CN105143269B - 抗cd20的全人源单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗CD20的全人源单克隆抗体,其通过人杂交瘤技术制备。所述抗体具有优异的亲和力和特异性,对淋巴瘤细胞具有显著的细胞毒功效,可用于制备治疗或诊断非霍奇金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、风湿性和类风湿性疾病、系统性红斑狼疮、免疫性血小板减少性紫癜和多发性硬化症等疾的药物组合物。
Description
技术领域
本发明涉及抗体药物的技术领域。具体地说,涉及一组全人源单克隆抗体新分子,其可用于淋巴瘤的诊断和治疗。
背景技术
1.CD20
CD20是一种分子量为33~37kDa的非糖基化磷蛋白,有4个跨膜区,氨基端和羧基端都位于细胞质膜内侧,在第三跨膜区和第四跨膜区之间,有一个由43个氨基酸残基组成的环区,构成其主要的抗原表位。作为B淋巴细胞表面分化抗原,它起始表达于pre-B细胞阶段,到B细胞终端分化成浆细胞时结束,一直被认为是B系细胞表面特有的标识。它主要参与调节B淋巴细胞的增殖与分化,在免疫系统起重要作用。80%~85%的非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)为B细胞来源,并且这些细胞的约95%均有表面CD20表达[1,2]。CD20的表达因淋巴瘤细胞的不同而有所差异,滤泡性淋巴瘤细胞表面表达较高,小细胞淋巴瘤白血病细胞表面表达较低,在干细胞和浆细胞中不表达,慢性B淋巴白血病细胞中的表达远低于正常的B细胞和其他B淋巴瘤细胞,CD20的表达高低在一定程度上决定了抗体和补体杀伤瘤细胞的程度[3]。单核细胞、静息以及激活的T细胞、裸细胞以及非淋巴细胞都不表达CD20分子。CD20与抗CD20抗体结合后内化现象不明显,细胞表面CD20分子数量并不因为与抗体结合而大量减少,CD20也不会发生明显细胞表面脱落的现象,因此,CD20是免疫治疗B细胞淋巴瘤的理想作用位点,特别是对治疗惰性、复发难治性B细胞淋巴瘤有较肯定的疗效。
2.治疗性抗CD20抗体
抗CD20治疗可清除恶性B细胞和部分正常B细胞,但由于干细胞和B细胞前体不表达CD20,因而不会造成长期B细胞损耗。其临床应用主要适应证为:1.单纯应用抗CD20单克隆抗体治疗滤泡性B细胞型非霍奇金淋巴瘤;2.抗CD20单克隆抗体与化疗联合应用治疗弥漫大B细胞型淋巴瘤及慢性B淋巴细胞白血病(B-CLL)。
2.1 Rituximab(美罗华)
IDEC-C2B8,又名Rituximab,商品名为美罗华,1997年由FDA批准上市,是第一个被美国FDA批准用于治疗肿瘤的单克隆抗体[4]。它是一个人鼠嵌合抗体,包含鼠源抗CD20单克隆抗体2B8(Ibritumomab)的可变区和人源IgG1重链及κ链的恒定区,用于B细胞淋巴瘤的治疗。Rituximab在体内通过抑制细胞增殖或触发多种细胞破坏机制,包括抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)和补体依赖性细胞毒作用(CDC)以及细胞凋亡发挥明显的抗肿瘤功效[5]。近年的临床研究证实,该药治疗谱较广,对B淋巴细胞性疾病均可取得较好的疗效。
2.2 ZEVALIN
2002年2月,FDA批准了第一个放射性免疫治疗药物Zevalin。该药由IDEC制药公司生产,通用名Ibritumomab Tiuxetan。FDA批准此药用于治疗复发性或难治性低恶性度/滤泡性或转化的B细胞NHL,其中包括Rituximab难治性的滤泡性NHL。该产品由小鼠IgG1-κ单克隆抗体2B8(Ibritumomab)连接同位素90Y用于肿瘤治疗。其单抗部分对CD20具有高的特异亲和性[6]。
2.3 BEXXAR
2003年6月27日,FDA批准Bexxar(Tositumomab和131I Tositumomab)用于治疗癌细胞已经或未发生转移、对Rituximab有耐药性、化疗后又复发的CD20阳性滤泡性NHL。它由鼠源单克隆抗体-抗Bl单克隆抗体(Tositumomab,IgG2a-λ)与放射性同位素131I共价偶联而成。
2.4 ARZERA
2009年10月26日,FDA批准ARZERA(Ofatumumab)用于治疗慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。它由KM人源转基因鼠免疫通过杂交瘤技术产生的人单克隆抗体。和Rituximab相似其在体内通过抑制细胞增殖或触发多种细胞破坏机制,包括抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)和补体依赖性细胞毒作用(CDC)以及细胞凋亡发挥明显的抗肿瘤功效。但其在治疗非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的三期临床试验失败。目前其主要用于对一线化疗药物耐受的慢性淋巴细胞性白血病。
3.Rituximab在临床的应用
3.1单独应用治疗非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)
Rituximab可单独应用,推荐的使用剂量是每周375毫克/平方米,静脉内注射,共4次,治疗复发或耐药性低度恶性CD20阳性B细胞NHL;II期临床试验表明,总体有效率为48%,其中6%为完全有效,42%为部分有效,缓解期通常为1年。对于初治的低度恶性NHL,单药有效率为50%~70%左右,维持治疗能够进一步提高疗效。副作用较温和,可随抗体输入量的减少而减轻,治疗中没有或少有感染并发症发生。因而Rituximab作为一线药物应用治疗NHL已有着无法替代的作用。
2004年,欧盟许可Rituximab联合标准化疗以治疗侵袭性NHL。一些临床试验用来评估Rituximab单独或联合治疗惰性、侵袭性NHL和其他一些B细胞淋巴组织增生紊乱。Rituximab对类风湿性关节炎、免疫性血小板减少性紫癜、免疫性溶血性贫血、系统性红斑狼疮和多发性硬化等自身免疫紊乱性疾病的作用也在研究中[7]。
3.2联合化疗治疗B细胞淋巴瘤
徐志巧等[8]应用同期对照的前瞻性研究方法,将22例B细胞性NHL患者分为研究组(Rituximab组)和对照组,研究组11例用CHOP方案(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松)联合Rituximab治疗;对照组11例单用CHOP方案。结果Rituximab组完全缓解率(CR)达72.7%(8/11),总有效率90.9%(10/11);对照组CR为36.4%(4/11),总有效率为54.6%(6/11),两组疗效差异有统计学意义。初步研究结果提示,Rituximab联合CHOP方案治疗CD20阳性的B细胞性NHL的疗效显著,不良反应与单纯化疗相似,可作为该病目前的首选方案。
3.3在风湿性疾病治疗中的应用
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以滑膜炎为主要病理改变的全身性自身免疫病,以慢性破坏性关节病变为特征。B细胞是类风湿因子(RF)、抗瓜氨酸抗体(抗CCP)等自身抗体的主要来源细胞,同时研究表明RA滑膜中T细胞活化主要依赖于B细胞抗原呈递作用[9],是RA等自身免疫病发病机制核心环节之一。
