KR20200026253A - Siglec-9 중화 항체 - Google Patents

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이나뜨 파르마
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Abstract

본 발명은 면역 세포에서 억제 활성을 갖는 인간 Siglec에 결합하고, 이러한 Siglec의 억제 활성을 중화시키는 제제에 관한 것이다. 이러한 제제는 암 또는 감염성 질병의 치료를 위해 이용될 수 있다.

Description

SIGLEC-9 중화 항체
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 모든 도면 및 서열 목록을 포함하여, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는, 2017년 7월 10일에 출원된 미국 가출원 제62/530,463호 및 2017년 9월 6일에 출원된 미국 가출원 제62/554,750호의 이익을 청구한다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록은 154 KB 크기의, 2018년 7월 3일에 생성된 "Sig794 PCT_ST25 txt" 표제의 파일로 제공된다. 서열 목록의 전자 형식의 정보는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 NK 및/또는 다른 면역 세포에서 억제 활성을 가지는 인간 Siglec 단백질에 결합하며, 이러한 Siglec의 억제 활성을 중화시키는 제제에 관한 것이다. 이러한 제제는 암 또는 감염성 질병의 치료를 위해 이용될 수 있다.
NK 세포는 림프구 선조체로부터 골수에서 발달하는 단핵 세포이며, 형태적 특징 및 생물학적 특성에는 전형적으로 클러스터 결정기(CD) CD16, CD56, 및/또는 CD57의 발현; 세포 표면 상에서 알파/베타 또는 감마/델타 TCR 복합체의 부재; "자가" 주조직 적합성 복합체(MHC)/인간 백혈구 항원(HLA) 단백질을 발현하지 못하는 표적 세포에 결합하고 이를 사멸시키는 능력; 및 활성화 NK 수용체에 대한 리간드를 발현하는 종양 세포 또는 다른 질병을 갖는 세포를 사멸시키는 능력이 포함된다. NK 세포는 사전 면역화 또는 활성화가 필요 없이 몇몇 유형의 종양 세포주에 결합하고 이를 사멸시키는 이의 능력을 특징으로 한다. NK 세포는 또한 면역계에 대해 조절 효과를 발휘하는 가용성 단백질 및 사이토카인을 방출할 수 있고; 다회의 세포 분열을 거쳐 모체 세포와 유사한 생물학적 특성을 갖는 딸 세포를 생산할 수 있다. 보통, 건강한 세포는 NK 세포에 의한 용해로부터 보호된다.
생물학적 특성에 기반하여, NK 세포의 조정에 의존하는 다양한 치료 및 백신 전략이 당분야에서 제안되었다. 그러나, NK 세포 활성은 자극 및 억제 신호가 둘 다 관여되는 복잡한 기전에 의해 조절된다. 간략하게, NK 세포의 용해 활성은 표적 세포 상에서 리간드와의 상호작용 시 양성 또는 음성 세포내 신호를 전달하는 다양한 세포 표면 수용체에 의해 조절된다. 이들 수용체를 통해 전달되는 양성 및 음성 신호 간 밸런스가 표적 세포가 NK 세포에 의해 용해(사멸)되는지 또는 용해(사멸)되는지 여부를 결정한다. NK 세포 자극 신호는 자연 세포독성 수용체(NCR), 예컨대 NKp30, NKp44, 및 NKp46뿐만 아니라 NKG2C 수용체, NKG2D 수용체, 소정 활성화 킬러 Ig-유사 수용체(KIR), 및 다른 활성화 NK 수용체(Lanier, Annual Review of Immunology 2005;23:225-74)에 의해 매개될 수 있다. NK 세포 억제 신호는 CD94/NKG2-A와 같은 수용체뿐만 아니라 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I-분자를 인식하는 소정 억제 KIR에 의해 매개될 수 있다(Wagtmann et al. (1995) Immunity 5:439-449). 이들 억제 수용체는 다른 세포 상에 존재하는 MHC 클래스 I 분자(HLA 클래스 I 포함)의 다형성 결정기에 결합하며 NK 세포-매개 용해를 억제한다.
NK 세포의 용해 활성은 또한 siglec 폴리펩타이드에 의해 조절될 수 있다. Siglec(sialic-acid-binding immunoglobulin-like lectin, 시알산-결합 면역글로불린-유사 렉틴)은 시알로글리칸에 결합하는 I-형 렉틴의 하위세트이며 세포 유형 및 분화에 의존하는 방식으로 조혈계 세포 상에서 우선적으로 발현된다. 시알산은 도처에서 발현되는 반면, 전형적으로 당단백질 및 지질의 말단 위치에서는, 하위말단 탄수화물 모이어티에 대한 결합 및 정체에 따라, 개별 Siglec 수용체에 의해 매우 특이적이고 독특한 시알로글리칸 구조만이 인식된다. Siglec은 N-아세틸뉴라민산(Neu5Ac) α2-6 및 α2-3 결합을 함유하는 일반 포유류 시알로사이드 구조에 대해 낮은 일반적 친화도만을 갖는다.
Siglec은 일반적으로 2개 그룹으로 구분되며, 첫 번째 하위세트는 Siglec-1, Siglec-2, Siglec-4 및 Siglec-15로 이루어지고, Siglec의 CD33-관련 그룹에는 Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-7, Siglec-8, Siglec-9, Siglec-10, Siglec-11, Siglec-12, Siglec-14 및 Siglec-16이 포함된다. CD33-관련 Siglec은 특히, 낮은 진화 보존도 및 여러 기전에 의해 신속히 변하는 서열을 특징으로 한다.
Moretta 그룹(이탈리아, 제노바)에서 1999년에 최초 클로닝하여 특성규명하였으며 인간 CD33-관련 Siglec 수용체에 속하는 1형 막통과 단백질인 Siglec-7(CD328)은 시알산 결합 N-말단 V-세트 Ig 도메인, 2개의 C2-세트 Ig 도메인 및 하나의 면역-수용체 티로신 기반 억제 모티프(ITIM) 및 하나의 ITIM-유사 모티프를 함유하는 세포질내 영역을 특징으로 한다. Siglec-7은 NK 세포, 수지상 세포, 단핵구 및 호중구에서 구성적으로 발현된다. 상기 수용체의 세포외 도메인은 우선적으로 (2,8)-결합 디시알산 및 분기화 α 2,6-시알릴 잔기, 예컨대 갱글리오사이드 GD3에 의해 나타내는 것들에 결합한다.
Siglec-9(CD329)는 2000년에 Varki 그룹에서 특성규명되었으며(예컨대, 문헌[Angata et al. J Biol Chem 2000; 275:22127-22135] 참고) 단핵구, 호중구, 수지상 세포, CD34+ 세포 및 NK 세포 상에서 발현된다. Siglec-9(뿐만 아니라 Siglec-8)는 시알산 및 설페이트를 둘 다 함유하는 시알로사이드 리간드에 대해 차별적인 특이성을 갖는 것으로 나타났으며, 설페이트의 위치가 특이성의 중요한 결정인자이다. Siglec-9는 암 세포 상에서 과발현되는 MUC16에 결합하는 것으로 나타났다. Siglec-7과 마찬가지로, Siglec 9도 시알산 결합 N-말단 V-세트 Ig 도메인, 2개의 C2-세트 Ig 도메인 및 하나의 면역-수용체 티로신 기반 억제 모티프(ITIM)와 하나의 ITIM-유사 모티프를 함유하는 세포질내 영역을 함유한다. 인간 Siglec-9의 N-말단 V-세트 Ig 도메인은 인간 Siglec-7의 N-말단 V-세트 Ig 도메인과 약 77%의 전반적인 아미노산 서열 동일성을 공유하며, 이들 두 siglec은 상이한 시알산 결합 특이성을 나타낸다.
결합 검정은 Siglec-7과 유사하게, Siglec-9가 갈락토스에 대해 α2,3-글리코시드계 결합 또는 α2,6-글리코시드계 결합에서 시알산을 인식함을 보고하였다. Siglec-9 특이적 mAb를 이용하여, Zhang 등((2000) J. Biol. Chem. Vol. 275, No. 29: 22121-22126)은 Siglec-9가 단핵구, 호중구, 및 CD16+, CD56- 세포의 소수 집단에 의해 높은 또는 중간 수준으로 발현됨이 확인되었다고 보고하였다. 그러나, 약 50%의 B 세포 및 NK 세포 그리고 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포의 소수의 하위세트 상에서는 더 약한 발현이 관찰되었다. 저자들은 이의 높은 서열 유사성 정도에도 불구하고, Siglec-7 및 Siglec-9이 구별되는 발현 프로필을 갖는다고 결론지었다.
NK 및 다른 면역 세포 상에서 Siglec-9의 흥미로운 발현 프로필, 및 Siglec-9 중화에서의 잠재적인 치료 관심에도 불구하고, 현재까지 Siglec-9를 특이적으로 중화시키는 후보 치료제는 치료 용도를 위해 진전되거나 제안되지 않았다. 종양-연관 시알산 리간드에 의한 골수단핵구 계통 세포 상 Siglec-9의 연루는 미생물을 인식하고 직접 사멸시키는 NK 세포뿐만 아니라 호중구, 특화된 과립구에 의한 면역감독 및 종양 세포 사멸을 억제하는 것으로 보고되었다(Laubli et al. (2014) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 111(39): 14211-14216). Carlin 등((2009) Blood 113: 3333-3336)은 숙주 시알릴화 글리칸의 모방이 박테리아 병원체로 하여금 호중구 Siglec-9에 연루되어 선천성 면역 반응을 방해할 수 있도록 함을 보고하였다. Carlin 등은 항-Siglec-9 항체 191240(R&D Systems, inc.)을 Siglec-9에 대한 시알산 결합 부위로의 결합 및 시알산과의 상호작용 억제로서 설명한다. Carlin 등은 비-차단 항체(클론 E10-286, BD Biosciences inc.)와는 다르게, 클론 191240이 박테리아 세포에 대한 호중구의 활성화를 증강시킨다고 추가 보고하였다. 유사하게, 문헌[Laubli et al. (2014), 상기 문헌]은 항-Siglec-9 항체 클론 191240이 호중구에 의한 종양 세포의 사멸을 증강시키지 않은 클론 E10-286에 비해, 호중구에 의한 종양 세포의 사멸을 증강시킬 수 있음을 보고하였다.
항-Siglec-7 항체는 뮤린 항-siglec-7 항체 QA79를 언급하는 유럽 특허 1238282B1(Moretta et al) 및 문헌[Vitale et al. ((1999) Proc. Nat. Acad. Sci. 96(26):15091-96)]에 기재되었을 뿐만 아니라 문헌[Falco et al. (1999) J. Exp. Med. 190:793-801]에서는 항-Siglec-7 항체 Z176을 보고한다.
문헌[Hudak et al. (2014) Nat. Chem. Biol. 10:69-77]에서는 차단 항-Siglec-7 항체가 NK 세포에 의한 용해로부터 종양 표적 세포의 Siglec-7 매개 보호를 억제함을 보고하였다. 그러나, Siglec-9로 돌아가보면, 항-Siglec-9 항체(클론 191240이 이용됨)는 호중구에 의한 종양 세포의 사멸을 증강시키는 능력에도 불구하고(문헌[Laubli et al. (2014)] 참고), 인간 공여체로부터 정제된 NK 세포에 의한 용해로부터 종양 표적 세포의 Siglec-9 매개 보호를 억제할 수 없었다(문헌[Hudak et al (2014)] 참고). 문헌[Laubli et al. (2014)]에서 호중구에 의한 종양 세포의 사멸을 증강시키지 않으며 비-차단성으로 보고된 2가 결합 항체 클론 E10-286도 일차 NK 세포에 의한 용해로부터 종양 표적 세포의 Siglec-9 매개 보호를 억제하지 못했다(Jandus et al. (2014) J. Clin. Invest. 124(4): 1810-18020).
Siglec-7 및 Siglec-9에 대한 관심에도 불구하고, 이들 수용체를 표적화하는 치료제는 개발되지 않았다. 따라서 암과 같은 질병의 치료에서 이용하기 위한 이들 수용체를 표적화하는 제제에 대한 필요성이 존재한다.
하나의 양태에서, 본 개시는 호중구 및/또는 다른 세포에 비해 더 낮은 수준의 세포 표면 Siglec을 발현하는 인간 개체에서, 특히 NK 세포 상의, 인간 Siglet의 강력한 중화제로서 작용하고며 효과기 림프구(Siglec-7, Siglec-9)에서 억제 세포 표면 수용체로서 작용하는, 고친화도 결합제 항체를 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 개시는 Siglec-9의 경쟁적 및 비-경쟁적 억제제를 포함하는 Siglec(예컨대, 세포 표면에 발현되는 Siglec-9) 억제제를 제공한다. 각각의 억제제는 Siglec 및 이의 시알산 리간드 간 상호작용을 실질적으로 차단하거나 차단하지 않으면서 Siglec의 억제 활성 중화에서 특히 높은 효능을 갖는다.
하나의 구현예에서, Siglec 억제제는 인간 Siglec-9 단백질에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질, 예컨대 항체 또는 항체 단편, 또는 이를 포함하는 단백질이다. 하나의 구현예에서, Siglec 억제제는 인간 Siglec-7 및/또는 표 1의 다른 인간 Siglec에 결합하지 않고 인간 Siglec-9 단백질에 특이적으로 결합한다(mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 및 mAb-F로 예시됨). 하나의 구현예에서, Siglec 억제제는 선택적으로 또한 표 1의 다른 인간 Siglec에 결합하지 않고, 인간 Siglec-9 단백질 및 인간 Siglec-7 단백질에 특이적으로 결합한다(mAb-4, mAb-5, mAb-6로 예시됨). 하나의 구현예에서, Siglec 억제제는 선택적으로 또한 표 1의 다른 인간 Siglec에 결합하지 않고, 인간 Siglec-9 단백질, 인간 Siglec-7 단백질 및 인간 Siglec-12 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편이다(mAb-1, mAb-2 및 mAb-3으로 예시됨). 하나의 구현예에서, Siglec 억제제는 인간 Siglec-9 단백질에 2가 결합할 수 있는 항체 또는 항체 단편이다(억제제는 각각 인간 Siglec-9 단백질에 결합할 수 있는 2개의 항원 결합 도메인을 포함한다).
하나의 구현예에서, 본 개시는 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하며 Siglec-9 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시키는 단리된 항체를 제공하며, 선택적으로 이 항체는 Siglec-9 폴리펩타이드 및 이의 시알산 리간드 간 상호작용을 실질적으로 차단하지 않으며(mAb1, mAb2 및 mAb3으로 예시됨, 실시예 10 참고), 선택적으로 이 항체는 Siglec-9 폴리펩타이드 및 이의 시알산 리간드 간 상호작용을 차단한다(mAbA, mAbB 및 mAbC로 예시됨, 실시예 10 참고). 선택적으로, Siglec-9 폴리펩타이드는 세포, 예컨대 인간 개체로부터의 효과기 림프구, NK 세포, 예컨대, 일차 NK 세포, CD56dim NK 세포의 표면에서 발현된다. 하나의 구현예에서, 항체는 인간 Siglec-7 폴리펩타이드에 추가로 결합하며 Siglec-7 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시키고, 선택적으로는 추가로 이 항체는 Siglec-7 폴리펩타이드 및 이의 시알산 리간드 간 상호작용을 실질적으로 차단하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 항체는 인간 Siglec-7 폴리펩타이드에 결합하지 않는다.
하나의 양태에서, 본 발명은 특히, 인간 Siglec-9에 특이적으로 결합하며 시알산 리간드-보유 표적 세포에 대한 NK 세포(예컨대 일차 NK 세포)의 활성(예컨대 세포독성)을 증강시키는 항체의 발견으로부터 생긴다. 호중구, 이의 세포 표면에 고수준의 Siglec-9를 발현하거나 발현하도록 제조된 Siglec 전달감염체 및/또는 다른 세포에서만 세포독성을 증강시킬 수 있는 선행 기술의 항체와는 달리, 본원에 기재되는 항체는 저수준의 Siglec-9를 발현하는 세포, 예컨대 인간에서의 NK 세포(예컨대 CD56dim NK 세포)에서도 기능적이다. 이러한 Siglec-9 저-발현 NK 세포의 세포독성을 증강시키는 능력은 질병 표적 세포, 예컨대 종양 세포, 바이러스 감염된 세포 및/또는 박테리아 세포에 대해 상기 세포 집단을 추가적으로 가동화할 수 있는 이점을 갖는다.
하나의 구현예에서, 인간 Siglec-9에 특이적으로 결합하고 Siglec-9를 발현하는 NK 세포가 Siglec-9의 시알산 리간드를 발현하는 표적 세포와 인큐베이션되는 표준 4-시간 시험관내 세포독성 검정에서 NK 세포(일차 NK 세포)의 세포독성을 증강시키고/시키거나 복원하는 항체 또는 항체 단편(또는 이러한 단편을 포함하는 단백질)이 제공된다. 하나의 구현예에서 표적 세포는 NK 세포의 첨가 전에 51Cr로 표지된 후 사멸(세포독성)이 세포로부터 배지로의 51Cr 방출과 비례하는 것으로 산정된다. 선택적으로, 검정은 본원에서의 실시예에서의 방법에 따라 수행될 수 있으며, 예컨대 실시예 8을 참고한다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 Siglec-9를 발현하는 NK 세포의 세포독성을 적어도 Siglec-9를 발현하지 않는 NK 세포로 관찰되는 수준까지 복원시킬 수 있다(예컨대, 본원에서 실시예의 방법에 따라 결정됨).
본원에서 임의의 양태에서, NK 세포(예컨대 일차 NK 세포)는 공여체로부터 정제되고, 선택적으로 이용 전에 37℃에서 하룻밤 인큐베이션되는 신선 NK 세포로서 특정될 수 있다. 본원에서 임의의 양태에서, NK 세포 또는 일차 NK 세포는 Siglec-9를 발현하는 것으로 특정될 수 있고, 예컨대, 검정에서 이용하기 위해 세포는 유세포 측정에 의해 Siglec-9 상에서 관문화될 수 있다. 예컨대 본원에서, 실시예 8에 기재된 NK 세포를 참고한다.
또 다른 구현예에서, 인간 Siglec-9에 특이적으로 결합하며 단핵구-유래 수지상 세포(moDC)에서 Siglec-9 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시키는 항체 또는 항체 단편(또는 이러한 단편을 포함하는 단백질)이 제공된다. 하나의 구현예에서, moDC는 이의 표면에 Siglec-9의 이의 표면에 Siglec-9의 시알산 리간드를 보유한다. 하나의 구현예에서, moDC는 이의 표면에 시알산과의 시스-상호작용에 연루되는 Siglec-9 폴리펩타이드를 보유한다. 하나의 구현예에서, 항체는 moDC에서 활성화 또는 신호전달을 증가시킨다. 하나의 구현예에서, 항체는 Siglec-9의 시알산 리간드를 보유하는 moDC에서 Siglec-9 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시키며, 여기서 moDC는 시알산 리간드를 제거하기 위한 뉴라미다제로의 moDC의 처리로 moDC에 대한 항체 결합에 있어서 더 낮은 EC50을 생성하는 세포이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 특히, Siglec-7 및 Siglec-9 폴리펩타이드 둘 다에 필적하는 친화도로 결합하는 항-Siglec 항체의 발견으로부터 생긴다. 이러한 항체는 유리한 약리학적 특징을 갖는다. 본원에서 나타낸 바와 같이, NK 세포는 억제 Siglec-7 및 억제 Siglec-9 단백질을 둘 다 발현할 수 있지만, Siglec-7 및 Siglec-9는 또한 상이한 세포 집단에 걸쳐 상이한 발현 프로필을 가질 수 있다. 또한, 종양 세포가 Siglec-7에 대한 그리고 Siglec-9에 대한 천연 리간드(글리칸)를 발현할 수 있는 것으로 나타났다. 결과적으로, 하나의 Siglec은 억제하지만 다른 것은 억제하지 않는 치료제는 NK 및/또는 다른 면역 세포 집단 활성의 Siglec-매개 제한의 중화에서 최대로 효율적이 아닐 수 있다. 따라서 Siglec 7 및 9 둘 다의 억제가 유리할 수 있다. 그러나, Siglec-9는 인간 Siglec-7의 N-말단 V-세트 Ig 도메인과 단지 약 77%의 전반적인 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 또한, 이들 두 siglec은 상이한 시알산 결합 특이성을 나타내어 시알산 리간드에 의해 결합되는 영역의 구조적 차이를 제시한다.
하나의 양태에서, 본 개시는 Siglec-7 및/또는 Siglec-9의 억제 활성을 중화시키고 억제 인간 Siglec-7 폴리펩타이드 및 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 필적하는 친화도로 특이적으로 결합할 수 있는 고친화도 결합제 항체를 제공한다. 예를 들어, 소정 구현예에서, Siglec-7 및 Siglec-9에 필적하는 친화도로 결합하는 항체는 각각의 Siglec 및 이의 시알산 리간드(들) 간 상호작용을 차단하는 증가된 능력을 갖는다(mAb4, mAb5 및 mAb6으로 예시됨, 실시예 6 참고). 다른 구현예에서, Siglec-9에 결합하는 항체는 Siglec-9 및 이의 시알산 리간드(들), 특히 Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb 구조를 포함하는 시알산 간 상호작용을 실질적으로 차단하지 않고, Siglec-9의 억제 활성의 중화를 특징으로 할 수 있다(mAb1, mAb2 및 mAb3으로 예시됨, 실시예 9 참고).
본원에서 나타낸 바와 같이, 인간 Siglec-9는 Sia1(Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb) 및 Sia2(6'-시알릴락토스)에 둘 다 결합하는 반면, Siglec-7은 Sia2에만 결합한다. 하나의 양태에서, 이러한 Siglec 폴리펩타이드(들)과 Siglec-9 및 Siglec-7 둘 다의 시알산 리간드, 예컨대 Sia2 시알산의 상호작용을 차단할 수 있는 항체가 제공된다. 하나의 구현예에서, 시알산은 시알릴화 삼당류이다. 하나의 구현예에서, 시알산은 6'-시알릴락토스 구조를 포함한다.
또 다른 양태에서, 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하며 이의 억제 활성을 중화시키는 항체가 제공되며, 여기서 항체는 Sia1(Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb) 및 Sia2(6'-시알릴락토스) 둘 다와 Siglec-9 폴리펩타이드의 상호작용을 차단할 수 있다(mAb1, mAb2 및 mAb3으로 예시됨, 실시예 10 참고).
하나의 구현예에서, Siglec-7 및 Siglec-9에 결합할 수 있는 항체는 이의 표면에 Siglec-7 또는 Siglec-9를 발현하는 세포(예컨대, 각각의 Siglec 중 하나로 전달감염되었으나 다른 Siglec은 발현하지 않는 CHO 세포)로의 결합에 대해 유세포 측정에 의해 결정되는, 인간 Siglec-9 폴리펩타이드로의 결합에 대한 그 EC50으로부터 1-log 미만 만큼 상이한 인간 Siglec-7 폴리펩타이드로의 결합에 대한 EC50을 갖는다. 하나의 구현예에서, 항체는 이의 표면에 Siglec-7 또는 Siglec-9를 발현하는 세포로의 결합에 대해 유세포 측정에 의해 결정되는, 0.5 log, 0.3 log, 0.2 log 또는 0.1 log 이하만큼 상이한 인간 Siglec-7 폴리펩타이드 및 인간 Siglec-9 폴리펩타이드로의 결합에 대한 EC50을 갖는다. 이의 표면에 Siglec-7 또는 Siglec-9를 발현하는 세포는 필적하는 발현 수준으로 각각의 siglec을 발현하는 것을 특징으로 할 수 있다.
하나의 구현예에서, 항체는 인간 Siglec-7 및/또는-9에 대해 필적하는 친화도로 비-인간 영장류 Siglec에 추가로 결합한다. 하나의 구현예에서, 항체는 이의 표면에 Siglec-7 또는 Siglec-9를 발현하는 세포(예컨대, 각각의 Siglec로 전달감염된 CHO 세포)로의 결합에 대해 유세포 측정에 의해 결정되는 1-log, 0.5 log, 0.3 log, 0.2 log 또는 0.1 log 이하만큼 상이한 인간 Siglec-7 폴리펩타이드, 인간 Siglec-9 폴리펩타이드 및 비-인간 영장류 Siglec로의 결합에 대한 EC50을 갖는다.
하나의 구현예에서, 인간 Siglec-9의 활성을 중화시키고, 이의 표면에 Siglec-9를 발현하는 세포(예컨대, Siglec로 전달감염된 CHO 세포)로의 결합에 대해 유세포 측정에 의해 결정되는, 1-log, 0.5 log, 0.3 log, 0.2 log 또는 0.1 log 이하만큼 상이한 인간 Siglec-9 폴리펩타이드 및 비-인간 영장류 Siglec으로의 결합에 대한 EC50을 갖는 항체가 제공된다.
하나의 구현예에서, 항체는 인간 Siglec-7 폴리펩타이드 및 인간 Siglec-9 폴리펩타이드(및 선택적으로는 추가의 비-인간 영장류 Siglec)로의 결합에 대해 10-배, 5-배, 3-배 또는 2-배 이하만큼 상이한, 예컨대 표면 플라즈몬 공명(SPR) 스크리닝에 의해(예컨대, BIAcore? SPR 분석 장치로의 분석에 의해) 결정되는 결합 친화도에 대한 KD를 갖는다.
하나의 구현예에서, 항체는 인간 인간 Siglec-9 폴리펩타이드(및 선택적으로 추가로 인간 Siglec-7 폴리펩타이드 및/또는 비-인간 영장류 Siglec)로의 결합에 대해 1 x 10-7 M 이하의 KD를 갖는다. 하나의 구현예에서, 항체는 인간 인간 Siglec-9 폴리펩타이드(및 선택적으로 추가로 인간 Siglec-7 폴리펩타이드 및/또는 비-인간 영장류 Siglec)로의 결합에 대해 약 1 × 10-7 M 내지 약 1 × 10-10 M, 또는 약 1 × 10-8 M 내지 약 1 × 10-10 M의 KD를 갖는다. 하나의 구현예에서, 항-Siglec-9 항체는 인간 인간 Siglec-9 폴리펩타이드로의 결합에 대해(예컨대, 1가 친화도) 약 1 × 10-7 M 내지 약 1 × 10-10 M, 또는 약 1 × 10-8 M 내지 약 1 × 10-10 M, 또는 약 1 × 10-9 M 내지 약 1 × 10-11 M의 KD를 가지며, 여기서 항체는 인간 Siglec-7 폴리펩타이드에 대해 실질적인 결합을 갖지 않는다. 본원의 임의의 구현예에서, 항체의 1가 결합 친화도는 항체가 Fab' 단편으로서 시험되는 경우 평가된다.
하나의 구현예에서, 항체는 추가로 임의의 인간 Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-8, Siglec-10, Siglec-11 및 Siglec-12에 실질적으로 결합하지 않는다. 하나의 구현예에서, 항체는 추가로 임의의 Siglec-14 및 Siglec-16에 실질적으로 결합하지 않는다. 하나의 구현예에서, 항체는 추가로 인간 Siglec-6에 실질적으로 결합하지 않는다. 하나의 구현예에서, 항체는 추가로 인간 Siglec-12에 실질적으로 결합하지 않는다.
본원에서 임의의 구현예에서, 항-Siglec 항체는 세포(예컨대, NK 세포, Siglec-7 및/또는 Siglec-9를 발현하도록 제조된 세포, 예컨대, 실시예에 나타낸 바와 같이, 그 표면에 Siglec-7 및/또는 Siglec-9를 발현하도록 제조된 재조합 CHO 숙주 세포)의 표면 상에서 발현되는 폴리펩타이드로의 결합을 특징으로 할 수 있으며, 선택적으로는 추가로 항체는 유세포 측정에 의해 결정되는 고친화도로 결합한다. 예를 들어, 항체는 일차 NK 세포 (예컨대, 인간 개체 또는 공여체로부터의 생물학적 샘플로부터 정제된 NK 세포), 선택적으로 CD56dim NK 세포로의 결합에 대해, 유세포 측정에 의해 결정되는, 5 ㎍/㎖ 이하, 선택적으로 1 ㎍/㎖ 이하, 0.5 ㎍/㎖ 이하, 0.2 ㎍/㎖ 이하 또는 0.1 ㎍/㎖ 이하의 EC50을 특징으로 할 수 있다. EC50은, 예를 들어, 실시예 9의 방법에 따르면, 예컨대, 4명 이상의 건강한 공여체가 평가되고, BD FACS Canto II에서 염색이 획득되고, FlowJo 소프트웨어를 이용해서 분석되고, 4-파라미터 로지스틱 피팅을 이용하여 EC50이 계산되어 결정될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 인간 Siglec-7 및/또는 Siglec-9 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하며 면역 세포에서 이러한 Siglec(들)의 억제 활성을 중화시키고 이러한 폴리펩타이드(들)와 이의 시알산 리간드의 상호작용을 차단할 수 있는 항체 또는 항체 단편(예컨대 항원 결합 도메인 또는 이를 포함하는 단백질)이 제공된다. 하나의 구현예에서, 시알산은 시알릴화 삼당류이다. 하나의 구현예에서, 시알산은 Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb 구조를 포함한다. 하나의 구현예에서, 시알산은 6'-시알릴락토스 구조를 포함한다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 인간 Siglec-7 및/또는 Siglec-9 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하며 인간 NK 세포 세포(예컨대 인간 일차 NK 세포; CD56dim NK 세포), 인간 단핵구, 인간 수지상 세포, 인간 대식구(특히 면역억제성 또는 M2 대식구), CD8 T 세포, 및/또는 인간 호중구에서 이러한 Siglec(들)의 억제 활성을 중화시킬 수 있다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 인간 Siglec-7 및/또는 Siglec-9 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하며 인간 공여체로부터의 면역억제성 대식구(예컨대 M2 대식구)에서 이러한 Siglec(들)의 억제 활성을 중화시킬 수 있고, 여기서 항체 또는 항체 단편은 대식구의 면역억제성 활성 또는 능력을 감소시킨다.
논의된 바와 같이, 인간 Siglec-9는 Sia1(Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb) 및 Sia2(6'-시알릴락토스)에 둘 다 결합하는 반면, Siglec-7은 Sia2에만 결합한다. 소정 양태에서는 Siglec-9 폴리펩타이드(들)와 Siglec-7이 아니라 Siglec-9의 리간드인 시알산, 예컨대, Sia1 시알산의 상호작용을 차단할 수 있는 항체가 제공된다. 하나의 구현예에서, 시알산은 시알릴화 삼당류이다. 하나의 구현예에서, 시알산은 Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb 구조를 포함한다. 하나의 구현예에서 항체는 Siglec-7 폴리펩타이드(들)와 Siglec-9가 아니라 Siglec-7의 리간드인 시알산, 예컨대, 6'-시알릴락토스-함유 시알산의 상호작용을 실질적으로 차단하지 않는다.
이러한 항체의 단편 및 유도체가 또한 제공된다. 하나의 구현예에서, 항체는 인간 Siglec-7 폴리펩타이드 및/또는 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 항원-결합 도메인(예컨대, 단일 항원 결합 도메인, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인으로 제조된 도메인 등)을 포함한다. 하나의 구현예에서, 항원-결합 도메인은 인간 Siglec-7 폴리펩타이드가 아닌 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합한다(mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 및 mAb-F로 예시됨). 하나의 구현예에서, 항원-결합 도메인은 인간 Siglec-9 폴리펩타이드 및 인간 Siglec-7 폴리펩타이드 둘 다에 결합한다(mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 및 mAb-6으로 예시됨). 하나의 구현예에서, 단백질(예컨대 항체, 다량체성 및/또는 다중특이적 단백질) 또는 이러한 항원 결합 도메인을 인코딩하는 핵산이 제공된다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 중화 항-Siglec 항체는 면역 세포에서 Siglec-7 및/또는 Siglec-9에 의해 발휘되는 억제 활성을 경감시켜 Siglec-7의 시알산 리간드 및/또는 Siglec-9의 시알산 리간드를 발현하는 암 세포를 효과적으로 인식하고/하거나 제거하는 림프구의 능력을 증강시킨다. 항체(또는 항체 단편)는 암 세포가 하나의 또는 다른 유형의 리간드의 발현으로 인한 용해를 회피하는 능력을 감소시키고, 이들은 이에 따라 면역계에 의한 종양 감독을 증강시킨다. NK 구획에서, Siglec-9는 주로 CD56dim NK 세포 상에서 발현되는 반면, siglec-7은 CD56dim 및 CD56bright NK 세포 상에서 발현된다. CD56dim NK 세포(CD56dimCD16+KIR+)는 약 90%의 말초혈 및 비장 NK 세포를 나타내며, 퍼포린 및 그랜자임을 발현하고, 주요 세포독성 하위세트인 반면, CD56bright NK 세포(CD56brightCD16dim/-KIR-)는 림프절 및 편도에서 대부분의 NK 세포를 이루며, 활성화 시 주로 사이토카인 생산으로 반응한다. 하나의 구현예에서, 인간 Siglec-9에 특이적으로 결합하며, 인간 NK 세포(예컨대 인간 일차 NK 세포; CD56dim NK 세포)에서 Siglec-9에 의해 발휘되는 억제 활성을 경감시켜 NK 세포가 Siglec-9의 시알산 리간드를 발현하는 암 세포를 효과적으로 인식하고/하거나 제거하는 능력을 증강시키는 항체 또는 항체 단편이 제공된다. 하나의 구현예에서, 인간 Siglec-7 및 Siglec-9에 특이적으로 결합하며, 인간 NK 세포(예컨대 인간 일차 NK 세포; CD56dim NK 세포)에서 Siglec-7 및 Siglec-9에 의해 발휘되는 억제 활성을 경감시켜 NK 세포가 Siglec-7 및 Siglec-9의 시알산 리간드를 발현하는 암 세포를 효과적으로 인식하고/하거나 제거하는 능력을 증강시키는 항체 또는 항체 단편이 제공된다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 항체는 Siglec-7 및 Siglec-9 둘 다에 결합할 수 있으며 림프구(예컨대, NK 세포, CD8+ T 세포) 세포독성의 Siglec-7 및 Siglec-9-매개 억제를 둘 다 중화시킬 수 있다. 하나의 양태에서, 항체는 표적 세포(예컨대, Siglec-7의 리간드 및/또는 Siglec-9의 리간드를 발현하는 세포, 종양 세포)의 존재 하에 림프구 활성화를 증가시킨다. 하나의 구현예에서, 항체는 Siglec-9를 발현하는 NK 세포가 인간 공여체로부터 정제되며 Siglec-9의 시알산 리간드를 발현하는 표적 세포와 인큐베이션되는 표준 시험관내 세포독성 검정에서 평가되는, NK 세포의 세포독성을 증가시킨다. 하나의 구현예에서, 세포독성의 증가된 활성화 또는 억제의 중화는 세포독성/세포독성 가능성 마커, 예컨대 CD107 및/또는 CD137 발현(가동화)의 증가에 의해 평가된다. 하나의 구현예에서, 세포독성의 증가된 활성화 또는 억제 중화는 51Cr 방출 검정에서 51Cr 방출의 증가에 의해 평가된다. Siglec-7은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. Siglec-9는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, Siglec-9는 SEQ ID NO: 160의 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 항체는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 Siglec-9 폴리펩타이드(위치 100에 라이신을 보유하며, 집단의 약 49%를 나타냄) 및 SEQ ID NO: 160의 아미노산 서열을 포함하는 Siglec-9 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2의 잔기 100에 해당하는 위치에 글루탐산을 보유하며), 집단의 약 36%를 나타냄) 둘 다에 결합할 수 있다. 임의의 구현예에서 본 개시의 항체 또는 항체 단편은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 Siglec-9 폴리펩타이드를 발현하는(또는 그 세포가 이를 발현하는) 개체에서뿐만 아니라 SEQ ID NO: 160의 아미노산 서열을 포함하는 Siglec-9 폴리펩타이드를 발현하는(또는 그 세포가 이를 발현하는) 개체에서 Siglec-9의 억제 활성을 중화시킬 수 있는 것으로 특정될 수 있다.
하나의 구현예에서, 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하며 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 Siglec-9 폴리펩타이드 및 SEQ ID NO: 160의 아미노산 서열을 포함하는 Siglec-9 폴리펩타이드 둘 다의 억제 활성을 중화시킬 수 있는 항체 또는 항체 단편(또는 이러한 단편을 포함하는 단백질)이 제공된다. 하나의 구현예에서, 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하며 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 Siglec-9 폴리펩타이드를 발현하는 NK 세포에서 및 SEQ ID NO: 160의 아미노산 서열을 포함하는 Siglec-9 폴리펩타이드를 발현하는 NK 세포에서 Siglec-9 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시킬 수 있는 항체 또는 항체 단편(또는 이러한 단편을 포함하는 단백질)이 제공된다. 하나의 구현예에서, 항체는 특정 Siglec-9를 발현하는 NK 세포가 인간 공여체로부터 정제되어 Siglec-9의 시알산 리간드를 발현하는 표적 세포와 인큐베이션되는 표준 시험관내 세포독성 검정에서 평가되는 NK 세포의 세포독성을 증가시킨다.
본원에서 임의의 구현예의 하나의 양태에서, 항체는 2가 방식으로 Siglec의 세포외 도메인 상에 존재하는 에피토프에 결합하는 4량체(예컨대, 전장, F(ab)'2 단편) 항체 또는 항체 단편이다. 예를 들어, 2가 방식으로 Siglec에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 각각 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합할 수 있는, 또는 각각 Siglec-7 및 Siglec-9 폴리펩타이드 둘 다에 존재하는 에피토프에 결합할 수 있는, 2개의 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 본원에서 임의의 구현예의 또 다른 양태에서, 항체는 1가 방식으로 Siglec에 결합하며 각각의 Siglec, 예컨대, Siglec-7 및/또는 Siglec-9에서 작용제 활성이 없다. 하나의 구현예에서, 1가 방식으로 Siglec에 결합하는 항체는 Fab 단편이다. 본원에서 임의의 구현예에서, 1가 방식 또는 2가 방식으로 Siglec에 결합하는 항체는 Siglec9에서 작용제 활성이 없다. 치료적 이용을 위해, 항체는 바람직하게는 비-고갈 항체이다. 선택적으로 항체는 인간 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 의해 결합될 수 있지만 그 Fc 도메인을 통한 인간 FcγR (예컨대, CD16; 선택적으로 하나 이상의 또는 각각의 인간 CD16A, CD16B, CD32A, CD32B 및/또는 CD64 폴리펩타이드)에 대한 결합이 실질적으로 부재하는 Fc 도메인을 포함한다. 선택적으로 항체는 하나 이상의, 또는 각각의 인간 CD16A, CD16B, CD32A, CD32B 및/또는 CD64 폴리펩타이드에 대한 항체의 결합 친화도를 감소시키는 아미노산 개질(예컨대 하나 이상의 치환)을 포함하는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형의 Fc 도메인을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 Siglec-9에, 선택적으로는 추가로 Siglec-7에 결합하는 하나 이상의(예컨대, 2개의) 항원 결합 도메인을 포함한다. 하나의 특정한 구현예에서, 항체는 2개의 동일한 항원 결합 도메인(선택적으로, 2개의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 페어)을 포함하며 Siglec-9, 선택적으로는 추가로 Siglec-7에 결합하고 그 억제 활성을 중화시키며, 인간 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 의해 결합될 수 있는 Fc 도메인을 포함하고, 인간 FcγR (예컨대, CD16; 선택적으로 하나 이상의, 또는 각각의 인간 CD16A, CD16B, CD32A, CD32B 및/또는 CD64 폴리펩타이드)에 대한 결합이 실질적으로 부재하는 4량체, 선택적으로 전장, 항체이다.
