczema), 천식(asthma), 죽상 동맥경화(atherosclerosis), 백혈구 부착 결핍증(leukocyte adhesion deficiency), 다발경화증(multiple sclerosis), 레이나우드 증후군(Raynaud's syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 유년발병형 당뇨(juvenile onset diabets), 라이터 질환(Reiter's disease), 베켓 질환(Behcet's disease), 면역 복합성 신장염(immune complex nephritis), IgA 신장병증(IgA nephropathy), IgM 다발신경병증(IgM polyneuropathies), 급성 특발성 혈소판 감소성 자색증(actue idiopathic thrombocytopenic purpura) 및 만성 특발성 혈소판 감소성 자색증(chronic idiopathic thrombocytopenic purpura) 등의 면역매개 혈소판 감소증(immune mediate thrombocytopenias), 용혈성 빈혈(hemolytic anemia), 중증 근육무력증(myasthenia gravis), 루프스 신염(lupus nephritis), 전신 홍반 루프스(systemic lupus erythematosus), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis, RA), 아토피 피부염(atopic dermatitis), 천포창(pemphigus), 그레이브 질환(Grave's disease), 하시모토 갑상샘염(Hashimoto's thyroiditis), 오멘 증후 군(Omenn's syndrome), 만성 신부전(chronic renal failure), 급성 전염성 단핵구증(acute infectious mononucleosis), HIV 및 허퍼스 바이러스 관련 질환(herpes virus associated disease)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 추가적인 질환은 심각한 급성 호흡곤란 증후군과 무도성 망막염(choreoretinitis)을 포함한다. 다른 예로서는, 엡스테인 바 바이러스(Epstein Barr virus, EBV) 등의 B 세포 감염 바이러스에 의해 야기되는 질환 및 질병을 포함한다.

본 발명의 추가적인 실시태양은 동물에서 B 세포 종양성장 억제법을 포함한다. 상기 방법은 B 세포 종양성장의 치료가 필요한 동물의 선별 및 CD20에 특이적으로 결합하는 완전한 인간 단클론 항체의 치료적 유효량을 동물에 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 추가적 실시태양은 동물에서 CD20 발현으로 인한 질환의 치료를 위한 약물의 제조를 위한 CD20에 특이적으로 결합하는 단클론 항체의 용도를 포함한다.

본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 항체는 동물에서 종양성 질환의 치료를 위한 약물로 사용할 수 있다. 치료가능한 종양성 질환은 비-호킨 림프종 등의 B 세포 림프종을 포함하는 림프종을 포함한다.

추가적 실시태양은 동물에서 면역질환의 치료를 위한 약물의 제조를 위한 CD20에 특이적으로 결합하는 항체의 용도를 포함한다.

CD20의 발현을 포함하는 치료가능한 질환은 B 세포 만성 림프구성 백혈병, 소 림프구성 림프종, B 세포 전 림프구성 백혈병, 림프 형질세포성 림프종, 외투세 포 림프종, 양성, 중성 및 음성을 포함하는 난포성 림프종, 피부 난포중추 림프종, 가장자리 영역 B 세포 림프종(MALT 형, 결절(nodal) 및 지라형(splenic type), 머리카락 세포 백혈병(hair cell leukemia), 큰 B 세포 확산 림프종(diffuse large B cell lymphoma), 버킷 림프종, 형질세포종, 형질세포 골수종, 이식후 면역증식 질환, 왈덴스트롬 마크로글로블린혈증 및 큰 세포 역형성 림프종 등의 전구체 B 세포 림프모구성 백혈병/림프종 및 성숙 B 세포 신생물을 포함하는 비-호킨 림프종 등의 종양성 질환을 포함한다. 추가적으로, 예시적인 질환은 리투잔^® 치료 후 재발 또는 불응성 B-NHL을 포함한다. 면역계 질환은 크론병, 베게너 육아종, 건선, 건선성 관절염, 피부염, 전신 피부경화증 및 경화증, 염증성 창자질환, 궤양대장염, 호흡곤란 증후군, 수막염, 뇌염, 포도막염, 사구체신염, 습진, 천식, 죽상 동맥경화, 백혈구 부착 결핍증, 다발경화증, 레이나우드 증후군, 쇼그렌 증후군, 유년발병형 당뇨, 라이터 질환, 베켓 질환, 면역 복합성 신장염, IgA 신장병증, IgM 다발신경병증, 급성 특발성 혈소판 감소성 자색증 및 만성 특발성 혈소판 감소성 자색증 등의 면역매개 혈소판 감소증, 용혈성 빈혈, 중증 근육무력증, 루프스 신염, 전신 홍반 루프스, 류마티스성 관절염, 아토피 피부염, 천포창, 그레이브 질환, 하시모토 갑상샘염, 오멘 증후군, 만성 신부전, 급성 전염성 단핵구증, HIV 및 허퍼스 바이러스 관련 질환을 포함한다. 추가적인 질환은 심각한 급성 호흡곤란 증후군과 무도성 망막염을 포함한다. 다른 예로 엡스테인바 바이러스 등의 B 세포 감염 바이러스에 의해 야기되는 질환 및 질병을 포함한다.

본 발명의 실시태양은 CD20에 결합하고 CD20 기능에 영향을 미치는 단클론 항체에 관련이 있다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 완전한 인간 항 CD20 항체와 CD20에 대한 높은 친화도를 포함하는 실험실 조건 및 생체조건에서 CD20+ B 세포와 B 림프종 세포를 근절하는 능력, 실험실 조건 및 생체조건에서 세포자살을 유도하는 능력, 실험실 조건 및 생체조건에서 ADCC 활성을 끌어내는 능력, 실험실 조건 및 생체조건에서 CDC를 유도하는 능력 및/또는 B 세포 종양성장을 억제하는 능력의 치료적 측면에서 매력적인 특성이 있는 항 CD20 항체의 제조에 관한 것이다. 본 발명의 다른 실시태양은 완전한 인간 항 CD20 항체 및 반복된 투여에 의한 심각한 인간 항 키메라 항체(Human Anti-Chimeric Antibody, HACA) 반응을 나타내지 않는 항 CD20 항체의 제조와 관련된다.

따라서, 본 발명의 어떤 실시태양은 분리된 CD20에 결합하는 항체 또는 그 항체의 절편을 포함한다. 공지된 바와 같이, 상기 항체는 예를 들어, 편리하게 다클론(polyclonal), 올리고클론(oligoclonal), 단클론, 키메라, 인간화(humanized) 및/또는 완전한 인간항체일 수 있다. 본 발명의 실시태양에 따르면, 상기 항체들의 생산을 위한 세포 또한 제공된다.

본 발명의 실시태양이 항체의 어떤 특이적 형태나 발생 또는 생산에 제한되지 않는다는 것은 이해될 수 있을 것이다. 예를 들어, 항 CD20 항체는 전장(full-length) 항체(예를 들어, 완전한 인간 Fc 부위를 가지는) 또는 항체의 절편(예를 들어, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂)일 수 있다. 추가적으로, 상기 항체는 항체를 분비 하는 하이브리도마(hybridoma) 또는 항체를 암호화하는 유전자들이나 유전자를 형질전환(transformation) 또는 형질도입(transfection)하여 유전자 재조합 세포로 부터 작제할 수 있다. 추가적으로, 상기 항체는 CD20에 결합하는 낙타과(camelid) 또는 인간 단일 VH 또는 VL 영역 등의 단일영역 항체일 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양은 상기 항체 중 어떤 것을 암호화하는 분리된 핵산분자, 항 CD20 항체를 암호화하는 분리된 핵산분자를 가지는 벡터(vector) 또는 이러한 핵산분자 중 어떤 것으로 형질전환된 숙주세포를 포함한다. 추가적으로, 본 발명의 일 실시태양은 생산된 항체의 회수가 뒤따르는 핵산분자가 발현되어 항체를 생산하는 조건하에서 숙주세포를 배양하여 항 CD20 항체를 생산하는 방법이다.

본 발명의 또 다른 실시태양은 인간 CD20을 발현하는 세포, 인간 CD20을 포함하는 분리된 세포막, 분리된 인간 CD20 또는 그 절편 및/또는 하나 또는 그 이상의 종간 상동성(orthologous) 서열 또는 그 절편을 가지는 포유동물을 면역화시켜 CD20에 대한 높은 친화도를 가지는 항체를 생산하는 방법을 포함한다.

본 발명의 다른 실시태양은 CD20에 특이적으로 결합하는 분리된 항체의 생산 및 동정에 기반한다. CD20은 B 세포 림프종의 90% 이상에서 발현된다. CD20을 발현하는 B 세포의 사멸을 야기하는 항체는 CD20에 의해 유도되는 종양성장 및 다른 관련되는 영향을 막을 수 있다. 비-악성 B 세포(non-malignant B cell)의 사멸을 야기하는 항체는 면역질환을 예방하거나 치료하는데 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시태양은 본 명세서에 개시된 대로 제조된 항체를 사용하여 환자에서 CD20의 양을 검출하는, 질환 또는 건강 상태를 진단하는 방법을 포 함한다. 본 발명의 추가적 실시태양에 따르면, 위험인자의 동정, 질환의 진단 및 질환의 단계를 구분하기 위한 방법은 항 CD20 항체를 사용하여 CD20의 발현 및/또는 과발현의 동정하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일부 실시태양에 따르면, 상기 방법은 세포에서 CD20 단백질에 선택적으로 결합하는 완전한 인간항체 접합자(conjugate)을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 항체 접합자는 선택적으로 CD20과 결합하는 표지된(labeled) 항체를 포함한다. 상기 방법은 추가로 환자에서 상기 표지의 존재를 관찰하는 단계를 포함한다. 상대적으로 표지의 양이 많은 것은 질환의 상대적인 높은 위험성을 나타낼 것이고, 상대적으로 표지의 양이 적은 것은 질환의 상대적인 낮은 위험성을 나타낼 것이다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 표지는 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP)이다.

추가적으로, 본 발명은 환자로부터 얻은 생물학적 시료로 항 CD20 항체에 접촉하는 단계와 상기 시료에서 상기 항체와 CD20 간의 결합 수준을 측정하는 단계를 포함하는 환자의 시료에서 CD20의 양을 분석하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 좀 더 구체적인 실시태양에 따르면, 생물학적 시료는 혈액 또는 혈청이다.

본 발명의 또 다른 실시태양은 혈청이나 세포에 항 CD20 항체로 접촉한 후 CD20의 존재를 검출함으로써, 세포에서 CD20의 발현과 관련된 건강 상태를 진단하는 방법을 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 본 발명은 CD20을 발현하는 세포를 포함하는 질환을 선별하기 위하여 포유동물의 조직, 세포 또는 체액에서 CD20을 검출하는 검사 키트(assay kit)를 포함한다. 상기 키트는 CD20에 결합하는 항체와 존재하는 CD20과 항체의 반응을 나타내기 위한 수단을 포함한다. 상기 항체는 단클론 항체인 것이 바람직하다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, CD20에 결합하는 항체에 표지하였다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 상기 항체는 표지하지 않은 1차 항체이고, 상기 키트는 추가로 상기 1차 항체를 검출하기 위한 수단을 포함한다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 수단은 항 면역글로블린 표지된 2차 항체를 포함한다. 상기 항체는 플루오로크롬(fluorochrome), 효소(enzyme), 방사선핵종(radionuclide) 또는 방사선 비투과성 물질(radiopaque material)를 포함하는 군으로 부터 선택된 마커(marker)로 표지되는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 실시태양은 항 CD20 항체의 유효량을 환자에게 투여하여, 환자에서 CD20의 발현과 관련된 질환이나 건강 상태를 치료하고 처치하기 위한 방법을 포함한다. 상기 항 CD20 항체는 단독으로 투여되거나, 또는 추가적인 항체, 화학치료 약물 또는 방사성 약물과 병용하여 투여할 수 있다. 예를 들어, B 림프종 세포의 세포자살, 항체 의존성 세포독성(antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성(complement dependent cytotoxicity, CDC)를 유도하는 CD20 항체의 단클론, 올리고클론 또는 다클론 혼합물은 종양세포의 증식을 직접적으로 억제하기 위하여 상기 약물과 병용 투여할 수 있다. 상기 방법은 생체조건에서 수행될 수 있으며, 환자는 인간인 것이 바람직하다.

본 발명의 일부 실시태양에 따르면, 항 CD20 항체는 보체를 고정하고 CDC에 기여하는 능력을 증대시키기 위하여 변형될 수 있다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 상기 항 CD20 항체는 작용기 세포(effector cell)의 활성화와 ADCC에 기여하는 능력을 증대시키기 위하여 변형될 수 있다. 또한, 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 상기 항 CD20 항체는 작용기 세포의 활성화와 ADCC에 기여하는 능력의 증대 및 보체를 고정하고 CDC에 기여하는 능력을 증대시키기 위하여 변형될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 본 발명은 항 CD20 항체를 포함하는 조성물 및, 상기 조성물이 CD20이 발현 또는 과발현되는 질환을 치료하기 위하여 사용되는 것임을 나타내는 포장 내용물 또는 설명서를 포함하는 제품을 제공한다.

본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 본 발명은 항 CD20 단클론 항체및 치료가 필요한 환자에게 단클론 항체 투여에 대한 설명서를 포함하는, CD20 발현되는 질환의 치료용 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 환자의 암 세포를 선택적으로 사멸시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 환자에게 완전한 인간항체 접합자((fully human antibody conjugate)를 투여하는 단계를 포함한다. 상기 완전한 인간항체 접합자는 CD20의 세포외 영역과 결합할 수 있는 항체와 약물을 포함한다. 상기 약물은 독소, 방사성 동위원소 또는 암 세포를 사멸시킬 수 있는 또 다른 물질일 수 있다. 이것에 의한 상기 항체 접합자는 선택적으로 암세포를 사멸시킨다. 상기 약물은 사포린(saporin)일 수 있다.

본 발명의 한 가지 측면에 의하면, CD20에 결합하는 접합된 완전한 인간항체(conjugated fully human antibody)를 제공한다. 약물이 항체에 결합하고, 항체 가 세포에 결합하면 약물이 전달된다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 접합된 완전한 인간항체는 CD20의 세포외 영역에 결합한다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 상기 항체와 접합된 독소는 CD20을 발현하는 세포의 내부로 들어가게 된다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 상기 약물은 세포독성제이다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 상기 약물은 사포린이다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 상기 약물은 방사성 동위원소이다.

본 발명의 몇몇 실시태양에 따르면, 본 명세서에 개시된 항체의 당화(glycosylation)는 ADCC와 CDC의 기능을 증대시키도록 변형된다(참조: Shields RL, et al., (2002) JBC., 277, 26733, Shinkawa T, et al., (2003) JBC., 278, 3466 및 Okazaki A et al., (2004) J. Mol. Biol., 336, 1239).

본 명세서에 개시된 발명의 실시태양은 CD20에 결합하는 단클론 항체와 관련이 있다. 본 발명의 몇몇의 실시태양에 따르면, 상기 항체는 CD20에 결합하고 B 림프종 세포의 세포자살을 유도한다. 본 발명의 다른 실시태양은 완전한 인간 항 CD20 항체와 치료적으로 유용한 항체의 제조를 포함한다. 이러한 항 CD20 항체의 제조는 CD20에 강하게 결합하는 친화도, 실험실 조건 및 생체조건에서 B 림프종 세포의 세포자살 유도능력, 실험실 조건 및 생체조건에서 ADCC 활성 유도능력 및 실험실 조건 및 생체조건에서 CDC 활성 유도능력을 포함하는, 바람직한 치료적 특성을 가진다.

본 발명의 또 다른 실시태양은 항 CD20 항체에서 분리된 결합절편(isolated binding fragment)을 포함한다. 결합절편은 완전한 인간 항 CD20 항체에서 유도되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 상기 절편은 후술하겠지만, Fv, Fab' 또는 다른 공지된 항체의 절편를 포함한다. 본 발명의 실시태양은 또한 CD20에 대한 완전한 인간항체를 발현하는 세포를 포함한다. 세포의 예로는 하이브리도마(hybridoma) 또는 CD20에 대한 항체를 생산하는 중국 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovary cell, CHO cell) 등의 재조합 세포를 포함한다.

이외에도, 본 발명의 실시태양은 질환을 치료하기 위하여 상기 항체를 이용하는 방법을 포함한다. 항 CD20 항체는 CD20 양성(positive) B 세포 및/또는 B 림프종 세포를 근절하기 위하여 유용하다. 작용 기작은 CD20을 발현하는 세포의 세포자살 유도, CD20을 발현하는 세포에서 ADCC 유도 또는 CDC를 유도를 포함한다. 상기 기작으로 치료할 수 있는 질환은 B 세포 만성 림프구성 백혈병, 소 림프구성 림프종, B 세포 전 림프구성 백혈병, 림프 형질세포성 림프종, 외투세포 림프종, 양성, 중성 및 음성을 포함하는 난포성 림프종, 피부 난포중추 림프종, 가장자리 영역 B 세포 림프종(MALT 형, 결절 및 지라형), 머리카락 세포 백혈병, 큰 B 세포 확산 림프종, 버킷 림프종, 형질세포종, 형질세포 골수종, 이식후 면역증식 질환, 왈덴스트롬 마크로글로블린혈증 및 큰 세포 역형성 림프종 등의 전구체 B 세포 림프모구성 백혈병/림프종 및 성숙 B 세포 신생물(mature B cell neoplasm)을 포함하는 비-호킨 림프종 등의 B 세포 림프종을 포함하는 종양성 질환을 포함하지나, 이에 제한되는 것은 아니다. 추가적으로, 예시적인 질환은 리투잔^® 치료 후 재발 또는 불응성 B-NHL을 포함한다. 면역계 질환은 크론병, 베게너 육아종, 건선, 건선성 관절염, 피부염, 전신 피부경화증 및 경화증, 염증성 창자질환, 궤양대장염, 호흡곤란 증후군, 수막염, 뇌염, 포도막염, 사구체신염, 습진, 천식, 죽상 동맥경화, 백혈구 부착 결핍증, 다발경화증, 레이나우드 증후군, 쇼그렌 증후군, 유년발병형 당뇨, 라이터 질환, 베켓 질환, 면역 복합성 신장염, IgA 신장병증, IgM 다발신경병증, 급성 특발성 혈소판 감소성 자색증 및 만성 특발성 혈소판 감소성 자색증 등의 면역매개 혈소판 감소증, 용혈성 빈혈, 중증 근육무력증, 루프스 신염, 전신 홍반 루프스, 류마티스성 관절염, 아토피 피부염, 천포창, 그레이브 질환, 하시모토 갑상샘염, 오멘 증후군, 만성 신부전, 급성 전염성 단핵구증, HIV 및 허퍼스 바이러스 관련 질환을 포함한다. 추가적인 질환은 심각한 급성 호흡곤란 증후군과 무도성 망막염을 포함한다. 다른 예로 엡스테인바 바이러스 등의 B 세포 감염 바이러스에 의해 야기되는 질환 및 질병을 포함한다.

본 발명의 다른 실시태양은 환자 또는 생물학적 시료에서 CD20의 양 및/또는 존재를 특이적으로 검출하기 위한 진단방법을 포함한다. 검사용 키트는 상기 항체를 검출하기 위하여 필요한 표지를 가지는 항 CD20 항체를 포함할 수 있다. 상기 진단용 검사는 B 세포 만성 림프구성 백혈병, 소 림프구성 림프종, B 세포 전 림프구성 백혈병, 림프 형질세포성 림프종, 외투세포 림프종, 양성, 중성 및 음성을 포함하는 난포성 림프종, 피부 난포중추 림프종, 가장자리 영역(marginal zone) B 세포 림프종(MALT 형, 결절 및 지라형), 머리카락 세포 백혈병, 큰 B 세포 확산 림프종, 버킷 림프종, 형질세포종, 형질세포 골수종, 이식후 면역증식 질환, 왈덴스트롬 마크로글로블린혈증 및 큰 세포 역형성 림프종 등의 전구체 B 세포 림프모구성 백혈병/림프종 및 성숙 B 세포 신생물을 포함하는 비-호킨 림프종 등의 B 세포 림프종을 포함하지만, 이에 제한적이지 않는 CD20과 관련된 질환을 선별하는데 유용하다. 추가적으로, 예시적인 질환은 리투잔^® 치료 후 재발 또는 불응성 B-NHL을 포함한다. 면역계 질환은 크론병, 베게너 육아종, 건선, 건선성 관절염, 피부염, 전신 피부경화증 및 경화증, 염증성 창자질환, 궤양대장염, 호흡곤란 증후군, 수막염, 뇌염, 포도막염, 사구체신염, 습진, 천식, 죽상 동맥경화, 백혈구 부착 결핍증, 다발경화증, 레이나우드 증후군, 쇼그렌 증후군, 유년발병형 당뇨, 라이터 질환, 베켓 질환, 면역 복합성 신장염, IgA 신장병증, IgM 다발신경병증, 급성 특발성 혈소판 감소성 자색증 및 만성 특발성 혈소판 감소성 자색증 등의 면역매개 혈소판 감소증, 용혈성 빈혈, 중증 근육무력증, 루프스 신염, 전신 홍반 루프스, 류마티스성 관절염, 아토피 피부염, 천포창, 그레이브 질환, 하시모토 갑상샘염, 오멘 증후군, 만성 신부전, 급성 전염성 단핵구증, HIV 및 허퍼스 바이러스 관련 질환을 포함한다. 추가적인 질환은 심각한 급성 호흡곤란 증후군과 무도성 망막염을 포함한다. 다른 예로서는, 엡스테인바 바이러스 등의 B 세포 감염 바이러스에 의해 야기되는 질환 및 질병을 포함한다.

본 발명의 일 실시태양에 따르면, 서열번호 2의 서열을 가지는 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 단클론 항체가 제공된다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 항체는 서열번호 4의 서열을 가지는 경쇄 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 서열번호 30의 서열을 가지는 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체가 제공된다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 항체는 서열번호 32의 서열을 가지는 경쇄 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 서열번호 46의 서열을 가지는 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체가 제공된다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 항체는 서열번호 48의 서열을 가지는 경쇄 폴리펩티드를 추가로 포함한다.

본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 생산하는 하이브리도마가 제공된다. 바람직하게는, 상기 하이브리도마는 완전한 인간 단클론 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 생산한다. 보다 바람직하게는, 상기 하이브리도마는 완전한 인간 단클론 항체 1.1.2(ATCC 등록번호: PTA-7329), 2.1.2(ATCC 등록번호: PTA-7328) 및 1.5.3(ATCC 등록번호: PTA-7330)의 경쇄 및/또는 중쇄를 생산한다. 선택적으로, 상기 하이브리도마는 1.1.2(ATCC 등록번호: PTA-7329), 2.1.2(ATCC 등록번호: PTA-7328) 및 1.5.3(ATCC 등록번호: PTA-7330) 등의 동일한 에피토프 또는 에피토프들에 결합하는 항체를 생산한다.

본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 항체의 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 핵산분자가 제공된다.

바람직하게는, 완전한 단클론 항체의 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 핵산분자가 제공된다. 보다 바람직하게는, 완전한 인간 단클론 항체 1.1.2(ATCC 등록번호: PTA-7329), 2.1.2(ATCC 등록번호: PTA-7328) 및 1.5.3(ATCC 등록번호: PTA-7330)의 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 핵산분자가 제공된다.

본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상술한 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 암호화하고, 상기 핵산분자 또는 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다. 선택적으로, 상기 숙주세포는 하나 이상의 벡터를 포함할 수 있다.

이외에도, 본 발명의 일 실시태양은, 핵산분자가 생산된 항체의 회수가 이어지는 항체를 생산하기 위하여 발현되는 조건하에서 숙주세포를 배양하여 항 CD20 항체를 생산하는 방법이다.

본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 항체를 암호화하는 적어도 하나의 핵산분자로 적어도 하나의 숙주세포를 형질전환하는 단계, 상기 숙주세포에서 핵산분자를 발현하는 단계 및 상기 항체를 분리하는 단계를 포함하는, 항체의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 표적 결합제를 투여하는 단계를 포함하는, CD20을 발현하는 세포의 성장을 억제하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 CD20의 발현과 관련된 질환에 대한 치료가 필요한 동물을 선별하는 단계 및 CD20에 특이적으로 결합하는 표적 결합제의 치료적 유효량을 상기 동물에게 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 포유동물에서 CD20에 특이적으로 결합하는 표적 결합제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 면역계 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 면역질환에 대한 치료가 필요한 동물을 선별하는 단계 및 CD20에 특이적으로 결합하는 표적 결합제의 치료적 유효량을 상기 동물에게 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 포유동물에서 CD20에 특이적으로 결합하는 표적 결합제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 종양성 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 종양성 질환에 대한 치료가 필요한 동물을 선별하는 단계 및 CD20에 특이적으로 결합하는 표적 결합제의 치료적 유효량을 상기 동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 약물은 단독으로 투여되거나 항체, 화학치료 약물 또는 방사성 약물로부터 선별된 2차 항종양성 약물과 병용하여 투여할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 포유동물에서 CD20에 특이적으로 결합하는 표적 결합제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료방법이 제공된다. 상기 방법은 암치료가 필요한 동물을 선별하는 단계 및 CD20에 특이적으로 결합하는 표적 결합제의 치료적 유효량을 상기 동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 약물은 단독으로 투여되거나 항체, 화학치료 약물 또는 방사성 약물로부터 선별된 2차 항 종양성 약물과 병용하여 투여할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 면역계 질환의 치료를 위한 약물의 제조를 위하여, CD20에 특이적으로 결합하는 표적 결합제의 용도가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 종양성 질환의 치료를 위한 약물 제조를 위하여, CD20에 특이적으로 결합하는 표적 결합제의 용도가 제공된다.