Edwards等[10]报道了161例大样本的随机双盲对照研究,试验分为口服甲氨蝶呤组(≥10mg/周)、Rituximab组(1g dl,d15)、Rituximab联用环磷酰胺组(750mg d3,d17)、Rituximab联用甲氨蝶呤组,结果显示,Rituximab治疗组24周后达到ACR20 65%~76%,单用甲氨蝶呤治疗组为38%,两者比较有显著性差异(P<0.025);持续观察48周,Rituximab治疗组疗效(ACR20 33%~65%)与单用甲胺蝶呤组(ACR20 20%)相比仍有显著性差异(P≤0.01)。在治疗第24周达ACR50缓解的患者,单用Rituximab组(33%)、联用甲氨蝶呤组(43%)、联用环磷酰胺组(41%)均高于甲氨蝶呤组(13%)。此外,Rituximab治疗组患者的RF水平迅速下降。且24周内维持较低水平。而单用甲氨喋呤组RF水平仅一过性轻度下降。该试验Rituximab疗效与B细胞清除情况相关,证明了Rituximab在RA中的治疗作用以及B细胞在RA发病中的重要作用。针对Rituximab对RA的治疗作用的一系列研究也表明Rituximab治疗RA疗效稳定,是生物治疗的新途径。
3.4对系统性红斑狼疮的治疗作用
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是多系统受累、以多种自身抗体表达的自身免疫性疾病。B细胞在SLE发病机制中发挥了关键性作用:分泌大量致病性自身抗体和白介素10(IL-10)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-γ)等多种细胞因子;高选择性的抗原呈递作用,将抗原呈递给T细胞,同时刺激调节T细胞、树突状细胞活化[11]。
Looney等[12]报道了17例Rituximab治疗SLE的I/II期扩大临床试验,均为活动性狼疮。大部分患者同时接受免疫抑制剂治疗。分为三组接受低、中、高不同剂量的Rituximab,分别为100mg/m2、275mg/m2、375mg/m2每周1次、共4周。结果表明疾病控制与B细胞清除情况有关。11例B细胞清除(CD19阳性细胞<5/ul)患者皮疹、发热、关节痛等临床症状可缓解。系统性红斑狼疮活动评分(SLAM)多在用药2~3个月时缓解,持续12个月。
初步临床研究证明Rituximab治疗SLE是可行的,其疗效和安全性期待大样本临床研究。
3.5 Rituximab治疗小儿免疫性血小板减少性紫癜
免疫性血小板减少性紫癜(immunologic thrombocytopenic purpura,ITP)是一种自身免疫性出血性疾病。目前研究证明,ITP患者T淋巴细胞调节紊乱,导致B淋巴细胞功能紊乱,产生针对自身血小板的IgG抗体,进而使血小板破坏增多。文献报道Rituximab可快速持久地清除循环中的B淋巴细胞,减少自身抗体的产生,从而减少血小板的破坏。Taube等[13]使用Rituximab治疗了22例慢性ITP患儿,在Rituximab用后的1~2周外周血CD20阳性B淋巴细胞呈明显下降,2~3个月后逐渐恢复正常。结果7例完全缓解,6例部分缓解,5例复发,反应率为59%(13/22),复发率为38%(5/13),持续缓解的时间是2~16个月。石淑文等[14]用Rituximab治疗了3例小儿慢性/难治性ITP,3例均为联合用药,1例联合阿赛松治疗部分缓解,治疗后患儿血小板持续维持相对较高的水平达18个月之久,且不再需要IVIG冲击治疗,阿赛松逐渐减量至停用,余两例分别联合了大剂量IVIG、琥珀酸氢化考的松和长春新碱,治疗后血小板有短暂的回升(分别是21天和11天),但很快又降至同入院前的低水平且持续不见回升,认为短暂的血小板回升可能是大剂量IVIG、琥珀酸氢化考的松或长春新碱的作用,为不缓解病例。上述结果表明Rituximab对ITP有较好的治疗作用,能够快速持久地清除循环中的B淋巴细胞,减少自身抗体的产生,从而减少血小板的破坏,可作为临床用药。但部分病例这种清除是暂时的,停用Rituximab后循环中的B淋巴细胞又会恢复,这可能和部分病人再次复发有关。关于Rituximab治疗慢性/难治性ITP的总反应率成人为23~75%[15],儿童为66%,基本相同。
4.人源抗体的制备
20世纪70年代中期杂交瘤技术问世,由此制备出的单克隆抗体(MAb)是抗单一抗原决定簇的抗体,具有高度的特异性和均一性,且能大量制备,这成为抗体研究领域的一次重大革命。1986年,应用此技术制备的第一个单克隆抗体药物OKT3被美国FDA批准上市,被用于治疗器官移植后的免疫排斥。但由于抗体是鼠源的,在病人中引发了严重的免疫反应,这就大大阻碍了抗体药物的发展和利用。
随着抗体被用来开发成药物,它的一些特征也将被严格考量,像免疫原性、亲和力、稳定性、效应功能、半衰期、组织渗透性及其分布等[21]。在鼠源MAb生产变得成熟时,研究者便预想通过常规的杂交瘤技术生产人源MAb,但由于人杂交瘤细胞系不能稳定的生产高产量的抗体,并且对于很多抗原来说,人的体内免疫是不可行的。这样,基因工程抗体由然而生,1994年,第一个嵌合抗体ReoPro获准上市,临床应用表明其免疫原性远优于鼠源抗体,这就掀起了继杂交瘤单克隆抗体之后抗体工程研究领域的又一次革命。特别是90年代中期以来,为进一步降低免疫反应的发生,多种人源化改造技术被成功开发并得以应用,各种各样的基因工程抗体及抗体库不断出现[23][24],使得大规模生产医用人源化抗体成为可能。从1997年开始,大批的单抗药物被FDA批准上市。
单抗人源化改造技术的应用打破了抗体药物产业化的瓶颈。迄今,按照人源化程度的高低大体可分为三种技术:嵌合、人源化和全人源,其基因中人源序列占比分别为75%、95%和100%[22]。其中嵌合抗体是将鼠杂交瘤单克隆抗体基因的可变区和人的恒定区连接在一起,然后在哺乳动物细胞中进行表达产生;而人源化抗体则是除了将抗体的恒定区换成人源的之外,更进一步的将可变区的FR区转换成人源的[20],从而降低免疫原性;而全人源抗体制备则是有四种途径,一种从采集的病人血样中构建Fab或者ScFv文库,并通过噬菌体展示筛选抗体库,来产生人源MAb[18]。2002年,第一个全人源MAb,Humira,就是通过噬菌体展示开发出来的。第二种生产人源抗体的策略是用含有人免疫球蛋白基因位点的转基因小鼠,进行免疫,可以产生人抗体的免疫应答,这样通过传统的杂交瘤技术可以来生产人源MAb[17],从转基因小鼠衍生而来的人源MAb正在临床试验中。第三种途径是通过分离培养人外周血淋巴细胞或扁桃体淋巴细胞,然后用抗原进行免疫刺激,产生免疫应答,然后再和人类骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞,经筛选得到人源单克隆抗体,并立即进行分子克隆抗体基因,使用其他可长期稳定表达的哺乳动物细胞来表达目的抗体,这种抗体完全是在人细胞环境中生成的。第四类途径是通过分离和低密度(约500B细胞每96孔)培养人外周血淋巴细胞或扁桃体淋巴细胞,对培养上清进行抗原特异性筛选,对阳性孔B细胞进行分子克隆获得人抗体基因,再使用其他可长期稳定表达的哺乳动物细胞来表达目的抗体。
本发明的全人源单克隆抗体就是基于上述第三种途径并加以随机突变筛选得来的。利用人-人杂交瘤产生的单克隆抗体被认为是在氨基酸序列和糖基化谱上都要优于嵌合抗体和人源化抗体的全人源抗体。但是由于难以找到使人-人杂交瘤稳定传代的融合伴侣细胞,且由于融合效率低、细胞培养困难及生产能力低等问题,制备稳定传代且能持续产生单克隆抗体的人-人杂交瘤细胞系一直存在较大难度,且成功的实例甚少。本发明对表达人抗体的人-人杂交瘤快速进行包括特异性和功能学在内的筛选,并将筛选出的杂交瘤细胞进行分子克隆化以保存抗体基因,从而克服了上述困难。
