JP2008541758A - Cd20に対する抗体およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
発明の分野
本発明は、標的抗原CD20に対するモノクローナル抗体、およびこのような抗体の使用に関する。より具体的には、本発明は、CD20に指向化された完全ヒトモノクローナル抗体およびこれらの抗体の使用に関する。本発明の態様はまた、ハイブリドーマまたはこのような抗体を発現する他の株細胞に関する。記載の抗体は、CD20の活性および/または過剰発現、および/またはCD20+細胞の存在および/または活性に関連する疾病の、診断上、および治療に有用である。
CD20は、長さが298アミノ酸である33,000MWグリコ−リン酸化タンパク質である。ヒトCD20遺伝子は、1653塩基ペアの長さである。5’UTRは、147塩基ペアの長さである。コード配列は893塩基ペア、一方で3’UTRは613塩基ペアの長さである。
本発明の実施形態は、CD20に特異的に結合すると共に、CD20を発現する細胞の成長を阻害する標的結合剤に関する。これを達成することができるメカニズムは、限定されないが、CD20を発現する細胞のアポトーシスを誘起するステップ、CD20を発現する細胞における抗体依存細胞傷害活性(ADCC)を誘起するステップ、またはCD20を発現する細胞における補体依存性細胞傷害作用(CDC)を誘起するステップのいずれかを含むことができ、これにより、CD20+リンパ腫細胞、CD20+白血病細胞および通常のB細胞を含むCD20陽性B細胞を根絶する。
本願明細書に記載の本発明の実施形態は、CD20に結合するモノクローナル抗体に関する。いくつかの実施形態において、抗体はCD20に結合すると共に、Bリンパ腫細胞のアポトーシスを誘起する。本発明の他の実施形態は、治療的に有用である完全ヒト抗CD20抗体、および抗体調製物を含む。このような抗CD20抗体調製物は、好ましくは、CD20に対する強結合親和性、インビトロおよびインビボでのB−リンパ腫細胞のアポトーシスの誘起能、インビトロおよびインビボでのADCC活性の誘発能、およびインビトロおよびインビボでのCDC活性誘起能を含む所望の治療的特性を有する。
特に記載のない限り、本願明細書において用いられる科学的および技術的用語は、通例当業者によって理解される意味を有するべきである。さらに、内容によって要求されない限りにおいて、単数形は複数形を含むべきであると共に、複数形の用語は単数形を含むべきである。一般に、本願明細書に記載の、細胞および組織培養、分子生物学、およびタンパク質およびオリゴ−またはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名法およびこれらの技術は、周知であると共に技術分野において通例用いられるものである。
塩基性抗体構造的単位はテトラマーを含むことが公知である。各テトラマーは、ポリペプチド鎖の2つの同一のペアから構成されており、各ペアは、1つの「軽鎖」(約25kDa)および1つの「重鎖」(約50−70kDa)を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に主に関与する、約100〜110以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を定義する。ヒト軽鎖は、κおよびλ軽鎖として分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α、またはεとして分類され、抗体のアイソタイプを、それぞれ、IgM、IgD、IgA、およびIgEとして定義する。軽鎖および重鎖中において、可変および定常領域は、約12以上のアミノ酸の「J」領域によって、約10以上のアミノ酸の「D」領域をも含む重鎖と共に、接続される。一般に、「Fundamental Immunology Ch. 7」(Paul, W.編、第2版、Raven Press、ニューヨーク(N.Y.)(1989年))(すべての目的のために、その全体が参照により援用されている)を参照のこと。各軽鎖/重鎖ペアの可変領域は、抗体結合部位を形成する。
ヒト抗体は、マウスまたはラット可変および/または定常領域を有する抗体に付随する問題のいくつかを回避する。このようなマウスまたはラット由来タンパク質の存在は、抗体の急速なクリアランスをもたらす可能性があり、または患者による、抗体に対する免疫応答の発生をもたらす可能性がある。マウスまたはラット由来抗体の使用を回避するために、完全ヒト抗体は、げっ歯類、他の哺乳動物または動物が完全ヒト抗体を産生するよう、機能性ヒト抗体座位のげっ歯類、他の哺乳動物または動物への導入を介して生成されることができる。
本発明の実施形態は、以下の表1に列挙された特定の抗CD20抗体を含む。この表は、対応する重鎖および軽鎖遺伝子の可変領域の配列番号と共に、各抗CD20抗体の識別番号を報告する。
抗CD20抗体は、CD20発現に関連する症状および条件の治療において治療的効力を有することができる。例えば、抗体は、CD20を発現する細胞のアポトーシスを誘起することができ、これにより腫瘍成長を阻害し、または抗体は、剤と結合されて、致死的な毒素を標的細胞に送達することができる。さらに、抗CD20抗体は、疾病状態、特に腫瘍性および免疫疾患についての診断上有用である。