본원에서 임의의 구현예에서, 인간 림프구 상에서 Siglec에 대한 결합 시, 모노클로날 항체는 표적 세포가 림프구, 예컨대 인간 개체로부터의 효과기 림프구, NK 또는 CD8+ T 세포, 예컨대 CD56dim NK 세포와 접촉하는 경우, 표적 세포 표면 상에 Siglec의 시알산 리간드를 보유하는 표적 인간 세포의 용해를 증강시키거나 재구성하는 능력을 갖고/갖거나 림프구 활성화(예컨대, 림프구 상에서 CD107 및/또는 CD137 발현의 증가에 의해 결정됨)를 증가시키는 능력을 갖는다. 하나의 구현예에서, 제1 하위세트의 림프구에 의해 발현되는 제1 Siglec(예컨대 CD56dim NK 세포 상에서 발현되는 Siglec-9)을 중화시키며 제2 하위세트의 림프구에 의해 발현되는 제2 Siglec(예컨대 CD56bright NK 세포 상에서 발현되는 Siglec-7)을 중화시키는 항체가 제공된다. 제1 및 제2 하위세트의 인간 림프구(예컨대, NK 세포, CD8+ T 세포, 단핵구, 수지상 세포, 대식구, 면역억제성 또는 M2 대식구)는 예를 들어 상이한 세포 표면 마커 또는 상이한 기능적 특성, 또는 상이한 표적 세포를 용해시키거나 인식하는(예컨대, 이에 의해 활성화되는) 능력을 특징으로 할 수 있다. 하나의 구현예에서, 항체는 이의 시알로사이드 리간드(예컨대, 종양 세포 상에 존재하는 리간드)에 대한 Siglec의 결합을 감소시킨다(차단한다).
본원에서 임의의 구현예에서, Siglec의 시알로사이드 또는 시알산 리간드는 천연 리간드로, 예컨대, 시알산 리간드(시알산을 포함하는 리간드)는 항체가 결합하는 Siglec 폴리펩타이드에 결합하는 것으로 알려져 있다. 9-탄소 산성 단당류 패밀리인 시알산은 전형적으로 N-글리칸, O-글리칸 및 당지질의 종결 분기인 것으로 확인된다. Siglec은 2-위치로부터의 산 시알릭 결합, 시알산의 배열 및 이의 제시 방식과 같은 시알산 분자의 여러 양태를 인식하는 것으로 여겨진다. 본원에서 임의의 구현예에서, Siglec의 리간드는 주로 5-N-아세틸뉴라민산(Neu5Ac) 유도체를 포함하며, 다른 시알산 유도체, 예컨대 5-N-글리콜릴뉴라민산(Neu5Gc) 유도체를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, Siglec-9 및/또는 Siglec-7의 리간드는 당단백질(예컨대, 뮤신) 또는 당지질 상에 존재하는 시알산이다. 하나의 구현예에서, Siglec-7의 리간드는 b-계열 갱글리오사이드, 예컨대, GD2, GD3 및 GT1b 상에 제시되는 α2,8-결합 디시알산을 포함한다. 하나의 구현예에서, Siglec-7의 리간드는 내부 분기화 알파2,6-결합 디시알릭 갱글리오사이드, 예컨대, DSGb5를 포함한다. 하나의 구현예에서, Siglec-9의 리간드는 뮤신, 예컨대, MUC1 상에 존재하는 리간드이거나 이를 포함한다. 하나의 구현예에서, Siglec-9의 리간드는 시알산 및 설페이트를 둘 다 함유하는 시알로글리칸 리간드이다.
하나의 양태에서, 항체는 제1 및 제2 인간 CD33-관련 Siglec으로서 세포외 도메인 상에 존재하는 공통 결정기에 결합한다. 본원에서 임의의 구현예의 하나의 양태에서, 항체는 Siglec-7이 아니라 Siglec-9에 존재하는 결정기에 결합한다. 본원에서 임의의 구현예의 하나의 양태에서, 항체는 Siglec-7 및 Siglec-9 상에 존재하는 공통 결정기에 결합한다. 선택적으로, 항체에 의해 결합되는 결정기는 하나 이상의 다른 Siglec, 예컨대, 하나 이상의(모든) Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-8, Siglec-10, Siglec-11 및 Siglec-12 상에는 존재하지 않는다.
본원에서 임의의 구현예에서, 항체는 Siglec의 세포외 도메인에 결합한다. 본원에서의 소정 구현예에서, 특히 항체가 Siglec 및 이의 시알산 리간드 간 상호작용을 차단하는 경우, 항체는 적어도 부분적으로 Siglec의 시알산 결합 도메인 내에 또는 근처에 결합할 수 있다. 본원에서 다른 구현예에서, 특히 항체가 Siglec 및 이의 시알산 리간드 간 상호작용을 차단하지 않는 경우, 항체는 Siglec의 시알산 결합 도메인 밖에 결합할 수 있다.
본원에서 임의의 구현예에서, 인간 림프구(예컨대, 일차 NK 세포) 상의 Siglec에 대한 결합 시, 모노클로날 항체는 표적 세포가 림프구와 접촉하게 되는 경우, 표적 세포 표면 상에 Siglec의 시알산 리간드를 보유하는 표적 인간 세포의 용해를 재구성하는 능력을 갖는다.
본원에서 임의의 구현예에서, 항체는 Siglec 폴리펩타이드(예컨대, 인간 Siglec-7 및/또는 인간 Siglec-9)로의 결합에 대해 10-8 M 미만, 바람직하게는 10-9 M 미만의 KD를 갖는다(예컨대 본원에서 실시예에 개시된 방법에 따라 결정되는, 1가 결합에 대해). Siglec-7 및 Siglec-9 결합 부위가 풍부하게 발현되는 저친화도 시알산과의 시스 상호작용으로 인해 세포 표면에서 일반적으로 차단되는 것으로 여겨지는 한, 시스와 경쟁하는 리간드보다 높은 친화도를 발현하는 항체로 트랜스 상호작용이 일어날 수 있다. 하나의 구현예에서, 중화 항-Siglec 항체는 시알로사이드 리간드의 Siglec(예컨대, Siglec-7 및/또는 Siglec-9)으로의 결합을 변위시킬 수 있다.
본 발명은 또한 인간 또는 인간화 항체 또는 항체 단편, 또는 이의 유도체를 제공하며, 이는 임의의 상기 특성을 단독으로 또는 임의의 적합한 조합으로 갖는다.
하나의 양태에서 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 및/또는 mAb-F에 의해 결합된 Siglec-9 상의 에피토프로의 결합에 대해 경쟁하는(예컨대, Siglec-9 폴리펩타이드 상의 에피토프로의 결합에 대해 임의의 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 또는 mAb-F의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역을 갖는 항체와 경쟁하는) 모노클로날 항체가 제공된다.
하나의 양태에서 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 및/또는 mAb-6에 의해 결합된 Siglec-7 및/또는 Siglec-9 상의 에피토프로의 결합에 대해 경쟁하는(예컨대, Siglec-7 및/또는 Siglec-9 폴리펩타이드 상의 에피토프로의 결합에 대해 임의의 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역을 갖는 항체와 경쟁하는) 모노클로날 항체가 제공된다.
하나의 양태에서, 잔기 N82, P83, A84, R85, A86 및/또는 V87에서 돌연변이(예컨대 표 3에 나타낸 돌연변이 M9)를 갖는 Siglec-7 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 특징으로 하는, 항-Siglec 항체(예컨대 본원의 임의의 항-Siglec 항체)가 제공된다. 하나의 양태에서, 항-Siglec-7 항체는 잔기 N81, D100, H102 및/또는 T103에서 돌연변이(예컨대 표 3에 나타낸 돌연변이)를 갖는 Siglec-7 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 갖는다. 하나의 양태에서, 항-Siglec-7 항체는 잔기 W88, E89, E90, R92에서 돌연변이(예컨대 표 3에 나타낸 돌연변이 M11)를 갖는 Siglec-7 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 갖는다. 돌연변이에 대한 잔기 위치는 SEQ ID NO: 1의 Siglec-7 폴리펩타이드에 대해 참조된다. 선택적으로, 항체는 표 3의 하나 이상의 다른 돌연변이체 Siglec-7 폴리펩타이드, 예컨대, 하나 이상의(또는 모든) 돌연변이체 M6, M8, M15 또는 M16에 대한 결합을 소실하지 않는다.
하나의 양태에서, 잔기 N78, P79, A80, R81, A82 및/또는 V83에서 돌연변이(예컨대 표 3에 나타낸 돌연변이 M9)를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 특징으로 하는, 항-Siglec 항체(예컨대 본원의 임의의 항-Siglec 항체)가 제공된다. 하나의 양태에서, 항-Siglec-9 항체는 잔기 N77, D96, H98 및/또는 T99에서 돌연변이(예컨대 표 3에 나타낸 돌연변이 M10)를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 갖는다. 하나의 양태에서, 항-Siglec-9 항체는 잔기 W84, E85, E86 및/또는 R88에서 돌연변이(예컨대 표 3에 나타낸 돌연변이 M11)를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 갖는다. 돌연변이에 대한 잔기 위치는 SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 참조된다. 선택적으로, 항체는 표 3의 하나 이상의 다른 돌연변이체 Siglec-9 폴리펩타이드, 예컨대, 하나 이상의(또는 모든) 돌연변이체 M6, M8, M15 또는 M16에 대한 결합을 소실하지 않는다. 하나의 양태에서, 항-Siglec-9 항체는 M9의 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합, M10의 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합, 및 M11의 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 갖고; 선택적으로 항-Siglec-9 항체는 M7 또는 M8의 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 추가로 갖고, 여기서 돌연변이 M9, M10, M11, M7 및 M8은 표 3에 나타낸다.
하나의 양태에서, 잔기 S47, H48, G49, W50, I51, Y52, P53 및/또는 G54에서 돌연변이(예컨대 표 3에 나타낸 돌연변이 M6)를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 특징으로 하는, 항-Siglec 항체(예컨대 본원의 임의의 항-Siglec 항체)가 제공된다. 돌연변이에 대한 잔기 위치는 SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 참조된다. 선택적으로, 항체는 표 3의 하나 이상의 다른 돌연변이체 Siglec-9 폴리펩타이드, 예컨대, 돌연변이체 9, 10 및/또는 11, 또는 하나 이상의(또는 모든) 돌연변이체 M7 또는 M8에 대한 결합을 소실하지 않는다.
하나의 양태에서, 잔기 P55, H58, E122, G124, S125 및/또는 K127에서 돌연변이(예컨대 표 3에 나타낸 7의 돌연변이)를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 특징으로 하는, 항-Siglec 항체(예컨대 본원의 임의의 항-Siglec 항체)가 제공된다. 돌연변이에 대한 잔기 위치는 SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 참조된다. 선택적으로, 항체는 표 3의 하나 이상의 다른 돌연변이체 Siglec-9 폴리펩타이드, 예컨대, 돌연변이체 9, 10 및/또는 11에 대한 결합을 소실하지 않는다.
하나의 양태에서, 잔기 R120, W128, 및/또는 N129에서 돌연변이(예컨대 표 3에 나타낸 M14의 돌연변이)를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 특징으로 하는, 항-Siglec 항체(예컨대 본원의 임의의 항-Siglec 항체)가 제공된다. 돌연변이에 대한 잔기 위치는 SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 참조된다.
하나의 양태에서, 잔기 S27, R116, H133 및/또는 134에서 돌연변이(예컨대 표 3에 나타낸 M15의 돌연변이)를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 특징으로 하는, 항-Siglec 항체(예컨대 본원의 임의의 항-Siglec 항체)가 제공된다. 돌연변이에 대한 잔기 위치는 SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 참조된다.
하나의 양태에서, 잔기 K131 및/또는 H132에서 돌연변이(예컨대 표 3에 나타낸 M16의 돌연변이)를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 특징으로 하는, 항-Siglec 항체(예컨대 본원의 임의의 항-Siglec 항체)가 제공된다. 돌연변이에 대한 잔기 위치는 SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 참조된다. 선택적으로, 항체는 표 3의 하나 이상의 다른 돌연변이체 Siglec-9 폴리펩타이드, 예컨대, 돌연변이체 M9, M10 및/또는 M11, 또는 하나 이상의(또는 모든) 돌연변이체 M8 또는 M15에 대한 결합을 소실하지 않는다.
하나의 양태에서, 잔기 R63, A66, N67, T68, D69, Q70 및/또는 D71에서 돌연변이(예컨대 표 3에 나타낸 돌연변이 M8)를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 특징으로 하는, 항-Siglec 항체(예컨대 본원의 임의의 항-Siglec 항체)가 제공된다. 돌연변이에 대한 잔기 위치는 SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 참조된다. 선택적으로, 항체는 표 3의 하나 이상의 다른 돌연변이체 Siglec-9 폴리펩타이드, 예컨대, 돌연변이체 M9, M10 및/또는 M11, 또는 하나 이상의(또는 모든) 돌연변이체 M14, M15 또는 M16에 대한 결합을 소실하지 않는다.
하나의 양태에서, 돌연변이체 M6 및 M7의 아미노산 치환 (표 3에 나타냄, SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 아미노산 서열 참조)을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 특징으로 하는, 항-Siglec 항체(예컨대 본원의 임의의 항-Siglec 항체)가 제공된다. 하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 돌연변이체 M6의 아미노산 치환을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합 및 돌연변이체 M7의 아미노산 치환 (표 3에 나타냄, SEQ ID NO : 2의 Siglec-9 아미노산 서열 참조)을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 갖는다.
하나의 양태에서, 돌연변이체 M9, M10 및 M11의 아미노산 치환 (표 3에 나타냄, SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 아미노산 서열 참조)을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 특징으로 하는, 항-Siglec 항체(예컨대 본원의 임의의 항-Siglec 항체)가 제공된다. 하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 돌연변이체 M9의 아미노산 치환을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합, 돌연변이체 M10의 아미노산 치환을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합 및 돌연변이체 M11의 아미노산 치환 (표 3에 나타냄, SEQ ID NO : 2의 Siglec-9 아미노산 서열 참조)을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 갖는다.
하나의 양태에서, 돌연변이체 M7, M9, M10 및 M11의 아미노산 치환 (표 3에 나타냄, SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 아미노산 서열 참조)을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 특징으로 하는, 항-Siglec 항체(예컨대 본원의 임의의 항-Siglec 항체)가 제공된다. 하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 돌연변이체 M7의 아미노산 치환을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합, 돌연변이체 M9의 아미노산 치환을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합, 돌연변이체 M10의 아미노산 치환을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합 및 돌연변이체 M11의 아미노산 치환 (표 3에 나타냄, SEQ ID NO : 2의 Siglec-9 아미노산 서열 참조)을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 갖는다.
하나의 양태에서, 돌연변이체 M8, M9, M10 및 M11의 아미노산 치환 (표 3에 나타냄, SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 아미노산 서열 참조)을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 특징으로 하는, 항-Siglec 항체(예컨대 본원의 임의의 항-Siglec 항체)가 제공된다. 하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 돌연변이체 M8의 아미노산 치환을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합, 돌연변이체 M9의 아미노산 치환을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합, 돌연변이체 M10의 아미노산 치환을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합 및 돌연변이체 M11의 아미노산 치환 (표 3에 나타냄, SEQ ID NO : 2의 Siglec-9 아미노산 서열 참조)을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 갖는다.
하나의 양태에서, 돌연변이체 M8 및 M16의 아미노산 치환 (표 3에 나타냄, SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 아미노산 서열 참조)을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 특징으로 하는, 항-Siglec 항체(예컨대 본원의 임의의 항-Siglec 항체)가 제공된다. 하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 돌연변이체 M8의 아미노산 치환을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합 및 돌연변이체 M16의 아미노산 치환 (표 3에 나타냄, SEQ ID NO : 2의 Siglec-9 아미노산 서열 참조)을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 갖는다.
하나의 양태에서, 돌연변이체 M8, M15 및 M16의 아미노산 치환 (표 3에 나타냄, SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 아미노산 서열 참조)을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 특징으로 하는, 항-Siglec 항체(예컨대 본원의 임의의 항-Siglec 항체)가 제공된다. 하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 돌연변이체 M8의 아미노산 치환을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합, 돌연변이체 M15의 아미노산 치환을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합 및 돌연변이체 M16의 아미노산 치환 (표 3에 나타냄, SEQ ID NO : 2의 Siglec-9 아미노산 서열 참조)을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 갖는다.
하나의 양태에서, 돌연변이체 M8, M14, M15 및 M16의 아미노산 치환 (표 3에 나타냄, SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 아미노산 서열 참조)을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 특징으로 하는, 항-Siglec 항체(예컨대 본원의 임의의 항-Siglec 항체)가 제공된다. 하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 돌연변이체 M8의 아미노산 치환을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합, 돌연변이체 M14의 아미노산 치환을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합, 돌연변이체 M15의 아미노산 치환을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합 및 돌연변이체 M16의 아미노산 치환 (표 3에 나타냄, SEQ ID NO : 2의 Siglec-9 아미노산 서열 참조)을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 갖는다.
하나의 양태에서, 돌연변이체 M14 및 M16의 아미노산 치환 (표 3에 나타냄, SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 아미노산 서열 참조)을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 특징으로 하는, 항-Siglec 항체(예컨대 본원의 임의의 항-Siglec 항체)가 제공된다. 하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 돌연변이체 M14의 아미노산 치환을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합 및 돌연변이체 M16의 아미노산 치환 (표 3에 나타냄, SEQ ID NO : 2의 Siglec-9 아미노산 서열 참조)을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 갖는다.
본원의 임의의 구현예에서, 아미노산 치환을 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합은 항체를 Siglec에 대한 결합이 1가인 배치로 시험되는 경우에 평가되는 것으로 명시될 수 있고, 선택적으로 항체는 Fab' 단편, 예컨대 항체의 VH 및 VL을 포함하는 Fab' 단편, VH 및 VL이 항체의 각각의 VH 및 VL CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 VH 및 VL을 포함하는 Fab' 단편으로서 시험된다.
하나의 구현예에서, 다음으로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 또는 이와 동일한 에피토프에 결합하고/하거나 이와 Siglec-7 및/또는 Siglec-9 폴리펩타이드로의 결합에 대해 경쟁하는 항원-결합 화합물이 제공된다:
(a) (i) SEQ ID NO: 3의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 4의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체;
(b) (i) SEQ ID NO: 5의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 6의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체;
(c) (i) SEQ ID NO: 7의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 8의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체;
(d) (i) SEQ ID NO: 9의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 10의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체;
(e) (i) SEQ ID NO: 11의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 12의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체; 및
(f) (i) SEQ ID NO: 13의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 14의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체.
(g) (i) SEQ ID NO: 15의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 16의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체;
(h) (i) SEQ ID NO: 17의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 18의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체;
(i) (i) SEQ ID NO: 19의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 20의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체;
(j) (i) SEQ ID NO: 21의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 22의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체;
(k) (i) SEQ ID NO: 23의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 24의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체; 및
(l) (i) SEQ ID NO: 25의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 26의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체.
본 발명의 임의의 구현예의 하나의 양태에서, Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하는 항체는 항체 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 및 mAb-F로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체의 중쇄의 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 갖는 중쇄; 및 항체 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 및 mAb-F로 구성되는 군으로부터 선택되는 각 항체의 경쇄의 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 갖는 경쇄를 가질 수 있다.
하나의 양태에서, 다음을 포함하는, 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 항체가 제공된다: 아미노산 서열 SYWMH(SEQ ID NO: 75)를 포함하는 중쇄 CDR1; 아미노산 서열 EINPSNGHTNYNEKFES(SEQ ID NO: 78)를 포함하는 중쇄 CDR2; 아미노산 서열 GVESYDFDDALDY(SEQ ID NO: 80)를 포함하는 중쇄 CDR3; 아미노산 서열 RASQDINNYLN(SEQ ID NO: 83)을 포함하는 경쇄 CDR1; 아미노산 서열 YTSRLHS(SEQ ID NO: 57)를 포함하는 경쇄 CDR2; 아미노산 서열 QQGNTLPFT(SEQ ID NO: 86)를 포함하는 경쇄 CDR3; 및 인간 중쇄 및 경쇄 프레임워크 서열.
하나의 양태에서, 다음을 포함하는, 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 항체가 제공된다: 아미노산 서열 SYWMH(SEQ ID NO: 75) 또는 SYWIH (SEQ ID NO: 198)를 포함하는 중쇄 CDR1; 아미노산 서열 EINPSNGHTNYNEKFKT(SEQ ID NO: 90) 또는 EINPSNGHTNYAEKFKT (SEQ ID NO: 199)를 포함하는 중쇄 CDR2; 아미노산 서열 GVETYDFDDAMDY(SEQ ID NO: 92)를 포함하는 중쇄 CDR3; 아미노산 서열 RASQDINNYLN(SEQ ID NO: 83) 또는 QASQDINNYLN (SEQ ID NO: 200)을 포함하는 경쇄 CDR1; 아미노산 서열 FTSRLHS(SEQ ID NO: 95)를 포함하는 경쇄 CDR2; 아미노산 서열 QQGDTFPFT(SEQ ID NO: 96)를 포함하는 경쇄 CDR3; 및 인간 중쇄 및 경쇄 프레임워크 서열.
하나의 양태에서, 다음을 포함하는, 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 항체가 제공된다: 아미노산 서열 NYEMN(SEQ ID NO: 98)을 포함하는 중쇄 CDR1; 아미노산 서열 WINTYTGESTYADDFK(SEQ ID NO: 101)를 포함하는 중쇄 CDR2; 아미노산 서열 DDYGRSYGFAY(SEQ ID NO: 103)를 포함하는 중쇄 CDR3; 아미노산 서열 RASESVDSYGNSFMH(SEQ ID NO: 106)를 포함하는 경쇄 CDR1; 아미노산 서열 LASKLES(SEQ ID NO: 109)를 포함하는 경쇄 CDR2; 아미노산 서열 HQNNEDPPWT(SEQ ID NO: 110)를 포함하는 경쇄 CDR3; 및 인간 중쇄 및 경쇄 프레임워크 서열.
하나의 양태에서, 다음을 포함하는, 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 항체가 제공된다: 아미노산 서열 DYSMH(SEQ ID NO: 112)를 포함하는 중쇄 CDR1; 아미노산 서열 WIITETGEPTYADDFRG(SEQ ID NO: 115)를 포함하는 중쇄 CDR2; 아미노산 서열 DFDGY(SEQ ID NO: 117)를 포함하는 중쇄 CDR3; 아미노산 서열 RASENIYSYLA(SEQ ID NO: 119)를 포함하는 경쇄 CDR1; 아미노산 서열 NAKTLTE(SEQ ID NO: 122)를 포함하는 경쇄 CDR2; 아미노산 서열 QHHYGFPWT(SEQ ID NO: 123)를 포함하는 경쇄 CDR3; 및 인간 중쇄 및 경쇄 프레임워크 서열.
하나의 양태에서, 다음을 포함하는, 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 항체가 제공된다: 아미노산 서열 TFGMH(SEQ ID NO: 125)를 포함하는 중쇄 CDR1; 아미노산 서열 YISSGSNAIYYADTVKG(SEQ ID NO: 128)를 포함하는 중쇄 CDR2; 아미노산 서열 PGYGAWFAY(SEQ ID NO: 130)를 포함하는 중쇄 CDR3; 아미노산 서열 RASSSVSSAYLH(SEQ ID NO: 133)를 포함하는 경쇄 CDR1; 아미노산 서열 STSNLAS(SEQ ID NO: 136)을 포함하는 경쇄 CDR2; 아미노산 서열 QQYSAYPYT(SEQ ID NO: 137)를 포함하는 경쇄 CDR3; 및 인간 중쇄 및 경쇄 프레임워크 서열.
하나의 양태에서, 다음을 포함하는, 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 항체가 제공된다: 아미노산 서열 DYSMH(SEQ ID NO: 112)를 포함하는 중쇄 CDR1; 아미노산 서열 VISTYNGNTNYNQKFKG(SEQ ID NO: 139)를 포함하는 중쇄 CDR2; 아미노산 서열 RGYYGSSSWFGY(SEQ ID NO: 141)를 포함하는 중쇄 CDR3; 아미노산 서열 KASQNVGTDVA(SEQ ID NO: 144)를 포함하는 경쇄 CDR1; 아미노산 서열 SASYRYS(SEQ ID NO: 147)를 포함하는 경쇄 CDR2; 아미노산 서열 QQYNSFPYT(SEQ ID NO: 148)를 포함하는 경쇄 CDR3 및 인간 중쇄 및 경쇄 프레임워크 서열.
본 발명의 임의의 구현예의 하나의 양태에서, Siglec-7 및 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하는 항체는 항체 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 및 mAb-6으로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체의 각각의 중쇄 및/또는 경쇄의 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 갖는 중쇄 및/또는 경쇄를 가질 수 있다.
하나의 양태에서, 다음을 포함하는 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 항체가 제공된다: (a) 인간 IGHV1-69 (또는 선택적으로 IGHV1-46) 유전자 유래의 인간 중쇄 프레임워크 영역 (FR1, FR2, 및/또는 FR3), 및 mAbA 항체의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 인간 IGKV1-33 유전자 유래의 인간 경쇄 프레임워크 영역 (FR1, FR2, 및/또는 FR3), 및 mAbA 항체의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역. 선택적으로, CDR은 Kabat 넘버링에 의해 정의된다. 하나의 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 15, 또는 SEQ ID NO: 170-173 중 임의의 것의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하고/하거나 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NOS: 16, 174, 175 또는 176의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 mAbA H0, H1, H2 또는 H3 가변 도메인의 아미노산 서열 (또는 그와의 적어도 80, 90%, 95% 또는 98% 동일성을 공유하는 아미노산 서열)을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 mAbA L0, L1 또는 L2 가변 도메인의 아미노산 서열 (또는 그와의 적어도 80, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일성을 공유하는 아미노산 서열)을 포함한다.
하나의 양태에서, 다음을 포함하는 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 항체가 제공된다: (a) 인간 IGHV1-69 (또는 선택적으로 IGHV1-46) 유전자 유래의 인간 중쇄 프레임워크 영역 (FR1, FR2, 및/또는 FR3), 및 mAbB 항체의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 인간 IGKV1-33 유전자 유래의 인간 경쇄 프레임워크 영역 (FR1, FR2, 및/또는 FR3), 및 mAbB 항체의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역. 선택적으로, CDR은 Kabat 넘버링에 의해 정의된다. 하나의 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 17, 177, 178, 179, 180, 181 또는 182의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성(또는 100%)을 공유하는 아미노산 서열을 포함하고/하거나 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 18, 183, 184 또는 185의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 mAbB H0, H1, H2, H3, H4 또는 H5 가변 도메인의 아미노산 서열 (또는 그와의 적어도 80, 90%, 95% 또는 98% 동일성을 공유하는 아미노산 서열)을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 mAbB L0, L1 또는 L2 가변 도메인의 아미노산 서열 (또는 그와의 적어도 80, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일성을 공유하는 아미노산 서열)을 포함한다.
하나의 양태에서, 다음을 포함하는 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 항체가 제공된다: (a) 인간 IGHV7-4-1 유전자 유래의 인간 중쇄 프레임워크 영역 (FR1, FR2, 및/또는 FR3), 및 mAbC 항체의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 인간 IGKV7-3 유전자 유래의 인간 경쇄 프레임워크 영역 (FR1, FR2, 및/또는 FR3), 및 mAbC 항체의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역. 선택적으로, CDR은 Kabat 넘버링에 의해 정의된다. 하나의 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 20, 192, 193, 194 또는 195의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성(또는 100%)을 공유하는 아미노산 서열을 포함하고/하거나 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 20, 196 또는 197의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 mAbB H0, H1, H2 또는 H3 가변 도메인의 아미노산 서열 (또는 그와의 적어도 80, 90%, 95% 또는 98% 동일성을 공유하는 아미노산 서열)을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 mAbB L0 또는 L1 가변 도메인의 아미노산 서열 (또는 그와의 적어도 80, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일성을 공유하는 아미노산 서열)을 포함한다.
하나의 양태에서, 다음을 포함하는 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 항체가 제공된다: (a) 인간 IGHV7-4-1 (예컨대 7-4-1*02) 유전자 유래의 인간 중쇄 프레임워크 영역 (FR1, FR2, 및 FR3) (및 선택적으로 IGHJ6 (예컨대 IGHJ6*01) 유전자 유래의 FR4), 및 mAbD 항체의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 인간 IGKV1-39 (예컨대 1-39*01) 유전자 유래의 인간 경쇄 프레임워크 영역 (FR1, FR2, 및 FR3), 및 mAbD 항체의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역. 선택적으로, CDR은 Kabat 넘버링에 의해 정의된다. 하나의 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 21, 186, 187 또는 188의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성(또는 100%)을 공유하는 아미노산 서열을 포함하고/하거나 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 22, 189, 190 또는 191의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 mAbD H0, H1 또는 H2 가변 도메인의 아미노산 서열 (또는 그와의 적어도 80, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일성을 공유하는 아미노산 서열)을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 mAbB L0, L1 또는 L2 가변 도메인의 아미노산 서열 (또는 그와의 적어도 80, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일성을 공유하는 아미노산 서열)을 포함한다.
하나의 양태에서, 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하고 인간 NK 세포에 의해 발현되는 Siglec-9 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시킬 수 있는 항원 결합 도메인이 제공되고, 항원 결합 도메인은 SEQ ID NOS: 170, 171, 172 및 173, 각각에 제시된 mAbA H0, H1, H2 또는 H3 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 SEQ ID NOS: 174, 175 및 176, 각각에 제시된 mAbA L0, L1 또는 L2 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
하나의 양태에서, 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하고 인간 NK 세포에 의해 발현되는 Siglec-9 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시킬 수 있는 항원 결합 도메인이 제공되고, 항원 결합 도메인은 SEQ ID NOS: 177, 178, 179, 180, 181 및 182, 각각에 제시된 mAbB H0, H1, H2, H3, H4 또는 H5 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 SEQ ID NOS: 183, 184 및 185, 각각에 제시된 mAbB L0, L1 또는 L2 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
하나의 양태에서, 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하고 인간 NK 세포에 의해 발현되는 Siglec-9 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시킬 수 있는 항원 결합 도메인이 제공되고, 항원 결합 도메인은 SEQ ID NOS: 186,　187 및 188, 각각에 제시된 mAbD H0, H13 또는 H2 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 SEQ ID NOS: 189, 190 및 191, 각각에 제시된 mAbD L0, L1 또는 L2 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
하나의 양태에서, 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 이를 포함하는 단백질(예컨대 항체, 항체 단편, 이중특이적 항체, 단일쇄 또는 다량체성 단백질, Fc 단백질)이 제공되고, 항원 결합 도메인 또는 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH 및 VL 조합을 포함한다:
(a) SEQ ID NO: 15에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGHV1-69 (또는 선택적으로 IGHV1-46) 유전자 절편의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 VH, 및 SEQ ID NO: 16에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGKV1-33 유전자 절편의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 VL;
(b) SEQ ID NO: 17에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGHV1-69 (또는 선택적으로 IGHV1-46) 유전자 절편의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 VH, 및 SEQ ID NO: 18에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGKV1-33 유전자 절편의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 VL;
(c) SEQ ID NO: 19에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGHV7-4-1 유전자 절편의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 VH, 및 SEQ ID NO: 20에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGKV7-3 유전자 절편의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 VL;
(d) SEQ ID NO: 21에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGHV7-4-1 유전자 절편 (선택적으로 IGHJ6 유전자 절편과 조합으로)의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 VH, 및 SEQ ID NO: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGKV1-39 유전자 절편의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 VL.
임의의 양태에서, 항체 또는 항원 결합 도메인은 VH 및 VL을 포함할 수 있고, 여기서 VH 및 VL 각각은 하기 항체 중 임의의 하나의 각각의 VH 및 VL과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 일치하는 아미노산 서열을 포함한다: mAbA H0L0, mAbA H0L1, mAbA H0L2, mAbA H1L0, mAbA H1L1, mAbA H1L2 mAbA H2L0, mAbA H2L1, mAbA H2L2, mAbA H3L0, mAbA H3L1, 또는 mAbA H3L2.
임의의 양태에서, 항체 또는 항원 결합 도메인은 VH 및 VL을 포함할 수 있고, 여기서 VH 및 VL 각각은 하기 항체 중 임의의 하나의 각각의 VH 및 VL과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 일치하는 아미노산 서열을 포함한다: mAbB H0L0, mAbB H0L1, mAbB H0L2, mAbB H1L0, mAbB H1L1, mAbB H1L2, mAbB H2L0, mAbB H2L1, mAbB H2L2, mAbB H3L0, mAbB H3L1, mAbB H3L2, mAbB H4L0, mAbB H4L1, mAbB H4L2, mAbB H5L0, mAbB H5L1 또는 mAbB H5L2.
임의의 양태에서, 항체 또는 항원 결합 도메인은 VH 및 VL을 포함할 수 있고, 여기서 VH 및 VL 각각은 하기 항체 중 임의의 하나의 각각의 VH 및 VL과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 일치하는 아미노산 서열을 포함한다: mAbC H0L0, mAbC H0L1, mAbC H1L0, mAbC H1L1, mAbC H2L0, mAbC H2L1, mAbC H3L0 또는 mAbC H3L1.
임의의 양태에서, 항체 또는 항원 결합 도메인은 VH 및 VL을 포함할 수 있고, 여기서 VH 및 VL 각각은 하기 항체 중 임의의 하나의 각각의 VH 및 VL과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 일치하는 아미노산 서열을 포함한다: mAbD H0L0, mAbD H0L1, mAbD H0L2, mAbD H1L0, mAbD H1L1, mAbD H1L2 mAbD H2L0, mAbD H2L1 또는 mAbD H2L2.
이들 항체의 각각의 VH 및 VL 서열은 표 C 및 실시예 2 파트 B에 나열된다.
하나의 구현예에서, mAbA VH는 SEQ ID NO: 15의 잔기 26 (Kabat FR1), 27 (Kabat FR1), 74 (Kabat FR3) 및/또는 98 (Kabat FR3)에 (또는 Kabat 넘버링에 따른 상응하는 위치에) 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, mAbA VH는 Kabat 위치 26에 티로신 (예컨대 G26Y 치환) 및/또는 위치 27에 페닐알라닌 (예컨대 G27F 치환)을 포함한다. 하나의 구현예에서, mAbA VH는 Kabat 위치 74에 아르기닌 (예컨대 E74R 치환)을 포함한다. 하나의 구현예에서, mAbA VH는 Kabat 위치 98에 아스파라긴 (예컨대 R98N 치환)을 포함한다.
하나의 구현예에서, mAbA VL은 Kabat 잔기 44 (Kabat FR2) 및/또는 71 (Kabat FR3)에 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, mAbA VL은 Kabat 위치 44에 이소류신 (예컨대 K44I 치환)을 포함한다. 하나의 구현예에서, mAbA VL은 Kabat 위치 71에 티로신 (예컨대 D71Y 치환)을 포함한다.
하나의 구현예에서, mAbB VH는 Kabat 잔기 26, 27, 30 및/또는 74의 1, 2, 3, 또는 4에 프레임워크 내 치환을 포함한다. 하나의 구현예에서, mAbB VH는 Kabat 잔기 34, 61 및/또는 66의 1, 2, 또는 3에 (또는 Kabat 넘버링에 따른 상응하는 위치에) CDR 내 치환을 포함한다. 하나의 구현예에서, mAbB VH는 Kabat 위치 26에 발린 및/또는 위치 27에 티로신 (Kabat FR1)을 포함한다. 하나의 구현예에서, mAbB VH는 Kabat 위치 30 (Kabat FR1)에 트레오닌을 포함한다. 하나의 구현예에서, mAbB VH는 Kabat 위치 74 (Kabat FR3)에 라이신을 포함한다. 하나의 구현예에서, mAbB VH는 Kabat 위치 34 (Kabat CDR1)에 이소류신 (예컨대 M34I 치환)을 포함한다. 하나의 구현예에서, mAbB VH는 Kabat 위치 61 (Kabat CDR2)에 알라닌 (예컨대 N61A 치환)을 포함한다. 하나의 구현예에서, mAbB VH는 Kabat 위치 66 (Kabat CDR2)에 글리신 (예컨대 T66G 치환)을 포함한다.
하나의 구현예에서, mAbB VL은 Kabat 잔기 24 (Kabat CDR1) 및/또는 71 (Kabat FR3)에 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, mAbB VL은 Kabat 위치 24에 글루타민 (예컨대 R24Q 치환)을 포함한다. 하나의 구현예에서, mAbB VL은 Kabat 위치 71에 티로신 (예컨대 F71Y 치환)을 포함한다.
하나의 구현예에서, mAbC VH는 Kabat 잔기 39 (Kabat FR2), 91 (Kabat FR3) 및/또는 93 (Kabat FR3)에 아미노산 치환을 포함한다. 하나의 구현예에서, mAbC VH는 Kabat 위치 39에 글루탐산 (예컨대 Q39E 치환)을 포함한다. 하나의 구현예에서, mAbC VH는 Kabat 위치 91에 페닐알라닌 (예컨대 Y91F 치환)을 포함한다. 하나의 구현예에서, mAbC VH는 Kabat 위치 93에 발린 (예컨대 A93V 치환)을 포함한다.
하나의 구현예에서, mAbC VL은 Kabat 잔기 68 (Kabat FR3)에 아미노산 치환을 포함한다. 하나의 구현예에서, mAbC VL은 Kabat 위치 68에 아르기닌 (예컨대 G69R 치환)을 포함한다.
