艰难梭菌抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年8月22日提交的美国临时申请第61/526031号的优先权,该临时申请的内容以其整体通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及针对艰难梭菌毒素A的单克隆抗体,本发明还涉及用于治疗或预防脊椎动物受试者中细菌艰难梭菌感染的组合物和方法。提供的方法用于对脊椎动物受试者施用有效量的抗体以减少、消除或预防感染复发。提供了治疗或预防生物体中艰难梭菌感染的方法。
背景技术
艰难梭菌(C.difficile)是常见的医院病原体,并且是世界范围内住院患者的发病率和死亡率的主要原因。Kelly等人,New Eng.J.Med.,330:257-62,1994。广谱抗生素增加的使用和艰难梭菌异常毒性株的出现导致了这样的想法,即疫苗可能非常适合于减少与这种细菌有关的疾病和死亡。艰难梭菌几乎不具有传统的抗生素选择,并经常导致复发性疾病(占25%)。艰难梭菌每年仅在美国就导致约20,000人死亡,并导致约50,000例确诊感染。近日,产生更多毒素的毒性更强的艰难梭菌菌株已经出现,如B1/NAB1/027株,其还具有降低的甲硝唑敏感性。艰难梭菌的爆发迫使病房和部分医院关闭。随着老年人口的增加以及人口统计数据的变化,艰难梭菌将成为21世纪的一个主要的问题。艰难梭菌疾病的范围从无症状带菌者至轻度腹泻至暴发性伪膜性结肠炎。
艰难梭菌具有二相性(dimorphic)生命周期,借此其既以传染性且坚韧的孢子形式存在,又以具有代谢活性的产生毒素的营养细胞的形式存在。艰难梭菌相关疾病(CDAD)被认为是由营养细胞并且更具体是由两种毒素肠毒素毒素A和细胞毒素毒素B的作用而引起的。用于艰难梭菌的疫苗和疗法目前集中于毒素(A和B)、A和B的类毒素、A和B的重组片段和营养细胞表层蛋白(SLPA)。
毒素A是具有多个功能域的高分子量蛋白。该毒素被分成4个功能域:氨基末端的葡萄糖基转移酶,其修饰导致上皮细胞中细胞骨架调节异常的Rho样GTP酶;自催化半胱氨酸蛋白酶结构域;疏水跨膜序列和高度重复的羧基末端宿主细胞结合域。羧基末端结构域锚定毒素到肠上皮细胞上的宿主细胞糖受体,其启动了内化过程,借此递送氨基末端酶结构域到靶细胞的细胞质中。酶结构域和葡萄糖基转移酶活性的递送导致由中毒细胞的凋亡性细胞死亡引起的腹泻和炎症。
许多研究显示了抗毒素的抗体对影响疾病结果的重要性。研究还显示了血清抗毒素A抗体与对CDAD和复发的保护之间的相关性。这些研究产生了用于CDAD的毒素mAb疗法。
尽管取得了这些进步,仍未满足对于包括CDAD复发的预防的艰难梭菌相关感染的有效治疗和/或预防的需要。本发明提供了针对毒素A的小鼠和人源化抗体以满足这些需要和其它的需要。
发明内容
本发明提供了抗体或其抗原结合部分,其结合艰难梭菌(C.difficile)的毒素A。抗体或其抗原结合部分可结合于艰难梭菌毒素A的片段4上。
在一个实施方式中,本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其包括重链区和轻链区,其中重链区包含3个互补决定区(CDR):CDR1、CDR2和CDR3,其氨基酸序列分别与SEQ ID NO:29、30和31中所述的氨基酸序列具有约80%至约100%的同源性,并且其中轻链区包含3个CDR:CDR1、CDR2和CDR3,其氨基酸序列分别与SEQ ID NO:21、22和23中所述的氨基酸序列具有约80%至约100%的同源性。
本发明还提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其结合艰难梭菌毒素A并包含重链区,其中重链区包含3个CDR:CDR1、CDR2和CDR3,其氨基酸序列分别与SEQ ID NO:29、30和31中所述的氨基酸序列具有约80%至约100%的同源性。