本発明に基づいて、およびCD20に関して本願明細書において産生されおよび特徴づけられる抗体の活性をベースとして、他の治療的モダリティの設計は促進されおよび当業者に開示される。このようなモダリティとしては、限定されないが、二重特異性抗体、免疫毒素、放射性標識化治療薬、および単一抗体Vドメイン、V領域骨格以外をベースとする抗体様結合剤、ペプチド治療薬の生成、遺伝子療法、特に細胞内抗体、アンチセンス治療薬、および小分子などの先進的抗体治療薬が挙げられる。
本願明細書において定義される抗腫瘍治療は、単独治療として適用され得、または、本発明の化合物に追加して、従来の手術、骨髄および末梢幹細胞移植または放射線療法または化学療法を含み得る。このような化学療法としては、抗腫瘍剤の以下のカテゴリーの1つまたは複数が挙げられ得る:
(i)フルダラビン、2−クロロデオキシアデノシン、クロランブシルまたはドキソルビシンなどの細胞障害性剤、およびフルダラビン+シクロホスファミド、CVP:シクロホスファミド+ビンクリスチン+プレドニゾン、ACVBP:ドキソルビシン+シクロホスファミド+ビンデシン+ブレオマイシン+プレドニゾン、CHOP:シクロホスファミド+ドキソルビシン+ビンクリスチン+プレドニゾン、CNOP:シクロホスファミド+ミトキサントロン+ビンクリスチン+プレドニゾン、m−BACOD:メトトレキサート+ブレオマイシン+ドキソルビシン+シクロホスファミド+ビンクリスチン+デキサメタゾン+ロイコボリン、MACOP−B:メトトレキサート+ドキソルビシン+シクロホスファミド+ビンクリスチン+プレドニゾン固定投与量+ブレオマイシン+ロイコボリン、またはProMACE CytaBOM:プレドニゾン+ドキソルビシン+シクロホスファミド+エトポシド+シタラビン+ブレオマイシン+ビンクリスチン+メトトレキサート+ロイコボリンなどのこれらの組み合わせ。
(ii)癌細胞侵襲を阻害する剤(例えばマリマスタットのようなメタロプロテイナーゼ抑制剤およびウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体機能の抑制剤);
(iii)増殖因子または生存シグナル機能抑制剤であって、例えばこのような抑制剤としては、増殖因子抗体(例えばB−LySに指向された抗体)、増殖因子受容体抗体(例えばCD40またはTRAIL受容体TRAILR1およびTRAILR2に指向された抗体)、ファルネシルトランスフェラーゼ抑制剤またはチロシンキナーゼ抑制剤およびセリン/スレオニンキナーゼ抑制剤、MEK抑制剤、Bcl−2、Bcl−XL例えばABT−737などの生存シグナルタンパク質の抑制剤;
(iv)血管性内皮増殖因子の効力を阻害するものなどの血管新生抑制剤(例えば抗血管性内皮細胞増殖因子抗体ベバシズマブ[Avastin(商標)]、抗KDR抗体および抗flt1抗体などの抗血管性内皮増殖因子受容体抗体、国際公開第97/22596号パンフレット、国際公開第97/30035号パンフレット、国際公開第97/3285号パンフレット、国際公開第98/13354号パンフレット、国際公開第00/47212号パンフレットおよび国際公開第01/32651号パンフレットに開示のものなどの化合物)および他のメカニズムによって作用する化合物(例えばlinomide、インテグリンavb3機能およびアンジオスタチンの抑制剤);
(v)コンブレタスタチンA4および、国際公開第99/02166号パンフレット、国際公開第00/40529号パンフレット、国際公開第00/41669号パンフレット、国際公開第01/92224号パンフレット、国際公開第02/04434号パンフレットおよび国際公開第02/08213号パンフレットに開示の化合物などの血管性傷害剤;
(vi)G−3139(Genasense)、抗bcl2アンチセンスなどの、例えば上記に列挙した標的に指向化されたものといったアンチセンス療法;
(vii)例えば、異常p53または異常BRCA1またはBRCA2などの異常遺伝子を置き換えるアプローチ、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼまたは細菌性ニトロ還元酵素酵素を用いるものなどのGDEPT(遺伝子指向化酵素プロドラッグ治療)アプローチ、およびマルチ薬剤耐性遺伝子治療などの化学療法または放射線療法に対する患者許容誤差を増加させるアプローチを含む遺伝子治療アプローチ;および
(viii)例えばアレムツズマブ(campath−1H(商標))、CD52で指向化されたモノクローナル抗体での治療、またはCD22で指向化された抗体での治療、患者腫瘍細胞の免疫原性を増加させるエキソビボおよびインビボアプローチ、インターロイキン2、インターロイキン4または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子などのサイトカインでの形質移入、CTLA−4機能を阻害するモノクローナル抗体での治療などのT細胞アネルジーを低減させるアプローチ、サイトカイン形質移入樹状細胞などの形質移入された免疫細胞を用いるアプローチ、サイトカイン形質移入化腫瘍株細胞を用いるアプローチおよび抗イディオタイプ抗体を用いるアプローチを含む、免疫療法アプローチ。