随着人源化和全人源抗体技术的成熟,如何提高抗体的亲和力成了目前所有基因工程抗体药物需要解决的关键问题。这是因为增加一个抗体的亲和力将降低抗体药物的剂量并起到更好的生物活性,还可能使其治疗更多的疾病及降低剂量相关的毒性[18][22]。此外,费用也将大大降低。多项独立的研究表明,抗体亲和力和生物学活性在达到极限值之前是成线性关系的。围绕这一问题人们已经从不同的方向展开了研究,提高抗体亲和力的途径基本有两条途径,其中一个途径是通过随机突变CDR或是整个的VR,然后从这个大量的突变体库里筛选更高亲和力的抗体[19];另一个途径是通过集中突变或是建模模拟体内亲和力成熟的热点区域,建立一个小的突变体库[18][19]。综合起来说,当进行体外抗体亲和力成熟时,应考虑4个主要方面:①在抗体基因的何处导人突变;②如何导入突变;③如何从较低亲和力的抗体中选择稀有的更高亲和力抗体。④如何鉴别更高亲和力抗体。
目前已批准上市的三种针对CD20的抗体均为Biogen-Idec公司创制。其中Zevalin和Bexxar为鼠源单抗,并且主要是通过抗体介导放射性同位素到肿瘤部分,发挥放射性细胞毒直接杀伤肿瘤细胞。由于放射毒性和人抗鼠抗体的产生等因素,导致临床疗效不佳,适应症狭窄。Rituxan(即Rituximab)系人鼠嵌合型抗CD20单克隆抗体,其可通过CDC、ADCC、诱导CD20细胞发生凋亡或直接抑制恶性B细胞的增殖来发挥其治疗效果且都获得了很好的疗效。但是由于其25%鼠源部分,更容易产生鼠源性免疫原性,即人抗鼠抗体反应。这将会引起较多的输液反应,同时也无法长期用药。因为在病人血清中循环的人抗鼠抗体将会中和Rituxan而使其疗效下降甚至失效。此外Rituxan本身杀瘤疗效还存在着提高的空间,例如其目前临床有效率(CR+PR)约为50%,不能连续用药,而且缓解期只有一年,因此有必要发明新的抗体分子来提升此类药物的疗效[29]。本发明正是针对Rituximab不足之处而进行的新分子创制:(1)变鼠人嵌合抗体为全人源抗体(2)通过新药物的提升,使其针对其他瘤细胞的CDC,ADCC和凋亡能力增强以提高杀瘤疗效。
发明内容
本发明提供抗CD20的一组新抗体,这些抗体为全人源抗体,并且作为一种新药物,这些抗体的多项CD20特异性的细胞毒功效比美国同类药物美罗华强,具有比美罗华相同或更好的药效。可用于治疗和诊断炎性疾病、自身免疫性疾病、细胞增殖病症、心血管病、血液病,尤其是非霍奇金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、风湿性和类风湿性疾病、系统性红斑狼疮、免疫性血小板减少性紫癜和/或多发性硬化症等疾病。
本发明的抗体的重链恒定区为人IgG1重链的恒定区,轻链恒定区为人κ链的恒定区,重链可变区的氨基酸序列为Seq ID NO:1、Seq ID NO:2、Seq ID NO:3、Seq ID NO:4和Seq ID NO:9中的一个,轻链可变区的氨基酸序列为Seq ID NO:5、Seq ID NO:6、Seq IDNO:7、Seq ID NO:8和Seq ID NO:10中的一个。
其中优选11种抗体,其重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别为:
其中,优选的组合是1)和2),更优选的是1)。
由于抗体的结合特性主要由互补决定区(CDR)来决定,因此,本发明的抗体还包括重链可变区包含Seq ID NO:1-4和9的CDR序列、轻链可变区包含Seq ID NO:5-8和10的CDR序列的那些抗体。上述CDR序列详见Seq ID NO:11-26。
而且,本发明的抗体并不限于人IgG和人κ链,本发明抗体的可变区以外的区域可以是其他类型,例如人IgM等。
本领域技术人员将知晓的是,上述抗体中的保守性氨基酸替换并不会实质性地影响抗体的亲和力和结构,尤其是所述保守性替换发生在恒定区时。本领域技术人员还知晓,根据上述抗体的氨基酸序列可以设计出编码其的核苷酸序列,并且针对不同的表达宿主对该核苷酸序列进行优化。为了治疗、检测、实验或其他目的,本发明的抗体可以与同位素、免疫毒素和/或化学药物共价连接,还可以与固体介质、半固体介质偶联,还可以使用本发明的抗体的功能性片段,这在本领域中是已知的。
本发明提供了一种方法,使用该方法制造全人源抗体并且作为一种新药物。目前尚未有抗体药物系使用本发明的技术方法成功创制的报道。该方法所克服的最重要的技术难点是(1)人淋巴细胞体外有效免疫技术;(2)人杂交瘤基因不稳定,必须快速进行包括特异性和功能学在内的筛选,并将筛选出的杂交瘤细胞进行分子克隆化以保存抗体基因;(3)对已筛选出具有一定药理学功效的人源抗体通过分子生物学抗体工程技术进行进一步优化改造。
所述抗体的制造及相关检测方法如下:通过提取不同人的外周血淋巴细胞或者是人扁桃体淋巴细胞,体外混合后,用抗原和具有佐剂功用的分子共培养,使其产生针对抗原的抗体,通过与骨髓瘤细胞融合,产生临时稳定的人杂交瘤,培养上清中含有其分泌的人源抗体。通过细胞ELISA(CD20阳性细胞和CD20阴性细胞双筛选)筛选出CD20阳性杂交瘤细胞生长孔,再以相对抗原亲和力,细胞毒功能测试(ADCC、CDC和凋亡实验)综合评估筛选最好的10个细胞生长孔,并立即进行亚克隆,筛选出保持抗原特异性的单克隆细胞株。立即进行测序和分子克隆抗体基因到适当的表达载体中,并将质粒DNA扩增纯化于-80℃永久保存。根据相对抗原亲和力,细胞毒功能测试(ADCC、CDC和凋亡实验)综合评估筛选最好的3个单克隆细胞株的抗体基因,以此作为模板对其进行体外抗体亲和力成熟工程。我们以对CDR1、CDR2、CDR3区进行随机突变和定点突变相结合的方式建立抗体亲和力成熟突变文库。以抗原特异性和相对亲和力排序对文库进行筛选。将每轮最好的5~10抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)进行全排列组合形成全长抗体。使用瞬转、培养和微量亲和纯化(Protein A)制备少量纯化抗体,以细胞毒功能测试(ADCC、CDC和凋亡实验)进行筛选鉴定。在经此筛选出来的一组有良好细胞毒功效的抗体分子,再对这些抗体可变区特别是CDR区序列检索,确定此组具备CD20特异性的细胞毒功效的抗体为首次发现的新分子。在此组新分子里有一个或一个以上的新抗体分子其(1)多项CD20特异性的细胞毒功效比美罗华强;(2)皮下移植瘤和生存期的试验结果显示其具有比美国同类药物美罗华相同和更好的药效。
在确定本发明的抗体的氨基酸序列后,可以通过人工合成编码该抗体的多核苷酸并选取适合的宿主进行有效地表达来制备该抗体,这在本领域中是公知的。
除非特别说明,在本文中“Rituxan”、“Rituximab”和“美罗华”可以互换使用。
附图说明
图1~图3为Raji细胞CDC测试结果;其中图1是对不同人杂交瘤上清液的CDC功能学筛选;图2是对亲和力成熟后CHO细胞表达纯化人抗体H2L3、H2L6、H2L10、H8L3和H8L10的CDC功能学筛选;图3是对亲和力成熟后CHO细胞表达纯化人抗体H8L15、H11L6、H11L10、H19L3和H19L15的CDC功能学筛选;