본 발명의 일 실시태양은 CD20 발현에 단독으로 또는 부분적으로 의존적인 종양을 가지는 환자에서의 B 세포 종양성장 억제에 사용하기에 특히 적합하다.

본 발명의 또 다른 실시태양은 종양성 및/또는 면역계 질환의 선별을 위하여 포유동물의 조직, 세포 또는 체액에서 CD20을 검출하기 위한 검사 키트를 포함한다. 상기 키트는 CD20에 결합하는 표적 결합제와 존재하는 CD20과 표적 결합제의 반응을 나타내기 위한 수단을 포함한다. 상기 표적 결합제는 단클론 항체일 수 있다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 CD20에 결합하는 항체는 표지될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시태양은 상기 항체는 표지하지 않은 1차 항체와 상기 키트는 상기 1차 항체를 검출하는 수단을 추가로 포함한다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 수단은 항 면역글로블린 표지된 2차 항체를 포함한다. 바람직하게는, 상기 항체는 플루오로크롬, 효소, 방사선핵종 및 방사선 비투과성 물질을 포함하는 군으로 부터 선택되는 마커로 표지된다.

항 CD20 항체에 대한 추가적 실시태양, 특징 등은 아래에 상세히 기술한다.

정의

다르게 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 과학, 기술용어는 이 분야의 일반적으로 숙련된 자들에 의해 공통적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 더욱이, 문맥상으로 규정되지 않는 한, 단수 단어는 복수를 포함하고, 복수 단어는 단수를 포함한다. 일반적으로, 본 명세서에 기술된 세포와 조직배양, 분자 생물학, 단백질, 올리고-, 폴리뉴클레오티드 화학과 혼성화 기술과 관련하여 사용된 전문용어는 당업계에 잘 알려져 있고, 통상적으로 사용되는 것들이다.

표준 기술이 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성과 조직배양, 형질전환(예를 들면, 전기천공법(electroporation), 양이온 지질법(lipofection))에 사용하였다. 효소반응과 정제기술은 생산자의 지침서에 따르거나, 당업계에 일반적으로 사용되거나, 본 명세서에 기술된 대로 수행하였다. 상술한 기술과 방법은 당업계에 공지된 통상적인 방법, 본 명세서에 전반적으로 인용되고 논의된 다양하고 일반적인 참조문헌에 기술된 대로 수행하였다. 예를 들어, 본 명세서에서 인용한 참조문헌 Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Mannual(3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001))을 참고하라. 본 명세서에 사용된 분석화학, 합성 유기화학과 의,약화학과 관련하여, 실험방법 및 기술에 이용되는 전문용어는 당업계에 잘 알려지고 일반적으로 사용되는 것들이다. 화학합성, 화학분석, 약학적 제조, 제제와 전달 및 환자의 치료에는 표준방법을 사용하였다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 다음의 용어들은, 다르게 지시되지 않는 한, 다음의 의미를 갖는 것으로 이해되어야 할 것이다:

화합물은 약 2,000달톤(Dalton) 이하의 적은 분자량을 가지는 화합물을 의미한다.

"CD20"는 CD20 유전자에 의해 암호화되고, 298개 아미노산을 가지는 33,000MW의 당인산단백질(glyco-phosphoprotein)을 의미한다.

본 명세서에 사용된 “분리된 폴리뉴클레오티드(isolated polynucleotide)"라는 용어는 자연적 발생 환경에서 분리한 폴리뉴클레오티드를 의미할 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 지놈(genomic), cDNA 또는 합성된 것일 수 있다. 분리된 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는, 자연계에서 결합된 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 부분과 연관된 것이 아니다. 상기 분리된 폴리뉴클레오티드는 자연계에서는 연결되지 않는 다른 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결(operably linked) 될 수 있을 것이다. 아울러, 분리된 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는, 자연계에서 큰 서열의 일 부분으로 발생하지는 않는다.

본 명세서에서“분리된 단백질(isolated protein)”이란, 자연적으로 발생하는 환경으로부터 분리된 단백질을 의미한다. 이러한 단백질은 지놈 DNA(genomic DNA), cDNA, 재조합 DNA, 재조합 RNA 또는 합성 기원 또는 그들의 조합으로 부터 유래되는데, 기원 또는 유래 기원에 의해, 상기“분리된 단백질”은 (1) 자연에서 발견되는 단백질과 연관이 없고, (2) 같은 근원으로부터의 다른 단백질, 예를 들어, 마우스 단백질이 없으며, (3) 각기 다른 종의 세포에 의해 발현되거나, (4) 자연적으로 발생하지 않는다.

본 명세서에서 “폴리펩티드(polypeptide)”란 원래의 단백질, 절편 또는 폴리펩티드 서열의 유사체를 의미하는 포괄적인 용어이다. 따라서, 원래의 단백질, 절편 또는 유사체는 일종의 폴리펩티드이다. 본 발명에 따른 바람직한 폴리펩티드는 인간 중쇄 면역글로블린 분자와 인간 카파(kappa) 경쇄 인간 면역글로블린 분자뿐만 아니라, 카파(kappa) 또는 람다(lambda) 경쇄 면역글로블린 분자 그리고, 반대로, 절편뿐만 아니라 유사체 등의 중쇄 면역글로블린과 경쇄 면역글로블린으로 포함하는 조합으로 형성된 항체 분자를 포함한다. 본 발명에 따른 바람직한 폴리펩티드는 순전히 인간 중쇄 면역글로블린 분자 또는 절편을 포함할 수도 있다.

본 명세서에서 어느 대상에 사용되는“자연계에 존재하는(naturally occurring)”이라는 용어는 자연계에서 발견되는 대상을 의미한다. 예를 들어, 생물체(바이러스를 포함)내에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 서열은 인간에 의해 실험실 또는 다른 곳에서 의도적으로 수정되지 않아도 자연상태의 원료로부터 분리할 수 있으므로 자연적으로 발생하였다 한다.

본 명세서에서“작동가능하도록 연결된(operably linked)”이란, 그들이 의도한 대로 기능하도록 하는 구성 성분의 위치를 의미한다. 예를 들어, 한 조절서열이 암호서열에 “작동가능하도록 연결하였다”라는 것은, 암호서열의 발현이 조절서열과 적합한 조건하에서 이루어진다는 것이다.

본 명세서에서 사용된 “조절서열(control sequence)”이란, 폴리뉴클레오티드 서열이 그들이 연결되는 코딩서열의 발현과 처리(processing)에 효과 또는 영향을 주는데 필요하다는 것을 의미한다. 이러한 조절서열의 특성은 숙주 생물체에 따라 다르다; 원핵생물에서는, 이러한 조절서열은 일반적으로 프로모터(promoter), 리보좀 결합부위와 전사 종료 서열을 포함하고; 진핵생물에서는, 일반적으로, 이러한 조절서열은 프로모터, 인핸서(enhancer), 인트론(intron), 전사 종료 서열, 폴리아데노신화(polyadenylation) 신호 서열과 5'와 3'의 비해독부위(untranslated region, UTR)를 포함한다. 상기“조절서열(control sequence)”이란 용어는, 최소한으로, 존재가 발현과 처리(processing)에 필수적으로 모든 구성요소와 존재가 이점이 되는 추가의 구성요소를 포함하며, 예를 들면, 선도서열(leader sequence)과 융합 파트너 서열(fusion partner sequence)이 있다.

본 명세서에 사용된 “폴리뉴클레오티드(polynucleotide)”, 리보뉴클레오티드(ribonucleotide) 또는 데옥시뉴클레오티드(deoxyrebonucleotide) 또는 수정된 형태의 뉴클레오티드 또는 RNA-DNA 이형접합체(hetero-duplex)를 포함하는 최소 10개 염기의 뉴클레오티드로 형성되는 중합체 형태를 의미한다. 상기 용어는 단일과 이중 가닥 형태의 DNA를 포함한다.

본 명세서에 사용된 “올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)”란 용어는 자연적으로 발생하고, 자연발생에 의해 서로 연결되거나 비자연적으로 연결되어 수정되는 뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 200개 염기 또는 그 이하의 길이로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 부분집합(subset)이다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 10 내지 60염기 길이이며, 가장 바람직하게는, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 내지 40염기 길이이다. 비록, 예를 들어, 유전자 돌연변이체의 구조의 경우; 올리고뉴클레오티드가 이중 가닥임에 불구하고, 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 탐침(probe)의 경우; 대개 단일 가닥이다. 올리고뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

본 명세서에 사용된 “자연계에 존재하는 뉴클레오티드(naturally occurring nucleotide)”라는 용어는 데옥시리보뉴클레오티드와 리보뉴클레오티드를 포함한다. 본 명세서에 사용된 “변형된 뉴클레오티드(modified nucleotide)"라는 용어는 당(sugar) 그룹이 수정되거나 치환된 뉴클레오티드와 기타 같은 종류의 것을 포함한다. 본 명세서에 사용된 “올리고뉴클레오티드 연결(oligonucleotide linkage)" 이라는 용어는 포스포로티이오에이트(phosphorothioate), 포스포로디티오에이트(phosphorodithioate), 포스포로셀레노에이트(phosphoroselenoate), 포스포로디셀레노에이트(phosphorodiselenoate), 포스포로아닐로티오에이트(phosphoroanilothioate), 포스포라닐라데이트(phosphoraniladate), 포스포로아미데이트(phosphoroamidate)와 기타 같은 종류의 것들에 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 연결을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에서 인용한 Laplanche et al., Nucl. Acids Res. 14:9081(1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077(1984); Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:3209(1988); Zon et al., Anti-Cancer Durg Desing 6:539(1991); Zorn et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108(F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England(1991); Stec et al., 미합중국 특허 제 5,151,510호; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543(1990)을 참조하라. 올리고뉴클레오티드는 원한다면, 검출을 위하여 표지될 수 있다.

본 명세서에 사용된 “선택적으로 혼성화(selectively hybridize)"라는 용어는 검출할 수 있는 특이적인 결합을 의미한다. 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드와 절편은 혼성화와 비특이적 아미노산에 검출할 수 있는 결합의 분명한 양을 최소화하는 세척 조건하에서 아미노산 가닥에 선택적으로 혼성화된다. 선택적 혼성화를 위한 매우 엄격한 조건은 이 분야에 공지된 바와 본 명세서에서 기술된 대로 사용할 수 있다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 또는 항체 절편과 원하는 아미노산 서열 간의 아미노산 서열 상동성은 최소 80%일 것이며, 좀 더 통상적으로 바람직하게는, 상동성을 최소 85%, 90%, 95%, 99% 및 100%로 증가시키는 것이다.

두 아미노산 서열이 “상동의(homologous)”라는 것은 이들 서열 간에 부분적이거나 완전한 동일성이 있음이다. 예를 들면, 85% 상동성은 두 서열이 최대 일치로 정렬되었을 때, 아미노산이 85% 동일하다는 것을 의미한다. 갭(gap, 일치하는 2개의 서열 어느 쪽에서든)은 최대의 일치에 허용하였다; 바람직하게는 갭 길이는 5 내지 그 이하로, 더욱 바람직하게는 2 내지 그 이하로 한다. 선택적으로 그리고 바람직하게, 만약, 두 단백질 서열(또는 최소 약 30개 아미노산 길이의 폴리펩티드 서열)의 배열 점수가 ALIGN 프로그램과 돌연변이 데이타 매트릭스(matrix)를 이용하여 5 이상을 가지고, 갭 벌점(penalty)이 6 또는 그 이상이면, 이들 단백질 서열은 본 명세서에 사용된 용어로 상동의(homologous)라고 한다. Dayhoff, M.O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110(볼륨 5, National Biomedical Research Foundation(1972))와 이 볼륨의 Supplement 2, pp. 1-10 참조. ALIGN 프로그램을 사용하여 최적으로 정렬되었을때, 이들 아미노산이 50% 또는 그 이상으로 동일하다면, 두 서열 또는 그것의 부분이 좀 더 바람직하게 상동이다. 종간 상동성 서열(orthologous sequence)내에 상동성이 다른 부분이 있을 수 있음을 인정해야한다. 예를 들면, 마우스와 인간의 종간 상동유전자(orthologue)의 기능적 부위는 비기능 부위의 상동성보다 높을 것이다.

본 명세서에 사용된 “~에 상응하는(corresponds to)”이라는 용어는 폴리뉴클레오티드 서열이 참고 폴리뉴클레오티드 서열과 전체적으로 또는 일부분이 상동(즉, 동일하나, 엄격히 진화상의 관계가 아닌) 또는 폴리펩티드 서열이 참고 폴리펩티드 서열과 동일함을 의미한다.

대비적으로, 본 명세서에 사용된 “~에 상보적인(complementary to)”이란 용어는 상보적인 서열이 참고 폴리뉴클레오티드 서열과 전체적으로 또는 일부분 상동(homologous)이라는 것을 의미한다. 예를 들면, “TATAC” 뉴클레오티드 서열은 “TATAC” 참고 서열에 상응하고 “GTATA” 참고 서열에 상보적이다.

“서열의 동일성(sequence identity)”은 비교창(comparison window)에서 두 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 동일함을 의미한다(즉, 뉴클레오티드-사이-뉴클레오티드 또는 잔기-사이-잔기 기준상). “서열 동일성의 백분율(percentage of sequence identity)”은 비교창에서 최적으로 정렬된 두 서열을 비교함으로써 계산하였고, 동일한 아미노산 염기(예를 들어, A, T, C, G, U, 또는 I) 또는 두 서열에서 발생하는 아미노산 잔기를 측정해 일치하는 위치의 수를 산출하였고, 일치하는 위치의 수는 비교창에서의 총 위치의 수로 나누었고, 상기 결과를 100으로 증폭하여 서열 동일성을 백분율로 산출하였다. 본 명세서에서 사용한 “실제적 동일성(substantial identity)”은 서열 동일성의 백분율을 참고서열(reference sequence)을 비교창에서 참고서열의 총 20% 또는 그 이하의 결실 또는 부가된 서열과 비교하여 계산된다는 점에서, 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산은 최소 85% 서열 동일성, 바람직하게는, 최소 90에서 95% 의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는, 최소 99% 서열 동일성을 가진다는 점에서의 최소 10 뉴클레오티드(6 아미노산) 위치의 비교창에서, 때때로 최소 24 내지 48 뉴클레오티드(8 내지 16 아미노산) 위치의 비교창에서의 참고서열을 비교하여, 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 특징을 의미한다. 상기 참고서열은 더 큰 서열의 부분집합(subset)일 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 통상적인 20개 아미노산과 이의 약어들은 통상적인 용법을 따른다. 본 명세서에 참조문헌으로 포함된 Immunology-A Synthesis(2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass.(1991))를 참고하라. 상기 통상적인 20개 아미노산의 입체이성질체(stereoisomer, 예를 들어, D-아미노산), α-, α-이치환(disubstitute) 아미노산, N-alkyl 아미노산, 젖산 등의 비자연적인 아미노산 및 다른 비통상적인(unconventional) 아미노산은 본 발명의 폴리펩티드의 적절한 구성성분으로 포함될 수 있을 것이다. 비통상적인 아미노산의 예로서는 다음을 포함한다: 4-하이드록시프롤린(4-hydroxyproline), γ-카르복시글루탐산(γ-carboxyglutamate), ε-N,N,N-트리메틸리신(ε-N,N,N-trimethyllysine), ε-N-아세틸리신(ε-N-acetyllysine), O-포스포세린(O-phosphoserine), N-아세틸세린(N-acetylserine), N-포르밀메티오닌(N-formylmethionine), 3-메틸히스티딘(3-methylhistidine), 5-하이드록시리신(5-hydroxylysine), δ-N-메틸아르기닌(δ-N-methylarginine) 및 다른 유사 아미노산과 이미노산(immino acid, 예를 들어, 4-하이드록시프롤린(4-hydroxyproline)). 본 명세서에서 사용된 폴리펩티드의 표시법(notation)에서는, 표준 용법과 협정에 따라, 왼손 방향은 아미노 말단 방향이고, 오른손 방향은 카르복시 말단 방향을 나타낸다.

마찬가지로, 달리 특정하지 않는 한, 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼손 말단은 5' 말단이다; 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼손 방향은 5' 방향으로 지시된다. 초기의 미성숙한(nascent) RNA 전사체(transcript)의 5'에서 3' 방향으로의 부가는 전사방향(transcription direction)을 나타내고; RNA와 동일한 서열을 가지는 DNA의 5' 말단에서 RNA 전사체의 5' 말단까지의 서열영역은 “상류서열(upstream sequence)”을 나타내며; RNA와 동일한 서열을 가지는 DNA의 3' 말단에서 RNA 전사체의 3' 말단까지의 서열영역은 “하류서열(downstream sequence)”을 나타낸다.

폴리펩티드에 적용하였을 때, “실제적 동일성(substantial identity)”이란 용어는 두 펩티드 서열이 최적으로 정렬되었을 때, 예를 들어, 디폴트 갭웨이트(default gap weight)를 이용한 GAP 또는 BESTFIT 프로그램에 의해, 최소 80% 서열 동일성(sequence identity), 바람직하게는, 최소 90%의 서열 동일성, 좀 더 바람직하게는, 최소 95%의 서열 동일성, 그리고 가장 바람직하게는, 최소 99%의 서열 동일성을 공유한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적인 아미노산의 치환에 의해 달라진다. 보존적인 아미노산의 치환은 유사한 곁사슬을 가지는 잔기들의 호환성(interchangeability)을 의미한다. 예를 들어, 지방족(aliphatic) 곁사슬을 가지는 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 루이신 및 이소루이신이고; 지방족 수산기(aliphatic hydroxy) 곁사슬을 가지는 아미노산은 세린과 트레오닌이며; 아미드-함유(amide-containing) 곁사슬을 가지는 아미노산은 아스파라긴과 글루타민이고; 방향족 곁사슬(aromatic side chain)을 가지는 아미노산은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이며; 염기(basic) 곁사슬을 가지는 아미노산은 리신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황 함유(sulfur-containing) 곁사슬을 가지는 아미노산은 시스테인과 메티오닌이다. 바람직한 보존적인 아미노산의 치환 집단은: 발린-루이신-이소루이신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루탐산-아스파르트산(glutamic acid-aspartic acid) 및 아르파라긴-글루타민(asparagine-glutamine)이다.

본 명세서에 기술된 바와 같이, 항체와 면역글로블린 분자의 아미노산 서열 내의 작은 변형은 본 발명에 의해 포함된 바로, 관찰된다. 즉, 본 명세서에 기술된 항체 또는 면역글로블린의 아미노산 서열 내의 상기 변동은 최소 75%, 바람직하게는 최소 80%, 90%, 95% 및 가장 바람직하게는 99% 서열 동일성을 제공한다. 특히, 보존적인 아미노산 치환(conservative amino acid replacement)이 고려된다. 보존적인 치환은 연관이 있는 곁사슬을 가지는 아미노산의 집단(family) 내에서 일어난다. 유전적으로 암호화된 아미노산은 일반적으로 다음의 집단으로 나뉜다: (1) 산성(acidic)=아스파르트산, 글루탐산; (2) 염기성(basic)=리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비-극성(non-polar)=알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및, (4) 비전하 극성(uncharged polar)=글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신. 좀 더 바람직한 집단은 다음과 같다: 세린과 트레오닌은 지방족 수산기 과(aliphatic-hydroxy family)이고; 아스파라긴과 글루타민은 아미드-함유 과(amide-containing family)이고; 알라닌, 발린, 루이신 및 이소루이신은 지방족 과(aliphatic family)이고; 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 방향족 과(aromatic family)이다. 예를 들어, 루이신은 이소루이신이나 발린으로, 아스파르트산은 글루탐산으로, 트레오닌은 세린으로, 또는 아미노산을 구조적으로 연관이 있는 아미노산으로의 유사한 치환이 결과물 분자의 결합기능 또는 특성에 주요한 영향을 주지 않을 것이며, 특히, 상기 치환이 프레임웍(framework) 영역 내에 포함되지 않는다면 더욱 그러할 것이라는 예상을 할 수 있다. 아미노산 변화가 기능적 펩티드를 야기하는지의 여부는 상기 폴리펩티드 유도체의 비활성을 측정함으로써 용이하게 측정할 수 있다. 검사법은 본 명세서에서 상세히 설명하였다. 항체나 면역글로블린 분자의 절편 또는 유사체는 이 분야의 통상의 기술로 용이하게 제조할 수 있다. 바람직한 절편과 유사체의 아미노- 와 카르복시-말단은 기능 부위의 경계 근처에서 발생한다. 구조적 및 기능적 부위는 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열을 공공의 또는 개인의 서열 자료와 비교함으로써 확인할 수 있다. 바람직하게는, 컴퓨터화된 비교방법을 공지된 구조 및/또는 기능의 다른 단백질에서 발생하는 서열 모티브(motif) 또는 예상된 단백질 형태 부위를 확인하는데 사용한다. 공지된 3차 구조로 접힌 단백질 서열을 확인하는 방법이 알려졌다(참조: Bowie et al., Science 253:164(1991)). 따라서, 전술한 예들은 당업자라면 본 명세서에 기술된 항체를 가지고, 구조적 및 기능적 부위를 정의하는 데 사용되는 서열 모티브와 구조적 형태를 인식할 수 있다는 것을 증명한다.

바람직한 아미노산의 치환은 다음과 같다: (1) 단백질 분해에의 민감성 감소, (2) 산화에의 민감성 감소, (3) 단백질 복합체 형성에의 결합 친화도 변경, (4) 결합 친화도 변경, 및 (4) 이러한 유사체의 물리화학적 또는 기능적 특성 부여 또는 변경. 유사체는 자연계에 존재하는 펩티드 서열이외의 돌연변이 단백질(mutein)을 포함한다. 예를 들면, 하나 또는 다수의 아미노산의 치환(바람직하게는, 보존적인 아미노산 치환(conservative amino acid substitution))이 자연계에 존재하는 서열에 가해질 것이다(바람직하게는, 폴리펩티드 분자 내의 접촉을 형성하는 폴리펩티드 외부의 부분에). 보존적인 아미노산 치환은 모체 서열(parent sequence)의 구조적 특징을 충분히 바꾸지 않는다(예를 들면, 아미노산의 치환은 모체 서열 내의 나선구조를 파괴하거나, 모체 서열을 특징짓는 다른 형태의 이차구조를 방해하지 않아야 한다). 폴리펩티드 2차와 3차 구조 인식(art-recognized)의 예로서는, 본 명세서에 참조문헌으로 포함된 Proteins, Structures and Molecular Principles(Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York(1984)); Introduction to Protein Structure(C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y.(1991)); 및 Thornton et al., Nature 354:105(1991)에 기술되어있다.

본 명세서에서 사용된 “폴리펩티드 절편(polypeptide fragment)"이라는 용어는 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단 결실(deletion)이 있는 폴리펩티드로서, 남아 있는 아미노산 서열은, 예를 들어, 전장의(full length) cDNA 서열처럼, 자연계에 존재하는 서열이 추론되는 상응하는 위치와 동일한 폴리펩티드를 의미한다. 통상적으로, 절편은 최소 5, 6, 8, 또는 10개 아미노산 길이이며, 바람직하게는 최소 14개 아미노산 길이이고, 좀 더 바람직하게는, 최소 20개 아미노산 길이로, 보통 최소 50개 아미노산 길이이고, 가장 바람직하게는, 최소 70개 아미노산 길이로 한다. 본 명세서에 사용된 “유사체(analog)"라는 용어는 최소 25개 아미노산의 절편으로 이루어진 폴리펩티드를 의미하며, 추론된 아미노산 서열의 부분에 실제적 동일성을 가지고 다음의 특징 중 적어도 하나를 가진다: (1) 적절한 결합 조건하에 CD20에 특이적으로 결합, (2) CD20을 발현하는 세포의 자살(apoptosis)을 유도하는 능력, (3) 항체 의존적 세포 매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)를 유도하는 능력, 또는 (4) 보체 의존적 세포독성(complement dependent cytotoxicity, CDC)을 유도하는 능력. 통상적으로, 폴리펩티드 유사체는 자연계에 존재하는 서열에 대하여 보존적인 아미노산의 치환(substitution), 부가(addition) 및 결실(deletion))을 포함한다. 유사체는 통상적으로 최소 20개 아미노산 길이이고, 바람직하게는, 최소 50개 아미노산 길이 또는 그 이상이고, 종종 자연계에 존재하는 전장의 폴리펩티드만큼 길 수도 있다.

