CN117545781A - 靶向NKp46和CD38的双特异性抗体以及其使用方法 - Google Patents

靶向NKp46和CD38的双特异性抗体以及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了与NKp46和CD38特异性结合的双特异性抗体分子。本公开进一步涉及组合疗法，其包括所述双特异性抗体分子。所述双特异性抗体分子可以用于治疗、预防和/或诊断与表达NKp46和/或CD38的细胞相关的癌症或感染性病状或病症。

Description

靶向NKp46和CD38的双特异性抗体以及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年4月5日提交的美国临时申请第63/170,917号的优先权和权益，所述美国临时申请通过引用以其整体并入本文。
对以电子方式提交的序列表的引用
创建于2022年4月5日并且大小为44,213字节的命名为“CYTT-002_001WO_SeqListing_ST25.txt”的文本的内容通过引用以其整体并入本文。
背景技术
癌症免疫疗法用于产生和增强抗肿瘤免疫应答，例如，通过用对肿瘤细胞上的抗原具有特异性的抗体进行治疗、通过抗原呈递细胞与肿瘤细胞融合或通过对抗肿瘤NK细胞或T细胞进行特异性激活来产生和增强抗肿瘤免疫应答。在患者体内募集针对肿瘤细胞的免疫细胞的能力提供了一种对抗迄今为止被视为不可治愈的癌症类型和转移的治疗模式。
如自然杀伤(NK)细胞等淋巴细胞是有效的抗肿瘤效应子，其在先天性和适应性免疫中发挥重要作用。NK细胞上存在三种激活受体，即NKp30、NKp44和NKp46，这三种激活受体被统称为天然细胞毒性受体(NCR)。NKp46是确立的用于鉴定NK细胞的标志物。NKp46是存在于静止NK细胞和经激活的NK细胞两者中的NK细胞特异性触发分子。其是针对多种靶标进行NK细胞激活的重要介导子，所述多种靶标包含肿瘤和病毒感染的细胞。
将免疫细胞用于过继性细胞疗法仍然具有挑战性，并且尚未满足改进的需求。因此，在过继性免疫疗法中，仍有大量机会来利用NK细胞或其它淋巴细胞的全部潜能。提供另外的且更有效的特异性、安全和/或稳定的药剂单独、作为免疫构建体的一部分或与其它药剂组合来加强免疫系统的细胞，如NK细胞以攻击肿瘤细胞的需要未得到满足。因此，需要一种使得能够双靶向NK细胞上的NKp46和肿瘤细胞上的CD38，以治疗如多发性骨髓瘤和淋巴瘤等癌症的新型抗体和治疗剂。
发明内容
本公开提供了能够靶向NK细胞上的NKp46和肿瘤细胞上的CD38，以治疗癌症的抗体，所述癌症包含但不限于多发性骨髓瘤(MM)、淋巴瘤和白血病(例如，急性髓系白血病)。
本公开提供了一种与NKp46和CD38特异性结合的双特异性抗体，所述双特异性抗体包括：i)第一重链，所述第一重链包括重链互补决定区1(CDRH1)，所述CDRH1包括SEQ IDNO:17的氨基酸序列；重链互补决定区2(CDRH2)，所述CDRH2包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列；以及重链互补决定区3(CDRH3)，所述CDRH3包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列；ii)第一轻链，所述第一轻链包括轻链互补决定区1(CDRL1)，所述CDRL1包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列；轻链互补决定区2(CDRL2)，所述CDRL2包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列；以及轻链互补决定区3(CDRL3)，所述CDRL3包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列；iii)第二重链，所述第二重链包括CDRH1，所述CDRH1包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列；CDRH2，所述CDRH2包括SEQ IDNO:33的氨基酸序列；以及CDRH3，所述CDRH3包括SEQ ID NO:34的氨基酸序列；以及iv)第二轻链，所述第二轻链包括CDRL1，所述CDRL1包括SEQ ID NO:35的氨基酸序列；CDRL2，所述CDRL2包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列；以及CDRL3，所述CDRL3包括SEQ ID NO:37的氨基酸序列；并且其中所述双特异性抗体包括第一抗原结合区和第二抗原结合区，所述第一抗原结合区包括i)和ii)，所述第一抗原结合区与NKp46特异性结合，所述第二抗原结合区包括iii)和iv)，所述第二抗原结合区与CD38特异性结合。
在一些实施例中，所述第一重链包括第一重链可变区，所述第一重链可变区包括SEQ ID NO:23、25、27或29的氨基酸序列；所述第一轻链包括第一轻链可变区，所述第一轻链可变区包括SEQ ID NO:24、26、28或30的氨基酸序列；所述第二重链包括第二重链可变区，所述第二重链可变区包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列；并且所述第二轻链包括第二轻链可变区，所述第二轻链可变区包括SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述第一抗原结合区包括a)第一重链和第一轻链，所述第一重链包括第一重链可变区，所述第一重链可变区包括SEQ ID NO:23的氨基酸序列，所述第一轻链包括第一轻链可变区，所述第一轻链可变区包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列；b)第一重链和第一轻链，所述第一重链包括第一重链可变区，所述第一重链可变区包括SEQ IDNO:25的氨基酸序列，所述第一轻链包括第一轻链可变区，所述第一轻链可变区包括SEQ IDNO:26的氨基酸序列；c)第一重链和第一轻链，所述第一重链包括第一重链可变区，所述第一重链可变区包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列，所述第一轻链包括第一轻链可变区，所述第一轻链可变区包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列；或d)第一重链和第一轻链，所述第一重链包括第一重链可变区，所述第一重链可变区包括SEQ ID NO:29的氨基酸序列，所述第一轻链包括第一轻链可变区，所述第一轻链可变区包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述第二抗原结合区包括第二重链和第二轻链，所述第二重链包括第二重链可变区，所述第二重链可变区包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列，所述第二轻链包括第二轻链可变区，所述第二轻链可变区包括SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
在一些实施例中，a)所述第一重链包括第一重链可变区，所述第一重链可变区包括SEQ ID NO:23的氨基酸序列；所述第一轻链包括第一轻链可变区，所述第一轻链可变区包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列；所述第二重链包括第二重链可变区，所述第二重链可变区包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列；并且所述第二轻链包括第二轻链可变区，所述第二轻链可变区包括SEQ ID NO:39的氨基酸序列；b)所述第一重链包括第一重链可变区，所述第一重链可变区包括SEQ ID NO:25的氨基酸序列；所述第一轻链包括第一轻链可变区，所述第一轻链可变区包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列；所述第二重链包括第二重链可变区，所述第二重链可变区包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列；并且所述第二轻链包括第二轻链可变区，所述第二轻链可变区包括SEQ ID NO:39的氨基酸序列；c)所述第一重链包括第一重链可变区，所述第一重链可变区包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列；所述第一轻链包括第一轻链可变区，所述第一轻链可变区包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列；所述第二重链包括第二重链可变区，所述第二重链可变区包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列；并且所述第二轻链包括第二轻链可变区，所述第二轻链可变区包括SEQ ID NO:39的氨基酸序列；或者d)所述第一重链包括第一重链可变区，所述第一重链可变区包括SEQ ID NO:29的氨基酸序列；所述第一轻链包括第一轻链可变区，所述第一轻链可变区包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列；所述第二重链包括第二重链可变区，所述第二重链可变区包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列；并且所述第二轻链包括第二轻链可变区，所述第二轻链可变区包括SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述双特异性抗体包括融合的重链，所述融合的重链包括SEQID NO:41的氨基酸序列；第一轻链，所述第一轻链包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列；以及第二轻链，所述第二轻链包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述双特异性抗体包括至少两个具有不同CH1结构域和CL结构域的Fab片段，其中所述Fab片段包括：a)第一Fab片段，所述第一Fab片段由以下组成：i.与NKp46特异性结合的VH区和VL区；ii.人免疫球蛋白的CH1结构域，所述CH1结构域包括用谷氨酸残基对所述CH1结构域的位置192处的苏氨酸残基的取代；以及iii.人免疫球蛋白的CL-κ结构域，所述CL-κ结构域包括用赖氨酸残基对所述CL结构域的位置137处的天冬酰胺残基的取代以及用丙氨酸残基对所述CL结构域的位置114处的丝氨酸残基的取代；b)第二Fab片段，所述第二Fab片段由以下组成：免疫球蛋白的野生型人CH1结构域和野生型人CL结构域以及与CD38特异性结合的VH区和VL区；并且其中用于所述CH1结构域和所述CL结构域的序列位置编号参考Kabat编号，并且Fab片段是以任何顺序串联布置的，并且其中所述第一Fab片段的CH1结构域的C末端与下一个Fab片段的VH结构域的N末端连接是通过多肽接头。
在一些实施例中，所述多肽接头包括SEQ ID NO:9或44的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述双特异性抗体进一步包括c)免疫球蛋白的二聚化的CH2结构域和CH3结构域；以及d)IgA、IgG或IgD的铰链区，所述铰链区将抗原结合区的CH1结构域的C末端与所述CH2结构域的N末端连接。
在一些实施例中，所述双特异性抗体进一步包括进一步包括Fc结构域，所述Fc结构域衍生自IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域。在一些实施例中，所述Fc结构域区包括SEQID NO:15的氨基酸序列。在一些实施例中，所述Fc结构域区包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述双特异性抗体为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施例中，所述IgG抗体为IgG1抗体或IgG4抗体。
本公开还提供一种核酸序列，其编码本公开的双特异性抗体中的任一种双特异性抗体。
本公开还提供了一种多特异性抗体，其包括本公开的双特异性抗体的抗原结合区。
在一些实施例中，所述多特异性抗体与细胞因子融合或缀合。
本公开进一步提供了一种治疗、预防或延缓有需要的受试者的与异常CD38表达或活性相关的病理的进展的方法，所述方法包括施用有效量的本公开的双特异性抗体或多特异性抗体。
在一些实施例中，所述病理为癌症。在一些实施例中，所述癌症为多发性骨髓瘤。在一些实施例中，所述癌症为淋巴瘤。在一些实施例中，所述癌症为白血病(例如，慢性髓系白血病)。
本公开进一步提供了一种重定向有需要的受试者的NK细胞应答的方法，所述方法包括施用有效量的本公开的双特异性抗体或多特异性抗体。
在一些实施例中，所述NK细胞应答是NK介导的细胞毒性或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
本公开进一步提供了一种促进通过自然杀伤(NK)细胞使表达CD38+细胞的细胞进行特异性裂解的方法，所述方法包括使所述CD38+细胞与有效量的本公开的双特异性抗体或多特异性抗体接触，其中所述有效量是足以促进通过NK细胞使所述CD38+细胞进行特异性裂解的量。在一些实施例中，所述CD38+细胞是多发性骨髓瘤细胞。在一些实施例中，所述CD38+细胞是淋巴瘤细胞。在一些实施例中，所述接触步骤包括向患有多发性骨髓瘤或淋巴瘤或有风险患上多发性骨髓瘤或淋巴瘤的受试者施用所述双特异性抗体。
本公开进一步提供了一种抑制多发性骨髓瘤或淋巴瘤细胞或CD38+癌细胞在用根据权利要求1至15中任一项所述的双特异性抗体治疗的受试者体内的增殖的方法，所述方法包括施用有效量的自然杀伤(NK)细胞。在一些实施例中，所述方法包括施用有效量的自然杀伤(NK)细胞。
本公开进一步提供了一种用于治疗多发性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病(例如，急性髓系白血病)或CD38+癌的组合疗法或试剂盒，所述组合疗法或试剂盒包括NK细胞和本公开的双特异性抗体。
本公开进一步提供了一种与NK细胞组合的双特异性抗体用途。
本公开还提供了一种自然杀伤(NK)细胞和双特异性抗体用于治疗多发性骨髓瘤、淋巴瘤或CD38+癌的用途。
本公开还提供了一种试剂盒，其包括本公开的双特异性抗体。
在一些实施例中，所述NK细胞为诱导多能干细胞衍生的自然杀伤(iPSC-NK)细胞。在一些实施例中，所述CD38+癌症为多发性骨髓瘤或淋巴瘤。在一些实施例中，所述NK细胞为供体源性NK细胞。在一些实施例中，所述NK细胞为经照射的永生化NK细胞。
附图说明
图1A-1B示出了一系列流式细胞术直方图，其描绘了用小鼠抗NKp46单克隆抗体对表达人NKp46的细胞进行的染色。图1A示出了使用抗NKp46 mAb(9E2、461-G1、02、09、12)对BW亲本细胞与表达NKp46的BW经转染的细胞进行的FACs染色。填充的灰色直方图表示仅用BW亲本细胞的次级抗体进行的染色。BW NKp46转染子的背景相似，并且未示出。这些直方图与进行的6个实验中的一个代表性实验相对应。图1B示出了使用抗NKp46 mAb(9E2、461-G1、02、09、12)对原代经激活的大量人NK细胞进行的FACs染色。填充的灰色直方图表示仅用次级抗体对NK细胞进行的染色。这些直方图与进行的6个实验中的一个代表性实验相对应。
图2示出了一系列流式细胞术直方图，其描绘了在三种类型的细胞上对NKp46的检测。NKp46-Ig单独或与抗NKp46 mAb(9E2、461-G1、02、09、12)一起在4℃下预温育，之后用经预处理的NKp46-Ig对BJAB、MCF7和C1R细胞进行FACs染色。填充的灰色直方图表示仅用次级抗体对细胞进行的染色。这些直方图与进行的2个实验中的一个代表性实验相对应。
图3示出了一系列流式细胞术直方图，其显示出抗NKp46抗体结合后NKp46的表面表达下调。经激活的大量NK细胞培养物与指定的抗NKp46 mAb(9E2、461-G1、02、09、12)一起在4℃下温育。在37℃下处理的细胞的背景相似，并且未示出。这些直方图与进行的5个实验中的一个代表性实验相对应。
图4示出了用这些抗体对两种原代经激活的原代NK细胞进行的剂量应答FACS染色。使用抗NKp46 mAb(9E2、461-G1、02、09、12)对来自两种供体NK1和NK2的原代经激活的大量人NK细胞的FACs染色。填充的灰色直方图表示仅用次级抗体对NK细胞进行的染色。
图5示出了通过BIAcore测定确定的小鼠抗NKp46 mAb 09的结合亲和力。
图6示出了通过BIAcore测定确定的小鼠抗NKp46 mAb 12的结合亲和力。
图7A-7B示出了小鼠抗NKp46抗体相较于人源化抗NKp46抗体的可变区的氨基酸序列比对。图7A示出了重链可变区的氨基酸序列比对。图7B示出了κ轻链可变区的氨基酸序列比对。
图8示出了全长人NKp46、NKp46结构域I(D1)和NKp46结构域II(D2)。
图9示出了一系列直方图，其描绘了使用抗NKp46 mAb抗体对BW细胞、BW NKp46细胞和NK Fiji细胞上的NKp46的检测。测试了商用抗NKp46抗体(黑线)(百进公司(BioLegends，目录号331702))。
图10示出了一系列直方图，其描绘了使用人源化NKp46杂交瘤抗体对BW细胞、BWNKp46细胞和NK Fiji细胞上的NKp46的检测。
图11示出了描绘了与抗NKp46抗体和人源化NKp46杂交瘤抗体一起温育的细胞的激活和人NK细胞杀伤百分比的图表。PAR-R为对照抗体。GPC3为抗GPC3对照抗体。9E2为商用抗NKp46抗体。
图12示出了描绘了与抗NKp46抗体和人源化NKp46杂交瘤抗体一起温育后对HepG2细胞进行的人NK细胞杀伤的百分比的图表。
图13A-13B示出了本公开的双特异性抗体分子或NK衔接子双特异性抗体的示意图。图13A示出了双特异性抗体的结构的示意图。在一些情况下，Mab1为抗NKp46 Fab；Mab2为抗CD38 Fab；接头为多肽接头；铰链1和铰链2为人IgG1或IgG4铰链；Fc区为人IgG1或人IgG4 Fc区。Fab片段具有位于CH1结构域和CL结构域的界面处的防止重链和轻链错配的突变(用圆圈表示)。图13B示出了与在NK细胞上表达的NKp46和在肿瘤细胞的表面上表达的肿瘤抗原(TA)，如CD38结合的双特异性抗体分子或NK衔接子双特异性抗体的示意图。双特异性抗体与两种表面抗原结合引起NK细胞介导的细胞毒性。
图14示出了NKE2与多发性骨髓瘤细胞系的剂量依赖性结合。
图15A-15B示出了NKE2分别与BW亲本细胞和经人Nkp46转染的BW细胞的结合。
图16示出了通过CD38丙氨酸扫描诱变进行的NKE2表位制图分析的结果。
图17A-17C示出了用NKE2对多发性骨髓瘤细胞系KMS11(图17A)、MM.1S(图17B)和MM.1S(图17C)进行的剂量依赖性PBNK再定向细胞溶解。
图18A和18B示出了针对多发性骨髓瘤MM.1S细胞进行的PB-NK细胞再定向的细胞溶解、脱粒和细胞因子产生。图18A示出了利用NKE2、达雷妥尤单抗(Daratumumab)或单个CD38和NKp46 mAb针对多发性骨髓瘤MM.1S细胞进行的PB-NK细胞再定向的细胞溶解和脱粒。图18B示出了在NKE2、达雷妥尤单抗或单个CD38和NKp46 mAb的情况下IFN-γ和TNF-α产生性PBNK细胞的比例。
图19A-19C示出了在人PBMC中在体外利用野生型和突变体NKE2得到的免疫亚群耗竭的丧失和低水平的NK细胞自相残杀和细胞因子释放。图19A示出了在存在NKE2、达雷妥尤单抗或人IgG的情况下对PBNK进行的NK细胞自相残杀。图19B示出了利用NKE2、达雷妥尤单抗或hIgG1进行的人PBMC免疫细胞亚群耗竭。图19C示出了来自与NKE2、抗CD3或CD28 mAb(TGN1412)或hIgG1一起温育后的人PBMC的细胞因子释放。
具体实施方式
本公开提供了与人自然杀伤受体NKp46和CD38结合的双特异性抗体以及其抗原结合片段。具体地，所述双特异性抗体包含第一抗原结合区和第二抗原结合区，所述第一抗原结合区与在NK细胞的表面上表达的NKp46特异性结合，所述第二抗原结合区与在肿瘤细胞上表达的CD38特异性结合。在本公开的上下文中，提供了以下定义。
定义
除非在本文另外定义，否则与本发明结合使用的科学术语和技术术语应该具有本领域的普通技术人员通常所理解的含义。另外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包含复数，并且复数术语应包含单数。通常，与本文所描述的细胞和组织培养、分子生物学以及蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交结合使用的术语表和其技术是本领域众所周知和常用的术语表和技术。可以将标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质体转染)。根据制造商的说明或如本领域通常实现的或如本文所描述来进行酶促反应和纯化技术。前述技术和程序通常根据本领域熟知的常规方法并且如在整个本说明书中引用和讨论的各种一般的和更具体的参考文献中所描述那样进行。参见，例如Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:实验室手册》(第2版,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.)(1989))。与本文所描述的分析化学、合成有机化学以及药物和制药化学相关使用的命名法以及实验室程序和技术都是本领域中众所周知且常用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、调配和递送以及对患者的治疗。
如根据本公开所用，除非另外指示，否则以下术语应理解为具有以下含义：
如在说明书和权利要求中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”以及“所述(the)”包含复数参考物，除非上下文中另外明确指明。例如，术语“细胞”包含多种细胞，包含其混合物。
如本文所使用的，向受试者或受试者“施用”药剂(例如，抗NKp46和抗CD38双特异性抗体)包含向受试者引入或递送化合物以发挥其预期功能的任何途径。合适的给药调配物和施用药剂的方法在本领域是已知的。还可以确定施用途径，并且确定最有效的施用途径的方法对本领域的技术人员来说已知的，并且将随用于治疗的组合物、治疗目的、所治疗的受试者的健康状况或疾病阶段以及靶细胞或组织而变化。施用途径的非限制性实例包含肠胃外、肠内和局部施用途径。施用包含自我施用和由他人施用。还应理解，如所描述的医疗病状的各种治疗或预防模式旨在表示“基本的”，其包含完全治疗或预防但也包含不太完全的治疗或预防，并且其中实现了一些生物学或医学相关的结果。
如本文所用，术语“动物”是指活的多细胞脊椎动物生物体，即包含例如哺乳动物和鸟类的类别。术语“哺乳动物”包含人和非人哺乳动物。类似地，术语“受试者”或“患者”包含人和兽医受试者，例如人、非人灵长类动物、狗、猫、羊、小鼠、马和牛。
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即含有与抗原特异性结合(与抗原发生免疫反应)的抗原结合位点的分子。“特异性结合”或“与...发生免疫反应”或“免疫特异性结合”意指抗体与期望抗原的一个或多个抗原决定簇发生反应并且不与其它多肽发生反应或以低得多的亲和力(KD>10-6M)结合。抗体包含但不限于多克隆、单克隆、嵌合、dAb(结构域抗体)、单链、Fab、Fab'和F(ab')2片段、scFv和Fab表达文库。具有高亲和力的抗体，如本文所述的抗体的亲和力(KD)为约0.01-25nM或更低。
已知碱性抗体结构单元包括四聚体。每个四聚体由两个相同的多肽链对构成，每对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包含主要负责抗原识别的由约100个至110个或更多个氨基酸构成的可变区。每条链的羧基末端部分限定主要负责效应功能的恒定区。通常，从人体中获得的抗体分子涉及类别IgG、IgM、IgA、IgE和IgD中的任一种，这些类别因分子中存在的重链的性质而彼此不同。某些类别也具有亚类，如IgG1、IgG2等。此外，在人体中，轻链可以是κ链或λ链。
如本文所用的术语“单克隆抗体”(MAb)或“单克隆抗体组合物”是指含有由独特轻链基因产物和独特重链基因产物组成的抗体分子的仅一个分子物种的抗体分子群体。具体地，在群体中的所有分子中，单克隆抗体的互补决定区(CDR)是相同的。MAb含有能够与抗原的其特征在于对其具有独特结合亲和力的特定表位免疫反应的抗原结合位点。