(ix)Velcade(ボルテゾミブ)などのポロテアソーム抑制剤などのタンパク質分解の抑制剤。
(x)例えば、受容体リガンド、受容体に結合するブロックリガンドを隔離する、または受容体シグナルを低減させる(例えば増強された受容体分解または低下された発現レベルによる)ペプチドまたはタンパク質(抗体または可溶性外部受容体ドメイン構成などの)を用いるものといった生物学的薬物治療的アプローチ。
免疫化およびタイタリング
ヒトCD20プラスミドのクローン化
全RNAを、RNAzol B RNA単離溶液(Tel−テスト、INC、テキサス州フレンズウッド(Friendswood,TX))を用いて、製造業者の説明書に従ってラージ細胞から単離し、および260nmでの紫外吸収によって定量化した(Bio-RAD smartspec(商標)3000)。2マイクログラムの全RNAを、単鎖cDNA合成キット(GIBCO-BRL)で、製造業者の説明書に従ってランダムに刺激した。単鎖のcDNAをTaq DNAポリメラーゼ(QIAGEN、カリフォルニア州バレンシア(Valencia,CA)を用いて、オレゴヌクレオチドプライマー(Operon、アラバマ州ハンツビル(Huntsville,AL))で以下のとおり増幅した:
順方向プライマー:5’−TCAGGAGTTTTGAGAGCAAAATG−3’(配列番号137)および
逆方向プライマー:5’−AACAGAAGAAATCACTTAAGGAG−3’。配列番号138)
HEK293FおよびCHO K1細胞を、10%FBS、2mM L−グルタミン、50μM BME、100単位ペニシリン−g/ml、100単位MCGストレプトマイシン/mlを追加したDMEM/F12(50/50混合)培地中に増殖させた。ヒトCD20/pCR3.1プラスミドを、HEK293FおよびCHO K1細胞に、LipofectAMINE 2000 Reagent(Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド(Carlsbad,CA))を製造業者の説明書に従って用いて形質移入した。形質移入を48時間進行させ、続いて、1mg/ml G418(Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド(Carlsbad,CA))で2週間セレクションした。安定G418耐性クローンを、1次マウス抗ヒトCD20モノクローナル抗体(BD)で染色し、続いて、ヤギ抗マウスIgG(CalTag Laboratories、カリフォルニア州バーリンガム(Burlingame,CA))をPE複合物化し、およびFACSによって、FACS Vantage(BD、ニュージャージー州フランクリンレイクス(Franklin Lakes,NJ))で分析した。
ヒト癌株細胞ラモス、ダウディおよびCD20−CHO細胞において発現されたCD20を抗原として用いた。CD20に対するモノクローナル抗体を、XenoMouse(登録商標)マウス(XenoMouse菌株:XM3B3:IgG1K、XM3B3L3:IgG1KL、XM3B3L:IgG1L、XM3C−1:IgG4K、XM3C−1L3:IgG4KL、およびXM3C−1L:IgG4L、Abgenix, Inc.、カリフォルニア州フレモント(Fremont,CA))を順番に免疫化することにより発生させた。XenoMouse動物は、従来の手段によるすべての注入について、足蹠経路を介して免疫化した。各注入の総体積は、マウス当たり50μl、足蹠当たり25μlであった。
リンパ球、B細胞単離、融合物の回収およびハイブリドーマの生成
選択した免疫化マウスを子宮頚部の転移によって犠牲にし、および排出リンパ節を採取し、および各コホートからプールした。リンパ球細胞を、DMEM中に粉砕することにより分離して、細胞を組織から放出させ、および細胞をDMEM中に懸濁させた。細胞を計数し、および0.9ml DMEM/1億のリンパ球を細胞ペレットに添加して、細胞を穏やかにかつ完全に再懸濁させた。100μlのCD90+磁性ビーズ/1億細胞を用いて、細胞を、細胞を磁性ビーズと共に4℃で15分間インキュベートすることにより標識化した。108以下の陽性細胞(または2×109以下の総細胞)を含有する、磁性的に標識化した細胞懸濁液をLS+カラムにロードし、およびカラムをDMEMで洗浄した。総溶出液を、CD90−陰性分画(これらの細胞ほとんどは、B細胞であると予想された)として回収した。
FMATおよびFACSによる候補抗体のセレクション
14日間の培養の後、ハイブリドーマ上清を、組み換え型CHO−ヒトCD20形質移入細胞に対してスクリーニングし、および親CHO細胞に対して対−スクリーニングすることにより、CD20−特異的モノクローナル抗体について蛍光定量的微体積アッセイテクノロジー(FMAT)でスクリーニングした。
アポトーシス活性
2つの実験的アプローチを実行してスクリーニングし、およびラモスヒトリンパ腫株細胞中にアポトーシス促進活性を示す抗体系統を同定した。より具体的には、アポトーシス活性を、CellTiterGloアッセイを用いて、およびヨウ化プロピジウム/ヘキスト染色と併せて自動化蛍光顕微鏡により評価した。
アポトーシスアッセイ:架橋剤無しでのCELLTITERGLO生存度アッセイ