펩티드 유사체(analog)는 제약 산업에서 흔히 주형(template) 펩티드의 유사한 특성의 비펩티드로 사용된다. 이러한 형태의 비펩티드 화합물은 “펩티드 모방체(peptide mimetic)” 또는 “펩티드 유사체(peptidomimetic)”라 불리운다. 본 명세서에 참조문헌으로 포함된 Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29(1986); Veber and Freidinger TINS p.392(1985); 및 Evan et al. J. Med. Chem. 30:1229(1987) 참조. 이러한 화합물은 종종 컴퓨터화된 분자 모델링의 도움으로 개발된다. 치료적으로 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모방체는 동일한 치료적 또는 질병 예방적 효과를 생성할 것이다. 일반적으로, 펩티드 유사체는 예를 들어, 인간항체 등의 범례 폴리펩티드(paradigm polypeptide, 예를 들어, 생화학적 특성 또는 약학적 활성을 가지는 폴리펩티드)와 구조적으로 유사하나, 추가로구성된 집단으로부터 이 분야에 잘 공지된 방법으로 선택된 연결이 하나 또는 그 이상의 선택적으로 교체된 펩티드 연결을 가진다: --CH₂NH--, --CH₂S--, --CH₂-CH₂--, --CH=CH--(시스(cis)와 트랜스(trans)), --COCH₂--, CH(OH)CH₂-- 및 --CH₂SO--. 같은 형태의 D-아미노산(예를 들어, L-리신 대신의 D-리신)과 일치하는 서열의 하나 또는 그 이상의 체계적인 아미노산 교체는 좀 더 안정적인 펩티드 형성에 사용될 것이다. 아울러, 일치 서열 또는 충분하게 동일한 일치 서열 변이를 포함하는 강제적인 펩티드(constrained peptide)는 이 분야의 공지된 방법으로 형성될 것이다(본 명세서에 참조문헌으로 포함된 참조: Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387(1992)); 예를 들면, 분자 내부에 이황화물 다리(disulfide bridge)를 형성할 수 있는 내부의 시스테인 잔기의 부가에 의해, 펩티드를 환형화(cyclize)한다.

본 명세서에 사용된 “항체(antibody)"라는 용어는 내부 표면 모양과 항원의 항원 결정의 특징에 상응하는 전하 분포의 3차원적 결합공간(binding space)을 포함하는 폴리펩티드의 접힘에 의해 형성된 최소 하나의 결합 영역(binding domain)를 가지는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 집단을 의미한다. 항체는 통상적으로 폴리펩티드 사슬의 두 동일한 쌍(pair)을 가지며, 각 쌍은 하나의“경쇄(light)”와 하나의 “중쇄(heavy)”로 구성된 4량체(tetrameric) 형태를 가진다. 각각의 경/중쇄 쌍의 가변영역은 항체 결합부위를 형성한다.

본 명세서에서 사용된 “표적 결합제(targeted binding agent)"라는 용어는 표적부위에 우선적으로 결합하는 항체 또는 결합절편 같은 것들이다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 표적 결합제는 오직 하나의 표적부위에 특이적으로 결합한다. 다른 실시태양에 따르면, 상기 표적 결합제는 하나 또는 그 이상의 표적부위에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 표적 결합제는 단클론 항체일 수 있고, 상기 표적부위는 에피토프일 수 있다.

항체의 “결합절편(binding fragment)”은 재조합 DNA 기술에 의해 또는 본래 항체의 효소적 또는 화학적 분해에 의해 생성된다. 결합절편은 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv 및 단일사슬 항체를 포함한다. 항체는 “이중특이적(bispecific)” 또는 “이중기능적(bifunctional)”항체가 아닌 각각이 동일한 그의 결합부위를 가지고 있는 것으로 이해된다. 고도한 항체는 수용체가 상대-수용체(counter-receptor)에 결합하는 양을 최소 약 20%, 40%, 60%, 또는 80%, 및 좀 더 일반적으로 약 85% 이상으로 감소시킬 때(생체 외 경쟁 결합 검사법으로 측정), 수용체의 상대-수용체에의 결합을 충분히 억제한다.

항체는 올리고클론(oligoclonal), 다클론항체(polycolonal antibody), 단클론 항체(monoclonal antibody), 키메라 항체(chimeric antibody), CDR-접합 항체(CDR-grafted antibody), 다중 특이적 항체(multi-specific antibody), 이중특이적 항체(bispecific antibody), 촉매항체(catalytic antibody), 키메라 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody), 완전한 인간항체(fully human antibody), 항유전자형 항체(anti-idiotype antibody) 및 가용성 또는 결합된 형태로 표지할 수 있는 항체뿐만 아니라, 절편, 변이체 또는 그것의 유도체, 이들 단독 또는 공지된 기술에 의해 제공될 수 있는 다른 아미노산 서열의 조합일 수 있다. 항체는 어떤 종에서든 유래할 것이다. 상기 항체란 용어는 본 발명의 항체의 결합된 절편; Fv, Fab, Fab', 단일가닥 항체(svFC), 이량체 가변영역(dimeric variable region, Diabody) 및 가변영역을 안정화하는 이황화물(disulfied, dsFV)을 포함한 통상적인 절편 또한 포함한다.

“에피토프(epitope)”라는 용어는 면역글로블린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 어떤 단백질 결정기(determinant)를 포함한다. 에피토프 결정기(epitopic determinant)는 일반적으로 아미노산 또는 당 곁사슬 등분자의 화학적으로 활성을 가지는 표면기를 포함하며, 아마도, 그러나 항상 그렇지 않은, 특정 3차 구조적 특징뿐만 아니라, 특정 전하 특징을 가진다. 항체는 해리상수(dissociation constant)가 ≤1μM일 때, 바람직하게는, ≤100nM일 때, 및 가장 바람직하게는, ≤10nM일 때, 항원에 특이적으로 결합한다고 한다.

본 명세서에 사용된 “약물(agent)”이라는 용어는 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합, 생물학적 거대분자, 또는 생물학적 물질로부터의 추출물(extract)을 의미한다.

CD20 폴리펩티드와 관련하여, “활성의(active)” 또는 “활성(activity)”이라는 용어는 천연의 CD20 폴리펩티드의 생물학적 또는 면역학적 활성을 가지는 CD20 폴리펩티드의 일부분을 의미한다. 본 명세서에서, “생물학적(biological)”이란 용어는 천연의 CD20의 활성으로부터 야기되는 생물학적 기능을 의미한다. 바람직한 CD20 생물학적 활성은 예를 들어, B-림프구 분열 증식을 포함한다.

본 명세서에 사용된 “포유동물(mammal)”은 포유류라 여겨지는 어떤 동물을 의미한다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간이다.

파파인(papain) 효소에 의한 항체의 분해는 "Fab" 절편 및 "Fc"절편으로 공지된 두 개의 동일한 항원-결합절편을 생성하는데, 항원-결합 활성을 가지지 않지만, 결정화할 수 있는 능력은 가지고 있다. 파파인에 의한 항체의 분해는 항체의 두 팔이 연결된 채로 남아 있고, 두 항원결합 주위로 구성된 F(ab')₂ 절편을 형성한다. F(ab')₂ 절편은 항원을 연결하는 능력을 가진다.

“Fv"라는 용어는 본 명세서에 사용될 때, 항원 인식과 항원 결합부위를 유지하는 항체의 최소 절편을 의미한다.

“Fab"라는 용어는 본 명세서에 사용될 때, 경쇄의 고정영역(constant domain)과 중쇄의 CH1 부위를 포함하는 항체의 절편을 의미한다.

“mAb”라는 용어는 단클론 항체를 의미한다.

본 명세서에 사용된 “리포좀(liposome)"라는 용어는 본 발명의 CD20 폴리펩티드 또는 CD20 폴리펩티드에 대한 항체를 포함하는 약물의 포유류에의 전달에 이용되는 작은 소포(small vesicle)를 의미한다.

본 명세서에 사용된 “표지(label)” 또는 “표지된(labeled)"라는 용어는 폴리펩티드를 검출할 수 있는 부위, 예를 들어, 방사성 표지, 형광표지, 효소표지, 화학발광 표지된(chemiluminescent labeled) 또는 바이오티닐기(biotinyl group)의 부가를 의미한다. 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종은 ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I를 포함하고, 형광표지는 로다민(rhodamine), 란탄족형광체(lanthanide phosphor) 또는 FITC를 포함하며, 효소표지는 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시페라제, 알칼라인 포스파타제를 포함한다.

본 명세서에서 “의약적 약물 또는 약물(pharmaceutical agent or drug)”이라는 용어는 환자에 적절히 투여하였을 때, 원하는 치료적 효과를 유도하는 화학적 화합물 또는 합성물을 의미한다. 이 분야의 통상적인 사용에 따라 본 명세서에 사용된 다른 화학적 용어들은 The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco(1985))(참조문헌으로 포함된)에 예시되어 있다.

본 명세서에 사용된 “대체로 순수한(substantially pure)”은 개체종(object species)이 우점종(predominant species)으로 존재하는(즉, 몰수를 기준으로, 조성물에서 다른 어떤 개개의 종보다 풍부한) 것을 의미하며, 바람직하게는 대체로 순수한 분획은 개체종이 존재하는 모든 거대분자 종 중에 최소 약 50%(몰수를 기준으로)를 포함하는 조성물이다. 일반적으로, 대체로 순수한 조성물은 조성물 중에 존재하는 모든 거대분자 종 중에 약 80% 이상을 포함하며, 좀 보다 바람직하게는, 약 85%, 90%, 95% 및 99% 이상을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 개체종은 조성물이 본질적으로 하나의 거대분자 종을 포함하는 본질적 동종(essential homogeneity)으로 정제된다(통상적인 검출방법에 의해서는 오염종(contaminant species)을 검출할 수 없다).

“항체 의존성 세포 매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)” 또는 “ADCC”는 표적세포에 결합한 항체를 인지하여 표적세포의 용혈을 야기하는 Ig Fc 수용체(FcRs)(예를 들어, 자연 세포독성 세포(natural killer(NK) cell, 단구체(monocyte), 호중구(neutrophil) 및 대식세포(macrophage))를 발현하는 비특이적 세포독성 세포의 세포-매개 반응을 의미한다. ADCC를 야기하기 위한 원발성 세포(primary cell), 자연 세포독성 세포(natural killer cell)는 오직 FcγRⅢ만 발현하는 반면, 단구체(monocyte)는 FcγRⅠ, FcγRⅡ, FcγRⅢ를 발현한다. 조혈세포(hematopoietic cell)의 FcRs 발현은 라벳치(Ravetch)와 키넷(Kinet)의 Annu. Rev. Immunol., 9: 457-92(991)의 464페이지 표 3에 요약되어 있다. 목적하는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, USP 5,500,362 또는 5,821,337에 개시되어 있는 실험실 조건의 ADCC 검사가 행해질 수 있다. 이 검사에 필요한 작용기 세포(effector cell)는 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)와 자연 세포독성 세포(natural killer(NK) cell)를 포함한다. 추가적으로 또는 선택적으로, 목적하는 분자의 ADCC 활성은 예를 들면, Clynes, et al., PNAS(USA), 95: 652-656(1988)에 개시된 것과 같은 동물모델(animal model) 등의 생체조건에서 측정될 수 있다.

“보체 의존성 세포독성(complement dependent cytotoxicity)” 또는 “CDC”는 항체의 세포독성 기능을 수행하는 기작을 의미한다. 이는 항체와 결합된 Igs, IgG, IgM의 Fc 영역에, 보체의 첫번째 성분의 구성요소인 C1q가 결합함으로써 개시된다(참조: Hughs-Jones,. N. C., and B. Gardner, 1979, Mol. Immunol., 16: 697). C1q는 사람의 혈청 내에서 70㎍/ml의 농도로 존재하는 ~410kDa의 구조적으로 복잡하고 커다란 당단백질이다(참조: Cooper, N. R., 1985, Adv. Immuno., 37: 151). 2개의 세린 프로테아제인 C1r, C1s와 함께, C1q는 보체의 첫번째 성분인 C1의 복합체(complex C1)을 형성한다. 적어도 C1q의 N 말단의 구상 두부(globular head)의 2개는 보체 연쇄반응(complement cascade)을 개시하기 위한 C1 활성화를 위하여 Igs의 Fc와 결합해야 한다(참조: Cooper, N. R., 1985, Adv. Immunol., 37: 151).

“전혈검사(whole blood assay)”는 자연적인 작동기의 근원(source)으로서, 분획되지 않은 혈액(unfractionated blood)을 사용한다. 혈액은 다형핵 세포(polymorphonuclear cells, PMNs)와 단핵 세포(mononuclear cells, MNCs) 등의 FcR을 발현하는 세포 작동기(cellular effector)와 함께, 혈장에 보체를 함유하고 있다. 따라서, 전혈검사는 실험실 조건에서 ADCC와 CDC 작동 기작의 상승효과(synergy)를 동시에 평가할 수 있다.

“환자(patient)”라는 용어는 인간과 수의학적 개체를 포함한다.

항체구조

기초적인 항체 구조의 단위는 사량체(tetramer)로 알려져 있다. 각 사량체는 폴리펩티드 사슬인 하나의 "경쇄(light chain)"(약 25kDa)와 하나의 "중쇄(heavy chain)"(약 50-70kDa)를 가지는 2개의 동일한 쌍을 포함한다. 상기 각 사슬의 아미노 말단(amino-terminal) 부분은 주로 항체 인식(antigen recognition)을 위한 약 100 내지 110 또는 더 많은 아미노산의 가변영역(variable region)을 포함한다. 상기 각 사슬의 카복시 말단(caboxy-terminal) 부분은 주로 효과 기능(effector function)을 위한 불변영역(constant region)을 정의한다. 인간 경쇄는 카파(kappa)와 람다(lambda) 경쇄로 구분된다. 중쇄는 뮤(mu), 델타(delta), 감마(gamma), 알파(alpha) 또는 엡실론(epsilon)으로 구분되고, 상기 항체의 동형(isotype)인 IgM, IgD, IgA 및 IgE을 정의한다. 경쇄와 중쇄의 내부에, 가변영역와 불변영역은 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함하는 중쇄와 약 12개 또는 그 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결된다(참조: Fundamental Immunology Ch. 7(Paul W., ed. 2nd ed., Raven Press, N.Y.(1989))). 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변영역은 항체 결합부위를 형성한다.

따라서, 자연적인 항체는 2개의 결합부위를 갖는다. 이중기능성(bifunctional) 또는 이중특이성(bispecific) 항체를 제외하고는, 상기 2개 결합부위는 동일하다.

상기 사슬은 모두 상보성 결정부위(complementarity determining regions, CDRs)라고도 하는 3개의 과다 가변영역(hyper variable region)에 의해 연결된 상대적으로 보존된 프레임 영역(framework region, FR)의 일반적으로 동일한 구조를 가진다. 각 쌍의 2개 사슬에서 상기 CDRs는 특이적인 에피토프에 결합할 수 있도록 하는 프레임 영역에 의해 정렬된다. N 말단에서 C 말단까지, 중쇄와 경쇄는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 영역에 아미노산을 할당하는 것은 면역적으로 중요한 단백질의 Kabat서열의 정의를 따른다(참조: National Institutes of Health, 베데스다, 마릴랜드(1987 및 1991) 또는 Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917(1987); Chothia, et al., Nature, 342: 878-883(1989)).

이중특이성 또는 이중기능성 항체는 2개의 다른 중쇄/경쇄 쌍과 두개의 다른 결합부위를 가지는 인공적인 혼성화 항체(hybrid antibody)이다. 이중특이성 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 절편의 연결을 포함하는 방법의 다양성에 의해 생성될 수 있다(참조: Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79: 315-321(1990), Kostelny, et al., J. Immunol., 148: 1547-1553(1992)). 이중특이성은 하나의 결합부위(예를 들어, Fab, Fab' 및 Fv)를 가지는 절편의 형태에서는 존재하지 않는다.

인간항체 및 항체의 인간화

인간항체는 항체가 마우스 또는 랫트의 가변 및/또는 고정영역을 가지는 것과 관련된 일부 문제를 회피한다. 이러한 생쥐 또는 랫트 유래 단백질의 존재는 항체를 빨리 제거하거나, 또는 환자에 의해 항체에 대한 면역반응을 유도할 수 있다. 생쥐 또는 랫트 유래 항체를 사용하는 것을 피하기 위하여, 완전한 인간항체를 설치류, 다른 포유동물 또는 동물에 기능성 인간항체 좌(loci)를 도입하여 생성하여, 설치류, 다른 포유류 또는 동물이 완전한 인간항체를 생성한다.

완전한 인간항체를 생성하는 한 가지 방법은 인간 중쇄 좌와 카파(kappa) 경쇄 좌의 절편으로 형성된 1000kb 까지 이르나 이보다 적은 크기의 배선(胚線, germ line)을 포함하도록 조작된 마우스의 XenoMouse^®계통의 이용하는 것이다. 상기 XenoMouse^®계통은 Abgenix, Inc(Fremont, CA)로부터 입수가능하다. 그리고, 이러한 마우스는 인간 면역글로블린 분자 및 항체의 생산에 유용하고, 생쥐의 면역글로블린 분자 및 항체를 생성하지 않는다. 이러한 기술은 본 명세서에 참조문헌으로 삽입된 1996년 12월 3일자 출원한 미합중국 특허출원 08/759,620과 1998년 6월 11일자 공개된 WO 98/24893, 및 2000년 12월 21일자 공개된 국제특허공개 WO 00/76310에 개시되어 있다. 또한, 역시 본 명세서에 참조문헌으로 삽입된 Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156(1997)를 참조하라.

일반적으로, 융합된 하이브리도마에 의해 생산된 항체는 완전한 인간 카파 또는 람다 경쇄를 가지는 인간 IgG1 또는 IgG4 중쇄이다. 항체는 IgG2 중쇄를 포함하는 다른 인간 동형의 항체일 수도 있다. 상기 항체는 통상적으로 형광 활성화된 세포 분류기(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS)에 기초한 친화도 측정 기술에서 세포에 대하여 측정하였을 때, 약 10^-6 내지 약 10^-12M 또는 그 이하의 Kd값을 가지는 높은 친화도를 가졌다. 상기 친화도는 고체상(solid phase) 및 액체상(solution phase) 기술에 의해서도 측정 가능하다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 항체는 12nM 이하의 Kd 값으로 CD20에 결합하고, B 림프종의 세포자살을 유도한다. 본 발명의 일부 실시태양에 따르면, 상기 항체는 약 10, 9, 8, 7, 6, 5 또는 4nM 이하의 Kd 값으로 CD20에 결합한다.

당업자라면 이해할 수 있듯이, 항 CD20 항체는 하이브리도마 세포외의 다른 세포주에서 발현시킬 수 있다. 부분적인 항체를 암호화하는 서열은 적합한 포유동물 숙주세포를 형질전환하는데 사용될 수 있다. 형질전환은 예를 들어, 바이러스(또는 바이러스 벡터)에 상기 폴리뉴클레오티드를 포장(packaging)하고 바이러스(또는 벡터)로 숙주세포를 변환시키는 단계를 포함하는, 숙주세포에 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 공지된 방법 또는 USP 4,399,216, 4,912,040, 4, 740,461 및 4,959,455에 공지된 형질도입 방법으로도 가능하다. 상기 형질전환 방법은 형질전환시키기 위한 숙주에 따라 좌우된다. 포유동물 세포에 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하는 방법은 공지되어 있으며, 덱스트란을 이용한 형질도입법(dextran-mediated transfection), 칼슘 포스페이트 침전법(calcium phosphate precipitation), 폴리브렌을 이용한 형질도입법(polybrene mediated transfection), 원형질체 융합법(protoplast fusion), 전기천공법(electroporation), 상기 폴리뉴클레오티드에 대한 리포솜 포획법(encapsulation) 및 핵에 DNA를 직접 도입하는 미세주사법(direct microinjection)을 포함한다.

발현을 위한 숙주로서 유효한 포유동물 세포주는 공지되어 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, 중국 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovary cell, CHO cell), HeLa 세포, 아기 햄스터 신장(baby hamster kidney, BHK) 세포, 원숭이 신장(monkey kidney, COS) 세포, 인간 간세포 암종(human hepatocellular carcinoma, 예를 들어, Hep G2) 세포, 인간 신장 상피 293(human epithelial kidney 293) 세포 및 많은 수의 다른 세포주를 포함하는, 미합중국 종균협회(American Type Culture Collection, ATCC)로 부터 입수가능한 많은 불멸세포주를 포함한다.

항 CD20 항체는 환자의 시료에서 CD20을 검출하는데 유용하고, 본 명세서에 개시한 질환의 상태를 진단하는데에도 유용하다. 그외에도, 세포자살 유도, ADCC 유도 및/또는 CDC 유도능력(하기 실시예에서 설명한다)에 기초하여, 항 CD20 항체는 B 세포에 CD20의 발현으로 인한 증상 및 건강 상태를 치료하는 효과를 가진다. 본 발명의 실시태양에 따르면, 본 명세서에 개시한 상기 항체와 방법은 CD20에 의해 유도되는 종양성장으로 인한 증상의 치료와 관련이 있다. 다른 실시태양은, B 세포 만성 림프구성 백혈병, 소 림프구성 림프종, B 세포 전 림프구성 백혈병, 림프 형질세포성 림프종, 외투세포 림프종, 양성, 중성 및 음성을 포함하는 난포성 림프종, 피부 난포중추 림프종, 가장자리 영역 B 세포 림프종(MALT 형, 결절 및 지라형), 머리카락 세포 백혈병, 큰 B 세포 확산 림프종, 버킷 림프종, 형질세포종, 형질세포 골수종, 이식후 면역증식 질환, 왈덴스트롬 마크로글로블린혈증 및 큰 세포 역형성 림프종 등의 전구체 B 세포 림프모구성 백혈병/림프종 및 성숙 B 세포 신생물을 포함하는 비-호킨 림프종 등의 종양성 질환의 치료에 상기 항체와 방법을 이용하는 것을 포함한다. 이외에도, 예시적인 질환은 리투잔^® 치료 후 재발 또는 불응성 B-NHL을 포함한다. 면역계 질환은 크론병, 베게너 육아종, 건선, 건선성 관절염, 피부염, 전신 피부경화증 및 경화증, 염증성 창자질환, 궤양대장염, 호흡곤란 증후군, 수막염, 뇌염, 포도막염, 사구체신염, 습진, 천식, 죽상 동맥경화, 백혈구 부착 결핍증, 다발경화증, 레이나우드 증후군, 쇼그렌 증후군, 유년발병형 당뇨, 라이터 질환, 베켓 질환, 면역 복합성 신장염, IgA 신장병증, IgM 다발신경병증, 급성 특발성 혈소판 감소성 자색증 및 만성 특발성 혈소판 감소성 자색증 등의 면역 야기 혈소판 감소증, 용혈성 빈혈, 중증 근육무력증, 루프스 신염, 전신 홍반 루프스, 류마티스성 관절염, 아토피 피부염, 천포창, 그레이브 질환, 하시모토 갑상샘염, 오멘 증후군, 만성 신부전, 급성 전염성 단핵구증, HIV 및 허퍼스 바이러스 관련 질환을 포함한다. 추가적인 질환은 심각한 급성 호흡곤란 증후군과 무도성 망막염을 포함한다. 다른 예로서는, 엡스테인바 바이러스 등의 B 세포 감염 바이러스에 의해 야기되는 질환 및 질병을 포함한다.

항체의 서열

본 발명의 실시태양은 표 1에 개시된 특이적인 항 CD20 항체를 포함한다. 이 표는 중쇄와 경쇄 유전자에 상응하는 가변영역의 서열번호와 함께, 각 항 CD20 항체의 인식번호(identification number)를 나타낸다.

각 항체에게는 하나 또는 두 개의 소수점으로 구분되는 두 개 또는 세 개의 숫자를 포함하는 인식번호가 주어졌다. 몇몇 경우에, 하나의 소수점으로 구분되는 오직 두 개의 인식번호가 개시되어 있다. 그러나, 어떤 경우에는, 하나의 항체의 몇 개의 클론이 제조되었다. 비록, 상기 클론이 모체서열(parental sequence)과 동일한 핵산과 아미노산 서열을 갖는다 하더라도, 그들은 두 번째의 소수점의 오른쪽 숫자에 의해 표시되는 클론 수로 분리되어 개시되었다. 따라서, 예를 들어, 항체 1.2의 핵산과 아미노산 서열은 항체 1.2.1, 1.2.2 및 1.2.3의 서열과 동일하다.

mAb 인식번호	서 열	서 열 번 호
1.1.2	중쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	1
	중쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	2
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	3
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	4
1.10.3.1	중쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	5
	중쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	6
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	7
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	8
1.11.3.1	중쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	9
	중쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	10
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	11
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	12
1.12.1	중쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	13
	중쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	14
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	15
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	16
1.13.1	중쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	17
	중쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	18
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	19
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	20
1.2.1.1	중쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	21
	중쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	22
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	23
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	24
1.4.1	중쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	25
	중쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	26
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	27
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	28
1.5.3	중쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	29
	중쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	30
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	31
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	32
1.6.1	중쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	33
	중쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	34
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	35
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	36
1.7.1	중쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	37
	중쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	38
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	39
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	40
1.9.1	중쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	41
	중쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	42
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	43
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	44
2.1.1	중쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	45
	중쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	46
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	47
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	48

2.2.1	중쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	49
	중쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	50
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	51
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	52
2.4.1	중쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	53
	중쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	54
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	55
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	56
3.1.1	중쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	57
	중쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	58
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	59
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	60
3.2.1	중쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	61
	중쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	62
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	63
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	64
3.31	중쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	65
	중쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	66
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	67
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	68
3.4.1	중쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	69
	중쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	70
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	71
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	72
3.7.1	중쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	73
	중쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	74
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	75
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	76
4.2.1.1	중쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	77
	중쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	78
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	79
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	80
4.6.1	중쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	81
	중쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	82
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	83
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	84
6.3.1	중쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	85
	중쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	86
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	87
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	88
7.1.1	중쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	89
	중쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	90
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	91
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	92
7.17.1	중쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	93
	중쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	94
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	95
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	96
7.18.1	중쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	97
	중쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	98
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	99
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	100

7.21.1	중쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	101
	중쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	102
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	103
	경쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	104
7.23.1	중쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	105
	중쇄의 가변영역을 암호화하는 아미노산서열	106
7.23.1.1 k2	경쇄의 가변영역을 암호화하는 염기서열	107
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치료적 투여 및 제제화

항 CD20 항체는 CD20 발현과 관련된 증상 및 상태를 치료하는 효과를 가진다. 예를 들어, 상기 항체는 CD20을 발현하는 세포의 세포자살을 유도하여 종양성장 억제를 억제할 수 있거나, 또는 담체와 결합하여 표적세포에 치사 독소(lethal toxin)를 전달할 수 있다. 그외에도, 상기 항 CD20 항체는 질환의 상태, 특히 종양성 및 면역질환을 위한 진단에 유용하다.