图4~图6为Raji细胞ADCC测试结果;其中图4是对不同的人杂交瘤上清液的ADCC功能学筛选;图5是对亲和力成熟后CHO细胞表达纯化人抗体H2L3、H2L6、H2L10、H8L3和H8L10的ADCC功能学筛选;图6是对亲和力成熟后CHO细胞表达纯化人抗体H8L15、H11L6、H11L10、H19L3和H19L15的ADCC功能学筛选;
图7.源自细胞株1.105.3的重链经突变得到的H1~H20根据亲和力的排序;图8.源自细胞株1.105.3的轻链经突变得到的L1~L20根据亲和力的排序;对应的结果数据和KD值参见表6;
图9.经筛选的重链突变基因和轻链突变基因组合的根据亲和力的排序;对应的结果数据和KD值参见表7;
图10显示了抗体H2L10治疗人B细胞淋巴瘤的小鼠Raji细胞侵润瘤模型的药效学试验结果,是对小鼠体重和健康状态的观察。静脉注射107Raji淋巴瘤细胞形成小鼠淋巴瘤疾病模型。分五组分别为1.生理盐水组、2.美罗华组、3.H2L10(即本发明的代表性抗体)低剂量组、4.H2L10中剂量组和5.H2L10高剂量组。癌细胞静脉注射后7天开始给药。腹腔注射每周一次。图中为各组动物体重变化。生理盐水组动物自第16天后开始明显下降并呈肿瘤恶液质。美罗华组在第37天开始出现体重明显下降,总体呈亚健康状态直至第50天试验结束。而H2L10高中低三组动物均呈健康状态,体重正常增长。此结果清楚表明H2L10和美罗华均对淋巴瘤动物有肯定的疗效,H2L10各组包括低剂量组疗效均优于美罗华。
图11显示了抗体H2L10治疗人B细胞淋巴瘤的小鼠Raji细胞侵润瘤模型的生存期试验结果。静脉注射107Raji淋巴瘤细胞形成小鼠侵润型淋巴瘤疾病模型。分五组分别为1.生理盐水组、2.美罗华组、3.H2L10低剂量组、4.H2L10中剂量组和5.H2L10高剂量组。癌细胞静脉注射后7天开始给药。腹腔注射每周一次。生理盐水组动物自第23天开始明出现死亡,到第34天全部死亡。美罗华组和H2L10高中低三组动物均无死亡直至第50天试验结束。但美罗华组在第37天开始出现体重明显下降,并总体呈亚健康情况直至50天试验结束。此结果清楚表明H2L10和美罗华均可肯定地延长淋巴瘤动物的生存时间。
图12显示了抗体H2L10治疗人B细胞淋巴瘤小鼠raji细胞原位移植瘤抑瘤实验结果。小鼠接种后观察肿瘤生长情况,待肿瘤体积为40-100mm3左右时,按瘤体积大小进行筛选,瘤体积过大及未成瘤者不予入选。筛选后随机分为3组:1.生理盐水组、2.美罗华组、3.H2L10。给药剂量5mg/kg,腹腔注射每周一次。试验结果清楚表明美罗华和H2L10均可以明显抑制Raji细胞皮下移植瘤的生长,H2L10药效和美罗华有同等药效。
图13A和13B为抗体A137、H2L10和美罗华对Raji细胞的ADCC测试结果。
图14为抗体A137和美罗华对Raji细胞的CDC测试结果。
图15显示了A137和美罗华的亲和力测试结果,图中的表格显示出了其相关参数Bmax和KD及置信区间。
图16显示了A137和美罗华的治疗人B细胞淋巴瘤小鼠raji细胞原位移植瘤的结果。每只小鼠静脉注射107个Raji淋巴瘤细胞形成小鼠侵润型淋巴瘤疾病模型,5天后腹膜内注射给药。分3组小鼠进行实验(每组8只):A.生理盐水对照组;B.美罗华组(剂量为1mg/kg体重);C.A137组(剂量为1mg/kg体重)。
图17显示了用A137和美罗华的治疗人B细胞淋巴瘤小鼠raji细胞原位移植瘤时的小鼠体重变化曲线。每只小鼠静脉注射107个Raji淋巴瘤细胞形成小鼠侵润型淋巴瘤疾病模型,5天后腹膜内注射给药。分4组小鼠进行实验(每组8只):A.生理盐水对照组;B.美罗华高剂量组(3mg/kg体重);C.美罗华低剂量组(1mg/kg体重);D.A137组(1mg/kg体重)。
具体实施方式
下文将通过具体的实施例来阐明本发明,但应理解的是,以下实施例并不限制本发明的范围。
实施例
实施例1:杂交瘤和载体的制备
1.抗原和淋巴细胞的准备及免疫
1.1抗原准备:
1.1.1 CD20蛋白
购买人CD20(Novusbio)抗原,用PBS稀释后,用0.22μm针式无菌滤器过滤。
1.1.2表达CD20膜蛋白的293F细胞的制备
购买CD20的cDNA(Origene,SC101205),并设计、合成PCR扩增引物:
CD20正向引物:5’-TCAGGAGTTTTGAGAGCAAAATG-3’
CD20反向引物:5’-AACAGAAGAAATCACTTAAGGAG-3’
然后以CD20的cDNA为模板进行扩增、纯化,并克隆到pCR3.1载体(Invitrogen,K300001)中,测序验证后,大量制备该质粒,然后按照说明书转染FreeStyleTM 293-F细胞(Invitrogen,R790-07),48小时后,加入1mg/ml的G418(Invitrogen,10131035)培养2周,稳定的G418抗性克隆被筛选出来,并冻存。
1.1.3抽提的CD20膜蛋白
使用细胞膜蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(购自碧云天生物研究所)由CD20-293F细胞依循试剂盒说明书抽提CD20膜蛋白。用0.22微米滤器过滤后分装于1.5毫升细胞冻存管-80℃保存。
1.2人淋巴细胞准备:
无菌摘取慢性扁桃体炎新鲜组织样本(与徐州医学院附院耳鼻喉科合作,扁桃体取自扁桃体摘除手术的病人,10例病人,年龄5~10岁),用淋巴细胞分离液(GE)分离出其中的淋巴细胞,取30×106个;无菌抽取人新鲜外周血细胞,用淋巴细胞分离液(GE)分离出其中的淋巴细胞,取30×106个。
1.3体外淋巴细胞免疫:
淋巴细胞培养基配方为:1升DMEM中含有20%胎牛血清(FBS)、1%的200毫摩尔左旋谷氨酸(Sigma,cat.#G 2150)、1%的100×的非必须氨基酸(Sigma,cat.#M 7145)、1%的100×青霉素链霉素混合液(Sigma,cat.#P 7539)、(10,000U/ml penicillin+10mg/mlstreptomycin)、10单位/每毫升白介素6(Boehringer Mannheim,cat.#1299972)、20单位/每毫升人重组白介素2(R&D system,cat.#202-IL-050)、20微克/每毫升美洲商陆有丝分裂原(PWM)(Sigma,cat.#L8777)、1纳克/毫升的无内毒素CpG(定制合成)和1支OPI细胞培养添加剂(Sigma,cat.#O 5003)。
将1.2中的两种来源的16位个体淋巴细胞混合后在含20%FBS的RPMI-1640培养基中进行混合培养,淋巴细胞终浓度为5×105个/ml,同时加入下述步骤2.1中获得的小鼠腹腔饲养细胞(终浓度为1×105个/ml)、非必需氨基酸(终浓度为1ug/ml)、CD20抗原(蛋白免疫:终浓度为1ug/ml,细胞膜免疫组:源于106个CD20-293细胞的细胞膜蛋白/ml),并放于二氧化碳培养箱中共培养6-12天(第5-6天换一次新鲜培养液)。
2.杂交瘤细胞的制备
2.1饲养细胞的准备:
在融合前一天,断颈处死BALB/c小鼠(从北京维通利华实验动物技术有限公司购买),浸泡于75%酒精中5分钟,在超净台内,无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤,露出腹膜,用注射器注入腹腔内10ml HAT培养基(20%FBS,HAT 1×,其余为DMEM),反复吹吸,吸出培养基放入50ml离心管内,台盼蓝细胞计数,调整细胞浓度为2×105个/ml,加入96孔板,100ul/孔,放入二氧化碳培养箱中过夜。此操作适用于所有需要用到小鼠腹腔饲养细胞的实验。