存在する生存細胞の数に相関する、細胞中に存在するATPの量を判定するために、CellTiterGloアッセイを実施した。簡潔には、リンパ腫(ラモス)細胞を、Costar96ウェル平底プレート(カタログ番号3603)に、10,000細胞/ウェルで、50μlの体積中に播種した。一次抗体を、25μl/ウェルとして、組織培養培地に添加し、および細胞と共に10分間室温でインキュベートした。インキュベーションの後、CellTiter Glo試薬(Promegaカタログ番号G7571)を細胞に添加し、および10分間室温で、暗中でインキュベートした。プレートをプロトコル説明書のとおり読み取った。結果は、図1(72時間での2つのうちのプレート1)および2(72時間での2つのうちのプレート2)に示されており、および以下の表5および6にまとめられている。太字の値は、リツキシマブ対照より優れているEC50値を示す。
アポトーシスアッセイ:架橋剤無しでのALAMAR BLUE生存度アッセイ
ラモス細胞におけるアポトーシスを計測するために、Alamar Blue(Biosource、カリフォルニア州カマリロ(Camarillo,CA))生存度アッセイを実施した。Alamar Blueは、代謝活性に応じて変色する酸化還元指示薬である。増殖性細胞の内部環境は、非増殖性細胞のものより還元されている。Alamar Blueは増殖性細胞内で還元され、計測可能な色の変化を伴う。
アポトーシスアッセイ:架橋剤なしでのWST-1生存度アッセイ
ラモス細胞におけるアポトーシスを計測するために、WST-1(Roche Molecular Biochemicals、インディアナ州インディアナポリス(Indianapolis,IN))生存度アッセイを実施した。WST-1還元アッセイは細胞傷害性の定量化のための比色アッセイであり、生存細胞中のミトコンドリアデヒドロゲナーゼによるWST-1テトラゾリウム塩の開裂に基づく。
アポトーシスアッセイ:架橋剤無しでのアネキシンV/PIアポトーシスアッセイ
リンパ腫細胞を、Costar96ウェル平底プレート(カタログ番号3603)に、200,000細胞/ウェルで、50μlの体積に播種した。一次抗体を25μl/ウェルとして組織培養培地中に添加し、および細胞と共に10分間室温でインキュベートした。インキュベーションの後、プレートを、1,200rpmで5分間遠心分離し、および上清を吸引した。細胞ペレットを、100μl FACS緩衝剤(1×PBS中の2%FBS)中に再懸濁させ、およびプレートを、1,200rpmで5分間遠心分離した。ペレットを、100μlのインキュベーション緩衝剤(95%1×結合緩衝剤、2.5%アネキシンV、2.5%PI)中に再懸濁させ、および10〜15分間室温で、暗中でインキュベートした。インキュベーションの後、タイターチューブ中の体積を、200μlの1×緩衝剤(w/oアネキシンVおよびPI)を添加することにより300μlに増やした。分析を、チャンネルFL−1(アネキシンV)およびFL−3(PI)をFACS Caliburと共に用いて実施した。
CDCアッセイ
リンパ腫細胞(ラモス、ラージ、またはダウディ)を、Costar96−ウェル平底プレート(カタログ番号3603)に、100,000細胞/ウェルで、25μlの体積に播種した。一次抗体サンプルを、25μl/ウェルとして、組織培養培地中に添加し、および室温で10分間インキュベートした。正常なヒト血清を、10〜50%の濃度で添加し、および成長培地(血清濃度を滴定した)(Advanced Research Technologies、カリフォルニア州サンディエゴ(San Diego,CA)から入手した血清)で希釈し、および37℃で1時間インキュベートした。CellTiter Glo試薬(Promegaカタログ番号G7571)を細胞に添加し、および10分間室温で、暗中でインキュベートした。プレートを、プロトコル説明書どおり読み取った。
ヒト抗CD20抗体のADCC
全血(35〜45ml)からのPBMCの単離
PMBCからのNKの濃縮を、RosetteSep(登録商標)Human NK Cell Enrichment反応混液およびプロトコル(カタログ番号15065)を用いて実施した。RosetteSep(登録商標)抗体反応混液は、ヒト全血中の不必要な細胞と多重(RBC)に架橋して、免疫ロゼットを形成する。これは、Ficol-Paque(登録商標)などの浮遊密度培地上に遠心分離されたときにこれらがフリーRBCと共にペレット化されるよう不必要な(ロゼット形成された)細胞の密度を増加させる。所望の細胞は、プラズマおよび浮遊密度培地の間になることはない。
Calcein-AMは、カルセインの細胞透過性バージョンである。これは、カルセインと比して増強された疎水性により、生存細胞の細胞膜を容易に通過する。Calcein-AMが原形質に浸透するとき、これは、細胞中のエステラーゼによって、細胞の内部に良好に維持されるカルセインに加水分解される。それ故、Calcein-AMは、生存細胞を染色する好適なプローブである。カルセインを用いる生存度アッセイは信頼でき、および標準51Cr−放出アッセイと良好に相関する。
全血アッセイ
calcein−AMでの標的細胞の標識化