원하는 경우, 항 CD20 항체의 동형(isotype)은, 예를 들어 다른 동형의 생물학적 성질을 이용하기 위하여 연결될 수 있다. 예를 들어, 경우에 따라서는, 항체가 보체를 고정하고 CDC에 기여할 수 있도록, CD20에 대한 치료 항체로서의 항체가 생성되는 것이 바람직할 것이다. 이에 제한되는 것은 아니나, 생쥐의 IgM, 생쥐의 IgG2a, 생쥐의 IgG2b, 생쥐의 IgG3, 인간 IgM, 인간 IgA, 인간 IgG1 및 인간 IgG3을 포함하는, 많은 항체의 동형이 있을 수 있다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 효과기 세포에 Fc 수용체가 결합하고, ADCC에 기여할 수 있도록, CD20에 대한 치료 항체로서의 항체가 생성되는 것이 바람직할 것이다. 이에 제한되는 것은 아니나, 생쥐의 IgG2a, 생쥐의 IgG2b, 생쥐의 IgG3, 인간 IgG1 및 인간 IgG3을 포함하는, 많은 항체의 동형이 있을 수 있다. 생성되는 항체는 처음부터 그러한 동형을 가질 필요가 없으나, 어떠한 동형이라도 가질 수 있고, 차후에 당해 분야에 공지된 통상적인 기술을 이용하여 연결된 동형일 수도 있다. 그러한 기술은 직접 재조합 기술(direct recombinant technique)(참조: USP 4,816,397), 세포 간 융합 기술(cell-cell fusion technique)(참조: USP 5,916,771 및 6,207,418), 이외의 다른 것들의 이용을 포함한다.

예로서, 상기 항 CD20 항체는 완전한 인간항체이다. 만약 항체가 CD20에 바람직한 결합을 한다면, 그것은 여전히 같은 (항체의 특이성 및 친화도의 일부를 정의하는) 가변부위를 가지는 인간 IgM, 인간 IgG1 또는 인간 IgG3 동형을 생성하기 위하여 연결되는 동형일 수 있다. 이러한 분자들은 보체를 고정하고 CDC에 기여할 수 있고/있거나 효과기 세포의 Fc 수용체에 결합하고 ADCC에 기여할 수 있을 것이다.

세포 간 융합 기술에서, 골수종, CHO 세포 또는 다른 세포주는 바람직한 동형의 중쇄를 가지도록 작제되고, 또 다른 골수종, CHO 세포 또는 다른 세포주는 경쇄를 가지도록 작제된다. 이러한 세포는 차후에, 융합될 수 있고, 자연계에 존재하는 항체를 발현하는 세포주를 분리할 수 있다.

따라서, 항체 후보는 바람직한 "구조적(structural)" 속성을 가지고 생성되기 때문에, 그들은 일반적으로 동형 연결(isotype switching)을 통하여 바람직한 어떤 "기능적인(functional)" 특성을 제공받는다.

본 발명의 실시태양에 따르면, 질환을 치료하기에 유용한 항 CD20 항체의 무균의 약학 제제를 포함한다. 이러한 제제들은 B 림프종 세포의 세포자살을 유도함으로써, 예를 들어, CD20 발현이 비정상적으로 증가하거나 CD20을 발현하는 세포가 질환의 상태를 야기하는 병리적 상태를 효과적으로 치료한다. 항 CD20 항체는 CD20에 특이적으로 결합하기에 적절한 친화도를 가지는 것이 바람직하고, 또한 사람에게 낮은 빈도로(infrequent) 복용시키기에 적합하도록 적절한 약효의 지속기간을 가지는 것이 바람직하다. 약효의 지속기간이 길면 낮은 빈도로 사용하는 것이 가능하고, 피하주사 또는 근육내 주사 등의 비경구적 경로를 번갈아가며 더 알맞은 복용 계획을 세우는 것이 가능할 것이다.

무균 제제는 예를 들어, 항체의 재구성(reconstitution) 및 동결건조 전후에 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체는 대개 동결건조 상태나 용액 상태로 보관될 것이다. 치료 항체의 조성물은 일반적으로, 예를 들어, 피하주사 바늘이 꽂힐 수 있는 마개와 같이, 제제의 보충이 가능한 어댑터를 가지는 정맥주사액의 백(bag) 또는 바이알(vial) 등의 접근 포트를 가지는 용기에 포장한다.

항체의 투여경로는 예를 들어, 정맥(intravenous), 복강내(intraperitoneal), 뇌내(intracerebral), 근육(intramuscular), 안내(intraocular), 동맥(intraarterial), 수막강(intrathecal), 흡입(inhalation) 또는 병변내(intralesional)에 주사 또는 주입, 서방형 유리방식(sustained release system) 등의 공지된 방법이다. 상기 항체는 주입(infusion) 또는 일시주사(bolus injection)에 의해 지속적으로 투여되는 것이 바람직하다.

치료효과를 나타내기 위한 항체의 유효량은 예를 들어, 치료 목적, 투여경로 및 환자의 상태에 좌우될 것이다. 따라서, 주치의는 투여량을 적정하고 적절한 치료효과를 얻기 위하여 요구되는 투여경로를 조작하는 것이 바람직하다. 통상적으로, 임상의사는 바람직한 효과를 얻을 수 있는 투여량까지 항체를 투여할 것이다. 이 치료의 진행은 편리한 검사 또는 여기에 기술된 검사에 의해 간단히 모니터링된다.

상기의 항체는 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합되어 조제된다. 이 치료 조성물은 정맥 또는 코나 폐를 통해, 액체 또는 분말분무제(powder aerosol)로 투여되는 것이 바람직하다. 상기 조성물은 원하는 경우, 비경구 또는 피하에도 투여할 수 있다. 전신에 투여할 때, 상기 치료 조성물은 반드시 멸균되어야 하고, 발열원(pyrogen)이 없어야 하며, pH, 등장성(isotonicity) 및 안정성(stability)이 충분히 고려된 비경구적으로 투여가능한 용액이어야 한다. 이러한 조건은 당업계에 공지된 기술이다. 요약하면, 상기 성분의 투여 제형은 생리학적으로 허용 가능한 담체, 부형제(excipient) 또는 안정화제(stabilizer)와 바람직한 순도(purity)를 가지는 성분을 혼합하여 투여 또는 보관하기 위하여 조제된다. 이러한 물질은 수혜자에게 사용된 투여량과 농도가 비독성이고, Tris-HCl, 인산, 시트르산, 아세트산 및 다른 유기산 염 등의 완충용액; 아스코르브산 등의 항산화제; 폴리아르기닌(polyarginine), 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로블린 등의 단백질 등의 저분자량(잔기가 10개 미만) 펩티드; 폴리비닐파이롤리디논(polyvinylpyrrolidinone) 등의 친수성 고분자; 글리신, 글루탐산, 아스파르트산 또는 알기닌 등의 아미노산; 단당류, 이당류, 셀룰로오즈 또는 그 유도체를 포함하는 다른 탄수화물, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; EDTA 등의 킬레이트제(chelating agent); 만니톨 또는 솔비톨 등의 당알콜(sugar alcohol); 나트륨 및/또는 트윈(TWEEN), 플루로닉스(PLURONICS) 또는 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol) 등의 비이온성 계면활성제를 포함한다.

주사를 위한 무균 조성물은 통상적인 약학적 실무에 따라 제조할 수 있다(참조: Remington: The Science and Practice of Pharmacy(20^th ed., Lippincott Williams & wilkens Publishers(2003)). 예를 들어, 활성 성분이 물 또는 참깨(sesame), 땅콩(peanut) 또는 목화씨(cottonseed) 기름 등의 자연성 식물성 기름, 에틸 올레이트(ethyl oleate) 등의 합성 지질 운반제 등에 용해 또는 현탁되는 것은 바람직하다. 완충용액, 보존제, 항산화제 등은 허용된 약학 실무에 따라 혼합할 수 있다.

서방형 제제의 적절한 예로는 폴리펩티드를 포함하는 고형 소수성 고분자의 반투과성 기질(semipermeable matrix)을 포함하고, 상기 기질은 필름(film) 또는 마이크로캡슐(microcapsule) 등을 포함한다. 서방형 기질의 예로서는 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸메타크릴레이트, 참조: Langer, et al., J. Biomed. Mater. Res., (1981) 15:167-277 및 Langer, Chem. Tech., (1982) 12:98-105), 폴리비닐알콜(poly(vinylalcohol), 폴리락티드(polylactides, 참조: USP 3,773,919, EP 58,481), L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루탐산염의 공중합체(참조: Sidman, et al., Biopolymers, (1983) 22: 547-556), 루프론 디팟^TM(LUPRON Depot^TM 젖산-글리콜산 공중합체와 루프롤리드 아세테이트(leuprolide acetate)로 구성된 주사가능한 미세구(injectable microsphere) 등의 분해성 젖산-글리콜산 공중합체 및 폴리-D-(-)-3-히드로부틸산(poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid, 참조: EP 133,988)을 포함한다.

100일 이상 물질을 유리할 수 있는 에틸렌-비닐 아세테이트와 젖산-글리콜산 등의 고분자에 비하여, 어떤 히드로겔은 단시간에 단백질을 유리시킨다. 포획된(encapsulated) 단백질이 체내에 오랜 시간 남아 있으면, 이는 37℃에서 수분에 노출되어 생물학적 활성의 소실 및 면역성이 변화할 수 있는 변성 또는 응집을 일으킬 수 있다. 합리적인 전략이 기작에 따른 단백질의 안정화를 위하여 고려될 수 있다. 예를 들어, 만약 응집기작이 이황화물 교환에 의한 분자간 S-S 결합에 의한 것이라면, 설프하이드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터 동결건조, 수분함량 조절, 적절한 첨가제 사용 및 특이적 고분자 기질 조성물의 개발 등의 방법으로 안정화시킬 수 있다.

서방형 제제는 또한 현탁액에서 결정을 유지할 수 있는 적절한 제제에 현탁된 항체의 결정제(crystal preparation)를 포함한다. 이러한 제제는 피하주사 또는 복강내주사시 서방효과를 나타낸다. 다른 조성물은 또한 리포좀에 포획된 항체를 포함한다. 이러한 항체를 포함하는 리포좀은 공지된 방법으로 제조할 수 있다(참조: USP DE 3,218,121; Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1985) 82: 3688-3692; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1980) 77: 4030 내지 4034; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; 142,641; JP 83-118008; USP 4,485,045 및 4,544,545; 및 EP 102,324).

환자를 위한 항체 제제의 투여는 질환의 심각도 및 유형, 체중, 성별, 식이, 투여시간 및 경로, 다른 약물과 다른 관련된 임상적 요소를 포함하는 약물의 작용에 영향을 준다고 공지된 다양한 요소를 고려하여 주치의에 의해 결정될 수 있다. 치료적 유효량은 실험실 조건 또는 생체조건의 방법으로 결정할 수 있다.

본 명세서에 개시된 항체의 유효량은 예를 들어, 치료의 목적, 투여 경로 및 환자의 상태에 의존한다. 따라서, 적절한 치료효과를 얻기 위하여 요구되는 투여경로를 변형하거나 투여량을 주치의가 적정하는 것이 바람직하다. 통상적인 일일 투여량은 상기 요인에 따라 다르겠으나, 대략 0.001mg/kg 내지 100mg/kg 또는 그 이상의 범위이다. 통상적으로, 임상의사는 원하는 효과에 도달하는 투여량까지 치료 항체를 투여할 수 있다. 이 치료방법의 경과는 일반적인 검사나 상술한 방법으로 용이하게 모니터링할 수 있다.

본 명세서에 개시된 성분과 방법에 따른 치료적 실재(therapeutic entity)의 투여는 적절한 담체, 부형제 및 제형에 개선된 이동, 수송, 내성 등을 제공하기 위하여 혼합되는 다른 약물과 함께 투여될 수 있다. 이러한 제형은 예를 들어, 분말제, 반고체 연고제(paste), 연고제(ointment), 젤리(jelly), 왁스(wax), 유제(oil), 지질(lipid), 담체(Lipofectin^TM 등)를 포함하는 지질(양이온 또는 음이온), DNA 접합제, 무수 흡착연고제(anhydrous absorption paste), 수중유(oil-in-water) 및 유중수 유탁액(water-in-oil emulsion), 에멀젼 카보왁스(emulsion carbowax, 다양한 분자량의 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)), 반고형겔(semi-solid gel) 및 카보왁스를 포함하는 반고형 혼합물을 포함한다. 상기 혼합물 중 어느 것도 제형의 활성성분이 제형에 의해 비활성화되지 않는다면, 본 발명에 따른 치료 및 치료방법으로 적합하고, 생리학적으로 적합하고 투여경로에 적절할 것이다. Baldrick P., "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol. Pharmacol., 32(2): 210-8(2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm., 203(1-2): 1-60(2000), Charman WN. " Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concetps." J. Pharm. Sci. 89(8): 967-78(2000), Powell et al., "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J. Pharm. Sci. Technol. 52: 238-311(1998) 및 당업자에게 공지된 제형, 부형제 및 담체와 관련된 정보에 대한 인용문헌을 참조하라.

다른 치료제의 설계 및 조제

CD20에 대하여 본 발명에서 생산되고 특정화된 항체의 활성에 따르면, 다른 치료 패턴의 설계가 당업자에 의하여 용이하게 행해질 수 있다. 이러한 패턴은, 이에 제한되는 것은 아니나, 이중특이성(bispecific) 항체, 면역독소법, 방사성 동위원소 치료법 및 단일 항체 V 영역, V 부위 구조(scaffold)와 다른 구조에 기초한 항체-유사 결합제, 펩티드 치료법의 개발, 유전자 치료법, 부분적 인트라바디(intrabody), 안티센스 치료법(antisense therapeutics) 및 저분자 등의 개선된 항체 치료법을 포함한다.

개선된 항체 치료방법과 관련하여, 보체의 고정을 원한다면, 이중특이성, 면역독소 또는 방사성 동위원소의 사용을 통한 세포사멸의 보체 의존성을 회피할 수 있을 것이다.

예를 들어, 이중특이성 항체는 (i) CD20 특이적인 항체와 2차 분자 특이적인 다른 항체가 서로 접합된 2개의 항체, (ii) CD20에 특이적인 하나의 사슬과 2차 분자 특이적인 두번째 사슬을 가지는 하나의 항체, 또는 (iii) CD20과 2차 분자 모두에 특이적인 단일 사슬 항체를 포함하도록 생성될 수 있다. 이러한 이중특이성 항체는 공지된 기술을 사용하여 생성할 수 있다: 예를 들어, (i)과 (ii)에 관련되어, Fanger et al., Immunol. Methods., 4: 72-81(1994) 및 Wright and Harris, supra. 및, (iii)과 관련되어, Traunecker et al., Int. J. Cancer.(Suppl.) 7: 51-52(1992). 각 경우에, 2차 특이성은 원하는 것으로 만들 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, CD16 또는 CD64을 포함하는 중쇄 활성화 수용체에 2차 특이성(second specificity)을 부여할 수 있다(참조: Deo et al., 18: 127(1997)) 또는 CD89(참조: Valenrius et al., Blood, 90: 4485-4492(1997)).

항체는 또는 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 면역독소로서 작동하도록 변형할 수 있다(참조: Vitetta, Immunol. Today, 14: 252(1993), 및 USP 5,194,594). 방사성 표지된 항체의 조제와 관련하여, 이러한 변형된 항체는 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다(참조: Junghans et al., in Cancer Chemotherapy and Biotherapy, 655-686(2nd edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven(1996)), USP 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990(RE 35,500), 5,648,471 및 5,697,902). 면역독소 및 방사성 표지 물질의 각각은 원하는 다량체 효소 서브유닛 올리고머화 영역을 발현하는 세포를 사멸시킬 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양에 따르면, 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 항체의 유효량을 포함하는 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 일부 실시태양에 따르면, 항 CD20 항체는 약물(방사성 동위원소, 약학 조성물 또는 독소)과 결합된다. 이러한 항체는 CD20을 발현하거나 과발현하는 세포와 관련된 질환의 치료에 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 항 유사분열성(antimitotic), 알킬화, 항 대사물질, 항 혈관신생, 세포자살, 알칼리성, COX-2 및 항생제 및 이들의 조합으로 구성된 군으로 부터 선택된 약학적 특성을 가지는 약물로 이해할 수 있다. 상기 약물은 니트로젠 머스타드(nitrogen mustard), 에틸렌이민 유도체(ethylenimine derivative), 알킬 설폰산(alkyl sulfonate), 니트로소우레아(nitrosourea), 트리아진(triazene), 엽산 유사체(folic acid analog), 안트라사이클린(anthracycline), 택산(taxane), COX-2 억제제, 피리미딘 유사체(pyrimidine analog), 퓨린 유사체(purine analog), 항 대사물질, 항생제, 효소, 에피포도필로톡신(epipodophullotoxin), 백금 배위결합 복합체(platium coordination complex), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid), 치환 유레아(substituted urea), 메틸 히드라진(methyl hydrazine) 유도체, 부신피질 억제제(adrenocortical suppressant), 길항제(antagonist), 엔도스타틴(endostatin), 택솔(taxol), 캄프토텍신(camptothecin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 독소루비신(doxorubicin) 및 그 유사체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로 부터 선택된다.

추가적으로, 독소의 예로서는 겔로닌(gelonin), 슈도모나스 엑소톡신(pseudomonas exotoxin, PE), PE40, PE38, 디프테리아 독소(diphtheria toxin), 리신(ricin), 아브린(abrin), 알파 독소(alpha toxin), 사포린(saporin), 리보뉴클라아제(ribonuclease, RNase), DNase I, 스타필로코카스 엔테로톡신-A(staphylococcal enterotoxin-A), 억새풀(pokeweed) 항 바이러스 단백질 및 그 유도체, 조합 및 변형을 포함한다.

방사성 동위원소의 예로서는, 감마 방출원소(gamma-emitter), 양성자(positron) 방출원소, 위치 추적 및/또는 치료를 위하여 사용되는 X 선 방출원소, 치료용으로 사용되는 베타(beta) 및 알파(alpha) 방출원소를 포함한다. 상기 방사성 동위원소는 진단, 예후 및 치료를 위한 시기결정(styaging)에 유용하다고 알려져 있다. 항암제 또는 항 백혈병제의 예로서는, 이에 제한되는 것은 아니나, 독소루비신(아드리아마이신, adriamycin), 다우노루비신(daunorubicin, 다우노마이신(daunomycin), 이다루비신(idarubicin), 데토루비신(detorubicin), 카미노마이신(carminomycin), 에피루비신(epirubicin), 에소루비신(esorubicin), 몰폴리노(molpholino) 및 그의 치환 유도체, 조합 및 변형 등의 안트라사이클린을 포함한다. 대표적인 약물의 예로서는, 시스-백금(cis-platinum), 택솔, 칼리케아미신(calicheamicin), 빈크리스틴(vincristine), 사이타라빈(cytarabine, Ara-C), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 프레드니손(prednisone), 다우노루비신, 이다루비신, 플루다라빈(fludarabine), 클로람부실(chlorambucil), 인터페론 알파(interferon alpha), 히드록시유레아(hydroxyurea), 테모졸로미드(temozolomide), 탈리도미드(thalidomide), 블레오마이신(bleomycin) 및 그 유도체, 조합 및 변형을 포함한다. 바람직하게는, 상기 항암제 또는 항백혈병제는 독소루비신, 몰폴리노독소루비신(morpholinodoxorubicin) 또는 몰폴리노다우노루비신(morpholinodaunorubicin)이다.

당업자라면 이해할 수 있듯이, 상기 실시태양에서, 친화도 값이 중요하지만, 항체의 부분적인 기능을 좌우하는 다른 요소들이 더 중요하다. 예를 들어, 면역독소(항체에 접합된 독소)를 위하여, 표적에 항체가 결합하는 작용은 유용하다; 그러나, 몇몇의 실시태양에서 중요한 것은, 원하는 마지막 결과인 세포에 독소의 내재화(internalization)이다. 이러한 상황에서, 고효율의 내재화가 요구된다. 따라서, 본 발명의 실시태양에서는, 내재화하는 효율이 높은 항체를 고려되었다. 고효율의 내재화는 내부로 들어간 항체의 비율로 측정되고, 100% 보다 낮은 값일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 0.1 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 45, 45 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 99 및 99 내지 100%가 높은 효율일 수 있다. 당업자라면 이해할 수 있듯이, 원하는 효율은 예를 들어, 결합된 약물, 일정 부위에 투여되는 항체의 양, 항체-약물의 부작용, 치료하기 위한 질환의 심각성 및 종류(암 종류)에 의존하여 경우에 따라 다를 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 본 발명의 항체는 CD20의 발현의 변화와 관련된 질병 또는 질환을 탐색(screen)하기 위한 포유동물의 조직 또는 세포에서의 CD20의 발현을 탐지하기 위한 검사 키트를 제공한다. 상기 키트는 CD20에 결합하는 항체와 존재하는 항원과 항체의 반응을 나타내기 위한 수단을 포함한다.

본 발명의 일부 실시태양에 따르면, 제조품은 담체, 항 CD20 항체를 포함하는 조성물, CD20 발현에 의해 야기되는 질환을 치료하기 위하여 사용할 수 있는 조성물을 나타내는 패키지 삽입물(package insert) 또는 표지(label)를포함하는 제품으로 제공된다. 바람직하게는, 포유동물, 보다 바람직하게는, 인간이 항 CD20 항체를 수용한다.

조합( combination )

본 명세서에 정의된 항 종양 치료는 단독치료(sole therapy) 또는 본 발명의 화합물 이외에, 통상적인 외과수술, 골수 및 말초 간세포 이식 또는 방사선치료 또는 화학요법을 포함할 수 있다. 이러한 화학요법은 다음에 열거한 하나 또는 그 이상의 항암제를 포함할 수 있다:

(i) 플루다라빈(fludarabine), 2-클로로디옥시아데노신(2-chlorodeoxyadenosine), 클로람부실(chlorambucil), 또는 독소루비신(doxorubicin) 등의 세포독성제 혹은 상기 세포독성제를 조합한 플루다라빈 + 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), CVP: 사이클로포스파미드 + 빈크리스틴(vincristine) + 프레드니손(prednisone), ACVBP: 독소루비신 + 사이클로포스파미드 + 빈데신(vindesine) + 블레오마이신(bleomycine) + 프레드니손, CHOP: 사이클로포스파미드 + 독소루비신 + 빈크리스틴 + 프레드니손, CNOP: 사이클로포스파미드 + 미토잔트론(mitoxantrone) + 빈크리스틴 + 프레드니손, m-BACOD: 메토트렉사이트(methotrexate) + 블레오마이신 + 독소루비신 + 사이클로포스파미드 + 빈크리스틴 + 덱사메타손(dexamethasone) + 루코보린(leucovorin), MACOP-B: 메토트렉사이트 + 독소루비신 + 사이클로포스파미드 + 빈크리스틴 + 고정유효량(fixed dose) + 블레오마이신 + 루코보린, 또는 ProMACE CytaBOM: 프레드니손 + 독소루비신 + 사이클로포스파미드 + 에토포시드(etoposide) + 사이타라빈(cytarabine) + 블레오마이신 + 빈크리스틴 + 메토트렉사이트 + 루코보린 등의 세포독성제;

(ii) 암세포 침투 억제제(예를 들어, 마리마스타트(marimastat) 등의 메탈로프로티나제(metalloproteinase) 억제제 및 유로키나제 플라스미노젠(urokinase plasminogen) 촉진자 수용체 기능);

(iii) 성장인자 또는 생존 신호 기능(survival signaling function) 억제제, 예를 들어, 이러한 억제제는 성장인자 항체(예를 들어, B-Lys에 대한 항체), 성장인자 수용체 항체(예를 들어, CD40 또는 TRAIL 수용체인 TRAILR1과 TRAILR2에 대한 항체), 파네실 전달효소(farnesyl transferase) 억제제 또는 티로신 키나제(tyrosine kinase) 억제제와 세린/트레오닌 키나제(serine/threonine kinase) 억제제, MEK 억제제, ABT-737 등의 Bcl-2, Bcl-XL 등의 생존 신호 단백질의 억제제;

(iv) 혈관내피 성장인자의 효과를 억제하는 약물 등의 항혈관신생 약물(예를 들어, 항 혈관내피세포 성장인자 항체 베바시주맵(bevacizumab) [Avastin^TM], 항-KDR 항체와 항-flt1 항체, 국제 특허공개 WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/3285, WO 98/13354, WO 00/47212 및 WO 01/32651에 기재된 화합물 등의 항-혈관내피세포 성장인자 수용체 항체)과 다른 기작(예를 들어, 리노마이드(linomide), 인테그린 avb3(integrin avb3) 기능과 앤지오스타틴(angiostatin)의 억제제)에 의해 작용하는 화합물;

(v) 콤브레타스타틴 A4(combretastatin A4)와 국제 특허공개 WO 99/02166, WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 및 WO 02/08213에 개시된 화합물 등의 혈관 손상제(vascular damaging agent);

(vi) 예를 들어, 항 bcl2 안티센스(antisense)인 G-3139와 같이 상기 나열된 표적을 지향하는 약물인 안티센스 요법(antisense therapy);

(vii) 예를 들어, 비정상의 p53 또는 비정상의 BRCA1 또는 BRCA2, GDEPT 등의 비정상 유전자를 교체하는 방법(유전자 유도된 효소 프로드러그 치료법), 싸이토신 디아미나제(cytosine deaminase), 티미딘 키나제(thymidine kinase) 또는 세균의 니트로리덕타제(nitroreductase) 효소 등 접근법 및 다수 약물 저항 유전자 치료 등의 화학요법 또는 방사선요법에의 환자의 관용 증가를 포함하는 유전자 치료방법;

(viii) 예를 들어, CD52에 대한 단클론 항체인 알렘투주맙(Alemtuzumab, campath-1H^TM)에 의한 치료 또는 CD22에 대한 항체에 의한 치료, 환자의 종양세포의 면역원성을 증대시키는 방법, 인터루킨-2, 인터루킨-4 또는 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor) 등 사이토카인의 형질도입, CTLA-4 기능을 억제하는 단클론 항체를 처리하는 것과 같은 T 세포의 면역저하(anergy)의 감소, 사이토카인이 형질도입된 가지 세포(dendritic cell)와 같이 형질도입된 면역세포를 사용하는 방법, 사이토카인이 형질도입된 종양세포주를 사용하는 방법; 및 항 개별특이형(idiotypic) 항체를 사용하는 방법 등의 면역치료 접근법;

(ix) 벨케이드(velcade, Bortezomid) 등 프로테아좀(proteasome) 억제제 등의 단백질 분해(degradation) 억제제; 및,

(x) 예를 들어, 수용체 리간드의 분해를 증가시키거나 발현량을 줄이기 위한 수용체 리간드(ligand)의 격리, 수용체에 대한 리간드의 결합 억제, 또는 (증대된 수용체의 분해 또는 낮은 발현 수준에 의해) 수용체의 신호를 감소시키는 펩티드 또는 단백질(예를 들어, 항체 또는 수용성 외부 수용체 영역 구조)을 사용하는 방법 등의 생물학적 치료방법. .