术语“抗原结合区”、或“抗原结合位点”或“结合部分”是指免疫球蛋白分子的参与抗原结合的部分。抗原结合位点由重链(“H”)和轻链(“L”)的N末端可变区(“V”)的氨基酸残基形成。重链和轻链的V区内的三个高度趋异的延伸段(被称为“高变区”)插置在更保守的侧翼延伸段(被称为“框架区”或“FR”)之间。因此，术语“FR”是指天然存在于免疫球蛋白中的高变区之间并且邻近所述高变区的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此安置以形成抗原结合表面。抗原结合表面与所结合抗原的三维表面互补，并且重链和轻链中的每一者的三个高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。本领域已知用于对抗体的氨基酸序列进行编号并且鉴定互补决定区的各种方法。例如，Kabat编号系统(参见Kabat,E.A.等人,《免疫相关蛋白序列(Sequences of Protein of ImmunologicalInterest)》,第5版(1991))或IMGT编号系统(可在www.imgt.org在线获得)。作为本领域用于确定编码序列中的氨基酸位置、等位基因的比对并且轻松比较来自所有脊椎动物物种的免疫球蛋白(IG)和T细胞受体(TR)中的序列的可靠且准确的系统，IMGT编号系统被常规使用并接收。IMGT数据的准确性和一致性基于IMGT-ONTOLOGY，这是首个并且迄今为止唯一的用于免疫遗传学和免疫信息学的本体(Lefranc.M.P.等人,《生物分子(Biomolecules)》,2014年12月；4(4),1102-1139)。IMGT工具和数据库是针对由大型序列存储库构建的IMGT参考目录运行的。在IMGT系统中，IG V结构域和IG C结构域是在适当时考虑外显子划分来划分的。因此，更多数据可用于IMGT数据库，IMGT外显子编号系统可以由并且“由”本领域的技术人员用于可靠地确定编码序列中的氨基酸位置和等位基因的比对。此外，IMGT唯一编号与其它编号(即，Kabat)之间的对应性可在IMGT科学图表(Lefranc.M.P.等人,《生物分子》,2014年12月；4(4),1102-1139)中获得。
术语“高变区”或“可变区”是指抗体的通常负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，当根据Kabat编号系统；Kabat等人,《免疫相关蛋白序列》,第5版(1991)编号时VL中的约残基24-34(LI)、50-56(L2)和89-97(L3)以及VH中的约31-35(HI)、50-65(H2)和95-102(H3))；和/或来自“高变环”的那些残基(例如，当根据Chothia编号系统；Chothia和Lesk,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196:901-917(1987)编号时VL中的残基24-34(LI)、50-56(L2)和89-97(L3)以及VH中的26-32(HI)、52-56(H2)和95-101(H3))；和/或来自“高变环”VCDR的那些残基(例如，当根据IMGT编号系统；Lefranc.M.P.等人,《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》,27:209-212(1999)；Ruiz,M.等人《核酸研究》28:219-221(2000)编号时，VL中的残基27-38(LI)、56-65(L2)和105-120(L3)以及VH中的27-38(HI)、56-65(H2)和105-120(H3))。任选地，当根据AHo；Honneger,A.和Plunkthun,A.《分子生物学杂志》309:657-670(2001))编号时，抗体在以下点中的一个或多个点处具有对称插入：VL中的28、36(LI)、63、74-75(L2)和123(L3)以及VH中的28、36(HI)、63、74-75(H2)和123(H3)。
“抗体片段”或“抗原结合片段”包含蛋白水解抗体片段(如本领域已知的F(ab')2片段、Fab'片段、Fab'-SH片段和Fab片段)、重组抗体片段(如sFv片段、dsFv片段、双特异性sFv片段、双特异性dsFv片段、F(ab)'2片段、单链Fv蛋白(“scFv”)、二硫稳定Fv蛋白(“dsFv”)、双抗体和三抗体(如本领域已知的)、和骆驼抗体(例如，参见美国专利第6,015,695号；第6,005,079号；第5,874,541号；第5,840,526号；第5,800,988号；以及第5,759,808号)。scFv蛋白是一种其中免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区通过接头结合的融合蛋白，而在dsFv中，链已经发生突变以引入二硫键以稳定链的缔合。
如本文所用，术语“抗原”是指可以通过特异性体液或细胞免疫的产物特异性结合的化合物、组合物或物质，如抗体分子或T细胞受体。抗原可以是任何类型的分子，包含例如半抗原、简单中间代谢物、糖(例如，寡糖)、脂质和激素以及大分子，如复合碳水化合物(例如，多糖)、磷脂和蛋白质。常见的抗原类别包含但不限于病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原生动物和其它寄生虫抗原、肿瘤抗原、参与自身免疫性疾病、过敏和移植排斥的抗原、毒素和其它杂项抗原。
如本文所使用的，术语“表位”包含能够与免疫球蛋白、scFv或T细胞受体特异性结合的任何蛋白决定簇。术语“表位”包含能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的任何蛋白决定簇。表位决定簇通常由如氨基酸或糖侧链等分子的化学活性表面基团组成，并且通常具有特定三维结构特特性以及特定电荷特性。例如，可以产生针对多肽的N末端或C末端肽的抗体。
如本文所用，术语“免疫结合”和“免疫结合特性”是指存在于免疫球蛋白分子与免疫球蛋白对其具有特异性的抗原之间的类型的非共价相互作用。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以在相互作用的解离常数(Kd)方面表达，其中更小的Kd表示更大的亲和力。所选多肽的免疫结合特性可以使用本领域中众所周知的方法进行定量。一种此类方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中那些速率取决于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲和力以及在两个方向上同等地影响速率的几何参数。因此，可以通过计算缔合和解离的浓度和实际速率来确定“缔合速率常数”(Kon)和“解离速率常数”(Koff)。(参见《自然(Nature)》361:186-87(1993))。Koff/Kon的比率实现消除与亲和力无关的所有参数，并且因此等于解离常数Kd。(通常参见Davies等人,(1990)《生物化学年鉴(Ann RevBiochem)》59:439-473)。当平衡结合常数(Kd)≤1μM，例如，≤100nM，优选地≤10nM，并且更优选地≤1nM时，本发明的抗体是与其靶标特异性结合，如通过如生物层干涉测定等测定或本领域的技术人员已知的类似测定测量的。
如本文所用，“结合亲和力”是指一个分子与另一个分子结合(通常非共价地)的倾向性，如特定结合对的成员对特定结合对的另一成员的倾向性。结合亲和力可以作为解离常数进行测量，对于特定结合对(如抗体/抗原对)来说，所述解离常数可以低于1×10-5M、低于1×10-6M、低于1×10-7M、低于1×10-8M、低于1×10-9M、低于1×10-10M、低于1×10-11M或低于1×10-12M。一方面，结合亲和力是通过修改Frankel等人,《分子免疫学(Mol.Immunol.)》,16:101-106,1979描述的Scatchard方法来计算的。另一方面，结合亲和力是通过结合常数测量的。另一方面，结合亲和力是通过抗原/抗体解离速率测量的。另一方面，高结合亲和力是通过竞争放射免疫测定测量的。
如本文所用，术语“分离的多核苷酸”应意指基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸或其某种组合，由于其来源，“分离的多核苷酸”(1)不与多核苷酸的全部或一部分缔合，其中“分离的多核苷酸”存在于自然界中，(2)与其在自然界中未连接的多核苷酸连接，或(3)作为较大序列的一部分不存在于自然界中。根据本发明的多核苷酸包含编码重链免疫球蛋白分子的核酸分子和编码本文所述的轻链免疫球蛋白分子的核酸分子。
本文提及的术语“分离的蛋白质”是指cDNA、重组RNA或合成来源的蛋白质或其某种组合，由于其起源或衍生来源，所述“分离的蛋白质”(1)未与存在于自然界中的蛋白质缔合，(2)不含来自相同来源的其它蛋白质，例如，不含海洋蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)不存在于自然界中。
术语“多肽”在本文中用作通用术语以指代多肽序列的天然蛋白质、片段或类似物。因此，天然蛋白质片段和类似物是多肽属的物种。根据本发明的多肽包括本文所述的重链免疫球蛋白分子和轻链免疫球蛋白分子，以及由包括重链免疫球蛋白分子与轻链免疫球蛋白分子，如κ轻链免疫球蛋白分子组合形成的抗体分子，反之亦然，以及其片段和类似物。
如本文所用，短语“天然存在的”在应用于对象时是指对象可以存在于自然界中的事实。例如，存在于可以从自然界中的来源中分离并且在实验室中没有被人有意修饰的生物体(包含病毒)中的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指如此描述的组分的位置处于允许所述组分按其预期方式起作用的关系。与编码序列“可操作地连接的”控制序列以这样的方式连接，即在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
如本文所用，术语“控制序列”是指影响其所连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。这类控制序列的性质因宿主生物体而不同，在原核生物中，这类控制序列通常包含启动子、核糖体结合位点和转录终止序列，在真核生物中，通常这类控制序列包含启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在至少包含其存在对表达和加工至关重要的组分，并且还可以包含其存在有利的另外的组分，例如前导序列和融合配偶体序列。如本文提到的，术语“多核苷酸”通常意指长度为至少10个碱基的核苷酸、核糖核苷酸或脱氧核苷酸或者是任一类型的核苷酸的经修饰形式的聚合物硼。所述术语包含DNA的单链和双链形式。
如本文所使用的，二十种常规氨基酸和其缩写遵循常规用法。参见《免疫学-合成(Immunology-A Synthesis)》(第2版,E.S.Golub和D.R.Gren编辑,马萨诸塞州桑德兰的Sinauer Associates出版社(Sinauer Associates,Sunderland Mass.)(1991))。二十种常规氨基酸、非天然氨基酸，如经α-、α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)也可以是本发明的多肽的合适组分。非常规氨基酸的实例包含：4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其它类似的氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。在本文所使用的多肽符号中，根据标准使用和惯例，左手方向是氨基末端方向，并且右手方向是羧基末端方向。
如应用于多肽的，术语“显著同一性”意指两个多肽序列在如使用默认空位权重通过程序GAP或BESTFIT进行最佳比对时共享至少80％序列同一性，优选地至少90％序列同一性，更优选地至少95％序列同一性，并且最优选地至少99％序列同一性。
优选地，不相同的残基位置因保守性氨基酸取代而不同。
“保守氨基酸取代”是指具有类似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；并且具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守氨基酸取代基是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
如本文所讨论的，设想本发明涵盖抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列的微小变化，条件是氨基酸序列的变化保持至少75％，更优选地至少80％、90％、95％，并且最优选地保持99％。具体地，设想了保守氨基酸替代。保守替代是那些发生在其侧链中相关的氨基酸家族内的取代。经基因编码的氨基酸通常被划分为四个家族：(1)酸性氨基酸为天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸为赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；并且(4)未带电的极性氨基酸为甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。亲水性氨基酸包含精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸。疏水性氨基酸包含丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸。其它氨基酸家族包含(i)丝氨酸和苏氨酸，所述丝氨酸和苏氨酸为脂肪族羟基家族；(ii)天冬酰胺和谷氨酰胺，所述天冬酰胺和谷氨酰胺为含酰胺的家族；(iii)丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，所述丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸为脂肪族家族；以及(iv)苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，所述苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸为芳香族家族。例如，可以合理地预期，异亮氨酸或缬氨酸对亮氨酸、谷氨酰胺对天冬氨酸、丝氨酸对苏氨酸的单独替代或结构上相关的氨基酸对一种氨基酸的类似替代对所产生的分子的结合或特性将不会产生重大影响，在替代不涉及框架位点内的氨基酸的情况下尤其如此。氨基酸改变是否产生功能性多肽可以通过测定多肽衍生物的比活性来容易地确定。测定在本文更详细地描述。本领域的普通技术人员可以容易制备抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物。片段或类似物的优选氨基末端和羧基末端存在于功能性结构域的边界附近。可以通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或专用序列数据库进行比较来鉴定结构性结构域和功能性结构域。优选地，使用计算机化的比较方法以鉴定存在于已知结构和/或功能的其它蛋白质中的序列基序或预测的蛋白质构象结构域。用于鉴定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。Bowie等人,《科学(Science)》253:164(1991)。因此，前述实例表明，根据本发明，本领域的那些技术人员可以识别可以用于限定结构性结构域和功能性结构域的序列基序和结构构象。
优选氨基酸取代为以下的那些：(1)降低对蛋白水解的易感性；(2)降低对氧化的易感性；(3)改变结合亲和力，以形成蛋白质复合物；(4)改变结合亲和力；和/或(4)赋予或修饰此类类似物的其它生理化学或功能特性。类似物可以包含序列的各种突变蛋白质，而非天然存在的肽序列。例如，可以在天然存在的序列中(优选地，在多肽的位于形成分子间接触的结构域之外的部分中)进行单个或多个氨基酸取代(优选地，保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代不应显著改变亲本序列的结构特性(例如，替代氨基酸不应倾向于破坏存在于亲本序列中的螺旋，或破坏表征亲本序列的其它类型的二级结构)。本领域公认的多肽二级和三级结构的实例描述于：《蛋白质、结构和分子原理(Proteins,Structures andMolecular Principles)》(Creighton,编辑,纽约的W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman andCompany,New York)(1984))；《蛋白质结构概论(Introduction to Protein Structure)》(C.Branden和J.Tooze,编辑,纽约州纽约的兰登书屋出版公司(Garland Publishing,NewYork,N.Y.)(1991))；和Thornton等人《自然》354:105(1991)。
如本文所用，术语“标记”或“标记的”是指并入可检测标志物，例如，通过并入放射性标记的氨基酸或附接到可以通过标志的亲和素检测到的生物素基部分的多肽(例如，含有荧光标志物或可以通过光学或量热方法检测到的酶活性的链霉亲和素)。在某些情况下，标记或标志物还可以是治疗性的。本领域已知并且可以使用标记多肽和糖蛋白的各种方法。用于多肽的标记的实例包含但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标记(例如，FITC、罗丹明、镧系磷)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、对半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光、生物素基、次级报告子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、次级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施例中，标记通过各种长度的间隔子臂附接，以减少潜在的空间位阻。本文使用的术语“药剂或药物”是指在适当地施用于患者时能够诱导期望的治疗效果的化学化合物或组合物。
本文的其它化学术语根据本领域的常规用法使用，如通过以下所例示的：“《麦格劳-希尔化学术语词典(The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms)》”,Parker,S.编辑,旧金山的麦格劳-希尔公司(McGraw-Hill,San Francisco)(1985))。
如本文所用，“基本上纯的”意指目标物种是存在的主要物种(即，以摩尔为基础，其在其组合物中比任何其它单独物种更充足)，并且优选地基本上经纯化的级分是其中目标物种占存在的所有大分子物种的至少约50％(以摩尔为基础)的组合物。
通常，基本上纯的组合物将占组合物中存在的所有大分子物种的多于约80％，更优选地，多于约85％、90％、95％和99％。最优选地，将目标物质纯化至基本上均质(在组合物中通过常规检测方法不可以检测到污染物物种)，其中组合物基本上由单一大分子物种组成。
可互换使用并且呈单数或复数形式的术语“癌症”、“赘生物”和“肿瘤”是指经历了使其对宿主生物体具有病理性的恶性转化的细胞。可以根据本公开的方法治疗的癌症的非限制性实例包含血液病恶性肿瘤和实体瘤。癌症的非限制性实例包含多发性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病(例如，AML)。
如本文所用，“治疗(treating)”或“治疗(treating)”受试者的疾病是指(1)防止易患或尚未表现出疾病的症状的受试者发生症状或疾病；(2)抑制疾病或者阻止疾病的发展；(3)改善或者使疾病或疾病的症状消退。如本文所用，“治疗”是用于获得有益或期望的结果，包含临床结果的方法。出于本公开的目的，有益的或期望的临床结果可以包含一种或多种但不限于一种或多种症状减轻或缓解、病状程度(包含疾病)降低、病状(包含疾病)状态稳定(即，未恶化)、病状(包含疾病)延缓或减慢、进展、病状(包含疾病)改善或缓和、状态和缓解(无论是部分的还是全部的)，无论是可检测到的还是不可检测的。优选的是有效并且可以以非常低的剂量施用，由此使全身性不良影响最小化的化合物。
抗NKp46和抗CD38双特异性抗体
公开的双特异性抗体优于本领域的那些双特异性抗体，因为其靶向用于接合NK细胞的NKp46，而不是其它NK细胞标志物，如CD16和NKG2D。重要的是，NKp46表达通常保持在具有下调的CD16和NKG2D的实体瘤中。如此，本公开的双特异性抗体可以比本领域已知的靶向其它较低表达标志物的其它双特异性抗体疗法更有效。此外，NKp46对NK细胞更具特异性。相反，NKG2D通过T细胞广泛表达，从而在使用双特异性靶向时，导致如细胞因子释放综合征(CRS)等毒性。因此，本公开的双特异性抗体比本领域已知的靶向其它NK细胞标志物的其它双特异性抗体的安全性谱更好。
本公开的双特异性抗体与NKp46膜近侧结构域(D2结构域)特异性结合，这是有利的，因为其不阻断NKp46与其配体的相互作用。双特异性抗体不会内化或降解NKp46受体，并且因此可以用于在各种疗法中募集NK细胞。
因此，双特异性抗体可用于癌症免疫疗法，并且还可以用于癌症诊断。
人自然杀伤受体NKp46
如本文所用，术语“NKp46”是指自然杀伤蛋白46，其还被称为自然细胞毒性触发受体1(NCR1)或CD335。NKp46是存在于静止NK细胞和经激活的NK细胞两者中的NK细胞特异性触发分子(Sivori等人,1997)。其是针对多种靶标进行NK细胞激活的重要介导子，所述多种靶标包含肿瘤和病毒感染的细胞(Moretta等人,2001)。NKp46是NK细胞上具有小鼠同源物的唯一受体，表示为NCR1(Biassoni等人,1999)。NKp46是确立的用于鉴定NK细胞的标志物(Koch等人,2013)。
NKp46具有两个Ig样胞外结构域(D1和D2)以及之后的一个约40个残基的茎区、一个I型跨膜结构域和一个短细胞质尾部。NKp46是参与消除HCV和其它病毒感染的细胞的主要NK细胞激活受体，并已显示出调节NK细胞与其它免疫细胞，包含T细胞和树突状细胞(DC)的相互作用。根据本发明的示例性NKp46以UniProt和GenBank符号或登录号说明：UniProtKB-076036(NCTR1_人)和基因ID：9437。NKp46具有两个Ig样胞外结构域(D1和D2)以及之后的一个约40个残基的茎区、一个I型跨膜结构域和一个短细胞质尾部。D2结构域(或NKp46D2)，其包括134个氨基酸残基(对应于同种型a的全长蛋白的残基121-254)。
根据本发明的双特异性抗体或其抗原结合片段与NKp46中的表位结合。具体地，抗体与NKp46蛋白的D2结构域内的表位结合。
CD38
如本文所用，术语“CD38”和“CD38抗原”可互换使用，并且包含由细胞天然表达或在用CD38基因转染的细胞上表达的人CD38的任何变体、同种型和物种同源物。如本领域所公认的，CD38的同义词包含ADP核糖环化酶1、cADPr水解酶1、Cd38-rsl、环ADP核糖水解酶1,1-19、NIM-R5抗原。示例性人CD38的完整氨基酸序列Genbank/NCBI登录号NP_001766.2(UniProtID编号P28907)。
CD38是在受体介导的粘附和信号传导以及通过其外酶促活性介导钙动员、催化环ADP核糖(cADPR)和ADPR的形成方面具有功能的多功能蛋白。CD38介导细胞因子分泌和淋巴细胞的激活和增殖(Funaro等人,《免疫学杂志(J Immunolog)》145:2390-6,1990；Terhorst等人,《细胞(Cell)》771-80,1981；Guse等人,《自然》398:70-3,1999)。CD38通过其NAD糖水解酶活性还调节胞外NAD+水平，这与调节调节性T细胞区室有关(Adriouch等人,14:1284-92,2012；Chiarugi等人,《自然综述(Nature Reviews)》12:741-52,2012)。除了通过Ca2+进行信号传导外，CD38信号传导还通过与T细胞和B细胞上的抗原受体复合物或其它类型的受体复合物，例如，MHC分子的交互从而使CD38参与几种细胞应答但还参与IgG1的切换和分泌来发生。
CD38是一种在造血细胞，如髓状胸腺细胞、经激活的T细胞和B细胞、静止NK细胞和单核细胞、淋巴结生发中心淋巴母细胞、浆B细胞、滤泡内细胞和树突状细胞上表达的II型跨膜糖蛋白。正常骨髓细胞，具体地前体细胞和脐带细胞的一部分呈CD38阳性。除淋巴样前体细胞外，CD38在红细胞和血小板上表达，并且表达还存在于一些实体组织，如肠、脑、前列腺、骨和胰腺中。成熟的静止T细胞和B细胞限于非表面CD38进行表达。
CD38还在多种恶性血液病中表达，所述恶性血液病包含多发性骨髓瘤、白血病和淋巴瘤，如B细胞慢性淋巴细胞白血病、T细胞和B细胞急性淋巴细胞白血病、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、原发性系统性淀粉样变性、套细胞淋巴瘤、前淋巴细胞/髓细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、大颗粒淋巴细胞(LGL)白血病、AML、NK细胞白血病和浆细胞白血病。已描述了CD38的表达在不同来源的上皮/内皮细胞上，包含前列腺中的腺上皮、胰腺中的胰岛细胞、腺体中的导管上皮(包含腮腺)、支气管上皮细胞、睾丸和卵巢中的细胞以及结直肠腺癌中的肿瘤上皮。可能涉及CD38表达的其它疾病包含例如肺部的支气管上皮癌、乳腺癌(从乳腺的导管和小叶中的上皮衬里的恶性增殖演变而来)、从β-细胞演变而来的胰腺肿瘤(胰岛素瘤)、从肠道中的上皮演变而来的肿瘤(例如，腺癌和鳞状细胞癌)、前列腺中的癌症以及睾丸中的精原细胞瘤和卵巢癌。在中枢神经系统中，神经母细胞瘤表达CD38。