腫瘍標的細胞(ラモス、ラージ、ダウディ)を収穫し、および1×106細胞/mlで培地に再懸濁させた。Calcein-AM(Sigma、カタログ番号C1359)を、10μM(2mL細胞中に5μl)の最終濃度に添加し、および37℃で45分間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を、1200RPMで10分間スピンさせ、上清を廃棄し、およびペレットを新鮮な成長培地(2×)中に再懸濁させた。ペレットを、10,000細胞/75μlに再懸濁させた。標的細胞を、次いで、75μl(10,000細胞/ウェル)に、丸底プレート(Costar、カタログ番号3799)に播種した。抗体を、標的細胞に、培地中に希釈された50μl/ウェルとしての適切な濃度で添加し、および30分間室温でインキュベートした。インキュベーションの後、ウェル当たり50μlの全血を添加し、および37℃で4時間インキュベートした。(注記:全血は、ヘパリンを含有するチューブ中に回収した)。インキュベーションの後、プレートを、1200RPMで5分間スピンさせた。100μL上清を、黒色、清透な平底プレート(Costar、カタログ番号3603)に移し、および蛍光を計測した。
これらの知見は、さらに株細胞由来の多数の非ホジキンリンパ腫(ダウディ、ラモス、ARH−77、ナマルバ、ラージ、SC1、WSU−NHL、SU−DHL−4およびカルパス(Karpas)422)および慢性リンパ性白血病(EHEB、JMV−2およびJMV−3)に拡張された。抗CD20抗体のパネルの細胞溶解活性を、抗CD20抗体の活性におけるバリエーションはFcgRIIIa受容体における多形性の関数として異なるため、異なるヒトドナーからの未分画化血液を用いて評価した(「Blood」2002年;99:754〜758ページ)。図15および16に示されるデータは、ドナーおよび株細胞にわたって、抗CD20抗体1.1.2および1.5.3が高レベルの細胞溶解を10μg/mlの抗体濃度で媒介していたことを示している。
CD20を発現するSB細胞に結合している7つの精製モノクローナル抗体についてのFACS Kd判定
精製した抗体の、CD20(mAb1.1.2、1.2.1、2.1.2、1.3.3、1.5.3、1.10.3.1、1.13.2)、リツキシマブ(陽性対照)、およびB1に対する親和性は、FACSによって測定した。簡潔には、CD20を発現するSB細胞を、FACS緩衝剤(2%FBS、0.05%NaN3)中に、およそ500万個の細胞/mLの濃度で再懸濁させた。HSB細胞をまた、FACS緩衝剤中に、およそ900万個の細胞/mLの濃度で再懸濁させた。細胞を氷上に維持した。精製した抗体を、96−ウェルプレートにおける11ウェルにわたってろ過された1×PBS(2×)中に連続的に希釈した。各列における12番目のウェルは、緩衝剤のみを含有した。1×PBSおよび細胞を、最終体積が30μL/ウェルであると共に各ウェルがおよそ375,000個の細胞を含有するよう各mAbウェルに添加した。mAbについての最終分子濃度範囲は以下のとおりであった:
mAb 濃度
1.1.2 =156−0.304nM
1.2.1 =202−0.098nM
2.1.2 =396−0.387nM
1.3.3 =289−0.283nM
1.5.3 =107−0.104nM
1.10.3.1 =265−0.258nM
1.13.2 =367−0.358nM
リツキシマブ =365−0.356nM
B1 =351−0.343nM
抗CD20抗体の構造分析
抗体の可変重鎖および可変軽鎖を配列して、それらのDNA配列を判定した。抗CD20抗体についての完全な配列情報が、配列リストに、各γおよびκ鎖組み合わせについてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列と共に提供されている。可変重配列を分析して、VHファミリー、D−領域配列およびJ−領域配列を判定した。次いで、配列を翻訳して第一級アミノ酸配列を判定し、および生殖系列VH、DおよびJ−領域配列と比較して体細胞性高頻度変異を評価した。「−」は生殖系列配列との同一性を示す。「#」は、生殖系列中に見出されない抗体配列における追加のアミノ酸を示す。
正準クラス抗体の判定
Chothiaらは、各免疫グロブリン鎖の高頻度可変領域についての「正準クラス」の観点で抗体構造を説明している(「J Mol Biol.」1987年8月20日;196(4):901〜17ページ)。多様な免疫グロブリンのFabおよびVLフラグメントの原子構造を分析して、それらのアミノ酸配列とそれらの抗原結合部位の三次元構造と間の関係を判定した。Chothiaらは、それらのパッキング、水素結合または異例のφ、ψまたはωコンフォメーションの推定能を介する、高頻度可変領域の主鎖コンフォメーションについての主な原因である残渣は比較的少数であったことを見出した。これらの残渣は、高頻度可変領域内のおよび転換β−シートフレームワークにおける部位で生じることが見出された。不明な構造を有する免疫グロブリンの配列を試験することにより、Chothiaらは、多くの免疫グロブリンが、既知の構造の1つと類似のサイズである高頻度可変領域を有すると共に、追加的に、同一の残渣を観察されたコンフォメーションについての原因である部位で含有していたことを示す。