본 발명의 하나의 실시태양에 따르면, 본 발명의 항-혈관신생적 치료는, 혈관내피세포 성장인자(VEGF)의 효과를 억제하는 약물(예를 들어, 항-혈관내피세포 성장인자 항체 베바시주맵(bevacizumab)(Avastin^?), 항-KDR 항체와 항-flt1 항체, 국제 특허공개 WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/3285, WO 98/13354, WO 00/47212 및 WO 01/32651에 기재된 화합물 등의 항-혈관내피세포 성장인자 수용체 항체), 및 다른 기작에 의해 작용하는 화합물(예를 들어, 리노마이드(linomide), 인테그린 avb3(integrin avb3) 기능과 앤지오스타틴(angiostatin)의 억제제)과 병용하여 수행된다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 본 발명의 항-혈관신생적 치료는 혈관내피세포 성장인자 수용체, KDR의 티로신 키나제 활성을 억제하는 것과 병용하여 수행된다(예를 들어, AZD2171 또는 AZD6474). AZD2171의 추가 세부사항은 웨지(Wedge) 등의(2005) Cancer Research. 65(10): 4389-4400에서 찾을 수 있을 것이다. AZD6474의 추가 세부사항은 라이언(Ryan) & 웨지(Wedge)(2005) Britsh journal of Cancer. 92 Suppl 1:S6-14에서 찾을 수 있을 것이다. 두 출판물은 전문이 본 명세서에 참조문헌으로 포함되었다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 완전한 인간항체 1.1.2, 1.5.3 또는 2.1.2는 독자적으로, 또는 AvistinTM, AZD2171 또는 AZD6474과 함께 조합된다.

이러한 연합치료(conjoint treatment)는 상기 치료의 개별 요소의 동시적인, 연속적인 또는 개별적인 투여에 의해 행해질 것이다. 이러한 병용제는 상술한 투여량 범위 내에서 또한 다른 약학적으로 허용되는 약물의 허용된 투여량 범위 내에서, 본 발명의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 염들을 사용한다.

도 1 및 도 2는 mAbs 1.1.2, 1.2.1, 1.3.3, 1.4.3, 1.5.3, 1.6.2(도 1), 1.9.2, 1.12.3, 1.13.2, 2.1.2, 2.2.2, 2.4.1(도 2) 및 리투잔^® 항체 대조군과 같이 배양되고, 교차결합(cross-linking)되지 않은 라모스 세포의 CellTiterGlo 세포 생존율 분석결과를 나타낸 그래프이다.

도 3A 내지 3D는 mAbs 1.6.2, 1.5.3, 1.4.3(도 3A), 1.3.3, 1.1.2, B1(도 3B), 2.4.1, 2.2.2, 2.1.2(도 3C), 1.13.2, 1.12.3, B1(도 3D), 리툭시맙, IgM, IgG1과 같이 배양되고, 교차결합되지 않은 라모스 세포의 알라마 블루 세포 생존율 분석결과를 나타낸 그래프이다. y축은 % 생존율을 나타내고, x축은 항체농도를 나타낸다.

도 4A 내지 4D는 mAbs 1.1.2, 1.3.3, 1.4.3(도 4A), 1.5.3, 1.6.2(도 4B), 1.12.3, 1.13.2(도 4C), 2.1.2, 2.2.2, 2.4.1(도 4D), B1, 리툭시맙, IgG 및 IgM과 같이 배양되고, 교차결합되지 않은 라모스 세포의 WST-1 세포 생존율 분석결과를 나타낸 그래프이다. y축은 % 생존율을 나타내고, x축은 항체농도를 나타낸다.

도 5 및 도 6은 mAbs 1.1.2, 1.3.3, 1.4.3, 1.5.3, 1.6.2(도 5), 1.12.3, 1.13.2, 2.1.2, 2.2.2, 2.4.1(도 6), 리툭시맙 및 B1과 같이 배양되고, 교차결합되지 않은 라모스 세포의 앤넥신(Annexin) V/PI 세포자살 분석결과를 나타낸 그래프이다. y축은 % 생존율을 나타내고, x축은 항체농도를 나타낸다.

도 7A 내지 7D, 8A 내지 8D 및 9A 내지 9D는 mAbs 1.1.2, 1.2.1, 1.3.3(A), 1.4.3, 1.5.3, 1.6.2(B), 1.9.2, 1.12.3, 1.13.2(C), 2.1.2, 2.2.2, 2.4.1(D), 리툭시맙 및 IgG1 대조군과 같이 각각 배양된 라모스(도 7A 내지 7D), 라지(Raji, 도 8A 내지 8D) 및 도디(Daudi, 9A 내지 9D) 세포주의 CDC 분석결과를 나타낸 그래프이다. y축은 % 생존율을 나타내고, x축은 항체농도를 나타낸다.

도 10은 mAbs 2.1.2, 1.1.2, 1.5.3, 1.10.3.1, 1.11.3.1, 리툭시맙 및 IgG1 대조군과 같이 배양된 라모스 세포주의 ADCC 분석결과를 나타낸 그래프이다. y축은 % 생존율을 나타내고, x축은 항체농도를 나타낸다.

도 11 내지 12는 mAbs 2.1.2, 1.1.2, 1.3.3, 1.5.3, 리툭시맙 및 IgG1 대조군과 같이 배양된 라지(도 11) 및 도디(도 12) 세포주의 ADCC 분석결과를 나타낸 그래프이다. y축은 % 생존율을 나타내고, x축은 항체농도를 나타낸다.

도 13은 mAbs 1.1.2, 2.1.2, 리툭시맙 및 IgG1 대조군과 같이 배양된 라지, 라모스, 도디 세포의 전혈분석결과를 나타낸 그래프이다. y축은 % 용혈율을 나타내고, x축은 라지, 라모스, 도디 세포주를 각각 나타낸다. 그 결과를 mAbs 1.1.2와 2.1.2가 리툭시맙보다 더 많은 세포 용혈을 야기한다는 것을 나타낸다.

도 14A 및 도 14B는 mAbs 2.1.2, 1.1.2, 1.5.3, 1.10.3.1, 1.11.3.1, 리툭시맙 및 IgG1 대조군과 같이 배양한 카파스-422(Karpas-422, 도 14A)와 EHEB(도 14B) 세포주의 전혈분석결과를 나타낸 그래프이다. y축은 % 용혈율을 나타내고, x축은 항체농도를 나타낸다. 그 결과는 EHEB와 카파스-422 세포주가 세포 용혈을 현저히 높이는 것을 야기한 상기의 CD20 항체에 반해, 리툭시맙 처리에 저항성을 보인다는 것을 나타낸다.

도 15는 mAbs 1.5.3, 1.1.2 및 리툭시맙을 사용하여 패널 세포주에서 용혈 활성을 비교한 전혈분석결과를 나타낸 점산도(scatterPlot)이다. 각 표시는 전혈(whole blood)의 인간 기증자(human donor)를 나타낸다. y축은 % 용혈율을 나타내고, x축은 ARH-77, 도디, EHEB, JMV2, MV3, 카파스-422, 나말바(Namalwa), 라지, 라모스, SC1, SU-DHL-4 및 WSU-NHL 세포주를 각각 나타낸다.

도 16은 전혈분석시, 패널 세포주에서 mAb 1.1.2와 리툭시맙, mAb1.5.3과 리툭시맙 간의 용혈비를 나타낸 점산도이다. 각 표시는 전혈의 인간 기증자를 타나낸다. 각 항 CD20 mAb에 대한 10㎍/ml에서 %용혈율 등의 혈액 기증자에 대한 10㎍/ml에서 리툭시맙에 의해 얻어진% 용혈율 사이의 비를 나타낸다. ARH-77, 도디, EHEB, JMV2, JMV3, 카파스-422, 나말바, 라지, 라모스, SC1, SU-DHL-4 및 WSU-NHL 세포주를 각각 x축에 나타내었다.

도 17은 리툭시맙과 mAb 1.1.2 및 mAb 1.5.3에 의한 전혈 분석에서 리툭시맙 저항성 세포인 RR1-라지의 용혈율을 나타낸 막대 그래프이다. y축은 % 용해율을 나타내고, x축은 1㎍/ml과 10㎍/ml 농도로 항체를 처리한 라지 모(parental) 세포와 1㎍/ml과 10㎍/ml 농도로 항체를 처리한 RR1-라지 세포를 각각 나타낸다.

도 18은 리툭시맙과 mAb1.5.3에 의한 전혈 분석에서 리툭시맙 저항 세포인 RR1-라모스, RR6-라모스 및 RR8-라모스의 용혈율을 나타낸 막대 그래프이다. y축은 % 용해율을 나타내고, x축은 1㎍/ml과 10㎍/ml 농도로 항체를 처리한 라모스 모 세포, 1㎍/ml과 10㎍/ml 농도로 항체를 처리한 RR1-라모스 세포, 1㎍/ml과 10㎍/ml 농도로 항체를 처리한 RR6-라모스 세포 및 1㎍/ml과 10㎍/ml 농도로 항체를 처리한 RR8-라모스 세포를 각각 나타낸다.

도 19는 라모스 세포의 정맥 주입으로 인한 마비 모델(CB17 SCID)에 항 CD20 항체, 리툭시맙, 2.1.2, 1.1.2 및 1.5.3이 마우스 생존에 미치는 영향을 나타내는 선 그래프이다. 그 결과를 한가지 양의 단일치료제로 투여되었을 때, 3가지의 항 CD20 항체가 잠재적인 항 림프종 활성을 보인다는 것을 나타낸다. x축은 종양세포 이식 후 치료된 날짜를 나타내고, y축은 % 생존율을 나타낸다.

도 20은 도디 피하(subcutaneous) 종양모델에서 항 CD20 항체의 효능을 나타내는 선 그래프이다. x축은 종양세포 이식 후 치료된 날짜를 나타내고, y축은 % 생존율을 나타낸다.

도 21은 나말바 피하 종양모델에서 항 CD20 항체의 효능을 나타내는 선 그래프이다. x축은 종양세포 이식 후 치료된 날짜를 나타내고, y축은 % 생존율을 나타 낸다.

도 22는 RR1-라지 피하 종양모델에서 항 CD20 항체의 효능을 나타내는 선 그래프이다. x축은 종양세포 이식 후 치료된 날짜를 나타내고, y축은 % 생존율을 나타낸다.

도 23은 RR6-라모스 피하 종양모델에서 항 CD20 항체의 효능을 나타내는 선 그래프이다. x축은 종양세포 이식 후 치료된 날짜를 나타내고, y축은 % 생존율을 나타낸다.

도 24는 대조군(saline), 리툭시맙(10mg/kg) 및 mAb 1.5.3(10mg/kg)을 처리함에 따라 필리핀 원숭이(cynomolgus monkey)의 조직 B 세포의 감소를 나타내는 막대 그래프이다. y축은 % 조직 CD20+CD40+를 나타내고, x축은 보조 림프절(auxiliary lymph node), 장간막(mesenteric lymph node), 샅고랑 림프절(inguinal lymph node), 골수(bone marrow) 및 비장(spleen) 시료를 나타낸다.

수행된 실험과 얻어진 결과를 포함하는 다음의 실시예로서는 단지 본 발명의 예시를 목적으로 제공된 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않는다.

실시예 1: 면역화 및 적정

인간 CD20 플라스미드의 복제

RNAzol B RNA 분리용액(Tel-Test, INC, Friendswood, TX)을 이용하여 제조사의 지침서에 따라 라지(RAJI) 세포로부터 전체 RNA를 분리하였으며, 260nm에서의 자외선 흡광도(Bio-RAD smartspecTm 3000)를 측정하여 정량분석을 행하였다. 단일 가닥(single stranded) cDNA 합성키트(GIBCO-BRL)를 이용하여, 제조사의 지침서에 따라 2㎍의 전체 RNA를 프라임(prime)하였다. Taq DNA 중합효소(QIAGEN, Valencia, CA)와 다음 등의 올리고뉴클레오타이드 프라이머(oligonucleotide primer, Operon, Huntsville, AL)를 사용하여, 단일 가닥 cDNA를 증폭하였다.

정방향 프라이머(forward primer): 5'-TCAGGAGTTTTGAGAGCAAAATG-3'(서열번호 137); 및,

역방향 프라이머(reverse primer): 5'-AACAGAAGAAATCACTTAAGGAG-3'(서열번호 138)

PCR 조건은 다음과 같았다: 초기변성(initial denaturation)은 94℃에서 5분간, 이후 94℃에서 30초간, 55℃에서 45초간, 72℃에서 1분간의 싸이클을 30회 반복, 및 연장(extension) 단계는 72℃에서 10분간 수행.

PCR 결과물을 아가로즈 젤 전기영동법을 사용하여 젤 상에서 분리한 후, Qiaquick 젤 추출 키트(QIAGEN, Valencia, CA)로 추출하고, T4 리가제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여, pCR 3.1 양방향 진핵세포 TA 발현벡터(bidirectional eukaryotic TA expression vector)(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 삽입하였다. 형질전환을 위하여는 Top10F' 대장균주가 사용하였다. 엠피실 린(ampicillin) 저항성 클론을 세균에서 증식시킨 후, 제한효소인 EcoRI(New England Biolabs, Beverly, MA)에 의해 1kb의 삽입체(insert)가 절단되는지 확인하였다. 생성된 DNA의 서열이 올바른지를 확인하기 위하여, BioDye 종결법과 3100 Genetic analyzer(PE Biosynthsis, Foster City, CA)를 사용하여, 모든 PCR 증폭 결과물의 서열을 결정하였다.

세포 및 형질도입( transfection )

HEK 293F 세포와 CHO K1 세포를 10% FBS, 2mM L-글루타민, 50μΜ BME, 100단위의 페니실린-g/ml(Penicillin-g/ml), 100단위의 MCG 스트렙토마이신/ml이 첨가된 DMEM/F12(50/50 혼합) 배지에서 배양하였다. 제조사의 지침서에 따라, LipofectAMINE 2000 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 인간의 CD20/pCR3.1 플라스미드를 HEK 293F 세포와 CHO K1 세포에 형질도입시켰다. 형질도입은 48시간 동안 실시하였으며, 그 후 2주 동안 1mg/ml의 G418(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 선별하였다. 안정적인 G418 저항성을 가지는 클론을 인간 CD20에 대한 단클론 항체(BD)와 PE-접합형 염소 항 마우스 IgG(CalTag Laboratories, Burlingame, CA)를 사용하여 염색하였으며, FACS와 FACS Vantage(BD, Franklin Lakes, NJ)를 이용하여 분석하였다.

면역화

인간 라모스 암세포주인 도디(Daudi) 및 CD20-CHO 세포에서 발현된 CD20이 항원으로 사용하였다. CD20에 대한 단클론 항체를 XenoMouse^® 마우스(XenoMouse strains: XM3B3:IgG4KL과 XM3C-1L: IgG4L, Abgenix, Inc. Fermont, CA)를 순차적으로 면역화시켜 수득하였다. XenoMouse 동물은 통상적인 수단을 이용하여 발바닥 경로(footpad route)로 주사하여 면역화하였다. 주사량은 마리당 50㎍, 한쪽 발당 25㎍이었다.

실시예 2: 림프구의 회수, B림프구의 분리, 하이브리도마의 융합과 생성

선별된 면역화 마우스를 경추분리법(cervical isolation)에 의해 사망시킨 후, 각각의 군(cohort)으로부터 배출되는 림프절을 수확하였다. 림프구 세포를 DMEM에서 갈아 조직으로부터 세포를 유리시키고, DMEM에 현탁시켰다. 이들 세포의 수를 헤아린 후, 10⁸ 세포 당 0.9ml의 DMEM을 가하여 세포의 펠렛을 서서히 재현탁시켰다. 현탁시킨 10⁸개의 세포 당 100μl의 CD90+의 자기성 비드(magnetic bead)를 가한 다음, 4^oC에서 15분간 방치하여 세포에 자기성 비드가 부착되도록 하였다. 10⁸ 세포이상 또는 2×10⁸ 세포를 포함하는 자기성 비드가 부착된 세포현탁액을 LS+ 컬럼에 로딩한 후, 컬럼을 DMEM으로 세척하였다. 컬럼을 통과하여 유출된 세포를 CD90 음성 세포들이다(이들 세포의 대부분은 B림프구일 것으로 기대되었다).

상술한 과정에 의해 분리되고 세척한 집적 B림프구와 ATCC로부터 입수된 비분비성의 흑색종 P3X63Ag8.653 세포(Cat. #CRL-1580)를 1:1로 혼합함으로써 융합을 행하였다(참조: Kearney et al., J. Immunol. 123:1548-1550, 1979). 세포 혼합물은 800g로 서서히 원심분리하여 침전시키고, 상층액을 완전히 제거한 후, 세포에 프로나제 용액(Pronase solution, CalBiochem, cat.#53702; 0.5mg/ml in PBS) 2 내지 4ml을 2분 미만으로 처리하였다. 이후, 3 내지 5ml의 우태아 혈청(FBS)을 가하여 효소의 활성을 억제하고, 전기세포융합 용액(electro cell fusion solution, ECFS, 0.3M 수크로즈, Sigma, Cat# S7903, 0.1mM 마그네슘 아세테이트, Sigma, Cat#M2545, 0.1mM 칼슘 아세테이트, Sigma, Cat#C4705)을 이용하여 현탁액을 총 40ml의 부피로 조정하였다. 원심분리 후에 상층액을 제거하고, 40ml의 ECFS로 세포를 재현탁시켰다. 상기 세척단계를 반복하고, 2×10⁶ 세포/ml의 농도로 ECFS에 재현탁시켰다.

융합생성기(fusion generator, model ECM2001, Genetronic, Inc., San Diego, CA)를 이용하여, 전기세포융합(electro-cell fusion)을 행하였다. 융합챔버(fusion chamber)의 크기는 2.0ml로, 다음과 같이 장치의 조건으로 조작하였다; 정렬조건(alignment condition): 전압: 50V, 시간: 50초; 세포막 파괴: 전압: 3000V, 시간: 30μ초, 융합후 유지시간(post-fusion holding time): 3초.

전기세포융합(ECF)후, 멸균상태에서 세포현탁액을 조심스럽게 융합챔버에서 꺼내어, 15% 우태아혈청(Hyclone), L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신(pen/strep), OPI(옥살로아세테이트, 피루베이트(pyruvate), 소알부민, IL-6(Boehringer Mannheim))이 첨가된 동일부피의 하이브리도마 배양액(DMEM, JRH Biosciences)이 담긴 튜브로 옮겨져, 37^oC에서 15분 내지 30분 동안 방치한 후, 400×g(1000rpm)으로 5분 동안 원심분리하였다. 세포를 적은 양의 하이브리도마 선별배지(hybridoma selection medium, 0.5× HA(Sigma, cat.#A9666)가 첨가된 하이브리도마 배양배지)에 조심스럽게 재현탁하고, 96웰 플레이트의 웰당 5×10⁶ B세포 및 200μl를 기준으로, 하이브리도마 선별배양액을 가하여 부피를 적절히 조정하였다. 세포를 조심스럽게 혼합하고, 96웰 플레이트에 분주하여 생장하도록 하였다. 7 내지 10일 후에, 배양액의 절반을 제거하고, 새로운 하이브리도마 선별배지를 다시 넣어 주었다.

실시예 3: FMAT와 FACS를 이용한 후보 항체의 선별

형광 미세부피 분석기술(Flourometric Microvolume Assay Technology, FMAT)을 이용하여, 재조합 CHO-인간 CD20 형질도입체(transfectant) 세포에 대한 선별(screen) 및 모(parental) CHO 세포에 대한 비교선별(counter-screen)을 함께 수행함으로써, 14일간의 배양한 하이브리도마의 상등액(supernatant) 내의 CD20 특이적인 단클론 항체의 존재 유무를 확인하였다.

일차적인 선별의 결과, 양성반응을 보인 하이브리도마 세포가 자란 웰(well)에 담겨진 상등액을 제거하였으며, CD20 양성인 하이브리도마 세포를 신선한 배양액에 현탁시킨 후 24 웰 플레이트에 옮겨졌다. 다시 2일간의 배양한 다음, 상등액을 이차 확인선별(confirmation screen)을 위하여 사용하였다. 이차 확인선별에서는, 항 CD20 항체가 완전한 인간의 것임을 확인하기 위하여, 일차에서 양성으로 판정된 것들은 아래의 항체들 중 2세트 혹은 3세트를 사용하여 FACS 방법으로 선별하였다: 인간 감마 사슬의 선별을 위하여서는 1.25㎍/ml GAH-감마 Cy5(JIR#109-176-098)를, 인간 카파 경쇄의 선별을 위하여서는 1.25㎍/ml GAH-카파 PE(S.B.#2063-09)을, 인간 람다 경쇄의 선별을 위하여서는 1.25㎍/ml GAH-람다 PE(S.B.#2073-09)를 각각 사용하였다.

CD20 특이적인 78개의 인간 IgG/카파 또는 IgG/람다 항체들이 생성하였다.

완전한 인간 CD20 특이적인 단클론 항체

군	종	항원	FMAT	CD20 항원 특이적 항체 (FACS로 확인)	면역시간
1 2 3 4	G1k G1KL G4K G4GL	라모스 라모스 라모스 라모스	77 29 26 18	13 4 7 7	27-38일
5 6 7 8	G1K G1L G4K G4L	CHO-CD20 CHO-CD20 CHO-CD20 CHO-CD20	94 25 85 50	0 3 28 2	27-38일
9	G1K	CHO-CD20	32	0	67일
10	G1K	도디	165	14	59일

실시예 4: 세포자살 활성(apoptotic activity)

라모스 인간 림프종(lymphoma) 세포주에서의 전세포자살 활성(pro-apoptotic activity)을 가지는 항체계통(antibody line)을 선별 및 동정하기 위하여, 두가지의 실험적 접근법이 사용하였다. 세포자살 활성은 두가지 방법, 즉 CellTiterGlo 검사를 이용한 방법 및 자동화된 형광현미경과 프로피디움 아이오다이트/훽스트(Propidium Iodite/Hoechst) 염색을 이용하는 방법으로 측정하였다.

요약하면, CellTiterGlo 분석(Promega, Madison, WI)을 위하여, ATCC에서 입수한 라모스 세포를 10% FBS, 1% 피루브산 나트륨(sodium pyruvate), 1% HEPES 완충용액이 첨가된 RPMI 배양액에서 배양하였다. 세포를 96 웰 플레이트에 100,000세포/ml(100㎕/well)의 농도로 접종하고, 37℃, 5% CO₂에서 72시간 배양하였다. 검사는 항체를 가하고 72시간 후 중지하였으며, 키트에 첨부된 설명서에 따라 수행하였다. 세포들을 교차접합(cross-linking) 이차항체가 있거나 없는 상태에서, 1 또는 10㎍/ml의 항체 하이브리도마 상등액(antibody hybridoma supernatant)으로 처리하였다. 동형(IgG1 및 IgG4)와 리투잔^®(리툭시맙 -- Genetech Inc.) 그리고 B1(Beckham Coulter, Miami, FL) 항체가 비교군으로 사용하였다(참고: B1 항체는 완충용액에 0.10% 농도로 첨가된 소디움 아자이드(sodium azide)의 제거를 위하여 투석하였다). 비교군(무처리)의 생존률을 100%로 가정하여, 처리군에서의 생존률을 구하였다.