双特异性抗体
本公开的双特异性抗体具有一个对NKp46具有特异性的抗原结合区和一个对CD38具有特异性的第二抗原结合区。
虽然本文提供下面的抗体序列作为实例，但应理解，这些序列可以用于使用各种本领域公认的技术中的任何技术来产生双特异性抗体。双特异性形式的实例包含但不限于基于Fab臂交换的双特异性IgG(Gramer等人,2013《Mab》5(6))；CrossMab形式(Klein C等人,2012《Mab》4(6))；基于SEED技术等强制异源二聚化方法的多种形式(Davis JH等人,2010《蛋白质工程、设计和选择(Protein Eng Des Sel.)》23(4):195-202)；静电转向(Gunasekaran K等人,《生物化学杂志(J Biol Chem.)》2010 285(25):19637-46)或旋钮入孔(Ridgway JB等人,《蛋白质工程化(Protein Eng.)》1996 9(7):617-21.)或防止同二聚体形成的突变的其它集合(Von Kreudenstein TS等人,2013《Mab》5(5):646-54.)；基于片段的双特异性形式，如串联scFv(如BiTE)(Wolf E等人,2005《今日药物发现(DrugDiscov.Today)》10(18):1237-44.)；双特异性四价抗体(Portner LM等人,2012《癌症免疫学免疫疗法(Cancer Immunol Immunother.)》61(10):1869-75.)；双亲和力再靶向分子(Moore PA等人,2011《血液(Blood.)》117(17):4542-51)；双抗体(Kontermann RE等人,《自然生物技术(Nat Biotechnol.)》1997 15(7):629-31)。
双特异性或多特异性衔接子为由不同抗体的两个或更多个单链可变片段(scFv)组成的融合蛋白，其中至少一个scFv与效应细胞表面分子结合，并且至少另一个scFv通过肿瘤特异性表面分子与肿瘤细胞结合。
可以用于双特异性或多特异性衔接子识别或偶联的示例性NK细胞表面分子包含但不限于CD3、CD28、CD5、CD16、NKG2D、CD64、CD32、CD89、NKG2C。
用于双特异性或多特异性衔接子识别的示例性肿瘤细胞表面分子包含但不限于GPC3、B7H3、BCMA、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD44、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD179b、CEA、CLEC12A、CS-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、FLT-3、FOLR1、FOLR3、GD2、gpA33、HER2、HM1.24、LGR5、MSLN、MCSP、MICA/B、PSMA、PAMA、P-cadherin、ROR1。
在一些实施例中，双特异性抗体进一步包括位于效应细胞与肿瘤细胞抗原结合结构域之间的接头，例如作为效应NK细胞的用于促进效应细胞扩增的接头的经修饰的IL15(在一些公开案中被称为TriKE，或三特异性杀伤衔接子)。在一个实施例中，TriKE为NKp46-IL15-CD38。
在一些实施例中，双特异性或多特异性衔接子的表面触发受体对于效应细胞可以是内源性的，这有时取决于细胞类型。在一些其它实施例中，一种或多种外源性表面触发受体可以使用本文提供的方法和组合物，即通过对iPSC进行额外工程化，随后将iPSC的分化定向到包括与源iPSC相同的基因型和表面触发受体的T、NK或任何其它效应细胞而被引入到效应细胞中。
在一些实施例中，双特异性形式包含但不限于PCT申请第WO2013005194号以及美国专利第US 9,631,031号和第US10,815,310号中描述的双特异性抗体形式，所述文献中的每一个都通过引用以其整体并入。本文中用于CH1和CL结构域的序列位置编号参考Kabat编号(Kabat,E.A.等人,《免疫相关蛋白序列》第5版—美国卫生和人类服务部(USDepartmentof Health and Human Services),NIH出版物n°91-3242,第662、680、689页,1991)。本发明的双特异性抗体是经突变Fab片段，所述经突变Fab片段选自以下：a)由以下组成的Fab片段：所关注抗体的VH结构域和VL结构域；CH1结构域，所述CH1结构域从免疫球蛋白的CH1结构域通过用谷氨酸残基取代所述CH1结构域的位置192处的苏氨酸残基衍生而来；以及CL结构域，所述CL结构域从免疫球蛋白的CL结构域通过用赖氨酸残基取代所述CL的位置137处的天冬酰胺残基并且用丙氨酸残基取代所述CL结构域的位置114处的丝氨酸残基衍生而来；b)由以下组成的Fab片段：所关注抗体的VH结构域和VL结构域；CH1结构域，所述CH1结构域从免疫球蛋白的CH1结构域通过用谷氨酰胺残基取代所述CH1结构域的位置143处的亮氨酸残基并且用缬氨酸残基取代所述CH1结构域的位置188处的丝氨酸残基衍生而来；以及CL结构域，所述CL结构域从免疫球蛋白的CL结构域通过用苏氨酸残基取代所述CL结构域的位置133处的缬氨酸残基并且用缬氨酸残基取代所述CL结构域的位置176处的丝氨酸残基衍生而来；c)由以下组成的Fab片段：所关注抗体的VH结构域和VL结构域；CH1结构域，所述CH1结构域从IgG免疫球蛋白的CH1结构域通过用丙氨酸残基取代所述CH1结构域的位置124处的亮氨酸残基并且用谷氨酸残基取代所述CH1结构域的位置143处的亮氨酸残基衍生而来；以及CL结构域，所述CL结构域从IgG免疫球蛋白的CL结构域通过用色氨酸残基取代所述CL结构域的位置133处的缬氨酸残基衍生而来；d)由以下组成的Fab片段：所关注抗体的VH结构域和VL结构域；CH1结构域，所述CH1结构域从免疫球蛋白的CH1结构域通过用丙氨酸残基取代所述CH1结构域的位置190处的缬氨酸残基衍生而来；以及CL结构域，所述CL结构域从免疫球蛋白的CL结构域通过用色氨酸残基取代所述CL结构域的位置135处的亮氨酸残基并且用丙氨酸残基取代所述CL结构域的位置137处的天冬酰胺残基衍生而来。
根据一优选实施例，所述CH1结构域衍生自IgG免疫球蛋白。在一些实施例中，IgG免疫球蛋白来自IgG1同种型或IgG4同种型。在一些实施例中，CL结构域为κ型。对于在人疗法中使用，经突变的CH1结构域和CL结构域所衍生自的免疫球蛋白是人免疫球蛋白。
Fab片段是以任何顺序串联布置的，第一Fab片段的CH1结构域的C末端通过多肽接头与下一个Fab片段的VH结构域的N末端连接。通常，所述多肽接头的长度应为至少20个，优选地至少25个，并且仍更优选地至少30个，并且至多80个，优选地至多60个，并且仍更优选地至多40个氨基酸。
多肽接头包括选自IgA、IgG和IgD的一种或多种免疫球蛋白的铰链区的序列的全部或一部分。如果抗体用于人疗法，则人来源的铰链序列将是优选的。
人IgG、IgA和IgD的铰链区的序列在以下指出：
IgA1(SEQ ID NO：1)：VPSTPPTPSPSTPPTPSPS
IgA2(SEQ ID NO：2)：VPPPPP
IgD(SEQ ID NO：3)：
IgG1(SEQ ID NO：4)：EPKSCDKTKTCPPCP
IgG2(SEQ ID NO：5)：ERKCCVECPPCP
IgG3：(SEQ ID NO：6)ELKTPLGDTTHTCPRCP
之后是以下的0个或1至4个重复序列：
＞SEQ ID NO：7)EPKSCDTPPPCPRCP
IgG4：(SEQ ID NO：8)ESKYGPPCPSCP
所述多肽接头可以包括仅一种免疫球蛋白的铰链区的序列的全部或一部分。在这种情况下，所述免疫球蛋白可以属于与相邻CH1结构域所衍生自的免疫球蛋白相同的同种型和亚类，或者属于不同的同种型或亚类。
可替代地，所述多肽接头可以包括至少两种不同同种型或亚类的免疫球蛋白的铰链区的序列的全部或一部分。在这种情况下，直接跟随CH1结构域的多肽接头的N末端部分优选地由属于与所述CH1结构域所衍生自的免疫球蛋白相同的同种型和亚类的免疫球蛋白的铰链区的全部或一部分组成。
任选地，所述多肽接头可以进一步包括免疫球蛋白的CH2结构域的2个至15个，优选地5个至10个N末端氨基酸的序列。
在一些情况下，可以使用来自天然铰链区的序列；在其它情况下，可以对这些序列进行点突变，具体地用丙氨酸或丝氨酸替代天然IgG1、IgG2或IgG3铰链序列中的一个或多个半胱氨酸残基，以避免不希望的链内或链间二硫键。
可以用于本发明的多特异性抗原结合片段的多肽接头的非限制性实例是具有序列EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG(SEQ ID NO：9)或EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPGGGGSGGSGSGG(SEQ ID NO:44)或与其至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列的多肽。SEQ ID NO:9由人IgG1铰链的全长序列(SEQ ID NO:4)，随后是人IgG1 CH2的9个N末端氨基酸(APELLGGPS，SEQ ID NO:10)，随后是人IgA1铰链的序列的一部分(TPPTPSPS，SEQ ID NO:11)和二肽GG组成，这些加起来为接头提供了补充的灵活性。可以使用其它柔性接头，包含GS型接头，如(GGGS)n或(GGGGS)n，其中n为整数，或非重复接头，如SPNSASHSGSAPQTSSAPGSQ(SEQ ID NO:45)或与其至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。
任选地，可以使用人IgG1 CH2结构域的N末端序列的较短部分。此外，可以使用人IgA1铰链的较长部分至其全长序列(优选地，减去N末端缬氨酸残基)。根据特定实施例，所述人IgA1铰链序列可以被人工序列取代，所述人工序列含有交替的苏氨酸、丝氨酸和脯氨酸残基。
例如，还适用于本发明的多特异性抗原结合片段的SEQ ID NO:9的多肽的变体是具有以下序列：EPKSCDKTHTCPPCPAPELLPSTPPSPSTPGG(SEQ ID NO:12)或与其至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列的多肽。在此多肽中，人IgG1铰链的全长序列之后是人IgG1 CH2的5个N末端氨基酸(APELL，SEQ ID NO:13)和序列PSTPPSPSTP(SEQ ID NO:14)。
在本发明的包括多于两个不同Fab片段的多特异性抗原结合片段的情况，分离Fab片段的多肽接头可以是相同的或不同的。
在一些实施例中，Fc结构域衍生自IgG免疫球蛋白。在一些实施例中，IgG免疫球蛋白来自IgG1同种型或IgG4同种型。在一些实施例中，IgG1 Fc结构域包括L234A和/或L235A突变(EU编号)。对于在人疗法中使用，经突变的Fc结构域所衍生自的免疫球蛋白是人免疫球蛋白。
在一些实施例中，IgG4 Fc结构域包括S228P突变(EU编号)。在一些实施例中，IgG4Fc结构域包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与其至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。
>IgG4同种型的mutIGHG4 S228P突变体
在一些实施例中，IgG1 Fc结构域包括L234A/L235A突变(EU编号)。在一些实施例中，IgG1 Fc结构域包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与其至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。
>IGHG1*01-L234A/L235A|智人
>在一些实施例中，IgG1 Fc结构域为野生型IgG1 Fc结构域。在一些实施例中，IgG1Fc结构域包括SEQ ID NO:42的序列或与其至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。
>IGHG1*01野生型(人)：
本公开的示例性双特异性抗体包括用于控制重链和轻链配对的CR3突变。(Golay等人《免疫学杂志(J Immunol.)》2016)。双特异性抗体具有CH1结构域，属于IgG1同种型，并且包括T192E的CR3突变；κ同种型的轻链并且包括S114A和N137K的CR3突变、GS型的肽接头、铰链结构域和具有S228P(EU编号)突变的IgG4 Fc结构域。
本公开的示例性双特异性抗体包括用于控制重链和轻链配对的CR3突变。(Golay等人《免疫学杂志》2016)。双特异性抗体具有CH1结构域，属于IgG1同种型，并且包括T192E的CR3突变；κ同种型的轻链并且包括S114A和N137K的CR3突变、GS型的肽接头、铰链结构域和具有L234A/L235A(EU编号)突变的huIgG1 Fc结构域(Xu等人五个人源化OKT3效应功能变体抗体的体外表征(In vitro characterization of five humanized OKT3 effectorfunction variant antibodies)《细胞免疫学(Cellular Immunology)》200,16-26(2000)；Hezareh等人针对人免疫缺陷病毒1型的广泛中和抗体的突变体组群的效应功能活性(Effector Function Activities of a Panel of Mutants of a Broadly NeutralizingAntibody against Human Immunodeficiency Virus Type 1).《病毒学杂志(J.Virol.)》2001,12161-12168(75))。
与NKp46和CD38特异性结合的示例性双特异性抗体
本公开的双特异性抗体具有一个对NKp46具有特异性的抗原结合区和一个对CD38具有特异性的第二抗原结合区。
NKp46抗原结合区可以衍生自其的示例性NKp46抗体包含02抗体、09抗体(还被称为“K3 P4”或“P4”)、12抗体(还被称为“K3b”或“K3”)、人源化09抗体、人源化12抗体、B341001抗体、B341002抗体、B341003抗体和B341004抗体。
CD38抗原结合区可以衍生自其的示例性CD38抗体包含“抗CD38”抗体。另外，CD38抗原结合区可以衍生自其的示例性CD38抗体包含但不限于美国专利US9,758,590、US9,944,711和US10,766,965中公开的那些。
在一些实施例中，至少包含与NKp46结合的第一抗原结合区和与CD38结合的第二抗原结合区的本发明的示例性双特异性抗体包含选自表1、2、3和4中示出的CDR序列的重链和互补决定区和轻链互补决定区(CDR)的组合。表1、2、3和4中示出的CDR是根据IMGT命名法(参见可在线获得：http://www.imgt.org/)定义的。
在一些实施例中，本发明的示例性双特异性抗体，其包含：第一重链，所述第一重链包括选自表1中示出的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列的重链CDR氨基酸序列的组合；和第一轻链，所述第一轻链具有由选自表2中示出的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列的第一轻链CDR氨基酸序列构成的集合；第二重链，所述第二重链包括选自表3中示出的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列的重链CDR氨基酸序列的组合；以及第二轻链，所述第二轻链具有由选自CDRL1、CDRL2和CDRL3序列表4的第二轻链CDR氨基酸序列构成的集合。
在一些实施例中，本发明的示例性双特异性抗体，其包含与NKp46结合的第一抗原结合区和与CD38结合的第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含表1中示出的重链互补决定区(CDR)的组合和选自表2中示出的CDR序列的轻链CDR的组合，并且其中所述第二抗原结合区包含表3中示出的重链互补决定区(CDR)的组合以及选自表4中示出的CDR序列的轻链CDR的组合。
表1：抗NKp46重链CDR(IMGT编号)
表2：抗NKp46轻链CDR(IMGT编号)
表3：抗CD38重链CDR(IMGT编号)
表4：抗CD38轻链CDR(IMGT编号)
下面描述的示例性抗NKp46和抗CD38双特异性抗体中的每一种都包含第一重链可变结构域(VH)、第一轻链可变结构域(VL)、第二重链可变结构域和第二轻链可变结构域，如下面列出的氨基酸和对应核酸序列中所示。
抗NKp46抗体
示例性抗NKp46抗体序列如下所示。表5提供了根据本公开的抗NKp46抗体的说明性重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列。表6提供了编码根据本公开的抗NKp46抗体的说明性重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列。
表5：抗NKp46抗体的示例性VH和VL区氨基酸序列
抗CD38抗体
示例性抗CD38抗体序列如下所示。表6提供了根据本公开的抗CD38抗体的说明性重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列。
表6：抗CD38抗体的示例性VH和VL区氨基酸序列
示例性抗NKp46和抗CD38双特异性抗体
在一些实施例中，抗CD38/抗NKp46双特异性抗体包含第一重链，所述第一重链包括CDRH1，所述CDRH1包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列；CDRH2，所述CDRH2包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列；CDRH3，所述CDRH3包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列；第一轻链，所述第一轻链包括CDRL1，所述CDRL1包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列；CDRL2，所述CDRL2包括SEQ IDNO:21的氨基酸序列；以及CDRL3，所述CDRL3包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列；第二重链，所述第二重链包括CDRH1，所述CDRH1包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列，CDRH2，所述CDRH2包括SEQ ID NO:33的氨基酸序列；CDRH3，所述CDRH3包括SEQ ID NO:34的氨基酸序列；以及第二轻链，所述第二轻链包括CDRL1，所述CDRL1包括SEQ ID NO:35的氨基酸序列；CDRL2，所述CDRL2包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列；以及CDRL3，所述CDRL3包括SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗CD38/抗NKp46双特异性抗体包含第一重链可变区，所述第一重链可变区包括SEQ ID NO:25的氨基酸序列或与其至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列；第一κ轻链可变区，所述第一κ轻链可变区包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列或与其至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列；以及第二重链可变区，所述第二重链可变区包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列或与其至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列；以及第二κ轻链可变区，所述第二κ轻链可变区包括SEQ IDNO:39的氨基酸序列或与其至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。
在一些实施例中，抗CD38/抗NKp46双特异性抗体包含融合的重链，所述融合的重链包括SEQ ID NO:41的氨基酸序列或与其至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列；第一κ轻链，所述第一κ轻链包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列或与其至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列；以及第二κ轻链，所述第二κ轻链包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列或与其至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。在SEQID NO:41、31、40和46中以粗体示出了信号序列，所述信号序列不一定存在于所有实施例中。
>融合的重链CD38/NKp46/huIgG1-L234A/L235A
>融合的重链CD38/NKp46/huIgG1-野生型
>轻链1抗NkP46
>轻链2抗CD38
所述抗体可以通过含有编码以上所述的单链抗体的DNA段的载体表达。
这些可以包含载体、脂质体、裸DNA、佐剂辅助的DNA、基因枪、导管等。载体包含：化学缀合物，如WO 93/64701中描述的化学缀合物，所述化学缀合物具有靶向部分(例如，细胞表面受体的配体)和核酸结合部分(例如，聚赖氨酸)、病毒载体(例如，DNA或RNA病毒载体)；融合蛋白，如PCT/US 95/02140(WO 95/22618)中描述的融合蛋白，所述融合蛋白为含有靶部分(例如，对靶细胞具有特异性的抗体)和核酸结合部分(例如，鱼精蛋白)、质粒、噬菌体等的融合蛋白。载体可以是染色体的、非染色体的或合成的。
优选载体包含病毒载体、融合蛋白和化学缀合物。逆转录病毒载体包含莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia viruse)。DNA病毒载体是优选的。这些载体包含：痘病毒载体，如正痘病毒载体或禽痘病毒载体、疱疹病毒载体，如I型单纯疱疹病毒(HSV)载体(参见Geller,A.I.等人,《神经化学杂志(J.Neurochem)》,64:487(1995)；Lim,F.,等人,于《DNA克隆：哺乳动物系统(DNA Cloning:Mammalian Systems)》,D.Glover编辑(英国牛津的牛津大学出版社(Oxford Univ.Press,Oxford England))(1995)；Geller,A.I.等人,《美国国家科学院院刊(Proc Natl.Acad.Sci.:U.S.A.)》90:7603(1993)；Geller,A.I.等人,《美国国家科学院院刊》87:1149(1990))；腺病毒载体(参见LeGal LaSalle等人,《科学(Science)》,259:988(1993)；Davidson等人,《自然遗传学(Nat.Genet)》3:219(1993)；Yang等人,《病毒学杂志》69:2004(1995))以及腺相关病毒载体(参见Kaplitt,M.G.等人,《自然遗传学》8:148(1994))。
痘病毒载体将基因引入到细胞质中。禽痘病毒载体仅引起核酸的短期表达。对于将核酸引入到神经细胞中，腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒(HSV)载体是优选的。相比于腺相关病毒的表达(约4个月)，腺病毒载体引起较短期表达(约2个月)，这进而比HSV载体的表达短。所选择的具体载体将取决于靶细胞和所治疗的病状。引入可以通过标准技术，例如，感染、转染、转导或转化。基因转移模式的实例包含例如裸DNA、CaPO4沉淀、DEAE右旋糖酐、电穿孔、原生质体融合、脂转染、细胞微注射和病毒载体。
载体可以用于靶向基本上任何期望的靶细胞。例如，可以使用立体定向注射以将载体(例如，腺病毒、HSV)定向到期望定位。另外，可以通过使用微型泵输注系统，如SynchroMed输注系统进行脑室内(icv)输注来递送颗粒。一种基于被称为对流的体积流动的方法也被证明在将大分子递送到脑的扩展区域方面是有效的，并且可用于将载体递送到靶细胞。(参见Bobo等人,《美国国家科学院院刊》91:2076-2080(1994)；Morrison等人,《美国生理学、内分泌学与代谢杂志(Am.J.Physiol.)》266:292-305(1994))。可以使用的其它方法包含导管、静脉内、肠胃外、腹膜内和皮下注射，以及口服或其它已知施用途径。