2.2骨髓瘤细胞准备:骨髓瘤细胞P3X63Ag8.653购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心,将其培养至对数生长期,1000rpm下离心5分钟,用不含FBS的DMEM悬浮,1000rpm下离心5分钟,轻弹底部,用不含FBS的DMEM培养基悬浮,台盼蓝计数,细胞活性为95%。
2.3细胞电融合及HAT筛选:
收集与CD20抗原共培养6天后的淋巴细胞,台盼蓝计数活细胞,1300rpm下离心5分钟,弃上清,轻弹底部,用少量不含FBS的DMEM培养基悬浮;与同样数量的骨髓瘤细胞充分混匀,补DMEM培养基至40ml,2000rpm下离心5分钟,弃上清;
加入2ml无菌pronase溶液(CalBiochem,53702),轻微悬浮细胞团后,作用2分钟,加入3-5ml FBS终止,再加入电融合溶液至40ml,2000rpm离心5分钟,弃上清;加入少量电融合溶液轻轻悬浮细胞团后,补加至40ml,2000rpm离心5分钟,弃上清;轻弹底部,加入电融合溶液,细胞计数,调节细胞至2×106个/ml,分成2ml/管;按照2ml体积的秒数进行设定,启动电融合装置(BTX);融合后,1000rpm离心5分钟,弃上清;加入少量HAT培养基悬浮细胞后,加入适量体积的HAT培养基,按照融合时候的淋巴细胞加入量,1×106个/板,加入之前铺好饲养细胞的96孔板中,放入二氧化碳培养箱中进行培养。
融合后7天,对HAT培养基进行1/2换液,融合后10天,HAT培养基全换液。
2.4细胞上清抗原特异性ELISA检测:
包被:融合后12天,用双套ELISA法检测特异性抗体,一套为表达CD20的293细胞膜包被,一套为未转染293细胞膜包被;4℃过夜包板,浓度为50万个细胞膜/50ul/孔,包被液为PH 8.3的1%BSA PBS。封闭:用PBST洗板3次后以10%脱脂牛奶粉PBS封闭,室温孵育1小时;然后用PBST洗板3次。加样:吸出50ul细胞上清至孔中,阴性对照为1∶1000人血清(健康成人捐献),阳性对照为0.1ug/ml美罗华注射液;室温孵育2小时后,用PBST洗板3次。二抗:然后加入次辣酸根过氧化酶标记的羊抗人IgG1(Caltag),50ul/孔,室温孵育1小时后,用PBST洗板3次。显色:TMB显色,50ul/ml TMB,10~15分钟后以2M盐酸终止显色反应;A450nm读数。
以CD20-293包被板阳性同时293包被板阴性孔为抗原特异性。
2.5扩大培养
第一次检测后,选择阳性孔进行扩大至4个96孔,过2天,对所扩孔进行检测,确定阳性孔,扩大至24孔。待24孔细胞长至孔底约1/3,则进行ELISA检测。此方法同样适用于后期抗体的检测。
2.6细胞上清人抗体定量检测
对步骤2.5产生的经再次ELISA鉴定后仍为阳性的细胞孔培养上清,使用BethylLaboratories的人Ig定量检测ELISA试剂盒(货号E88-104),具体步骤按试剂盒说明书进行。
2.7相对亲和力排序
样品准备:将要比较的抗体,即已知浓度的纯化抗体或由步骤2.6定量检测后已知所含抗体浓度的细胞培养上清,稀释到4-8个相同浓度(120nM,40nM,13.1nM,4.4nM)。然后按2.4中描述的步骤进行ELISA检测。由于所有样品事先调整到相同抗体浓度,OD值的差异将由抗体的亲和力引起。OD值越高相对亲和力就越高。使用Prism软件作图和计算出相对每一抗体的亲和力。综合实施例3~5和此检验结果,选出抗原亲和力和功能学效能最高的10个细胞生长孔,即1.1、1.4、1.6、1.36、1.72、1.89、1.105、1.134、1.146、1.176。
2.8有限稀释法亚克隆、细胞扩大培养
于亚克隆前1天或者是当天采集小鼠腹腔饲养细胞(用HT培养基),细胞浓度为1×105个/ml,加入96孔板,100ul/孔。对经步骤2.7检测后筛选的1.1、1.4、1.6、1.36、1.72、1.89、1.105、1.134、1.146、1.176阳性杂交瘤细胞株分别进行台盼蓝染色计数后,将细胞分别按以下浓度铺到板子中:密度为5个/孔,铺1块;1个/孔,铺1块;0.5个/孔,铺2块。放入二氧化碳培养箱中进行培养5-7天后,经倒置显微镜从孔底观察细胞,用记号笔圈下确认为单克隆的孔。只转移这些单克隆孔的细胞培养上清,50μl/孔,进行ELISA检测(见2.4方法)。在经ELISA确定抗原阳性的孔里,根据细胞状态和OD值,从被亚克隆的每杂交瘤细胞株(1.1、1.4、1.6、1.36、1.72、1.89、1.105、1.134、1.146、1.176)中选取最好的3-5个单克隆细胞孔的上清进行下步骤(2.9)鉴定。
2.9亚类的鉴定
包板羊抗人IgG(Fc),2ug/ml,4℃过夜,BSA封闭,加入待测细胞上清,37℃,2小时,加入酶标亚类二抗IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,κ,λ(Southern Biotechnology),显色,A450读数,判断所测细胞株的亚类为IgG1,κ。在加液前每步都用PBST洗涤3次。从被亚克隆的每杂交瘤细胞株中由步骤2.8筛选出的3-5个单克隆细胞孔里,选定一个确定为IgG1-κ的单克隆细胞株,其分别为:1.1.81、1.4.68、1.6.14、1.36.2、1.72.108、1.89.45、1.105.3、1.134.42、1.146.78、1.176.109。将此10个单克隆细胞株扩大至24孔(用含20%FBS的DMEM培养基),待细胞长好,检测后,扩大至方瓶。
2.10细胞冻存
冻存液配制:10%DMSO,60%FBS,30%DMEM,放于冰上预冷,细胞吹悬后,放入离心管中,台盼蓝计数,离心,弃上清,加入预冷冻存液,按2~5×106个/管,进行冻存。细胞放入程序降温盒(Nalgene)后置于-70℃冰箱过夜,第二天转入液氮中。
2.11测序、克隆单克隆人杂交瘤基因
杂交瘤进行亚克隆后,筛选出保持抗原特异性的单克隆细胞株1.1.81、1.4.68、1.6.14、1.36.2、1.72.108、1.89.45、1.105.3、1.134.42、1.146.78、1.176.109。立即进行测序和分子克隆,抗体基因进入适当的表达载体,并将质粒DNA扩增纯化于-80℃永久保存。
实施例2:单克隆抗体制备及鉴定
1.采用体外培养法制备抗体
将含有15%胎牛血清的DMEM培养基中生长的1.1.81、1.4.68、1.6.14、1.36.2、1.72.108、1.89.45、1.105.3、1.134.42、1.146.78、1.176.109细胞,逐渐降低血清至无血清或者是只含有少量血清的无血清培养基中(Invitrogen,12338-026),放入225cm2方瓶,按接种1×105个/ml的细胞量,接种100ml,每株细胞各接种4瓶。
2.抗体纯化
取出在225cm2方瓶培养了10天左右的细胞上清,离心,去掉细胞碎片,经rProteinA亲和层析进行抗体纯化。上样:pH7.4的细胞培养上清经0.22um虑膜过滤后直接上样;流洗:pH7.4 PBS流洗,10倍的柱床体积;洗脱:pH3.0甘氨酸溶液,每段0.5ml收集洗脱液;读每段OD280,将含有抗体的各段混合。再检测OD280,按1.58OD=1mg计算抗体浓度。将收集的抗体溶液过滤0.22um的滤器后无菌保存。跑SDS-PAGE胶核实纯化抗体纯度。做LAL测试确定无内毒素污染(Genscript,Cat:L00350),将此纯化抗体用于细胞毒功能测试(见下述ADCC、CDC和凋亡实验)。