프로피디움 아이오다이트/훽스트 염색을 위하여, 세포를 96 웰 플레이트에 100,000 세포/ml(50㎕/well)의 농도로 분주하고, 37℃, 5% CO₂에서 48시간 동안 배양하였다. 이러한 다음, 5000ng/ml 내지 8ng/ml의 농도 범위에서 적정된 항체 하이브리도마 상등액(단백질 A-세파로즈(Protein A-Sepharose) 컬럼으로 분리한 후 인산완충용액에서 투석됨)으로 처리하였다. 모든 실험은 교차접합 이차항체가 있거나(N=2) 또는 없는(N=1) 상태에서 2회 반복하였다. 동형(IgG1과 희석제 비교군), 리툭시맙 및 B1 항체가 비교군으로 사용하였다. 48시간 배양 후 세포를 PI/훽스트로 염색하고, 자동 형광 현미경을 이용하여 관찰하였다. 세포자살률(percent apotosis, %)은 PI 양성인 세포(자살세포, apototic)의 수와 훽스트 양성인 세포(총세포, total)의 수의 비를 구하여 결정하였다.

CellTiterGlo 분석을 위하여, 세포를 2배로 깔았고, 평균의 표준편차는 엑셀 소프트웨어를 사용하여 결정하였다. 프로피디움 아이오디드/훽스트 염색 분석을 위하여, 평균치는 이배점(duplicate point)으로 구하였다. 이러한 평균은 투여량 반응성 커브(dose response curve)를 생성하기 위하여 사용되었으며, 이를 세포자살 활성을 평가하기 위한 동형과 희석제 대조군과 비교하였다.

요약하면, 이 실험은 25개 하이브리도마 상등액의 전체 네트(net)를 질문하였다. 분석은 상기 검사에서 세포자살 활성을 나타낸 항 CD20 항체 하이브리도마 세포주의 중요성을 나타내었다. 전체 22개 세포주가 복제를 위하여 선별하였다.

세포자살 검사에서 평가된 항 CD20 하이브리도마 세포주 상등액 (표는 각 실험으로부터 음성 세포주를 나타낸다. 굵게 나타낸 세포주는 일관되게 음성을 띠었고, 진전되지 않았다.)

	연구 #1/라모스 세포에서 훽스트 세포자살 검사			연구 #2/라모스 세포에서 CellTiterGlo 세포자살 검사
평가 세포주	교차결합 링커 첨가(2배)	교차결합 링커 첨가(2배)	교차결합 링커 미첨가(2배)	교차결합 링커 첨가(1배)	교차결합 링커 첨가(2배)	교차결합 링커 미첨가(2배)
1.1(G1)
1.2(G1)					1.2	1.2
1.3(G1)
1.4(G1)						1.4
1.5(G1)
1.6(G1)						1.6
1.9(G1)						1.9
1.10(G1)
1.11(G1)
1.12(G1)
1.13(G1)	1.13
2.1(G1)
2.2(G1)			2.2
2.4(G1)
3.1(G4)			3.1
3.2(G4)	3.2	3.2	3.2
3.3(G4)	3.3	3.3	3.3
3.4(G4)			3.4
3.6(G4)	3.6	3.6	3.6	3.6	3.6
3.7(G4)
4.1(G4)	4.1	4.1	4.1	4.1	4.1
4.2(G4)			4.2			4.2
4.5(G4)			4.5
4.6(G4)	4.6	4.6	4.6
4.7(G4)	4.7	4.7	4.7	4.7	4.7	4.7

세포자살 검사에서 음성으로 확인된 항 CD20 하이브리도마 세포주 상등액

연구 #1 세포자살 검사 음성	연구 #2 세포자살 검사 음성	양자 음성 (이 클론은 클로닝되지 않음)
3.2	1.2
3.3
3.6	3.6	3.6
4.1	4.1	4.1
4.6
4.7	4.7	4.7

상기 과정은 각 시료에 존재하는 하이브리도마 계통의 수가 하나로 부터 몇개 또는 많게 변화하는 올리고클론 혼합물을 생산하는 것으로 이해되어야 한다. 각 웰의 하이브리도마 혼합물 당 하나의 CD20 특이적인 항체 계통을 갖을 가능성이 있다. 추가적으로, 올리고클론 혼합물에서 실제 항원 특이적인 세포는 그들의 생산성(그들이 생산하고 분비하는 항체의 양)의 측면에서 다양할 수 있다. 검사에서 강한 신호는, 고농도의 항체, 표적에 높은 친화도를 가지는 항체 또는 이들 요소의 조합의 결과이다. 따라서, 정량 결과가 이러한 검사로부터 제시되는 반면에, 이러한 그 결과를 대조군과 비교하여 얻어진 몇몇 데이타의 중심으로 볼 때, "양성(positive)" 대 "음성(negative)"으로 해석된다.

클로닝은 융합세포주 1 및 2(여기서, 항체는 IgG이다)로 회수된 모든 세포주(line)에서 시작되었다. 융합세포주 3 및 4에서의 세포주는 세포주 3.6, 4.1 및 4.7을 제외하고 클로닝되었다.

실시예 5: 세포자살 검사: 교차결합되지 않은 세포의 CellTiterGlo 생존율 검사

생존 세포의 수와 관련이 있는, 세포에 존재하는 ATP 량을 측정하기 위하여, CellTiterGlo 검사를 수행하였다. 요약하면, 림프종(라모스) 세포를 Costar 96 웰 평편한 바닥 플레이트(Catalog # 3603)에 50㎕ 부피로 웰당 10,000개 세포로 도말하였다. 1차 항체를 조직배양 배지에 25㎕/well로 가하고, 상온에서 10분간 세포와 배양하였다. 배양 후, CellTiterGlo 시약(Promega Catalog # G7571)을 세포에 가하고, 암조건의 상온에서 10분간 세포와 배양하였다. 플레이트는 제조사의 지침서에 따라 판독하였다. 결과를 도 1(72시간째 플레이트 2의 1)과 2(72시간째 플레이트 2의 2)로 나타내었고, 또한 표 5와 6에 요약하였다. 굵은 값은 리툭시맙 대조군보다 우수한 EC₅₀ 값을 나타낸다.

실시예 6: 세포자살 검사: 교차결합되지 않은 세포의 알라마 블루 생존율 검사

라모스 세포에서 세포자살을 측정하기 위하여, 알라마 블루(Biosource, Camarillo, CA) 생존율 검사를 수행하였다. 알라마 블루는 대사 활성에 반응하여 색깔을 변화시키는 산화환원 지시약이다. 증식하는 세포의 내부환경은 비 증식 세포보다 더 환원상태에 있다; 알라마 블루는 증식하는 세포에서 환원되고, 색깔로 측정가능한 변화가 수반된다.

요약하면, 라모스 세포를 Costar 96 웰 평편한 바닥 플레이트(Catalog # 3603)에 50㎕ 부피로 웰당 10,000개 세포로 도말하였다. 1차 항체를 조직배양 배지에 25㎕/well로 가하고, 37℃에서 48시간 동안 세포와 배양하였다. 웰 당 10㎕의 알라마 블루 염색약을 가하고 37℃에서 밤새도록 세포와 반응시켰다. 이러한 다음, Victor(Perkin Elmer, Wellesley, MA)를 이용하여 형광을 측정하였다.

그 결과를 도 3A 내지 3D(72시간째)로 나타내었고, 또한 표 5와 6에 요약하였다. 굵은 값은 리툭시맙 대조군보다 우수한 EC₅₀ 값을 나타낸다.

실시예 7: 세포자살 검사: 교차결합되지 않은 세포의 WST-1 생존율 검사

라모스 세포의 세포자살을 측정하기 위하여, WST-1(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) 생존율 검사를 수행하였다. WST-1 환원 검사는 생존세포의 미토콘드리아 탈수소효소(mitochondrial dehydrogenase)에 의해 WST-1 테트라졸리움(tetrazolium) 염의 절단에 기초한 세포독성을 정량화하는 비색 검사법이다.

요약하면, 라모스 세포를 수확하여 수를 세고, 66,667 세포/ml의 농도로 완전한 RPMI 배지에 현탁시켰다. 세포를 바닥이 편평한 플레이트(Costar, cat. no. 3595)에 50㎕(10,000 세포/ml) 만큼 도말하였다. 항체를 적절한 농도로 표적세포에 웰당 50㎕ 가하고, 37℃에서 68시간 동안 배양하였다. 웰 당 10㎕ WST-1(Roche 1 644 807)를 가하고, 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 플레이트를 1분간 진탕배양기(shaker)에 방치하였다가, 450nm 파장에서 판독하였다.

그 결과를 도 4A 내지 4D로 나타내었고, 또한 표 5와 6에 요약하였다. 굵은 값은 리툭시맙 대조군보다 우수한 EC₅₀ 값을 나타낸다.

실시예 8: 세포자살 검사: 교차결합되지 않은 세포의 앤넥신(annexin) V/PI 세포자살 검사

림프종 세포를 Costar 96 well 편평한 바닥 플레이트(catalog # 3603)에 50㎕ 부피로 웰 당 200,000 세포를 도말하였다. 1차 항체를 조직배양 배지에 25㎕/well로 가하고, 상온에서 10분간 세포와 함께 배양하였다. 이러한 다음, 플레이트를 5분간 1,200rpm으로 원심분리하고, 상등액을 흡입하였다. 세포의 펠렛(cell pellet)을 100㎕ FACS 완충용액(1X PBS 내에 2% FBS)에 현탁하고, 5분간 1,200rpm으로 원심분리하였다. 펠렛을 100㎕ 배양 완충용액(95% 1X 결합 완충용액, 2.5% 앤넥신 V, 2.5% PI)에 재현탁하고, 암조건하의 상온에서 10 내지 15분간 배양하였다. 배양 후, 200㎕ 1X 완충용액(앤넥신 V와 PI 없이)을 가하여 300㎕로 부피를 증가시키고, 적정 튜브(titer tube)에 옮겼다. 분석은 FACS Calibur.를 가지고, FL-1(앤넥신 V)와 FL-3(PI) 채널을 사용하여 실시하였다.

그 결과를 도 5(24시간째 플레이트 2의 1)와 6(24시간째 플레이트 2의 2)로 나타내었고, 또한 표 5와 6에 요약하였다. 굵은 값은 리툭시맙 대조군보다 우수한 EC₅₀ 값을 나타낸다.

실시예 9: CDC 검사

림프종 세포(라모스, 라지 또는 도디)를 Costar 96 웰 편평한 바닥 플레이트(Catalog # 3603)에 25㎕ 부피로 웰 당 100,000 세포씩 도말하였다. 1차 항체를 조직배양 배지에 25㎕/well로 가하고 상온에서 10분간 세포와 배양하였다. 정상 인간 혈청(Advanced Research Technologies, San Diego, CA)을 10 내지 50% 농도로 배양배지(혈청농도는 적정함)에 희석하여 가하고, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. CellTiterGlo 시약(Promega Catalog # G7571)을 세포에 가하고, 암조건하의 상온에서 10분간 배양하였다. 플레이트는 제조사의 지침서대로 판독하였다.

그 결과를 도 7A 내지 7D(1시간째 라모스 세포주), 8A 내지 8D(1시간째 라지 세포주) 및 9A 내지 9D(1시간째 도디 세포주)로 나타내었다. 리툭시맙과 IgG1의 경우에 3회씩 한 것을 제외하고, 모든 검사는 2번씩 행하였다. 평균 EC₅₀ 값은 표 5와 6에 나타내었다. 굵은 값은 리툭시맙 대조군보다 우수한 EC₅₀ 값을 나타낸다.

실시예 10: 인간 항 CD20 항체의 ADCC

전혈(35 내지 45ml)로부터 PBMCs 의 분리

PBMCs로 부터 NK의 농축은 로제트셉^® 인간 NK 세포농축 칵테일(RosetteSep^® Human NK cell Enrichment cocktail) 및 설명서(Cat. no. 15065)를 사용하여 실시하였다. 상기 로제트셉^® 항체 칵테일은 면역 로제트(immunorosette)를 형성하는 인간 전혈(whole blood)의 쓸모없는 세포들을 다수의 RBCs로 교차접합시킨다. 이는 피콜-파크^®(Ficol-Paque^®) 등의 부력농도(buoyant density) 배지로 원심분리할 때, 단일 RBCs와 함께 침전하는 쓸모없는(로제트) 세포의 농도를 증가시킨다. 원하는 세포는 혈장 및 부력 농도 배지에 존재하지 않는다.

요약하면, 기증자의 전혈을 헤파린을 처리하거나 EDTA로 코팅된 튜브에 모아, 2.25ml 로제트셉^® 인간 NK 세포농축 칵테일(cat. no. 15065)를 넣고, 로제트셉^® 실험법에 따라 상온에서 20분간 배양하였다. 이러한 다음, 시료를 동일 부피의 PBS + 2% FBS로 희석하고, 30ml 혈액 혼합물을 50ml 코니칼 튜브(conical tube)에 15ml 피콜(Ficoll, Amersham 17-1440-02)에 넣어 층을 만들었다. 튜브를 2150rpm(테이블탑 원심분리기)에서 브레이크를 끄고, 30분간 상온에서 원심분리하였다. 경계면 층(interface layer)을 2개의 깨끗한 50ml 코니칼 튜브로 옮겼다. PBS + 2% FBS를 50ml 가하여 브레이크를 켠 상태로 테이블탑 원심분리기(Beckman Allegra 6)에서 1200rpm으로 10분간 원심분리하였다. 상층액은 버리고 펠렛은 1ml PBS에 재현탁하여 얼음에 보관하였다. 세포를 헤마사이토미터(hemacytometer)를 이용하여 세고, 용액 ml당 NK 세포수를 측정하였다[(전체 세포/#사분역(quadrant)) * 10e4 * 희석인자(dilution factor)].

칼세인 - AM ( Calcein - AM )을 이용한 종양 표적세포의 표지

칼세인-AM은 칼세인(calcein)의 세포 투과형이다. 이는 칼세인과 비교하여 소수성이 크기 때문에 생존세포의 세포막을 투과한다. 칼세인-AM이 세포질을 통과할 때, 세포 내의 에스터라제에 의해 세포내에 잔류되는 칼세인으로 가수분해된다. 따라서, 칼세인-AM은 생존세포의 염색에 적절한 탐침(probe)이 될 수 있다. 칼세인을 이용한 생존율 검사는 신뢰성이 있고, 표준 51Cr-유리 검사(51Cr-release assay)와 서로 잘 관련된다.

요약하면, 종양 표적세포(라모스, 라지 및 도디)를 수집하여, 1 x 10⁶ 세포/ml로 배지에 재현탁하였다. 칼세인-AM(Sigma, C1359)는 최종농도 10μM(2ml 세포에 5㎕)로 가하였다. 세포를 37℃에서 45분간 배양한 다음, 1200rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 펠렛을 깨끗한 배양 배지(2X)에 재현탁시켰다. 펠렛을 10,000 세포/75㎕로 재현탁하고, 표적세포 75㎕(10,000 세포/well)를 바닥이 둥근 플레이트(Costar, cat. no. 3799)에 도말하였다. 이러한 다음, 항체를 표적세포에 배지에 50㎕/well로 농도로 희석하여 가하고, 상온에서 30분간 배양하였다. 이러한 다음, 효과기 세포 75㎕를 100,000 세포/well로 가하고, 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 이어, 플레이트를 1200rpm으로 5분간 원심분리하였다. 100㎕ 상층액을 검고 깨끗한 편평한 바닥 플레이트(Costar, cat. no. 3603)에 옮겨, 형광을 측정하였다.

그 결과를 도 10 내지 12로 나타내었고, 또한 표 5와 6에 요약하였다. 굵은 값은 리툭시맙 대조군보다 우수한 EC₅₀ 값을 나타낸다.

선도 후보(lead candidate)를 시험 항체가 세포자살, CDC 및 ADCC에서 대조군과 비교하여 더 우수한 역가를 나타내는 경우의 수를 기준으로 선별하였다. 항 CD20 mAbs 2.1.2, 1.1.2 및 1.5.3(참고: mAbs 1.5.3과 1.3.3은 동일한 아미노산 서열을 가지는 것으로 확인됨)가 가장 우수한 3개의 후보로 동정되었다.

실시예 11: 전혈검사(whole blood assay)

칼세인 ( calcein )- AM 을 이용한 표적세포의 표지

종양 표적세포(라모스, 라지 및 도디)를 수집하여, 1 x 10⁶ 세포/ml의 밀도로 배지에 재현탁하였다. 칼세인-AM(Sigma, C1359)을 최종농도 10μM(2ml 세포에 5㎕)로 가하고, 세포를 37℃에서 45분간 배양하였다. 배양 후, 세포를 1200rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 펠렛을 깨끗한 배지(2X)에 재현탁하였다. 이러한 다음, 펠렛을 10,000 세포/75㎕로 재현탁하였다. 표적세포를 바닥이 둥근 플레이트(Costar, cat. no. 3799)에 75㎕(10,000 세포/well)를 도말하였다. 항체를 배지로 50㎕/well의 농도가 되도록 희석하여 표적세포에 가하고, 상온에서 30분간 배양하였다. 이러한 다음, 효과기 세포 75㎕를 웰당 100,000 세포가되도록 가하고, 37℃에서 4시간 동안 배양하였다(참고: 전혈은 헤파린이 들어있는 튜브에 수집하였다). 배양 후, 플레이트는 1200rpm으로 5분간 원심분리하였다. 100㎕ 상층액은 검고 깨끗한 편평한 바닥 플레이트(Costar, cat. no. 3603)에 옮겨 형광을 측정하였다.

도 13에 도시한 10㎍/ml의 항체농도에서 시작한 전혈검사에서의 세포독성 결과는, 1.1.2와 2.1.2 항체가 특히, 라지 세포주에서 리툭시맙 대조군 항체와 비교하여 더 많은 세포용혈을 야기시키는 것을 나타낸다.

자연계에 존재하는 효과기(natural effector)의 소스(source)인 비분획 혈액(un-fractional blood)을 사용하여, 항 CD20 mAbs의 패널의 세포독성 활성을 EHEB 및 카파스-422 세포주에 대해서 측정하였다. EHEB는 인간의 만성 B 세포 백혈병 세포주(CLL)인 반면, 카파스(Karpas)-422 세포를 비-호킨 림프종 세포주이다. 상기 카파스-422 세포주는 이전에 리툭시맙과 보체에 대한 저항성이 보고되었다(참조: Br J Haematol., 2001; 114: 800-9). 이들 세포주는 상기 항체와 리툭시맙에 관련된 민감성을 비교하기 위한 전혈검사에서 평가되었다. 도 14에 개시된 데이타는 EHEB와 카파스-422 세포주 모두가 리툭시맙 치료에 저항성이 있음을 나타낸다; 그러나, 항 CD20 항체 2.1.2, 1.1.2 및 1.5.3은 높은 수준으로 카파스-422 세포주를 세포용해시켰고, 항 CD20 항체 1.1.2, 1.5.3, 1.10.3.1 및 1.11.3.1은 높은 수준으로 EHEB 세포주를 세포용혈시켰다.

용혈활성 비교

많은 비-호킨 림프종(도디, 라모스, ARH-77, 나말바, 라지, SC1, WSU-NHL, SU-DHL-4 및 카파스-422) 및 만성 림프구성 백혈병(EHEB, JMV-2 및 JMV-3)이 유도되는 세포주에서도 이러한 발견이 행하여졌다. FcgRIIIa 수용체에서 다형 현상(polymorphism)의 기능으로서 다양한 항 CD20 항체의 활성에서 다양성을 위하여, 항 CD20 항체의 패널 중 세포용혈 활성을 다른 인간 기증자로부터 비분획 혈액을 사용하여 평가하였다(참조: Blood, 2002; 99: 754-758). 도 15와 16에 도시된 데이타는 기증자와 세포주 간에, 항 CD20 항체 1.1.2와 1.5.3은 10㎍/ml의 항체농도에서 세포용혈을 높은 수준으로 야기한다는 것을 나타낸다.

추가로 항 CD20 항체의 세포독성 활성을 평가하기 위하여, 리툭시맙에 의한 보체 매개 세포독성에 저항성이 있는 세포주를 생성하여, 전혈검사에서 단클론 항체 1.5.3과 1.1.2의 활성을 확인하였다. 리툭시맙 저항성 라모스와 라지 세포주는 인간 혈청(Research Blood Components, LLC)의 증가된 농도에서 리툭시맙에 반복적으로 3회 노출시켜 수득하였다. 라지와 라모스(버킷 림프종) 세포를 ATCC로 부터 입수하였고, 10% FBS, 1% 피루브산 나트륨과 1% HEPES 완충용액이 제공된 RPMI 배지로 유지하였다. 첫회 선별에서, 세포를 20% 인간 혈청의 존재하에서 1㎍/ml 리툭시맙에 16시간 동안 37℃, 5% CO₂ 상태에서 노출하였다. 2차와 3차 선별에서는 50%까지 인간 혈청이 존재하는 상태에서, 리툭시맙의 농도를 10과 100㎍/ml로 증가시켰다. 각 단계 후, 세포 생존율은 Guava ViaCount Kit(Guava Technologies, Inc., Hayward, CA, USA)로 측정하였다. 리툭시맙 저항성 세포(RR-라지 또는 RR-라모스)는 제한된 희석으로 복제하여 복제를 확장하였다.

리툭시맙에 의해 CDC를 야기하는 활성에 대한 저항성은 각 클론에서 확인하였다. 라지와 라모스 세포주에서 생성된 3개 클론에서, CD20의 발현은 FACS 분석에 의해 모세포주와 동등하게 나타났다. 도 17은 라지 모세포주에는 리툭시맙에 대한 민감성이 남아 있는데 반하여, RR1-라지 세포를 1 또는 10㎍/ml의 리툭시맙이 존재하여도 죽지 않는 것을 나타낸다. 반면에, 10㎍/ml 1.5.3. 또는 1.1.2는 4시간 동안 검사한 결과, RR1-라지 세포의 약 50%를 용해할 수 있었다. 증가된 용혈활성은 도 18에 나타난 것과 같이, 리툭시맙에 비교하여 단클론 항체인 1.5.3.과 1.1.2를 가지는 RR1-라모스, RR6-라모스 및 RR8-라모스 세포주에서도 관찰하였다.

실시예 12: CD20을 발현하는 SB 세포에 결합하는 7개의 정제된 단클론 항체의 FACS Kd 결정

CD20에 대한 정제된 항체(mAbs 1.1.2, 1.2.1, 2.1.2, 1.3.3, 1.5.3, 1.10.3.1, 1.13.2), 리툭시맙(양성 대조군) 및 B1의 친화도를 FACS를 이용하여 결정하였다. 요약하면, CD20을 발현하는 SB 세포를 약 5 X 10⁶ cell/ml의 농도로 FACS 완충용액(2% FBS, 0.05% NaN₃)에 재현탁하였다. HSB 세포를 또 약 9 X 10⁶ cell/ml의 농도로 FACS 완충용액에 재현탁하였다. 세포를 얼음에 보관하였다. 정제된 항체는 96 웰 플레이트의 교차된 11개 웰에 여과된 1X PBS(2X)에 순차적으로 희석하였다. 12번째 웰에는 오직 완충용액만 넣었다. 1X PBS와 세포를 각 mAb의 웰에, 최종부피가 30㎕/well 되도록, 한 웰 당 약 375,000 세포를 포함하도록 가하였다. mAbs를 위한 최종 물질의 농도범위는 다음과 같다:

mAb 농도

1.1.2 =156-0.304nM

1.2.1 =202-0.098nM

2.1.2 =396-0.387nM

1.3.3 =289-0.283nM

1.5.3 =107-0.104nM

1.10.3.1 =265-0.258nM

1.13.2 =367-0.358nM

리툭시맙 =365-0.356nM

B1 =351-0.343nM

플레이트를 4℃ 의 진탕배양기에 3시간 동안 방치한 다음, 원심분리하고 PBS로 3번 세정하였다. 145nM의 Cy5 염소 알파 인간 다클론항체 200㎕를 각 웰에 가하고, 192nM의 Cy5 염소 알파 마우스 다클론항체 200㎕를 B1 항체와 혼합하여 세포에 넣어주었다. 이러한 다음, 플레이트를 40분간 4℃에서 배양하고 원심분리하여 PBS로 3번 세정하였다.

각 mAb 농도를 위하여 10,000 세포의 기하 평균 형광(geometric mean fluorescence, GMF)을 FACSCalibur 기기를 이용하여 측정하였다. 무의미한 비특이적 결합(무의미한 신호)이 HSB 세포에서 나타났다. SB 세포를 포함하는 각 열(row)에서, 앞의 11개 웰의 신호로 부터 12번째 웰(완충용액만 포함)의 신호를 차감하였다. 분자 mAb 농도의 함수로서의 GMF의 비선형 플롯(non-linear plot)을 하기 식을 이용한 과학 소프트웨어로 작성하였다:

상기 식에서, F는 기하 평균형광, L_T는 전체 분자 mAb 농도, P'는 결합한 mAb에 대한 임의의 형광단위와 관련된 비례상수, K_D는 평형 해리상수(equilibrium dissociation constant)를 각각 나타낸다. 각 mAb에 대한 K_D값은 P'로 얻어졌고, K_D값은 비직선 분석에서 자유롭게 변동되었다. 다음 표는 95%의 고정된 신뢰구간(confidence interval)에 걸쳐 각 mAb에 대한 K_D 값을 개시하였다. mAbs는 친화도가 낮은 순으로 개시하였다. FACS K_D 분석방법을 사용한 리툭시맙의 종래의 몇몇 독립적인 측정을 감안하였을 때, 예상되는 정확도는 표준편차(변동계수, coefficient of variation)에 기초하여 12%, 및 95%의 신뢰구간에 기초하여 30%이었다. 그러나, 상기 정확도는 각 mAb에 따라 다양할 수 있다.