双特异性抗体为对至少两种不同抗原具有结合特异性的抗体。在本实例中，结合特异性之一是针对如NKp46等靶标或其任何片段。第二结合靶标是CD38或其任何片段。
用于制备双特异性抗体的方法在本领域是已知的。传统上，双特异性抗体的重组产生是基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，在所述两个免疫球蛋白重链/轻链对中两个重链具有不同的特异性(Milstein和Cuello,《自然》,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机组合，这些杂交瘤(quadromas)产生十种不同抗体分子的潜在混合物，在所述十种不同抗体分子中，仅一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常是通过亲和色谱法步骤完成的。1993年5月13日发布的WO 93/08829和Traunecker等人,《EMBO杂志(EMBO J.)》10:3655-3659(1991)中公开了类似程序。
双特异性抗体可以使用多种本领域公认的技术中的任何技术制备，所述技术包含WO 2012/023053中公开的那些，所述文献的内容通过引用以其整体在此并入。WO 2012/023053中描述的方法产生与人免疫球蛋白的结构相同的双特异性抗体。这种类型的分子由一个独特的重链多肽的两个拷贝，即与恒定κ结构域融合的第一轻链可变区和与恒定λ结构域融合的第二轻链可变区构成。每个结合位点都表现出不同的抗原特异性，重链和轻链两者共同促进所述不同抗原特异性。轻链可变区可以属于λ或κ家族，并且优选地分别与λ和κ恒定结构域融合。为了避免产生非天然多肽连接，这是优选的。然而，还可以通过将κ轻链可变结构域与第一特异性的恒定λ结构域融合并且将λ轻链可变结构域与第二特异性的恒定κ结构域融合来获得本发明的双特异性抗体。WO 2012/023053中描述的双特异性抗体被称为IgGκλ抗体或“κλ体”，这是一种新的完全人双特异性IgG形式。这种κλ体形式允许对与具有与标准单克隆抗体的特性不可区分的特性的标准IgG分子不可区分的双特异性抗体进行亲和纯化，并且因此相较于先前的形式是有利的。
所述方法的基本步骤是鉴定具有不同抗原特异性的共享相同重链可变结构域的两个抗体Fv区(每个区由可变轻链结构域和可变重链结构域构成)。已经描述了用于产生单克隆抗体和其片段的许多方法。(参见例如，《抗体：实验室手册(Antibodies:ALaboratoryManual)》,Harlow E和Lane D,1988,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY),其通过引用并入本文。全人抗体是其中轻链和重链，包含CDR 1和2两者的序列都由人基因产生的抗体分子。CDR3区可以属于人来源或可以通过合成手段设计。这种抗体在本文被称为“人抗体”或“全人抗体”。人单克隆抗体可以通过使用以下技术来制备：三瘤技术；人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor,等人,1983《今日免疫学(Immunol Today)》4:72)；以及用于产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(参见Cole等人,1985于：《单克隆抗体与癌症疗法(MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCERTHERAPY)》中,Alan R.Liss公司(Alan R.Liss,Inc.),第77-96页)。人单克隆抗体可以利用并且可以通过使用人杂交瘤(参见Cote等人,1983.《美国国家科学院院刊》80:2026-2030)或通过在体外用爱泼斯坦巴尔病毒(Epstein Barr Virus)转化人B细胞来产生(参见Cole等人,1985于：《单克隆抗体与癌症疗法》中,Alan R.Liss公司,第77-96页)。
单克隆抗体例如通过用靶抗原或其免疫原性片段、其衍生物或变体对动物进行免疫来产生。可替代地，用利用含有编码靶抗原的核酸分子的载体转染的细胞对动物进行免疫，使得靶抗原表达并且与经转染的细胞的表面缔合。用于产生异种非人动物的各种技术是众所周知的。例如，参见美国专利第6,075,181号和第6,150,584号，所述文献通过引用以其整体在此并入。
可替代地，通过筛选含有抗体或抗原结合结构域序列的文库以与靶抗原结合来获得抗体。此文库例如是在噬菌体中作为在经组装的噬菌体颗粒的表面上表达的噬菌体外壳蛋白和包含在噬菌体颗粒内的编码DNA序列的蛋白质或肽融合物制备的(即“噬菌体展示文库”)。
然后针对与靶抗原的反应性筛选由骨髓瘤/B细胞融合物产生的杂交瘤。单克隆抗体是例如使用杂交瘤方法，如Kohler和Milstein,《自然》,256:495(1975)所描述的那些方法制备的。在杂交瘤方法中，小鼠、仓鼠或其它适当的宿主动物典型地用免疫剂免疫以引发产生或能够产生将会与免疫剂特异性结合的抗体的淋巴细胞。可替代地，淋巴细胞可以在体外免疫。
虽然不是完全不可能，但是偶然鉴定出具有相同重链可变结构域但针对不同抗原进行定向的不同抗体是极不可能的。事实上，在大多数情况下，重链主要作用于抗原结合表面，并且在序列中也是最可变的。特别是，重链上的CDR3在序列、长度和结构方面是最多样化的CDR。因此，对不同抗原具有特异性的两种抗体将几乎一贯地承载不同重链可变结构域。
共同未决申请WO 2012/023053中公开的方法克服了这一限制，并且通过使用抗体文库极大地促进了具有相同重链可变结构域的抗体的分离，在所述抗体文库中，对于所有文库成员来说，重链可变结构域是相同的，并且由此多样性局限于轻链可变结构域。此类文库描述于例如共同未决申请WO 2010/135558和WO 2011/084255中，所述文献中的每一个通过引用以其整体特比并入。然而，由于轻链可变结构域与重链可变结构域结合进行表达，因此这两个结构域都可以促进抗原结合。为了进一步促进这一过程，含有相同重链可变结构域和多种λ可变轻链或κ可变轻链的抗体文库可以并行用于对针对不同抗原的抗体进行体外选择。此方法使得能够鉴定两种具有共同重链但一种承载λ轻链可变结构域并且另一种承载κ轻链可变结构域的抗体，所述两种抗体可以用作用于产生本发明的全免疫球蛋白形式的双特异性抗体的构建块。
将共同重链和两个不同的轻链共表达到单个细胞中，以允许组装本发明的双特异性抗体。如果所有多肽都以相同水平进行表达并且同等地进行组装以形成免疫球蛋白分子，那么单特异性(相同轻链)和双特异性(两条不同轻链)的比率应该是50％。然而，很可能不同的轻链以不同水平进行表达和/或不以相同的效率进行组装。因此，使用了用于调节不同多肽的相对表达的方式以补偿其固有表达特性或用于与共同重链进行组装的不同倾向性。这种调节可以通过启动子强度、使用特征在于不同效率的内部核糖体进入位点(IRES)或其它类型的可以以转录或翻译水平起作用也可以对mRNA稳定性起作用是调节元件来实现。不同强度的不同启动子可以包含CMV(立即-早期巨细胞病毒启动子)；EF1-1α(人延长因子1α亚基启动子)；Ubc(人泛素C启动子)；SV40(猴病毒40启动子)。已描述了来自哺乳动物和病毒来源的不同IRES。(参见例如Hellen CU和Sarnow P.《基因与发育(Genes Dev)》200115:1593-612)。这些IRES在其长度和核糖体募集效率方面可以极大不同。此外，通过引入IRES的多个拷贝来进一步调谐活性是可能的(Stephen等人2000《美国国家科学院院刊》97:1536-1541)。表达的调节也可以通过对细胞进行多次顺序转染以增加表达一条或另一条轻链的单独基因的拷贝数，并由此修改其相对表达来实现。本文提供的实例表明，控制不同链的相对表达对于使双特异性抗体的组装和总产率最大化来说至关重要。
重链和两条轻链的共表达产生了成为细胞培养上清液的三种不同抗体的混合物：两种单特异性二价抗体和一种双特异性二价抗体。后者必须从混合物中纯化以获得所关注分子。本文所描述的方法通过使用亲和色谱法介质极大地促进了这一纯化程序，所述亲和色谱法介质与κ或λ轻链恒定结构域，如CaptureSelect Fabκ和CaptureSelect Fabλ亲和基质特异性相互作用(荷兰的BAC BV公司(BAC BV,Holland))。此多步骤亲和色谱法纯化方法高效且普遍适用于本发明的抗体。这与必须对衍生自quadromas或表达抗体混合物的其它细胞系的每种双特异性抗体进行开发和优化的具体纯化方法形成鲜明对比。事实上，如果混合物中的不同抗体的生化特性相似，则其使用如离子交换色谱法等标准色谱法技术进行的分离可能具有挑战性或根本不可能。
其它合适的纯化方法包含2012年10月19日提交的以WO2013/088259发布的共同未决申请PCT/IB2012/003028中公开的那些，所述文献通过引用以其整体特此并入。
在产生双特异性抗体的其它实施例中，具有期望的结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)可以与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。所述融合优选地是与免疫球蛋白重链恒定结构域，所述免疫球蛋白重链恒定结构域包括铰链区、CH2区和CH3区的至少一部分。优选的是具有含有融合中的至少一种融合中存在的轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和(如果需要的话)免疫球蛋白轻链的DNA插入到单独表达载体中，并且共转染到合适的宿主生物体中。关于产生双特异性抗体的其它详情，参见例如Suresh等人,《酶学方法(Methods in Enzymology)》,121:210(1986)。
根据WO 96/27011中描述的另一种方法，可以对抗体分子对之间的界面进行工程化，以将从重组细胞培养物中回收的异源二聚体的百分比最大化。优选界面包含抗体恒定结构域的CH3区的至少一部分。在此方法中，用较大侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替代来自第一抗体分子的界面的一个或多个小氨基酸侧链。通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替代大的氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生大小与大侧链的大小相同或类似的补偿性“腔”。这提供了用于提高异源二聚体相比于如同源二聚体等不希望的最终产物的产率的机制。
文献中已描述了用于由抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，双特异性抗体可以使用化学键制备。所产生的双特异性抗体可以用作用于对酶进行选择性固定的药剂。
还描述了用于直接由重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，已使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体。Kostelny等人,《免疫学杂志》148(5):1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体同二聚体在铰链区处被还原以形成单体，并且然后被再氧化以形成抗体异源二聚体。此方法还可以用于产生抗体同二聚体。Hollinger等人《美国国家科学院院刊》90:6444 -6448(1993)所描述的“双抗体”技术已提供了用于制备双特异性抗体片段的替代机制。所述片段包括通过接头与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)，所述接头太短以至于不能在同一条链上的两个结构域之间进行配对。因此，一个片段的VH和VL结构域被迫使与另一个片段的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报告了另一种用于通过使用单链Fv(sFv)二聚体来制备双特异性抗体片段的策略。参见Gruber等人,《免疫学杂志》152:5368(1994)。
设想了具有多于两个效价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等人,《免疫学杂志》147:60(1991)。
示例性双特异性抗体可以与两个不同的表位结合，所述两个不同的表位中的至少一个表位衍生自本发明的蛋白抗原。可替代地，免疫球蛋白分子的抗抗原臂可以与和白细胞上的触发分子，如T细胞受体分子(例如，CD2、CD3、CD28或B7)或IgG的Fc受体(FcγR)，如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)结合的臂组合，以便于将细胞防御机制集中于表达特定抗原的细胞。双特异性抗体还可以用于将细胞毒剂定向到表达特定抗原的细胞。这些抗体具有抗原结合臂和与细胞毒性剂或放射性核素螯合剂，如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA结合的臂。另一种所关注的双特异性抗体与本文所述的蛋白抗原结合并进一步与组织因子(TF)结合。
本文公开的抗体也可以被调配为免疫脂质体。含有所述抗体的脂质体通过本领域已知的方法，如Epstein等人,《美国国家科学院院刊》82:3688(1985)；Hwang等人,《美国国家科学院院刊》77:4030(1980)；以及美国专利第4,485,045号和第4,544,545号中所描述的方法制备。美国专利第5,013,556号公开了具有增强的循环时间的脂质体。
特别有用的脂质体可以用包括磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发法产生。通过具有限定孔径的过滤器将脂质体挤出以产生具有期望直径的脂质体。本发明的抗体的Fab'片段可以通过二硫化物交换反应与Martin等人,《生物化学杂志》,257:286-288(1982)中描述的脂质体缀合。
缀合物
异缀合抗体也在本发明的范围内。异缀合抗体由两个共价连接的抗体构成。例如，已提出这类抗体将免疫系统细胞靶向到不希望的细胞(参见美国专利第4,676,980号)，并且用于治疗HIV感染(参见WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089)。设想了抗体可以使用合成蛋白质化学方面的已知方法，包含涉及交联剂的那些方法在体外制备。例如，免疫毒素可以使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建。用于此目的的合适试剂的实例包含亚氨基硫醇酯和甲基-4-巯基丁酰亚氨酸酯以及例如美国专利第4,676,980中公开的那些。
本发明还涉及免疫缀合物，其包括与细胞毒性剂，如毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射性缀合物)缀合的抗体。
可以使用的酶活性毒素和其片段包含白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))的外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、药莲毒素A链、α-八叠球菌、油桐蛋白(Aleurites fordii protein)、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(Phytolaca americana protein，PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂(momordicacharantia inhibitor)、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制剂(sapaonariaofficinalis inhibitor)、白树毒素、丝裂菌褶素、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯。多种放射性同位素可用于生产放射性缀合的抗体。实例包含212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
抗体和细胞毒性剂的缀合物是使用多种双功能蛋白偶联剂，如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如己二酸二甲酯HCL)、活性酯(如双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟2,4-二硝基苯)制备的。例如，蓖麻毒素免疫毒素可以如Vitetta等人,《科学》238:1098(1987)中所述的制备。碳-14标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。(参见WO94/11026)。
本领域的普通技术人员将认识到，可以将多种可能的部分与所产生的本发明的抗体偶联。(参见例如“缀合疫苗(Conjugate Vaccines)”,《对微生物学和免疫学的贡献(Contributions to Microbiology and Immunology)》,J.M.Cruse和小R.E.Lewis(编辑),纽约卡格尔出版社(Carger Press,New York),(1989)，所述文献的整个内容通过引用并入本文)。
偶联可以通过将结合两种分子的任何化学反应来完成，只要抗体和其它部分保持其相应活性即可。这种连接可以包含许多化学机制，例如共价结合、亲和结合、嵌入、配位结合和络合。然而，首选结合是共价结合。共价结合可以通过现有侧链的直接缩合或通过外部桥接分子的掺入来实现。许多二价或多价连接剂可用于将蛋白质分子，如本发明的抗体与其它分子偶联。例如，代表性偶联剂可以包含如硫酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醛、重氮苯和六亚甲基二胺等有机化合物。本清单并不打算详尽地列出本领域已知的各种类别的偶联剂，而是更常见的偶联剂的实例。(参见Killen和Lindstrom,《免疫学杂志》133:1335-2549(1984)；Jansen等人,《免疫学评论(Immunological Reviews)》62:185-216(1982)；以及Vitetta等人,《科学》238:1098(1987)。
文献中描述了优选接头。(参见例如Ramakrishnan,S.等人,《癌症研究(CancerRes.)》44:201-208(1984)，其描述了MBS(M-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)的用途。还参见美国专利第5,030,719号，其描述了通过寡肽接头与抗体偶联的卤化的乙酰酰肼衍生物的用途)。特别优选的接头包含：(i)EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳化二亚胺盐酸盐)；(ii)SMPT(4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)-甲苯)(皮尔斯化学公司(Pierce Chem.Co.)，目录(21558G)；(iii)SPDP(琥珀酰亚胺基-6[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]己酸酯)(皮尔斯化学公司，目录号21651G)；(iv)磺基-LC-SPDP(磺基琥珀酰亚胺基6[3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺]己酸酯)(皮尔斯化学公司目录号2165-G)；以及(v)与EDC缀合的磺基-NHS(N-羟基磺-琥珀酰亚胺：皮尔斯化学公司，目录号24510)。
上面描述的接头含有具有不同属性，由此导致具有不同物理化学特性的缀合物的化合物。例如，烷基羧酸酯的磺基-NHS酯比芳香族羧酸酯的磺基-NHS酯更稳定。相比于磺基-NHS酯，含有NHS酯的接头的可溶性较差。此外，接头SMPT含有空间位阻的二硫键，并且可以形成稳定性提高的缀合物。通常，相比于其它键，二硫键不太稳定，因为二硫键在体外被切割，从而导致可获得更少的缀合物。特别是，磺基-NHS可以提高碳二亚胺偶联的稳定性。碳二亚胺偶联(如EDC)在与磺基-NHS结合使用时，形成相比于单独的碳二亚胺偶联反应对水解更具抗性的酯。
经Fc修饰的抗体
本发明的双特异性抗体可以属于不同的同种型，并且其Fc部分可以进行修饰以改变与不同Fc受体的结合特性，并且以这种方式修饰抗体的效应功能以及其药代动力学特性。许多用于修饰Fc部分的方法已进行了描述，并且适用于本发明的抗体(参见例如Strohl,WR《生物技术的当前观点(Curr Opin Biotechnol)》2009(6):685-91；美国专利第6,528,624号；于2009年1月9日提交的PCT/US2009/0191199)。本发明的方法还可以用于产生缺少Fc部分的F(ab')2形式的双特异性抗体和抗体混合物。
可以期望关于效应功能对本发明的抗体进行修饰，以增强例如，抗体在治疗与异常NKp46和/或CD38表达和/或活性相关的癌症和/或其它疾病和病症方面的有效性。例如，可以将半胱氨酸残基引入到Fc区中，由此允许此区中的链间二硫键形成。由此产生的同二聚体抗体可以具有改善的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。(参见Caron等人,《实验医学杂志(J.Exp Med.)》176:1191-1195(1992)以及Shopes,《免疫学杂志》,148:2918-2922(1992))。可替代地，抗体可以被工程化为具有双Fc区，并且可以由此具有增强的补体裂解和ADCC能力。(参见Stevenson等人,《抗癌药物设计(Anti-Cancer Drug Design)》3:219-230(1989))。
对于可以引入在本文所述的抗体中的Fc修饰的实例，增强抗体的效应功能的突变在本领域已知的，参见例如，Saunders等人,2019；《免疫学前沿(Front.Immunol)》10:1296以及Wang等人,2018,《蛋白质与细胞(Protein Cell)》9(1):63-73，所述文献中的每一个都通过引用以其整体并入。除非另有说明，否则本节中的Fc突变均参考用于免疫球蛋白的Kabat编号方案进行描述。
例如，Lys326Trp/Glu333Ser和Ser267Glu/His268Phe/Ser324Thr Fc突变体显示出ADCC降低，而Lys326Trp/Glu333Ser、Lys326Ala/Glu333Ala、Lys326Met/Glu333Ser、Cys221Asp/Asp222Cys、Ser267Glu、His268Phe和Ser324Thr以及Glu345Arg Fc突变体显示出Clq结合增加。另一方面，S239D/I332E和S239D/I332E/A330L Fc突变体与ADCC活性增加相关。
Fc区的其它突变可以提高抗体循环半衰期，例如，Arg435His、Met252Tyr/Ser254Thr/Thr256Glu(“YTE”)、Met428Leu/Asn434Ser和Thr252Leu/Thr253Ser/Thr254Phe突变体显示出相比于未经突变的版本延长的半衰期。
在其它实施例中，Fc突变可能导致效应功能的丧失，例如，Fc受体结合的消融。减少与一种或多种Fc受体的结合的Fc突变体的实例包含Leu235Glu、Leu234Ala/Leu235Ala(“LALA”)、Ser228Pro/Leu235Glu、Leu234Ala/Leu235Ala/Pro329Gly、Pro331Ser/Leu234Glu/Leu235Phe、Asp265Ala和Ala330Leu。
此外，与Fc受体的结合可以通过糖工程化实现。糖工程化可能涉及对免疫球蛋白的CH2结构域的氨基酸N297处的糖基化位点的修饰。可替代地或另外，重组地产生的抗体可以通过将产生抗体的细胞培养物暴露于糖基化抑制剂来进行翻译后修饰。翻译后修饰糖基化、羧化、脱酰胺化、氧化、羟基化、O-硫酸化、酰胺化、甘氨酸化、糖化、烷基化、酰化、乙酰化、磷酸化、生物素化、甲酰化、脂化、碘化、异戊烯化、氧化、棕榈酰化、磷脂酰肌醇化(phosphatidylinositolation)、磷酸泛酰巯基乙胺化、唾液酰化和硒化、C末端赖氨酸去除。对于可以用于产生本文所述的抗体的糖基化抑制剂的实例，说明性糖基化抑制剂描述于例如，美国专利第9,868,973号中，所述美国专利通过引用以其整体并入本文。
NK细胞
在一些实施例中，本公开提供了用于免疫疗法的方法，所述方法包括施用有效量的本公开的双特异性抗体和免疫细胞(例如NK细胞)。