하나의 구현예에서, mAbD VH는 Kabat 잔기 46 (Kabat FR2) 및/또는 95 (Kabat FR3)에 아미노산 치환을 포함한다. 하나의 구현예에서, mAbD VH는 Kabat 위치 46에 라이신 (예컨대 E46K 치환)을 포함한다. 하나의 구현예에서, mAbD VH는 Kabat 위치 95에 페닐알라닌 (예컨대 Y95F 치환)을 포함한다.
하나의 구현예에서, mAbD VL은 Kabat 잔기 46 (Kabat FR2) 및/또는 63 (Kabat FR3)에 아미노산 치환을 포함한다. 하나의 구현예에서, mAbD VL은 Kabat 위치 46에 페닐알라닌 (예컨대 L46F 치환)을 포함한다. 하나의 구현예에서, mAbD VL은 Kabat 위치 63에 아르기닌 (예컨대 S63R 치환)을 포함한다.
본 발명의 임의의 구현예의 하나의 양태에서, Siglec으로의 결합은 세포성 Siglec으로의 결합인 것으로 특정될 수 있으며, 여기서 Siglec은 세포에 표면에서, 예를 들어 천연 또는 개질된 세포성 Siglec, 재조합 숙주 세포에 의해 발현되는 Siglec, NK 세포, CD8 T 세포 등에 의해 발현되는 Siglec으로 발현된다.
임의의 구현예에서, 항체는 항체 단편, (예컨대, 1, 2 또는 3 VH 및/또는 VL CDR을 포함하는 항체 단편, VH 및/또는 VL 도메인을 포함하는 항체 단편, 또는 과가변 영역 또는 항체 결합 도메인을 포함하는 항체 단편) 또는 이러한 항체 단편을 포함하는 단백질인 것으로 명시될 수 있다. 본 발명은 또한 임의의 상기 특성을 갖는 인간 또는 인간화 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터, 이러한 벡터를 포함하는 세포, 및 이러한 세포를 항-Siglec 항체 또는 항체 단편 (또는 이를 포함하는 단백질)의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는 인간 항-Siglec 항체의 생산 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 단백질, 핵산, 벡터, 및/또는 세포 및 전형적으로 조성물의 제형화, 전달, 안정성, 또는 다른 특징을 촉진하는 활성 성분 또는 비활성 성분일 수 있는 하나 이상의 추가 성분(예컨대, 다양한 담체)을 포함하는, 조성물, 예컨대 약제학적으로 허용 가능한 조성물 및 키트에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 Siglec-매개 생물학적 활성의 조정에서, 예를 들어 이에 관련된 질병, 특히 암 및 감염성 질병의 치료에서, 이러한 항체, 핵산, 벡터, 세포, 유기체, 및/또는 조성물의 다양하고 새롭고 유용한 제조 및 이용 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 Siglec-7 및/또는 Siglec-9-발현 림프구, 선택적으로 NK 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 활성을 조정하기 위한 시험관내 방법을 제공하며, 방법은 이의 표면에 Siglec-7 및/또는 Siglec-9를 발현하는 림프구(예컨대 일차 NK 세포)를 Siglec-7 및 Siglec-9의 억제 활성을 중화시키는 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 림프구(예컨대, NK 세포, CD8+ T 세포) 활성의 활성 강화 및/또는 조정을 필요로 하는 대상체에서 림프구(예컨대, NK 세포, CD8+ T 세포) 활성의 활성 강화 및/또는 조정 방법, 예를 들어 CD56dim NK 세포(주요 세포독성 하위세트) 및 선택적으로 추가로 CD56bright NK 세포(림프절 및 편도에서 대부분의 NK 세포로, 활성화 시 주로 사이토카인 생산으로 반응함)의 조정에 의한 NK 세포 활성의 강화 방법을 제공하며, 방법은 대상체에 유효량의 임의의 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 대상체는 암을 앓는 환자이다. 예를 들어, 환자는 혈액암, 예컨대 급성 골수구 백혈병, 만성 골수구 백혈병, 다발성 골수종, 또는 비-호지킨 림프종을 앓을 수 있다. 대안적으로, 환자는 고형 종양, 예컨대, 결장직장암, 신장암, 난소암, 폐암, 유방암 또는 악성 흑색종을 앓을 수 있다. 또 다른 구현예에서, 대상체는 감염성 질병을 앓는 환자이다.
이들 양태는 본원에서 제공되는 본 발명의 기재에서 보다 자세히 기재되며, 추가 양태, 특징, 및 이점은 이로부터 명백할 것이다.
도 1은 항-Siglec 항체의 NK 세포로의 결합을 나타낸다. Siglec MFI:형광 세기의 평균. 유의미한 분율(약 44%)의 NK 세포가 Siglec-7 및 Siglec-9를 둘 다 발현하여, 큰 비율의 NK 세포가, 예를 들어 종양 세포 상에 존재하는 글리칸 리간드의 함수로서, 각각의(또는 둘 다의) 이들 수용체에 의해 저해될 수 있음을 제시한다.
도 2는, 예를 들어, Siglec-9 또는 시아노몰구스 Siglec이 아닌 Siglet-7에 결합하는 항체(오른쪽 패널), 각각의 Siglec-7, Siglec-9 및 시아노몰구스 Siglec에 결합하는 항체(중간 패널), 및 Siglec-7 또는 시아노몰구스 Siglec이 아닌 Siglet-9에 결합하는 항체(왼쪽 패널)의 유세포 측정으로부터의 대표 결과를 나타낸다.
도 3은 이의 각각의 EC50 값이 수반되는, 항체 mAbA, mAbC 및 mAbD의 moDC(왼쪽 패널) 및 뉴라미다제-처리 moDC(오른쪽 패널)로의 유세포 측정 결합에 의한 적정을 나타낸다. EC50은 뉴라미니다제 처리 후 크게 증강되어(10배), moDC 상에서 발현되는 Siglec-9가 뉴라미니다제 처리 전에 이의 시알산 리간드와의 시스 상호작용에 연루되었음을 제시하였다. 그러나, 정체기 수준은 변경되지 않아, 항체가 세포 표면 상의 모든 Siglec-9(결합 및 비결합) 입체형태에 결합할 수 있고 monoDC뿐만 아니라 다른 세포 유형(예컨대, 단핵구 및 대식구 M1 및 M2)에서 시스-상호작용 및 신호전달을 억제함을 제시한다.
도 4는 Siglec-7 및 Siglec-9 교차 반응성 항체 중에서(도 4b) 및 Siglec-9 단일특이적(비-Siglec-7 결합) 항체 중에서(도 4a) YTS Siglec-9* 세포독성 증가의 용량 의존적 유도를 나타낸다.
도 5는 일차 NK 세포(공여체로부터 정제된 신선 NK 세포로서) 및 HT29 결장직장암 세포를 이용하여, 전통적인 51Cr 방출 검정에서, 2명의 상이한 인간 공여체(공여체 D1(왼쪽 패널) 및 D2(오른쪽 패널))에서 항체 mAbA, mAbC, mAbD, mAbE, 및 mAbF에 의해 매개되는 일차 NK 세포 세포독성의 증가를 나타낸다.
도 6은 HT29 종양 세포의 존재 하에 1명의 인간 공여체에서 몇몇 항-Siglec-9 및 항 Siglec-7/9 항체 mAbA, mAbB, mAbF, mAb6 및 mAb4에 의해 매개되는 CD137을 발현하는 Siglec-9-양성 NK 세포%의 증가를 나타낸다. 항-Siglec-9 항체는 Siglec-9-발현 일차 인간 NK 세포의 세포독성을 동일한 공여체로부터의 Siglec-9-음성 일차 인간 NK 세포에서 관찰되는 수준까지 완전 복원하였다.
도 7은 항체 mAbA 및 mAb1이 Siglec-9-음성 CD137+ NK 세포(%)(오른쪽 패널)가 아닌 Siglec-9-양성 CD137+ NK 세포(%)(중간 패널)의 증가를 유도함을 나타낸다. 항체의 부재 하에 CD137을 발현하는 NK%를 왼쪽 패널에 나타낸다.
도 8은 항체의 존재 하에 Siglec-9-Fc 단백질의 Ramos 세포로의 결합을 나타낸다(상부 패널). 항-Siglec/9 mAb mAbA, mAbB, mAbC, 및 mAbD는 각각 Siglec-9-Fc 단백질의 Ramos 세포로의 결합을 억제한 반면, mAbE는 부분적 억제를 나타내었고, mAbF는 결합을 억제하지 않았다. 항체의 존재 하에 Siglec-9-Fc 단백질의 K562 세포로의 결합을 하부 패널에 나타낸다. 항-Siglec/9 mAb mAbA, mAbB, mAbC 및 mAbD는 각각 Siglec-9-Fc 단백질의 Ramos 세포로의 결합을 억제한 반면, mAbE 및 mAbF는 둘 다 부분적 억제를 나타내었다.
도 9 및 10은 ELISA 검정을 이용하여 항 Siglec-7/9 항체에 의한 Siglec-7 및 Siglec-9 및 시알릴화 리간드 간 상호작용의 차단 평가를 나타낸다. 도 9는 mAb 1, mAb2, mAb4, mAb5 및 mAb6이 Sia2와의 Siglec-7 상호작용을 차단하였으나, mAb3은 차단하지 않았음을 나타낸다. 도 10은 모든 mAb가 Sia2와 Siglec-9 상호작용을 차단하는 반면, mAb1, mAb2 및 mAb3은 Sia1과 Siglec-9 상호작용을 억제하는 능력을 낮게 나타내었고 이에 따라 Sia1 상호작용을 실질적으로 차단하지 않았음을 나타낸다.
도 11 내지 도 14는 인간 Siglec-9 단백질을 나타낸다. 도 11a는 Siglec-9 N-말단 V-세트 Ig-유사 도메인의 구조를 나타내며, Siglec-9 돌연변이체 M9, M10 및 M11에서 치환된 잔기를 짙은 색조로 나타내고; 도 11b는 Siglec-9 돌연변이체 M7, M9, M10 및 M11에서 치환된 잔기를 나타내며; 도 11c는 Siglec-9 돌연변이체 M8, M9, M10 및 M11에서 치환된 잔기를 나타낸다. 도 12는 Siglec-9 N-말단 V-세트 Ig-유사 도메인의 구조를 나타내며, Siglec-9 돌연변이체 M6 및 M7에서 치환된 잔기를 짙은 색조로 나타낸다. 도 13a는 Siglec-9 N-말단 V-세트 Ig-유사 도메인의 구조를 나타내며, Siglec-9 돌연변이체 M16에서 치환된 잔기를 짙은 색조로 나타낸다. 도 13b는 Siglec-9 돌연변이체 M14 및 M16에서 치환된 잔기를 나타낸다. 도 14a는 Siglec-9 돌연변이체 M8에서 치환된 잔기를 짙은 색조로 나타낸다. 도 14b는 Siglec-9 돌연변이체 M8, M14, M15 및 M16에서 치환된 잔기를 나타낸다. 각각의 도 11 내지 14에서, 시알산 리간드 결합 부위를 밝은 색조로 나타낸다.
정의
명세서에서 이용되는 단수는 하나 이상을 의미할 수 있다. 단어 "포함하는"과 함께 이용되는 경우, 청구범위(들)에서 이용되는 단수는 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다. 본원에서 이용되는 "또 다른"은 적어도 제2의 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
"포함하는"이 이용되는 경우, 이는 선택적으로 "로 본질적으로 구성되는" 또는 "로 구성되는"에 의해 대체될 수 있다.
인간 Siglec-7(Genbank 접근 번호 NP_055200.1에 나타내며, 그 전체 개시는 본원에 참조로 포함됨)은 CD33-관련 Siglec 패밀리의 구성원이다(Angata and Varki, Glycobiology 10 (4), 431-438 (2000)). 인간 Siglec-7은 다음 아미노산 서열을 갖는, 467개 아미노산을 포함한다:
Figure pct00001
인간 Siglec-9(Genbank 접근 번호 NP055256.1에 나타내며, 그 전체 개시는 본원에 참조로 포함됨)는 CD33-관련 Siglec 패밀리의 구성원이다(Angata and Varki, J. Biol. Chem. 275 (29), 22127-22135 (2000)). 인간 Siglec-9는 다음 아미노산 서열을 갖는 463개 아미노산을 포함한다:
Figure pct00002
본 발명의 맥락에서, "NK 세포 세포독성의 Siglec-매개 억제를 중화시킨다", ""T 세포 세포독성의 Siglec-매개 억제를 중화시킨다" 또는 "Siglec의 억제 활성을 중화시킨다""는 Siglec(예컨대, Siglec-7, Siglec-9)이 세포내 공정에 부정적으로 영향을 미치는 그 능력이 억제되어 사이토카인 방출 및 세포독성 반응과 같은 림프구 반응을 야기하는 공정을 나타낸다. 이는 예를 들어 표준 NK-세포 또는 T-세포 기반 세포독성 검정에서 측정될 수 있으며, 여기서 치료 화합물이 Siglec 양성 림프구에 의한 시알산 리간드 양성 세포의 사멸을 자극하는 능력이 측정된다. 하나의 구현예에서, 항체 조제물은 Siglec-제한 림프구의 세포독성에서 적어도 10% 강화, 선택적으로 림프구 세포독성에서 적어도 40% 또는 50% 강화, 또는 선택적으로 NK 세포독성에서 적어도 70% 강화를 야기하며, 기재된 세포독성 검정을 참조한다. 하나의 구현예에서, 항체 조제물은 Siglec-제한 림프구에 의한 사이토카인 방출에서 적어도 10% 강화, 선택적으로 사이토카인 방출에서 적어도 40% 또는 50% 강화, 또는 선택적으로 사이토카인 방출에서 적어도 70% 강화를 야기하며, 기재된 세포독성 검정을 참조한다. 하나의 구현예에서, 항체 조제물은 Siglec-제한 림프구에 의한 세포독성 마커(예컨대, CD107 및/또는 CD137)의 세포 표면 발현에서 적어도 10% 강화, 선택적으로 적어도 40% 또는 50% 강화, 또는 선택적으로 세포독성 마커(예컨대, CD107 및/또는 CD137)의 세포 표면 발현에서 적어도 70% 강화를 야기한다.
항-Siglec 항체가 Siglec 분자의 시알산 리간드로의 결합을 "차단"하는 능력은 항체가 가용성 또는 세포-표면 연관된 Siglec 및 시알산 분자를 이용하는 검정에서 Siglec 분자의 시알산 분자로의 결합을 용량-의존적 방식으로 검출 가능하게 감소시킬 수 있음을 의미하며, 여기서 Siglec 분자는 항체의 부재 하에 시알산 분자에 검출 가능하게 결합한다.
본 전체 명세서 내에서 "암의 치료" 등이 항-Siglec 결합 제제(예로 항체)에 대해 언급되는 경우, 이는 본 출원이 출원되는 국가에서의 특허 허여에 허용 가능한 요지 대상에 따라, (a) 암의 치료 방법으로서, 암의 치료를 허용하는 용량(치료 유효량)으로, 바람직하게는 본원에 명시된 용량(양)으로, 이러한 치료를 필요로 하는 개체, 포유류, 특히 인간에게 항-Siglec 결합 제제(바람직하게는 약제학적으로 허용 가능한 담체 물질 중)를(적어도 1회 치료를 위해) 투여하는 단계를 포함하는, 방법; (b) 암의 치료를 위한 항-Siglec 결합 제제의 용도 또는 상기 치료에서(특히 인간에서)의 이용을 위한 항-Siglec 결합 제제; (c) 암의 치료를 위한 약학 조제물의 제조를 위한 항-Siglec 결합 제제의 용도, 항-Siglec 결합 제제를 약제학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함하는 암의 치료를 위한 약학 조제물의 제조를 위한 항-Siglec 결합 제제의 이용 방법, 또는 암의 치료에 적절한 항-Siglec 결합 제제의 유효 용량을 포함하는 약학 조제물; 또는 (d) a), b) 및 c)의 임의의 조합을 의미한다.
본원에서 이용되는 용어 "항원 결합 도메인"은 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 3차원 구조를 포함하는 도메인을 나타낸다. 따라서, 하나의 구현예에서, 상기 도메인은 항체 사슬의 고가변 영역, 선택적으로 VH 및/또는 VL 도메인, 선택적으로 적어도 VH 도메인을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 결합 도메인은 항체 사슬의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 결합 도메인은 비-면역글로불린 스캐폴드로부터의 폴리펩타이드 도메인을 포함할 수 있다.
본원에서 상호 교환적으로 이용되는 용어 "항체" 또는 "면역글로불린"에는 전체 항체 및 이의 임의의 항원 결합 단편 또는 단일쇄가 포함된다. 전형적인 항체는 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개 도메인 CH1, CH2, 및 CH3으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 이루어진다. 예시적인 면역글로불린(항체) 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩타이드쇄로 이루어지며, 각각의 쌍은 1개의 "경쇄"(약 25 kDa) 및 1개의 "중쇄"(약 50 내지 70 kDa)를 갖는다. 각각의 쇄의 N-말단은 일차적으로 항원 인식에 관여하는 약 100개 내지 110개 이상 아미노산의 가변 영역을 정의한다. 용어 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)는 이들 경쇄 및 중쇄를 각각 나타낸다. 상이한 면역글로불린 클래스에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 "알파", "델타", "엡실론", "감마" 및 "뮤"로 명명된다. 이들 중 몇몇은 서브클래스 또는 이소형, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등으로 추가 구분된다. 상이한 면역글로불린 클래스의 서브유닛 구조 및 3차원 배치는 잘 알려져 있다. IgG는 이들이 생리적 상황에서 가장 일반적인 항체이므로, 그리고 이들이 실험실 환경에서 가장 쉽게 제조되므로, 본원에서 채용되는 예시적인 항체 클래스이다. 선택적으로 항체는 모노클로날 항체이다. 항체의 구체예에는 인간화, 키메라, 인간, 또는 달리-인간-적합 항체가 있다. "항체"에는 또한 본원에 기재되는 임의의 항체의 임의의 단편 또는 유도체가 포함된다.
"교차 반응성" 항-Siglec 항체는 특이성 및/또는 친화도를 가지고 하나를 초과하는 Siglec 분자에 결합하는 항체이다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 Siglec-7 및 Siglec-9와 교차 반응성일 수 있다.
용어 "~에 특이적으로 결합한다"란 항체가 단백질의 재조합 형태, 여부에서의 에피토프, 또는 단리된 표적 세포의 표면 상에 존재하는 원상태 단백질을 이용하여 평가되는 바와 같이, 경쟁적 결합 검정에서 결합 파트너, 예로 Siglec-7, Siglec-9에 바람직하게 결합할 수 있음을 의미한다. 특이적 결합을 결정하기 위한 경쟁적 결합 검정 및 다른 방법은 아래에 추가 기재되며 당분야에 널리 공지되어 있다.
항체가 특정한 모노클로날 항체"와 경쟁한다"고 언급되는 경우, 이는 항체가 재조합 Siglec 분자 또는 표면 발현 Siglec 분자를 이용하는 결합 검정에서 모노클로날 항체와 경쟁함을 의미한다. 예를 들어, 평가 항체가 결합 검정에서 Siglec 폴리펩타이드 또는 Siglec-발현 세포에 대한 참조 항체의 결합을 감소시키는 경우, 항체는 참조 항체와 각각 "경쟁한다"고 언급된다.
본원에서 이용되는 용어 "친화도"란, 에피토프에 대한 항체의 결합 강도를 의미한다. 항체의 친화도는 [Ab] x [Ag] / [Ab-Ag]로 정의되는 해리 상수 Kd에 의해 주어지며, 여기서 [Ab-Ag]는 항체-항원 복합체의 몰 농도이고, [Ab]는 미결합 항체의 몰 농도이고, [Ag]는 미결합 항원의 몰 농도이다. 친화도 상수 Ka는 1/Kd로 정의된다. mAb의 친화도 결정 방법은 문헌[Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993) 및 Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601(1983)]에서 확인될 수 있고, 상기 참고문헌은 전체가 본원에 참조로 포함된다. mAb의 친화도를 결정하기 위해 당분야에 널리 공지된 하나의 표준 방법은 표면 플라즈몬 공명(SPR) 스크리닝의 이용이다(예컨대 BIAcore™ SPR 분석 장치를 이용하는 분석에 의해).
본원의 맥락 내에서, "결정기"는 폴리펩타이드 상의 상호작용 또는 결합 부위를 지칭한다.
용어 "에피토프"란 항원성 결정기를 나타내며, 항체가 결합하는 항원 상 지역 또는 영역이다. 단백질 에피토프는 결합에 직접 관여되는 아미노산 잔기뿐만 아니라 특정한 항원 결합 항체 또는 펩타이드에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기, 즉 항체의 "풋프린트(footprint)" 내의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 이는, 예로 항체 또는 수용체와 조합될 수 있는 복잡한 항원 분자 상의 가장 간단한 형태 또는 가장 작은 구조 영역이다. 에피토프는 선형 또는 입체형태/구조적일 수 있다. 용어 "선형 에피토프"는 아미노산의 선형 서열(일차 서열) 상에서 인접하는 아미노산 잔기로 이루어진 에피토프로서 정의된다. 용어 "입체형태 또는 구조적 에피토프"는 전혀 인접하지 않고 아미노산 잔기로 이루어진 에피토프로서 정의되며, 이에 따라 분자의 폴딩에 의해 서로 인접하게 되는 아미노산의 선형 서열의 분리된 부분(이차, 삼차 및/또는 사차 구조)을 나타낸다. 입체형태 에피토프는 3-차원 구조에 의존한다. 따라서 용어 '입체형태'란 종종 '구조적'과 상호교환적으로 이용된다.
Siglec-발현 세포(예컨대, Siglec-7 또는 Siglec-9 발현 림프구)에 대한 용어 "고갈시키다" 또는 "고갈시키는"은 샘플 또는 대상체에 존재하는 이러한 Siglec-발현 세포의 수에 부정적으로 영향을 미치기 위한, 사멸, 제거, 용해 또는 이러한 사멸, 제거 또는 용해의 유도를 일으키는 공정, 방법, 또는 화합물을 의미한다. 공정, 방법, 또는 화합물에 대한 "비-고갈"은 공정, 방법, 또는 화합물이 고갈시키지 않음을 의미한다.
용어 "제제"란 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자, 또는 생물학적 물질로부터 제조된 추출물을 표시하기 위해 본원에서 이용된다. 용어 "치료제"는 생물학적 활성을 갖는 제제를 나타낸다.
본원에서의 목적을 위해, "인간화" 또는 "인간" 항체는 하나 이상의 인간 면역글로불린의 불변 및 가변 프레임워크 영역이 동물 면역글로불린의 결합 영역, 예컨대, CDR과 융합되는 항체를 나타낸다. 이러한 항체는 결합 영역이 유래되는 비-인간 항체의 결합 특이성을 유지하지만, 비-인간 항체에 대한 면역 반응을 회피하도록 설계된다. 이러한 항체는 항원성 유발접종에 반응하여 특이적 인간 항체를 생산하도록 "조작된" 트랜스제닉 마우스 또는 다른 동물로부터 수득될 수 있다(예로, 그 전체 교시가 본원에 참조로 포함되는, 문헌[Green et al. (1994) Nature Genet 7:13; Lonberg et al. (1994) Nature 368:856; Taylor et al. (1994) Int Immun 6:579] 참고). 완전 인간 항체는 모두 당분야에 널리 공지되어 있는, 유전적 또는 염색체 전달감염 방법뿐만 아니라 파지 디스플레이 기술에 의해서도 구축될 수 있다(예로, 문헌[McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-553] 참고). 인간 항체는 또한 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수 있다(예로, 이들의 전문이 참조로 포함되는, 미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호 참고).
"키메라 항체"는 (a) 항원 결합 부위(가변 영역)가 상이하거나 변형된 클래스, 효과기 기능 및/또는 종의 불변 영역 또는 키메라 항체에 대해 새로운 특성을 부여하는 완전히 상이한 분자, 예로 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 약물 등에 연결되도록 불변 영역, 또는 이들의 일부가 변형되거나, 대체되거나, 교환된; 또는 (b) 가변 영역 또는 이들의 일부가 상이하거나 변형된 항원 특이성을 갖는 가변 영역으로 변형되거나, 대체되거나, 교환된 항체 분자이다.
본원에서 이용되는 경우, 용어 "고가변 영역"은 항원 결합에 관여되는 항체의 아미노산 잔기를 나타낸다. 고가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(예컨대, 경쇄 가변 도메인에서의 잔기 24~34(L1), 50~56(L2) 및 89~97(L3) 및 중쇄 가변 도메인에서의 31~35(H1), 50~65(H2) 및 95~102(H3); Kabat et al. 1991) 및/또는 "고가변 루프"로부터의 아미노산 잔기(예컨대, 경쇄 가변 도메인에서의 잔기 26~32(L1), 50~52(L2) 및 91~96(L3) 및 중쇄 가변 도메인에서의 26~32(H1), 53~55(H2) 및 96~101(H3); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917), 또는 항원 결합에 관여되는 필수 아미노산을 결정하기 위한 유사 시스템으로부터의 잔기를 포함한다. 전형적으로, 상기 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al., 상기 문헌]에 기재된 방법에 의해 수행된다. 본원에서 "Kabat 위치", "Kabat에서의 가변 도메인 잔기 넘버링" 및 "Kabat에 따른"과 같은 어구는 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대한 상기 넘버링 시스템을 나타낸다. Kabat 넘버링 시스템을 이용하여, 펩타이드의 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축 또는 그 안으로의 삽입에 대응하는 더 적거나 추가적인 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인에는 CDR H2의 잔기 52 뒤의 단일 아미노산 삽입(Kabat에 따른 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 뒤의 삽입된 잔기(예컨대, Kabat에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)가 포함될 수 있다. 잔기의 Kabat 넘버링은 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" Kabat 넘버링된 서열과의 정렬에 의해 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다.
본원에서 이용되는 "프레임워크" 또는 "FR" 잔기란 CDR로 정의되는 영역을 배제하는 항체 가변 도메인의 영역을 의미한다. 각각의 항체 가변 도메인 프레임워크는 CDR에 의해 구분되는 인접 영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)으로 추가 세분될 수 있다.
용어 "Fc 도메인", "Fc 부분" 및 "Fc 영역"은 항체 중쇄의 C-말단 단편, 예로 인간 γ(감마) 중쇄의 아미노산(aa) 약 230 내지 aa 약 450 또는 다른 유형의 항체 중쇄(예로, 인간 항체에 있어서 α, δ, ε 및 μ), 또는 이들의 천연 발생 동종이형에서의 그 대응부 서열을 나타낸다. 달리 명시되지 않는 한, 면역글로불린에 대해 일반적으로 허용되는 Kabat 아미노산 넘버링이 본 개시를 통해 이용된다(문헌[Kabat et al.(1991) Sequences of Protein of Immunological Interest, 5th ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD] 참고).
용어 "단리된", "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한"은 그 원상태 상태에서 확인되는 바와 같이 이들에 보통 수반되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 나타낸다. 순도 및 균질성은 전형적으로 분석 화학 기법, 예컨대 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 결정된다. 조제물에 존재하는 주요 종인 단백질은 실질적으로 정제된다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 나타내기 위해 본원에서 상호 교환적으로 이용된다. 상기 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 대응하는 천연 발생 아미노산의 인공적 화학 모사체인 아미노산 중합체뿐만 아니라 천연 발생 아미노산 중합체 및 비천연 발생 아미노산 중합체에 적용된다.
용어 "재조합"은, 예로 세포, 또는 핵산, 단백질, 또는 벡터에 대해 이용되는 경우, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종성 핵산 또는 단백질의 도입 또는 원상태 핵산 또는 단백질의 변형에 의해 개질되었음을, 또는 세포가 이렇게 개질된 세포로부터 유래됨을 시사한다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 원상태(비재조합) 형태 내에서 확인되지 않는 유전자를 발현하거나 다르게 비정상적으로 발현되거나 하향 발현되거나 전혀 발현되지 않는 원상태 유전자를 발현한다.
본원에서의 맥락 내에서, 폴리펩타이드 또는 에피토프에 "결합하는" 항체라는 용어는 상기 결정기에 특이성 및/또는 친화도를 가지고 결합하는 항체를 지칭한다.
용어 "동일성" 또는 "동일한"은 2개 이상의 폴리펩타이드의 서열 간 관계에서 이용되는 경우, 2개 이상의 아미노산 잔기 스트링 간 매치 수에 의해 결정되는, 폴리펩타이드 간 서열 관련성 정도를 나타낸다. "동일성"은 특정한 수학 모델 또는 컴퓨터 프로그램(즉, "알고리즘")에 의해 해결되는 갭 정렬(존재하는 경우)을 갖는 더 작은 2개 이상의 서열 간 동일한 매치 백분율을 측정한다. 관련 폴리펩타이드의 동일성은 공지된 방법에 의해 쉽게 계산될 수 있다. 이러한 방법에는, 비제한적으로 문헌[Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; 및 Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)]에 기재된 것들이 포함된다.
동일성 결정 방법은 평가되는 서열 간에 가장 큰 매치를 제공하도록 설계된다. 동일성 결정 방법은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램에서 설명된다. 두 서열 간 동일성을 결정하기 위한 컴퓨터 프로그램 방법에는 GAP을 포함하는 GCG 프로그램 패키지(Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12, 387(1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN 및 FASTA(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410(1990))가 포함된다. BLASTX 프로그램은 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 및 다른 출처(BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., 상기 문헌)에서 공개적으로 이용 가능하다. 널리 공지된 Smith Waterman 알고리즘도 동일성을 결정하기 위해 이용될 수 있다.
항체의 생산
질병(예컨대 암, 감염성 질병)의 치료를 위해 유용한 항-Siglec 제제는 인간 Siglec-9 단백질의 세포외 부분에 결합하며(그리고 선택적으로 추가 Siglec-12 결합을 포함하거나 포함하지 않고, 인간 Siglec-7 단백질에 추가 결합하며) Siglec 양성 면역 세포의 표면 상에서 발현되는 인간 Siglec의 억제 활성을 감소시킨다. 하나의 구현예에서 제제는 시알산 분자가 호중구, 수지상 세포, 대식구, M2 대식구, NK 세포 및/또는 CD8+ T 세포에서 Siglec에 의한 억제성 신호전달을 야기하는 능력을 억제한다.
하나의 구현예에서, 본원에 기재되는 항-Siglec 제제는 Siglec의 리간드를 보유하는 표적 세포(예컨대 암 세포)에 대한 인간에서의 또는 인간 공여체로부터의 NK 세포 및/또는 호중구의 세포독성을 증가시키기 위해 이용될 수 있다. NK 세포 및 호중구는 미생물 및 암 세포를 인식하고 직접 사멸시키는 특화된 과립구이다. 종양 세포의 표면에서 발현하는 시알산은 종양 세포에 대한 NK 세포의 세포독성을 감소시키는 것으로 나타난다. 항체는 NK 세포 세포독성을 증강시키기 위해, 예를 들어 세포독성 수준을 그 표면에서 특정 Siglec을 발현하지 않는 NK 세포 또는 호중구에서 실질적으로 관찰되는 수준까지 복원하기 위해 이용될 수 있다.
시알산은 또한 수지상 세포 상에서 고발현되며, TLR 자극에 대한 반응성을 포함하여, 몇몇 DC 기능을 조정하는 것으로 기재되었다. 시알산 합성의 차단은 TLR 자극에 대한 moDC의 활성화 역치 및 몇몇 미생물 TLR 리간드에 대한 Siglec-E 고갈 증강된 수지상 세포 반응을 저하시킨다. Siglec-9는 마우스에서 Siglec-E의 가장 가까운 인간 오르소로그 구성원이며, 항-Siglec-9 항체의 차단은 수지상 세포 활성화를 증강시키고 DC-T 상호작용을 조정할 수 있다. 시알산으로의 항원 변형은 항원-특이적 조절 T(Treg) 세포의 생성을 조절하고 수지상 세포를 통한 효과기 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 형성을 방지한다. 수지상 세포의 식균능도 a2,6-시알산 결핍에 의해 개선될 수 있다.
Siglec-7 및 Siglec-9는 둘 다 유형 M1 및 M2 대식구에서 발현되며, Siglec-9의 녹다운은 다양한 표면 발현 마커(예컨대 CCR7 및 CD200R)를 조정하는 것으로 기재되어, Siglec-9에 의한 대식구 기능의 조정을 제시한다. 실제로, 다양한 Siglec-9 돌연변이체(ITIM 도메인에서의 돌연변이)가 대식구 세포주에서 전달감염되었으며 Siglec-9가 항-염증성 사이토카인 IL-10의 생산을 증강시킴을 실증하였다. Siglec-9와 가용성 리간드의 결합은 또한 체크포인트 리간드 PD-L1의 증가된 발현을 가지며, 대식구가 종양-연관 대식구-유사 표현형을 나타내도록 유도할 수 있다.
하나의 구현예에서 제제는 시알산 분자와 Siglec으로의 결합에서 경쟁한다, 즉, 제제는 Siglec 및 이의 시알산 리간드 간 상호작용을 차단한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 제제는 전장 항체, 항체 단편, 및 합성 또는 반-합성 항체-유래 분자로부터 선택되는 항체이다.
본 발명의 하나의 양태에서, 제제는 완전 인간 항체, 인간화 항체, 및 키메라 항체로부터 선택되는 항체이다.
본 발명의 하나의 양태에서, 제제는 IgA, IgD, IgG, IgE 및 IgM 항체로부터 선택되는 항체의 단편이다.
본 발명의 하나의 양태에서, 제제는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택되는 불변 도메인을 포함하는 항체의 단편이다.
본 발명의 하나의 양태에서, 제제는 Fab 단편, Fab' 단편, Fab'-SH 단편, F(ab)2 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 중쇄 Ig(라마 또는 낙타 Ig), VHH 단편, 단일 도메인 FV, 및 단일쇄 항체 단편으로부터 선택되는 항체 단편이다.
본 발명의 하나의 양태에서, 제제는 scFV, dsFV, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 카파 바디, IgNAR; 및 다중특이적 항체로부터 선택되는 합성 또는 반합성 항체-유래 분자이다.
따라서 본 발명은 Siglec에 결합하는 항체 및 항원 결합 도메인(및 이를 포함하는 폴리펩타이드)에 관한 것이다. 하나의 양태에서, 항체 또는 항원 결합 도메인은 추가 인간 Siglec, 예컨대, Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-8, Siglec-10, Siglec-11 및/또는 Siglec-12에 비해 적어도 100-배 더 낮은 결합 친화도(예컨대, KD)로 Siglec-7 및/또는 Siglec-9에 결합한다. 하나의 양태에서, 항체 또는 항원 결합 도메인은 Siglec-7이 아닌 Siglec-9에 결합한다; 하나의 구현예에서, 항체는 인간 Siglec-7 폴리펩타이드에 비해 적어도 100-배 더 낮은 결합 친화도(예컨대, KD)로 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합한다. 또 다른 양태에서, 항체는 서로 1-log 초과가 상이하지 않은 결합 친화도(예컨대, KD)로 인간 Siglec-9 폴리펩타이드 및 인간 Siglec-7 폴리펩타이드에 모두 결합하며, 여기서 상기 Siglec-7 및 Siglec-9에 대한 결합 친화도는 추가 인간 Siglec, 예컨대, Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-8, Siglec-10, Siglec-11 및/또는 Siglec-12에 비해 적어도 100-배 더 낮다. 친화도는, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명에 의해, 재조합 Siglec 폴리펩타이드로의 결합에 대해 결정될 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 항체는 정제되거나 적어도 부분적으로 정제된 형태이다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체는 본질적으로 단리된 형태이다.
항체는 당분야에 공지된 다양한 기법에 의해 생산될 수 있다. 전형적으로, 이들은 Siglec 폴리펩타이드, 바람직하게는 인간 Siglec 폴리펩타이드를 포함하는 면역원을 이용한 비-인간 동물, 바람직하게는 마우스의 면역화에 의해 생산된다. Siglec 폴리펩타이드는 인간 Siglec-9 및/또는 Siglec-7 폴리펩타이드의 전장 서열, 또는 이의 단편 또는 유도체, 전형적으로 면역원성 단편, 즉, Siglec 폴리펩타이드를 발현하는 세포 표면 상에 노출된 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 포함할 수 있다. 이러한 단편은 전형적으로 성숙 폴리펩타이드 서열의 적어도 약 7개 연속 아미노산, 더욱 바람직하게는 이의 적어도 약 10개 연속 아미노산을 함유한다. 단편은 전형적으로 수용체의 세포외 도메인으로부터 본질적으로 유래된다. 하나의 구현예에서, 면역원은 지질막에, 전형적으로 세포 표면에서, 야생형 인간 Siglec 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 온전한 세포, 특히 온전한 인간 세포, 선택적으로 처리되거나 용해된 세포를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 재조합 Siglec 폴리펩타이드이다.
항원으로 비-인간 포유류를 면역화하는 단계는 마우스에서 항체의 생산을 자극하기 위해 당분야에 널리 공지된 임의의 방식으로 수행될 수 있다(예를 들어, 그 전체 개시가 본원에 참조로 포함되는 문헌[E. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)] 참고). 면역원은 선택적으로 아주반트, 예컨대 완전 또는 불완전 프로인트 아주반트를 함유하며, 완충액 중에 현탁되거나 용해된다. 면역원의 양, 완충액 유형 및 아주반트의 양을 결정하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있으며 어떠한 방식으로든 제한되지 않는다. 이들 파라미터는 상이한 면역원에 있어서 상이할 수 있지만, 쉽게 규명된다.
유사하게, 항체의 생산을 자극하기 충분한 면역화 위치 및 빈도도 당분야에 널리 공지되어 있다. 전형적인 면역화 프로토콜에서, 비-인간 동물은 1일차에 그리고 약 1주 후 다시 항원이 복강내 주사된다. 여기에 약 20일차에, 선택적으로 아주반트, 예컨대 불완전 프로인트 아주반트를 함유하는 항원의 리콜 주사가 뒤따른다. 리콜 주사는 정맥내 수행되며, 연속 며칠 동안 반복될 수 있다. 여기에 약 40일차에, 전형적으로 아주반트를 함유하지 않고, 정맥내 또는 복강내 부스터 주사가 뒤따른다. 상기 프로토콜은 약 40일 후 항원-특이적 항체-생산 B 세포의 생산을 일으킨다. 면역화에서 이용된 항원에 대한 항체를 발현하는 B 세포의 생산을 일으키는 한, 다른 프로토콜도 이용될 수 있다.
대안적 구현예에서, 비-면역화된 비-인간 포유류로부터의 림프구가 단리되고, 시험관내 성장된 후 세포 배양에서 면역원에 노출된다. 이어서 림프구가 수확되고 후술되는 융합 단계가 수행된다.