本发明进一步提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其结合艰难梭菌毒素A并包含轻链区,其中轻链区包含3个CDR:CDR1、CDR2和CDR3,其氨基酸序列分别与SEQ IDNO:21、22和23中所述的氨基酸序列具有约80%至约100%的同源性。
抗体或其抗原结合部分可以具有小于约1×10-11M的解离常数(KD)。抗体或者其抗原结合部分可以是人源化的或嵌合的。
在一个实施方式中,抗体或其抗原结合部分的重链区包含与SEQ ID NO:89中所述的氨基酸序列具有约80%至约100%的同源性的氨基酸序列;抗体或其抗原结合部分的轻链区包含与SEQ ID NO:91中所述的氨基酸序列具有约80%至约100%的同源性的氨基酸序列。
在另一个实施方式中,抗体或其抗原结合部分的重链区包含与SEQ ID NO:93中所述的氨基酸序列具有约80%至约100%的同源性的氨基酸序列;抗体或其抗原结合部分的轻链区包含与SEQ ID NO:95中所述的氨基酸序列具有约80%至约100%的同源性的氨基酸序列。
抗体或其抗原结合部分可以如下所示:(a)整个免疫球蛋白分子;(b)scFv;(c)Fab片段;(d)F(ab')2;和(e)二硫化物连接的Fv。
抗体或其抗原结合部分可以包括至少一个恒定结构域,其选自:a)IgG恒定结构域;和(b)IgA恒定结构域。
本发明的一个实施方式提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其结合艰难梭菌毒素A并包含重链可变区,其中重链可变区包含与SEQ ID NO:12、28、44或60中所述的氨基酸序列具有约80%至约100%同源性的氨基酸序列。
本发明的另一个实施方式提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其结合艰难梭菌毒素A并包含轻链可变区,其中轻链可变区包含与SEQ ID NO:4、20、36或52中所述的氨基酸序列具有约80%至约100%同源性的氨基酸序列。
本发明的另一个实施方式还提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其中抗体或其抗原结合部分结合包含重链可变区和轻链可变区的抗体识别的艰难梭菌毒素A的相同表位,该重链可变区和轻链可变区分别具有与SEQ ID NO:28和20中所述的氨基酸序列具有约80%至约100%同源性的氨基酸序列。
本发明还包括由命名为CAN20G2的杂交瘤所产生的抗体和命名为CAN20G2的杂交瘤。
本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其中,在体内毒素A攻毒试验中,在将哺乳动物暴露于大于约100ng的艰难梭菌毒素A之前约24小时,以约8mg/kg体重至约13mg/kg体重的剂量范围对哺乳动物施用抗体或其抗原结合部分时,哺乳动物在约7天内的存活机会大于约80%。
本发明也包括分离的单克隆抗体或其抗原结合部分,其中在体外中和试验中,抗体或其抗原结合部分在约4μM至约17μM的浓度范围中和大于约40%的约150ng/ml的艰难梭菌毒素A。
本发明提供了分离的核酸,其编码包含与SEQ ID NO:12、28、44、60、4、20、36或52中所述的氨基酸序列具有约80%至约100%同源性的氨基酸序列的肽。本发明还提供了分离的核酸,其包含与SEQ ID NO:68、69、70、71、72、73、74或75中所述的核酸序列具有约80%至约100%同源性的核酸序列。还提供了包含任何这些核酸的细胞。该细胞可以是细菌细胞或真核细胞,如哺乳动物细胞。细胞的非限制性实例包括COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、SP2/0、HeLa、骨髓瘤或淋巴瘤细胞。