实施例3:补体依赖的细胞毒实验(CDC)
Ramos、Raji和Daudi细胞从ATCC购买,培养基为10%FBS,1%丙酮酸钠和1%HEPES缓冲的DMEM。CellTiterGlo试剂盒购自Promega(Madison,WI)。正常人血清由健康献血者全血分离获得。
按1×105个/孔,将Ramos、Raji和Daudi细胞铺入96孔板。在37℃、5%CO2的细胞培养箱中细胞和不同浓度的待测试抗体共孵育10分钟,其中待测试抗体为实施例2中得到的细胞上清抗体或实施例6中得到的亲和力成熟抗体,阳性对照为美罗华,阴性对照为纯化的人IgG(从健康人的血清纯化制备)。然后加入正常人血清使其在培养液中终浓度为10%。在37℃、5%CO2的细胞培养箱中,将细胞、不同浓度的不同抗体与人血清共孵育60分钟后,通过CellTiterGlo试剂盒测定细胞裂解率。如为筛选杂交瘤培养上清,则需要根据定量ELISA的上清中含抗体浓度的结果,将要筛选的众多上清抗体浓度调释至10μg/ml,然后比较在相同浓度下各抗体的CDC功效,以筛选出高CDC功效的抗体杂交瘤抗体株。使用Prism软件作图和计算EC50。结果见图1、图2、图3和表1、表2。
表1:对不同的人杂交瘤细胞株上清液的CDC功能学筛选
对应细胞株 | EC<sub>50</sub> | 排序 |
1.1.81 | 4.103 | 6 |
1.4.68 | 68.53 | 10 |
1.6.14 | 56.89 | 9 |
1.36.2 | 0.452 | 2 |
1.72.108 | 1.563 | 4 |
1.89.45 | 3.882 | 5 |
1.105.3 | 0.446 | 1 |
1.134.42 | 7.442 | 7 |
1.146.78 | 9.99 | 8 |
1.176.109 | 0.556 | 3 |
Rituximab | 0.346 |
表2:对亲和力成熟后CHO细胞表达纯化人抗体的CDC功能学筛选(表中排序抗体的来源见实例6)
抗体名称 | EC<sub>50</sub> | 排序 |
H2L3 | 0.496 | 3 |
H2L6 | 2.054 | 10 |
H2L10 | 0.258 | 1 |
H8L3 | 0.742 | 8 |
H8L10 | 0.554 | 4 |
H8L15 | 0.623 | 5 |
H11L6 | 1.186 | 9 |
H11L10 | 0.646 | 6 |
H19L3 | 0.740 | 7 |
H19L15 | 0.327 | 2 |
Rituximab | 0.455 |
实施例4:抗体依赖的细胞毒实验(ADCC)
靶细胞准备:用不含血清的DMEM培养基,悬浮Raji细胞至浓度为1×105个/ml,加入CalceinAM(Sigma)至最终浓度为10UM,37℃,孵育50分钟。离心去上清,不含血清的DMEM培养基悬浮细胞至104/75ul,铺到黑色透明底96孔板中(Corning),75ul/孔。PBS稀释待测抗体和阳性对照成不同浓度,25ul/孔加入板子中,室温孵育30分钟。
效应细胞准备:无菌采取新鲜正常人静脉血,用抗凝剂使血液抗凝,加入Rosettesep Human NK cell Enrichment cocktail(1ml加入50ul),加入与全血等体积的含有2%FBS的PBS,加入淋巴细胞分离液,2150rpm离心30分钟;转中间层细胞至锥形管中,补加含有2%FBS的PBS,2150rpm离心10分钟,弃上清;用少量PBS悬浮细胞,用台盼蓝计数,调节细胞浓度至105个/75ul,
反应:取75ul的效应细胞至靶细胞和抗体的混合液中,37℃孵育4小时,离心板子,1000rpm离心5分钟,转移上清至铺到黑色透明底96孔板中(Corning),100ul/孔,板子放到酶标仪(Luminescence Plate Reader)读数。结果例举见图4、图5、图6和表3、表4。
表3:对不同的人杂交瘤细胞株上清液的ADCC功能学筛选
对应细胞株 | EC<sub>50</sub> | 排序 |
1.1.81 | 0.012 | 7 |
1.4.68 | 6.646 | 9 |
1.6.14 | 8.201 | 10 |
1.36.2 | 0.007 | 2 |
1.72.108 | 0.011 | 6 |
1.89.45 | 0.009 | 4 |
1.105.3 | 0.005 | 1 |
1.134.42 | 0.011 | 5 |
1.146.78 | 0.007 | 3 |
1.176.109 | 0.012 | 8 |
Rituximab | 0.004 |
表4:对亲和力成熟后CHO细胞表达纯化人抗体的ADCC功能学筛选例举(表中排序抗体的来源见实例6)
实施例5:抗体诱导的肿瘤细胞凋亡实验
按1×105个/孔,将Ramos、Raji和Daudi细胞铺入96孔板。在37℃、5%CO2的细胞培养箱中细胞和不同浓度的待测试抗体H2L10(来自实施例6)共孵育48小时,其中阳性对照为美罗华,阴性对照为纯化的人IgG。48小时共孵育培养后,取出96板,用PBS洗涤2次,以每孔100ul细胞培养液悬浮细胞,每孔加入1ul FITC-Annexin V(eBioscinece cat#:88-8005)并混合均匀,室温避光染色15分钟,用PBS洗涤3次。以200ul PBS悬浮细胞,加样入细胞计数板,在荧光显微镜计数细胞总数和染色的凋亡细胞数求出细胞凋亡率。结果见表5。结果显示:H2L10在凋亡和CDC实验中,药效比美罗华强约2倍,在ADCC试验中,与美罗华等效。
表5:H2L10和美罗华之凋亡、补体介导的细胞毒、抗体介导细胞毒功效对比(H2L10来源见实例6)。细胞凋亡、抗体介导细胞毒、补体介导的细胞毒实验是三个主要的抗癌药物药效学试验。半数有效药物浓度(EC50)是比较不同药物药效学的标准指标。表中显示的实验是以美罗华为对照对H2L10进行的背靠背药效学实验的结果。
实施例6:亲和力成熟
6.1测序Anti-CD20的重链和轻链
经免疫、融合以及单克隆化后,基于亲和力和细胞功能学实验结果选取抗CD20单克隆抗体细胞株1.105.3为模板做抗体亲和力成熟实验。
抗体基因重链和轻链的序列分析。抗CD20单克隆抗体细胞1.105.3的总RNA采用Invitrogen公司的reagent试剂盒(15596-026)进行提取;接着采用Takara公司的5’RACE FULL试剂盒(D315)中的随机引物,以总RNA为模板,反转录为第一链cDNA,并按照试剂盒的说明书操作步骤,在5’端加上接头;然后用试剂盒自带的接头引物,分别和人重链基因IgG1恒定区特异引物以及轻链基因κ链恒定区特异性引物进行扩增得到抗CD20单克隆抗体(本文中称其为“野生型”抗体)基因的重链可变区和轻链可变区。用于PCR扩增的重链和轻链特异引物是:
IgG1反向引物:GCGCCTGAGTTCCACGACAC
κ链反向引物:CACAACAGAGGCAGTTCCAG
将PCR扩增产物克隆到T载体(Takara,D101A)中,并进行测序,测序得到一致的重链可变区和轻链可变区。
6.2 scFv的构建及ELISA检测