NK细胞是对多种肿瘤细胞、病毒感染的细胞以及骨髓和胸腺中的一些正常细胞具有自发细胞毒性的淋巴细胞的亚群。NK细胞是对经转化的细胞和病毒感染的细胞的早期先天免疫应答的关键效应子。NK细胞占人外周血中的淋巴细胞的约10％。当淋巴细胞在存在IL-2的情况下培养时，会发生强烈的细胞毒性反应。NK细胞是效应细胞，其因为其较大的大小和细胞质中特征性亲氮颗粒的存在而被称为大颗粒淋巴细胞。NK细胞在骨髓、淋巴结、脾脏、扁桃体和胸腺中分化和成熟。NK细胞可以通过特异性表面标志物，如人体中的CD16、CD56和CD8等检测到。NK细胞不表达T细胞抗原受体、泛T标志物CD3或表面免疫球蛋白B细胞受体。
NK细胞的刺激是通过衍生自细胞表面激活和抑制受体的信号的串扰实现的。NK细胞的激活状态是通过从种系编码的激活和抑制受体的阵列接收到的胞内信号的平衡调节的(Campbell,2006)。当NK细胞遇到异常细胞(例如，肿瘤或病毒感染的细胞)，并且激活信号占主导时，NK细胞可以通过含有穿孔素和颗粒酶的细胞溶解颗粒的定向分泌或含有死亡结构域的受体的接合而快速诱导靶细胞的凋亡。经激活的NK细胞还可以分泌I型细胞因子，如干扰素-γ、肿瘤坏死因子-a和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，这些细胞因子激活先天免疫细胞和适应性免疫细胞以及其它细胞因子和趋化因子(Wu等人,2003)。这些可溶性因子在早期先天免疫应答中通过NK细胞的产生显著影响其它造血细胞的募集和功能。此外，通过物理接触和细胞因子的产生，NK细胞在与树突状细胞和中性粒细胞的调节串扰网络中发挥核心作用，以促进或抑制免疫应答。
在某些实施例中，NK细胞从人外周血单核细胞(PBMC)、未经刺激的白细胞去除术产物(PBSC)、人胚胎干细胞(hESC)、诱导多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞(MSC)、造血干细胞(HSC)、骨髓、CD34+细胞或脐带血(CB)中通过本领域众所周知的方法衍生。在一些实施例中，NK细胞是从PBMC中分离的。在一些实施例中，脐带CB用于衍生NK细胞。在某些方面，NK细胞是通过先前描述的NK细胞的体外扩增方法分离和扩增的(Shah等人,2013)。在这种方法中，将CB单核细胞通过ficoll密度梯度离心分离，并且在生物反应器中与IL-2和人工抗原呈递细胞(aAPC)一起培养。7天后，将细胞培养物中表达CD3的细胞耗竭，并且再培养另外7天。对细胞再次进行CD3耗竭，并表征为确定CD56+/CD3+细胞或NK细胞的百分比。在一些实施例中，脐带CB用于通过分离CD34+细胞，并且通过在含有SCF、IL-7、IL-15和IL-2的培养基中培养分化为CD56+/CD3+细胞来衍生NK细胞。
分离和衍生NK细胞的示例性方法包含但不限于美国专利US 9,260,696中描述的那些方法。产生iPSC-NK细胞的示例性方法还描述于Zhu和Kaufman,《分子生物学》2019、Yang等人,《分子疗法：方法与临床开发(Mol Ther:Meth Clin Dev)》,2020以及Moseman等人,2020中。
使用方法
应当理解，根据本发明的治疗实体的施用将与合适的载剂、赋形剂和并入到调配物中以提供经改进的转移、递送、耐受性等的其它药剂一起施用。大量合适的调配物可以在所有药物化学家所知的处方集：《雷明顿药物科学(Remington's PharmaceuticalSciences)》(第15版,宾夕法尼亚州伊斯顿的麦克米伦出版有限公司(Mack PublishingCompany,Easton,PA)(1975))，具体地其中Blaug,Seymour的第87章中找到。这些调配物包含例如粉末、糊剂、软膏、凝胶、蜡、油、脂质、含有囊泡的脂质(阳离子或阴离子)(如LipofectinTM)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、碳蜡乳剂(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有碳蜡的半固体混合物。前述混合物中的任何混合物可以适用于根据本发明的治疗和疗法，条件是调配物中的活性成分不会被调配物激活，并且调配物与施用途径是可生理上相容的且耐受的。对于涉及药物化学家众所周知的调配物、赋形剂和载剂的额外信息，还参见Baldrick P.“药物赋形剂开发：临床前引导的需要(Pharmaceutical excipient development:the need for preclinical guidance.)”《监管毒理学和药理学(Regul.Toxicol Pharmacol.)》32(2):210-8(2000),Wang W.“固体蛋白制剂的冻干与开发(Lyophilization and development of solid proteinpharmaceuticals.)”《国际药物科学杂志(Int.J Pharm.)》203(1-2):1-60(2000)、CharmanWN“脂质、亲脂性药物和口服药物递送-一些新兴概念(Lipids,lipophilic drugs,andoral drug delivery-some emerging concepts.)”《药学科学杂志》89(8):967-78(2000)、Powell等人“用于肠胃外调配物的赋形剂的汇编(Compendium of excipients forparenteral formulations)”，PDA《药物科学与技术杂志(J Pharm Sci Technol.)》52:238-311(1998)以及其中的引文。
包含本发明的抗体的本发明的治疗调配物用于治疗或缓解与癌症相关的症状，如以非限制性实例为例，白血病、淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、胶质瘤、肺癌和支气管癌、结直肠癌、胰腺癌、食道癌、肝癌、尿膀胱癌、肾癌和肾盂癌、口腔癌和咽喉癌、子宫癌和/或黑色素瘤。本发明还提供了治疗或减轻与癌症相关的症状的方法。治疗方案是通过使用标准方法鉴定受试者，例如患有(或有风险患上)癌症的人类患者进行的。
治疗的有效性与用于诊断或治疗具体免疫相关病症的任何已知方法关联进行确定。缓解免疫相关病症的一种或多种症状表明抗体赋予了临床益处。
用于筛选具有期望特异性的抗体的方法包含但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)和本领域内已知的其它免疫介导的技术。
针对如NKp46、CD38或其组合(或其片段)等靶标的抗体可以用于本领域内与这些靶标的定位和/或定量相关的方法，例如，用于测量适当生理样品内的这些靶标的水平、用于诊断方法、用于对蛋白质进行成像等。在一给定实施例中，特定含有抗体衍生的抗原结合结构域的任何这些靶标或其衍生物、片段、类似物或同源物的抗体被用作药理学活性化合物(以下被称为“治疗剂”)。
本发明的抗体可以用于使用如免疫亲和力、色谱法或免疫沉淀等标准技术来分离特定靶标。本发明的抗体(或其片段)可以用于在诊断上监测组织中的蛋白质水平作为临床测试程序的一部分，例如以确定给定治疗方案的功效。检测可以通过将抗体与可检测物质偶联(例如，物理连接)来促进。可检测物质的实例包含各种酶、假基团、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包含辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的假基团复合物的实例包含链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的实例包含伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包含鲁米诺(luminol)；生物发光材料的实例包含荧光素酶、荧光素和水母素，并且合适的放射性材料的实例包含125I、131I、35S或3H。
本发明的抗体，包含多克隆、单克隆、人源化和全人抗体，可以用作治疗剂。此类药剂通常将用于治疗或预防与受试者体内的给定靶标的异常表达或激活相关的疾病或病理。抗体调配物，优选地对其靶抗原具有高特异性和高亲和力的抗体调配物施用于受试者，并且通常将具有由于其与靶标的结合而产生的效果。抗体的施用可以消除、抑制或干扰靶标的信号传导功能。抗体的施用可以消除或抑制或干扰靶标与其天然结合的内源性配体的结合。例如，抗体与靶标结合，并且中和或以其它方式抑制CD38与其内源性配体之间的相互作用。例如，抗体与靶标结合，并且中和或以其它方式抑制NKp46与其内源性配体之间的相互作用。
本发明的抗体的治疗有效量通常涉及实现治疗目的所需的量。如以上所指出的，这可以是抗体与其靶抗原之间的结合相互作用，在某些情况下，所述结合相互作用会干扰靶标的功能化。施用所需的量将另外取决于抗体对其特异性抗原的结合亲和力，并且还将取决于从施用所施用的抗体的其它受试者的自由体积耗竭所施用的抗体的速率。通过非限制性实例，本发明的抗体或抗体片段的治疗有效剂量的常见范围可以是约0.1mg/kg体重至约50mg/kg体重。常见的给药频率范围可以在，例如，每天两次到每周一次的范围内。
本发明的抗体或其片段可以以药物组合物的形式施用以治疗多种疾病和病症。制备此类组合物所涉及的原则和考虑因素，以及选择成分的指导提供于例如《雷明顿：药物科学和实践(Remington:The Science And Practice Of Pharmacy)》第19版(AlfonsoR.Gennaro等人,编辑)宾夕法尼亚州伊斯顿的麦克米伦出版有限公司：1995；《药物吸收增强：概念、可能性、限制和趋势(Drug Absorption Enhancement:Concepts,Possibilities,Limitations,And Trends)》,宾夕法尼亚州兰霍恩的哈伍德学术出版社(HarwoodAcademic Publishers,Langhome,Pa.),1994；；以及肽和蛋白质药物递送(Peptide AndProtein Drug Delivery)(《肠胃外科学进展(Advances In Parenteral Sciences)》,第4卷),1991,M.Dekker,纽约(New York)。
在使用抗体片段的情况下，与靶蛋白的结合结构域特异性结合的最小抑制片段是优选的。例如，基于抗体的可变区序列，肽分子可以被设计成保留与靶蛋白序列结合的能力。这种肽可以通过重组DNA技术在化学上合成和/或产生。(参见例如Marasco等人,《美国国家科学院院刊》90:7889-7893(1993))。调配物还可以含有超过一种所治疗的具体适应症所需的活性化合物，优选地具有不会彼此不利地影响的互补活性的那些化合物。可替代地或另外，组合物可以包括增强其功能的药剂，如例如细胞毒性剂、细胞因子、化疗剂或生长抑制剂。此类分子以有效用于预期目的的量以组合方式适当存在。
活性成分还可以例如通过凝聚法技术或通过界面聚合包入在所制备的微胶囊中，所述微胶囊例如：分别在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒以及纳米胶囊)或在微型乳剂中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊以及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。
要用于体内施用的调配物必须是无菌的。这通过无菌过滤膜过滤而容易地完成。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包含含有抗体的固体疏水性聚合物的半渗透基质，所述基质呈成型制品，例如膜或微胶囊的形式。缓释基质的实例包含聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林构成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟丁酸。虽然如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子超过100天，但某些水凝胶释放蛋白质释放较短时间段。
根据本发明的抗体可以用作用于检测样品中的给定靶标(或其蛋白质片段)的存在的药剂。在一些实施例中，抗体含有可检测标记。抗体是多克隆或更优选地单克隆的。使用完整抗体或其片段(例如，Fab、scFv或F(ab)2)。关于探针或抗体的术语“标记的”旨在涵盖通过将可检测物质与探针或抗体偶联(即，物理连接)来直接标记探针或抗体，以及通过与直接标记的另一种试剂的反应性来间接标记探针或抗体。间接标记的实例包含使用荧光标记的次级抗体检测以及抗体，以及用生物素对DNA探针进行末端标记，使得可以用荧光标记的链霉亲和素进行检测。术语“生物样品”旨在包含从受试者体内分离的组织、细胞和生物流体，以及存在于受试者体内的组织、细胞和流体。因此，在术语“生物样品”的用法内包含血液和血液的级分或组分，包含血清、血浆或淋巴。也就是说，本发明的检测方法可以用于在体外以及体内检测生物样品中的分析物mRNA、蛋白质或基因组DNA。例如，用于检测分析物mRNA的体外技术包含北方杂交(Northern hybridization)和原位杂交。用于检测分析物蛋白的体外技术包含酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光。用于检测分析物基因组DNA的体外技术包含南方杂交(Southern hybridizations)。用于进行免疫测定的程序描述于例如“ELISA：理论与实践：分子生物学方法(ELISA:Theory andPractice:Methods in Molecular Biology)”,第42卷,J.R.Crowther(编辑)新泽西州托托瓦的胡马纳出版社(Human Press,Totowa,NJ),1995；“免疫测定(Immunoassay)”,E.Diamandis和T.Christopoulus,加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社(Academic Press,Inc.,San Diego,CA),1996；以及“酶免疫测定的实践和理论(Practice and Theory ofEnzyme Immunoassays)”,P.Tijssen,阿姆斯特丹的爱思唯尔出版社(Elsevier SciencePublishers,Amsterdam),1985。此外，用于检测分析物蛋白的体内技术包含将标记的抗分析物蛋白抗体引入到受试者体内。例如，抗体可以用放射性标志物标记，所述放射性标志物在受试者体内的存在和定位可以通过标准成像技术来检测。
疾病和病症
在一些实施例中，通过转移引起免疫应答的免疫细胞群体来治疗医学疾病或病症。在本公开的某些实施例中，通过转移引发免疫应答的免疫细胞群体来治疗癌症或感染。本文提供了用于治疗个体的癌症或延缓癌症的进展的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗原特异性细胞疗法。本方法可以应用以治疗免疫病症、实体癌、血液癌和病毒感染。
本治疗方法可用于的肿瘤包含任何恶性细胞类型，如存在于实体瘤或血液肿瘤的那些细胞类型。示例性实体瘤可以包含，但不限于，选自由以下组成的组的器官的肿瘤：胰腺、结肠、盲肠、胃、脑、头、颈、卵巢、肾、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑色素瘤、前列腺和乳腺。示例性血液肿瘤包含骨髓肿瘤、T细胞或B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、母细胞瘤、骨髓瘤等。可以使用本文提供的方法治疗的癌症的另外的实例包含但不限于肺癌(包含小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、腹膜癌、胃癌或胃部癌症(包含胃肠道癌和胃肠道间质癌)、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾部癌症或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、各种类型的头颈癌和黑色素瘤。
癌症可以具体地属于以下组织学类型，但是不限于这些癌症：恶性赘生物；癌；未分化的癌；巨细胞癌和纺锤细胞癌(giant and spindle cell carcinoma)；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌(pilomatrix carcinoma)；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；组合的肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；恶性类癌瘤；支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌(chromophobe carcinoma)；嗜酸细胞癌；亲氧性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡腺癌；乳头状和滤泡腺癌；非包膜硬化性癌(nonencapsulating sclerosing carcinoma)；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附件癌(skin appendage carcinoma)；大汗腺癌(apocrine adenocarcinoma)；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺派杰氏病(mammarypaget's disease)；腺泡细胞癌；腺鳞状癌；腺癌伴鳞状化生(adenocarcinoma w/squamousmetaplasia)；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质瘤；恶性泡膜细胞瘤(thecoma,malignant)；恶性颗粒细胞瘤；恶性男性母细胞瘤(androblastoma,malignant)；塞尔托利氏细胞癌(sertolicell carcinoma)；恶性莱迪希细胞瘤(leydig cell tumor,malignant)；恶性脂质细胞瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺外副神经节瘤(extra-mammary paraganglioma,malignant)；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤(glomangiosarcoma)；恶性黑色素瘤；无黑素性黑色素瘤；浅表扩散黑色素瘤；雀斑痣样恶性黑色素瘤；肢端雀斑样黑色素瘤；结节性黑色素瘤；巨大色素痣中的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡状横纹肌肉瘤；基质肉瘤；恶性混合瘤；米勒氏混合瘤(mullerian mixed tumor)；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间质瘤；恶性布伦纳瘤(brenner tumor,malignant)；恶性叶状瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎性癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺瘤(struma ovarii,malignant)；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波济氏肉瘤(kaposi'ssarcoma)；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；近皮质骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间充质软骨肉瘤；骨巨细胞肿瘤；尤文氏肉瘤(ewing's sarcoma)；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞性牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞性纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原生质星形细胞瘤；纤维状星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质细胞瘤；少突胶质母细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；成神经细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金氏病(hodgkin's disease)；霍奇金氏；副肉芽肿；小淋巴细胞性恶性淋巴瘤；弥漫性大细胞恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样真菌病(mycosis fungoides)；其它指定的非霍奇金氏淋巴瘤(non-hodgkin'slymphomas)；B细胞淋巴瘤；低级别/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞性NHL；高级淋巴母细胞性NHL；高级小费切割细胞NHL；巨块病变NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；华氏巨球蛋白血症；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓样白血病；嗜碱性粒细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓样肉瘤；毛细胞白血病；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；急性髓系白血病(AML)；骨髓增生异常综合征(MDS)；慢性成髓细胞白血病；弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)；外周T细胞淋巴瘤(PTCL)；或间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)。在一些实施例中，癌症为多发性骨髓瘤。在一些实施例中，癌症为淋巴瘤。在一些实施例中，癌症为AML。
在本公开的某些实施例中，将免疫细胞(例如，NK细胞)递送给有需要的个体，如患有癌症或感染的个体。然后，所述细胞增强个体的免疫系统以攻击相应癌细胞或致病细胞或直接攻击相应癌细胞或致病细胞。在一些情况下，为个体提供一个或多个剂量的免疫细胞。在为个体提供两个或更多个剂量的免疫细胞的情况下，施用之间的持续时间应足以允许在个体中进行繁殖的时间，并且在具体实施例中，给药之间的持续时间为1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周或12周或更多周。
本公开的某些实施例提供了用于治疗或预防免疫介导的病症的方法。在一些实施例中，所述受试者患有自身免疫性疾病。自身免疫性疾病的非限制性实例包含：斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病(autoimmune Addison's disease)、肾上腺自身免疫性疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、自身免疫性血小板减少症、贝赛特氏病(Behcet's disease)、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻孢子淤积性皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多神经病变、Churg-Strauss综合征、瘢痕性类天疱疮、CREST综合征、感冒凝集素病、克罗恩氏病(Crohn's disease)、盘状狼疮、基本混合冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病(Graves'disease)、格林-巴雷病(Guillain-Barre)、桥本甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA神经病、幼年关节炎、扁平苔藓、红斑狼疮、梅尼埃氏病(Meniere's disease)、混合性结缔组织病、多发性硬化症、1型或免疫介导的糖尿病、重症肌无力、肾病综合征(如微小病变、局灶性肾小球硬化症或膜性肾病)、寻常性天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性无球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病关节炎、雷诺氏现象(Raynaud's phenomenon)、瑞特氏综合征(Reiter's syndrome)、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、舍格伦氏综合征(Sjogren's syndrome)、僵人综合征、系统性红斑狼疮、红斑狼疮、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎(如结节性多动脉炎、高安氏动脉炎(takayasuarteritis)、颞动脉炎/巨细胞动脉炎或疱疹样皮炎血管炎)、白癜风和韦格纳氏肉芽肿病(Wegener'sgranulomatosis)。因此，可以使用本文公开的方法治疗的自身免疫性疾病的一些实例包含但不限于多发性硬化症、类风湿性关节炎、系统性狼疮红斑病、I型糖尿病、克罗恩氏病；溃疡性结肠炎、重症肌无力、肾小球肾炎、强直性脊柱炎、血管炎或牛皮癣。受试者还可能患有过敏性病症，如哮喘。