本发明提供了包含抗体或其抗原结合部分和至少一种药学上可接受的载体的组合物。
本发明提供了用于预防或治疗艰难梭菌相关疾病的方法,其包括对受试者施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合部分。抗体或其抗原结合部分可以以静脉内、皮下、肌内或经皮进行给药。方法可以包含对受试者施用第二药剂的另一个步骤。例如,第二药剂可以是不同的抗体或其片段,或者可以是抗生素,如万古霉素、甲硝唑或非达霉素(fidaxomicin)。
附图说明
图1显示了标准化的ELISA,其显示了纯化的鼠mAb对艰难梭菌毒素A的反应性。
图2是ELISA,其显示了纯化的1μg/ml CAN19mAb对毒素A(ToxA)及毒素A片段4(ToxAF4)的结合活性。ToxB是毒素B;ToxBF4是毒素B片段4。
图3是ELISA分析,其显示了纯化的1μg/ml鼠CAN20mAb对毒素A和毒素A片段4的结合活性。
图4显示了纯化的鼠CAN19mAb(0.5μg/ml)的Western免疫印迹。泳道1:毒素A;泳道2:类毒素A;泳道4:毒素A片段4;泳道5:毒素B;泳道7:毒素B片段4;泳道8:PiLF(阴性对照)。预期大小:毒素A(308kDa);毒素A片段4(114kDa);毒素B(280kDa)。
图5显示了纯化的CAN20克隆(1μg/ml)的Western免疫印迹。用CAN20G1探测印迹A,用CAN20G2探测印迹B,用CAN20G5探测印迹C,用Can20G8探测印迹D。(泳道1:毒素A(308kDa);泳道2:毒素A片段4(114kDa);泳道3:毒素B(280kDa);泳道4:破伤风类毒素)。
图6a是表位框并(binning)图,其显示了生物素化的CAN20G1抗体结合至SA(链霉亲和素)生物传感器上。结合的抗体再与游离毒素A和游离CAN20G1进行孵育。CAN20G1-毒素A复合物再与游离抗体进行孵育。在波长上的大的nm转变将指示分析物的结合,其表明CAN20G1和游离抗体具有不同的表位。1,生物素化的CAN20G1到SA生物传感器。2,游离的完整毒素A与CAN20G1形成复合物。3,游离的CAN20G1与生物素化的CAN20G1-毒素A复合物相联。4,相联样品曲线。5,解离步骤。
图6b是全程序的最后3个步骤(3-5)的曲线。在波长上的大的nm转变将指示分析物的结合,其表明CAN20G1和游离抗体具有不同的表位。在这种情况下,仅CDA1(用Merck的抗毒素A mAb作为对照)具有在波长上的显著的nm转变,其证明CDA1结合到不同的表位上,而CAN20G1、G2、G5和G8结合到与CAN20G1一样的表位仓(bin)。
图7是显示了艰难梭菌毒素A对小鼠存活的效果和CAN19mAb对毒素A攻毒的效力的柱状图。
图8是显示了艰难梭菌毒素A对小鼠存活的效果以及CAN19和CAN20mAb对毒素A攻毒的效力的柱状图。
图9是显示了艰难梭菌毒素A对小鼠存活的效果以及鼠CAN20G2mAb以全剂量和半剂量抗毒素A攻毒的效力的柱状图。
图10显示了用于从RNA扩增V基因的引物。简并碱基符号是代表简并核苷酸序列模式的IUPAC(国际纯化学和应用化学联盟)代码。
图11显示了用于muCAN20G2的V基因测序结果,其包含来自muCAN20G2亲本克隆的VH和VL序列。
图12显示了muCAN20G2v区与最接近的人类种系的v区的比对。人类种系被用作人源化的受体框架。
图13a和13b显示了CDR-huCAN20G2设计。最接近的匹配的人类框架是IGHV7-4-1*02和IGKV1-39*01。muCAN20G2的CDR(IMGT编号)被插入到人类框架中。图13A显示了重链可变区,其包括核酸序列和氨基酸序列二者。FR1、FR2和FR3来自IGHV7-4-1*02;FR4来自IGHJ6*01。图13B显示了轻(κ)链可变区,其包括核酸序列和氨基酸序列二者。FR1、FR2和FR3来自IGKV1-39*01;FR4来自IGKJ4*01。