실시예 13:

항체의 DNA 염기서열을 결정하기 위하여, 각각 가변성 중쇄(variable heavy chain)와 가변성 경쇄(variable light chain)의 서열을 결정하였다. 상기 항-CD20 항체의 완전한 염기서열 정보는 각각의 감마(gamma)와 카파(kappa) 사슬의 뉴클레오티드와 아미노산 서열을 나타내는 염기서열 목록에 개시하였다. 상기 가변성 중쇄 염기서열은 VH과(family), D-영역(D-region) 염기서열과 J-영역(J-region) 염기서열을 결정함으로써 분석하였다. 상기 염기서열을 일차 아미노산 염기서열을 결정하기 위하여 번역하고, 체세포 과돌연변이(somatic hypermutation)를 평가하기 위하여 배선(germ line) VH, D와 J-영역 염기서열과 비교하였다. '-'은 배선 서열(germ line sequence)과의 동일성을, '#'은 항체서열에서, 배선에서는 발견되지 않는 추가적인 아미노산을 각각 나타낸다.

표 8은 항체 중쇄 영역과 그와 동종의 배선 중쇄 영역과를 비교한 표이고, 표 9는 항체 카파 경쇄 영역과 그와 동종의 배선 경쇄 영역과를 비교한 표이다.

면역글로블린 사슬의 상기 가변성(V) 영역은 다중의 배선 DNA 절편에 의해 암호화되어, B세포가 발생하는 동안 기능성 가변영역(V_HDJ_H 또는 V_KJ_K)에 결합하게 된다. CD20에 대한 상기 항체 반응의 분자적, 유전적 다양성이 상세히 연구되었다. 이들 검사법으로 항-CD20 항체에 특이적인 몇몇 사항들이 밝혀졌다.

8개 하이브리도마 융합에서 분리된 CD20에 결합하는 36개의 각 항체의 분석결과, 거의 모든 하이브리도마가 CD20에 특이적인 항체결합부(paratope)를 형성하기 위하여 같은 중쇄와 경쇄 쌍을 사용한다는 것을 알 수 있었다. 선별된 항체결합부는 VH5-51 중쇄와 쌍을 이루는 Vκ A23 경쇄로 구성된다. Vκ A23 경쇄가 VH1-18 중쇄와 쌍을 이루는, 오직 2개의 mAbs만이 분리되었다. 하나의 mAb만이 VH6-1 중쇄와 쌍을 이루는 Vλ V4-3 경쇄를 사용하고, 하나의 mAb만이 VH1-18 중쇄와 쌍을 이루는 Vλ V2-13 경쇄를 사용하였다.

36개의 독특한 하이브리도마에서 유래된 mAbs 중 31개가 VH5 우세(predominance)로 확인되었다. VH5-51 유래의 중쇄는 CDR1 및 FR3에 걸쳐 폭넓게 돌연변이되었다. VH5-51 mAbs의 서열은, CDR3과 JH 사용에 있어서 치환 및 변이의 서로 다른 패턴을 나타내는 것처럼, 다발성 재배열(multi-rearrangement event)을 야기하였다. 동일한 치환이 항원 유도의 선별을 의미하는 다른 재배열(예를 들어, CDR1에서 Ser³¹이 Asn³¹로, FR3에서 Met⁹³이 Ile⁹³으로)로 부터의 VH5-51 중쇄에서 목격되었다.

28개의 분석된 mAbs가 CD20 특이적으로 결합하는 영역을 형성하는데 Vκ A23로부터 유도된 경쇄를 사용하였다. 모든 Vκ A23 사슬들이 9개 아미노산 CDR3와 재배열되고, CDRs의 배선(germ line)과 비교하여 돌연변이되었다. 21개의 mAbs에서, 분리된 A23 카파 사슬은 돌연변이 및 공용 JK4 구획 사용의 패턴에서 보듯이, 단일 재배열(single rearrangement)로 유도되었다. 동일한 치환이 서로 다른 mAbs(CDR1에서 Ser³²가 Arg³²로, CDR2에서 Ile⁵⁶이 Val⁵⁶으로, CDR3에서 Met⁸⁹가 Val⁸⁹로)에서 목격되었는 바, 이는 친화력 성숙(affinity maturation) 과정에서 이들 위치에서의 특정 잔기에 대한 항원-유도 선별을 암시하였다.

전세포자살 활성뿐만 아니라 상술한 CDC와 ADCC를 유도하는 능력에 의해 결정된 3개의 선도 mAbs인 mAbs 1.1.2, 1.5.3 및 2.1.2 모두는, VH5-51 중쇄와 쌍을 이루는 Vκ A23 경쇄를 사용한다. 중쇄와 경쇄 모두가 CDRs에서 주로 돌연변이되었다. 상기 선도 항체들은 하이브리도마에서 반복되는 단일 항체결합부를 나타낸다.

실시예 14: 항체의 표준집단(canonical class) 결정

초시아(Chothia) 등은 항체의 구조를 각 면역글로블린 사슬의 초가변영역에 대해 “표준집단(canonical class)"의 관점에서 기술하였다(참조: J Mol Biol. 1987 Aug 20; 196(4):901-917). 다양한 면역글로블린의 아미노산 염기서열과 항원 결합부위의 3차원적 구조간의 관계를 결정하기 위하여, Fab절편과 VL절편의 원자적 구조를 분석하였다. 초시아 등은 패킹(packing), 수소결합 또는 파이(phi), 싸이(psi), 또는 오메가(omega) 형태를 취할 수 있는 능력을 통하여, 상기 초가변영역의 주-사슬(main-chain) 구조의 형성에 주로 관여하는 잔기가 상대적으로 적게 존재한다는 것을 발견하였다. 상기 잔기는 초가변영역과 보존된 베타-쉬트(beta-sheet) 구조의 특정 부위에서 발생함을 발견하였다. 초시아 등은 알려지지 않은 구조의 면역글로블린의 염기서열을 검증함으로써, 다수의 면역글로블린이 이미 공지된 구조 중 하나와 크기 면에서 유사하다는 것과, 추가적으로 상기 관찰된 구조에 관여하는 부위에 동일한 잔기를 포함하고 있음을 개시하였다.

상기 연구자의 발견은 초가변영역들이 이미 공지된 구조의 형태와 가까운 형태를 가지고 있음을 암시한다. 상기 초가변영역 중 5개에 대해, 형태의 레퍼토리(repertoire)는 상대적으로 적은 수의 별개의 구조적 분류에 제한되어 있는 것으로 여겨지고 있다. 상기 일반적인 초가변영역의 주-사슬(main-chain) 구조는 “표준구조(canonical structure)"라고 명명하였다. 초시아 등(참조: Nature 1989 Dec 21-28; 342(6252):877-883)과 다른 연구자들(참조: Martin et al., J Mol Biol. 1996 Nov 15; 263(5):800-815)에 의한 연구결과, 항체의 6가지 초가변영역은 적어도 5가지의 주-사슬 형태의 적은 레퍼토리가 존재함을 확인하였다.

상술한 각 항체의 CDR을 이들의 표준집단을 결정하기 위하여 분석하였다. 공지된 바대로, 표준집단은 단지 상기 항체 중쇄의 CDR 1과 CDR 2, 상기 항체 경쇄의 CDR 1, CDR 2와 CDR3에 할당되었다. 아래의 표에 상기 분석결과를 요약하여 나타내었다. 상기 표준집단 데이타는 *HCDR 1-HCDR 2-LCDR 1-LCDR 2-LCDR3의 형태로 표시되는데, 여기서“HCDR"은 CDR의 중쇄을 의미하고, "LCDR"은 CDR의 경쇄을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 1-3-2-1-5의 표준집단은 표준집단 1에 속한 HCDR 1, 표준집단 3에 속한 HCDR 2, 표준집단 2에 속한 LCDR 1, 표준집단 1에 속한 LCDR 2, 표준집단 5에 속한 LCDR 3를 가지는 항체를 의미한다.

항체의 서열이 각 표준집단에서 정의된 중요 아미노산에 부합하는 특정 표준집단이 할당되었다. 각 항체에 정의된 아미노산은 예를 들어, 상기 Chothia, et al.의 논문에서 찾을 수 있었다. 표 10과 표 11은 CD20 항체 각각에 대한 표준집단 데이타를 나타낸다. 같은 CDR 길이에서 부합되는 표준집단이 없는 경우에는, 표준집단의 할당을 CDR의 크기 18(size 18)을 의미하는 "s18"과 같이 영문 s와 숫자로 표시하였다. CDR의 구조가 표준집단과 유사하나 편차를 가지는 것으로 예상되는 경우에는, 표준집단은 '^'로 표시하였다. 중쇄 또는 경쇄 중 하나에 유효한 서열 데이타가 없는 경우에는, 표준집단을 "Z"로 표시하였다.

항체(분류된)	H1-H2-L1-L2-L3	H3길이
50-001H1_10_3_1	1-2-2-1-s9	15
50-001H1_11_3_1	1-2-4-1-1	12
50-001H1_12_1	1-2-4-1-1	13
50-001H1_13_1	1-2-4-1-1	12
50-001H1_1_1	1-2-8-1-1	13
50-001H1_2_1_1	1-2-4-1-1	12
50-001H1_3_1	1-2-4-1-1	13
50-001H1_4_1	1-2-8-1-1	13
50-001H1_5_1	1-2-4-1-1	13
50-001H1_6_1	1-2-4-1-4	12
50-001H1_7_1	1-2-4-1-1	12
50-001H1_9_1	1-2-4-1-s10	13
50-001H2_1_1	1-2-4-1-1	13
50-001H2_2_1	1-2-4-1-1	13
50-001H2_4_1	1-2-4-1-1	14
50-001H3_1_1	1-2-4-1-1	12
50-001H3_2_1	1-2-4-1-1	8
50-001H3_3_1	1-2-4-1-1	8
50-001H3_4_1	1-2-4-1-1	14
50-001H3_7_1	1-2-4-1-1	12
50-001H4_2_1_1	1-2-4-1-1	12
50-001H4_5_1	1-2-Z-Z-Z	12
50-001H4_6_1	1-3-4-1-1	6
50-001H6_3_1	1-3-9-1-5	13
50-001H7_17_1	1-2-4-1-1	12
50-001H7_18_1	1-2-4-1-1	12
50-001H7_1_1	1-2-4-1-1	12
50-001H7_21_1	1-2-4^-1-1	12
50-001H7_23_1_1	1-2-4-1-1	12
50-001H7_24_1_1	1-2-4-1-1	15
50-001H7_26_1	1-2-4-1-1	15
50-001H7_28_1_1	1-2-4-1-1	12
50-001H7_7_1	1-2-4-1-s10	12
50-001H7_8_1	1-2-4-1-1	12
50-001H7_9_1	1-2-4-1-1	12

항체	H1-H2-L1-L2-L3(분류된)	H3길이
50-001H1_10_3_1	1-2-2-1-s9	15
50-001H7_21_1	1-2-4^-1-1	12
50-001H3_2_1	1-2-4-1-1	8
50-001H3_3_1	1-2-4-1-1	8
50-001H1_11_3_1	1-2-4-1-1	12
50-001H1_13_1	1-2-4-1-1	12
50-001H1_2_1_1	1-2-4-1-1	12
50-001H1_7_1	1-2-4-1-1	12
50-001H3_1_1	1-2-4-1-1	12
50-001H3_7_1	1-2-4-1-1	12
50-001H4_2_1_1	1-2-4-1-1	12
50-001H7_17_1	1-2-4-1-1	12
50-001H7_18_1	1-2-4-1-1	12
50-001H7_1_1	1-2-4-1-1	12
50-001H7_23_1_1	1-2-4-1-1	12
50-001H7_28_1_1	1-2-4-1-1	12
50-001H7_8_1	1-2-4-1-1	12
50-001H7_9_1	1-2-4-1-1	12
50-001H1_12_1	1-2-4-1-1	13
50-001H1_3_1	1-2-4-1-1	13
50-001H1_5_1	1-2-4-1-1	13
50-001H2_1_1	1-2-4-1-1	13
50-001H2_2_1	1-2-4-1-1	13
50-001H2_4_1	1-2-4-1-1	14
50-001H3_4_1	1-2-4-1-1	14
50-001H7_24_1_1	1-2-4-1-1	15
50-001H7_26_1	1-2-4-1-1	15
50-001H1_6_1	1-2-4-1-4	12
50-001H1_7_1	1-2-4-1-s10	12
50-001H1_9_1	1-2-4-1-s10	13
50-001H1_1_1	1-2-8-1-1	13
50-001H1_4_1	1-2-8-1-1	13
50-001H4_5_1	1-2-Z-Z-Z	12
50-001H4_6_1	1-3-4-1-1	6
50-001H6_3_1	1-3-9-1-5	13

표 12는 각 집단 당 항체의 수를 분석한 결과를 나타낸다. 왼쪽 컬럼에 표시된 특정 표준집단을 가지는 항체의 수를 오른쪽 컬럼에 나타내었다. 하나의 사슬 서열 데이타의 결실되고, 이에 따른 표준배치에서 'Z'를 가지는 하나의 mAb는 여기에 포함되지 않는다. 가장 일반적인 구조는 이 조합의 중쇄 및 경쇄 서열을 모두 갖는 34개 mAb 중 25개 mAb가 가지는 1-2-4-1-1이다.

각 표준집단 조합에서 CD20 항체의 수

H1-H2-L1-L2-L3	수
1-2-2-1-s9	1
1-2-4^-1-1	1
1-2-4-1-1	25
1-2-4-1-4	1
1-2-4-1-s10	2
1-2-8-1-1	2
1-3-4-1-1	1
1-3-9-1-5	1

실시예 15: 에피토프 특성화: 합성 펩티드의 점 합성(spot-synthesis)

펩티드-항체 간의 낮은 친화도 측정

인간 CD20 서열의 세포외 영역 43개 아미노산에 걸친 중복 펩티드(overlapping peptide)를 자동화 점 합성(automated spot synthesis)에 의해 제조하였다. 12량체(12-mer) 펩티드의 33개를 폴리프로필렌막 박판(polypropylene membrane sheet)에서 점으로 합성하였다. 상기 펩티드 정렬은 CD20 서열의 142 내지 185의 아미노산 잔기에 걸쳐져 있다. 각 연속된 펩티드는 이전의 펩티드로 부터 1개의 잔기만큼 상쇄되어, 결과적으로 표 13에 개시된 바 등의 포개지고(nested) 중복된(overlapping) 정렬된 올리고펩티드의 라이브러리(library)를 만들었다.

펩티드	서열번호
1 KISHFLKMESLN	163
2 ISHFLKMESLNF	164
3 SHFLKMESLNFI	165
4 HFLKMESLNFIR	166
5 FLKMESLNFIRA	167
6 LKMESLNFIRAH	168
7 KMESLNFIRAHT	169
8 MESLNFIRAHTP	170
9 ESLNFIRAHTPY	171
10 SLNFIRAHTPYI	172
11 LNFIRAHTPYIN	173
12 NFIRAHTPYINI	174
13 FIRAHTPYINIY	175
14 IRAHTPYINIYN	176
15 RAHTPYINIYNC	177
16 AHTPYINIYNCE	178
17 HTPYINIYNCEP	179
18 TPYINIYNCEPA	180
18 TPYINIYNCEPA	181
19 PYINIYNCEPAN	182
20 YINIYNCEPANP	183
21 INIYNCEPANPS	184
22 NIYNCEPANPSE	185
23 IYNCEPANPSEK	186
24 YNCEPANPSEKN	187
25 NCEPANPSEKNS	188
26 CEPANPSEKNSP	189
27 EPANPSEKNSPS	190
28 PANPSEKNSPST	191
29 ANPSEKNSPSTQ	192
30 NPSEKNSPSTQY	193
32 SEKNSPSTQYCY	194
33 EKNSPSTQYCYS	195

요약하면, 12량체 CD20로부터 유도된 펩티드를 포함하는 펩티드는 단클론 항체로 탐침하였다. CD20로부터 유도된 펩티드에 결합하는 항체 펩티드는 폴리 비닐 디플루오리드(polyvinyldifluoride, PVDF) 막에서 항체-펩티드 복합체의 전기화학적 이동에 의해 고정화되었다. 전기이동은 3개의 분리된 PVDF 막(높은 백그라운드로 부터 낮은 백그라운드까지)위에 분획된 순서로 이루워진다. 단클론 항체는 퍼록시다제로 표지된 염소 항 인간 IgG 항체와의 화학발광으로 탐지하였다.

모든 3개 막에서 단일 결합부위를 확인하였다. mAbs 1.1.2와 1.5.3의 결합은 27 내지 30번째 펩티드에서 결정하였다. 일반적인 에피토프를 나타내는 펩티드는 NPSEKNSPS(서열번호: 196)인 것으로 결정하였다. 이 펩티드는 CD20 세포외 영역의 171 내지 179번째 잔기에 결합한다.

2.1.2 항체에 대한 에피토프 서열결정(epitope mapping)은 세포외 영역에서 부위특이적으로 돌연변이된 CD20 구조를 발현하는 CHO 세포를 사용하여 흐름세포측정(flow cytometry)에 의해 결정하였다. 4개의 CHO 돌연변이주가 작제되었다. 3개의 mAbs에 대하여 단일 결합영역이 동정되었다.

실시예 16: CD20 세포외 영역 서열 정렬

본 실시예로서는 마우스 B 세포에 결합하지 않는 인간 CD20의 세포외 에피토프에 직접적인 항체를 나타낸다. 인간과 마우스 CD20의 세포외 영역은 약 43개 아미노산 중 16개에서 차이가 난다. 8개의 비상보적인 차이는 다음의 정렬에 나타난 10개 아미노산(ESLNFIRAHT(서열번호: 197)) 내에 위치한다.

	아미노산 142-184
인간	KISHFLKMESLNFIRAHTPYINIYNCEPANPSEKNSPSTQYCY(서열번호: 198)
마우스	TL------RR-EL-QTSK--VD--D---S-S-----------N(서열번호: 199)

마우스 CD20 세포외 영역의 아미노산 서열에서 이러한 차이는 상기 에피토프 서열결정 연구를 위한 기초로 사용하였다. 돌연변이 전략은 마우스 서열의 그것들과 서로 다른 인간 CD20 서열에서의 세포외 잔기를, 마우스의 서열에서의 동등한 위치의 그것들로 치환하도록 설계되었다.

실시예 17: 부위 특이적 돌연변이(site directed mutagenesis)에 의한 에피토프 서열결정

돌연변이를 이용한 에피토프 서열결정의 연구는 170번째 알라닌(alanine)과 172번째 프롤린(proline)이 항 CD20 항체로 공지된 인간 CD20 인식에 관여한다는 것을 나타내었다. 이들 잔기가 세린(serine)으로 전환되면, 공지된 항체 B1, 2H7, 1F5 및 리툭시맙은 결합하지 않게 된다. 인간 CD20에 대한 mAb 2F2의 결합은 AxP 돌연변이에 민감하지 않고, N163과 N166을 포함하는 CD20 에피토프를 나타낸다.

mAbs 1.1.2와 1.5.3의 에피토프는 171 내지 179 잔기(NPSEKNSPS(서열번호: 196))로 밝혀졌다. 인간 서열에 대한 이들 mAbs의 특이성은 172번 프롤린에 의한다. 표 16에 나타낸 것과 같이, 170번째 알라닌은 결합에 필수적이지 않다.

CD20 mAbS의 세부적 특이성

mAb	특이성	점(spot)	서열번호	중요 잔기
B1	인간 CD20	PANPSEKNSP	200	A170, P172
2H7	인간 CD20			A170*, P172
IF5	인간 CD20			A170*, P172
리툭시맙	인간 CD20			A170, P172
2F2	인간 CD20			N163, N166
1.1.2	인간 CD20	NPSEKNSPS	196	P172
1.5.3	인간 CD20	NPSEKNSPS	196	P172
2.1.2	인간 CD20

* 결합의 최소요건. Polyak & Deans(2002); Blood 99: 3256-62

본 명세서에 개시된 제노우스^®(Xenouse^®)로부터 유도된 항 CD20 단클론 항체는 공지된 모든 CD20 항체의 다른 에피토프에도 중복되어 있다.

실시예 18: CD20의 발현을 수반하는 질환의 치료를 위한 항 CD20 항체의 용도

항 CD20 선도 항체후보들을 라모스 후돌출부 정맥주사 마비 모델(i.v. rear-limb paralysis model)에서 평가하였다(참조: Cragg MS, Glennie MJ, (2004) Blood 103: 2738-43). 구체적으로, CB17 SCID 마우스에 꼬리 정맥을 통해 1 x 10⁶ 인간 라모스 림프종 세포를 주입하고, 후돌출부의 마비와 생존의 징후를 평가하였다. 동물집단에 3개의 선도 후보 항 CD20 항체를 처리하고; 리툭시맙을 처리한 한 집단을 표준 대조군으로 정하였다. 따라서, 각각 7마리 쥐의 6개 군은 종양세포 주입 후 15일간, 1회 0.05mg/kg의 항체를 복강내 주사하였다. 6개의 실험군은 다음과 같다: PBS(대조군), IgG1 동형 대조군 항체, 리툭시맙 및 항 CD20 항체 2.1.2, 1.3.3 및 1.1.2. 전체(overall) 생존과 절반(median) 생존점을 확인하였다. 참고: 항 CD20 mAb 1.3.3의 서열은 mAb 1.5.3의 서열과 동일하다는 것을 확인하였다. 입수의 용이성 문제로, mAb 1.3.3을 mAb 1.5.3 대신에 사용하였다.

상기 실험의 그 결과를 도 19로에 나타내었고, 단회투여(single dose monotherapy)시 3개의 모든 선도 항체 후보에서 강력한 항 림프종 활성이 나타냄을 알 수 있었다. 게다가, 이 실험은 1.5.3과 2.1.2 항체로 실험군의 전체 생존이 리툭시맙 대조군과 비교하였을 때보다 현저히 개선되었음을 나타낸다. 1.5.3 항체와 리툭시맙을 비교하는 통계적인 분석은 0.022의 유의확률(p-value)을 나타내고; 2.1.2와 리툭시맙을 비교하는 분석은 0.023의 유의확률을 나타낸다. 따라서, 이는 1.5.3과 2.1.2 항 CD20 항체를 처리한 마우스에서 확률적으로 전체 생존이 현저하게 개선되었다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 19: 피하 종양모델에서 CD20에 대한 인간항체를 사용한 면역치료

도디( Daudi) 피하모델에서의 효능

mAb 1.5.3과 리툭시맙을 이용한 면역치료는 도디 종양세포(ATCC)를 가지는 CB17 SCID 마우스로 평가하였다. 요약하면, CB17 SCID 마우스는 챨스 리버 레이보러토리(Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA)에서 입수하였고, 무균상태에 유지시켰다. 10⁷ 도디 세포를 피하주사하여 종양을 형성시켰다. 평균 종양 크기가 200mm³이 되었을 때, 처치를 시작하였다. 각 항체, 2.1.2, 1.1.2, 1.5.3 및 리툭시맙는 1mg/kg과 5mg/kg의 2가지 양으로 시험하고, 대조군과 IgG1 동형 대조군과 비교하였다. 항 CD20 항체, 동형 대조군 및 PBS 대조군의 투여는 종양주입 후 18일에 시작하였고, 3주간 일주일에 2번씩 복강내 주사하였다.

상기 실험의 그 결과를 도 20과 표 17에 나타내었다. 모든 mAbs는 강력한 항종양 효과를 나타내었다. mAbs 1.5.3과 1.1.2는 도디 종양의 성장억제에 리툭시맙에 의한 억제가 71%로 나타났던 5mg/kg 양에서 95%(p<0.001)로서 더 강력한 억제력을 나타내었다. 1.5.3 또는 1.1.2를 리툭시맙과 비교한 통계분석결과를, 스튜던트 t 검증(student t test)에서 0.05 이하의 p값을 나타내었는 바, mAbs 1.1.2와 1.5.3의 효능이 현저히 개선되었음을 입증하였다. 완전 회복(complete regression) 및 비 종양 생존(tumor free survival)은 mAbs 1.5.3과 1.1.2의 더 높은 양을 처리한 마우스에서 각각 10%와 20%로 관찰되었다.