모노클로날 항체에 있어서, 다음 단계는 항체-생산 하이브리도마를 형성하기 위한 면역화된 비-인간 포유류로부터의 비장세포의 단리 및 이들 비장세포와 불멸화된 세포의 후속 융합이다. 비-인간 포유류로부터 비장세포의 단리는 당분야에 널리 공지되어 있으며, 전형적으로 단일 세포 현탁액을 생산하기 위해 마취된 비-인간 포유류로부터의 비장 제거, 이의 소편으로의 절단 및 세포 여과장치의 나일론 메쉬를 통해 비장낭으로부터 적절한 완충액으로의 비장세포 압착이 관여된다. 세포는 세척되어, 원심분리되고, 임의의 적혈구를 용해시키는 완충액 중에 재현탁된다. 용액이 다시 원심분리되고 펠렛 내의 잔여 림프구가 신선 완충액 중 최종 재현탁된다.
일단 단리되어 단일 세포 현탁액에 존재하는 경우, 림프구는 불멸 세포주에 융합될 수 있다. 이는 전형적으로 마우스 골수종 세포주이지만, 하이브리도마의 생성에 유용한 여러 다른 불멸 세포주가 당분야에 공지되어 있다. 뮤린 골수종 세포주에는 비제한적으로 Salk Institute Cell Distribution Center(San Diego, U. S. A.)로부터 이용 가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양에서 유래되는 것들, American Type Culture Collection(Rockville, Maryland U. S. A.)으로부터 이용 가능한 X63 Ag8653 및 SP-2 세포가 포함된다. 융합은 폴리에틸렌 글리콜 등을 이용해서 실시된다. 이어서 생성 하이브리도마는 미융합, 모체 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 선택 배지에서 성장시킨다. 예를 들어, 모체 골수종 세포에 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)가 부재하는 경우, 하이브리도마에 대한 배양 배지에는 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT 배지)이 포함될 것이며, 이 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
하이브리도마는 전형적으로 대식구의 영양세포층 상에서 성장시킨다. 대식구는 바람직하게는 비장세포를 단리하기 위해 이용되는 비-인간 포유류의 한배로부터 유래되며 전형적으로 하이브리도마의 플레이트-접종 수 일 전에 불완전 프로인트 아주반트 등으로 초회감작된다. 융합 방법은 문헌[Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice," pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]에 기재되어 있으며, 그 개시는 본원에 참조로 포함된다.
세포는 콜로니 형성 및 항체 생산을 위해 충분한 시간 동안 선택 배지에서 성장시킨다. 이는 보통 약 7일 내지 약 14일이다.
이어서 하이브리도마 콜로니는 Siglec 폴리펩타이드 유전자 산물에 특이적으로 결합하는 항체의 생산에 대해 검정된다. 검정은 전형적으로 비색계측 ELISA-유형 검정이지만, 하이브리도마를 성장시키는 웰에 적응될 수 있는 임의의 검정이 채택될 수 있다. 다른 검정에는 방사선면역검정 또는 형광 활성화 세포 정렬이 포함된다. 요망되는 항체 생산에 대해 양성인 웰이 하나 이상의 별도의 콜로니가 존재하는지를 결정하기 위해 검사된다. 하나를 초과하는 콜로니가 존재하는 경우, 하나의 세포만 요망되는 항체를 생산하는 콜로니를 생성함을 보장하기 위해 세포가 재클로닝되고 성장시킬 수 있다. 전형적으로, 항체는 또한 Siglec 폴리펩타이드, 예컨대, Siglec-발현 세포에 결합하는 능력에 대해 평가될 것이다.
모노클로날 항체를 생산하는 것으로 확인되는 하이브리도마는 적절한 배지, 예컨대 DMEM 또는 RPMI-1640에서 더 다량으로 성장시킬 수 있다. 대안적으로, 하이브리도마 세포는 생체내에서 동물 내의 복수 종양으로서 성장시킬 수 있다.
요망되는 모노클로날 항체를 생산하기 충분한 성장 후, 모노클로날 항체를 함유하는 성장 배지(또는 복수액)는 세포로부터 분리되며 거기에 존재하는 모노클로날 항체가 정제된다. 정제는 전형적으로 겔 전기영동, 투석, 단백질 A 또는 단백질 G-세파로스를 이용하는 크로마토그래피, 또는 고체 지지체, 예컨대 아가로스 또는 세파로스 비드에 연결된 항-마우스 Ig에 의해 달성된다(모두, 예를 들어, 문헌[Antibody Purification Handbook, Biosciences, publication No. 18-1037-46, Edition AC]에 기재되며, 그 개시는 본원에 참조로 포함된다). 결합된 항체는 전형적으로 항체-함유 분획의 즉각적인 중화를 포함하는 저 pH 완충액(pH 3.0 이하의 글리신 또는 아세테이트 완충액)을 이용함으로써 단백질 A/단백질 G 컬럼으로부터 용출된다. 이들 분획은 필요에 따라 풀링되고, 투석되고, 농축된다.
하나의 모노클로날 항체만 검출되고 생산됨을 확실히 하기 위해 하나의 뚜렷한 콜로니를 갖는 양성 웰이 전형적으로 재-클로닝되고 재-검정된다.
항체는 또한 예를 들어 문헌[(Ward et al. Nature, 341 (1989) p. 544, 그 전체 개시는 본원에 참조로 포함됨)]에 개시된 바와 같은, 면역글로불린의 조합 라이브러리의 선택에 의해 생산될 수 있다.
항체는 Siglec 폴리펩타이드에 대한 최대 결합을 달성하기 위해 요구되는 농도에 대해 Siglec 상에서 적정될 수 있다. Siglec 폴리펩타이드(또는 이를 발현하는 세포)로의 결합에 대한 "EC50"은 Siglec 폴리펩타이드(또는 이를 발현하는 세포)로의 결합에 대해 그 최대 반응 또는 효과의 50%를 생성하는 항-Siglec 항체의 효율적 농도를 나타낸다.
일단 Siglec에 결합할 수 있는/있거나 다른 요망되는 특성을 가질 수 있는 항체가 확인되면, 이들은 또한 전형적으로, 다른 Siglec 폴리펩타이드 및/또는 미관련 폴리펩타이드를 포함하는 다른 폴리펩타이드에 결합하는 이의 능력에 대해, 본원에 기재되는 것들을 포함하는 표준 방법을 이용하여 평가될 것이다. 이상적으로, 항체는 Siglec, 예컨대, 인간 Siglec-7 및/또는 인간 Siglec-9에만 상당한 친화도를 가지고 결합하며, 미관련 폴리펩타이드, 특히 CD33-관련 Siglec 이외의 폴리펩타이드, 또는 요망되는 Siglec 이외의 Siglec(예컨대, Siglec-7 및/또는 Siglec-9)에 유의미한 수준으로 결합하지 않는다. 그러나, Siglec에 대한 친화도가 다른 Siglec 및/또는 다른, 미관련 폴리펩타이드)에 대한 것보다 실질적으로 더 큰(예컨대, 5x, 10x, 50x, 100x, 500x, 1000x, 10,000x 이상인) 한, 항체는 본 발명의 방법에서 이용하기 적합함이 이해될 것이다.
항-Siglec 항체는 이들이 인간 Fcγ 수용체에 대한 특이적 결합이 감소되거나 실질적으로 없도록 비-고갈 항체로 제조될 수 있다. 이러한 항체는 Fcγ 수용체에 결합하지 않거나 이에 대해 낮은 결합 친화도를 갖는 것으로 알려져 있는 다양한 중쇄의 불변 영역을 포함할 수 있다. 하나의 이러한 예는 인간 IgG4 불변 영역이다. 대안적으로 불변 영역, 예컨대 Fab 또는 F(ab')2 단편을 포함하지 않는 IgG4 항체 단편이 Fc 수용체 결합을 회피하기 위해 이용될 수 있다. Fc 수용체 결합은, 예를 들어 BIACORE 검정에서 Fc 수용체 단백질에 대한 항체의 결합 평가를 포함하는 당분야에 공지된 방법에 따라 평가될 수 있다. 또한, Fc 부분이 Fc 수용체에 대한 결합을 최소화하거나 제거하도록 개질된 임의의 항체 이소형이 이용될 수 있다(예로, 그 개시가 본원에 참조로 포함되는 WO03101485 참고). 검정, 예컨대 Fc 수용체 결합을 평가하기 위한 세포 기반 검정은 당분야에 널리 공지되어 있으며, 예로, WO03101485에 기재되어 있다.
Siglec 폴리펩타이드 상에 존재하는 에피토프에 결합하는 항체를 인코딩하는 DNA는 하이브리도마로부터 단리되어 적절한 숙주 내로의 전달감염을 위해 적절한 발현 벡터 내에 배치된다. 이어서 숙주는 항체, 또는 이의 변이체, 예컨대 그 모노클로날 항체의 인간화 버전, 항체의 활성 단편, 항체의 항원 인식부를 포함하는 키메라 항체, 또는 검출 가능한 모이어티를 포함하는 버전의 재조합 생산을 위해 이용된다.
모노클로날 항체를 인코딩하는 DNA는 통상적 절차를 이용하여(예컨대, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 탐침을 이용하여) 쉽게 단리되고 서열분석될 수 있다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터 내로 배치될 수 있고, 이어서 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 수득하기 위해, 다른 경우 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 대장균 세포, 시미안 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포 내로 전달감염된다. 본 명세서에서 다른 곳에 기재된 바와 같이, 이러한 DNA 서열은 임의의 다수의 목적을 위해, 예컨대, 항체의 인간화를 위해, 단편 또는 유도체의 생산을 위해, 또는 예컨대 항체의 결합 특이성을 최적화하기 위해 항원 결합 부위에서 항체의 서열을 변경하기 위해 변경될 수 있다. 항체를 인코딩하는 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현은 당분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5, pp. 256 (1993); 및 Pluckthun, Immunol. 130, p. 151 (1992)] 참고).
본 발명의 맥락 내에서, "공통 결정기"는 인간 억제 Siglec 수용체, 특히 CD33-관련 Siglec의 몇몇 유전자 산물에 의해 공유되는 결정기 또는 에피토프를 명명한다. 항체는 적어도 Siglec-7 및 Siglec-9에 의해 공유되는 공통 결정기에 결합할 수 있다. 하나의 구현예에서, 공통 결정기는 선택적으로 하나 이상의, 또는 모든 CD33-관련 Siglec, 특히 Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-8, Siglec-10, Siglec-11 및 Siglec-12 상에 부재할 수 있다. 하나의 구현예에서 공통 결정기는 Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-8, Siglec-10, Siglec-11 및 Siglec-12 상에 부재한다.
Siglec 폴리펩타이드(예컨대, Siglec-7 및/또는 Siglec-9, 특히 모노클로날 항체 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 또는 mAb-F와 실질적으로 또는 본질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 항체(Siglec-9 특이적) 또는 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6과 실질적으로 또는 본질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 항체(Siglec-7/9 특이적)의 확인은 항체 경쟁이 평가될 수 있는 임의의 하나의 다양한 면역학적 스크리닝 검정을 이용해서 쉽게 결정될 수 있다. 여러 이러한 검정이 일상적으로 실시되며 당분야에 널리 공지되어 있다(예컨대, 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 제5,660,827호 참고). 본원에 기재되는 항체가 결합하는 에피토프의 실제 결정이 어떠한 방식으로든 본원에 기재되는 모노클로날 항체와 동일하거나 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 확인하기 위해 요구되지 않음이 이해될 것이다.
예를 들어, 검사될 평가 항체가 상이한 원천 동물로부터 수득되거나, 심지어 상이한 Ig 이소형을 갖는 경우, 대조군(예를 들어, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 또는 mAb-F 또는 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6) 및 평가 항체가 혼합되고(또는 사전-흡착되고), Siglec 폴리펩타이드 함유 샘플에 적용되는 단순한 경쟁 검정이 채택될 수 있다. 웨스턴 블로팅에 기반하는 프로토콜 및 BIACORE 분석의 이용이 이러한 경쟁 연구에서 이용하기 적합하다.
소정 구현예에서, Siglec 항원 샘플로의 적용 전 시기 동안 대조군 항체(예를 들어, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 또는 mAb-F 또는 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6)를 가변량의 평가 항체(예컨대, 약 1:10 또는 약 1:100)와 사전 혼합한다. 다른 구현예에서, 대조군 및 가변량의 평가 항체는 Siglec 항원 샘플로의 노출 동안 단순 혼합될 수 있다. 결합된 항체를 자유 항체와(예컨대, 미결합 항체를 제거하기 위한 분리 또는 세척 기법을 이용함으로써) 그리고 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6을 평가 항체와(예컨대, 종-특이적 또는 이소형-특이적 이차 항체를 이용함으로써 또는 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6을 검출 가능한 표지로 특이적으로 표지함으로써) 구별할 수 있는 한, 평가 항체가 결합에 대해 경쟁하고/하거나 Siglec 상에서 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6과 공통 결합 부위를 인식함을 시사하는, 평가 항체가 항원에 대한 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6의 결합을 감소시키는지를 결정할 수 있다. 경쟁적으로 무관한 항체의 부재 하에 (표지된) 대조군 항체의 결합은 대조군 고-값으로 작용할 수 있다. 대조군 저-값은 표지된(mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6) 항체를 정확히 동일한 유형(mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6)의 미표지 항체와 인큐베이션함으로써 수득될 수 있고, 여기서 경쟁이 일어나 표지된 항체의 결합을 감소시킬 것이다. 평가 검정에서, 평가 항체의 존재 하에 표지된 항체 반응성의 유의미한 감소는 Siglec 상에서 실질적으로 동일한 영역을 인식하고, 표지된 (mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6) 항체와 "교차-반응하는" 또는 이와 경쟁하는 평가 항체임을 시사한다. 약 1:10 내지 약 1:100의 임의의 비의 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6:평가 항체로 Siglec 항원으로의 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6의 결합을 적어도 약 50%, 예컨대 적어도 약 60%, 또는 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 또는 90%(예컨대, 약 65% 내지 100%)만큼 감소시키는 임의의 평가 항체는 각각의 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6과 경쟁하는 항체인 것으로 간주된다. 바람직하게는, 이러한 평가 항체는 Siglec 항원으로의 각각의 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6의 결합을 적어도 약 90%(예컨대, 약 95%)만큼 감소시킬 것이다.
경쟁은 또한, 예를 들어, 유세포 측정 평가에 의해 평가될 수 있다. 이러한 평가에서, 하나 이상의 주어진 Siglec 폴리펩타이드(들)를 보유하는 세포는 먼저, 예를 들어, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6과, 이어서 형광단 또는 바이오틴으로 표지된 평가 항체와 인큐베이션될 수 있다. 항체는 포화량의 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6과의 사전 인큐베이션 시 수득되는 결합이 각각의 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6과의 사전 인큐베이션 없이 항체에 의해 수득되는 결합(형광의 평균으로 측정됨)의 약 80%, 바람직하게는 약 50%, 약 40% 이하(예컨대, 약 30%, 20% 또는 10%)인 경우, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6과 경쟁하는 것으로 언급된다. 대안적으로, 항체는 포화량의 평가 항체와 사전 인큐베이션된 세포 상에서 각각의 표지된 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6 항체(형광단 또는 바이오틴에 의해)로 수득되는 결합이 평가 항체와의 사전 인큐베이션 없이 수득된 결합의 약 80%, 바람직하게는 약 50%, 약 40% 이하(예컨대, 약 30%, 20% 또는 10%)인 경우, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6과 경쟁하는 것으로 언급된다.
평가 항체가 사전-흡착되고 Siglec 항원이 고정되는 표면으로 포화 농도로 적용되는 단순 경쟁 검정이 또한 채택될 수 있다. 단순 경쟁 검정에서의 표면은 바람직하게는 BIACORE 칩(또는 표면 플라즈몬 공명 분석에 적합한 다른 매체)이다. 이어서 대조군 항체(예컨대, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6)가 Siglec-포화 농도로 표면과 접촉되고 Siglec 및 대조군 항체의 표면 결합이 측정된다. 대조군 항체의 상기 결합은 평가 항체의 부재 하에 Siglec-함유 표면으로의 대조군 항체의 결합과 비교된다. 평가 검정에서, 평가 항체의 존재 하에 대조군 항체에 의한 Siglec-함유 표면 결합에서의 유의미한 감소는 평가 항체가 결합에 대해 경쟁하며 이에 따라 평가 항체가 대조군 항체와 "교차-반응"하도록 Siglec 상에서 대조군 항체와 동일한 영역을 인식할 수 있음을 시사한다. Siglec 항원으로의 대조군(such as mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6) 항체의 결합을 적어도 약 30% 이상, 바람직하게는 약 40%만큼 감소시키는 임의의 평가 항체는 대조군(예컨대, 각각의 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6)으로서 Siglec으로의 결합에 대해 경쟁하는 항체인 것으로 간주될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 평가 항체는 Siglec 항원으로의 대조군 항체(예컨대, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6)의 결합을 적어도 약 50%(예컨대, 적어도 약 60%, 적어도 약 70% 이상)만큼 감소시킬 것이다. 대조군 및 평가 항체의 순서가 역전될 수 있음이 이해될 것이다: 즉, 대조군 항체가 먼저 표면에 결합될 수 있고 평가 항체가 이후 경쟁 검정에서 표면과 접촉된다. 바람직하게는, 제2 항체(항체가 교차-반응한다고 가정하면)에 대해 나타난 결합에서의 감소가 더 큰 크기일 것으로 예상될 것이므로, Siglec 항원에 대해 더 높은 친화도를 갖는 항체가 표면에 먼저 결합된다. 이러한 검정의 추가예는, 예컨대, 문헌[Saunal (1995) J. Immunol. Methods 183: 33-41]에서 제공되며, 그 개시가 본원에 참조로 포함된다.
항체가 에피토프 영역 내에 결합하는지 여부의 결정은 당업자에게 공지된 방식으로 수행될 수 있다. 이러한 맵핑/특성규명 방법의 일례로서, 항-Siglec 항체에 대한 에피토프 영역은 Siglec 단백질에서 노출된 아민/카복실의 화학적 변경을 이용하는 에피토프 "풋-프린팅"에 의해 결정될 수 있다. 이러한 풋-프린팅 기법의 하나의 구체예는 HXMS(질량 분광측정에 의해 검출되는 수소-중수소 교환)의 이용이며, 여기서 수용체 및 리간드 단백질 아미드 양성자의 수소/중수소 교환, 결합, 및 역 교환이 일어나며, 단백질 결합에 참여하는 골격 아미드기는 역 교환으로부터 보호되고, 이에 따라 중수소화된 채 유지될 것이다. 관련 영역은 이 지점에서 펩타이드 단백분해, 신속 마이크로보어 고성능 액체 크로마토그래피 분리, 및/또는 전기분무 이온화 질량 분광측정에 의해 확인될 수 있다. 예컨대, 문헌[Ehring H, Analytical Biochemistry, Vol. 267 (2) pp. 252-259 (1999) Engen, J. R. and Smith, D. L. (2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A]을 참고한다. 적합한 에피토프 확인 기법의 또 다른 예에는 핵 자기 공명 에피토프 맵핑(NMR)이며, 여기서 전형적으로 자유 항원 및 항원 결합 펩타이드, 예컨대 항체와 복합체를 이룬 항원의 2차원 NMR 스펙트럼에서의 신호 위치가 비교된다. 항원은 전형적으로 항원에 대응하는 신호만 NMR-스펙트럼에서 나타나고 항원 결합 펩타이드로부터의 신호는 나타나지 않도록 15N으로 선택적으로 동위원소 표지된다. 항원 결합 펩타이드와의 상호작용에 관여되는 아미노산으로부터 유래되는 항원 신호는 전형적으로 자유 항원의 스펙트럼에 비해 복합체의 스펙트럼에서 위치를 이동할 것이며, 결합에 관여되는 아미노산은 그러한 방식으로 확인될 수 있다. 예컨대, 문헌[Ernst Schering Res Found Workshop. 2004; (44): 149-67; Huang et al., Journal of Molecular Biology, Vol. 281 (1) pp. 61-67 (1998); 및 Saito and Patterson, Methods. 1996 Jun; 9 (3): 516-24]을 참고한다.
에피토프 맵핑/특성규명은 또한 질량 분광측정 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예컨대, 문헌[Downard, J Mass Spectrom. 2000 Apr; 35 (4): 493-503 및 Kiselar and Downard, Anal Chem. 1999 May 1; 71 (9): 1792-1801]을 참고한다. 프로테아제 소화 기법도 에피토프 맵핑 및 확인의 맥락에서 유용할 수 있다. 항원 결정기-관련 영역/서열은 프로테아제 소화에 의해, 예컨대 트립신을 Siglec에 대해 약 1:50 비로 이용하여 또는 pH 7~8에서 o/n 소화에 의해, 이어서 펩타이드 확인을 위한 질량 분광측정(MS) 분석에 의해 결정될 수 있다. 항-Siglec 결합제에 의한 트립신 절단으로부터 보호되는 펩타이드는 이후 트립신 소화를 거친 샘플 및 항체와 인큐베이션된 후, 예컨대 트립신에 의한 소화를 거친 샘플의 비교에 의해(이에 따라 결합제의 풋프린트를 드러내어) 확인될 수 있다. 다른 효소, 예컨대 키모트립신, 펩신 등이 또한 또는 대안적으로 유사한 에피토프 특성규명 방법에서 이용될 수 있다. 또한, 효소 소화는 잠재적 항원 결정기 서열이 표면 노출되지 않은 Siglec 폴리펩타이드 영역 내에 있는지 여부, 그리고 이에 따라 면역원성/항원성 측면에서 가장 무관할 수 있음을 분석하기 위한 빠른 방법을 제공할 수 있다.
부위-지정 돌연변이화는 결합 에피토프의 규명에 유용한 또 다른 기법이다. 예를 들어, "알라닌-스캐닝"에서, 단백질 절편 내의 각각의 잔기가 알라닌 잔기로 대체되고, 결합 친화도에 대한 결과가 측정된다. 돌연변이가 결합 친화도의 상당한 감소를 야기하는 경우, 이는 결합에 관여될 가능성이 크다. 구조 에피토프에 특이적인 모노클로날 항체(즉, 폴딩되지 않은 단백질에 결합하지 않는 항체)는 알라닌-대체가 단백질의 전반적 폴딩에 영향을 미치지 않음을 확인하기 위해 이용될 수 있다. 예컨대, 문헌[Clackson and Wells, Science 1995; 267:383-386; 및 Wells, Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93:1-6]을 참고한다.
전자 현미경이 또한 에피토프 "풋-프린팅"을 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Wang et al., Nature 1992; 355:275-278]에서는 원상태 동부 모자이크 바이러스의 캡시드 표면 상에서 Fab-단편의 물리적 풋프린트를 결정하기 위해 냉동전자 현미경, 3차원 이미지 재구성, 및 X-선 결정측정의 통합 적용을 이용하였다.
에피토프 평가를 위한 다른 형태의 "표지-비함유" 검정에는 표면 플라즈몬 공명(SPR, BIACORE) 및 반사계측 간섭 분광측정(RifS)이 포함된다. 예컨대, 문헌[F
Figure pct00003
gerstam et al., Journal Of Molecular Recognition 1990;3:208-14; Nice et al., J. Chromatogr. 1993; 646:159-168; Leipert et al., Angew. Chem. Int. Ed. 1998; 37:3308-3311; Kr
Figure pct00004
ger et al., Biosensors and Bioelectronics 2002; 17:937-944]를 참고한다.
본 발명의 항체와 동일하거나 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 본원에 기재되는 하나 이상의 예시적인 경쟁 검정에서 확인될 수 있음이 또한 주지되어야 한다.
교차-차단 검정은 또한 평가 항체가 인간 Siglec(예컨대, Siglec-7 및/또는 Siglec-9)에 대한 천연 또는 비-천연 시알산 리간드의 결합에 영향을 미치는지 여부를 평가하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 인간화 항-Siglec 항체 조제물이 시알산과의 Siglec-7 상호작용을 감소시키거나 차단하는지 여부를 결정하기 위해, 다음 평가가 수행될 수 있다: 용량-범위의 항-인간 Siglec-9 Fab가 고정된 용량의 인간 Siglec-Fc(예컨대, Siglec-7 Fc 및/또는 Siglec-9 Fc)와 실온에서 30분 공동-인큐베이션된 후, 1 h 동안 시알산 리간드 발현 세포주 상에 첨가된다. 세포를 염색 완충액 중에서 2회 세척 후, 염색 완충액 중 희석된 PE-커플링된 염소 항-마우스 IgG Fc 단편 2차 항체가 세포에 첨가되고, 플레이트는 4℃에서 추가 30분 동안 인큐베이션된다. 세포는 2회 세척되고 HTFC 플레이트 판독기가 장착된 Accury C6 유세포 측정기 상에서 분석된다. 평가 항체의 부재 하에, Siglec-Fc는 세포에 결합한다. 시알산으로의 Siglec-결합을 차단하는 Siglec-Fc(예컨대, Siglec-7 Fc 및/또는 Siglec-9 Fc)와 사전-인큐베이션된 항체 조제물의 존재 하에, 세포로의 Siglec-Fc의 결합은 감소된다. 그러나, 시알산 리간드-발현 표적 세포에 대한 NK 세포 용해 활성의 재구성은 Siglec-시알산 리간드 상호작용의 차단을 평가할 필요 없이 직접 평가될 수 있음이 이해될 것이다.
선택적으로, 본 개시의 항체는 임의의 하나 이상의 항체 E10-286(BD Biosciences Corp.), 유럽 특허 1238282B1에 개시된 QA79(Moretta et al., Universita degli Studi di Genova), 또는 문헌[Falco et al. (1999) J. Exp. Med. 190:793-801]에서 언급된 Z176, 또는 예컨대, 전체적으로 또는 부분적으로 항원 결합 영역 또는 중쇄 및/또는 경쇄 CDR을 포함하는, 상기 항체의 유도체가 아닌 항체로 특정될 수 있다. 선택적으로, 본 개시의 항체는 2015년 9월 9일에 출원된 PCT 출원 번호 PCT/EP2015/070550(Innate Pharma)에 개시된 임의의 하나 이상의 항체 3A11, 1H9 및 2B4가 아닌 항체로 특정될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 언급된 항체는, 항체의 성질에 따라, 본 개시의 항체의 특징을 갖도록 변경될 수 있다.
인간 Siglec-9의 세포외 도메인, 예컨대, N-말단 V-세트 도메인 또는 Ig-유사 C2-유형 도메인 1 또는 2에 결합하는 항체, 예를 들어 본원에서 실시예에 나타내는 에피토프에 결합하는 항체가 본원에서 제공된다.
하나의 양태에서, 항체는 항체 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 또는 mAb-F와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합한다. 하나의 구현예에서, 항체는 항체 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 또는 mAb-F에 의해 결합되는 에피토프와 적어도 부분적으로 중첩되거나 그 안에, 적어도 하나의 잔기를 포함하는 Siglec-9 및/또는 Siglec-7의 에피토프에 결합한다. 항체에 의해 결합되는 잔기는 Siglec-9 및/또는 Siglec-7 폴리펩타이드의 표면, 예컨대 세포 표면 상에서 발현되는 Siglec-9 또는 Siglec-7 폴리펩타이드에 존재하는 것으로 특정될 수 있다. 항체에 의해 결합된 Siglec-9 및/또는 Siglec-7 상의 아미노산 잔기는, 예를 들어 표 3에 기재된 잔기로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
Siglec-9 돌연변이체로 전달감염된 세포에 대한 항-Siglec 항체의 결합이 측정되어 야생형 Siglec-9 폴리펩타이드(예컨대, SEQ ID NO: 2)에 결합하는 항-Siglec 항체의 능력과 비교될 수 있다. Siglec-7에 추가적으로 결합하는 항체에 있어서, 항-Siglec 항체의 결합은 추가적으로 또는 대안적으로 Siglec-7 돌연변이체(예컨대 표 3)로 전달감염된 세포를 이용하여 수행되고 야생형 Siglec-7 폴리펩타이드(예컨대, SEQ ID NO: 1)에 결합하는 항-Siglec 항체의 능력과 비교될 수 있다. 항-Siglec 항체 및 돌연변이체 Siglec-9 및/또는 Siglec-7 폴리펩타이드(예컨대, 표 3의 돌연변이체 Siglec-9 또는 Siglec-7) 간 결합의 감소는 결합 친화도 감소(예컨대, 공지된 방법, 예컨대 특정 돌연변이체를 발현하는 세포의 FACS 평가에 의해 또는 돌연변이체 폴리펩타이드에 대한 결합의 Biacore™(SPR) 평가에 의해 측정됨) 및/또는 항-Siglec 항체의 총 결합능 감소(예컨대, 항-Siglec 항체 농도 대 폴리펩타이드 농도의 그래프에서 Bmax 감소로 입증됨)가 있음을 의미한다. 결합의 유의미한 감소는 돌연변이된 잔기가 항-Siglec 항체로의 결합에 직접 관여되거나 항-Siglec 항체가 Siglec-9에 결합되는 경우 결합 단백질에 매우 인접해 있음을 시사한다.
일부 구현예에서, 결합의 유의미한 감소는 항-Siglec 항체 및 돌연변이체 Siglec-9 폴리펩타이드 간 결합 친화도 및/또는 결합능이 항체 및 야생형 Siglec-9 폴리펩타이드 간 결합에 비해 40% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과만큼 감소됨을 의미한다. 소정 구현예에서, 결합은 검출 한계 미만으로 감소된다. 일부 구현예에서, 결합의 유의미한 감소는 돌연변이체 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 항-Siglec 항체의 결합이 항-Siglec 항체 및 야생형 Siglec-9 폴리펩타이드 간 관찰되는 결합의 50% 미만(예컨대, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% 또는 10% 미만)인 경우 입증된다.
일부 구현예에서, 항체 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 또는 mAb-F에 의해 결합된 아미노산 잔기를 포함하는 절편 내 잔기가 상이한 아미노산으로 치환되는 돌연변이체 Siglec-9 및/또는 Siglec-7 폴리펩타이드에 대해 유의미하게 더 낮은 결합을 나타내는 항-Siglec 항체가 제공된다. 하나의 구현예에서, 돌연변이체는 야생형 Siglec 폴리펩타이드(예컨대 SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 폴리펩타이드)에 대한 결합에 비해, 표 3의 돌연변이체 M6, M7, M8, M9, M10, M11, M14, M15 및 M16으로부터 선택되는 돌연변이체이다. 하나의 구현예에서, 돌연변이체는 야생형 Siglec-7 폴리펩타이드(예컨대 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드)에 대한 결합에 비해, 표 3의 돌연변이체 M6, M7, M8, M9, M10, M11, M14, M15 및 M16으로부터 선택되는 돌연변이체이다.
하나의 구현예에서, 항-Siglec 항체는, Fab' 단편으로서 시험되는 경우, SEQ ID NO: 2의 야생형 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합에 비해, 표 3의 돌연변이체 Siglec-9 폴리펩타이드 M7 및 M6 각각에 대해 유의미하게 더 낮은 결합을 나타낸다.
하나의 구현예에서, 항-Siglec 항체는, Fab' 단편으로서 시험되는 경우, SEQ ID NO: 2의 야생형 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합에 비해, 표 3의 돌연변이체 Siglec-9 폴리펩타이드 M7, M9, M10 및 M11 각각에 대해 유의미하게 더 낮은 결합을 나타낸다.
하나의 구현예에서, 항-Siglec 항체는, Fab' 단편으로서 시험되는 경우, SEQ ID NO: 2의 야생형 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합에 비해, 표 3의 돌연변이체 Siglec-9 폴리펩타이드 M8, M9, M10 및 M11 각각에 대해 유의미하게 더 낮은 결합을 나타낸다.
하나의 구현예에서, 항-Siglec 항체는, Fab' 단편으로서 시험되는 경우, SEQ ID NO: 2의 야생형 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합에 비해, 표 3의 돌연변이체 Siglec-9 폴리펩타이드 M16 및 M14 각각에 대해 유의미하게 더 낮은 결합을 나타낸다.
하나의 구현예에서, 항-Siglec 항체는, Fab' 단편으로서 시험되는 경우, SEQ ID NO: 2의 야생형 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합에 비해, 표 3의 돌연변이체 Siglec-9 폴리펩타이드 M16 및 M8 각각에 대해 유의미하게 더 낮은 결합을 나타낸다.
하나의 구현예에서, 항-Siglec 항체는, Fab' 단편으로서 시험되는 경우, SEQ ID NO: 2의 야생형 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합에 비해, 표 3의 돌연변이체 Siglec-9 폴리펩타이드 M16, M15 및 M8 각각에 대해 유의미하게 더 낮은 결합을 나타낸다.
하나의 구현예에서, 항-Siglec 항체는, Fab' 단편으로서 시험되는 경우, SEQ ID NO: 2의 야생형 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합에 비해, 표 3의 돌연변이체 Siglec-9 폴리펩타이드 M16, M15, M14 및 M8 각각에 대해 유의미하게 더 낮은 결합을 나타낸다.
하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 N78, P79, A80, R81, A82 및/또는 V83(SEQ ID NO: 2 참조)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개를 포함하는 인간 Siglec-9 상의 에피토프에 결합한다.
하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 N77, D96, H98 및/또는 T99(SEQ ID NO: 2 참조)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기 중 1개, 2개, 3개 또는 4개를 포함하는 인간 Siglec-9 상의 에피토프에 결합한다.
하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 W84, E85, E86 및/또는 R88(SEQ ID NO: 2 참조)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기 중 1개, 2개, 3개 또는 4개를 포함하는 인간 Siglec-9 상의 에피토프에 결합한다.
하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 S47, H48, G49, W50, I51, Y52, P53 및/또는 G54(SEQ ID NO: 2 참조)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개를 포함하는 인간 Siglec-9 상의 에피토프에 결합한다.
하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 잔기 K131 및/또는 H132(SEQ ID NO: 2 참조) 중 1개 또는 2개를 포함하는 인간 Siglec-9 상의 에피토프에 결합한다.
하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 잔기 R120, W128 및/또는 N129A(SEQ ID NO: 2 참조) 중 1개 또는 2개를 포함하는 인간 Siglec-9 상의 에피토프에 결합한다.
하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 잔기 S27, R116, H133 및/또는 R134(SEQ ID NO: 2 참조) 중 1개 또는 2개를 포함하는 인간 Siglec-9 상의 에피토프에 결합한다.
하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 R63, A66, N67, T68, D69, Q70 및/또는 D71(SEQ ID NO: 2 참조)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개를 포함하는 인간 Siglec-9 상의 에피토프에 결합한다.
하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 P55, H58, E122, G124, S125 및/또는 K127(SEQ ID NO: 2 참조)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개를 포함하는 인간 Siglec-9 상의 에피토프에 결합한다.
하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 N82, P83, A84, R85, A86 및/또는 V87(SEQ ID NO: 1 참조)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개를 포함하는 인간 Siglec-7 상의 에피토프에 결합한다.
하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 N81, D100, H102 및/또는 T103(SEQ ID NO: 1 참조)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기 중 1개, 2개, 3개 또는 4개를 포함하는 인간 Siglec-7 상의 에피토프에 결합한다.
하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 W88, E89, E90, R92(SEQ ID NO: 1 참조)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기 중 1개, 2개, 3개 또는 4개를 포함하는 인간 Siglec-7 상의 에피토프에 결합한다.
일단 Siglec에 대해 요망되는 결합을 갖는 항원-결합 화합물이 수득되면, 이는 Siglec(예컨대, Siglec-7 및/또는 Siglec-9)을 억제하는 그 능력에 대해 평가될 수 있다. 예를 들어, 항-Siglec 항체가 시알산 리간드(예컨대 세포 상에 존재하는)에 의해 유도되는 Siglec 활성화를 감소시키거나 차단하는 경우, 이는 Siglec-제한 림프구의 세포독성을 증강시킬 수 있다. 이는 그 예가 후술되는, 전형적인 세포독성 검정에 의해 평가될 수 있다.
항체가 Siglec-매개 신호전달을 감소시키는 능력은, 예컨대, Siglec-7 또는 Siglec-9를 발현하는 NK 세포, 및 각각의 Siglec의 시알산 리간드를 발현하는 표적 세포를 이용하여 표준 4시간 시험관내 세포독성 검정에서 평가될 수 있다. 이러한 NK 세포는 Siglec-7 또는 Siglec-9가 시알산 리간드를 인식하여 림프구-매개 세포용해를 방지하는 억제성 신호전달의 개시 및 전파를 야기하므로, 시알산 리간드를 발현하는 표적을 효율적으로 사멸시키지 않는다. 이러한 검정은 본원에서 실시예, 예컨대 실시예 8에서의 방법에 따라, 이용 전에 37℃에서 하룻밤 인큐베이션된, 공여체로부터 정제된 신선 NK 세포로서 일차 NK 세포를 이용하여 수행될 수 있다. 이러한 시험관내 세포독성 검정은, 예를 들어 문헌[Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)]에 기재된 바와 같이, 당분야에 널리 공지된 표준 방법에 의해 수행될 수 있다. 표적 세포는 NK 세포의 첨가 전에 51Cr로 표지된 후, 사멸의 결과로서 세포로부터 배지로의 51Cr의 방출에 비례하는 것으로 사멸이 산정된다. Siglec-7 및/또는 Siglec-9의 시알산 리간드로의 결합을 방지하는 항체의 첨가는 Siglec을 통한 억제성 신호전달의 개시 및 전파를 방지한다. 따라서, 이러한 제제의 첨가는 표적 세포의 림프구-매개 사멸을 증가시킨다. 이에 따라 상기 단계는, 예컨대 리간드 결합의 차단에 의한 Siglec-7 또는 Siglec-9-유도 음성 신호전달을 방지하는 제제를 확인시켜준다. 특정 51Cr-방출 세포독성 검정에서, Siglec-7 또는 Siglec-9-발현 NK 효과기-세포는 시알산 리간드-음성 표적 세포(예컨대, 시알리다제로 처리된 세포)를 사멸시킬 수 있지만, 시알산 리간드-발현 대조군 세포는 덜 사멸시킨다. 따라서, NK 효과기 세포는 특정 Siglec을 통한 시알산-유도 억제성 신호전달로 인해 시알산 리간드 양성 세포를 덜 효율적으로 사멸시킨다. NK 세포가 이러한 51Cr-방출 세포독성 검정에서 차단 항-Siglec 항체와 사전-인큐베이션되는 경우, 시알산 리간드-발현 세포는 항체-농도-의존적 방식으로 더 효율적으로 사멸된다. 검정은 각각의 Siglec, 예컨대, Siglec-7 및 Siglec-9에 대해 별도로 수행될 수 있다.