图14a和14b显示了HE-huCAN20G2设计。重现(resurfaced)并改变的密码子以粗体显示。翻译核苷酸序列以确保正确的框。图14A显示了重链可变区,其包括核酸序列和氨基酸序列二者。图14B显示了轻(κ)链可变区,其包括核酸序列和氨基酸序列二者。
图15显示了HE-huCAN20G2重链。重现并改变的密码子以粗体显示。在设计V区之后,加入IgG1恒定区。去除内含子并翻译核苷酸序列以确保正确的框。
图16显示了HE-huCAN20G2κ链。重现并改变的密码子以粗体显示。在设计V区之后,加入κ恒定区。去除内含子并翻译核苷酸序列以确保正确的框。
图17显示了AVA-huCAN20G2κV区比对。阿瓦斯汀(Avastin)κV区与IMGT域目录进行比对,并鉴定了最接近的种系V区。IGKV1D-33-01用作AVA mAb设计的受体框架。
图18显示了AVA-huCAN20G2。阿瓦斯汀κV区与IMGT域目录进行比对,并鉴定了最接近的种系V区。分析和设计之后,加入κ恒定区。如前所述,恒定区含有内含子。对于AVA-huCAN20G2重链,使用以前设计和重现的HE-huCAN20G2重链。FR1、FR2和FR3来自IGKV1D-33-01;FR4来自IGKJ1-01。
图19a和19b显示了嵌合的CAN20G2。用人类恒定区设计鼠V区。去除内含子并翻译核苷酸序列以确保正确的框。图19A显示了重链,其包括核酸序列和氨基酸序列二者。图14B显示了轻(κ)链,其包括核酸序列和氨基酸序列二者。
图20a显示了纯化的人类CAN20G2克隆在150ng/ml时的中和数据,以柱状图表示。
图20b显示了纯化的人类CAN20G2克隆在250ng/ml时的中和数据,以柱状图表示。
图21a显示了45分钟的ELISA,以筛选转染上清液中结合毒素A的表达的人类Can20G2mAb。
图21b显示了45分钟的ELISA,以筛选转染上清液中结合毒素A片段4的表达的人类Can20G2mAb。
图21c显示了60分钟的ELISA,以筛选转染上清液中结合毒素A的表达的人类Can20G2mAb。
图21d显示了60分钟的ELISA,以筛选转染上清液中结合毒素A片段4的表达的人类Can20G2mAb。
图22显示了纯化的人类CAN20G2克隆的SDS-PAGE。
图23显示了纯化的人类CAN20G2克隆的Western印迹分析。将破伤风类毒素、完整毒素A、毒素A片段4和BSA在SDS-PAGE凝胶上进行电泳。将凝胶转移到硝酸纤维素膜上,并用各个人类CAN20G2mAb(1μg/ml)进行探针检测(probe)。(泳道1:毒素A;泳道2:毒素A片段4;泳道3:破伤风类毒素;泳道4:BSA)。
图24a和24b显示了在孵育后5、6、7和8天时,健康供体的T细胞对测试抗体CDR-huCAN20G2(图24A)和HE-huCAN20G2(图24B)的增殖应答。SI≥2.00(由虚线表示)的增殖反应被认为是阳性的,所述SI≥2.00通过使用非成对的两个样品的学生t检验(student’s ttest)检测为显著的(P<0.05)。对于每一个供体,由左到右的柱分别代表5天、6天、7天和8天。
图25显示了在4个时间点所检测的对抗体CDR-huCAN20G2(C001)和HE-huCAN20G2(H001)的阳性T细胞增殖应答的数目。
图26显示了健康供体T细胞对测试抗体CDR-huCAN20G2(C001)和HE-huCAN20G2(H001)的IL-2酶联免疫斑点反应。使用PBMC以评估对在8天孵育中两个抗体的刺激反应的IL-2的分泌。SI≥2.00的T细胞反应被评分为阳性的,所述SI≥2.00通过使用非成对的两个样品的学生t检验检测为显著的(P<0.05)。临界反应(显著P<0.05且SI≥1.90)被显示(*)。