在又另一实施例中，受试者是所移植的器官或干细胞的受体，并且使用免疫细胞以预防和/或治疗排斥。在特定实施例中，受试者患有或有风险患有移植物抗宿主病。GVHD是使用或含有来自相关或非相关供体的干细胞的任何移植物的可能并发症。存在两种种类的GVHD，即急性和慢性。急性GVHD出现在移植后前三个月内。急性GVHD的体征包含手和脚上的红色皮疹，所述红色皮疹可能扩散并且变得更严重，伴随皮肤脱落或起泡。急性GVHD还可能影响胃和肠，在这种情况下存在痉挛、恶心和腹泻。皮肤和眼睛变黄(黄疸)表明急性GVHD已经影响肝脏。慢性GVHD基于其严重程度进行排序：1期/级为轻度；4期/级为严重。慢性GVHD在移植后三个月或更晚出现。慢性GVHD的症状与急性GVHD的那些症状相似，但另外，慢性GVHD还可能影响眼睛的粘液腺、口腔中的唾液腺以及润滑胃粘膜和肠道的腺体。可以利用本文公开的免疫细胞群体的任何免疫细胞群体。所移植的器官的实例包含实体器官移植物，如肾、肝、皮肤、胰腺、肺和/或心脏，或细胞移植物，如胰岛、肝细胞、成肌细胞、骨髓或造血细胞或群体干细胞。移植物可以是复合移植物，如面部的组织。免疫细胞可以在移植前、与移植同时或在移植后施用。在一些实施例中，免疫细胞在移植物之前，如在移植物之前至少1小时、至少12小时、至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周或至少1个月施用。在一个特定的非限制性实例中，治疗有效量的免疫细胞的施用发生在移植前3-5天。
在一些实施例中，可以在免疫细胞疗法之前向受试者施用非清髓性淋巴细胞清除化学疗法。非清髓性淋巴细胞清除化学疗法可以是可以通过任何合适的途径施用的任何合适的此类疗法。非清髓性淋巴细胞清除化学疗法可以包括，例如，施用环磷酰胺(cyclophosphamide)和氟达拉滨(fludarabine)。环磷酰胺和氟达拉滨的示例性施用途径是静脉内施用。同样，可以施用任何合适剂量的环磷酰胺和氟达拉滨。在特定方面，施用大约60mg/kg环磷酰胺持续两天，之后施用大约25mg/m2氟达拉滨持续五天。
在一些实施例中，可以在免疫细胞疗法之前向受试者施用非清髓性淋巴细胞清除免疫疗法。非清髓性淋巴细胞清除免疫疗法可以是可以通过任何合适途径施用的任何合适的此类疗法。非清髓性淋巴细胞清除免疫疗法可以包括，例如，施用抗CD52剂或抗CD20剂。在一些实施例中，淋巴细胞清除免疫疗法为抗CD52抗体。在一些实施例中，抗CD52抗体为阿仑单抗(alemtuzumab)。在一些实施例中，淋巴细胞清除免疫疗法为抗CD20抗体。示例性抗CD20抗体包含但不限于利妥昔单抗(rituximab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥瑞利珠单抗(ocrelizumab)、奥妥珠单抗(obinutuzumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)或碘i131托西莫单抗(iodine i131 tositumomab)。施用抗CD52剂或抗CD20剂的示例性途径为静脉内。同样，可以施用任何合适剂量的抗CD52剂或抗剂。
在某些实施例中，促进免疫细胞的生长和激活的生长因子伴随着免疫细胞一起施用于受试者或在免疫细胞之后施用于受试者。免疫细胞生长因子可以是促进免疫细胞的生长和激活的任何合适的生长因子。合适的免疫细胞生长因子的实例包含白介素(IL)-2、IL-7、IL-15和IL-12，所述白介素可以单独使用或以各种组合使用，如IL-2和IL-7、IL-2和IL-15、IL-7和IL-15、IL-2、IL-7和IL-15、IL-12和IL-7、IL-12和IL-15或IL-12和IL2。
治疗有效量的免疫细胞可以通过多种途径施用，包含肠胃外施用，例如静脉内、腹膜内、肌内、胸骨内或关节内注射或输注。
用于过继性细胞疗法的免疫细胞的治疗有效量是在所治疗的受试者中达到期望效果的量。例如，这可以是抑制自身免疫性或同种免疫性疾病的进展或使自身免疫性或同种免疫性疾病消退所需的或能够缓解由自身免疫性疾病引起的症状，如疼痛和炎症的免疫细胞的量。这可以是缓解与炎症相关的症状，如疼痛、水肿和体温升高所必需的量。其还可以是减少或防止所移植的器官的排斥所必需的量。
免疫细胞群体可以按与疾病一致的治疗方案施用，例如在一周至几周内单次或几次给药以改善疾病状态，或在延长的时间内周期性给药以抑制疾病进展并防止疾病复发。调配物中采用的精确剂量还将取决于施用途径和疾病或病症的严重程度。免疫细胞的治疗有效量将取决于所治疗的受试者、患病的严重程度和类型以及施用方式。在一些实施例中，可以用于治疗人类受试者的剂量在至少3.8x104个、至少3.8x105个、至少3.8x106个、至少3.8x107个、至少3.8x108个、至少3.8x109个或至少3.8x1010个免疫细胞/m2的范围内。在某个实施例中，用于治疗人类受试者的剂量在约3.8x109个至约3.8x1010个免疫细胞/m2的范围内。在另外的实施例中，免疫细胞的治疗有效量可以从约5x106个细胞每kg体重至约7.5x108个细胞每kg体重，如约2x107个细胞至约5x108个细胞每kg体重、或约5x107个细胞至约2x108个细胞每kg体重或约5x106个细胞每kg体重至约1x107个细胞每kg体重变化。在一些实施例中，免疫细胞的治疗有效量可以从约1x105个细胞每kg体重至约10x109个细胞每kg体重变化。本领域技术人员可以很容易基于受试者的年龄、体重、性别和生理条件来确定免疫细胞的确切量。有效剂量可以从衍生自体外或动物模型测试系统的剂量应答曲线外推。
免疫细胞可以与一种或多种其它治疗剂组合施用，用于治疗免疫介导的病症。组合疗法可以包含但不限于一种或多种抗微生物剂(例如，抗生素、抗病毒剂和抗真菌剂)、抗肿瘤剂(例如，氟尿嘧啶、甲氨喋呤、紫杉醇、氟达拉滨、依托泊苷、多柔比星(doxorubicin)或长春新碱)、免疫耗竭剂(例如，氟达拉滨、依托泊苷、多柔比星或长春新碱)、免疫抑制剂(例如，硫唑嘌呤或糖皮质激素，如地塞米松或强的松)、抗炎剂(例如，糖皮质激素，如氢化可的松、地塞米松或强的松，或非甾体抗炎剂，如乙酰水杨酸、布洛芬或萘普生钠)、细胞因子拮抗剂(例如，抗TNF和抗IL-6)、细胞因子(例如，白介素-10或转化生长因子-β)、激素(例如，雌激素)或疫苗。另外，可以施用免疫抑制剂或耐受剂，所述免疫抑制剂或耐受剂包含但不限于钙调磷酸酶抑制剂(例如，环孢菌素和他克莫司(tacrolimus))；mTOR抑制剂(例如，雷帕霉素(Rapamycin))；吗替麦考酚酯、抗体(例如，识别CD3、CD4、CD40、CD154、CD45、IVIG或B细胞)；化疗剂(例如，甲氨蝶呤、曲奥舒凡(Treosulfan)、白消安(Busulfan))；辐射；或趋化因子、白介素或其抑制剂(例如，BAFF、IL-2、抗IL-2R、IL-4、JAK激酶抑制剂)。此类额外的药剂可以在施用免疫细胞之前、期间或之后施用，这取决于期望的效果。细胞和药剂的此施用可以通过相同途径或通过不同途径，并且可以在同一部位或在不同部位。
组合疗法
在一些实施例中，本实施例的组合物和方法涉及免疫细胞群体与至少一种另外的疗法的组合。另外的疗法可以是放射疗法、外科手术(例如，乳房肿瘤切除术和乳房切除术)、化学疗法、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法、单克隆抗体疗法或前述的组合。另外的疗法可以呈辅助或新辅助疗法的形式。
在一些实施例中，另外的疗法是施用小分子酶抑制剂或抗转移剂。在一些实施例中，另外的疗法是施用副作用限制剂(例如，旨在减少治疗副作用的发生和/或严重程度的药剂，如抗恶心剂等)。在一些实施例中，另外的疗法是放射疗法。在一些实施例中，另外的疗法是外科手术。在一些实施例中，另外的疗法是放射疗法和外科手术的组合。在一些实施例中，另外的疗法是γ放射。在一些实施例中，另外的疗法是靶向PBK/AKT/mTOR通路的疗法、HSP90抑制剂、微管蛋白抑制剂、凋亡抑制剂和/或化学预防剂。另外的疗法可以是本领域已知的化疗剂中的一种或多种。
免疫细胞疗法可以相对于如免疫检查点疗法等另外的癌症疗法在之前、期间、之后或以各种组合施用。施用的间隔的范围可以为同时到几分钟到几天到几周。在其中免疫细胞疗法是与另外的治疗剂分开提供给患者的实施例中，通常将确保在每次递送的时间之间不会超过显著的时间段，使得两种化合物仍将能够对患者发挥有利的组合作用。在此类情况下，设想了，可以在彼此约12小时至24小时或72小时内并且更具体地在彼此约6-12小时内向患者提供抗体疗法和抗癌疗法。在一些情况下，可以期望显著延长治疗时间段，其中在相应施用之间需要若干天(2天、3天、4天、5天、6天或7天)至若干周(1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周)的时间。
可以采用各种组合。对于以下实例，免疫细胞疗法为“A”，并且抗癌疗法为“B”：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
考虑到药剂的毒性(如果有的话)，向患者施用本实施例的任何化合物或疗法将遵循施用此类化合物的一般方案。因此，在一些实施例中，存在监测归因于组合疗法的毒性的步骤。
化学疗法
根据本实施例，可以使用多种化疗剂。术语“化学疗法”是指使用药物以治疗癌症。“化疗剂”用于表示在癌症治疗中施用的化合物或组合物。这些药剂或药物根据其在细胞内的活性模式进行分类，例如，其是否以及在什么阶段影响细胞循环。可替代地，药剂可以基于药剂与DNA直接交联、插入到DNA中或通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝分裂畸变的能力来表征。
化疗剂的实例包含烷化剂，如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮杂环丙烷，如苄替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包含六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三乙稀磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺和三甲蜜胺；乙酰精宁(acetogenin，具体地布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包含合成类似物拓扑替康)；苔藓虫素(bryostatin)；卡拉汀(callystatin)；CC-1065(包含其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(cryptophycin)(具体地念珠藻素1和念珠藻素8)；尾海兔素(dolastatin)；多卡米星(duocarmycin)(包含合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustard)，如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)和尿嘧啶芥(uracil mustard)；亚硝基脲(nitrosourea)，如卡莫司汀(carmustine)、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，如烯二炔类抗生素(例如，卡奇霉素(calicheamicin)，具体地卡奇霉素γ1I和卡奇霉素ω1I)；达内霉素(dynemicin)，包含达内霉素A；二膦酸盐(bisphosphonate)，如氯屈膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团(neocarzinostatin chromophore)和相关色素蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包含吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星和脱氧多柔比星(deoxy doxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、马塞罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)，如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalarnycin)、橄榄霉素类(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，如氨甲蝶呤(methotrexate)和5-氟脲嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)、蝶罗呤(pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)和硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、地西他滨(decitabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)和氟尿苷(floxuridine)；雄激素，如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)和睾内酯(testolactone)；抗肾上腺素，如米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；百垂布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfomithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(galliumnitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登醇(maytansinoid)，如美坦辛(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物；雷佐生(razoxane)；根瘤毒素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；尿烷(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；盖克托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷，例如，紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛吉西他滨(docetaxel gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤(mercaptopurine)；铂配位复合物，如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春花碱(vinblastine)；铂(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitroxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；米托蒽醌(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(difluorometlhylornithine，DMFO)；维甲酸，如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)；卡铂、丙卡巴肼(procarbazine)、光辉霉素(plicamycin)、吉西他滨(gemcitabine)、诺维本(navelbine)、法呢基蛋白转移酶抑制剂、反铂(transplatinum)以及上述药物中的任何药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施例中，阿扎胞苷以75mg/m2皮下施用。
放射疗法
导致DNA损伤并被广泛使用的其它因素包含通常被称为γ射线、X射线和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送的因素。还设想了其它形式的DNA损伤因素，如微波、质子束辐射(美国专利5,760,395和4,870,287)和UV辐射。最可能的是，所有这些因素对DNA、DNA的前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持产生广泛的损伤。X射线的剂量范围在50伦琴至200伦琴持续延长时间段(3周至4周)的每日剂量至2000伦琴至6000伦琴的单剂量的范围内。放射性同位素的剂量范围变化很大，并且取决于同位素的半衰期、发射的辐射的强度和类型以及肿瘤细胞的摄取。
免疫疗法
本领域的技术人员将理解，另外的免疫疗法可以与实施例的方法组合或结合使用。在癌症治疗的背景下，免疫疗法通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。利妥昔单抗是此类实例。免疫效应子可以是例如对肿瘤细胞的表面上的一些标志物具有特异性的抗体。单独的抗体可以充当疗法的效应子或者其可以募集其它细胞来实际影响细胞杀伤。抗体也可以与药物或毒素(化疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并且充当靶向剂。可替代地，效应子可以是携带与肿瘤细胞靶标直接或间接相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包含细胞毒性T细胞和NK细胞。
抗体-药物缀合物已成为用于开发癌症治疗剂的突破性方法。癌症是世界上死亡的主要原因之一。抗体-药物缀合物(ADC)包括与细胞杀伤药物共价连接的单克隆抗体(MAb)。这种方法将MAb针对其抗原靶标的高特异性与高效的细胞毒性药物组合，从而产生将有效负载(药物)递送到具有富集抗原水平的肿瘤细胞的“武装的”MAb。药物的靶向递送还可以最小化其在正常组织中的暴露，从而降低毒性并提高治疗指数。FDA对两种ADC药物：2011年的(维布本妥昔单抗(brentuximab vedotin))和2013年的(曲妥珠单抗美坦新(trastuzumab emtansine)或T-DM1)的批准验证了所述方法。目前在癌症治疗临床试验的各个阶段有30多种ADC药物候选物(Leal等人,2014)。随着抗体工程化和接头-有效负载优化变得越来越成熟，新ADC的发现和开发越来越依赖于适于这种方法的新靶标的鉴定和验证以及靶向MAb的产生。ADC靶标的两个标准是肿瘤细胞中上调的/高水平的表达和稳健的内化。
在免疫疗法的一个方面，肿瘤细胞必须带一些易于靶向，即不存在于大多数其它细胞上的标志物。存在许多肿瘤标志物并且在本实施例的上下文中，这些标志物中的任何标志物可以适合于靶向。常见的肿瘤标志物包含CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、层粘连蛋白受体、erb B和pl55。免疫疗法的替代性方面是将抗癌作用与免疫刺激作用组合。还存在免疫刺激分子，包含：细胞因子，如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN；趋化因子，如MIP-1、MCP-1、IL-8；以及生长因子，如FLT3配体。
目前正在研究或使用的免疫疗法的实例是免疫佐剂，例如，牛分枝杆菌、恶性疟原虫、二硝基氯苯和芳香族化合物(美国专利5,801,005和5,739,169；Hui和Hashimoto,1998；Christodoulides等人,1998)；细胞因子疗法，例如，干扰素α、β和γ、IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski等人,1998；Davidson等人,1998；Hellstrand等人,1998)；基因疗法，例如，TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin等人,1998；Austin-Ward和Villaseca,1998；美国专利5,830,880和5,846,945)；以及单克隆抗体，例如，抗CD20、抗神经节苷脂GM2和抗pl85(Hollander,2012；Hanibuchi等人,1998；美国专利5,824,311)。设想了一种或多种抗癌疗法可以与本文所描述的抗体疗法一起采用。
在一些实施例中，免疫疗法可以是免疫检查点抑制剂。免疫检查点调高信号(例如，共刺激分子)或调低信号。可以通过免疫检查点阻断靶向的抑制性检查点分子包含腺苷A2A受体(A2AR)、B7-H3(还被称为CD276)、B和T淋巴细胞弱化因子(BTLA)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4，还被称为CD152)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白(KIR)、淋巴细胞激活基因-3(LAG3)、程序性死亡1(PD-1)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)以及T细胞激活的V结构域Ig抑制因子(VISTA)。具体地，免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。
免疫检查点抑制剂可以是药物，如小分子、重组形式的配体或受体，或者具体地是抗体，如人抗体(例如，国际专利公开WO2015016718；Pardoll,《自然评论：癌症(Nat RevCancer)》,12(4):252-64,2012；两个文献通过引用并入本文)。可以使用已知的免疫检查点蛋白抑制剂或其类似物，具体地可以使用嵌合、人源化或人形式的抗体。如本领域的技术人员将了解的，替代性和/或等效名称可以用于本公开中所提及的某些抗体。在本公开的上下文中，此类替代性和/或等效名称是可互换的。例如，众所周知的是，兰布罗利珠单抗(lambrolizumab)也以替代性和等效名称MK-3475和派姆单抗(pembrolizumab)为人所熟知。
在一些实施例中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体的结合的分子。在一具体方面，PD-1配体结合配偶体为PDL1和/或PDL2。在另一实施例中，PDL1结合拮抗剂是抑制PDL1与其结合配偶体的结合的分子。在一具体方面，PDL1结合配偶体为PD-1和/或B7-1。在另一实施例中，PDL2结合拮抗剂是抑制PDL2与其结合配偶体的结合的分子。在一具体方面，PDL2结合配偶体为PD-1。拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。示例性抗体描述于美国专利第US8735553号、第US8354509号和第US8008449号中，所有这些专利通过引用并入本文。用于本文所提供的方法的其它PD-1轴拮抗剂是本领域已知的，如美国专利申请第US20140294898号、第US2014022021号和第US20110008369号中所描述的，所有这些专利通过引用并入本文。
在一些实施例中，PD-1结合拮抗剂为抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施例中，抗PD-1抗体选自由以下组成的组：纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗和CT-011。在一些实施例中，PD-1结合拮抗剂是免疫粘附素(例如，包括与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PDL1或PDL2的胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施例中，PD-1结合拮抗剂为AMP-224。纳武单抗，还被称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和为描述于WO2006/121168中的抗PD-1抗体。派姆单抗，还被称为MK-3475、Merck 3475、兰布罗利珠单抗、/>和SCH-900475，为描述于WO2009/114335中的抗PD-1抗体。CT-011，还被称为hBAT或hBAT-1，为描述于WO2009/101611中的抗PD-1抗体。还被称为B7-DCIg的AMP-224为描述于WO2010/027827和WO2011/066342中的PDL2-Fc融合可溶性受体。