항체의 억제 활성(즉, 세포독성 증강력)은 또한 임의의 여러 다른 방식으로, 예컨대, 그 개시가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Sivori et al., J. Exp. Med. 1997;186:1129-1136]에 기재된 바와 같은 세포내 자유 칼슘에 대한 그 효과에 의해 또는 NK 세포 세포독성 활성화 마커, 예컨대 탈과립 마커 CD107 또는 CD137 발현 상의 효과에 의해 평가될 수 있다. NK, T, 또는 NKT 세포 활성은 또한, 임의의 세포 기반 세포독성 검정을 이용하여, 예컨대, 표적 세포, 예컨대 P815, K562 세포, 또는 각각의 전체 개시가 본원에 참조로 포함되는, 문헌[Sivori et al., J. Exp. Med. 1997;186:1129-1136; Vitale et al., J. Exp. Med. 1998; 187:2065-2072; Pessino et al. J. Exp. Med. 1998;188:953-960; Neri et al. Clin. Diag. Lab. Immun. 2001;8:1131-1135; Pende et al. J. Exp. Med. 1999;190:1505-1516]에 개시되는 적절한 종양 세포를 사멸시키도록 NK 세포를 자극하는 항체의 능력을 평가하기 위해 임의의 다른 파라미터를 측정하여 평가될 수 있다.
하나의 구현예에서, 항체 조제물은 Siglec-제한 림프구 세포독성의 적어도 10% 강화, 바람직하게는 NK 세포독성의 적어도 40% 또는 50% 강화, 또는 보다 바람직하게는 NK 세포독성의 적어도 70% 강화를 야기한다.
세포독성 림프구의 활성은 또한 사이토카인-방출 검정을 이용하여 설명될 수 있고, 여기서 NK 세포는 NK 세포의 사이토카인 생산(예를 들어 IFN-y 및 TNF-α 생산)을 자극하기 위해 항체와 인큐베이션된다. 예시적인 프로토콜에서, PBMC로부터의 IFN-y 생산은 세포 표면 및 세포질내 염색 및 배양에서 4일 후 유세포 측정에 의한 분석에 의해 평가된다. 간략하게, 브레펠딘(Brefeldin) A(Sigma Aldrich)는 배양의 마지막 4시간 동안 5 ㎍/㎖의 최종 농도로 첨가된다. 이어서 세포는 투과화(IntraPrep™; Beckman Coulter) 및 PE-항-IFN-y 또는 PE-IgG1(Pharmingen)로의 염색 전에 항-CD3 및 항-CD56 mAb와 인큐베이션된다. 폴리클로날 활성화 NK 세포로부터의 GM-CSF 및 IFN-y 생산은 ELISA(GM-CSF: DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis, MN, IFN-y: OptElA set, Pharmingen)를 이용하여 상청액에서 측정된다.
항체 단편 및 유도체(달리 언급되거나 문맥 상 명확히 금지되지 않는 한, 본 출원에서 이용되는 용어 "항체" 또는 "항체들"에 의해 포괄됨)는 당분야에 공지된 기법에 의해 생산될 수 있다. "단편"은 온전한 항체의 일부, 일반적으로 항원 결합 부위 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 비제한적으로 (1) 단일쇄 Fv 분자 (2) 연관된 중쇄 모이어티를 포함하지 않고, 단 하나의 경쇄 가변 도메인을 함유하는 단일쇄 폴리펩타이드, 또는 경쇄 가변 도메인의 3개 CDR을 함유하는 이의 단편 및 (3) 연관된 경쇄 모이어티를 포함하지 않고, 단 하나의 중쇄 가변 도메인을 함유하는 단일쇄 폴리펩타이드, 또는 중쇄 가변 도메인의 3개 CDR을 함유하는 이의 단편을 포함하는, 인접한 아미노산 잔기의 하나의 비단속 서열로 구성되는 일차 구조를 갖는 폴리펩타이드인 임의의 항체 단편(본원에서 "단일쇄 항체 단편" 또는 "단일쇄 폴리펩타이드"로 언급됨); 및 항체 단편으로부터 형성되는 다중특이적(예컨대, 이중특이적) 항체가 포함된다. 특히, 나노바디, 도메인 항체, 단일 도메인 항체 또는 "dAb"가 포함된다.
소정 구현예에서, 항체 생산 하이브리도마의 DNA는, 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 동종성 비-인간 서열 대신 치환함으로써(예컨대, Morrison et al., PNAS pp. 6851 (1984)), 또는 면역글로불린 코딩 서열에 비-면역글로불린 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 공유 연결함으로써 발현 벡터 내로의 삽입 전에 변경될 수 있다. 이러한 방식으로, 원래 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체가 제조된다. 전형적으로, 이러한 비-면역글로불린 폴리펩타이드가 항체의 불변 도메인에 대해 치환된다.
선택적으로 항체는 인간화 항체이다. 항체의 "인간화" 형태는 뮤린 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 특이적인 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편(예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2, 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 대부분의 부분에 있어서, 인간화 항체는 수신체의 상보성-결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 원래 항체의 요망되는 특이성, 친화도, 및 능력을 유지하면서 원래 항체(공여체 항체)의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체되는 인간 면역글로불린(수신체 항체)이다.
일부 경우에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 대응하는 비-인간 잔기에 의해 대체될 수 있다. 또한, 인간화 항체는 수신체 항체 또는 들여오는 CDR 또는 프레임워크 서열에서 확인되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변경은 항체 성능을 추가 정련하고 최적화하도록 제조된다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나의, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 원래 항체의 영역에 대응하며 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 공통 서열의 영역이다. 인간화 항체는 최적으로는 또한, 전형적으로 인간 면역글로불린의 영역인, 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가 상세사항에 대해서는, 그 전체 개시가 본원에 참조로 포함되는, 문헌[Jones et al., Nature, 321, pp. 522 (1986); Reichmann et al, Nature, 332, pp. 323 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2, pp. 593 (1992); Verhoeyen et Science, 239, pp. 1534]; 및 U.S. 특허 제4,816,567호를 참고한다. 항체의 인간화 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다.
인간화 항체의 제조에서 이용될, 중쇄 및 경쇄 둘 다의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키기 위해 매우 중요하다. 소위 "최적-피팅" 방법에 따르면, 항체의 가변 도메인의 서열이 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 이어서 마우스 서열과 가장 가까운 인간 서열이 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크(FR)로서 승인된다(Sims et al., J. Immunol. 151, pp. 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. 196, 1987, pp. 901). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정한 하위군의 모든 인간 항체의 공통 서열로부터의 특정 프레임워크를 이용한다. 동일한 프레임워크가 몇몇 상이한 인간화 항체에 대해 이용될 수 있다(Carter et al., PNAS 89, pp. 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151, p. 2623 (1993)).
추가로 항체가 Siglec 수용체 및 다른 바람직한 생물학적 특성에 대해 고친화도를 보유하며 인간화되는 것이 중요하다. 상기 목표를 달성하기 위해, 하나의 방법에 따르면, 인간화 항체는 모체 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하여 모체 서열 및 다양한 개념적 인간화 산물의 분석 공정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델이 일반적으로 이용 가능하며, 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용 가능하다. 이러한 디스플레이의 조사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할 분석, 즉 그 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 상기 방식으로, FR 잔기가 요망되는 항체 특징, 예컨대 표적 항원(들)에 대해 증가된 친화도가 달성되도록 공통 및 들여온 서열로부터 선택되고 조합될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 대한 영향에 직접 그리고 가장 실질적으로 관여된다.
"인간화" 모노클로날 항체를 제조하는 또 다른 방법은 면역화를 위해 이용되는 마우스로서 XenoMouse(Abgenix, Fremont, CA)를 이용하는 것이다. XenoMouse는 그 면역글로불린 유전자가 기능적 인간 면역글로불린 유전자에 의해 대체된 뮤린 숙주이다. 따라서, 상기 마우스에 의해 또는 상기 마우스의 B 세포로부터 제조된 하이브리도마에서 생산되는 항체는 이미 인간화 항체이다. XenoMouse는 미국 특허 제6,162,963호에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
인간 항체는 또한 다양한 다른 기법에 따라, 예컨대, 면역화를 위해, 인간 항체 레퍼토리를 발현하도록 조작된 다른 트랜스제닉 동물을 이용함으로써(Jakobovitz et al., Nature 362 (1993) 255), 또는 파지 디스플레이 방법을 이용하는 인간 항체 레퍼토리의 선택에 의해 생산될 수 있다. 이러한 기법은 당업자에게 공지되어 있으며 본 출원에서 개시되는 모노클로날 항체에서 시작하여 구현될 수 있다.
하나의 구현예에서, 항-Siglec 항체는 인간 Fcγ 수용체, 예컨대, 임의의 하나 이상의 CD16A, CD16B, CD32A, CD32B 및/또는 CD64에 실질적인 특이적 결합을 갖지 않도록 제조될 수 있다. 이러한 항체는 Fcγ 수용체로의 결합이 없거나 낮은 것으로 알려진 다양한 중쇄의 불변 영역을 포함할 수 있다. 대안적으로, 불변 영역을 포함하지 않는(또는 그 일부를 포함하는) 항체 단편, 예컨대 F(ab')2 단편이 Fc 수용체 결합을 배제하기 위해 이용될 수 있다. Fc 수용체 결합은, 예를 들어 BIACORE 검정에서 Fc 수용체 단백질에 대한 항체의 결합 평가를 포함하는, 당분야에 공지된 방법에 따라 평가될 수 있다. 또한, 일반적으로 Fc 부분이 Fc 수용체에 대한 결합을 최소화하거나 제거하도록 변경된(예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 아미노산 치환의 도입에 의해) 임의의 항체 IgG 이소형이 이용될 수 있다(예컨대, 그 개시가 본원에 참조로 포함되는, WO 03/101485 참고). 검정, 예컨대 Fc 수용체 결합을 평가하기 위한 세포 기반 검정은 당분야에 널리 공지되어 있으며, 예컨대, WO 03/101485에 기재되어 있다.
하나의 구현예에서, 항체는 효과기 세포와 최소 상호작용을 갖는 "Fc 무증상(silent)" 항체를 생성하는 Fc 영역에서의 하나 이상의 특정 돌연변이를 포함할 수 있다. 무증상화 효과기 기능은 항체의 Fc 영역에서 돌연변이에 의해 수득될 수 있고 당분야에 기재되어 있다: N297A 돌연변이, LALA 돌연변이(Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. vol. 20(6):685-691); 및 D265A(Baudino et al., 2008, J. Immunol. 181: 6664-69), 또한 그 개시가 본원에 참조로 포함되는 Heusser 등의 WO2012/065950을 참고한다. 하나의 구현예에서, 항체는 힌지 영역에 1개, 2개, 3개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 하나의 구현예에서, 항체는 IgG1 또는 IgG2이며 잔기 233~236, 선택적으로 233~238(EU 넘버링)에 1개, 2개 또는 3개의 치환을 포함한다. 하나의 구현예에서, 항체는 IgG4이며 잔기 327, 330 및/또는 331(EU 넘버링)에 1개, 2개 또는 3개의 치환을 포함한다. 무증상 Fc lgG1 항체의 예는 lgG1 Fc 아미노산 서열에 L234A 및 L235A 돌연변이를 포함하는 LALA 돌연변이체이다. Fc 무증상 돌연변이의 또 다른 예는 예를 들어 DAPA(D265A, P329A) 돌연변이(US 6,737,056)와 같이 lgG1 항체에서 이용되는, 잔기 D265에서의, 또는 D265 및 P329에서의 돌연변이이다. 또 다른 무증상 lgG1 항체는 잔기 N297에 돌연변이(예컨대 N297A, N297S 돌연변이)를 포함하며, 이는 비글리코실화/비-글리코실화 항체를 생성한다. 다른 무증상 돌연변이에는 잔기 L234 및 G237에서의 치환(L234A/G237A); 잔기 S228, L235 및 R409에서의 치환(S228P/L235E/R409K,T,M,L); 잔기 H268, V309, A330 및 A331에서의 치환(H268Q/V309L/A330S/A331S); 잔기 C220, C226, C229 및 P238에서의 치환(C220S/C226S/C229S/P238S); 잔기 C226, C229, E233, L234 및 L235에서의 치환(C226S/C229S/E233P/L234V/L235A; 잔기 K322, L235 및 L235에서의 치환(K322A/L234A/L235A); 잔기 L234, L235 및 P331에서의 치환(L234F/L235E/P331S); 잔기 234, 235 및 297에서의 치환; 잔기 E318, K320 및 K322에서의 치환(L235E/E318A/K320A/K322A); 잔기에서의 치환(V234A, G237A, P238S); 잔기 243 및 264에서의 치환; 잔기 297 및 299에서의 치환; EU 넘버링 시스템에 의해 정의되는 잔기 233, 234, 235, 237, 및 238이 PAAAP, PAAAS 및 SAAAS로부터 선택되는 서열을 포함하도록 하는 치환(WO2011/066501 참고)이 포함된다.
하나의 구현예에서, 항체는 본 개시의 항체의 개선된 안정성을 생성하는 Fc 영역 내 하나 이상의 특정 돌연변이를 포함할 수 있고, 예컨대 여러 방향족 아미노산 잔기를 포함하고/하거나 높은 소수성을 가질 수 있다. 예를 들어, 이러한 항체는 인간 lgG1 기원의 Fc 도메인을 포함할 수 있고, Kabat 잔기(들) 234, 235, 237, 330 및/또는 331에 돌연변이를 포함할 수 있다. 이러한 Fc 도메인의 일례는 Kabat 잔기 L234, L235 및 P331에 치환을 포함한다(예컨대, L234A/L235E/P331S 또는 L234F/L235E/P331S). 이러한 Fc 도메인의 또 다른 예는 Kabat 잔기 L234, L235, G237 및 P331에 치환을 포함한다(예컨대, L234A/L235E/G237A/P331S). 이러한 Fc 도메인의 또 다른 예는 Kabat 잔기 L234, L235, G237, A330 및 P331에 치환을 포함한다(예컨대, L234A/L235E/G237A/A330S/P331S). 하나의 구현예에서, 항체는 L234X1 치환, L235X2 치환, 및 P331X3 치환을 포함하는, 선택적으로 인간 IgG1 이소형의, Fc 도메인을 포함하며, 여기서 X1은 류신 이외의 임의의 아미노산 잔기이고, X2는 류신 이외의 임의의 아미노산 잔기이고, X3은 프롤린 이외의 임의의 아미노산 잔기이고; 선택적으로 X1은 알라닌 또는 페닐알라닌 또는 이의 보존적 치환이고; 선택적으로 X2는 글루탐산 또는 이의 보존적 치환이고; 선택적으로 X3은 세린 또는 이의 보존적 치환이다. 또 다른 구현예에서, 항체는 L234X1 치환, L235X2 치환, G237X4 치환 및 P331X4 치환을 포함하는, 선택적으로 인간 IgG1 이소형의, Fc 도메인을 포함하며, 여기서 X1은 류신 이외의 임의의 아미노산 잔기이고, X2는 류신 이외의 임의의 아미노산 잔기이고, X3은 글리신 이외의 임의의 아미노산 잔기이고, X4는 프롤린 이외의 임의의 아미노산 잔기이고; 선택적으로 X1은 알라닌 또는 페닐알라닌 또는 이의 보존적 치환이고; 선택적으로 X2는 글루탐산 또는 이의 보존적 치환이고; 선택적으로, X3은 알라닌 또는 이의 보존적 치환이고; 선택적으로 X4는 세린 또는 이의 보존적 치환이다. 또 다른 구현예에서, 항체는 L234X1 치환, L235X2 치환, G237X4 치환, G330X4 치환, 및 P331X5 치환을 포함하는, 선택적으로 인간 IgG1 이소형의, Fc 도메인을 포함하며, 여기서 X1은 류신 이외의 임의의 아미노산 잔기이고, X2는 류신 이외의 임의의 아미노산 잔기이고, X3은 글리신 이외의 임의의 아미노산 잔기이고, X4는 알라닌 이외의 임의의 아미노산 잔기이고, 및 X5는 프롤린 이외의 임의의 아미노산 잔기이고; 선택적으로 X1은 알라닌 또는 페닐알라닌 또는 이의 보존적 치환이고; 선택적으로 X2는 글루탐산 또는 이의 보존적 치환이고; 선택적으로, X3은 알라닌 또는 이의 보존적 치환이고; 선택적으로, X4는 세린 또는 이의 보존적 치환이고; 선택적으로 X5는 세린 또는 이의 보존적 치환이다. 본원에서 이용되는 약칭 명명에서, 포맷은 야생형 잔기: 폴리펩타이드에서의 위치: 돌연변이체 잔기이며, 여기서 잔기 위치는 Kabat에 따른 EU 넘버링에 따라 나타낸다.
하나의 구현예에서, 항체는 아래의 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 90%, 95% 또는 99% 동일하지만 Kabat 위치 234, 235 및 331(밑줄침)의 아미노산 잔기를 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다:
Figure pct00005
하나의 구현예에서, 항체는 아래의 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 90%, 95% 또는 99% 동일하지만 Kabat 위치 234, 235 및 331(밑줄침)의 아미노산 잔기를 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다:
Figure pct00006
하나의 구현예에서, 항체는 아래의 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 90%, 95% 또는 99% 동일하지만 Kabat 위치 234, 235, 237, 330 및 331(밑줄침)의 아미노산 잔기를 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다:
Figure pct00007
하나의 구현예에서, 항체는 아래의 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 90%, 95% 또는 99% 동일하지만 Kabat 위치 234, 235, 237 및 331(밑줄침)의 아미노산 잔기를 보유하는 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다:
Figure pct00008
Fc 무증상 항체는 ADCC 활성을 생성하지 않거나 적게 생성하여, Fc 무증상 항체가 50% 미만의 특이적 세포 용해인 ADCC 활성을 나타낸다. 바람직하게는 항체에는 실질적으로 ADCC 활성이 부재하며, 예컨대, Fc 무증상 항체는 5% 미만 또는 1% 미만인 ADCC 활성(특이적 세포 용해)을 나타낸다. Fc 무증상 항체는 또한 세포(예컨대 NK 세포, T 세포, 단핵구, 수지상 세포, 대식구)의 표면에서 Siglec-9 및/또는 Siglec-7의 FcγR-매개 가교의 부재를 일으킬 수 있다.
하나의 구현예에서, 항체는 220, 226, 229, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 243, 264, 268, 297, 298, 299, 309, 310, 318, 320, 322, 327, 330, 331 및 409로 구성되는 군으로부터 선택되는 임의의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 잔기에서 중쇄 불변 영역에 치환을 갖는다(중쇄 불변 영역에서 잔기의 넘버링은 Kabat에 따른 EU 넘버링을 따른다). 하나의 구현예에서, 항체는 잔기 234, 235 및 322에 치환을 포함한다. 하나의 구현예에서, 항체는 잔기 234, 235 및 331에 치환을 포함한다. 하나의 구현예에서, 항체는 잔기 234, 235, 237 및 331에 치환을 포함한다. 하나의 구현예에서, 항체는 잔기 234, 235, 237, 330 및 331에 치환을 포함한다. 하나의 구현예에서, Fc 도메인은 인간 IgG1 서브타입의 도메인이다. 아미노산 잔기는 Kabat에 따른 EU 넘버링을 따라 나타낸다.
항체 CDR 서열
항체 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 및 mAb-F의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 표 B에 나타낸다. 특정 구현예에서, 모노클로날 항체 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 또는 mAb-F와 본질적으로 동일한 에피토프 또는 결정기에 결합하는 항체가 제공되며; 선택적으로 항체는 항체 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 또는 mAb-F의 고가변 영역을 포함한다. 본원에서 임의의 구현예에서, 항체 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 또는 mAb-F는 아미노산 서열 및/또는 이를 인코딩하는 핵산 서열을 특징으로 할 수 있다. 하나의 구현예에서, 모노클로날 항체는 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 또는 mAb-F의 VH 및/또는 VL, 또는 Fab 또는 F(ab')2 부분을 포함한다. 또한 mAb1의 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체가 제공된다. 하나의 구현예에 따르면, 모노클로날 항체는 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 또는 mAb-F의 중쇄 가변 영역의 3개 CDR을 포함한다. 또한 각각의 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 또는 mAb-F의 가변 경쇄 가변 영역, 또는 각각의 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 또는 mAb-F의 경쇄 가변 영역의 1개, 2개 또는 3개 CDR을 추가로 포함하는 모노클로날 항체가 제공된다. 선택적으로 임의의 하나 이상의 상기 경쇄 또는 중쇄 CDR은 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 삽입 또는 결실)을 함유할 수 있다. 선택적으로, 항체 mAb1의 항원 결합 영역의 일부 또는 전부를 포함하는 임의의 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역이 선택적으로 인간 불변 영역, 선택적으로 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형에 융합되고, 선택적으로는 추가로 효과기 기능(인간 Fcγ 수용체에 대한 결합)을 감소시키기 위한 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG 유형의 면역글로불린 불변 영역에 융합하는 항체가 제공된다.
또 다른 양태에서, 표 A-1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb1의 HCDR1 영역; 표 A-1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb1의 HCDR2 영역; 표 A-1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb1의 HCDR3 영역; 표 A-1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb1의 LCDR1 영역; 표 A-1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb1의 LCDR2 영역; 표 A-1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 결실되거나 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb1의 LCDR3 영역을 포함하는 항체가 제공된다.
[표 A-1]
Figure pct00009
또 다른 양태에서, 본 발명은 항체를 제공하며, 여기서 항체는 표 A-3에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb3의 HCDR1 영역; 표 A-3에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb3의 HCDR2 영역; 표 A-3에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb3의 HCDR3 영역; 표 A-3에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb3의 LCDR1 영역; 표 A-3에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb3의 LCDR2 영역; 표 A-3에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 결실되거나 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb3의 LCDR3 영역을 포함한다.
[표 A-3]
Figure pct00010
또 다른 양태에서, 본 발명은 항체를 제공하며, 여기서 항체는 표 A-4에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb4의 HCDR1 영역; 표 A-4에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb4의 HCDR2 영역; 표 A-4에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb4의 HCDR3 영역; 표 A-4에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb4의 LCDR1 영역; 표 A-4에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb4의 LCDR2 영역; 표 A-4에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 결실되거나 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb4의 LCDR3 영역을 포함한다.
[표 A-4]
Figure pct00011
또 다른 양태에서, 본 발명은 항체를 제공하며, 여기서 항체는 표 A-5에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb5의 HCDR1 영역; 표 A-5에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb5의 HCDR2 영역; 표 A-5에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb5의 HCDR3 영역; 표 A-5에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb5의 LCDR1 영역; 표 A-5에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb5의 LCDR2 영역; 표 A-5에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 결실되거나 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb5의 LCDR3 영역을 포함한다.
[표 A-5]
Figure pct00012
또 다른 양태에서, 본 발명은 항체를 제공하며, 여기서 항체는 표 A-7에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbA의 HCDR1 영역; 표 A-7에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbA의 HCDR2 영역; 표 A-7에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbA의 HCDR3 영역; 표 A-7에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbA의 LCDR1 영역; 표 A-7에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbA의 LCDR2 영역; 표 A-7에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 결실되거나 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbA의 LCDR3 영역을 포함한다.
[표 A-7]
Figure pct00013
또 다른 양태에서, 본 발명은 항체를 제공하며, 여기서 항체는 표 A-8에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있고, 선택적으로 HCDR1이 아미노산 서열 SYWIH (SEQ ID NO: 198)를 포함하는 mAbB의 HCDR1 영역; 표 A-8에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있고, 선택적으로 HCDR2가 아미노산 서열 EINPSNGHTNYAEKFKT (SEQ ID NO: 199)를 포함하는 mAbB의 HCDR2 영역; 표 A-8에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbB의 HCDR3 영역; 표 A-8에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있고, 선택적으로 LCDR1이 아미노산 서열 QASQDINNYLN (SEQ ID NO: 200)를 포함하는 mAbB의 LCDR1 영역; 표 A-8에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbB의 LCDR2 영역; 표 A-8에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 결실되거나 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbB의 LCDR3 영역을 포함한다.
[표 A-8]
Figure pct00014
또 다른 양태에서, 본 발명은 항체를 제공하며, 여기서 항체는 표 A-9에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbC의 HCDR1 영역; 표 A-9에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbC의 HCDR2 영역; 표 A-9에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbC의 HCDR3 영역; 표 A-9에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbC의 LCDR1 영역; 표 A-9에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbC의 LCDR2 영역; 표 A-9에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 결실되거나 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbC의 LCDR3 영역을 포함한다.
[표 A-9]
Figure pct00015
또 다른 양태에서, 본 발명은 항체를 제공하며, 여기서 항체는 표 A-10에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbD의 HCDR1 영역; 표 A-10에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbD의 HCDR2 영역; 표 A-10에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbD의 HCDR3 영역; 표 A-10에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbD의 LCDR1 영역; 표 A-10에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbD의 LCDR2 영역; 표 A-10에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 결실되거나 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbD의 LCDR3 영역을 포함한다.
[표 A-10]
Figure pct00016
또 다른 양태에서, 본 발명은 항체를 제공하며, 여기서 항체는 표 A-11에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbE의 HCDR1 영역; 표 A-11에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbE의 HCDR2 영역; 표 A-11에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbE의 HCDR3 영역; 표 A-11에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbE의 LCDR1 영역; 표 A-11에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbE의 LCDR2 영역; 표 A-11에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 결실되거나 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbE의 LCDR3 영역을 포함한다.
[표 A-11]
Figure pct00017
또 다른 양태에서, 본 발명은 항체를 제공하며, 여기서 항체는 표 A-12에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbF의 HCDR1 영역; 표 A-12에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbF의 HCDR2 영역; 표 A-12에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbF의 HCDR3 영역; 표 A-12에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbF의 LCDR1 영역; 표 A-12에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbF의 LCDR2 영역; 표 A-12에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 결실되거나 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbF의 LCDR3 영역을 포함한다.
[표 A-12]
Figure pct00018
본원에서 임의의 구현예의 또 다른 양태에서, 임의의 HCDR1, HCDR2, HCDR3 및 LCDR1, LCDR2, LCDR3 서열은 선택적으로 모두(또는 각각, 독립적으로) Kabat 넘버링 시스템의 것들(각각의 CDR에 대해 표 A-1 내지 A-12에 나타냄), Chotia 넘버링 시스템의 것들(각각의 CDR에 대해 표 A-1 내지 A-12에 나타냄), IMGT 넘버링 시스템의 것들(각각의 CDR에 대해 표 A-1 내지 A-12에 나타냄), 또는 임의의 다른 적합한 넘버링 시스템의 것들로 특정될 수 있다.
본원에서 임의의 구현예의 또 다른 양태에서, mAbA, mAbB, mAbC, mAbD, mAbE, mAbF, mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5 또는 mAb6의 중쇄 및 경쇄의 임의의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열, 및/또는 대응하는 SEQ ID NO에 기재된 특정 CDR 또는 CDR 세트와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 임의의 항체, 예컨대, mAbA, mAbB, mAbC, mAbD, mAbE, mAbF, mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5 또는 mAb6에서, 특정된 가변 영역 및 CDR 서열은 서열 변경, 예컨대, 치환(1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 이상의 서열 변경)을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 중쇄 및 경쇄의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3은 1개, 2개, 3개 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 치환된 잔기는 인간 기원의 서열에 존재하는 잔기이다. 하나의 구현예에서 치환은 보존적 변경이다. 보존적 서열 변경은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특징에 유의미하게 영향을 미치거나 이를 변형하지 않는 아미노산 변경을 나타낸다. 이러한 보존적 변경에는 아미노산 치환, 부가 및 결실이 포함된다. 변경은 당분야에 공지된 표준 기법, 예컨대 부위-지정 돌연변이화 및 PCR-매개 돌연변이화에 의해 본 발명의 항체 내로 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 전형적으로 아미노산 잔기가 유사한 물리화학적 특성을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것들이다. 특정된 가변 영역 및 CDR 서열은 1개, 2개, 3개, 4개 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 치환이 수행되는 경우, 바람직한 치환은 보존적 변경일 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리가 당분야에 정의되었다. 이들 패밀리에는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 미하전 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 무극성 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분기화 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이 포함된다. 따라서, 본 발명의 항체의 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고 변형된 항체는 본원에 기재되는 검정을 이용하여 보유된 기능(즉, 본원에 나타낸 특성)에 대해 평가될 수 있다.
IMGT, Kabat 및 Chothia 정의 시스템에 따른 CDR의 서열을 표 A-1 내지 A-12에 요약한다. 본 발명에 따른 항체의 가변 영역의 서열을 아래의 표 B에 기재한다. 본원에서 임의의 구현예에서, VL 또는 VH 서열은 신호 펩타이드 또는 이의 임의의 부분을 추가로 포함하거나 이것이 없도록 특정되거나 넘버링될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 이의 결합 및/또는 기능적 특성을 보유하는 항체 단편이다.
[표 B]
Figure pct00019
Figure pct00020
mAbA의 인간화 변이체의 예는 하기의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 조합을 갖는 항체를 포함한다 (표 C 및 실시예 2에 제시됨) : mAbA H0L0, mAbA H0L1, mAbA H0L2, mAbA H1L0, mAbA H1L1, mAbA H1L2 mAbA H2L0, mAbA H2L1, mAbA H2L2, mAbA H3L0, mAbA H3L1, 또는 mAbA H3L2.
임의의 양태에서, 항체 또는 항원 결합 도메인은 VH 및 VL을 포함할 수 있고, 여기서 VH 및 VL 각각은 하기 항체 중 임의의 하나의 각각의 VH 및 VL과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 일치하는 아미노산 서열을 포함한다: mAbA H0L0, mAbA H0L1, mAbA H0L2, mAbA H1L0, mAbA H1L1, mAbA H1L2 mAbA H2L0, mAbA H2L1, mAbA H2L2, mAbA H3L0, mAbA H3L1, 또는 mAbA H3L2.
mAbB의 인간화 변이체의 예는 하기의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 조합을 갖는 항체를 포함한다 (표 C 및 실시예 2에 제시됨) : mAbB H0L0, mAbB H0L1, mAbB H0L2, mAbB H1L0, mAbB H1L1, mAbB H1L2, mAbB H2L0, mAbB H2L1, mAbB H2L2, mAbB H3L0, mAbB H3L1, mAbB H3L2, mAbB H4L0, mAbB H4L1, mAbB H4L2, mAbB H5L0, mAbB H5L1 또는 mAbB H5L2.
임의의 양태에서, 항체 또는 항원 결합 도메인은 VH 및 VL을 포함할 수 있고, 여기서 VH 및 VL 각각은 하기 항체 중 임의의 하나의 각각의 VH 및 VL과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 일치하는 아미노산 서열을 포함한다: mAbB H0L0, mAbB H0L1, mAbB H0L2, mAbB H1L0, mAbB H1L1, mAbB H1L2, mAbB H2L0, mAbB H2L1, mAbB H2L2, mAbB H3L0, mAbB H3L1, mAbB H3L2, mAbB H4L0, mAbB H4L1, mAbB H4L2, mAbB H5L0, mAbB H5L1 또는 mAbB H5L2.
mAbC의 인간화 변이체의 예는 하기의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 조합을 갖는 항체를 포함한다 (표 C 및 실시예 2에 제시됨) : mAbC H0L0, mAbC H0L1, mAbC H1L0, mAbC H1L1, mAbC H2L0, mAbC H2L1 mAbC H3L0 또는 mAbC H3L1.
임의의 양태에서, 항체 또는 항원 결합 도메인은 VH 및 VL을 포함할 수 있고, 여기서 VH 및 VL 각각은 하기 항체 중 임의의 하나의 각각의 VH 및 VL과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 일치하는 아미노산 서열을 포함한다: mAbC H0L0, mAbC H0L1, mAbC H1L0, mAbC H1L1, mAbC H2L0, mAbC H2L1 mAbC H3L0 또는 mAbC H3L1.
mAbD의 인간화 변이체의 예는 하기의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 조합을 갖는 항체를 포함한다 (표 C 및 실시예 2에 제시됨) : mAbD H0L0, mAbD H0L1, mAbD H0L2, mAbD H1L0, mAbD H1L1, mAbD H1L2 mAbD H2L0, mAbD H2L1 또는 mAbD H2L2.
임의의 양태에서, 항체 또는 항원 결합 도메인은 VH 및 VL을 포함할 수 있고, 여기서 VH 및 VL 각각은 하기 항체 중 임의의 하나의 각각의 VH 및 VL과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 일치하는 아미노산 서열을 포함한다: mAbD H0L0, mAbD H0L1, mAbD H0L2, mAbD H1L0, mAbD H1L1, mAbD H1L2 mAbD H2L0, mAbD H2L1 또는 mAbD H2L2.
인간화 mAbA, mAbB 및 mAbD의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 본원에서 하기 표 C, 및 실시예 2에 나열된다.
표 C
Figure pct00021
Figure pct00022
mAbA, mAbB, mAbC 또는 mAbD 항체의 중쇄 가변 영역은, 각각의 항체에 대해: 인간 중쇄 FR1 프레임워크 영역; 표 A에 언급된 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산의 서열을 포함하며, 이들 아미노산 중 하나 이상은 상이한 아미노산으로 치환될 수 있는 HCDR1 영역; 인간 중쇄 FR2 프레임워크 영역; 표 A에 언급된 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산의 서열을 포함하며, 이들 아미노산 중 하나 이상은 상이한 아미노산으로 치환될 수 있는 HCDR2 영역; 인간 중쇄 FR3 프레임워크 영역; 및 표 A에 언급된 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산의 서열을 포함하며, 이들 아미노산 중 하나 이상은 상이한 아미노산으로 치환될 수 있는 HCDR3 영역을 포함할 수 있다. 선택적으로, 가변 영역은 추가로 인간 중쇄 FR4 프레임워크 영역을 포함한다.
mAbA, mAbB, mAbC 또는 mAbD 항체의 경쇄 가변 영역은, 각각의 항체에 대해: 인간 경쇄 FR1 프레임워크 영역; 표 A에 언급된 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산의 서열을 포함하며, 이들 아미노산 중 하나 이상은 상이한 아미노산으로 치환될 수 있는 LCDR1 영역; 인간 경쇄 FR2 프레임워크 영역; 표 A에 언급된 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산의 서열을 포함하며, 이들 아미노산 중 하나 이상은 상이한 아미노산으로 치환될 수 있는 LCDR2 영역; 인간 경쇄 FR3 프레임워크 영역; 및 표 A에 언급된 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 연속 아미노산의 서열을 포함하며, 이들 아미노산 중 하나 이상은 상이한 아미노산으로 치환될 수 있는 LCDR3 영역을 포함할 수 있다. 선택적으로, 가변 영역은 추가로 인간 경쇄 FR4 프레임워크 영역을 포함한다.
VH 및 VL 조합의 예는: SEQ ID NO: 15의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGHV1-69 또는 IGHV1-46 유전자 분절의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 VH, 및 SEQ ID NO: 16의 VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGKV1-33 유전자 분절의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 VL을 포함한다. 하나의 양태에서, VH는 SEQ ID NO 15의 잔기 26, 27, 74 및/또는 98의 1, 2, 3, 또는 4에서의 프레임워크 중의 치환을 포함한다. 하나의 양태에서, VL은 SEQ ID NO 16의 잔기 44 및/또는 71의 1, 2, 3, 또는 4에서의 프레임워크 중의 치환을 포함한다.
VH 및 VL 조합의 또다른 예는: SEQ ID NO: 17의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGHV1-46 및/또는 IGHV1-69 유전자 분절의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 VH, 및 SEQ ID NO: 18의 VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGKV1-33 유전자 분절의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 VL을 포함한다.
VH 및 VL 조합의 또다른 예는: SEQ ID NO: 21의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGHV7-4-1*02 유전자 분절의 FR1, FR2 및 FR3 (선택적으로 인간 IGHJ6*01 유전자 분절의 FR4와 함께)을 포함하는 VH, 및 SEQ ID NO: 22의 VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGKV1-39 유전자 분절 (예를 들어, IGKV1-39*01)의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 VL을 포함한다. 하나의 양태에서, CDR은 Kabat 넘버링에 따라 결정된다. 하나의 양태에서, VH는 SEQ ID NO: 17의 잔기 26, 27, 30 및/또는 74의 1, 2, 3, 또는 4에서의 프레임워크 중의 치환을 포함한다. 하나의 양태에서, VH는 SEQ ID NO: 17의 잔기 34, 61 및/또는 66의 1, 2, 또는 3에서의 CDR 중의 치환 VH 치환, 예를 들어, M34I 치환, N61A 치환 및/또는 T66G 치환을 포함한다.
또다른 양태에서, 인간화 mAbA 항체에 대한 VH 및 VL 조합의 예는 하기를 포함한다:
(a) mAbA H0, H1, H2 또는 H3 가변 도메인의 아미노산 서열의 (또는 이와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 일치하는) 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 mAbA L0 가변 도메인의 아미노산 서열의 (또는 이와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 일치하는) 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(b) mAbA H0, H1, H2 또는 H3 가변 도메인의 아미노산 서열의 (또는 이와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 일치하는) 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 mAbA L1 가변 도메인의 아미노산 서열의 (또는 이와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 일치하는) 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
(c) mAbA H0, H1, H2 또는 H3 가변 도메인의 아미노산 서열의 (또는 이와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 일치하는) 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 mAbA L2 가변 도메인의 아미노산 서열의 (또는 이와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 일치하는) 아미노산 서열을 포함하는 VL.
또다른 양태에서, 인간화 mAbB 항체에 대한 VH 및 VL 조합의 예는 하기를 포함한다:
(a) mAbB H0, H1, H2, H3, H4 또는 H5 가변 도메인의 아미노산 서열의 (또는 이와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 일치하는) 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 mAbB L0 가변 도메인의 아미노산 서열의 (또는 이와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 일치하는) 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(b) mAbB H0, H1, H2, H3, H4 또는 H5 가변 도메인의 아미노산 서열의 (또는 이와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 일치하는) 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 mAbB L1 가변 도메인의 아미노산 서열의 (또는 이와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 일치하는) 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
(c) mAbB H0, H1, H2, H3, H4 또는 H5 가변 도메인의 아미노산 서열의 (또는 이와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 일치하는) 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 mAbB L2 가변 도메인의 아미노산 서열의 (또는 이와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 일치하는) 아미노산 서열을 포함하는 VL.
또다른 양태에서, 인간화 mAbC 항체에 대한 VH 및 VL 조합의 예는 하기를 포함한다:
(a) mAbC H0, H1, H2 또는 H3 가변 도메인의 아미노산 서열의 (또는 이와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 일치하는) 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 mAbC L0 가변 도메인의 아미노산 서열의 (또는 이와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 일치하는) 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
(b) mAbC H0, H1, H2 또는 H3 가변 도메인의 아미노산 서열의 (또는 이와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 일치하는) 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 mAbC L1 가변 도메인의 아미노산 서열의 (또는 이와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 일치하는) 아미노산 서열을 포함하는 VL.