군의 명칭	종양 두배 성장기 (TD)	성장 지연 (GD)	세포 사멸 지수 (LCK)	T/C %	t-검증 One-tail P	억제 %	표준편차 log(Vf/Vi)	최대 체중 손실 %	회복 %	전부 회복 %	비종양 생존
	[전체]	[1000.0㎣]		[시작일:18 종결일:35]					[T/C<= -50.0%]	[Size <= 63.0㎣]	[Days >= 14]
PBS	4.607	-	-	-	-	-	0.08463	0%	-	-	-
IgG1-ctr	-	-0.4	-0.029	95	0.21909	13	0.06266	0%	0%	0%	0%
리투잔- 1mpk	-	1.8	0.115	61	0.001727	46	0.14526	0%	0%	0%	0%
리투잔- 5mpk	-	9.0	0.591	31	0.0	71	0.10263	0%	0%	0%	0%
2.1.2-1mpk	-	0.9	0.057	73	0.037602	36	0.15279	-1%	0%	0%	0%
2.1.2-5mpk	-	8.4	0.547	34	0.0	70	0.11548	-1%	0%	0%	0%

1.1.2-1mpk	-	3.3	0.215	48	2.0E-6	55	0.15718	0%	0%	0%	0%
1.1.2-5mpk	-	-	-	6	0	95	0	0%	30%	20%	20%
1.5.3-1mpk	-	4.4	0.288	47	8.14E-4	59	0.24263	0%	0/10	0%	0%
1.5.3-5mpk	-	24.6	1.608	5	0.0	95	0	-2%	10%	10%	10%

나말바 피하모델에서의 효능

유사한 실험 설계를 행하여 비-호킨 림프종의 나말바 모델에서 항 CD20 인간항체의 효능을 평가하였다. 10⁷ 나말바 세포(ATCC)를 Ncr 누드마우스(Ncr nude mice, Taconics, Germantown, NY, USA) 피하에 이식하였다. 나말바 세포를 낮은 수준의 CD20을 발현하는 강력한(aggressive) 종양을 형성하였다. 종양의 평균크기가 100mm³에 도달하였을 때, 처치를 시작하였다. 항체는 항 CD20 항체의 10과 20mg/kg의 양으로 검증하였고, 대조군과 IgG1 동형 대조군과 비교하였다. 항 CD20 항체, 동형 대조군 및 PBS 대조군의 투여는 종양주입 후 9일째에 시작하였고, 3주간 매주 2번씩 복강내 주사하였다. 도 21과 표 18에 개시된 바와 같이, 리툭시맙과 mAb 1.5.3은 20mg/kg의 높은 투여량에서 각각 78과 73%(p<0.001)의 종양성장 억제를 야기하였다. 그러나, 1.5.3의 10mg/kg 양에서는 같은 양의 리툭시맙보다 더 강력한 효과를 나타내었다. mAb 1.5.3는 65%의 종양성장 억제(p<0.05)를 보인 반면, 리툭시맙은 효과적이지 않았다.

군의 명칭	종양 두배 성장기 (TD)	성장 지연 (GD)	세포 사멸 지수 (LCK)	T/C%	t-검증 One-tail P	억제%	표준 편차 log (Vf/Vi)	최대 체중 손실%	회복	전부 회복
	[전체]	[1000.0mm3]		[시작일:9 종결일:23]					[T/C<= -50.0%]	[크기 <= 63.0mm3]
PBS	3.399	-	-	-	-	-	NaN	0%	0/10	0/10
IgG-1	-	0.6	0.053	85	0.212797	2	NaN	0%	0%	0%
RTX-10mpk	-	0.2	0.015	88	0.498394	5	NaN	0%	0%	0%
RTX-20mpk	-	N/A	N/A	22	5.76E-4	78	NaN	0%	80%	80%
1.5.3-10mpk	-	N/A	N/A	32	0.023883	65	NaN	0%	40%	40%
1.5.3-20mpk	-	N/A	N/A	28	0.005959	73	0.44.54	0%	40%	30%

RR1 -라지( Raji ) 피하모델에서의 효능

리툭시맙 저항성 세포모델에서 항 CD20 인간항체의 효능 또한 평가하였다. 10⁷ RR1-라지를 CB17 SCID 감수성 마우스에 피하에 이식하였다. 항체는 1mg/kg과 5mg/kg의 2개 투여량에서 검증하였고, 대조군과 IgG1 동형 대조군과 비교하였다. 종양주입 후 14일째에 항 CD20 항체, 동형 대조군 및 PBS 대조군의 투여를 시작하고, 3주간 매주 2번씩 복강내 주사하였다. RR1-라지 모델에서 5mg/kg의 리툭시맙은 mAb 1.5.3에 의해 달성된 62%와 유사한 59%의 종양성장을 억제하는 효과를 나타내었다(도 22). 1mg/kg 양에서, 비록 통계학적으로 의미있는 차이(p=0.058)를 나타내지는 않았지만, 항체 1.5.3은 리툭시맙보다 더 강력한 효과를 나타내었다.

군의 명칭	종양 두배 성장기(TD)	성장 지연 (GD)	세포 사멸 지수(LCK)	T/C%	t-검증 One-tail P	억제 %
	[전체]	[900.0㎣]		[시작일: 14 끝]
PBS	6.334	-	-	-	-	-
IgG2＠5mpk	-	-2.1	-0.1	120	0.249902	-9
리투잔＠1mpk	-	1.7	0.082	81	0.086581	20
리투잔＠5mpk	-	6.6	0.313	49	0.021599	59
1.5.3＠1mpk	-	4.8	0.229	61	0.009539	45
1.5.3＠5mpk	-	9.9	0.473	42	9.18E-4	62

RR6 -라모스( Ramos ) 피하모델에서의 효능

이어, RR6-라모스 모델은 생체조건에서 시도하였다. 10⁷ RR6-라모스 세포를 CB17 SCID 감수성 마우스의 피하에 이식하였다. 상기 마우스에 1 또는 5mg/kg의 2.1.2, 1.5.3 또는 리툭시맙을 처리하고, 항종양 효능을 PBS 대조군 또는 IgG1 동형 대조군과 비교하였다. 종양주입 후 14일째에 항 CD20 항체, 동형 대조군 및 PBS 대조군의 투여를 시작하고, 3주간 일주일에 2번씩 복강내 주사하였다. 도 23과 표 20은 리툭시맙이 이 모델에서 어떤 두드러진 항종양 효과도 나타내지 못하는 반면, mAbs 2.1.2와 1.5.3는 각각 61%와 59%(p<0.05)로 종양성장을 억제하였다.

군의 명칭	종양 두배 성장기(TD)	성장 지연 (GD)	세포 사멸 지수(LCK)	T/C%	t-검증 One-tail P	억제 %
	[전체]	[1000.0㎣]		[시작일: 14 끝]
IgG2＠5mpk	3.823	-	-	-	-	-
리투잔＠1mpk	-	-0.4	-0.029	97	0.382272	17
리투잔＠5mpk	-	0.9	-0.068	72	0.019239	26
2.1.2＠1mpk	-	4.3	0.337	40	2.05E-5	64
2.1.2＠1mpk	-	3.1	0.244	46	1.5E-5	61
1.5.3＠1mpk	-	3.4	0.27	44	7.53E-4	59
1.5.3＠5mpk	-	2.8	0.221	48	6.05E-4	59

실시예 20: CD20에 대한 인간항체 처리 후 조직 B 세포의 감소

필리핀 원숭이(cynomologus monkey) CD20과 인간 CD20 사이의 아미노산 동일성/상동성의 정도는, 많은 상업적으로 입수가능한 항 인간 CD20 항체가 필리핀 원숭이 B 림프구와 교차반응(cross-reaction)하기 때문에, 아마도 높을 것이다. 실험을 시작하기에 앞서, 전체 26마리의 수컷 필리핀 원숭이에서 순환하는 B 림프구(CD20+ 세포)의 비를 조사하였다. 부분 모집단 분포에서 CD20+ 세포의 극심한/비정상적인 분포를 보인 동물은 실험에서 제외하였다. 선별의 결과로 24마리 동물이 선택되었고, 체중에 의해 무작위로 각각 6마리씩의 수컷 필리핀 원숭이로 구성된 3개의 군으로 분류하였다. 14일간의 환경 적응기간 이후, 실험 1, 8 및 15일째에 용매(제 1군, 0mg/kg), 양성 대조군으로 리툭시맙(제 2군, 10mg/kg) 및 10mg/kg의 mAb 1.5.3(제 3군)을 정맥주사하였다.

평가된 요인들은 임상학적 관찰, 체중, 음식 소모량, 혈액학, 말초혈액과 림프 조직의 FACS 분석, 혈청내 검사시료(test article)의 농도(약물동력학), 전반적인 병리학, 기관의 무게, 조직병리학 및 면역조직화학을 포함한다. 모든 동물은 실험 18일째 예정된 마지막 검시일까지 생존하였다.

양성 대조군(리툭시맙) 또는 검사시료(mAb 1.5.3)에 의한 치료에 기여하는 변화가 임상학적 관찰, 음식 소모량, 체중, 조직 무게 또는 전반적인 병리학의 측면에서 나타나지 않았다. 예상한 바와 같이, 혈액학에서 다른 기대된 변화만큼 주입 후 1시간 내에 혈액에서 전체 림프구 수에 검사시료와 관련된 효과가 나타났다. 흐름 세포측정(flow cytometry) 그 결과를 혈액에서 동일한 양의 제 2군(리툭시맙) 및 제 3군(mAb 1.5.3)을 위한 CD19+와 CD20+ 부분집합에서 기준선과 관련된 양성 B 림프구의 연관된 퍼센트의 현저한 감소를 나타낸다. mAb 1.5.3 처리한 원숭이는 실험 18일째에 기준선의 약 >1% 남은 감소된 B 세포 양으로 투여 후 즉시 일어나는 확실한 효과를 보였다.

추가적으로, 다양한 부위(창자(mesenteric), 서혜부(inguinal) 및 보조 림프절(auxiliary lymph node)), 골수 및 지라에서 분리한 세포의 FACS 분석결과를, 제 3군, mAb 1.5.3을 처리한 동물 및 대조군 사이에서 큰 차이(p<0.05)를 나타내었다(도 24). mAb 1.5.3의 관찰된 효과는 동일한 양에서 리툭시맙을 이용했을 때보다 더 두드러졌다(도 24). 이러한 변화에는 난포와 가장자리 영역(marginal zone, 지라)에서의 최소한 또는 두드러진 B 세포의 고갈(depletion), 및 세동맥 림프구 덮개(periarteriolar lymphoid sheath, PALS)와 속겉질(paracortex)에서 T 세포의 상대적 및/또는 절대적 증가를 포함한다. 전체적으로 검사시료의 투여에 기인한 부작용은 본 연구에서 확인되지 않았다. 모든 검사시료와 관련하여 본 연구의 동물에서 관찰된 변화는 가장 강력한 효과를 나타내는 AB1 항체와 항 CD20+ 항체의 약리학적 활성과 일치하였다.

실시예 21

비-호킨 림프종에 걸린 인간 환자를 본 명세서에 개시된 mAb 1.5.3으로 처치하였다. 각 환자에게 4 내지 8주 동안 50mg/m² 내지 2,250mg/m² 범위의 항체 유효량으로 매주 투여하였다. 처치하는 동안 주기적으로, 환자의 림프종 세포수를 측정하기 위하여 각 환자를 모니터링하였다. mAb 1.5.3으로 처치한 환자의 림프종 세포를 mAb 1.5.3 항체로 처치하지 않은 대조군 환자와 비교하여 감소하였다.

참고문헌

특허, 특허출원, 논문, 교과서 등 및 거기에 인용된 참고문헌을 포함한 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 본 명세서에 전문이 참조로 삽입되었다.

균등물

상술한 본 명세서는 당업자들이 본 발명을 수행하기에 충분하도록 고려하였다. 상술한 설명 및 실시예들은 본 발명의 바람직한 실시태양들을 특정하고, 발명자들에게 이해되는 최선의 실시태양을 서술한다. 본 발명은 본 명세서에 얼마나 상세히 설명되었는지에 관계없이, 여러가지 방법으로 수행될 수 있으며, 첨부된 청구범위 및 그의 균등물에 따라 이해될 수 있을 것이다.

<110> GAZIT-BORNSTEIN, Gadi LARRY L., GREEN XIAODONG, YANG CHRISTOPHE, QUEVA DAVID CHARLES, BLAKEY <120> ANTIBODIES DIRECTED TO CD20 AND USES THEREOF <130> FP0717/CG/US <150> US 60/686,992 <151> 2005-06-02 <160> 202 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 368 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180 aggccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcac caccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagacaccct 300 tcctatggtt cggggagtcc caactttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctcagc 368 <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Arg Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Pro Ser Tyr Gly Ser Gly Ser Pro Asn Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 427 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gatattgtga tgacccagac tccactctcc tcacctgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta cacagtgatg gaaacaccta cttgagttgg 120 cttcagcaga ggccaggcca gcctccaaga ctcctaattt ataagatttc taaccggttc 180 tctggggtcc cagacagatt cagtggcagt ggggcaggga cagatttcac actgaaaatc 240 agcagggtgg aagctgagga tgtcggggtt tattactgca tgcaagctat acaatttccg 300 atcaccttcg gccaagggac acgactggag attaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaata 427 <210> 4 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Ala 85 90 95 Thr Gln Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 5 <211> 374 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180 agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagaatgggg 300 gatttttgga gtggttatta taccagaggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360 accgtctcct cagc 374 <210> 6 <211> 124 <212> PRT 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360 tcagc 365 <210> 38 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Gly Thr Thr Asp Tyr Tyr Ser Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 39 <211> 338 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 gatattgtga tgacccagac tccactctcc tcacctgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta cacagtgatg gaaacacctt cttgagttgg 120 cttcagcaga ggccaggcca gcctccaaga ctcctaattt ataagatttc taaccggttc 180 tctggggtcc cagacagatt cagtggcagt ggggcaggga cagatttcac actgaaaatc 240 agcagggtgg aagctgagga tgtcggggtt tattactgca tgcaacttac tcaatttccg 300 ctcactttcg gcggagggac caaggtggag atcagacg 338 <210> 40 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Phe Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Leu 85 90 95 Thr Gln Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Arg 100 105 110 <210> 41 <211> 368 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180 agcccatcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 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atctccaagg cgcctaattt ataaggtttc taactgggac 180 tctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240 agcagggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaggtac acactggcct 300 tcgatcacct tcggccaagg gacacgactg gagattaaac g 341 <210> 44 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Trp Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Thr His Trp Pro Ser Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 45 <211> 368 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 gaggtgcagt tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180 agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagacagggc 300 gatttttgga gtggttatgg gggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctcagc 368 <210> 46 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Gly Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Gly Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 47 <211> 338 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 gatattgtga 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gtggcggacc ggatgctttt gatgtctggg gccaagggac aatggtcacc 360 gtctcttcag c 371 <210> 70 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Phe Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ala Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu His Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Arg Asp Tyr Thr Ser Gly Gly Pro Asp Ala Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 71 <211> 338 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 71 gatattgtga tgacccagac tccactctcc tcacctgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta tacagtgatg gaaacaccta cttgagttgg 120 cttcaccaga ggccaggcca gcctccaaga ctcctaattt ataagatttc taaccggttc 180 tctggggtcc cagacagatt 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attactgtgc gcgaactggg 300 agctactcct actactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tcagc 365 <210> 102 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Arg Asn Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Gly Ser Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 103 <211> 338 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 103 gatattgtga tgacccagac tccactctcc tcacctgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta cacagtgata gaaataccta cttgagttgg 120 cttcagcaga ggccaggcca gcctccaaga ctcctaattt ataaggtttc taaccggttc 180 tctggggtcc cagaaagatt cagtggcagt gggacaggga cagatttcac actgaaaatc 240 agcagggtgg aagctgagga tgtcggggtt tattactgcg tgcaagaaac actatttccc 300 atcaccatcg gccaggggac acgactggag attaaacg 338 <210> 104 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asp Arg Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Glu Arg Phe Ser Gly Ser Gly Thr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Glu 85 90 95 Thr Leu Phe Pro Ile Thr Ile Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 105 <211> 365 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 105 ggggtgcagc tggttcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggata cagttttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180 agcccgtcct tccaaggcca ggtcatcatt tcagccgaca agtccatcag taccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagaactggg 300 gattactact cctaccacgg aatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tcagc 365 <210> 106 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Gly Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Ile Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Gly Asp Tyr Tyr Ser Tyr His Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 107 <211> 338 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 107 gatattgtga tgacccagac tccactctcc tcacctgtca cccttggaca 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tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagaattggg 300 gattactact cctattccgg tttggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tcagc 365 <210> 130 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 130 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Gly Asp Tyr Tyr Ser Tyr Ser Gly Leu Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 131 <211> 338 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 131 gatattgtga tgacccagac tccactctcc tcacctgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta cacagtgatg gacacaccta 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cagtgtctca agcaacagtg tttcttggaa ctggatcagg 120 cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtt taagtggttt 180 aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240 cagttctccc tgcgactgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctctgta ttactgtgca 300 agaatagata tctggaacga cgtctttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctcagc 368 <210> 134 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 134 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Met Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Val Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Phe Lys Trp Phe Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Leu 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Asp Ile Trp Asn Asp Val Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 135 <211> 347 <212> DNA 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Tyr Arg Ile Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Ser Pro Pro Arg Tyr 35 40 45 Leu Leu Ser Tyr Tyr Ser Asp Ser Ser Lys His Gln Gly Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ser Asn Ala Gly Ile 65 70 75 80 Leu Val Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 85 90 95 Met Ile Trp His Ser Ser Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr 100 105 110 Val Leu <210> 163 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 163 Lys Ile Ser His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn 1 5 10 <210> 164 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 164 Ile Ser His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe 1 5 10 <210> 165 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 165 Ser His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile 1 5 10 <210> 166 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 166 His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg 1 5 10 <210> 167 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 167 Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala 1 5 10 <210> 168 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 168 Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His 1 5 10 <210> 169 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 169 Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr 1 5 10 <210> 170 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 170 Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro 1 5 10 <210> 171 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 171 Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro Tyr 1 5 10 <210> 172 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 172 Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro Tyr Ile 1 5 10 <210> 173 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 173 Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro Tyr Ile Asn 1 5 10 <210> 174 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 174 Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro Tyr Ile Asn Ile 1 5 10 <210> 175 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 175 Phe Ile Arg Ala His Thr Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr 1 5 10 <210> 176 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 176 Ile Arg Ala His Thr Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn 1 5 10 <210> 177 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 177 Arg Ala His Thr Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys 1 5 10 <210> 178 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 178 Ala His Thr Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu 1 5 10 <210> 179 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 179 His Thr Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro 1 5 10 <210> 180 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 180 Thr Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala 1 5 10 <210> 181 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 181 Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn 1 5 10 <210> 182 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 182 Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro 1 5 10 <210> 183 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 183 Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser 1 5 10 <210> 184 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 184 Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu 1 5 10 <210> 185 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 185 Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys 1 5 10 <210> 186 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 186 Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn 1 5 10 <210> 187 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 187 Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser 1 5 10 <210> 188 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 188 Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro 1 5 10 <210> 189 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 189 Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser 1 5 10 <210> 190 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 190 Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr 1 5 10 <210> 191 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 191 Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln 1 5 10 <210> 192 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 192 Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr 1 5 10 <210> 193 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 193 Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys 1 5 10 <210> 194 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 194 Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr 1 5 10 <210> 195 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 195 Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser 1 5 10 <210> 196 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 196 Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser 1 5 <210> 197 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 197 Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr 1 5 10 <210> 198 <211> 43 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 198 Lys Ile Ser His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala 1 5 10 15 His Thr Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser 20 25 30 Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr 35 40 <210> 199 <211> 43 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 199 Thr Leu Ser His Phe Leu Lys Met Arg Arg Leu Glu Leu Ile Gln Thr 1 5 10 15 Ser Lys Pro Tyr Val Asp Ile Tyr Asp Cys Glu Pro Ser Asn Ser Ser 20 25 30 Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Asn 35 40 <210> 200 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 200 Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro 1 5 10 <210> 201 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 201 Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 202 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 202 Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser 1 5

Claims (38)

1. CD20에 결합하고, GYSFTSYWIG(서열번호 201)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄(heavy chain) 상보성 결정부위 1(complementarity determining region 1, CDR1)을 포함하는 표적 결합제(targeted binding agent).
2. CD20에 결합하고, KISNRFS(서열번호 202)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 (light chain) 상보성 결정부위 2(complementarity determining region 2, CDR2)를 포함하는 표적 결합제.
3. CD20에 결합하고, 표준 CellTiterGlo 생존율 분석에서 라모스 세포(Ramos cell)의 세포자살을 유도하기 위하여 0.5㎍/ml미만의 EC₅₀을 갖는 표적 결합제.
4. 제 3항에 있어서,

   표준 CellTigerGlo 생존율 분석에서 라모스 세포의 세포자살을 유도하기 위하여 0.2㎍/ml미만의 EC₅₀을 갖는 것을 특징으로 하는

   표적 결합제.
5. 제 3항에 있어서,

   표준 CellTigerGlo 생존율 분석에서 라모스 세포의 세포자살을 유도하기 위하여 0.02㎍/ml미만의 EC₅₀을 갖는 것을 특징으로 하는

   표적 결합제.
6. CD20에 결합하고, 표준 알라마 블루(Alamar Blue) 생존율 분석에서 라모스 세포의 세포자살을 유도하기 위하여 0.2㎍/ml미만의 EC₅₀을 갖는 표적 결합제.
7. 제 6항에 있어서,

   표준 알라마 블루 생존율 분석에서 라모스 세포의 세포자살을 유도하기 위하여 0.09㎍/ml미만의 EC₅₀을 갖는 것을 특징으로 하는

   표적 결합제.
8. 제 6항에 있어서,

   표준 알라마 블루 생존율 분석에서 라모스 세포의 세포자살을 유도하기 위하여 0.04㎍/ml미만의 EC₅₀을 갖는 것을 특징으로 하는

   표적 결합제.
9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,

   CD20을 발현하는 세포에서 세포자살을 유도하거나, 항체 의존성 세포독성(antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC)을 유도하거나, 또는 보체 의존성 세포독성(complement dependent cytotoxicity, CDC)를 유도하는 것을 특징으로 하는

   표적 결합제.
10. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,

    12nM 이하의 Kd값으로 CD20에 결합하는 것을 특징으로 하는

    표적 결합제.
11. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,

    10nM 이하의 Kd값으로 CD20에 결합하는 것을 특징으로 하는

    표적 결합제.
12. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,

    9nM 이하의 Kd값으로 CD20에 결합하는 것을 특징으로 하는

    표적 결합제.
13. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,

    5nM 이하의 Kd값으로 CD20에 결합하는 것을 특징으로 하는

    표적 결합제.
14. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,

    4nM 이하의 Kd값으로 CD20에 결합하는 것을 특징으로 하는

    표적 결합제.
15. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,

    단클론 항체 1.1.2(ATCC 등록번호: PTA-7329)인 것을 특징으로 하는

    표적 결합제.
16. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,

    단클론 항체 1.5.3(ATCC 등록번호: PTA-7330)인 것을 특징으로 하는

    표적 결합제.
17. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,

    단클론 항체 2.1.2(ATCC 등록번호: PTA-7328)인 것을 특징으로 하는

    표적 결합제.
18. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,

    서열번호 2의 서열을 가지는 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는

    표적 결합제.
19. 제 18항에 있어서,

    서열번호 4의 서열을 가지는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는

    표적 결합제.
20. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,

    서열번호 30의 서열을 가지는 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는

    표적 결합제.
21. 제 20항에 있어서,

    서열번호 32의 서열을 가지는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는

    표적 결합제.
22. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,

    서열번호 46의 서열을 가지는 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는

    표적 결합제.
23. 제 22항에 있어서,

    서열번호 48의 서열을 가지는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는

    표적 결합제.
24. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,

    약학적으로 허용가능한 담체와 병존하는 것을 특징으로 하는

    표적 결합제.
25. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 표적 결합제를 암호화하는 핵산분자.
26. 제 25항의 핵산분자를 포함하는 벡터.
27. 제 26항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
28. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 표적 결합제의 치료적 유효량을 그를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동물의 B 세포 림프종(lymphoma)을 치료하는 방법.
29. 제 28항에 있어서,

    상기 B 세포 림프종이 비-호킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma, NHL)인 것을 특징으로 하는

    방법.
30. 제 28항에 있어서,

    상기 동물이 사람인 것을 특징으로 하는

    방법.
31. 제 28항에 있어서,

    상기 표적 결합제가 mAb 1.1.2(ATCC 등록번호: PTA-7329), mAb 1.5.3(ATCC 등록번호: PTA-7330) 또는 mAb 2.1.2(ATCC 등록번호: PTA-7328)인 것을 특징으로 하는

    방법.
32. 제 28항에 있어서,

    항체, 화학치료 약물 및 방사성 약물를 포함하는 군으로부터 선택되는 2차 분자을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는

    방법.
33. 제 28항에 있어서,

    상기 투여는 2차 분자이 일반 외과수술, 골수 간세포 이식, 또는 말초 간세포 이식과 동시 또는 이후에 수행되는 것을 특징으로 하는

    방법.
34. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 개시된 표적 결합제의 B 세포 림프종 치료약물의 제조를 위한 용도.
35. 제 34항에 있어서,

    상기 B 세포 림프종이 비-호킨 림프종인 것을 특징으로 하는

    표적 결합제의 용도.
36. 제 34항에 있어서,

    상기 표적 결합제가 mAb 1.1.2(ATCC 등록번호: PTA-7329), mAb 1.5.3(ATCC 등록번호: PTA-7330) 또는 mAb 2.1.2(ATCC 등록번호: PTA-7328)인 것을 특징으로 하는

    표적 결합제의 용도.
37. 제 34항에 있어서,

    상기 약물은 항체, 화학치료 약물, 또는 방사성 약물를 포함하는 군으로부터 선택되는 2차 항 종양성 물질과 조합하여 사용하는 것을 특징으로 하는

    표적 결합제의 용도.
38. 제 34항에 있어서,

    상기 약물은 일반 외과수술, 골수 간세포 이식, 또는 말초 간세포 이식과 동시 또는 이후에 투여되는 것을 특징으로 하는

    표적 결합제의 용도.

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