エピトープ特徴づけ:合成ペプチドのSPOT合成
低親和性ペプチド−抗体相互作用の検出
ヒトCD20配列の43アミノ酸細胞外ドメインを橋架けするオーバーラッビングペプチドスキャンを自動化SPOT合成によって調製した。一連の33 12−塩基長ペプチドを、ポリプロピレンメンブランシート上のスポットとして合成した。ペプチドアレイが、CD20配列のアミノ酸残渣142−185を橋架けした。各連続したペプチドを、前のペプチドから、属する1つでオフセットして、表13に示されるとおり、アレイ化オリゴペプチドの入れ子、オーバーラッピングライブラリを得た。
CD20細胞外領域配列アラインメント
出版された報告は、ヒトCD20上の細胞外エピトープに対して指向化された抗体はマウスB細胞に結合しないことを示している。ヒトおよびマウスCD20の細胞外ドメインは、およそ43アミノ酸の16で異なっている。以下のアラインメントに示されているとおり、8つの非保存的な差異が、10−アミノ酸ストレッチ(ESLNFIRAHT(配列番号197))中に位置されている。
部位特異的突然変異誘発を用いるエピトープマッピング
突然変異誘発アプローチを用いるエピトープマッピング試験は、170番でのアラニンおよび172番でのプロリンが公知の抗CD20抗体によるヒトCD20の認識に関与していることを示していた。公知の抗体B1、2H7、1F5およびリツキシマブの結合は、セリンへのこれらの残渣の突然変異によって抑止されていた。mAb2F2のヒトCD20への結合はA×P突然変異に対して非感受性であり、およびN163およびN166を含むCD20エピトープを表す。
CD20の発現を伴う疾病の治療についての抗CD20抗体の使用
リード抗CD20抗体候補を、ラモス静脈内後肢麻痺モデルにおいて評価した。Cragg MS, Glennie, MJ(2004年)「Blood」103:2738〜43ページ。より具体的には、CB17SCIDマウスに1×106ヒトラモスリンパ腫細胞を、尾静脈を経由して注射し、後肢麻痺の発症および生存度について評価した。動物のコホートを3つのリード候補抗CD20抗体で処理し、リツキシマブで処理したコホートをベンチマーク対照として確立した。それ故、7匹のマウスの6つのコホートの各々を、腫瘍細胞接種後15日間、抗体の0.05mg/kgの単一投与量のi.p.(腹腔内注入)で処理した。6つのコホートは以下のとおりであった:PBS(ビヒクル)対照、IgG1アイソタイプ対照抗体、リツキシマブ、および抗CD20抗体2.1.2、1.3.3、および1.1.2。中央値および全体生存度終点を監視した。注記:抗CD20mAb1.3.3の配列は、mAb1.5.3のものと同一であることが見出された。入手性の理由により、mAb1.3.3をmAb1.5.3についての代わりとして用いた。
皮下腫瘍モデルにおけるCD20に対してヒト抗体を用いる免疫療法
ダウディ皮下モデルにおける効力
mAb1.5.3およびリツキシマブでの免疫療法を、ダウディ(ATCC)腫瘍細胞を有するCB17SCIDマウスで評価した。簡潔には、CB17SCIDマウスを米国マサチューセッツ州ウィルミントン(Wilmington,MA,USA)のCharles River laboratoriesから入手し、病原体フリー条件で維持した。107ダウディ細胞を皮下注射し、腫瘍を形成させた。平均腫瘍サイズが200mm3に達したときに治療を開始した。各抗体、2.1.2、1.1.2、1.5.3およびリツキシマブを1mg/kgおよび5mg/kgの2投与量レベルでテストし、ビヒクル対照およびIgG1アイソタイプ対照と比較した。抗CD20抗体、アイソタイプ対照およびPBSビヒクル対照の投薬を腹腔内注入により週2回で3週間行い、腫瘍接種後18日目に開始した。
類似の実験設計を用いて、非ホジキンリンパ腫のナマルバモデルにおける抗CD20ヒト抗体の効力を評価した。107ナマルバ(ATCC)細胞を、Ncrヌードマウス(米国ニューヨーク州ゲルマンタウン(Germantown,NY,USA)のTaconics)の皮下に移植した。ナマルバ細胞は、低レベルのCD20を発現する高悪性度の腫瘍を形成した。腫瘍が、100mm3の平均サイズに達したときに治療を開始した。抗体を、抗CD20抗体の10および20mg/kgの投与量レベルでテストし、ビヒクル対照およびIgG1アイソタイプ対照と比較した。抗CD20抗体、アイソタイプ対照およびPBSビヒクル対照の投薬を腹腔内注入により週2回で3週間行い、腫瘍接種後9日目に開始した。図21および以下の表18に示されるとおり、リツキシマブおよびmAb1.5.3は、20mg/kgの最高投与量で同等であり、それぞれ78および73%(p<0.001)の腫瘍成長阻害をもたらす。しかしながら、10mg/kgの投与量で、1.5.3は、同一の投与量のリツキシマブより劇的に強力であった。リツキシマブは効果的ではなかったが、一方、mAb1.5.3は、65%腫瘍成長阻害(p<0.05)を未だ示した。