图27显示了以0.05mg/小鼠的低剂量所测试的HE-huCAN20G2(“HE-CAN20G2”)、CDR-huCAN20G2(“CDR-CAN20G2”)和CDA1(Merck/Medarex)抗艰难梭菌毒素A(抗-TcdA)mAb的比较。mAb的效力表示为与对照动物(TcdA/PBS)相比的生存的百分比。*用于统计显著性的费雪(Fisher)精确检验。
图28显示了TcdA攻毒后,人源化的CAN20G2mAb、HE-huCAN20G2、CDR-huCAN20G2与CDA1相比,在生存上随时间推移的效果。描述了TcdA攻毒后,低剂量的Ab(0.05mg)的mAb或单独的PBS(对照)对生存时间的效果。图中显示了在指定的时间点(小时),各组动物在TcdA攻毒后的存活百分比。
图29a和29b显示了大鼠中人源化的抗体CDR-huCAN20G2(图29a)和HE-huCAN20G2(图29b)的PK研究数据。
具体实施方式
本发明提供了用于预防或治疗艰难梭菌细菌感染或细菌传输的组合物和方法。组合物包括识别艰难梭菌毒素A的抗体(或其抗原结合部分),其包括小鼠单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体或任何上述抗体的抗原结合部分。这些抗体(或其抗原结合部分)可在体外和体内中和毒素A,和/或抑制毒素A与哺乳动物细胞的结合。因此,本发明的抗体或其抗原结合部分可以用于被动免疫,以预防或治疗艰难梭菌相关疾病(CDAD)。
在一个实施方式中,本发明的抗体或其抗原结合部分提供了一种或多种下述效果:预防或治疗受试者的艰难梭菌介导的结肠炎、抗生素相关结肠炎、伪膜性结肠炎(PMC)或其它肠疾病;预防或治疗受试者的腹泻;和/或治疗或抑制艰难梭菌介导的疾病的复发。当对哺乳动物进行给药时,本发明的抗体或其抗原结合部分保护哺乳动物抵抗对以未施用抗体或其抗原结合部分的哺乳动物而言致死的量施用的毒素A。
本发明的抗体或其抗原结合部分包括由本文所述的杂交瘤克隆CAN20G2、CAN20G1、CAN20G5、CAN20G8、CAN19G1、CAN19G2或CAN19G3所生产的抗体。
本发明还包括抗体或其抗原结合部分,其包括由杂交瘤克隆CAN20G2、CAN20G1、CAN20G5、CAN20G8、CAN19G1、CAN19G2或CAN19G3所产生的抗体的抗原结合部分。
如本文所用,CAN20G1、CAN20G2、CAN20G5、CAN20G8、CAN19G1、CAN19G2和CAN19G3指杂交瘤克隆或由相应的杂交瘤克隆产生的单克隆抗体。
抗体或其抗原结合部分可以特异性地结合毒素A的片段4内的表位,例如,毒素A的氨基酸残基1853-2710之间的表位。Babcock,G.J.等人,Infection and Immunity,74:6339-6347(2006)。在另一个实施方式中,抗体或其抗原结合部分特异性地结合于毒素A的片段1(氨基酸残基1-659)、片段2(氨基酸残基660-1256)或片段3(氨基酸残基1257-1852)中的表位。在另一个实施方式中,抗体或其抗原结合部分特异性地结合毒素A的氨基酸残基1-600、400-600、415-540、1-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、900-1000、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1800-1900、1900-200、2100-2200或2200-2300、2300-2400、2400-2500、2500-2600、2600-2710或其任何间隔、部分或范围内的表位。