本文所提供的方法中可以靶向的另一个免疫检查点为还被称为CD 152的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)。人CTLA-4的完整cDNA序列具有Genbank登录号L15006。CTLA-4存在于T细胞的表面上，并且当与抗原呈递细胞的表面上的CD80或CD86结合时充当“断开”开关。CTLA4是免疫球蛋白超家族的成员，其在辅助T细胞的表面上表达并向T细胞传递抑制信号。CTLA4与T细胞共刺激蛋白CD28类似，并且两种分子与抗原呈递细胞上的CD80和CD86，还分别称为B7-1和B7-2结合。CTLA4向T细胞传递抑制信号，而CD28传递刺激信号。胞内CTLA4也存在于调节性T细胞中并且可能对其功能很重要。通过T细胞受体和CD28进行的T细胞激活导致CTLA-4，即B7分子的抑制性受体的表达增加。
在一些实施例中，免疫检查点抑制剂为抗CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。
适用于本方法的抗人CTLA-4抗体(或衍生自其的VH和/或VL结构域)可以使用本领域熟知的方法产生。可替代地，可以使用本领域公认的抗CTLA-4抗体。例如，在以下中公开的抗CTLA-4抗体可以用于本文所公开的方法：US 8,119,129、WO 01/14424、WO 98/42752；WO 00/37504(CP675,206，还被称为曲美木单抗(tremelimumab)；原名替西利姆单抗(ticilimumab))、美国专利第6,207,156；号；Hurwitz等人(1998)《美国国家科学院院刊》95(17):10067-10071；Camacho等人(2004)/《临床肿瘤学杂志(J Clin Oncology)》22(145):摘要号2505(抗体CP-675206)；以及Mokyr等人(1998)《癌症研究(Cancer Res)》58:5301-5304。前述出版物中的每一个出版物的教导在此通过引入并入。还可以使用与本领域公认的这些抗体中的任何抗体竞争与CTLA-4结合的抗体。例如，人源化CTLA-4抗体描述于国际专利申请第WO2001014424号、第WO2000037504号和美国专利第8,017,114号中；所有这些专利通过引用并入本文。
示例性抗CTLA-4抗体为伊匹单抗(ipilimumab)(还被称为10D1、MDX-010、MDX-101和)或其抗原结合片段和变体(参见例如WO 01/14424)。在其它实施例中，抗体包括伊匹单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施例中，所述抗体包括伊匹单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域和伊匹单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一实施例中，所述抗体与上述抗体竞争与CTLA-4上的同一表位结合和/或与所述同一表位结合。在另一实施例中，所述抗体与上述抗体具有至少约90％可变区氨基酸序列同一性(例如，与伊匹单抗具有至少约90％、95％或99％可变区同一性)。
用于调节CTLA-4的其它分子包含CTLA-4配体和受体，如美国专利第US5844905号、第US5885796号和国际专利申请第WO1995001994号和第WO1998042752号中描述的，所有这些专利通过引用并入本文；以及免疫粘附剂，如在美国专利第US8329867号中描述的，所述专利通过引用并入本文。
用于治疗肾癌或肾细胞癌的免疫疗法的实例包含但不限于：Afinitor(依维莫司)、Afinitor Disperz(依维莫司)、阿地白介素、Avastin(贝伐单抗(Bevacizumab))、阿维鲁单抗(Avelumab)、阿昔替尼(Axitinib)、Bavencio(阿维鲁单抗)、贝伐单抗、Cabometyx(苹果酸卡博替尼-S)、苹果酸卡博替尼-S、依维莫司、IL-2(阿地白介素)、Inlyta(阿西替尼)、白介素-2(阿地白介素)、伊匹单抗、Keytruda(帕博利珠单抗(Pembrolizumab))、甲磺酸乐伐替尼(Lenvatinib Mesylate)、Lenvima(甲磺酸乐伐替尼)、Mvasi(贝伐单抗)、Nexavar(甲苯磺酸索拉非尼)、纳武单抗、Opdivo(纳武单抗)、帕唑帕尼(Pazopanib)、盐酸盐、派姆单抗、Proleukin(阿地白介素)、甲苯磺酸索拉非尼、苹果酸舒尼替尼、索坦(Sutent，苹果酸舒尼替尼)、替西罗莫司、驮瑞塞尔(Torisel，替西罗莫司)、Votrient(盐酸帕唑帕尼(Pazopanib Hydrochloride))、Yervoy(伊匹单抗)。
用于治疗急性髓系白血病(AML)的免疫疗法的实例包含但不限于阿扎胞苷、三氧化二砷、Cerubidine(盐酸柔红霉素)、环磷酰胺、阿糖胞苷、盐酸柔红霉素、盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体、Daurismo(马来酸格拉斯吉布(Glasdegib Maleate))、地塞米松、盐酸多柔比星(Doxorubicin Hydrochloride)、甲磺酸恩西地平(Enasidenib Mesylate)、吉妥珠单抗奥佐加霉素(Gemtuzumab Ozogamicin)、富马酸吉列替尼(Gilteritinib Fumarate)、马来酸格拉斯吉布、伊达霉素PFS(盐酸伊达柔比星)、盐酸伊达柔比星、Idhifa(甲磺酸恩西地平)、艾伏尼布(Ivosidenib)、米哚妥林(Midostaurin)、盐酸米托蒽醌、Mylotarg(吉妥珠单抗奥佐加霉素)、红比霉素(Rubidomycin，盐酸多诺比星)、Rydapt(米哚妥林)、Tabloid(硫鸟嘌呤)、硫鸟嘌呤、Tibsovo(艾伏尼布)、Trisenox(三氧化二砷)、Venclexta(维奈托克(Venetoclax))、维奈托克、硫酸长春新碱、Vyxeos(盐酸多诺比星和阿糖胞苷脂质体)、Xospata(富马酸吉列替尼)。
外科手术
大约60％的患有癌症的人将接受一些类型的外科手术，所述外科手术包含预防性、诊断性或分期性、治疗性和姑息性外科手术。治疗性外科手术包含切除，在所述切除中全部或部分癌组织被物理地去除、切除和/或破坏，并且可以与其它疗法结合使用，如本实施例的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法。肿瘤切除是指物理去除肿瘤的至少一部分。除了肿瘤切除，通过外科手术进行的治疗还包含激光外科手术、冷冻外科手术、电外科手术和显微镜控制的外科手术(莫氏外科手术(Mohs'surgery))。
在切除部分或全部癌细胞、组织或肿瘤后，在体内能形成空腔。治疗可以通过灌注、直接注射或用另外的抗癌疗法施涂区域来完成。此类治疗可以重复，例如，每1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天，或每1周、2周、3周、4周和5周，或每1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月。这些治疗也可以是不同的剂量。
其它药剂
设想了其它药剂可以与本实施例的某些方面组合使用以提高治疗的治疗功效。这些另外的药剂包含影响细胞表面受体和间隙连接的上调的药剂、细胞生长抑制剂和分化剂、细胞粘附抑制剂、增加过度增殖性细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂或其它生物药剂。通过增加间隙连接的数量来增加胞间信号传导将增加对邻近过度增殖性细胞群体的抗过度增殖性作用。在其它实施例中，细胞抑制剂或分化剂可以与本实施例的某些方面组合使用，以提高治疗的抗过度增殖性功效。设想了细胞粘附抑制剂提高本实施例的功效。细胞粘附抑制剂的实例是粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀(Lovastatin)。进一步设想了增加过度增殖性细胞对凋亡的敏感性的其它药剂，如抗体c225，可以与本实施例的某些方面组合使用，以提高治疗功效。
药物组合物
本发明的抗体(在本文中还被称为“活性化合物”)及其衍生物、片段、类似物和同源物可以并入到适于施用的药物组合物中。此类组合物通常包括抗体和药学上可接受的载剂。如本文所使用，术语“药学上可接受的载剂”旨在包含与药学施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。合适的载剂描述于最新版本的《雷明顿药物科学》，即本领域中的标准参考教科书中，所述文献通过引入并入本文。此类载剂或稀释剂的优选实例包含(但不限于)水、盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水性媒剂，如固定油。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途在本领域中是众所周知的。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则考虑在组合物中使用它们。补充性活性化合物也可以并入到这些组合物中。
本文还提供了包括免疫细胞(例如，NK细胞)和药学上可接受的载剂的药物组合物和调配物。
在一些实施例中，药物组合物包括约1x105个NK细胞至约1个x109个NK细胞的剂量。在一些实施例中，剂量为约1x105个、1x106个、1x107个、1x108个或1x109个NK细胞。在一些实施例中，药物组合物包括约5x105个NK细胞至约10x1012个NK细胞的剂量。
在一些实施例中，将药物组合物冷冻保存。
如本文所描述的药物组合物和调配物可以通过将具有期望的纯度的活性成分(如抗体或多肽)与一种或多种任选的药学上可接受的载剂(《雷明顿药物科学》第22版,2012)混合以冻干调配物或水溶液的形式制备。药学上可接受的载剂通常在所采用的剂量和浓度下对受体无毒，并且包含但不限于：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，所述抗氧化剂包含抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和包含葡萄糖、甘露糖或糊精的其它碳水化合物；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载剂进一步包含间质性药物分散剂，如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(百特国际公司(Baxter International,Inc.))。在美国专利公开第2005/0260186号和第2006/0104968号中描述了包含rHuPH20在内的某些示例性sHASEGP和使用方法。一方面，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(glycosaminoglycanase)，如软骨素酶组合。
本发明的医药组合物被调配成与其预定施用途径相容。施用途径的实例包含肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如，吸入)、经皮(即，局部)、经粘膜和直肠施用。用于肠胃外、皮内或皮下施涂的溶液或悬浮液可以包含以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的药剂，如氯化钠或右旋糖。pH可以用酸或碱调节，如盐酸或氢氧化钠。可以将肠胃外制剂包封在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适于可注射使用的药物组合物包含无菌水溶液(在可水溶的情况下)或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载剂包含生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(新泽西州帕西波尼市的巴斯夫公司(BASF,Parsippany,N.J.))或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的，并且应该是用于达到易于注射的程度的流体。其必须在制备和储存的条件下稳定，并且必须保存以抵抗如细菌和真菌等微生物的污染作用。载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。可以例如通过使用如卵磷脂等包衣、通过在分散体的情况下维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如，对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现对微生物的作用的预防。在许多情况下，将优选的是在组合物中包含等张剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
根据需要，可以通过将活性化合物以所需量并入在具有以上列举的组分中的一种或组合的适当溶剂中、随后进行无菌过滤来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物并入到含有基础分散介质以及来自以上列举的那些成分的所需其它成分的无菌媒剂中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法为真空干燥和冷冻干燥，所述真空干燥和冷冻干燥产生活性成分加上来自其先前经无菌过滤的溶液的任何另外的所需成分的粉末。
口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载剂。其可以被包封在明胶胶囊中或被压缩成片剂。出于口服治疗施用的目的，活性化合物可以与赋形剂一起并入并且以片剂、糖衣片或胶囊形式使用。口服组合物还可以使用用作漱口水的流体载剂制备，其中流体载剂中的化合物是口服应用的并且漱口并吐掉或吞咽。可以包含药学上相容的结合剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有下述成分或类似性质的化合物中的任一种：粘合剂，如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；分散剂，如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙调味料。
对于通过吸入施用，化合物从含有适合的推进剂，例如气体(如二氧化碳)的加压容器或分配器或者从雾化器以气溶胶喷雾形式递送。
也可以通过经粘膜或透皮方式进行全身施用。对于经粘膜或经皮施用，可以在调配物中使用适用于要渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域已知的，并且例如对于经粘膜施用，包含清洁剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾或栓剂实现。如本领域中通常已知，对于经皮施用来说，活性化合物被调配成软膏、药膏、凝胶或乳膏。
化合物也可以制备成栓剂形式(例如，用常规的栓剂基质，如可可脂和其它甘油酯)或用于直肠递送的保留灌肠剂。
在一个实施例中，将活性化合物与将保护这些化合物免于从体内快速消除的载剂一起制备，如控释调配物，包含植入物和微囊化的递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类调配物的方法对本领域的技术人员而言是显而易见的。这些材料也可以从阿尔扎公司(Alza Corporation)和新星制药有限公司(Nova Pharmaceuticals,Inc.)商购获得。脂质体悬浮液(包含用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向到受感染的细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载剂。这些可以根据本领域的技术人员已知的，例如美国专利第4,522,811号中描述的方法来制备。
特别有利的是以剂量单位形式调配口服或肠胃外组合物以便于施用和剂量统一。如本文所使用的，剂量单位形式是指适于作为用于要治疗的受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有预定量的活性化合物，所述预定量被计算为产生与所需的药物载剂相关的所期望的治疗效果。针对本发明的剂量单位形式的规格受制于并直接取决于：活性化合物的独特特性和待实现的特定治疗效果，和所属领域中混配此类活性化合物以用于治疗个体所固有的限制。
药物组合物可以与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。
制品或试剂盒
提供了包括双特异性抗体的制品或试剂盒，并且本文还提供了免疫细胞。所述制品或试剂盒可以进一步包括包装插页，所述包装插页包括用于使用免疫细胞以治疗或延迟个体的癌症进展或增强患有癌症的个体的免疫功能的说明书。本文所述的抗原特异性免疫细胞中的任何抗原特异性免疫细胞都可以包含在制品或试剂盒中。合适的容器包含例如瓶、小瓶、袋和注射器。所述容器可以由多种材料形成，如玻璃、塑料(如聚氯乙烯或聚烯烃)或金属合金(如不锈钢或哈氏合金(hastelloy))。在一些实施例中，所述容器将调配物和标记保持或缔合，容器可以表示供使用的说明书。制品或试剂盒可以进一步包含由市售和使用者观点看来合乎需要的其它材料，包含其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用说明书的包装插页。在一些实施例中，制品进一步包含另一种药剂(例如，化疗剂和抗肿瘤剂)中的一种或多种。适于一种或多种药剂的容器包含，例如，瓶、小瓶、袋和注射器。
实例
实例1：产生与人NKp46结合的小鼠单克隆抗体
小鼠抗NKp46单克隆抗体与表达NKp46的细胞的结合
为了开发针对NKp46的抗体，用融合蛋白对NKp46缺陷型小鼠(Ncr1gfp/gfp(Gazit等人,2006))进行注射，所述融合蛋白由NKp46的与人IgG融合的胞外部分(NKp46-Ig)组成。评估新产生的抗NKp46 mAb与NKp46结合的能力。示出了克隆02、09和12的数据。检查表达NKp46的小鼠胸腺瘤BW转染细胞(BW NKp46)上的结合。可商购获得的抗NKp46 mAb(表示为9E2)和抗NKp46 mAb(461-G1)(Amon等人,2004；Mandelboim等人,2001)用作对照。基于流式细胞术实验，所测试的所有抗体均与BW NKp46特异性相互作用，但不与亲本BW细胞相互作用(图1A)。用IL-2激活的原代大量人NK细胞(经激活的NK细胞)重复此实验，以证明抗体识别由人NK细胞天然表达的NKp46(图1B)。整个实验中使用的经激活的NK细胞是从PBMC中分离的。纯化后，NK细胞为大约97％纯，并且验证CD56+CD3-表面标志物。所有抗体(9E2、461-G1、02、09和12)均对经激活的NK细胞进行阳性染色。用来自另外的供体的PBMC获得了类似结果。
使用小鼠抗NKp46 mAb抑制内源性NKp46配体结合
为了确定抗NKp46 mAb是否阻断NKp46与其配体的相互作用，使用了表达NKp46的未知配体的BJAB、MCF7和C1R肿瘤细胞(图2)。将NKp46-Ig单独或与抗NKp46 mAb和对照抗体一起在冰上温育。随后，使用经处理的NKp46-Ig融合蛋白以对肿瘤细胞进行FACS染色。抗NKp46 mAb均不能够阻断NKp46-Ig与细胞的结合(图2)。
使用小鼠抗NKp46抗体下调NK细胞上的表面表达的NKp46
为了测试抗NKp46 mAb是否导致NK细胞的表面上的NKp46表达减少，将人抗NKp46mAb与经激活的NK细胞一起在4℃或37℃下温育8小时。然后用缀合的次级抗小鼠抗体对细胞进行FACS染色。所测试的mAb中的仅一种02导致NKp46的水平降低(图3)。内化测定仅用9E2对照、461-G1对照和02进行，并且描述于(Berhani等人,2018)中。用02处理经激活的NK细胞仅使NKp46的平均表面下调60％(Berhani等人,2018)。02与NKp46结合通过溶酶体通路导致受体内化和降解(Berhani等人,2018)。12和09抗NKp46抗体并未导致NKp46从NK细胞的表面下调。
综上所述，这些测定揭示了一种在其下调NKp46表面表达的能力方面独特的新抗体02。两种其它抗体09和12可以用于产生双特异性或三特异性抗体。这些抗体与NKp46特异性结合，并且其不干扰NKp46与其同源配体的结合。
使用利用这些抗体对两个原代经激活的原代NK细胞进行的剂量应答FACS染色以证实这一发现(图4)。随着所测试的抗体的浓度降低，FACs染色中的荧光信号也降低。因此，09和12抗体表现出强剂量应答。这与商用抗NKp46对照抗体和461-G1对照抗体的结果相似。
这些结果表明，09和12抗NKp46抗体适于产生双特异性和三特异性抗体，所述双特异性和三特异性抗体将在NK细胞与肿瘤细胞之间进行桥接；由此导致肿瘤细胞杀伤。
BIAcore结合亲和力
使用BIAcore测定确定两种小鼠抗NKp46(09和12)的结合亲和力。图5和表9示出了09抗体的结合亲和力。图6和表10示出了12抗体的结合亲和力。
表9：通过BIAcore确定的09抗NKp46抗体的结合亲和力
表10：通过BIAcore确定的12抗NKp46抗体的结合亲和力
KD(M) SE(KD) Rmax(RU) SE(Rmax) 偏移(RU) SE(偏移)
1.67E-09 2.20E-10
317.8 19 6.1 2.1
实例2：与人NKp46结合的人源化抗体的产生
使用小鼠抗NKp46抗体(09抗体、12抗体)以产生具有IgG4框架的人源化抗NKp46抗体(09抗体人源化；12抗体人源化)。图7A和图7B分别示出了重链可变区氨基酸序列比对和轻链可变区氨基酸序列比对。所产生的人源化序列示出SEQ ID NO:25(12的重链的人源化)、SEQ ID NO:29(09的重链的人源化)、SEQ ID NO:26(09的轻链的人源化)和SEQ ID NO:30(12的轻链的人源化)。制备了四种人源化克隆：B341001、B341002、B341003和B341004。
>SEQ ID NO:25(09的重链的人源化)；
>SEQ ID NO:26(09的轻链的人源化)。
>SEQ ID NO:29(12的重链的人源化)；
>SEQ ID NO:30(12的轻链的人源化)
使用在HEK293细胞或CHO细胞上表达的人NKp46抗原(Acro生物系统公司(AcroBiosystems))测试人源化抗体与NKp46的结合。
1.在3种浓缩物相对于3种缓冲液的基质中测试抗原涂覆以找到最佳信号。
2.使用最佳信号条件来涂覆ELISA托盘。标准阻断和洗涤步骤。
3.在10次稀释的浓度范围内施涂初级抗体。(Mab具有MMT人源化可变和经突变的IgG4)
4.使用次级抗体来检测结合(抗抗-Huκ与HRP、TMB底物)。
5.在450nm处测量吸光度。
用于人源化09抗NKp46抗体的结合数据示出于表11中。使用归一化结合曲线，所估计的KD值为27pM。
表11：人源化09抗NKp46抗体结合数据
[09抗体]nM 吸光度％，经归一化的
5.218 0.709891
1.650 0.689258
0.5218 0.669464
0.1650 0.54814
0.05218 0.469117
0.01650 0.349274
用于人源化12抗NKp46抗体的结合数据示出于表12中。使用归一化结合曲线，所估计的KD值为25pM。
表12：人源化12抗NKp46抗体结合数据
BIACore测定
使用BIAcore测定确定人源化抗NKp46抗体(B341001、B341002、B341003和B341004)与NKp46结构域的结合亲和力。图8示出了在这些研究中测试的全长NKp46多肽D1结构域和D2结构域。
在本测定中，用小鼠NKp46抗体9和12、商用小鼠NKp46抗体9E9和人源化NKp46抗体(B241001、B341002、B341003和B341004)温育BW细胞和被转染以表达NKp46的BW细胞(BWNKp46)。抗体染色经转染的BW NKp46细胞而非亲本BW细胞，这表明人源化NKp46抗体和小鼠抗体具有特异性。因此，抗体与所表达的NKp46特异性结合。
使用小鼠抗人抗体9和12在以下浓度下针对NKp46表达对50,000个亲本BW细胞、被转染以表达NKp46的BW细胞或原代经IL-2激活的NK细胞(NK Fiji)进行染色：1μg/ml、5μg/ml和10μg/ml。使用抗PAFR抗体作为阴性对照。图9示出了这些实验的结果。
使用各种人源化抗NKp46抗体在以下浓度下针对NKp46表达对50,000个亲本BW细胞、被转染以表达NKp46的BW细胞或原代经IL-2激活的NK细胞(NK Fiji)进行染色：1μg/ml、5μg/ml和10μg/ml。使用抗PAFR抗体作为阴性对照。图10示出了这些实验的结果。
如表13所示，与NKp46多肽的D2结构域结合的人源化抗体。09和12小鼠抗NKp46单克隆抗体被包含在内作为对照，并且也与D2结构域结合。09抗NKp46单克隆抗体也显示出与D1结构域结合。