リツキシマブ−耐性細胞モデルにおける抗CD20ヒト抗体の効力もまた評価した。107RR1−ラージを、CB17SCIDレシピエントマウスの皮下に移植した。抗体を、1mg/kgおよび5mg/kgの2つの投与量レベルでテストし、ビヒクル対照およびIgG1アイソタイプ対照と比較した。抗CD20抗体、アイソタイプ対照およびPBSビヒクル対照の投薬を腹腔内注入により週2回で3週間行い、腫瘍接種後14日目に開始した。5mg/kgの濃度でのリツキシマブはRR1−ラージモデルにおいて有効であり、mAb1.5.3によって達成された62%に近似の59%腫瘍成長阻害をもたらした(図22)。週1mg/kgの投与量で、抗体1.5.3はリツキシマブより強力であるようにみられたが、差異は、統計学的有意性には到達していなかった(p=0.058)。
RR6−ラモスモデルを、次いでインビボで試した。107RR6−ラモス細胞を、CB17SCIDレシピエントマウスの皮下に移植した。マウスを1または5mg/kgの2.1.2、1.5.3またはリツキシマブで処理し、抗腫瘍効力をビヒクルPBS対照またはIgG1アイソタイプ対照と比較した。抗CD20抗体、アイソタイプ対照およびPBSビヒクル対照の投薬を腹腔内注入により週2回で3週間行い、腫瘍接種後14日目に開始した。図23および表20は、mAb2.1.2および1.5.3は腫瘍成長を、それぞれ、61%および59%で(p<0.05)阻害したことを実証しているが、リツキシマブはいずれの顕著な抗腫瘍効力もこのモデルにおいてはもたらさなかった。
CD20に対するヒト抗体での治療後の組織B細胞の欠乏
カニクイザルCD20およびヒトCD20の間のアミノ酸同一性/ホモロジーの程度は、多くの市販の抗ヒトCD20抗体はカニクイザルBリンパ球と交差反応するため、おそらく高い。試験の開始に先立って、循環Bリンパ球(CD20+細胞)の釣り合いのために合計で26匹の雄カニクイザルをスクリーニングした。分集団分布のいずれかの端の、CD20+細胞の極度/異例な罹患率を示す動物は排除した。24匹の動物をスクリーニングプロセスの結果選択し、体重で無作為抽出し、各々6匹の雄カニクイザルからなる3つのグループに割り当てた。14日間の順化期間に続いて、試験日1、8、および15に、グループを静脈内にビヒクル(グループ1、0mg/kg)、リツキシマブ(グループ2、10mg/kg)(陽性対照として)およびmAb1.5.3、10mg/kgで処理した。
非ホジキンリンパ腫のヒト患者が本願明細書に記載のmAb1.5.3で処理される。各患者は、毎週、50mg/m2〜2,250mg/m2の範囲の有効量の抗体で、4〜8週間投薬される。治療中に周期的に、各患者は、監視されて患者におけるリンパ腫細胞の数が判定される。mAb1.5.3での治療を受けている患者では、mAb1.5.3抗体が与えられていない対照患者と比してリンパ腫細胞の数が低減されることが見出された。
特許、特許出願、論文、教科書等、およびそれら中に引用された文献を含む本願明細書において引用したすべての文献は、既に引用されていない限りで、本願明細書においてそれらの全体が参照により援用される。
前述の明細書は、当業者が本発明を実施することができるために十分であると見なされている。前述の記載および実施例は本発明の一定の好ましい実施形態を詳述し、本発明者らによって予期される最良の形態を記載する。しかしながら、前述のものがどれほど詳細に文章で表現され得ているかにかかわらず、本発明は多くの方法で実施されることができ、および本発明は、添付の特許請求の範囲およびいずれかのそれらの均等物に従うと解釈されるべきであることが理解されるであろう。
Claims (38)
- CD20に結合し、且つGYSFTSYWIG(配列番号201)のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域1(CDR1)を含む標的結合剤。
- CD20に結合し、且つKISNRFS(配列番号202)のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域2(CDR2)を含む標的結合剤。
- CD20に結合する標的結合剤であって、前記標的結合剤は、標準CellTiterGlo生存度アッセイにおけるラモス細胞のアポトーシスを誘起するEC50が0.5μg/ml以下である標的結合剤。
- 前記標的結合剤は、標準CellTiterGlo生存度アッセイにおけるラモス細胞のアポトーシスを誘起するEC50が0.2μg/ml以下である、請求項3に記載の標的結合剤。
- 前記標的結合剤は、標準CellTiterGlo生存度アッセイにおけるラモス細胞のアポトーシスを誘起するEC50が0.02μg/ml以下である、請求項3に記載の標的結合剤。
- CD20に結合する標的結合剤であって、前記標的結合剤は、標準Alamar Blue生存度アッセイにおけるラモス細胞のアポトーシスを誘起するEC50が0.2μg/ml以下である標的結合剤。
- 前記標的結合剤は、標準Alamar Blue生存度アッセイにおけるラモス細胞のアポトーシスを誘起するEC50が0.09μg/ml以下である、請求項6に記載の標的結合剤。
- 前記標的結合剤は、標準Alamar Blue生存度アッセイにおけるラモス細胞のアポトーシスを誘起するEC50が0.04μg/ml以下である、請求項6に記載の標的結合剤。
- 前記標的結合剤は、CD20を発現する細胞におけるアポトーシスを誘起し、CD20を発現する細胞における抗体依存細胞傷害活性(ADCC)を誘起し、またはCD20を発現する細胞における補体依存性細胞傷害作用(CDC)を誘起する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の標的結合剤。