为了提高该抗体的亲和力,以构建的单链抗体scFv为模板,进行随机突变,并将突变的单链抗体进行噬菌体展示,然后通过ELISA筛选得到更高亲和力的抗体。根据上一步测序结果,设计重链可变区和轻链可变区特异性引物,并分别在重链可变区5’端和3’端加上SfiI位点和XhoI位点,轻链可变区5’端和3’端加上NheI位点和NotI位点,重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)扩增引物如下:
VH正向引物:ACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GAGGTGCAGCTGGTGCAGTC
VH反向引物:CCACCACTCGAGGC GCTCGAGACGGTGACCAGGGT
VL正向引物:TGGCGGGTCGACG GATATTGTGATGACCCAGACT
VL反向引物:TGTTCTGCGGCCGC TTTGATCTCCACCTTGGTC
分别以完全正确的VH和VL克隆为模板,PCR扩增重链可变区和轻链可变区后,酶切,分步克隆到噬菌体展示载体pFL249(基因合成构建),进行测序验证。
选择测序正确的克隆A0026/pFL249-scFv转化到TG1感受态细胞(Stratagene,200123)中,挑取单克隆进行培养、诱导、收集上清,以Raji细胞膜为抗原进行ELISA检测。
6.3随机突变体库的构建、筛选及测序分析
采用Statgene公司的GeneMorph II Random Mutagenesis试剂盒(200550),以VH正向引物和VL反向引物进行易错PCR扩增,将扩增好的PCR产物进行纯化、酶切、连接到pFL249载体上,然后电转化到TG1感受态细胞中,梯度稀释至适当的浓度,涂布平板,37℃过夜培养。
从单克隆密度适宜的平板上挑取单克隆到96孔细菌培养板进行培养和诱导表达,收集上清进行ELISA检测,在OD值比野生型高的单克隆中,根据OD值从高到低选择200个单克隆进行测序。
分析测序结果,去除FR区突变的非人源克隆后,根据OD值,从高到低,分别选择20个突变的克隆的VH和VL用于构建全长抗体。
6.4构建全长抗体及亲和力排序
6.4.1根据之前的结果,设计重链可变区和轻链可变区特异性引物,并分别在重链可变区5’端和3’端加上SfiI位点和SalI位点,轻链可变区5’端和3’端加上SfiI位点和BsiwI位点,重链可变区和轻链可变区扩增引物如下:
VH正向引物1:TGGCAGCGGCCACAGGGGCCCACTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAGTC
VH反向引物1:GCCCTTGGTCGACGC GCTCGAGACGGTGACCAGGGT
VL正向引物1:TGGCAGCGGCCACAGGGGCCCACTCC GATATTGTGATGACCCAGACT
VL反向引物1:AGCCACCGTACG TTTGATCTCCACCTTGGTC
分别以野生型的VH和VL克隆,以及突变后的20个VH和20个VL克隆为模板,PCR扩增重链可变区和轻链可变区后,酶切,分别克隆到含有人的IgG1恒定区和人的κ恒定区pCI载体(Promega,E1731)中,并进行测序验证。
6.4.2分别将突变后的20个全长重链(H1~H20)和野生型的全长轻链(L)组合,将突变后的20个全长轻链(L1~L20)和野生型的重链(H)组合,将共40种组合采用FreeStyleMAX转染系统(Invitrogen,16447-100)共转染到CHO-S细胞中,37℃,8%CO2培养6天后,离心收集上清。
按前述实施例1中2.6步骤方法进行40个抗体上清中抗体浓度定量,然后按前述实施例1中2.7步骤方法进行相对亲和力排序。结果如图7、图8和表6所示:40个突变体的上清的亲和力相比原始细胞株1.105.3都有10~20倍不同程度的提高。分别选定5个亲和力最高的重链H2、H8、H11、H16、H19和5个亲和力最高的轻链L3、L6、L10、L15、L18。
表6:突变后的重链和轻链的亲和力排序(KD为解离常数(单位:nM),是通过Prism软件以亲和力排序ELISA数据计算得到的)
6.4.3将上一步筛选到的5个重链突变体和5条轻链突变体相互组合,配成25个全长突变抗体:H2L3,H2L6,H2L10,H2L15,H2L18,H8L3,H8L6,H8L10,H8L15,H8L18,H11L3,H11L6,H11L10,H11L15,H11L18,H16L3,H16L6,H16L10,H16L15,H16L18H19L3,H19L3,H19L6,H19L19,H19L15,H19L18。将它们重轻链共转染,培养、收集上清,再进行亲和力排序。
结果如图9和表7所示,在25个上清中,有10个H/L组合比Rituximab的亲和力高。选择亲和力排序前10的抗体,即表7中的前10个抗体H2L10、H11L6、H2L3、H8L3、H19L15、H8L10、H11L10、H19L3、H2L6和H8L15,按照实施例3、4对这10个抗体进行ADCC和CDC测试,测试结果见图2、图3、图5、图6。
表7:突变后的H/L组合的亲和力排序(KD为解离常数(单位:nM),是通过Prism软件以亲和力排序ELISA数据计算得到的;Ritux表示美罗华)
名称 | KD |
H2/L10 | 0.7848 |
H11/L6 | 1.761 |
H2/L3 | 2.56 |
H8/L3 | 2.574 |
H19/L15 | 2.677 |
H8/L10 | 3.322 |
H11/L10 | 3.768 |
H19/L3 | 5.458 |
H2/L6 | 5.634 |
H8/L15 | 8.723 |
Ritux | 9.272 |
H16/L3 | 10.05 |
H8/L18 | 12.65 |
H2/L15 | 12.78 |
H19/L18 | 13 |
H19/L6 | 13.18 |
H11/L3 | 13.21 |
H19/L10 | 13.32 |
H11/L15 | 13.62 |
H16/L15 | 13.76 |
H8/L6 | 13.88 |
H16/L6 | 13.92 |
H11/L18 | 14.01 |
H16/L10 | 14.66 |
H16/L18 | 15.84 |
H2/L18 | 16.05 |
6.5本发明的人抗体可变区序列
经最终的测序验证,表7所示的前10个抗体的重链恒定区为人IgG1重链的恒定区,轻链恒定区为人κ链的恒定区,重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列如下:
6.5.1重链可变区序列及其互补决定区(CDR)
Seq ID NO:1为H19的可变区的氨基酸序列
Seq ID NO:2为H11的可变区的氨基酸序列
Seq ID NO:3为H8的可变区的氨基酸序列
Seq ID NO:4为H2的可变区的氨基酸序列
Seq ID NO:9为A137H的可变区的氨基酸序列
Seq ID NO:11为H19、H11、H8和A137H的CDR1序列
Seq ID NO:12为H2的CDR1序列
Seq ID NO:13为H19的CDR2序列
Seq ID NO:14为H2、H11的CDR2序列
Seq ID NO:15为A137H的CDR2序列
Seq ID NO:16为H8的CDR2序列
Seq ID NO:17为H19、H2、H8和A137H的CDR3序列
Seq ID NO:18为H11的CDR3序列
6.5.2轻链可变区序列及其互补决定区(CDR)
Seq ID NO:5为L3的可变区的氨基酸序列