또다른 양태에서, 인간화 mAbD 항체에 대한 VH 및 VL 조합의 예는 하기를 포함한다:
(a) mAbD H0, H1 또는 H2 가변 도메인의 아미노산 서열의 (또는 이와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 일치하는) 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 mAbD L0 가변 도메인의 아미노산 서열의 (또는 이와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 일치하는) 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(b) mAbD H0, H1 또는 H2 가변 도메인의 아미노산 서열의 (또는 이와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 일치하는) 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 mAbD L1 가변 도메인의 아미노산 서열의 (또는 이와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 일치하는) 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
(c) mAbD H0, H1 또는 H2 가변 도메인의 아미노산 서열의 (또는 이와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 일치하는) 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 mAbD L2 가변 도메인의 아미노산 서열의 (또는 이와 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 일치하는) 아미노산 서열을 포함하는 VL.
항체 제형물
항-Siglec 항체는 1 mg/㎖ 내지 500 mg/㎖의 농도로 포함하는 약학 제형물에 포함될 수 있고, 여기서 상기 제형물은 2.0 내지 10.0의 pH를 갖는다. 제형물은 완충 시스템, 보존제(들), 등장화제(들), 킬레이트화제(들), 안정화제 및 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 약학 제형물은 수성 제형물, 즉 물을 포함하는 제형물이다. 이러한 제형물은 전형적으로 용액 또는 현탁액이다. 추가 구현예에서, 약학 제형물은 수용액이다. 용어 "수성 제형물"은 적어도 50%w/w 물을 포함하는 제형물로 정의된다. 마찬가지로, 용어 "수용액"은 적어도 50%w/w 물을 포함하는 용액으로 정의되며, 용어 "수성 현탁액"은 적어도 50%w/w 물을 포함하는 현탁액으로 정의된다.
또 다른 구현예에서, 약학 제형물은 냉동 건조 제형물이며, 이용 전에 의사 또는 환자가 용매 및/또는 희석제를 여기에 첨가한다.
또 다른 구현예에서, 약학 제형물은 임의의 사전 용해 없이 바로 이용할 수 있는 건조 제형물(예컨대, 냉동-건조되거나 분무-건조됨)이다.
추가 양태에서, 약학 제형물은 이러한 항체의 수용액 및 완충액을 포함하며, 여기서 항체는 1 mg/㎖ 이상의 농도로 존재하며, 상기 제형물은 약 2.0 내지 약 10.0의 pH를 갖는다.
또 다른 구현예에서, 제형물의 pH는 약 2.0 내지 약 10.0, 약 3.0 내지 약 9.0, 약 4.0 내지 약 8.5, 약 5.0 내지 약 8.0 및 약 5.5 내지 약 7.5로 구성된 목록으로부터 선택된 범위이다.
추가 구현예에서, 완충액은 아세트산 나트륨, 탄산 나트륨, 시트레이트, 글리실글리신, 히스티딘, 글리신, 라이신, 아르기닌, 인산 2수소 나트륨, 인산 수소 2나트륨, 인산 나트륨 및 트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄, 바이신, 트리신, 말산, 숙시네이트, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 아스파르트산 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 이들 특정한 완충액 중 각각의 하나는 본 발명의 대안적 구현예를 구성한다.
추가 구현예에서, 제형물은 약제학적으로 허용 가능한 보존제를 추가로 포함한다. 추가 구현예에서, 제형물은 등장화제를 추가로 포함한다. 추가 구현예에서, 제형물은 또한 킬레이트화제를 포함한다. 본 발명의 추가 구현예에서, 제형물은 안정화제를 추가로 포함한다. 추가 구현예에서, 제형물은 계면활성제를 추가로 포함한다. 편의성을 위해, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995]을 참조한다.
다른 성분이 본 발명의 펩타이드 약학 제형물에 존재할 수 있음이 가능하다. 이러한 추가 성분에는 수화제, 유화제, 항산화제, 증량제, 등장성 개질제, 킬레이트화제, 금속 이온, 유성 비히클, 단백질(예로, 인간 혈청 알부민, 젤라틴 또는 단백질) 및 쯔비터이온(예로, 아미노산, 예컨대 베타인, 타우린, 아르기닌, 글리신, 라이신 및 히스티딘)이 포함될 수 있다. 이러한 추가 성분은, 당연히 본 발명의 약학 제형물의 전반적 안정성에 부정적 영향을 미치지 않아야 한다.
본 발명에 따른 항체를 함유하는 약학 조성물은 여러 부위에서, 예를 들어 국소 부위, 예를 들어 피부 및 점막 부위에서, 흡수를 우회하는 부위, 예를 들어 동맥 내, 정맥 내, 심장 내 투여에서 및 흡수가 관여되는 부위, 예를 들어 피부 내, 피부 하, 근육 내 또는 복부 내 투여에서 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여는 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 몇몇 투여 경로, 예를 들어, 피하, 근육내, 복강내, 정맥내, 혀, 설하, 볼, 입안, 경구, 위 및 장내, 비강, 폐, 예를 들어 세기관지 및 폐포 또는 이들의 조합을 통해, 표피, 피부, 경피, 질, 직장, 눈, 예를 들어 결막을 통해, 요관 및 비경구를 통할 수 있다.
적합한 항체 제형물은 또한 이미 개발된 다른 치료적 모노클로날 항체와의 경험을 조사하여 결정될 수 있다. 몇몇 모노클로날 항체는 임상적 상황에서 효율적인 것으로 나타났으며, 예컨대 리툭산(Rituxan)(리툭시맙(Rituximab), 허셉틴(Herceptin)(트라스투주맙(Trastuzumab)) 졸레어(Xolair)(오말리주맙(Omalizumab)), 벡사르(Bexxar)(토시투모맙(Tositumomab)), 캄파스(Campath)(알렘투주맙(Alemtuzumab)), 제바린(Zevalin), 온코림(Oncolym) 및 유사한 제형물이 본 발명의 항체와 함께 이용될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 9.0 mg/㎖ 염화 나트륨, 7.35 mg/㎖ 2수화 시트르산 나트륨, 0.7 mg/㎖ 폴리소르베이트 80 및 주이용 멸균수 중, IV 투여를 위해 제형화된 100 mg(10 mL) 또는 500 mg(50 mL) 단회-이용 바이알에서 10 mg/㎖ 농도로 공급될 수 있다. pH는 6.5로 조정된다. 또 다른 구현예에서, 항체는 약 20 mM Na-시트레이트, 약 150 mM NaCl, pH 약 6.0을 포함하는 제형물로 공급된다.
종양의 진단 및 치료
본원에 기재되는 항-Siglec 항체를 이용하는 개체, 특히 인간 환자의 치료 방법이 또한 제공된다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 인간 환자에 대한 투여를 위한 약학 조성물의 제조에서 본원에 기재되는 항체의 용도를 제공한다. 전형적으로, 환자는 암 또는 감염성 질병, 예컨대, 박테리아 또는 바이러스 질병을 앓거나, 이러한 위험에 처해 있다.
예를 들어, 하나의 양태에서, 본 발명은 Siglec-7 및/또는 Siglec-9-제한 면역 세포, 예컨대, 림프구의 활성 강화를 필요로 하는 환자에서 Siglec-7 및/또는 Siglec-9-제한 면역 세포, 예컨대, 림프구의 활성 강화 방법으로서, 상기 환자에 대한 중화 항-Siglec-7 및/또는 항-Siglec-9 항체의 투여 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 항체는, 예를 들어 인간 또는 인간화 항-Siglec-7 및/또는 Siglec-9 항체일 수 있으며, 이 항체는 Siglec-7 및/또는 Siglec-9 수용체의 시알산-매개 활성화를 감소시키거나 예방한다. 하나의 구현예에서, 방법은 증가된 림프구(예컨대, NK 및/또는 CD8+ T 세포) 활성이 유익한 질병을 갖는 환자에서 이러한 림프구의 활성 증가에 대한 것이며, 이는 NK 또는 CD8+ T 세포에 의한 용해에 취약한 세포가 관여되거나, 이에 의해 영향받거나, 야기되고, 또는 불충분한 NK 또는 CD8+ T 세포 활성, 예컨대 암 또는 감염성 질병에 의해 야기하거나 이를 특징으로 한다. 예를 들어, 하나의 양태에서, 본 발명은 Siglec-7 및/또는 Siglec-9-제한 면역 세포, 예를 들어 NK 세포(예컨대 CD56bright 세포), T 세포, 단핵구, 수지상 세포, 대식구(예컨대, 면역억제성 또는 M2 대식구)의 활성(예컨대 세포 활성화, 항-종양 면역성 또는 활성, 사이토카인 생산, 증식)의 증강을 필요로 하는 환자에서 Siglec-7 및/또는 Siglec-9-제한 면역 세포, 예를 들어 NK 세포(예컨대 CD56bright 세포), T 세포, 단핵구, 수지상 세포, 대식구(예컨대, 면역억제성 또는 M2 대식구)의 활성(예컨대 세포 활성화, 항-종양 면역성 또는 활성, 사이토카인 생산, 증식)의 증강 방법으로서, 상기 환자에게 본 개시의 중화 항-Siglec-7 및/또는 항-Siglec-9 항체를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 항체는 ST3GAL6 및/또는 ST3GAL1 효소의 발현(또는, 예컨대, 고수준의 ST3GAL6 및/또는 ST3GAL1 효소 활성), 선택적으로 ST3GAL6 효소의 과발현(예컨대, 건강한 조직에서, 건강한 개체에서의 발현 대비)을 특징으로 하는 종양의 치료에서 이용된다.
보다 구체적으로, 본원에서의 방법 및 조성물은 다양한 암 및 다른 증식성 질병의 치료를 위해 이용된다. 이들 방법은 림프구 상 억제 수용체의 차단을 통해 면역 반응을 증강시켜 작동하므로, 이들은 매우 광범위한 암에 적용 가능하다. 하나의 구현예에서, 본 개시의 항-Siglec 항체로 치료받는 인간 환자는 간암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암(예컨대 HNSCC), 유방암, 폐암, 비-소세포 폐암(NSCLC), 제거 내성 전립선암(CRPC), 흑색종, 자궁암, 결장암, 직장암, 항문 영역의 암, 위암, 정소암, 자궁암, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 비-호지킨 림프종, 식도암, 소장암, 내분비계의 암, 갑상샘암, 부갑상샘암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 소아기 고형 종양, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 요관암, 신우 암종, 중추 신경계(CNS) 종양, 일차 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 척추 축 종양, 뇌 줄기 교종, 뇌하수체 샘종, 카포시 육종, 표피모양 암, 편평상피세포암, 석면증에 의해 유도된 것을 포함하는 환경 유도된 암, 혈액 종양, 예를 들어, 다발성 골수종, B-세포 림프종, 호지킨 림프종/일차 종격 B-세포 림프종, 비-호지킨 림프종, 급성 골수구 림프종, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 소포 림프종, 광범위 큰 B-세포 림프종, 버키트 림프종, 면역모구 큰 세포 림프종, 전구체 B-림프모구 림프종, 맨틀 세포 림프종, 급성 림프모구 백혈병, 균상 식육종, 무형성 큰 세포 림프종, T-세포 림프종, 및 전구체 T-림프모구 림프종, 및 상기 암의 임의의 조합을 갖는다. 본 발명은 또한 전이암의 치료에 적용 가능하다. 환자는 치료 이전, 동안 또는 이후 하나 이상의 상술되는 임상 속성에 대해 평가되거나 선택될 수 있다.
항-Siglec 항체 기반 치료는 또한 바람직하게는 바이러스, 박테리아, 원생동물, 곰팡이 또는 진균에 의한 감염에 의해 야기되는 임의의 감염을 포함하는, 감염성 질병을 치료하거나 예방하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 바이러스 감염성 유기체에는 비제한적으로 A형 간염, B형 간염, C형 간염, 독감, 바리셀라, 아데노바이러스, 단순 헤르페스 1형(HSV-1), 단순 헤르페스 2형(HSV-2), 우역, 리노바이러스, 에코바이러스, 로타바이러스, 호흡기 융합 바이러스, 유두종 바이러스, 유두종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 에키노바이러스, 아르보바이러스, 헌타바이러스, 콕사키 바이러스, 볼거리 바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 소아마비 바이러스 및 인간 면역결핍 바이러스 1형 또는 2형(HIV-1, HIV-2)이 포함된다. 박테리아는 비제한적으로 다음을 포함하는, 또 다른 바람직한 감염성 유기체 클래스를 구성한다: 스타필로코커스(Staphylococcus); 스트렙토코커스(Streptococcus), 예컨대 S. 피오게네스(pyogenes); 엔테로코커스(Enterococci); 바실러스(Bacillus), 예컨대 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 및 락토바실러스(Lactobacillus); 리스테리아(Listeria); 코리네박테리움 디프테리애(Corynebacterium diphtheriae); 가드네렐라, 예컨대 G. 바지날리스(vaginalis); 노카디아(Nocardia); 스트렙토마이세스(Streptomyces); 써모액티노마이세스 불가리스(Thermoactinomyces vulgaris); 트레포네르나(Treponerna); 캄필로박터(Camplyobacter), 슈도모나스(Pseudomonas), 예컨대 P. 애루기노사(aeruginosa); 레지오넬라(Legionella); 나이세리아(Neisseria), 예컨대 N. 고노로애(gonorrhoeae) 및 N. 메닌지티데스(meningitides); 플라보박테리움, 예컨대 F. 메닌고셉티쿰(meningosepticum) 및 F. 오도라턴(odoraturn); 브루셀라(Brucella); 보르데텔라(Bordetella), 예컨대 B. 퍼투시스(pertussis) 및 B. 브론키셉티카(bronchiseptica); 에스체리키아(Escherichia), 예컨대 E. 콜라이(coli), 클렙시엘라(Klebsiella); 엔테로박터(Enterobacter), 세라티아(Serratia), 예컨대 S. 마르센스(marcescens) 및 S. 리퀘파시엔스(liquefaciens); 에드워드시엘라(Edwardsiella); 프로테우스(Proteus), 예컨대 P. 미라빌리스(mirabilis) 및 P. 불가리스(vulgaris); 스트렙토바실러스(Streptobacillus); 리케차세애(Rickettsiaceae), 예컨대 R. 피케츠피(fickettsfi), 클라미디아(Chlamydia), 예컨대 C. 시타치(psittaci) 및 C. 트라코나티스(trachornatis); 미코박테리움(Mycobacterium), 예컨대 M. 투베르쿨로시스(tuberculosis), M. 인트라셀룰라레(intracellulare), M. 폴루이턴(folluiturn), M. 라프래(laprae), M. 애비움(avium), M. 보비스(bovis), M. 아프리카넘(africanum), M. 칸사시이(kansasii), M. 인트라셀룰라레(intracellulare), 및 M. 레프래누리움(lepraernurium); 및 노카디아(Nocardia). 원생동물에는 비제한적으로 레이슈마니아(leishmania), 콕지디오아(kokzidioa), 및 트립파노소마(trypanosoma)가 포함될 수 있다. 기생충에는 비제한적으로 클라미디아(chlamydia) 및 리케차(rickettsia)가 포함된다.
항체 조성물은 개체에 의해 발현되는 대립유전자에서 Siglec-9(SEQ ID NO: 2 참조)의 위치 100 또는 Siglec-7(SEQ ID NO: 1 참조)의 위치 104에 존재하는 잔기와 무관하게 개체를 치료하기 위해 이용될 수 있다. 위치 100에 라이신을 보유하는 Siglec-9(예컨대 SEQ ID NO: 2)는 집단의 약 49%를 나타내는 반면, 위치 100에 글루탐산을 보유하는 Siglec-9(예컨대 SEQ ID NO: 160)는 집단의 약 36%를 나타낸다. 하나의 구현예에서, 항체 조성물은 Siglec-9(SEQ ID NO: 2 참조)의 위치 100에 라이신을 갖는 개체 및 Siglec-9의 위치 100에 글루탐산을 갖는 개체를 치료하기 위해 이용된다. 하나의 구현예에서, 그 세포(예컨대 NK 세포, 호중구 등)가 Siglec-9(SEQ ID NO: 2 참조)의 위치 100에 라이신을 발현하는 개체 및 그 세포가 Siglec-9의 위치 100에 글루탐산을 발현하는 개체를 치료하기 위해 동일한 투여 요법이 이용된다. 하나의 구현예에서, 투여 요법은 개체에서 발현되는 특정 MICA 대립유전자와 무관하게, 동일한 투여 방식, 동일한 투여량 및 동일한 투여 빈도를 포함한다.
항체 조성물은 단독치료법 또는 보통 항체가 투여되는 특정 치료 목적을 위해 이용되는 제제를 포함하는 하나 이상의 다른 치료제와의 조합 치료로서 이용될 수 있다. 추가적인 치료제는 보통 전형적으로 치료받는 특정 질병 또는 병태에 대한 단독치료법에서 그 제제에 대해 이용되는 양 및 치료 요법으로 투여될 것이다. 이러한 치료제에는 비제한적으로 항암제 및 화학치료제가 포함된다.
하나의 구현예에서, 항-Siglec-9 및/또는 항-Siglec-7 중화 항체는 인간 CD16에 대한 결합이 부재하지만 CD16-발현 효과기 세포(예컨대 NK 또는 효과기 T 세포)의 활성을 강화한다. 따라서, 하나의 구현예에서, 제2 또는 추가적인 제2 치료제는, 예컨대 NK 세포에 의해 발현되는 CD16을 통해 결합되는 세포에 대해 ADCC를 유도할 수 있는 항체 또는 다른 Fc 도메인-함유 단백질이다. 전형적으로, 이러한 항체 또는 다른 단백질은 관심 항원, 예컨대 종양 세포 상에 존재하는 항원(종양 항원)에 결합하는 도메인, 및 Fc 도메인 또는 이의 일부를 포함할 것이며, 항원 결합 도메인을 통해 항원으로 및 Fc 도메인을 통해 Fcγ 수용체(예컨대 CD16)로의 결합을 나타낼 것이다. 하나의 구현예에서, 그 ADCC 활성은 적어도 부분적으로 CD16에 의해 매개될 것이다. 하나의 구현예에서, 추가적인 치료제는 원상태 또는 변경된 인간 Fc 도메인, 예를 들어 인간 IgG1 또는 IgG3 항체로부터의 Fc 도메인을 갖는 항체이다. 용어 "항체-의존적 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 당분야에서 널리 이해되는 용어이며, Fc 수용체(FcR)를 발현하는 비-특이적 세포독성 세포가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고 이어서 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개 반응을 나타낸다. ADCC를 매개하는 비-특이적 세포독성 세포에는 자연 살해(NK) 세포, 대식구, 단핵구, 호중구, 및 호산구가 포함된다. 용어 "ADCC-유도 항체"는 당업자에게 공지된 검정(들)에 의해 측정되는 ADCC를 실증하는 항체를 나타낸다. 이러한 활성은 전형적으로 Fc 영역의 다양한 FcR과의 결합을 특징으로 한다. 임의의 특정 기전에 의해 제한되지 않고, 당업자는 항체가 ADCC를 실증하는 능력이, 예를 들어, 그 서브클래스(예컨대 lgG1 또는 lgG3)에 의해, Fc 영역 내로 도입된 돌연변이에 의해, 또는 항체의 Fc 영역내 탄수화물 패턴에 대한 변경에 의해서일 수 있음을 인식할 것이다. ADCC를 유도하는 항체의 예에는 리툭시맙(림프종, CLL의 치료를 위해, 트라스투주맙(유방암의 치료를 위해), 알렘투주맙(만성 림프구 백혈병의 치료를 위해) 및 세툭시맙(결장직장암, 두부 및 경부 편평상피세포 암종의 치료를 위해)이 포함된다. ADCC-증강 항체의 예에는 비제한적으로 GA-101(저푸코실화 항-CD20), 마게툭시맙(Fc 증강 항-HER2), 메폴리주맙, MEDI-551(Fc 조작 항-CD19), 오비누투주맙(당-조작/저푸코실화 항-CD20), 오카라투주맙(Fc 조작 항-CD20), XmAb®5574/MOR208(Fc 조작 항-CD19)이 포함된다.
하나의 구현예에서, 항-Siglec-9 및/또는 항-Siglec-7 중화 항체는 특히 인간 PD-1의 억제 활성을 중화시키는 제제로의 치료에 대해 불량한 반응체인(또는 감수성이 아닌) 개체에서, 예컨대 PD-1 및 PD-L1 간 상호작용을 억제하는, 인간 PD-1의 억제 활성을 중화시키는 제제의 효능을 강화한다. 항-Siglec-9 및/또는 항-Siglec-7 중화 항체는 PD-1-발현 효과기 세포(예컨대 NK 또는 효과기 T 세포, 예컨대 Siglec-9 발현 NK 세포)의 활성을 강화하기 유용할 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 제2 또는 추가적인 제2 치료제는 인간 PD-1의 억제 활성을 중화시키는 항체 또는 다른 제제이다.
Programmed Death 1(PD-1)(또한 "Programmed Cell Death 1"로 나타냄)은 수용체의 CD28 패밀리의 억제 구성원이다. 전체 인간 PD-1 서열은 GenBank 접근 번호 U64863 하에 확인될 수 있다. PD-1의 억제 활성의 억제 또는 중화에는 PD-L1-유도 PD-1 신호전달을 방지하는 폴리펩타이드 제제(예컨대, 항체, Fc 도메인에 융합된 폴리펩타이드, 면역어드헤신 등)의 이용이 관여될 수 있다. 시판되거나 임상 평가 중인, PD-1/PD-L1 경로를 차단하는 적어도 6개 제제가 현재 존재한다. 한 제제는 BMS-936558(니볼루맙(Nivolumab)/ONO-4538, Bristol-Myers Squibb; 예전 MDX-1106)이다. 니볼루맙(상표명 Opdivo®)은 PD-1 및 CD80 둘 다에 대한 PD-L1 리간드의 결합을 억제하는 FDA-승인받은 완전 인간 IgG4 항-PD-L1 mAb이며 그 개시가 본원에 참조로 포함되는, WO 2006/121168에서 항체 5C4로 기재된다. 흑색종 환자에 있어서, 가장 유의미한 OR은 3 ㎎/㎏의 용량에서 관찰된 반면, 다른 암 유형에 있어서는 10 ㎎/㎏이었다. 니볼루맙은 일반적으로 암 진행 전까지 3주마다 10 ㎎/㎏으로 투여된다. 용어 "인간 PD-1의 억제 활성을 감소시킨다", "PD-1을 중화시킨다" 또는 "인간 PD-1의 억제 활성을 중화시킨다"는 PD-1이 PD-1과 하나 이상의 그 결합 파트너, 예컨대 PD-L1 또는 PD-L2와의 상호작용으로 생성되는 그 신호 전달능에서 억제되는 공정을 나타낸다. PD-1의 억제 활성을 중화시키는 제제는 PD-1과 하나 이상의 그 결합 파트너, 예컨대 PD-L1, PD-L2와의 상호작용으로 생성되는 신호 전달을 감소시키거나, 차단하거나, 억제하거나, 폐지하거나, 방해한다. 이에 의해 이러한 제제는 T-세포 효과기 기능, 예컨대 증식, 사이토카인 생산 및/또는 세포독성을 증강시키기 위해, T 림프구 상에 발현되는 세포 표면 단백질에 의해 또는 이를 통해 매개되는 부정적 공동-자극 신호를 감소시킬 수 있다.
람브롤리주맙 또는 펨브롤리주맙(상표명 Keytruda®)으로도 나타내는 MK-3475(인간 IgG4 항-PD1 mAb, Merck)는 흑색종의 치료를 위해 FDA에 의해 승인받았으며, 다른 암에서 평가되고 있다. 펨브롤리주맙은 질병 진행 전까지 2주 또는 3주마다 2 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏으로 평가되었다. 인간화 항체 h409의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 인코딩하는 DNA 구축물. 모두 미국 타입 배양 수집 특허 기탁처(American Type Culture Collection Patent Depository, 10801 University Blvd., Manassas, VA)에 기탁되었다. h409A-l 1의 중쇄를 인코딩하는 DNA를 함유하는 플라스미드는 2008년 6월 9일에 기탁되었고 081469_SPD-H로 확인되었으며, h409Al 1의 경쇄를 인코딩하는 DNA를 함유하는 플라스미드는 2008년 6월 9일에 기탁되었고 0801470_SPD-L-l 1로 확인되었다. Merck 3745 또는 SCH-900475로도 알려져 있는 MK-3475도 WO2009/114335에 기재되어 있다.
MPDL3280A/RG7446(항-PD-L1, Roche/Genentech)은 FcγR 결합 및 결과적인 항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC)을 최소화함으로써 유효성 및 안전성을 최적화하도록 설계된 조작된 Fc 도메인을 함유하는 인간 항-PD-L1 mAb이다. 1 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏, 15 ㎎/㎏, 및 25 ㎎/㎏ 이상 용량의 MPDL3280A를 최대 1년 동안 3주마다 투여하였다. 3상 시험에서, MPDL3280A 1200 mg을 NSCLC에서 3주마다 정맥내 주입에 의해 투여한다.
AMP-224(Amplimmune 및 GSK)는 Fc 도메인에 융합된 PD-L2 세포외 도메인을 포함하는 면역어드헤신이다. PD-1을 중화시키는 제제의 다른 예에는 PD-L2에 결합하고(항-PD-L2 항체) PD-1 및 PD-L2 간 상호작용을 차단하는 항체가 포함될 수 있다.
피들리주맙(Pidlizumab, CT-011; CureTech)(인간화 IgG1 항-PD1 mAb, CureTech/Teva), 피들리주맙(CT-011; CureTech)(예컨대, WO2009/101611 참고)은 또 다른 예이다; 제제를 30명의 리툭시맙-감수성 재발 FL을 갖는 환자에서 평가하였고 CT-011의 최초 주입 2주 후부터 시작하여, 4주 동안 매주 375 ㎎/㎡으로 투여되는 리툭시맙과의 조합으로 4회 주입 동안 4주마다 3 ㎎/㎏의 정맥내 CT-011로 치료하였다.
추가의 공지된 PD-1 항체 및 다른 PD-1 억제제에는 AMP-224(GSK에 라이센싱된 B7-DC/IgG1 융합 단백질), WO 2012/145493에 기재된 AMP-514, WO2011/066389 및 US2013/034559에 기재된 항체 MEDI-4736(AstraZeneca/Medimmune에 의해 개발된 항-PD-L1), WO2010/077634에 기재된 항체 YW243.55.S70(항-PD-L1), WO2007/005874에 기재된 Bristol-Myers Squibb에 의해 개발된 항-PD-L1 항체로, BMS-936559로도 알려져 있는 MDX-1105, 및 WO2006/121168, WO2009/014708, WO2009/114335 및 WO2013/019906에 기재된 항체 및 억제제가 포함되며, 그 개시가 본원에 참조로 포함된다. 항-PD1 항체의 추가 예는, 예를 들어 각각 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 및/또는 SEQ ID NO: 8의 경쇄 가변 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 항체 중쇄 가변 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는 항체가 WO2015/085847(Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co. Ltd.)에 개시되어 있으며, 여기서 SEQ ID NO 언급은 WO2015/085847에 따른 넘버링이며, 그 개시가 본원에 참조로 포함된다. PD-1 또는 PD-L1로의 결합에 대해 임의의 이러한 항체와 경쟁하는 항체가 또한 이용될 수 있다.
예시적인 항-PD-1 항체는 펨브롤리주맙이다(예컨대, 그 개시가 본원에 참조로 포함되는 WO 2009/114335 참고). 항-PD-1 항체는 ATCC에 081469_SPD-H로 기탁된 DNA에 의해 인코딩되는 중쇄 가변 영역 및 ATCC에 0801470_SPD-L-l 1로 기탁된 DNA에 의해 인코딩되는 경쇄 가변 영역을 포함하는, WO 2008/156712의 항체 h409Al 1일 수 있다. 다른 구현예에서, 항체는 펨브롤리주맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역을 포함한다. 따라서, 하나의 구현예에서, 항체는 ATCC에 081469_SPD-H로 기탁된 DNA에 의해 인코딩되는 펨브롤리주맙의 VH의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 도메인, 및 ATCC에 0801470_SPD-L-l 1로 기탁된 DNA에 의해 인코딩되는 펨브롤리주맙의 VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, PD-1 중화 제제는 PD-L1의 PD-1로의 결합을 억제하는 항-PD-L1 mAb이다. 일부 구현예에서, PD-1 중화 제제는 PD-1의 PD-L1로의 결합을 억제하는 항-PD1 mAb이다. 일부 구현예에서, PD-1 중화 제제는 면역어드헤신(예컨대, 불변 영역(예컨대, 면역글로불린 서열의 Fc 영역)에 융합된 PD-L1 또는 PD-L2의 세포외 부분 또는 PD-1 결합부를 포함하는 면역어드헤신)이다.
치료 방법에서, 항-Siglec 항체 및 제2 치료제는 별도로, 함께 또는 순차적으로, 또는 칵테일 중에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원-결합 화합물은 제2 치료제의 투여 전에 투여된다. 예를 들어, 항-Siglec 항체는 제2 치료제의 투여 전 대략 0일 내지 30일에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, Siglec-결합 화합물은 제2 치료제의 투여 전 약 30분 내지 약 2주, 약 30분 내지 약 1주, 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 1일, 또는 약 1일 내지 5일에 투여된다. 일부 구현예에서, 항-Siglec 항체는 치료제의 투여와 동시적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 항-Siglec 항체는 제2 치료제의 투여 후 투여된다. 예를 들어, 항-Siglec 항체는 제2 치료제의 투여 후 대략 0일 내지 30일에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-Siglec 항체는 제2 치료제의 투여 후 약 30분 내지 약 2주, 약 30분 내지 약 1주, 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 1일, 또는 약 1일 내지 약 5일에 투여된다.
다른 양태에서, Siglec-7+ 및/또는 Siglec-9+ NK 세포 및/또는 T 세포, 예컨대, CD8 T 세포, CD56bright NK 세포, CD56dim NK 세포의 확인 방법이 제공된다. NK 세포 및/또는 T 세포 상의 Siglec-7 및/또는 Siglec-9의 공동-발현 평가는 진단 또는 예후 방법에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 개체로부터(예컨대, 혈액 샘플로부터, 암 환자로부터 수득된 암 또는 암-인접 조직으로부터) 수득되고 Siglec-7 및/또는 Siglec-9+ NK 및/또는 T 세포의 존재에 대해 분석될 수 있다. 이러한 세포 상에서 Siglec-9의 발현은, 예를 들어, NK 및/또는 T 세포, 예를 들어 Siglec-9 폴리펩타이드에 의해 억제되는 종양 침윤 NK 및/또는 T 세포를 갖는 개체를 확인하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 세포 상에서 Siglec-7 및 Siglec-9 둘 다의 발현은, 예를 들어, NK 및/또는 T 세포, 예를 들어 Siglec-7 및 Siglec-9 폴리펩타이드 둘 다에 의해 억제되는 종양 침윤 NK 및/또는 T 세포를 갖는 개체를 확인하기 위해 이용될 수 있다. 방법은, 예를 들어, Siglec-7 및/또는 Siglec-9를 중화시키는 제제로의 치료로의 반응에 대한 예후로 유용할 수 있다. 이러한 세포 상에서 Siglec-9(및 선택적으로 추가의 Siglec-7)의 발현은 본 개시의 항체로의 치료에 적합한 개체를 시사할 수 있다.
소정의 선택적 양태에서, 환자는 Siglec-7 및/또는 Siglec-9에 대한 천연 리간드의 종양 샘플(예컨대, 종양 조직 및/또는 종양 인접 조직)의 존재를 평가함으로써 항-Siglec-7 및/또는 항-Siglec-9 항체로의 치료에 대해 확인될 수 있다. 본원에서 임의의 치료 용도 또는 암 치료 또는 예방 방법의 하나의 구현예에서, 개체에서 암의 치료 또는 예방은 다음 단계를 포함한다:
a) 암을 갖는 개체 내에서 악성 세포(예컨대, 종양 세포)가 Siglec-7의 리간드 및/또는 Siglec-9의 리간드를 발현하는지 여부를 결정하는 단계, 및
b) Siglec-7의 리간드 및/또는 Siglec-9의 리간드가 악성 세포(예컨대, 종양 세포)에 의해(예컨대, 그 표면 상에) 유의미하게 발현된다는 결정 시, 개체에 각각의 항-Siglec-7 및/또는 항-Siglec-9 항체, 예컨대, 본 개시의 임의의 양태에 따른 항체를 투여하는 단계.
하나의 구현예에서, 생물학적 샘플(예컨대, 종양 세포, 종양 조직 및/또는 종양 인접 조직을 포함하는 샘플)이 Siglec-7의 리간드 및/또는 Siglec-9의 리간드를 우세하게 발현한다는 결정은 개체가 각각 Siglec-7 및/또는 Siglec-9 폴리펩타이드를 억제하는 항체로 치료받을 수 있고/있거나 이로부터 이익을 얻을 수 있는 암을 가짐을 시사한다.
하나의 구현예에서, Siglec-7의 리간드 및/또는 Siglec-9의 리간드의 유의미한 발현은 상기 리간드(들)가 주어진 개체로부터 채취된 상당수의 종양 세포에서 발현됨을 의미한다. 정확한 백분율 값에 의해 구애받지 않고, 일부 예에서 리간드는 환자로부터(샘플 중) 채취된 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 이상의 종양 세포 상에 존재하는 경우, "유의미하게 발현되는" 것으로 언급될 수 있다.
임의의 방법의 하나의 구현예에서, 암을 갖는 개체 내의 악성 세포(예컨대, 종양 세포)가 Siglec-7 및/또는 Siglec-9의 리간드를 발현하는지 여부의 결정은 생물학적 샘플 중 악성 세포 상에서 Siglec-7의 리간드 및/또는 Siglec-9의 리간드의 발현 수준을 결정하는 단계 및 그 수준을 참조 수준(예컨대, 값, 약하거나 강한 세포 표면 염색 등)과 비교하는 단계를 포함한다. 참조 수준은, 예를 들어, 건강한 개체, 항-Siglec 항체로의 치료로부터 임상적 이익을 유도하지 않는/낮게 유도하는 개체, 또는 항-Siglec 항체로의 치료로부터 실질적인 임상적 이익을 유도하는 개체에 대응할 수 있다. 생물학적 샘플이 증가된 수준(예컨대, 높은 값, 강한 표면 염색, 항-Siglec 항체로의 치료로부터 실질적인 임상적 이익을 유도하는 개체의 수준에 대응하는 수준, 항-Siglec 항체로의 치료로부터 임상적 이익을 유도하지 않는/낮게 유도하는 개체에 대응하는 수준보다 높은 수준 등)으로 Siglec-7의 리간드 및/또는 Siglec-9의 리간드를 발현한다는 결정은 개체가 항-Siglec 항체로 치료받을 수 있는 암을 가짐을 시사한다.
실시예
실시예 1: Siglec-7 및 Siglec-9를 공동 발현하는 인간 NK 세포 하위세트
CD33-관련 Siglec 중, Siglec-7(CD328) 및 Siglec-9(CD329)는 암 세포에 의해 과발현되는 글리칸을 포함하는 시알산에 대한 결합 특성을 공유하며, 이들이 발현되는 면역 세포에서 억제 수용체로 기능하는 것으로 여겨진다. 림프구 상에서 Siglec의 발현을 조사하기 위해, Siglec-7 및 Siglec-9의 분포를 인간 NK 세포 상에서 연구하였다.
NK 세포 상의 Siglec-7 및 Siglec-9 발현을 인간 공여체로부터 정제된 신선 NK 세포 상에서 유세포 측정에 의해 결정하였다. NK 집단을 CD3- CD56+ 세포(항 CD3 Pacific blue - BD Pharmingen #558124; 항 CD56-PE-Vio770 - Milteny #130 100 676)로서 결정하였다. 항-Siglec-7 항체(클론 194211 - IgG1 APC - R&D Systems #FAB11381A), 항-Siglec-9 항체(클론 191240 - IgG2A PE - R&D Systems #FAB1139P) 및 이소형 대조군 IgG1 APC 및 IgG2A APC를 이용하였다. NK 세포를 30분 동안 50 ㎕의 염색 Ab 혼합물과 인큐베이션하고, 염색 완충액으로 2회 세척하고, 형광을 Canto II(HTS)로 드러내었다.
결과를 도 1에 나타낸다. 대표 결과를 나타낸다. MFI:형광 세기의 평균. 상당한 분율(약 44%)의 NK 세포가 Siglec-7 및 Siglec-9를 둘 다 발현하여, 큰 비율의 NK 세포가, 예를 들어 종양 세포 상에 존재하는 글리칸 리간드의 함수로서, 각각의(또는 둘 모두의) 이러한 수용체에 의해 억제될 수 있음을 제시하였다.
실시예 2: 항-Siglec 항체의 생성
파트 A: 마우스에서의 항체의 발생
항-인간 Siglec-7 및 Siglec-9 항체를 수득하기 위해, Balb/c 마우스를 인간 Siglec-7 Fc 및 인간 Siglec-9 Fc 세포외 도메인 재조합 단백질로 면역화하였다. 2개의 상이한 면역화를 수행하였다.
Siglec-7 Fc 및 Siglec-9 Fc 단백질로의 제1 면역화에서, 마우스는 30 ㎍의 각각의 단백질 및 완전 프로인트 아주반트의 에멀젼의 2회 주사를 복강내 수여받았다. 이어서, 마우스는 7.5 ㎍의 각각의 단백질로의 추가접종을 정맥내 수여받았다. 2개의 상이한 융합(융합 1 및 2)을 수행하였다. 면역 비장 세포를 X63.Ag8.653 불멸화 B 세포로의 추가접종 3일 후 융합시키고, 조사된 비장 세포의 존재 하에 배양하였다. 하이브리도마를 반-고체 메틸셀룰로스-함유 배지에 플레이트-접종하고 자라는 클론을 clonepix 2 장치(Molecular Devices)를 이용하여 픽킹하였다.