表13：人源化抗NKp46抗体与NKp46结构域的结合亲和力
D1-Ig D2-Ig NKp46-Ig
B341001 - - -
B341002 - 3.32E-16 2.53E-16
B341003 - 2.48E-16 2.30E-17
B341004 - 5.13E-16 1.76E-17
Hyb 09 1.53E-14 3.68E-16 2.59E-16
Hyb 12 - 3.09E-16 3.15E-16
实例3：与人Nkp46结合的人源化抗体和小鼠单克隆抗体的功能表征
检查了人源化抗体激活NK细胞杀伤的能力。将2500个小鼠肥大细胞瘤细胞系P815用0.05μg抗体在冰上温育一小时，然后添加10,000个NK细胞，并且将细胞在37℃下温育5小时。使用PAR-R作为对照抗体。使用抗GPC3抗体作为对照。使用两种对照抗体均未观察到NK细胞杀伤。9E2为商用抗NKp46抗体。图11示出了人源化抗体激活NK细胞杀伤。
接下来，检查人源化抗体影响通过NK细胞对HepG2细胞(表达GPC3的细胞)的杀伤的能力。将5000个HepG2细胞与1μg或5μg小鼠NKp46抗体09和12、商用小鼠NKp46抗体9E9和人源化NKp46抗体B241001、B341002、B341003和B341004一起在冰上温育1小时。然后添加100,000个NK细胞，并且将细胞在37℃下温育5小时。图12显示，抗NKp46抗体均不影响HepG2细胞的杀伤。
实例4-与人CD38结合的人源化CD38抗体的产生
产生了两种与CD38结合的人源化抗体(CD38-IgG1 L234A、L235A和CD38-IgG1野生型)。测试了人源化抗体与人CD38的结合。用0.1mg/孔人CD38蛋白涂覆ELISA板。将第1抗体(人源化抗aNKp46抗体或人源化抗CD38抗体)以0.1mg/孔添加。将次级抗体1:7500稀释。添加链霉亲和素-HRP和TMB底物后，在650nm处测量光学吸光度。抗CD38抗体与人CD38特异性结合，而人源化抗NKp46对照抗体不与其结合。
实例5：与人NKp46和人CD38结合的双特异性抗体分子的产生
构建了与人NKp46和CD38结合的双特异性抗体分子(NKE2)。图13A示出了双特异性抗体分子的示意图，在所述双特异性抗体分子中mAb 1具有抗NKp46抗原识别区，并且mAb 2具有抗CD38抗原识别区。在一些情况下，这些双特异性抗体分子是NK细胞衔接子双特异性抗体分子(图13B)。NK细胞衔接子双特异性抗体可以与NK细胞和肿瘤细胞两者结合并介导NK介导的细胞毒性。
双特异性抗体与表达NKp46和CD38的细胞的结合
使用了三种不同类型的细胞以测试双特异性抗体分子与NKp46和CD38的结合-不表达NKp46或CD38的BW细胞、表达NKp46的BW细胞和表达CD38的KMS11和MM1.S MM细胞。将50,000个细胞与0.5μg抗CD38和NKp46双特异性抗体、抗CD38抗体或无抗体(对照)一起在冰上温育1小时，然后添加AF-647缀合的抗人抗体持续另外30分钟。此实验显示，双特异性抗体与NKp46(使用BW NKp46臂)和KMS11或MM1.S MM细胞(使用抗CD38臂)结合。
观察到在NKE2 WT或突变体Fc(Fc沉默)的情况下与MM1S和KMS11多发性骨髓瘤细胞的剂量依赖性结合，并且未观察到与CD38敲除的MM.1S细胞系的结合(图14)。在NKE2 WT和突变体Fc的情况下观察到与BW细胞的类似结合(图15A和15B)。
实例6：与人NKp46和人CD38结合的双特异性抗体分子的功能表征
通过NK细胞进行的KMS11和MMS.1细胞杀伤-放射性测定
KMS11和MMS.1细胞表达CD38。为了确定KMS11和MMS.1MM细胞是否可以在存在与NKp46和CD38结合的双特异性抗体的情况下被NK细胞杀死，将KMS11和MMS.1MM细胞用35S-甲硫氨酸进行放射性标记，并且以5000个细胞/孔铺板在96板中。将原代经激活的人NK细胞针对不同的效应子:靶标(E:T)比以不同的量添加到孔中(100,000个、50,000个、25,000个和12,500个细胞每孔，20:1、10:1、5:1和2.5:1比率)。将细胞在37℃下温育5小时，并且采集培养基，并且使用β计数器确定放射性。在各种E:T比率下在存在双特异性抗体的情况下测量KMS11和MMS.1MM细胞。
通过NK细胞进行的KMS11和MMS.1MM细胞杀伤-脱粒测定
将不同量的KMS11和MMS.1MM细胞铺板在96板中(500,000个、250,000个、125,000个、62,500个、31,250个、15,625个和7,800个细胞/孔)。然后将5000个原代经激活的人NK细胞与aCD56和aCD107A抗体一起添加。将细胞在37℃温育2小时。NK脱粒通过对CD56阳性细胞上的CD107进行流式细胞术染色计算。将细胞与抗NKp46和抗CD38双特异性抗体、抗NKp46抗体对照和抗CD38抗体对照一起温育。测量在不同E:T比率下在双特异性抗体中所展示的脱粒的百分比。脱粒是通过NK细胞进行的KMS11和MMS.1MM杀伤的代理。因此，这显示出与NKp46和CD38两者结合的双特异性抗体比单独的单特异性抗体对KMS11和MMS.1MM杀伤的功能作用增加。
实例7：与人NKp46和人CD38结合的双特异性抗体分子的体内功能表征
与人NKp46和CD38结合的双特异性抗体在人MM异种移植模型中的影响
将表达荧光素酶的MM1.S细胞(MM1.Sluc)注射到免疫缺陷型(NSG)小鼠的尾静脉中，并且每3天或4天通过IVIS成像系统测量荧光素酶水平。MM1.S注射后十三天，在利用和不利用抗NKp46和CD38双特异性抗体的情况下将经纯化的人T细胞进行I.V.移植。进行了用于确定减小肿瘤大小所需的双特异性抗体的安全量的剂量应答实验。将提高浓度的双特异性抗体和单抗体(人源化抗NKp46和抗CD38)注射到携带肿瘤的小鼠体内。抗体注射一周两次进行施用。对于4周的时间段，每天对小鼠进行监测(小鼠的体重和一般外观)，并且通过数字游标卡尺测量其肿瘤。人道终点设定为1cm3的肿瘤体积或相对于初始体重20％的重量损失。四周后，将小鼠处死，并且将肿瘤取出并称重。观察到对肿瘤生长的显著抑制(肿瘤体积和重量降低)的处理将被视为是成功的。
实例8：新型多功能四价CD38 NKp46 FLEX-NKTM衔接子的表征
CD38是多发性骨髓瘤的NK细胞介导的细胞毒性的经临床验证的靶标。NKE2是具有同时与所靶向的癌细胞和NK细胞两者结合的新型FLEX接头的四价IgG1样多功能NK衔接子抗体。NK接合和激活是通过针对天然细胞毒性受体NKp46的粘合剂介导的。NKE2包括人源化09抗体的抗CD38结合结构域和NKp47结合结构域(序列参见表1-6)。在此实例中，表征了两个版本的NKE2，一种具有野生型(WT)Fc，并且另一种具有突变体无效Fc。
NKE2显示出与多发性骨髓瘤细胞系的剂量依赖性结合
确定NKE2与表达CD38的多发性骨髓瘤细胞系MM1S和KMS11以及与CD38敲除的MM.1S细胞系的结合。观察到在NKE2 WT或突变体Fc(Fc沉默)的情况下与MM1S和KMS11多发性骨髓瘤细胞的剂量依赖性结合，并且未观察到与CD38敲除的MM.1S细胞系的结合(图14)。
NKE2显示出与NK细胞的剂量依赖性结合
确定NKE2与BW细胞的结合。将BW亲本细胞或经人Nkp46转染的BW细胞与NKE2或对照IgG1一起在RT下温育1小时。然后将细胞用次级抗IgG1 PE Ab染色，并且通过流式细胞术测量结合(抗IgG1 PE的MFI)。结果示出于图15A和15B中。在NKE2 WT和突变体Fc的情况下观察到与BW细胞的类似结合。
表位制图研究表明NKE2与和达雷妥尤单抗不同的位点结合
通过CD38丙氨酸扫描诱变进行的NKE2表位制图分析表明NKE2与和达雷妥尤单抗不同的位点结合。结果示出于图16中。影响NKE2结合的丙氨酸突变体以绿色突出显示，并且已知影响达雷妥尤单抗结合的残基以红色突出显示(残基S232对应于具有先导序列的S274)。这些数据表明通过NKE2检测到不同的表位。
NKE2对多发性骨髓瘤细胞系显示剂量依赖性PBNK重定向的细胞溶解。
在增加的NKE2浓度的情况下在为5的固定E/T比率下持续20小时评估PBNK细胞毒性测定，并且通过流式细胞术评估靶标细胞溶解。结果示出于图17A-17C中。KMS11和MM1S多发性骨髓瘤细胞的NKE2剂量依赖性PBNK重定向的细胞溶解依赖于CD38表达，因为在MM1SCD38KO细胞的情况下观察到最小细胞溶解。与NKE2 Fc突变体相比，NKE2 WT-Fc显示出略高的细胞溶解。
针对对多发性骨髓瘤MM1S细胞的NKE2 PB-NK细胞重定向的细胞溶解、脱粒和细胞 因子产生
在不同NKE2浓度下在为1的固定E/T比率下持续24小时评估PB-NK细胞溶解，并且通过流式细胞术分析靶标裂解。将PBNK脱粒在E/T比率为1的情况下持续5小时评估并且通过使用抗CD107a抗体的流式细胞术进行评估。结果示出于图18A中。与达雷妥尤单抗或单一CD38和NKp46 mAb相比，NKE2显示出针对多发性骨髓瘤MM1S细胞显著更高的剂量依赖性PB-NK细胞重定向的细胞溶解和脱粒。这些结果表明，NKp46和CD38在相对的NK和MM细胞上通过NKE2的共同接合促进了通过这种NK细胞衔接子观察到更高效力。有趣的是，在没有功能性Fc的情况下，单独的NKp46 mAb诱导对多发性骨髓瘤细胞的外周血NK细胞溶解，这与先前的报告一致，即NKp46在对骨髓瘤细胞的NK细胞介导的杀伤中起关键作用。
通过流式细胞术对IFN-g和TNF-a进行胞内染色评估细胞因子产生。结果示出于图18B中。与达雷妥尤单抗和单个CD38和NKp46 mAb相比，在与MM细胞以1的E/T比率一起温育5小时后，NKE2也诱导更高％的IFN-g和TNF-a产生性PBNK细胞。
NKE2在体外在人PBMC中未显示出显著的免疫亚群耗竭和低水平的NK细胞自相残 杀和细胞因子释放
使用活死细胞染料，通过流式细胞术在存在NKE2或达雷妥尤单抗或人IgG的情况下使用经纯化的PBNK评估NK细胞自相残杀。结果示出于图19A中。与NKE2 WT和NKE2 MUT相比，达雷妥尤单抗显示出更高的PBNK细胞自相残杀。
在与NKE2或达雷妥尤单抗或hIgG1一起温育24小时之后通过流式细胞术进行免疫亚群分析之后，评估NKE2对人PBMC免疫细胞亚群耗竭的影响。结果示出于图19B中。在达雷妥尤单抗显示出NK细胞和单核细胞的耗竭时，用NKE2 WT和NKE2 MUT观察到最小免疫细胞耗竭。
在人PBMC测定中在与NKE2或抗CD3或CD28 mAb(TGN1412)或hIgG1一起温育48小时后评估NKE2诱导细胞因子释放的潜力，并且通过多重ELISA测定测试上清液中细胞因子的存在。结果示出于图19C中。在用抗CD3和CD28(TGN1412)mAb观察到强效细胞因子释放时，用NKE2观察到最小细胞因子释放。
结论
本实例中讨论的结果表明，CD38 NKp46衔接子具有与达雷妥尤单抗不同的用于靶向表达CD38的多发性骨髓瘤的良好的NK细胞衔接子谱。
通过引用并入
本文所提及的所有出版物、专利和登录号通过引用以其整体特此并入，如同每个单独的出版物或专利被专门地且单独地指示为通过引用并入。
其它实施例
虽然已经结合其具体描述对本发明进行了描述，但前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其它方面、优点和修改都处于以下权利要求的范围内。

Claims (37)

1.一种与NKp46和CD38特异性结合的双特异性抗体，所述双特异性抗体包括：
i)第一重链，所述第一重链包括：
重链互补决定区1(CDRH1)，所述CDRH1包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列；
重链互补决定区2(CDRH2)，所述CDRH2包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列；以及
重链互补决定区3(CDRH3)，所述CDRH3包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列；
ii)第一轻链，所述第一轻链包括：
轻链互补决定区1(CDRL1)，所述CDRL1包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列；
轻链互补决定区2(CDRL2)，所述CDRL2包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列；以及
轻链互补决定区3(CDRL3)，所述CDRL3包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列；
iii)第二重链，所述第二重链包括：
CDRH1，所述CDRH1包括SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
CDRH2，所述CDRH2包括SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及
CDRH3，所述CDRH3包括SEQ ID NO:34的氨基酸序列；以及
iv)第二轻链，所述第二轻链包括：
CDRL1，所述CDRL1包括SEQ ID NO:35的氨基酸序列；
CDRL2，所述CDRL2包括SEQ ID NO:36的氨基酸序列；以及
CDRL3，所述CDRL3包括SEQ ID NO:37的氨基酸序列；并且
其中所述双特异性抗体包括第一抗原结合区和第二抗原结合区，所述第一抗原结合区包括i)和ii)，所述第一抗原结合区与NKp46特异性结合，所述第二抗原结合区包括iii)和iv)，所述第二抗原结合区与CD38特异性结合。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中
所述第一重链包括第一重链可变区，所述第一重链可变区包括SEQ ID NO:23、25、27或29的氨基酸序列；
所述第一轻链包括第一轻链可变区，所述第一轻链可变区包括SEQ ID NO:24、26、28或30的氨基酸序列；
所述第二重链包括第二重链可变区，所述第二重链可变区包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列；并且
所述第二轻链包括第二轻链可变区，所述第二轻链可变区包括SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合区包括：
a)第一重链和第一轻链，所述第一重链包括第一重链可变区，所述第一重链可变区包括SEQ ID NO:23的氨基酸序列，所述第一轻链包括第一轻链可变区，所述第一轻链可变区包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列；
b)第一重链和第一轻链，所述第一重链包括第一重链可变区，所述第一重链可变区包括SEQ ID NO:25的氨基酸序列，所述第一轻链包括第一轻链可变区，所述第一轻链可变区包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列；
c)第一重链和第一轻链，所述第一重链包括第一重链可变区，所述第一重链可变区包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列，所述第一轻链包括第一轻链可变区，所述第一轻链可变区包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列；或
d)第一重链和第一轻链，所述第一重链包括第一重链可变区，所述第一重链可变区包括SEQ ID NO:29的氨基酸序列，所述第一轻链包括第一轻链可变区，所述第一轻链可变区包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述第二抗原结合区包括：
第二重链和第二轻链，所述第二重链包括第二重链可变区，所述第二重链可变区包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列，所述第二轻链包括第二轻链可变区，所述第二轻链可变区包括SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中
a)所述第一重链包括第一重链可变区，所述第一重链可变区包括SEQ ID NO:23的氨基酸序列；所述第一轻链包括第一轻链可变区，所述第一轻链可变区包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列；所述第二重链包括第二重链可变区，所述第二重链可变区包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列；并且所述第二轻链包括第二轻链可变区，所述第二轻链可变区包括SEQ IDNO:39的氨基酸序列；
b)所述第一重链包括第一重链可变区，所述第一重链可变区包括SEQ ID NO:25的氨基酸序列；所述第一轻链包括第一轻链可变区，所述第一轻链可变区包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列；所述第二重链包括第二重链可变区，所述第二重链可变区包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列；并且所述第二轻链包括第二轻链可变区，所述第二轻链可变区包括SEQ IDNO:39的氨基酸序列；
c)所述第一重链包括第一重链可变区，所述第一重链可变区包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列；所述第一轻链包括第一轻链可变区，所述第一轻链可变区包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列；所述第二重链包括第二重链可变区，所述第二重链可变区包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列；并且所述第二轻链包括第二轻链可变区，所述第二轻链可变区包括SEQ IDNO:39的氨基酸序列；或者
d)所述第一重链包括第一重链可变区，所述第一重链可变区包括SEQ ID NO:29的氨基酸序列；所述第一轻链包括第一轻链可变区，所述第一轻链可变区包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列；所述第二重链包括第二重链可变区，所述第二重链可变区包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列；并且所述第二轻链包括第二轻链可变区，所述第二轻链可变区包括SEQ IDNO:39的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包括：融合的重链，所述融合的重链包括SEQ ID NO:41的氨基酸序列；第一轻链，所述第一轻链包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列；以及第二轻链，所述第二轻链包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包括：SEQ ID NO:46的氨基酸序列；第一轻链，所述第一轻链包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列；以及第二轻链，所述第二轻链包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包括至少两个具有不同CH1结构域和CL结构域的Fab片段，其中所述Fab片段包括：
a)第一Fab片段，所述第一Fab片段由以下组成：
i.与NKp46特异性结合的VH区和VL区；
ii.人免疫球蛋白的CH1结构域，所述CH1结构域包括所述CH1结构域的位置192处的苏氨酸残基变为谷氨酸残基的取代；以及
iii.人免疫球蛋白的CL-κ结构域，所述CL-κ结构域包括所述CL结构域的位置137处的天冬酰胺残基变为赖氨酸残基的取代以及所述CL结构域的位置114处的丝氨酸残基变为丙氨酸残基的取代；
b)第二Fab片段，所述第二Fab片段由以下组成：免疫球蛋白的野生型人CH1结构域和野生型人CL结构域以及与CD38特异性结合的VH区和VL区；并且
其中用于所述CH1结构域和所述CL结构域的序列位置编号参考Kabat编号，并且Fab片段是以任何顺序串联布置的，并且
其中所述第一Fab片段的所述CH1结构域的C末端与下一个Fab片段的VH结构域的N末端的连接是通过多肽接头进行的。
9.根据权利要求8所述的双特异性抗体，其中所述多肽接头包括SEQ ID NO:9或44的氨基酸序列。
10.根据权利要求8所述的双特异性抗体，其进一步包括：
c)免疫球蛋白的二聚化的CH2结构域和CH3结构域；以及
d)IgA、IgG或IgD的铰链区，所述铰链区将所述抗原结合区的所述CH1结构域的C末端与所述CH2结构域的N末端连接。
11.根据权利要求8所述的双特异性抗体，其进一步包括Fc结构域，所述Fc结构域衍生自IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域。
12.根据权利要求11所述的双特异性抗体，其中Fc结构域区包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
13.根据权利要求11所述的双特异性抗体，其中所述Fc结构域区包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的双特异性抗体，其中所述IgG抗体为IgG1抗体或IgG4抗体。
16.一种核酸序列，其编码根据权利要求1至15中任一项。
17.一种多特异性抗体，其包括根据权利要求1至15中任一项所述的双特异性抗体的所述抗原结合区。
18.一种治疗、预防或延缓有需要的受试者的与异常CD38表达或活性相关的病理的进展的方法，所述方法包括施用有效量的根据权利要求1至15中任一项所述的双特异性抗体或根据权利要求17所述的多特异性抗体。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述病理为癌症。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述癌症为多发性骨髓瘤。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述癌症为淋巴瘤。
22.根据权利要求23所述的方法，其中所述癌症为白血病。
23.一种重定向有需要的受试者的NK细胞应答的方法，所述方法包括施用有效量的根据权利要求1至15中任一项所述的双特异性抗体或根据权利要求17所述的多特异性抗体。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述NK细胞应答为NK介导的细胞毒性或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
25.一种促进通过自然杀伤(NK)细胞使表达CD38的细胞(CD38+细胞)特异性裂解的方法，所述方法包括使所述CD38+细胞与有效量的根据权利要求1至15中任一项所述的双特异性抗体接触，
其中所述有效量是足以促进通过NK细胞使所述CD38+细胞特异性裂解的量。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述CD38+细胞为多发性骨髓瘤细胞或淋巴瘤细胞。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述接触步骤包括向患有多发性骨髓瘤或淋巴瘤或有风险患上多发性骨髓瘤或淋巴瘤的受试者施用所述双特异性抗体。
28.一种抑制多发性骨髓瘤细胞、淋巴瘤细胞或CD38+癌细胞在用根据权利要求1至15中任一项所述的双特异性抗体治疗的受试者体内增殖的方法，所述方法包括施用有效量的自然杀伤(NK)细胞。
29.根据权利要求18至24中任一项所述的方法，其中所述方法包括施用有效量的自然杀伤(NK)细胞。
30.一种用于治疗多发性骨髓瘤、淋巴瘤或CD38+癌的组合疗法或试剂盒，所述组合疗法或试剂盒包括NK细胞和根据权利要求1至15中任一项所述的双特异性抗体。
31.根据权利要求1至15中任一项所述的双特异性抗体，其用于与NK细胞组合使用。
32.一种自然杀伤(NK)细胞和根据权利要求1至15中任一项所述的双特异性抗体的用途，其用于治疗多发性骨髓瘤、白血病(例如，急性髓系白血病)、淋巴瘤或CD38+癌。
33.一种试剂盒，其包括根据权利要求1至15中任一项所述的双特异性抗体。
34.根据权利要求25至29中任一项所述的方法，其中所述NK细胞为诱导多能干细胞衍生的自然杀伤(iPSC-NK)细胞。
35.根据权利要求25至29中任一项所述的方法，其中所述NK细胞为供体源性NK细胞。
36.根据权利要求25至29中任一项所述的方法，其中所述NK细胞为经照射的永生化NK细胞。
37.根据权利要求25至29中任一项所述的方法，其中所述CD38+癌为血液系统恶性病或实体瘤。
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