Seq ID NO:6为L10的可变区的氨基酸序列
Seq ID NO:7为L6的可变区的氨基酸序列
Seq ID NO:8为L15的可变区的氨基酸序列
Seq ID NO:10为A137L的可变区的氨基酸序列
Seq ID NO:19为L3的CDR1序列
Seq ID NO:20为L10的CDR1序列
Seq ID NO:21为L6的CDR1序列
Seq ID NO:22为L15的CDR1序列
Seq ID NO:23为A137L的CDR1序列
Seq ID NO:24为L3、L6、L10、L15和A137L的CDR2序列
Seq ID NO:25为L3、L6、L10和A137L的CDR3序列
Seq ID NO:26为L15的CDR3序列。
实施例7:动物体内药效试验
7.1本发明的抗体H2L10治疗人B细胞淋巴瘤Raji细胞侵润瘤模型的药效学试验
7.1.1小鼠体重和健康状态的观察
静脉注射107Raji淋巴瘤细胞形成小鼠淋巴瘤疾病模型。分五组分别为1.生理盐水组(无抗体)、2.美罗华组(单次剂量为3.5mg/kg小鼠体重)、3.H2L10低剂量组(单次剂量为1mg/kg)、4.H2L10中剂量组(单次剂量为3.5mg/kg)和5.H2L10高剂量组(单次剂量为10mg/kg)。癌细胞静脉注射后7天开始给药。腹腔注射每周一次。结果见图10。
7.1.2小鼠体内生存期实验
静脉注射107Raji淋巴瘤细胞形成小鼠淋巴瘤疾病模型。分五组分别为1.生理盐水组(无抗体)、2.美罗华组(单次剂量为3.5mg/kg)、3.H2L10低剂量组(单次剂量为1mg/kg)、4.H2L10中剂量组(单次剂量为3.5mg/kg)和5.H2L10高剂量组(单次剂量为10mg/kg)。癌细胞静脉注射后7天开始给药。腹腔注射每周一次。结果见图11。
7.2 H2L10治疗人B细胞淋巴瘤Raji细胞原位移植瘤的抑瘤试验
小鼠接种人B细胞淋巴瘤后观察肿瘤生长情况,待肿瘤体积为40-100mm3左右时,按瘤体积大小进行筛选,瘤体积过大及未成瘤者不予入选。筛选后随机分为3组:1.生理盐水组、2.美罗华组、3.H2L10,其中美罗华组和H2L10组的给药剂量均为5mg/kg小鼠体重。腹腔注射每周一次。实验结果见图12。
实施例8:抗体A137
重复进行实施例1~6的实验以筛选更多的符合本发明要求的抗体。结果发现,具有重链A137H(其可变区序列为SEQ ID NO:9)和轻链A137L(其可变区序列为SEQ ID NO:10)的全人源CD20抗体A137具有更好的效果。
具体而言,在ADCC测试中,A137的EC50小于美罗华(见图13A)和H2L10(图13B),细胞杀伤效果更好;在CDC测试中,A137的效果与美罗华相似(图14)。在亲和力测试中,A137对CD20的亲和力高于美罗华(图15)。
用A137进行动物体内药效试验。注射了生理盐水的人B细胞淋巴瘤模型小鼠在约21天时开始出现死亡,至40天时全部死亡;而注射美罗华的小鼠组在约44天时开始出现死亡,到约130天时全部死亡;相比之下,注射A137的小鼠组在约47天时开始死亡,且到140天以后仍有超过20%的小鼠存活(见图16)。这证明A137的疗效优于美罗华。从图17可以看出,在小鼠体重维持方面,A137比3倍剂量的美罗华的效果更好:到150天时,接受A137的小鼠组的体重变化仍然缓慢,且体重减少维持在15%以内;而高剂量美罗华组小鼠在约100天后体重下降就超过15%,在约130天时体重下降超过35%。
本发明带来的有益效果
本发明正是针对Rituximab不足之处而进行的新分子创制:(1)变鼠人嵌合抗体为全人源抗体(2)通过新药物的提升,使其针对其他瘤细胞的CDC,ADCC和凋亡能力增强以提高杀瘤疗效。(3)治疗人B细胞淋巴瘤Raji细胞侵润瘤模型的药效学试验和治疗人B细胞淋巴瘤Raji细胞原位移植瘤的小鼠药效学试验,在生存期和抑制肿瘤生长上均显示不低于或比美罗华更好的疗效。
本发明的抗体分子可作为药物候选分子将会对淋巴瘤和自身免疫性疾病有更好的疗效,有益于人类疾病的治疗。
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Claims (12)
1.一种抗CD20的全人源单克隆抗体,所述抗体具有重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区和轻链可变区各自具有3个互补决定区(CDR),其中,
所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列为Seq ID NO:11,
所述重链可变区的CDR2的氨基酸序列为Seq ID NO:15,
所述重链可变区的CDR3的氨基酸序列为Seq ID NO:17,
所述轻链可变区的CDR1的氨基酸序列为Seq ID NO:23,
所述轻链可变区的CDR2的氨基酸序列为Seq ID NO:24,并且
所述轻链可变区的CDR3的氨基酸序列为Seq ID NO:25。
2.如权利要求1所述的抗体,所述抗体的重链可变区的氨基酸序列为Seq ID NO:9,所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列为Seq ID NO:10。
3.如权利要求1或2所述的抗体,所述抗体的重链恒定区为人IgG1重链的恒定区,所述抗体的轻链恒定区为人κ链的恒定区。
4.一种多核苷酸,所述多核苷酸编码权利要求1~3中任一项所述的抗体。
5.一种载体,所述载体中包含权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种抗CD20的结合物,所述结合物包含与同位素、免疫毒素和/或化学药物共价连接的权利要求1~3中任一项所述的抗体。
7.一种偶联物,所述偶联物为权利要求1~3中任一项所述的抗体或权利要求6所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联而形成的。
8.权利要求1~3中任一项所述的抗体、权利要求6所述的结合物或权利要求7所述的偶联物在制备用于治疗下述疾病的药物中的应用,所述疾病选自炎性疾病、自身免疫性疾病、细胞增殖病症、心血管病或血液病。
9.权利要求1~3中任一项所述的抗体、权利要求6所述的结合物或权利要求7所述的偶联物在制备用于治疗下述疾病的药物中的应用,所述疾病选自非霍奇金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、风湿性和类风湿性疾病、系统性红斑狼疮、免疫性血小板减少性紫癜或多发性硬化症。
10.一种药物组合物,所述药物组合物包含权利要求1~3中任一项所述的抗体、权利要求6所述的结合物和/或权利要求7所述的偶联物。
11.一种用于诊断炎性疾病、自身免疫性疾病、细胞增殖病症、心血管病或血液病的试剂盒,所述试剂盒包含权利要求1~3中任一项所述的抗体、权利要求6所述的结合物和/或权利要求7所述的偶联物。
12.一种用于诊断非霍奇金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、风湿性和类风湿性疾病、系统性红斑狼疮、免疫性血小板减少性紫癜或多发性硬化症的试剂盒,所述试剂盒包含权利要求1~3中任一项所述的抗体、权利要求6所述的结合物和/或权利要求7所述的偶联物。
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