제2 면역화를 다시 Siglec-7 Fc 및 Siglec-9 Fc 단백질로 수행하였다. 마우스는 30 ㎍의 각각의 단백질 및 완전 프로인트 아주반트 에멀젼의 3회 주사를 복강내 수여받았다. 이어서, 마우스는 5 ㎍의 각각의 단백질로의 추가접종을 정맥내 수여받았다. 3개의 상이한 융합(융합 3, 4 및 5)을 수행하였다. 면역 비장 세포를 X63.Ag8.653 불멸화 B 세포로의 추가접종 3일 후 융합시키고, 조사된 비장 세포의 존재 하에 배양하였다. 하이브리도마를 P96 배지에 플레이트-접종하였다. 상기 면역화(및 이후 실시예)에서 이용된 Siglec-7 Fc 및 Siglec-9 Fc 단백질을 CHO 세포에서 생산하였다. Siglec-7 Fc 단백질은 다음 아미노산 서열을 가졌다:
Figure pct00023
Siglec-9 Fc 단백질은 다음 아미노산 서열을 가졌다:
Figure pct00024
일차 스크리닝: 두 면역화의 성장 클론의 상청액(SN)을 모체 및 huSiglec-7, huSiglec-9 및 cynoSiglec-발현 CHO 세포주를 이용하여 유세포 측정에 의해 일차 스크리닝에서 평가하였다. HuSiglec-7, - 및 cynoSiglec-발현 CHO를 각각 0.5 μM 및 0.05 μM CFSE로 염색하였다. 유세포 측정 스크리닝을 위해, 모든 세포를 균일하게 혼합하고, 상청액 중 반응 항체의 존재를 alexa fluor 647로 표지된 염소 항-마우스 폴리클로날 항체(pAb)로 드러내었다.
결과: 각각 융합 1, 2 및 3/4/5에서 인간 Siglec-7 및/또는 인간 Siglec-9 및/또는 Siglec-cyno에 결합하는 20개, 19개 및 80개 초과 항체를 각각의 융합에서 선택하였다. 3개의 상이한 융합으로부터 상이한 교차 반응성 항-Siglec-7, Siglec-9 및 Siglec-Cyno 항체 및 항-Siglec-9 항체(Siglec-7에 결합하지 않음)를 클로닝하여 N-연관 글리코실화가 없고 Fcγ 수용체에 대한 결합이 감소된 중쇄 N297Q(Kabat EU 넘버링) 돌연변이를 갖는 키메라 인간 IgG1 항체로 생산하였다.
도 2는 예를 들어 Siglec-7에 결합하지만 Siglec-9 또는 시아노몰구스 Siglec에 결합하지 않는 항체(오른쪽 패널), 각각의 Siglec-7, Siglec-9 및 시아노몰구스 Siglec에 결합하는 항체(가운데 패널), 및 Siglec-9에 결합하지만 Siglec-7 또는 시아노몰구스 Siglec에 결합하지 않는 항체(왼쪽 패널)의 유세포 측정의 대표 결과를 나타낸다.
표 1. Siglec 서열
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
파트 B : 항-Siglec-9 항체의 인간화
본원에서 표 B에 제시된 각각의 가변 영역을 갖는 항체 mAbA, mAbB 및 mAbD를 상보성 결정 영역 (CDR) 그래프팅에 의한 인간화 항체로서 개질하였다. 3D 모델링 연구에 기반하여, 하기 제시된 아미노산 서열을 갖는 상이한 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 각각의 개질된 mAbA, mAbB 또는 mAbD CDR 및 인간 프레임워크를 포함하도록 디자인하여, 제거된 Fcγ 수용체 결합에 대한 치환을 갖는 인간 IgG1 항체로서 제조하였다. 항체는 CHO 세포를 사용하여 생성되었고 인간 Siglec-9에 대한 결합에 시험하였다.
항체 mAbA
3D 모델링 연구에 기반하여, 상이한 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 mAbA CDR 및 인간 프레임워크를 포함하도록 디자인하여, 인간 IgG1 항체로서 제조하였다. 4개의 상이한 중쇄를 제조하고 (H0, H1, H2 및 H3으로서 언급됨), 3개의 상이한 경쇄를 제조하였다 (L0, L1 및 L2로서 언급됨). 중쇄 및 경쇄는 특정한 아미노산 치환을 가졌다 (하기에 볼드체로 제시됨; Kabat CDR은 밑줄침).
mAbA: "H0" 중쇄 가변 영역
Figure pct00028
mAbA: "H1" 중쇄 가변 영역
Figure pct00029
mAbA: "H2" 중쇄 가변 영역
Figure pct00030
mAbA: "H3" 중쇄 가변 영역
Figure pct00031
mAbA: "L0" 경쇄 가변 영역
Figure pct00032
mAbA: "L1" 경쇄 가변 영역
Figure pct00033
mAbA: "L2" 경쇄 가변 영역
Figure pct00034
항체 mAbB
3D 모델링 연구에 기반하여, 상이한 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 mAbB CDR 및 인간 프레임워크를 포함하도록 디자인하여, 인간 IgG1 항체로서 제조하였다. 6개의 상이한 중쇄를 제조하고 (H0, H1, H2, H3, H4 및 H5로서 언급됨), 3개의 상이한 경쇄를 제조하였다 (L0, L1 및 L2로서 언급됨). 이들 가변 영역은, 중쇄 가변 영역의 경우: mAbB 중쇄 CDR (하기 제시됨, 밑줄침), 인간 IGHV1-69 유전자 프레임워크 1, 2 및 3 영역, 경쇄 가변 영역의 경우: mAbB 경쇄 CDR (하기 제시됨, 밑줄침), 인간 IGKV1-33 유전자 프레임워크 1, 2 및 3 영역을 포함하였다. 이후 중쇄 및 경쇄의 조합을 제조하였다. 중쇄 및 경쇄는 특정한 아미노산 치환을 가졌다 (하기에 볼드체로 제시됨; Kabat CDR은 밑줄침).
mAbB: "H0" 중쇄 가변 영역
Figure pct00035
mAbB: "H1" 중쇄 가변 영역
Figure pct00036
mAbB: "H2" 중쇄 가변 영역
Figure pct00037
mAbB: "H3" 중쇄 가변 영역
Figure pct00038
mAbB: "H4" 중쇄 가변 영역
Figure pct00039
mAbB: "H5" 중쇄 가변 영역
Figure pct00040
mAbB: "L0" 경쇄 가변 영역
Figure pct00041
mAbB: "L1" 경쇄 가변 영역
Figure pct00042
mAbB: "L2" 경쇄 가변 영역
Figure pct00043
항체 mAbC
3D 모델링 연구에 기반하여, 상이한 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 mAbC CDR 및 인간 프레임워크를 포함하도록 디자인하여, 인간 IgG1 항체로서 제조하였다. 4개의 상이한 중쇄를 제조하고 (H0, H1, H2 및 H3으로서 언급됨), 2개의 상이한 경쇄를 제조하였다 (L0 및 L1로서 언급됨). 이후 중쇄 및 경쇄의 조합을 제조하였다. 가변 영역은, 중쇄 가변 영역의 경우: mAbC 중쇄 CDR (하기 제시됨, 밑줄침), 인간 IGHV7-4-1 유전자 프레임워크 1, 2 및 3 영역, 경쇄 가변 영역의 경우: mAbC 경쇄 CDR (하기 제시됨, 밑줄침), 인간 IGKV7-3 유전자 프레임워크 1, 2 및 3 영역을 포함하였다. 중쇄 및 경쇄는 특정한 아미노산 치환을 가졌다 (하기에 볼드체로 제시됨; Kabat CDR은 밑줄침).
mAbC: "H0" 중쇄 가변 영역
Figure pct00044
mAbC: "H1" 중쇄 가변 영역
Figure pct00045
mAbC: "H2" 중쇄 가변 영역
Figure pct00046
mAbC: "H3" 중쇄 가변 영역
Figure pct00047
mAbC: "L0" 경쇄 가변 영역
Figure pct00048
mAbC: "L1" 경쇄 가변 영역
Figure pct00049
항체 mAbD
3D 모델링 연구에 기반하여, 상이한 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 mAbD CDR 및 인간 프레임워크를 포함하도록 디자인하여, 인간 IgG1 항체로서 제조하였다. 3개의 상이한 중쇄를 제조하고 (H0, H1 및 H2로서 언급됨), 3개의 상이한 경쇄를 제조하였다 (L0, L1 및 L2로서 언급됨). 이후 중쇄 및 경쇄의 조합을 제조하였다. 가변 영역은, 중쇄 가변 영역의 경우: mAbD 중쇄 CDR (하기 제시됨, 밑줄침), 인간 IGHV7-4-1*02 유전자 프레임워크 1, 2 및 3 영역 및 인간 IGHJ6*01 유전자 프레임워크 4 영역, 경쇄 가변 영역의 경우: mAbD 경쇄 CDR (하기 제시됨, 밑줄침), 인간 IGKV1-39*01 유전자 프레임워크 1, 2 및 3 영역을 포함하였다. 중쇄 및 경쇄는 특정한 아미노산 치환을 가졌다 (하기에 볼드체로 제시됨; Kabat CDR은 밑줄침).
mAbD: "H0" 중쇄 가변 영역
Figure pct00050
mAbD: "H1" 중쇄 가변 영역
Figure pct00051
mAbD: "H2" 중쇄 가변 영역
Figure pct00052
mAbD: "L0" 경쇄 가변 영역
Figure pct00053
mAbD: "L1" 경쇄 가변 영역
Figure pct00054
mAbD: "L2" 경쇄 가변 영역
Figure pct00055
실시예 3: CD33-관련 Siglec에 대한 결합
Siglec-7 및 Siglec-9에 대한 서열 유사성을 공유하는 CD33-관련 Siglec은 일반적으로 Siglec-1, Siglec-2, Siglec-4 및 Siglec-15로 이루어지는 제1 하위세트 및 Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-7, Siglec-8, Siglec-9, Siglec-10, Siglec-11, Siglec-12, Siglec-14 및 Siglec-16이 포함되는 CD33-관련 Siglec 그룹의 2개 그룹으로 구분된다. 다른 CD33-관련 Siglec은 상이한 생물학적 기능을 가지고/가지거나 종양 감독에 관여되는 것으로 여겨지지 않으므로, 다른 CD33-관련 Siglec에 결합하지 않는 교차 반응성 Siglec-7/9 항체를 수득할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 항체를 추가 스크리닝하였다.
Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-8, Siglec-10, Siglec-11 및 Siglec-12를 발현하는 세포를 생성하고 교차 반응성 Siglec-7/9 항체의 대표 하위세트를 세포로의 결합에 대해 유세포 측정에 의해 평가하였다. 본원에서 이용된 상이한 Siglec에 대한 아미노산 서열 및 Genbank 참조는 상기, 표 1에 나타낸다.
간략하게, HuSiglec-발현 CHO 세포주(하나의 Siglec을 발현하는 세포주)를 이용하였다. 유세포 측정 스크리닝을 위해, 항체를 각각의 HuSig-lec-발현 CHO 세포주(CHO HuSiglec-3 세포주, CHO HuSiglec-5 세포주, CHO HuSiglec-6 세포주, CHO HuSiglec-8 세포주, CHO HuSiglec-10 세포주, CHO HuSiglec-11 세포주, CHO HuSiglec-12 세포주)와 1시간 인큐베이션하고, 염색 완충액 중 2회 세척하고, PE로 표지된 염소 항-마우스 폴리클로날 항체(pAb)로 드러내고, 염색 완충액으로 2회 세척하고, HTFC 유세포 측정기 상에서 염색을 획득하여 FlowJo 소프트웨어를 이용해서 분석하였다.
결과는 항-Siglec-9 항체 mAbA, mAbB, mAbC, mAbD, mAbE 및 mAbF 중 어느 것도 임의의 Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-7, Siglec-8, Siglec-10, Siglec-11 또는 Siglec-12에 결합하지 않음을 나타내었다.
결과는 일부 교차 반응성 Siglec-7/9 항체가 Siglec-7 및 Siglec-9에 부가하여 Siglec-12 또는 Siglec-6에 또한 결합할 수 있음을 나타내었다. mAb1, mAb2 및 mAb3은 Siglec-7 및 Siglec-9에 부가하여 Siglec-12에 결합한 반면, mAb3, mAb4, mAb5 및 mAb6은 Siglec-12에 결합하지 않았다. 예시적인 항체 mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5 또는 mAb6 중 어느 것도 임의의 Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-8, Siglec-10, 또는 Siglec-11에 결합하지 않았다.
실시예 4: Siglec으로의 결합에 대한 항체의 적정
인간 Siglec-7, 인간 Siglec-9 및 시아노몰구스 Siglec-9 상의 항체 결합을 인간 Siglec-7 및 인간 Siglec-9 및 시아노몰구스 Siglec-9로 전달감염된 CHO 세포 상에서 유세포 측정에 의한 적정 실험에 의해 평가하였다. 세포를 일차 항체 20 ㎍/㎖ 및 1:5의 희석 시리즈를 함유하는 염색 완충액(SB) 중 1 h 인큐베이션하였다. 이들을 SB로 3회 세척한 후, 염소 F(ab')2 항-인간 IgG(Fc) PE(Beckman Coulter #IM05510)와 30분 인큐베이션하고, SB로 2회 세척하였다. HTFC Intellicyt 유세포 측정기로 염색을 드러내었다.
2개의 면역화에서의 5개 융합으로부터 아래 나타낸 6개 항체가 세포에 의해 발현된 인간 Siglec-7 및 인간 Siglec-9, 그리고 추가로 시아노몰구스 Siglec에 필적하는 결합 친화도를 갖는 것으로 확인되었다. 각각의 항체에 있어서 결합에 대한 EC50 값(㎍/㎖)을 아래에 나타낸다.
Figure pct00056
실시예 5: 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의한 Siglec-9 결합 친화도
Biacore™ T100 일반 절차 및 시약
SPR 측정을 25℃에서 Biacore™ T200 장치(Biacore™ GE Healthcare) 상에서 수행하였다. 전체 Biacore™ 실험에서, HBS-EP+(Biacore™ GE Healthcare) 및 NaOH 10 mM이 각각 진행 완충액 및 재생 완충액으로 작용하였다. 센소그램을 Biacore™ T200 평가 소프트웨어로 분석하였다. 인간 siglec-9 및 siglec-7 다량체 단백질을 Innate Pharma에서 클로닝하고, 생산하고, 정제하였다.
단백질-A의 면역화
단백질을 센서 칩 CM5 상의 덱스트란층 내 카복실기에 공유 고정하였다. 칩 표면을 EDC/NHS(N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필) 카보디아미드 하이드로클로라이드 및 N-하이드록시숙신이미드(Biacore™, GE Healthcare)로 활성화하였다. 적절한 고정화 수준(즉 600 RU 내지 2000 RU)에 도달할 때까지 단백질을 커플링 완충액(10 mM 아세테이트, pH 4.2 & 5.0) 중 10 ㎍/㎖까지 희석하였다. 잔여 활성화기의 탈활성화를 100 mM 에탄올아민 pH 8(Biacore™, GE Healthcare)을 이용하여 수행하였다.
친화도 연구
친화도 연구를 제조업체(Biacore™ GE Healthcare kinetic wizard)에서 권장되는 표준 동역학 프로토콜에 따라 수행하였다. 600 nM 내지 0.975 nM 범위의 항-Siglec-9 및 항-Siglec-7/9 항체 Fab 단편의 연속 희석물을 고정화된 Siglec-9 Fc 및 Siglec-7 Fc 단백질 상에 순차적으로 주사하고, 재생 전 10분 동안 해리하게 두었다. 전체 센소그램 세트를 1:1 동역학 결합 모델을 이용하여 피팅하였다. 1가 친화도 및 동역학 연합 및 해리 속도 상수를 아래의 표 2에서 아래에 나타낸다.
Figure pct00057
실시예 6: 단핵구-유래 수지상 세포의 적정
단핵구-유래 수지상 세포(moDC)의 생성:
단핵구-유래 수지상 세포를 말초혈 단핵 세포로부터 생성하였다. PBMC를 건강한 공여체로부터 수득된, 백혈구 연층으로부터 단리하였다. 단핵구를 키트 단핵구 단리 키트 II(Miltenyi Biotec)를 이용하여 정제하고 10% 불활성화 FBS(GIBCO), 글루타민(GIBCO), MEM NEAA(GIBCO), 나트륨 피루베이트(GIBCO), IL-4(20 ng/㎖)(Peprotech) 및 GM-CSF(400 ng/㎖)(Miltenyi Biotec)가 보충된 RPMI 배지(GIBCO) 중 총 6일 동안 moDC에서 분화시켰다. 세포를 37℃에서 가습 CO2 인큐베이터에서 배양하고, 사이토카인을 4일차에 재생시켰다.
moDC를 25 mU 뉴라미니다제(Roche Diagnostics)로 2시간 동안 탈시알릴화하였다. 뉴라미니다제 처리 전 및 후에 탈시알릴화를 제어하였다: moDC 세포를 마우스 Siglec-7 Fc(IPH) 및 마우스 Siglec-9 Fc 재조합 단백질(IPH) 10 ㎍/㎖로 염색 완충액(SB) 중 1 h 인큐베이션하고, SB로 2회 세척하고, 염소 F(ab')2 항-마우스 IgG(Fc) PE(Jackson ImmunoResearch)와 30분 인큐베이션하고, SB로 2회 세척하고, Canto II(HTS)로 형광을 드러내었다.
적정
moDC 및 뉴라미니다제 처리 moDC 상의 결합을 유세포 측정에 의해 적정 실험에서 평가하였다. 세포를 일차 항체 10 ㎍/㎖ 및 1:10의 희석 시리즈를 함유하는 염색 완충액(SB) 중 1 h 인큐베이션하였다. 이들을 SB로 2회 세척한 후, 염소 F(ab')2 항-인간 IgG(Fc) PE(Jackson Immunoresearch)와 30분 인큐베이션하고, SB로 2회 세척하였다. HTFC Intellicyt 유세포 측정기로 형광을 드러내었다.
결과
EC50은 뉴라미니다제 처리 후 크게 증강되어(10배), moDC 상에서 발현되는 Siglec-9가 뉴라미니다제 처리 전 이의 시알산 리간드와 시스 상호작용에 관여됨을 시사하였다. 그러나, 정체기 상 수준은 변경되지 않아, 고친화도 항체가 세포 표면 상의 모든 Siglec-9(결합 및 미결합) 입체형태에 결합할 수 있고 모노DC뿐만 아니라 다른 세포 유형(예컨대, NK 세포, CD8 T 세포, 단핵구 및 대식구 M1 및 M2)에서 시스-상호작용 및 신호전달을 억제함을 제시한다. 이들 각각의 EC50 값이 수반되는, moDC(왼쪽 패널) 및 뉴라미다제-처리 moDC(오른쪽 패널)에서의 대표 항체 mAbA, mAbC 및 mAbD에 대한 결과를 도 3에 나타낸다.
실시예 7: NK 세포에서 Siglec 활성을 중화시키는 항체의 능력 평가
제1 및 제2 면역화에서 평가된 항-Siglec-7/9 항체를 일차 NK 세포(이용 전에 37℃에서 하룻밤 인큐베이션된, 인간 공여체로부터 정제된 신선 NK 세포)를 이용하여 NK 세포 활성화 검정에서 Siglec 활성의 차단에 대해 평가하였다. 24시간에 CD137 발현의 증가는 NK 세포를 포함하는 몇몇 림프구의 활성화와 연관된다(Kohrt et al. (2011) Blood 117(8):2423-2432). NK 세포 활성화에 대한 항-Siglec-7/9 항체 및 표적 세포의 탈시알릴화의 효과를 유세포 측정에 의해 NK 세포 상에서 CD137 발현의 분석에 의해 결정하였다. 각각의 항-Siglec-7/9 mAb mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5 및 mAb6은 24시간차에 CD137 발현의 증가를 유도하였다.
이어서 항-Siglec-7/9 항체의 효과를 효과기로서 YTS Siglec-9* 효과기 세포주(인간 Siglec-9로 전달감염된 인간 NK 세포주 YTS) 및 표적으로서 Ramos 세포주를 이용하여 세포독성 검정(Cr51)에 의해 연구하였다. 상기 평가는 51Cr-로딩된 표적 세포의 용해를 직접 정량하여 YTS Siglec-9* 세포주의 세포독성을 측정한다. 간략하게, 표적 세포를 먼저 방사활성 51Cr 동위원소로 표지한 후 효과기 세포와 37℃에서 4 h 동안 공동-인큐베이션한다. 상기 시간 동안, YTS 세포에 감수성인 표적 세포가 용해되어 51Cr을 배지 내로 방출한다. 회수된 상청액 중 51Cr을 액체 신틸레이션 카운팅에 의해 측정한다. 수득된 결과는 NK 세포에 의한 표적 세포의 용해 백분율 평가를 허용한다. 검정을 E:T 비 5/1로, 완전 RPMI 중, 200 ㎕ 최종/웰로 96 U 웰 플레이트에서 수행하였다. 항-Siglec-7/9 항체 및 이소형 대조군을 10 ㎍/㎖ 및 1:10의 희석 시리즈로 첨가하였다.
각각의 항-Siglec-7/9 mAbs mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5 및 mAb6은 용량 의존적 방식으로 YTS Siglec-9* 세포독성의 증가를 유도하였다. 대조군으로, 상기 효과는 야생형 YTS 세포주(Siglec-9 발현 없음) 상에서는 관찰되지 않았다. 유사하게, 각각의 항-Siglec-9 mAbs mAbA, mAbB, mAbC, mAbD, mAbE 및 mAbF는 용량 의존적 방식으로 YTS Siglec-9* 세포독성의 증가를 유도한다. 도 4는 Siglec-7 및 Siglec-9 교차 반응성 항체(도 4b) 중 및 Siglec-9 단일특이적(비-Siglec-7 결합) 항체(도 4a) 중 YTS Siglec-9* 세포독성 증가의 용량 의존적 유도를 나타낸다.
실시예 8: 일차 인간 NK 세포(낮은 Siglec-9 발현)에서 Siglec-9 중화의 상세 연구
본 발명자들은 NK 세포에서 Siglec-9를 중화시키지 못하는 선행 항체의 무능력이, 예를 들어, 이의 표면에 훨씬 더 높은 수준의 Siglec-9, 및 상이한 NK 세포 하위세트에서 발현되는 Siglec-7을 발현하는 호중구 및 다른 세포에 비해, 일차 NK 세포에서의 Siglec-9 발현차에 관련될 수 있다는 가능성을 고려하였다. NK 세포에서 Siglec-9를 중화시키는 항체가 수득될 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 유세포 측정에 의해 Siglec-9 상에서 관문화된 여러 인간 공여체로부터 일차 NK 세포에서 항체를 연구하고 선택하였다. 전통적 51Cr 방출 검정에서 종양 세포 용해를 평가함으로써 세포독성에 의해, 그리고 NK 세포 상의 CD137 표면 발현을 평가함으로써 활성화 검정에 의해 항-Siglec-9 항체의 효과를 연구하였다. 각각의 경우, 일차 NK 세포(공여체로부터 정제된 신선 NK 세포)를 효과기 세포로 이용하고 HT29 결장직장암 세포주를 표적으로 이용하였다.
파트 1: 세포독성 검정: 2명의 인간 공여체에서 정제된 NK 대 HT29 종양 세포
세포독성 검정으로 51Cr-로딩된 표적 세포의 용해를 직접 정량하여 NK 세포 상에서 세포독성을 측정하였다. 간략하게, 표적 세포를 먼저 방사활성 51Cr 동위원소로 표지한 후 효과기 세포와 37℃에서 4 h 동안 공동-인큐베이션하였다. 이 시간 동안, NK 세포에 감수성인 표적 세포가 용해되어 배지 내로 51Cr을 방출하였다. 회수된 상청액 중 51Cr을 액체 신틸레이션 카운팅에 의해 측정하였다. 수득된 결과는 NK 세포에 의한 표적 세포의 용해 백분율 평가를 허용한다. 검정을 E:T 비 8/1로, 완전 RPMI 중 200 ㎕ 최종/웰로 96 U 웰 플레이트에서 수행하였다. 항-Siglec-9 항체 및 이소형 대조군을 10 ㎍/㎖로 첨가하였다.
각각의 항-Siglec9 항체 mAbA, mAbB, mAbC, mAbD, mAbE, 및 mAbF 및 항-Siglec7/9 항체 mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5 및 mAb6은 NK 세포 세포독성의 증가를 유도하였다. 도 5는 2명의 상이한 인간 공여체(공여체 D1(왼쪽 패널) 및 D2(오른쪽 패널))에서 항체 mAbA, mAbC, mAbD, mAbE, 및 mAbF에 의해 매개되는 일차 NK 세포 세포독성의 증가를 나타내는 대표도이다.
파트 2: 활성화 검정(CD137): 단일 인간 공여체에서 정제된 NK 대 HT29, mAb 비교
NK 세포 활성화에 대한 항-Siglec-7/9 및 항-Siglec-9 항체의 효과를 유세포 측정에 의해 Siglec-9 양성 NK 세포 상의 CD137 발현 분석에 의해 결정하였다. 효과기 세포는 일차 NK 세포(이용 전 37℃에서 하룻밤 인큐베이션한, 공여체로부터 정제된 신선 NK 세포)였고 표적 세포(HT29 세포주)를 비 1:1로 혼합하였다. CD137 검정을 완전 RPMI 중, 200 ㎕ 최종/웰로 96 U 웰 플레이트에서 수행하였다. 항체를 효과기 세포와 37℃에서 30분 사전-인큐베이션한 후 표적 세포를 37℃에서 하룻밤 공동-인큐베이션하였다. 다음 단계는 500 g에서 3분 회전; 염색 완충액(SB)으로 2회 세척; 염색 Ab 혼합물(항 CD3 Pacific blue - BD Pharmingen; 항-CD56-PE-Vio770(Miltenyi); 항-CD137-APC(Miltenyi), 항 Siglec-9 K8-PE(Biolegend) 50 ㎕ 첨가; 4℃에서 30분 인큐베이션; SB로 2회 세척하고; SB로 펠렛을 재현탁하고; Canto II(HTS)으로 형광을 드러내었다.
음성 대조군은 NK 세포 대 HT29 단독 및 이소형 대조군의 존재 하였다. 도 6은 1명의 인간 공여체에서 몇몇 항-Siglec-9 및 항 Siglec-7/9 항체 mAbA, mAbB, mAbF, mAb6 및 mAb4에 의해 매개되는 CD137을 발현하는 Siglec-9-양성 NK 세포%의 증가를 나타내는 대표도이다. 대조군으로서, CD137을 발현하는 Siglec-9-음성 NK 세포%는 이들 항체에 의해 영향받지 않았다. 도면에서 알 수 있듯이, 항-Siglec-9 항체는 Siglec-9-발현 일차 인간 NK 세포의 세포독성을 동일한 공여체로부터 Siglec-9-음성 일차 인간 NK 세포에서 관찰되는 수준까지 완전 복원하였다.
파트 3: 활성화 검정(CD137): 6명의 인간 공여체에서 정제된 NK 대 HT29, mAbA 및 mAb1
하나의 항 Siglec-9(mAb.A) 및 하나의 항 Siglec-7/9(mAb1)를 이용하여 6명의 공여체로 실험을 재현하였다. 항체의 부재 하에("배지" 상황), CD137 발현 NK%는 공여체 사이에서 6% 내지 27%로 변하였다((도 7, 왼쪽 패널) 참고). 데이터를 각 실험으로부터의 대조군 배지 값 대비 상대 변화로 정상화하였다: ((X - X배지))/X배지)(%). 도 7에 나타낸 바와 같이, mAbA 및 mAb1은 Siglec-9+ CD137+ NK%의 증가를 유도하였고(도 7, 중간 패널), Siglec-9- CD137+ NK%의 증가는 유도하지 않았다(도 7, 오른쪽 패널).
실시예 9: 일차 NK 세포 상의 적정
신선 정제 인간 NK 세포 상의 항체 결합을 유세포 측정에 의한 적정 실험에 의해 평가하였다. 세포를 일차 항체 10 ㎍/㎖ 및 1:10의 희석 시리즈 함유 염색 완충액(SB) 중 1 h 인큐베이션하였다. 이를 SB로 3회 세척한 후, 염소 F(ab')2 항-인간 IgG(Fc) PE(Jackson ImmunoResearch)와 30분 인큐베이션하였다. 염색을 BD FACS Canto II 상에서 획득하고 FlowJo 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. EC50 값을 아아래의 표에 ㎍/㎖로 나타낸다(4-파라미터 로지스틱 피팅을 이용하여 계산함).
Figure pct00058
실시예 10: 시알산 리간드로의 Siglec 결합 차단
파트 A: 유세포 측정에 의한 시알산 발현 종양 세포로의 Siglec-9 결합의 차단
항-인간 Siglec-9 Fab의 용량-범위를 고정 용량의 인간 Siglec-9 Fc 융합 재조합 단백질과 실온에서 30분 공동-인큐베이션한 후, 1시간 동안 다양한 시알산 발현 세포주 K562 E6(인간 HLA-E로 전달감염된 K562 세포주 (human chronic myelogenous leukemia (CML) cells; ATCC™ reference CCL-243™)) 및 Ramos 상에 첨가하였다. 세포를 염색 완충액 중 2회 세척 후, 염색 완충액 중 희석된 PE-커플링된 염소 항-마우스 IgG Fc 단편 이차 항체(Jackson Immunoresearch)를 세포에 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 추가 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 2회 세척하고 HTFC 플레이트 판독기가 장착된 Accury C6 유세포 측정기 상에서 분석하였다. 형광 평균 대 Fab 및 Siglec-9 Fc 융합 재조합 단백질의 비를 그래프 상에 도시하였다.
결과를 도 8에 나타낸다. 상부 패널에, 항체의 존재 하에 Ramos 세포로의 Siglec-9-Fc 단백질의 결합을 나타낸다. 항-Siglec/9 mAb mAbA, mAbB, mAbC, 및 mAbD는 각각 Ramos 세포로의 Siglec-9-Fc 단백질의 결합을 억제한 반면, mAbE는 Ramos 세포로의 Siglec-9-Fc 단백질의 결합을 억제하는 부분적 능력을 나타내었고, mAbF는 Ramos 세포로의 Siglec-9-Fc 단백질의 결합을 유의미하게 억제하지 않았다. 도 8, 하부 패널에, 항체의 존재 하에 K562 세포로의 Siglec-9-Fc 단백질의 결합을 나타낸다. 항-Siglec/9 mAb mAbA, mAbB, mAbC 및 mAbD는 각각 Ramos 세포로의 Siglec-9-Fc 단백질 결합을 억제한 반면, mAbE 및 mAbF는 둘 다 K562 세포로의 Siglec-9-Fc 단백질의 결합을 억제하는 부분적 능력을 상당히 더 높은 항체 농도에서만 나타내었다. 결론적으로, 항체 mAbA, mAbB, mAbC, 및 mAbD는 종양 세포 상에서 그 시알산 리간드에 대한 Siglec-9의 결합을 완전 차단하는 반면, 항체 mAbE 차단은 시알산 발현 세포주에 의존하며 mAbF는 결합을 차단하지 않는다.
mAbA 또는 mAbD의 중쇄 및 경쇄 CDR을 갖는 인간화 항체로 실험을 반복하였다. (실시예 2의 VH 및 VL의 조합을 갖는) 표 C에서 본원에 나열된 각각의 인간화 mAbA 및 mAbD 항체는 각각 각각의 모체 mAbA 또는 mAbD 항체에 필적하는 Ramos 세포로의 Siglec-9-Fc 단백질의 결합 억제를 입증하였다.
파트 B: ELISA 검정에 의한 시알릴화 리간드로의 Siglec-7 및 Siglec-9 결합의 차단
시알산은 형성된 글리코실화 단백질 및 지질 상의 9-탄소 카복실화 단당류이다. 시알릴트랜스퍼라제(이의 생합성을 촉매함) 및 뉴라미니다제로도 명명되는 시알리다제(이의 절단을 촉매함)를 포함하는 몇몇 효소가 포유류 시스템에서 이의 발생을 조절한다. 암에서, 변형된 시알산 프로필은 종양 성장, 전이의 증강 및 면역 감독의 회피에서 우세한 역할을 담당하여, 암 세포 생존을 야기한다(Bork et al., J Pharm Sci. 2009 Oct;98(10):3499-508). 시알릴화를 조절하는 변형된 효소 프로필과 함께 증가된 시알릴화가 몇몇 암에서 보고되었다. ST3GAL6 효소는 다발성 골수종 세포주 및 환자에서 과발현되며, 시험관 내에서 다발성 골수종 세포의 표면 상 α-2,3-연관 시알산의 발현과 연관된다. 생체 내에서, ST3GAL6 녹다운은 감소된 종양 부담 및 연장된 생존과 더불어, 다발성 골수종 세포의 감소된 귀소 및 골수 틈새로의 그래프팅과 연관된다(Glavey et al., Blood. 2014 Sep 11;124(11):1765-76). 교종에서의 높은 ST3GAL1 효소 발현은 더 높은 종양 등급의 중간엽 분자 분류와 연관된다(Chong et al., Natl Cancer Inst. 2015 Nov 7;108(2). 비정상적인 프로모터 메틸화는 암에서 몇몇 시알릴 트랜스퍼라제 발현의 조정에서 역할을 담당한다(Vojta et al., Biochim Biophys Acta. 2016 Jan 12). 방광암에서, 비정상적인 ST6GAL1 프로모터 메틸화는 ST6Gal1 발현 손실을 유도한다(Antony et al., BMC Cancer. 2014 Dec 2;14:901).
Siglec-7 및 Siglec-9는 다양한 시알산 결합에 결합한다. 칩 상에 인쇄된 시알로사이드 라이브러리로 몇몇 Siglec 및 하나의 선택적 Siglec-7 리간드에 공통적인 시알로사이드 리간드를 확인하였다(Rillahan et al., ACS Chem Biol. 2013 Jul 19;8(7):1417-22). Siglec-7 및 Siglec-9에 의한 시알로사이드의 가능한 차별적 인식의 관점에서, 면역 세포 상의 Siglec-7 및 Siglec-9 둘 다의 표적화는 다양한 시알릴 트랜스퍼라제 및 시알산이 주어지는 몇몇 암 유형의 표적화를 허용할 수 있다.
항 Siglec-7/9 항체에 의한 Siglec-7 및 Siglec-9 그리고 시알릴화 리간드 간 상호작용의 차단을 ELISA 검정에서 평가하였다. Siglec 단백질은 Siglec-7 인간 Fc 및 Siglec-9 인간 Fc 재조합 단백질이었고, 리간드는 시알릴화 삼당류를 함유하는 바이오틴화 중합체였다("Sia1"로 나타내는 Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb-PAA-바이오틴 Glycotech # 01-077 및 6'-시알릴락토스-PAA-바이오틴 Glycotech # 01-039("Sia2"로 나타냄). 간략하게, 단백질 A를 4℃에서 하룻밤 ELISA 플레이트 상에 코팅하였다. 3회 세척 및 포화 후, Siglec-7 Fc 및 Siglec-9 Fc를 1H30 동안 RT에서 0.8 ㎍/웰로 첨가하였다. 3회 세척 후, mAb를 20 ㎍/㎖로 및 1:5의 희석 시리즈로 첨가하였다. 3회 세척 후, 바이오틴화 시알릴화 중합체를 실온에서 3시간 동안 첨가하였다. 3회 세척 후, 스트렙타비딘-퍼옥시다제(Beckman)를 1:1000으로 첨가하였다. 마지막으로, Siglec-7 및 Siglec-9 단백질 상의 바이오틴화 중합체의 결합을 암소 내 RT에서 TMB(Interchim)의 첨가에 의해 드러내었고, 반응을 H2SO4의 첨가에 의해 중단시켰다. 흡광도를 450 nm에서 판독하였다.
결과를 도 9 및 10에 나타낸다. mAb1, mAb2, mAb4, mAb5 및 mAb6은 Sia2와 Siglec-7의 상호작용을 차단하였으나, mAb3은 이를 차단하지 않았다(도 9). 모든 mAb가 Sia2와의 Siglec-9 상호작용을 차단하였으나(도 10), mAb1, mAb2 및 mAb3은 Sia1과 Siglec-9의 상호작용을 억제하는 능력을 적게 나타내었고(도 10), 이에 따라 Sia1 상호작용을 실질적으로 차단하지 않았다. mAb5 및 mAb6은 Sia1과 Siglec-9의 상호작용을 차단하였고, mAb4는 Sia1과 Siglec-9의 상호작용을 차단하는 중간 정도의 능력을 가졌다. Siglec-9 상의 차단 효과는 시알산 유형에 의존한다. 전반적으로, 가장 완전한 억제는 항-Siglec-9 항체 mAbA, mAbB, mAbC 및 mAbD로 관찰되었고 이는 시알산과 Siglec-9 상호작용의 실질적으로 완전 억제를 달성하였다.
실시예 11: Siglec 발현 세포 상의 인간화 항체의 적정
인간화 항체의 결합을, 유세포분석에 의한 적정 실험에서, 인간 Siglec-9로 전달감염된 CHO 세포 상에서 시험하였다. 세포를 일차 항체 10 ug/ml 및 1:10의 희석 시리즈를 함유하는 염색 완충액(SB) 중 37℃에서 90 분 인큐베이션하였다. 이를 SB로 3회 세척한 후, 염소 F(ab')2 항-인간 IgG(Fc) PE와 30분 인큐베이션하였다. Siglec-9 발현 세포에 대한 EC50 값 (㎍/ml)을 하기에 제시한다.
Figure pct00059
실시예 12: NK 세포에서 Siglec 활성을 중화시키기 위한 인간화 항체의 능력 평가
세포독성 검정으로 51Cr-로딩된 K562 표적 세포의 용해를 직접 정량하여 NK 세포의 세포독성을 측정하였다. 간략하게, 표적 세포를 먼저 방사활성 51Cr 동위원소로 표지한 후 효과기 세포(Siglec-9를 발현하도록 형질도입된 NK 세포주 (KHYG-1 Siglec-9*))와 37℃에서 4 h 동안 공동-인큐베이션하였다. 이 시간 동안, NK 세포에 감수성인 표적 세포가 용해되어 배지 내로 51Cr을 방출하였다. 회수된 상청액 중 51Cr을 액체 신틸레이션 카운팅에 의해 측정하였다. 수득된 결과는 NK 세포에 의한 표적 세포의 용해 백분율 평가를 허용한다. 검정을 E:T 비 8/1로, 완전 RPMI 중 200 ㎕ 최종/웰로 96 U 웰 플레이트에서 수행하였다. mAb.A의 중쇄 및 경쇄 CDR을 갖는 인간화 항체 또는 mAb.D의 중쇄 및 경쇄 CDR을 갖는 인간화 항체를 10 ug/ml로 첨가하였다.
시험된 실시예 2)에서 제조된 표 2 (VH 및 VL의 조합)의 인간화 항체 각각은 용량 의존적인 방식으로 NK 세포독성의 증가를 유도하였다.
실시예 13: 점 돌연변이를 이용한 항-Siglec 항체의 에피토프
항-Siglec-9 항체의 에피토프를 정의하기 위해, 본 발명자들은 먼저 HEK293T 세포에서 태그 V5와 함께 각각의 단일 Siglec-9 도메인(V-세트 Ig-유사 도메인, Ig-유사 C2-유형 도메인 1, 및 Ig-유사 C2-유형 도메인 2)을 발현하고 각각의 단백질에 대한 항체의 결합을 평가하여 본 발명의 항체의 결합 도메인을 확인하였다.