- 前記標的結合剤は、12nM未満のKdでCD20に結合する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の標的結合剤。
- 前記標的結合剤は、10nM未満のKdでCD20に結合する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の標的結合剤。
- 前記標的結合剤は、9nM未満のKdでCD20に結合する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の標的結合剤。
- 前記標的結合剤は、5nM未満のKdでCD20に結合する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の標的結合剤。
- 前記標的結合剤は、4nM未満のKdでCD20に結合する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の標的結合剤。
- 前記標的結合剤は、モノクローナル抗体1.1.2(ATCC受入番号PTA−7329)である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の標的結合剤。
- 前記標的結合剤は、モノクローナル抗体1.5.3(ATCC受入番号PTA−7330)である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の標的結合剤。
- 前記標的結合剤は、モノクローナル抗体2.1.2(ATCC受入番号PTA−7328)である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の標的結合剤。
- 前記標的結合剤は、配列番号2の配列を有する重鎖ポリペプチドを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の標的結合剤。
- 前記標的結合剤は、配列番号4の配列を有する軽鎖ポリペプチドを含む、請求項18に記載の標的結合剤。
- 前記標的結合剤は、配列番号30の配列を有する重鎖ポリペプチドを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の標的結合剤。
- 前記標的結合剤は、配列番号32の配列を有する軽鎖ポリペプチドを含む、請求項20に記載の標的結合剤。
- 前記標的結合剤は、配列番号46の配列を有する重鎖ポリペプチドを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の標的結合剤。
- 前記標的結合剤は、配列番号48の配列を有する軽鎖ポリペプチドを含む、請求項22に記載の標的結合剤。
- 薬剤的に許容可能なキャリアと連携した、請求項1〜8のいずれか一項に記載の標的結合剤。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の標的結合剤をコードする核酸分子。
- 請求項25に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項26に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 動物におけるB細胞リンパ腫を治療する方法であって、治療を必要とする前記動物に、治療的有効量の請求項1〜8のいずれか一項に記載の標的結合剤を投与するステップを含む方法。
- 前記B細胞リンパ腫が、非ホジキンリンパ腫(NHL)である、請求項28に記載の方法。
- 前記動物がヒトである、請求項28に記載の方法。
- 前記標的結合剤が、mAb1.1.2(ATCC受入番号PTA−7329)またはmAb1.5.3(ATCC受入番号PTA−7330)またはmAb2.1.2(ATCC受入番号PTA−7328)である、請求項28に記載の方法。
- 抗体、化学療法薬および放射性薬からなる群から選択される第2の剤を投与するステップをさらに含む、請求項28に記載の方法。
- 前記投与するステップが、従来の手術、骨髄幹細胞移植または末梢幹細胞移植と併せてまたはその後に行われる、請求項28に記載の方法。
- B細胞リンパ腫の治療のための薬剤の調製における請求項1〜8のいずれか一項に記載の標的結合剤の使用。
- 前記B細胞リンパ腫が非ホジキンリンパ腫(NHL)である、請求項34に記載の使用。
- 前記標的結合剤は、mAb1.1.2(ATCC受入番号PTA−7329)またはmAb1.5.3(ATCC受入番号PTA−7330)またはmAb2.1.2(ATCC受入番号PTA−7328)である、請求項34に記載の使用。
- 前記薬剤が、抗体、化学療法剤、または放射性薬からなる群から選択される第2の抗悪性腫瘍薬と組み合わせて用いられる、請求項34に記載の使用。
- 前記薬剤が、従来の手術、骨髄幹細胞移植または末梢幹細胞移植と併せてまたはその後に用いられる、請求項34に記載の使用。
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