이어서 본 발명자들은 N-말단 V-세트 Ig-유사 도메인의 표면에 걸친 분자 표면에 노출된 아미노산의 치환에 의해 정의된 Siglec-9 돌연변이체를 설계하였다. Siglec-9의 구조는 아직 풀리지 않았으나, 이용 가능한 Siglec 구조 중, Siglec-7이 가장 가까운 구성원이다(Siglec-9 아미노산 서열과 80% 초과 동일성을 가짐). 결과적으로, 본 발명자들은 Siglec-9 돌연변이체를 설계하기 위해 Siglec-7 구조를 이용하였다. SEQ ID NO: 2의 폴리펩타이드의 원상태 Siglec-9 펩타이드 리더를 치환 리더 서열 및 V5 태그(표 1에서 Siglec-9 도메인 단백질 V-세트 Ig-유사 도메인, Ig-유사 C2-유형 도메인 1, 및 Ig-유사 C2-유형 도메인 2에 나타냄), 이어서 표 1의 Siglec-9 아미노산 서열로 대체하였고, 여기에 표 3에 기재된 아미노산 치환을 포함시켰다. 단백질을 HEK293T 세포주에서 발현시켰다.
모든 도면(도 11 내지 14)은 상기 문헌[Alphey et al (2003)]에 기재된, SIGLEC-7 구조 107V의 N-말단 V-세트 Ig-유사 도메인에 대응한다. 도면은 말단 시알산 당 상에서 카복실기와의 상호작용에 대해 모든 Siglec에서 보존되는 주요 잔기인 아르기닌 124, 및 Siglec-7 및 Siglec-9 간에 보존된 주변 잔기 W132, K131, K135 및 N133을 포함하며 또한 시알산 결합에 대해 필수적인 것으로 기재되는 리간드 결합 영역을 밝은 색조로 나타낸다. W132는 시알산의 글리세롤 모이어티와 소수성 상호작용을 제공한다. 표 3에서 표적화된 아미노산 돌연변이는 Siglec-7 및 Siglec-9 둘 다에 존재하는 잔기이며, Siglec-7에 대해 SEQ ID NO: 1 또는 Siglec-9에 대해 SEQ ID NO: 2의 넘버링을 이용하여 나타낸다(야생형 Siglec-9에서의 잔기/잔기의 위치/돌연변이체에서의 잔기).
[표 3]
Figure pct00060
돌연변이체의 생성
Siglec-9 돌연변이체를 PCR에 의해 생성하였다. 증폭된 서열을 아가로스 겔 상에서 수행하고 Macherey Nagel PCR Clean-Up 겔 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 이어서 각각의 돌연변이체에 대해 생성된 정제 PCR 산물을 ClonTech InFusion™ 시스템으로 발현 벡터 내로 결찰하였다. 돌연변이된 서열을 함유하는 벡터를 Miniprep으로 제조하고 서열분석하였다. 서열분석 후, 돌연변이된 서열을 함유하는 벡터를 Promega PureYield™ 플라스미드 Midiprep 시스템을 이용하여 Midiprep™으로 제조하였다. HEK293T 세포를 DMEM 배지(Invitrogen) 중에 성장시키고, Invitrogen의 Lipofectamine™ 2000을 이용하여 벡터로 전달감염시키고 트랜스유전자 발현에 대한 평가 전 24시간 또는 48시간 동안 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션하였다.
HEK293T 전달감염된 세포로의 항-Siglec-9 결합의 유세포 측정 분석
항체 mAb4, mAb5 및 mAb6은 Ig-유사 C2-유형 도메인 1에 결합한 반면 mAbA, mAbB, mAbC, mAbD, mAbE mAbF, mAb1, mAb2 및 mAb3은 N-말단 V-세트 Ig-유사 도메인에 결합하였다. V-세트 Ig-유사 도메인 결합 항체를 유세포 측정에 의해 각각의 돌연변이체 1 내지 16으로의 이의 결합에 대해 평가하였다. 제1 실험을 수행하여 하나의 농도에서 하나 또는 몇몇 돌연변이체에 대해 이의 결합을 소실하는 항체를 결정하였다. 결합의 소실을 확인하기 위해, 그 결합이 Siglec-9 돌연변이에 의해 영향받는 것으로 보이는 항체 상에서 항체의 적정을 수행하였다. 이후 항체를 Fab' 단편으로서 추가로 시험하였는데 Fab' 단편이 결합 소실에 좀더 민감하기 때문이고, 따라서 결합 부위에 대한 것으로서 좀더 상세한 사항을 제공한다. 결과를 아래의 표 4에 나타낸다. ("+"는 결합에 대한 감소가 없음을 나타내고, "+/-"는 감소된 결합을 나타내고, "-"는 결합의 완전산 손실을 나타내고, "ND"는 수행하지 않음을 나타낸다).
어떠한 항체도 집단에서 가변하는 잔기 K100(SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 참조) 또는 K104(SEQ ID NO: 1의 Siglec-7 참조)에서의 치환을 포함하는 돌연변이체 M2에 대한 결합을 소실하지 않았다; 이에 따라, 항체는 표 1에 나타낸 Siglec-9 대립유전자(SEQ ID NO: 160)에 결합할 것이다.
항-Siglec-7 및 항-Siglec-9 특이적 항체 mAb1, mAb2 및 mAb3, 및 Siglec-9 특이적 항체 mAbE 및 mAbF는 모두 Siglec-9의 돌연변이체 M9, M10 및 M11에 대한 결합을 소실하였으나, 임의의 다른 돌연변이체에 대해서는 아니었다. 돌연변이체 9는 잔기 N78, P79, A80, R81, A82 및 V83(Siglec-9 참조)에 아미노산 치환을 함유하여, 돌연변이체의 하나 이상의, 또는 모든 잔기가 이들 항체의 코어 에피토프에 중요함을 시사한다. 돌연변이체 10은 잔기 N77, D96, H98 및 T99에 아미노산 치환을 함유하여, 돌연변이체의 하나 이상의, 또는 모든 잔기가 이들 항체의 코어 에피토프에 중요함을 시사한다. 돌연변이체 11은 잔기 W84, E85, E86 및 R88에 아미노산 치환을 함유하여, 돌연변이체의 하나 이상의, 또는 모든 잔기가 이들 항체의 코어 에피토프에 중요함을 시사한다. mAb1은, F(ab) 포맷에서의 경우, 잔기 P55, H58, E122, G124, S125, 및 K127에 아미노산 치환을 갖는 돌연변이체 7에 대한 결합을 부가적으로 감소시켰고, 돌연변이체의 잔기 중 하나 이상, 또는 모두가 상기 항체의 에피토프에 중요하다는 것을 나타낸다. mAbE 및 mAbF는, Fab' 포맷에서의 경우, 돌연변이체 8에 대한 결합을 부가적으로 감소시켰다; 돌연변이체 8은 잔기 R63, A66, N67, T68, D69, Q70 및 D71(Siglec-9 참조)에 아미노산 치환을 함유하고, 돌연변이체의 잔기 중 하나 이상, 또는 모두가 상기 항체의 에피토프에 중요하다는 것을 나타낸다. 도 11A에 제시되는 바와 같이, M9, M10 및 M11에서 치환된 잔기는 시알산 결합 부위 (밝은 색조)를 함유하는 면과 멀리 떨어져, N-말단 V-세트 Ig-유사 도메인 (짙은 색조)의 면에서 발견되고, 도 11B에 제시되는 바와 같이, M7은 시알산 결합 부위 (중간 색조)에 인접하여 발견된다. 도 11C에 제시되는 것은 M9, M10 및 M11에서 치환된 잔기가 시알산 결합 부위 (밝은 색조)를 함유하는 면을 함유하는 면과 멀리 떨어져, N-말단 V-세트 Ig-유사 도메인 (짙은 색조)의 면에서 발견되고, M8은 Siglecs의 시알 리간드 특이성을 정의하는 C-C' 루프 도메인에서 발견되고 (참고, 예를 들어, Alphey et al., 2003 J. Biol. Chem. 278(5):3372-3377), 부분적으로 리간드 결합 영역을 포괄하는 M16의 M15에 대해서는 아니다. 항체 mAb1은 따라서, C-C' 루프에 대한 결합 없이 Siglec-9를 차단하는데 큰 효능을 달성할 수 있는 반면, mAbE 및 mAbF는 C-C' 루프 도메인에서 적어도 부분적으로 결합될 수 있다.
항-Siglec-9 특이적 항체 mAbD는 돌연변이체 M6에 대한 결합을 소실하였고 돌연변이체 M7에 대한 결합을 감소시켰으나, 임의의 다른 돌연변이체에 대해서는 아니었다. 돌연변이체 6은 잔기 S47, H48, G49, W50, I51, Y52, P53 및 G54 (Siglec-9 참조)에 아미노산 치환을 함유하였고, 돌연변이체의 잔기 중 하나 이상, 또는 모두가 항체의 코어 에피토프에 중요하다는 것을 나타낸다. mAbD는, Fab' 포맷에서의 경우, 돌연변이체 7에 대한 결합을 부가적으로 소실하였고, 돌연변이체의 잔기 중 하나 이상, 또는 모두가 항체의 에피토프에 중요하다는 것을 나타낸다. 도 12에 제시되는 바와 같이, M6 (짙은 색조)에서 치환된 잔기는 시알산 결합 부위를 함유하는 N-말단 V-세트 Ig-유사 도메인 면의 상부, 그러나 리간드 결합 부위 (밝은 색조)의 외부에서 발견된다. M7은 리간드 결합 영역 내에 (밝은 색조 중에) 부분적으로 중복될 수 있는 잔기를 함유한다. M7은 잔기 P55, H58, E122, G124, S125 및 K127 (Siglec-9 참조)에 아미노산 치환을 포함하였다. 항체는 C-C' 루프 도메인 중에 돌연변이를 갖는 M8에 대한 또는 리간드 결합 영역을 부분적으로 포괄하는 M16의 M15에 대한 결합을 소실하지 않았다.
항-Siglec-9 특이적 항체 mAbA 및 mAbB는 둘다 Siglec-9의 돌연변이체 M16에 대한 결합을 소실하였으나, 임의의 다른 돌연변이체에 대해서는 아니었다. 돌연변이체 16은 잔기 K131 및 H136 (Siglec-9 참조)에 아미노산 치환을 함유하였고, 돌연변이체의 잔기 중 하나 이상, 또는 모두가 이들 항체의 코어 에피토프에 중요하다는 것을 나타낸다. mAbA 및 mAbB는, Fab' 포맷에서의 경우, 잔기 R120, W128 및 N129A에 아미노산 치환을 갖는, 돌연변이체 14에 대한 결합을 부가적으로 소실하였고, 돌연변이체의 잔기 중 하나 이상, 또는 모두가 이들 항체의 에피토프에 중요하다는 것을 나타낸다. 흥미롭게도, M14 및 M16이 Siglec-9의 시알산 리간드 접촉 부위에 근접하거나 내부에 있는 반면 (M16에 대해서 도 13A 및 M14 및 M16에 대해서 도 13B를 참고함), 항체는 M8 (C-C' 루프 도메인 돌연변이체)에 대해서나 M15에 대한 결합도 소실하지 않았다. 항체는 따라서 Siglec-9의 차단에 있어서, 게다가 시알산 접촉 영역 내에서, 그러나 C-C' 루프에 대한 결합 없이 큰 효능을 달성한다.
다른 한편 항체 mAbC는 Siglec-9의 돌연변이체 M8 (즉, C-C' 루프 내)에 대한 결합을 소실하였고, M15 또는 M16에 대한 결합을 완전히 소실하지 않았으나 M15 및 M16에 대한 결합이 감소되었으나, mAbC는 M6, M7 또는 M8에 대해서나, M9, M10 또는 M11에 대해서는 (또는 임의의 기타 돌연변이체에 대해서는) 결합을 소실하거나 감소시키지 않았다. 돌연변이체 8은 잔기 R63, A66, N67, T68, D69, Q70 및 D71 (Siglec-9 참조)에 아미노산 치환을 함유하고, 돌연변이체의 잔기 중 하나 이상, 또는 모두가 이들 항체의 에피토프에 중요하다는 것을 나타낸다. mAbC는, Fab' 포맷에서의 경우 돌연변이체 16 (잔기 K131 및 H136에서의 아미노산 치환을 갖는)에 대한 결합을 소실하였고, 돌연변이체 14 (잔기 R120, W128 및 N129에서의 아미노산 치환을 갖는) 및 돌연변이체 15 (잔기 H133, R134, R116 및 S27에서의 아미노산 치환을 갖는)에 대한 결합은 감소하였고, 이들 돌연변이체의 잔기 중 하나 이상, 또는 모두가 항체의 에피토프에 중요하다는 것을 나타낸다. M8에서 돌연변이된 잔기를 도 14A에 제시한다. M8, M14, M15 및 M16에서 돌연변이된 잔기를 도 14B에 제시한다. 항체는 따라서 Siglecs의 시알산 특이성을 정의하는 C-C' 루프 도메인에 포함하는, 시알산 접촉 영역 중의 잔기에 결합한다.
[표 4]
Figure pct00061
본원에서 인용된 공보, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 참고문헌은 이들의 전문이 참조로, 그리고 각각의 참고문헌이 참조로 포함됨을 개별적이고 구체적으로 나타내고, 본원에서 다른 곳에서 수행된 특정 문헌에 대한 임의의 별도로 제공된 포함과 무관하게, 본원에 그 전문(법에서 허용되는 최대 정도까지)을 나타낸 것과 동일한 정도로 본원에 포함된다.
본 발명의 기재의 맥락에서 부정관사("a" 및 "an") 및 정관사("the") 및 유사한 지시 대상 용어의 이용은 본원에서 달리 나타내거나 문맥 상 명확히 금기되지 않는 한, 단수 및 복수를 모두 포괄하는 것으로 간주되어야 한다.
달리 언급되지 않는 한, 본원에서 제공되는 모든 정확한 값은 대응하는 근사값을 대표한다(예로, 특정한 인자 또는 측정에 대해 제공되는 모든 정확한 예시 값은 적절한 경우, "약"에 의해 수식되는, 대응하는 근사 측정을 또한 제공하는 것으로 간주될 수 있다). "약"이 수치와 연계되어 이용되는 경우, 이는 명시된 수치의 ±10%에 대응하는 값을 포함하는 것으로 명시될 수 있다.
요소 또는 요소들에 대해 "포함하는", "갖는", "포함되는" 또는 "함유하는"과 같은 용어를 이용하는 본 발명의 임의의 양태 또는 구현예의 본원에서의 기재는 달리 언급되거나 문맥 상 명확히 금기되지 않는 한, 특정 요소 또는 요소들"로 구성되는", "로 본질적으로 구성되는" 또는 "을 실질적으로 포함하는" 본 발명의 유사한 양태 또는 구현예에 대한 뒷받침을 제공하려는 것이다(예로, 특정 요소를 포함하는 것으로 본원에 기재된 조성물은 달리 나타내거나 문맥 상 명확히 금기되지 않는 한, 해당 요소로 구성되는 조성물을 또한 기재하는 것으로 이해되어야 한다).
본원에서 제공된 임의의 모든 예 또는 예시적 언어(예로, "예컨대")의 이용은 단순히 본 발명을 더 잘 예시하기 위한 것이며, 달리 청구되지 않는 한, 본 발명의 범위에 제한을 부과하지 않는다. 명세서에서의 어떤 말도 임의의 청구되지 않은 요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 시사하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
SEQUENCE LISTING <110> INNATE PHARMA <120> SIGLEC NEUTRALIZING ANTIBODIES <130> Sig794 <150> US 62/530,463 <151> 2017-07-10 <150> US 62/554,750 <151> 2017-09-06 <160> 200 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 467 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Gly Arg Glu Arg Val 1 5 10 15 Glu Gly Gln Lys Ser Asn Arg Lys Asp Tyr Ser Leu Thr Met Gln Ser 20 25 30 Ser Val Thr Val Gln Glu Gly Met Cys Val His Val Arg Cys Ser Phe 35 40 45 Ser Tyr Pro Val Asp Ser Gln Thr Asp Ser Asp Pro Val His Gly Tyr 50 55 60 Trp Phe Arg Ala Gly Asn Asp Ile Ser Trp Lys Ala Pro Val Ala Thr 65 70 75 80 Asn Asn Pro Ala Trp Ala Val Gln Glu Glu Thr Arg Asp Arg Phe His 85 90 95 Leu Leu Gly Asp Pro Gln Thr Lys Asn Cys Thr Leu Ser Ile Arg Asp 100 105 110 Ala Arg Met Ser Asp Ala Gly Arg Tyr Phe Phe Arg Met Glu Lys Gly 115 120 125 Asn Ile Lys Trp Asn Tyr Lys Tyr Asp Gln Leu Ser Val Asn Val Thr 130 135 140 Ala Leu Thr His Arg Pro Asn Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Ser 145 150 155 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Phe Cys Val Ile Phe Ile Val Val Arg Ser Cys Arg Lys Lys Ser Ala 370 375 380 Arg Pro Ala Ala Asp Val Gly Asp Ile Gly Met Lys Asp Ala Asn Thr 385 390 395 400 Ile Arg Gly Ser Ala Ser Gln Gly Asn Leu Thr Glu Ser Trp Ala Asp 405 410 415 Asp Asn Pro Arg His His Gly Leu Ala Ala His Ser Ser Gly Glu Glu 420 425 430 Arg Glu Ile Gln Tyr Ala Pro Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Pro Gln 435 440 445 Asp Leu Ser Gly Gln Glu Ala Thr Asn Asn Glu Tyr Ser Glu Ile Lys 450 455 460 Ile Pro Lys 465 <210> 2 <211> 463 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Gly Arg Glu Arg Ala Glu 1 5 10 15 Gly Gln Thr Ser Lys Leu Leu Thr Met Gln Ser Ser Val Thr Val Gln 20 25 30 Glu Gly Leu Cys Val His Val Pro Cys Ser Phe Ser Tyr Pro Ser His 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Pro Val Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Glu 50 55 60 Gly Ala Asn Thr Asp Gln Asp Ala Pro Val Ala Thr Asn Asn Pro Ala 65 70 75 80 Arg Ala Val Trp Glu Glu Thr Arg Asp Arg Phe His Leu Leu Gly Asp 85 90 95 Pro His Thr Lys Asn Cys Thr Leu Ser Ile Arg Asp Ala Arg Arg Ser 100 105 110 Asp Ala Gly Arg Tyr Phe Phe Arg Met Glu Lys Gly Ser Ile Lys Trp 115 120 125 Asn Tyr Lys His His Arg Leu Ser Val Asn Val Thr Ala Leu Thr His 130 135 140 Arg Pro Asn Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Ser Gly Cys Pro Gln 145 150 155 160 Asn Leu Thr Cys Ser Val Pro Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro 165 170 175 Met Ile Ser Trp Ile Gly Thr Ser Val Ser Pro Leu Asp Pro Ser Thr 180 185 190 Thr Arg Ser Ser Val Leu Thr Leu Ile Pro Gln Pro Gln Asp His Gly 195 200 205 Thr Ser Leu Thr Cys Gln Val Thr Phe Pro Gly Ala Ser Val Thr Thr 210 215 220 Asn Lys Thr Val His Leu Asn Val Ser Tyr Pro Pro Gln Asn Leu Thr 225 230 235 240 Met Thr Val Phe Gln Gly Asp Gly Thr Val Ser Thr Val Leu Gly Asn 245 250 255 Gly Ser Ser Leu Ser Leu Pro Glu Gly Gln Ser Leu Arg Leu Val Cys 260 265 270 Ala Val Asp Ala Val Asp Ser Asn Pro Pro Ala Arg Leu Ser Leu Ser 275 280 285 Trp Arg Gly Leu Thr Leu Cys Pro Ser Gln Pro Ser Asn Pro Gly Val 290 295 300 Leu Glu Leu Pro Trp Val His Leu Arg Asp Ala Ala Glu Phe Thr Cys 305 310 315 320 Arg Ala Gln Asn Pro Leu Gly Ser Gln Gln Val Tyr Leu Asn Val Ser 325 330 335 Leu Gln Ser Lys Ala Thr Ser Gly Val Thr Gln Gly Val Val Gly Gly 340 345 350 Ala Gly Ala Thr Ala Leu Val Phe Leu Ser Phe Cys Val Ile Phe Val 355 360 365 Val Val Arg Ser Cys Arg Lys Lys Ser Ala Arg Pro Ala Ala Gly Val 370 375 380 Gly Asp Thr Gly Ile Glu Asp Ala Asn Ala Val Arg Gly Ser Ala Ser 385 390 395 400 Gln Gly Pro Leu Thr Glu Pro Trp Ala Glu Asp Ser Pro Pro Asp Gln 405 410 415 Pro Pro Pro Ala Ser Ala Arg Ser Ser Val Gly Glu Gly Glu Leu Gln 420 425 430 Tyr Ala Ser Leu Ser Phe Gln Met Val Lys Pro Trp Asp Ser Arg Gly 435 440 445 Gln Glu Ala Thr Asp Thr Glu Tyr Ser Glu Ile Lys Ile His Arg 450 455 460 <210> 3 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Gly Gly 20 25 30 Phe Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Thr Leu Glu Trp 35 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Mus musculus <400> 19 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Glu Met Asn Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asp Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Val Arg Asp Asp Tyr Gly Arg Ser Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 20 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Asn Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Lys Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 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Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly His Thr Asn Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Gly Val Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Asp Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 182 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric <400> 182 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Val Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Gly Val Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Asp Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 183 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric <400> 183 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Thr Phe Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 184 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric <400> 184 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Thr Phe Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 185 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric <400> 185 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Thr Phe Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 186 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric <400> 186 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Asp Tyr Gly Arg Ser Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 187 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric <400> 187 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Glu Met Asn Trp Val Arg Glu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Asp Tyr Gly Arg Ser Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 188 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric <400> 188 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Glu Met Asn Trp Val Arg Glu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Asp Asp Tyr Gly Arg Ser Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 189 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric <400> 189 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Glu Met Asn Trp Val Arg Glu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Val Arg Asp Asp Tyr Gly Arg Ser Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 190 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric <400> 190 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Lys Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys His Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 191 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric <400> 191 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Lys Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys His Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 192 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric <400> 192 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ile Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Phe Asp Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 193 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric <400> 193 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ile Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Phe Asp Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 194 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric <400> 194 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ile Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Phe Asp Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 195 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric <400> 195 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Thr Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Phe Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 196 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric <400> 196 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Thr Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Phe Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 197 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric <400> 197 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Thr Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Phe Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 198 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 198 Ser Tyr Trp Ile His 1 5 <210> 199 <211> 17 <212> PRT <213> mus musculus <400> 199 Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly His Thr Asn Tyr Ala Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Thr <210> 200 <211> 11 <212> PRT <213> mus musculus <400> 200 Gln Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Asn 1 5 10

Claims (53)

  1. 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하고 인간 NK 세포에 의해 발현되는 Siglec-9 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시킬 수 있는 항체로서, 항체는 Fab' 단편으로서, 잔기 K131 및 H132에 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합, 및 잔기 R120, W128, 및 N129에 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합이; SEQ ID NO: 2의 야생형 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합에 비해 감소되고, 아미노산 잔기는 SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 폴리펩타이드를 참조로 나타내는 것을 특징으로 하는 항체.
  2. 제 1 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 15에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGHV1-69 (또는 선택적으로 IGHV1-46) 유전자 분절의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 SEQ ID NO: 16에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL) 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGKV1-33 유전자 분절의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NOS: 170, 171, 172 및 173, 각각에 제시된 mAbA H0, H1, H2 또는 H3 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 SEQ ID NOS: 174, 175 및 176, 각각에 제시된 mAbA L0, L1 또는 L2 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체.
  4. 제 1 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 17에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGHV169 (또는 선택적으로 IGHV1-46) 유전자 분절의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 SEQ ID NO: 18에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL) 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGKV1-33 유전자 분절의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항체.
  5. 제 1 항 또는 제 4 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NOS: 177, 178, 179, 180, 181 및 182, 각각에 제시된 mAbB H0, H1, H2, H3, H4 또는 H5 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 SEQ ID NOS: 183, 184 및 185, 각각에 제시된 mAbB L0, L1 또는 L2 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체.
  6. 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하고 인간 NK 세포에 의해 발현되는 Siglec-9 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시킬 수 있는 항체로서, 항체는 Fab' 단편으로서, 잔기 P55, H58, E122, G124, S125 및 K127에 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합; 잔기 N78, P79, A80, R81, A82 및 V83에 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합; 잔기 N77, D96, H98 및 T99에 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합; 및 잔기 W84, E85, E86 및 R88에 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합이; SEQ ID NO: 2의 야생형 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합에 비해 감소되고, 아미노산 잔기는 SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 폴리펩타이드를 참조로 나타내는 것을 특징으로 하는 항체.
  7. 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하고 인간 NK 세포에 의해 발현되는 Siglec-9 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시킬 수 있는 항체로서, 항체는 Fab' 단편으로서, 잔기 R63, A66, N67, T68, D69, Q70 및 D71에 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합; 잔기 N78, P79, A80, R81, A82 및 V83에 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합; 잔기 N77, D96, H98 및 T99에 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합; 및 잔기 W84, E85, E86 및 R88에 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합이; SEQ ID NO: 2의 야생형 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합에 비해 감소되고, 아미노산 잔기는 SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 폴리펩타이드를 참조로 나타내는 것을 특징으로 하는 항체.
  8. 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하고 인간 NK 세포에 의해 발현되는 Siglec-9 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시킬 수 있는 항체로서, 항체는 Fab' 단편으로서, 잔기 S47, H48, G49, W50, I51, Y52, P53 및 G54에 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합; 및 잔기 P55, H58, E122, G124, S125 및 K127에 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합이; SEQ ID NO: 2의 야생형 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합에 비해 감소되고, 아미노산 잔기는 SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 폴리펩타이드를 참조로 나타내는 것을 특징으로 하는 항체.
  9. 제 8 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 21에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGHV7-4-1 유전자 분절 (선택적으로 IGHJ6 유전자 분절과 조합으로)의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 SEQ ID NO: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL) 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGKV1-39 유전자 분절의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항체.
  10. 제 9 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NOS: 186, 187 및 188, 각각에 제시된 mAbD H0, H1 또는 H2 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 SEQ ID NOS: 189, 190 및 191, 각각에 제시된 mAbD L0, L1 또는 L2 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체.
  11. 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하고 인간 NK 세포에 의해 발현되는 Siglec-9 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시킬 수 있는 항체로서, 항체는 Fab' 단편으로서, 잔기 K131 및 H132에 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합; 및 잔기 R63, A66, N67, T68, D69, Q70 및 D71에 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합이; SEQ ID NO: 2의 야생형 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합에 비해 감소되고, 아미노산 잔기는 SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 폴리펩타이드를 참조로 나타내는 것을 특징으로 하는 항체.
  12. 제 11 항에 있어서, 항체가 추가로 F(ab) 단편으로서, 잔기 S27, R116, H133 및 R134에 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합이; SEQ ID NO: 2의 야생형 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합에 비해 감소되고, 아미노산 잔기는 SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 폴리펩타이드를 참조로 나타내는 것을 특징으로 하는 항체.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 항체가 추가로 Fab' 단편으로서, 잔기 R120, W128 및 N129에 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합이; SEQ ID NO: 2의 야생형 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합에 비해 감소되고, 아미노산 잔기는 SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 폴리펩타이드를 참조로 나타내는 것을 특징으로 하는 항체.
  14. 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 19에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (VH) 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGHV7-4-1 유전자 분절의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 SEQ ID NO: 20에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (VL) 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGKV7-3 유전자 분절의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항체.
  15. 제 10 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NOS: 192, 193, 194 및 195, 각각에 제시된 mAbC H0, H1, H2 또는 H3 가변 도메인 중 임의의 것의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 SEQ ID NOS: 196 및 197, 각각에 제시된 mAbC L0 또는 L1 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체.
  16. 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하고 인간 NK 세포에 의해 발현되는 Siglec-9 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시킬 수 있는 제제로서, 제제는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL) 조합을 포함하는 항원 결합 도메인을 포함하는 제제:
    SEQ ID NO: 15에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGHV1-69 (또는 선택적으로 IGHV1-46) 유전자 분절의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 VH, 및 SEQ ID NO: 16에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGKV1-33 유전자 분절의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 VL;
    SEQ ID NO: 17에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGHV1-69 (또는 선택적으로 IGHV1-46) 유전자 분절의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 VH, 및 SEQ ID NO: 18에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGKV1-33 유전자 분절의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 VL;
    SEQ ID NO: 19에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGHV7-4-1 유전자 분절의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 VH, 및 SEQ ID NO: 20에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGKV7-3 유전자 분절의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 VL; 및
    SEQ ID NO: 21에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGHV7-4-1 유전자 분절 (선택적으로 IGHJ6 유전자 분절과 조합으로)의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 VH, 및 SEQ ID NO: 22에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 인간 IGKV1-39 유전자 분절의 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 VL.
  17. 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하고 인간 NK 세포에 의해 발현되는 Siglec-9 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시킬 수 있는 제제로서, 제제는 SEQ ID NOS: 170, 171, 172 및 173, 각각에 제시된 mAbA H0, H1, H2 또는 H3 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 SEQ ID NOS: 174, 175 및 176, 각각에 제시된 mAbA L0, L1 또는 L2 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항원 결합 도메인을 포함하는 제제.
  18. 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하고 인간 NK 세포에 의해 발현되는 Siglec-9 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시킬 수 있는 제제로서, 제제는 SEQ ID NOS: 177, 178, 179, 180, 181 및 182, 각각에 제시된 mAbB H0, H1, H2, H3, H4 또는 H5 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 SEQ ID NOS: 183, 184 및 185, 각각에 제시된 mAbB L0, L1 또는 L2 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항원 결합 도메인을 포함하는 제제.
  19. 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하고 인간 NK 세포에 의해 발현되는 Siglec-9 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시킬 수 있는 제제로서, 제제는 SEQ ID NOS: 192, 193, 194 및 195, 각각에 제시된 mAbC H0, H1, H2 또는 H3 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 SEQ ID NOS: 196 및 197, 각각에 제시된 mAbC L0 또는 L1 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항원 결합 도메인을 포함하는 제제.
  20. 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하고 인간 NK 세포에 의해 발현되는 Siglec-9 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시킬 수 있는 제제로서, 제제는 SEQ ID NOS: 186, 187 및 188, 각각에 제시된 mAbD H0, H1 또는 H2 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 SEQ ID NOS: 189, 190 및 191, 각각에 제시된 mAbD L0, L1 또는 L2 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% (또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항원 결합 도메인을 포함하는 제제.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 제제 또는 항체가 인간 또는 인간화 항체인 제제 또는 항체.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 제제 또는 항체가 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 2가 결합을 할 수 있는 모노클로날 항체 또는 항체 단편인 제제 또는 항체.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 제제 또는 항체가, Siglec-9를 발현하는 NK 세포가 인간 공여체로부터 정제되고 Siglec-9의 시알산 리간드를 발현하는 표적 세포와 인큐베이션되는, 표준 4시간 시험관내 51Cr 방출 세포독성 검정에서 NK 세포의 세포독성을 증강시키고/시키거나 복원하는 제제 또는 항체.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 그 표면에 시알산과의 시스-상호작용에 관여되는 Siglec-9 폴리펩타이드를 보유하는 인간 moDC에 의해 발현되는 Siglec-9 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시킬 수 있는 제제 또는 항체.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체에 CD16 인간 Fcγ 수용체에 결합하는 능력이 결여된 제제 또는 항체.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체에 인간 CD16A, CD16B, CD32A, CD32B 및 CD64에 결합하는 능력이 결여된 제제 또는 항체.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 Siglec-9 폴리펩타이드 및 이의 시알산 리간드 간 상호작용을 실질적으로 차단하지 않는 제제 또는 항체.
  28. 제 27 항에 있어서, 시알산 리간드가 Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb를 포함하는 제제 또는 항체.
  29. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 Siglec-9 폴리펩타이드 및 이의 시알산 리간드 간 상호작용을 실질적으로 차단하는 제제 또는 항체.
  30. 제 29 항에 있어서, 항체가 (a) 인간 Siglec-9 폴리펩타이드 및 Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb 간 상호작용을 실질적으로 차단하고, (b) 인간 Siglec-9 폴리펩타이드 및 6'-시알릴락토스 간 상호작용을 실질적으로 차단하는 제제 또는 항체.
  31. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 제제가, NK 세포가 표적 세포 표면 상에 Siglec의 리간드를 갖는 표적 인간 세포와 접촉될 때 인간 공여체로부터 정제된 Siglec-발현 NK 세포 내의 세포독성 및/또는 세포독성과 연관된 마커에서의 증가를 야기하는 제제 또는 항체.
  32. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 제제가 잔기 K131 및/또는 H132에 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합이; SEQ ID NO: 2의 야생형 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합에 비해 감소되고, 아미노산 잔기는 SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 폴리펩타이드를 참조로 나타내는 것을 특징으로 하는 제제 또는 항체.
  33. 제 1 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 제제가 하기 중 임의의 것의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 조합을 포함하는 제제 또는 항체: mAbA H0L0, mAbA H0L1, mAbA H0L2, mAbA H1L0, mAbA H1L1, mAbA H1L2, mAbA H2L0, mAbA H2L1, mAbA H2L2, mAbA H3L0, mAbA H3L1, 또는 mAbA H3L2.
  34. 제 1 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 제제가 하기 중 임의의 것의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 조합을 포함하는 항체 또는 제제: mAbB H0L0, mAbB H0L1, mAbB H0L2, mAbB H1L0, mAbB H1L1, mAbB H1L2, mAbB H2L0, mAbB H2L1, mAbB H2L2, mAbB H3L0, mAbB H3L1, mAbB H3L2, mAbB H4L0, mAbB H4L1, mAbB H4L2, mAbB H5L0, mAbB H5L1 또는 mAbB H5L2.
  35. 제 1 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 제제가 잔기 S47, H48, G49, W50, I51, Y52, P53 및/또는 G54에 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합이; SEQ ID NO: 2의 야생형 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 결합에 비해 감소되고, 아미노산 잔기는 SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 폴리펩타이드를 참조로 나타내는 것을 특징으로 하는 항체 또는 제제.
  36. 제 1 항 내지 제 32 항 또는 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 제제가 하기 중 임의의 것의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 조합을 포함하는 항체 또는 제제: mAbD H0L0, mAbD H0L1, mAbD H0L2, mAbD H1L0, mAbD H1L1, mAbD H1L2, mAbD H2L0, mAbD H2L1 또는 mAbD H2L2.
  37. 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 제제가 Fc 도메인 및 Fcγ 수용체 간 결합을 감소시키도록 변형된 Fc 도메인을 갖는 항체인 항체 또는 제제.
  38. 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 제제가 항체 단편, 선택적으로 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 디아바디, 단일쇄 항체 단편으로부터 선택되는 단편, 또는 복합적인 상이한 항체 단편을 포함하는 다중특이적 항체인 항체.
  39. 제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 검출 가능한 모이어티에 콘쥬게이션되거나 공유 결합되는 항체 또는 제제.
  40. 제 1 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항의 항체 또는 제제, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  41. 제 1 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항의 항체 또는 제제를 포함하며, 선택적으로 제 1 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항의 항체를 특이적으로 인식하는 표지된 제2 항체를 추가로 포함하는 키트.
  42. 제 1 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 도메인의 중쇄 및/또는 경쇄를 인코딩하는 핵산.
  43. 제 1 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 도메인을 생산하는 재조합 숙주 세포.
  44. 질병의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에서 질병의 치료 또는 예방 방법으로서, 상기 환자에게 유효량의 제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항의 항체 또는 제 40 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  45. 제 44 항에 있어서, 상기 질병이 암, 선택적으로 ST3GAL1 및/또는 ST3GAL6 효소의 발현을 특징으로 하는 암인 방법.
  46. 대상체에서의 CD56dim NK 세포 및/또는 CD56bright NK 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 조정 방법으로서, 상기 대상체에 유효량의 제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항의 항체 또는 제 40 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  47. 단핵구-유래 세포 및/또는 림프구, 선택적으로 CD56dim NK 세포, CD56bright NK 세포 및/또는 CD8 + T 세포 활성의 시험관내 조정 방법으로서, Siglec 7 및/또는 Siglec-9를 발현하는 단핵구-유래 세포 및/또는 림프구를 제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항의 항체 또는 제 40 항의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  48. 질병을 갖는 대상체로부터의 NK 세포 활성의 시험관내 평가 방법으로서, NK 세포를 포함하는 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계, 상기 세포를 제 1 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항의 항체와 접촉시키는 단계 및 항체가 NK 세포의 활성을 조정하는지 여부를 평가하는 단계를 포함하는 방법.
  49. 림프구, 선택적으로 CD56dim NK 세포, CD56bright NK 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 확인 방법으로서, 세포를 포함하는 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계, 상기 세포를 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항의 항체와 접촉시키는 단계 및 항체가 세포에 결합하는지 여부를 평가하는 단계를 포함하는 방법.
  50. 제 47 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 질병, 선택적으로 암을 갖는 대상체로부터 수득되는 생물학적 샘플에 존재하는 방법.
  51. 제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항의 항체 또는 제제 또는 제 40 항의 조성물로의 치료에 반응하는 암을 갖는 대상체의 선택 방법으로서, 상기 대상체에서 암 세포가 Siglec-7 또는 Siglec-9의 리간드를 발현하는지 여부, 선택적으로 암 세포가 상승된 수준의 Siglec-7 또는 Siglec-9의 리간드를 발현하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, Siglec-7 또는 Siglec-9의 시알산 리간드(들)의 발현, 또는 상승된 수준의 Siglec-7 또는 Siglec-9의 시알산 리간드(들)은 반응체 대상체임을 나타내는 방법.
  52. 제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항의 항체 또는 제제 또는 제 40 항의 조성물로의 치료에 반응하는 암을 갖는 대상체의 선택 방법으로서, 상기 대상체에서 암 세포가 ST3GAL1 및/또는 ST3GAL6 효소(또는 ST3GAL1 및/또는 ST3GAL6 효소 활성)를 발현하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, ST3GAL1 및/또는 ST3GAL6 효소의 발현, 또는 상승된 수준의 ST3GAL1 및/또는 ST3GAL6 효소(또는 ST3GAL1 및/또는 ST3GAL6 효소 활성)가 반응체 대상체임을 나타내는 방법.
  53. 제 50 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 반응체 대상체에 제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항의 항체 또는 제 40 항의 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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