本发明的抗体或其抗原结合部分包括但不限于单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、多克隆抗体、重组抗体以及上述抗体的抗原结合部分。抗体的抗原结合部分可包括抗体特异性结合艰难梭菌的毒素(如毒素A)的部分。
本发明的人源化抗体是来自非人类物种的抗体,其中在非抗原结合区域(和/或抗原结合区)的氨基酸序列被改变,使得抗体更类似于人类抗体,并仍然保留其原有的结合能力。
人源化抗体可以通过用等效的来自人类可变区的序列替换不直接参与抗原结合的可变区序列来生成。这些方法包括分离、操纵和表达编码来自重链或轻链至少一个的全部或部分的可变区的核酸序列。这样的核酸来源是本领域技术人员所公知的,例如可以从产生抗毒素A的抗体的杂交瘤获得。编码人源化抗体或其片段的重组DNA可以再克隆到合适的表达载体中。
抗体轻链或重链可变区由被三个超变区(称为互补决定区(CDR))中断的框架区组成。在一个实施方式中,人源化抗体是来自非人物种的抗体分子,其具有一个、两个或所有的来自非人物种的CDR和来自人类免疫球蛋白分子的框架区。
本发明的人源化抗体可以通过本领域已知的方法来制备。例如,一旦获得非人类(例如鼠)抗体,可对可变区进行测序,并确定CDR与框架残基的定位。Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Departmentof Health and Human Services,NIH出版物No.91-3242。Chothia,C.等人(1987)J.Mol.Biol.,196:901-917。轻链和重链可变区可以任选地连接到相应的恒定区。CDR-移植抗体分子可以通过CDR-移植或CDR取代来制备。免疫球蛋白链的一个、两个或所有的CDR可以被替换。例如,特定抗体的所有CDR可以来自非人类动物(例如,小鼠,如表1所示的CDR)的至少一部分,或仅替换某些CDR。仅需要保持抗体结合预定抗原(例如,艰难梭菌毒素A)所需的CDR。Morrison,S.L.,1985,Science,229:1202-1207。Oi等人,1986,BioTechniques,4:214。美国专利第5,585,089;5,225,539;5,693,761和5,693,762号。EP519596。Jones等人,1986,Nature,321:552-525。Verhoeyan等人,1988,Science,239:1534。Beidler等人,1988,J.Immunol.,141:4053-4060。
本发明还包括的抗体或其抗原结合部分包括一个、两个或所有本文所公开的CDR,而其它区域由来自至少一种不同的物种的序列所替代,不同的物种包括但不限于人、兔、绵羊、狗、猫、牛、马、山羊、猪、猴、猩猩、大猩猩、黑猩猩、鸭、鹅、鸡、两栖动物、爬行动物和其他动物。
嵌合抗体是其中不同部分源自不同动物物种的分子。例如,抗体可以包含源自鼠mAb的可变区和人类免疫球蛋白恒定区。嵌合抗体可以通过重组DNA技术来生产。Morrison等人,Proc Natl Acad Sci,81:6851-6855(1984)。例如,将编码鼠(或其它物种)单克隆抗体分子的基因用限制性内切酶消化以去除编码鼠Fc的区域,并且代替为编码人类Fc恒定区的基因的等效部分。嵌合抗体也可以通过重组DNA技术产生,其中编码鼠V区的DNA可以连接到编码人类恒定区的DNA上。Better等人,Science,1988,240:1041-1043。Liu等人PNAS,198784:3439-3443。Liu等人,J.Immunol.,1987,139:3521-3526。Sun等人PNAS,1987,84:214-218。Nishimura等人,Canc.Res.,1987,47:999-1005。Wood等人Nature,1985,314:446-449。Shaw等人,J.Natl.Cancer Inst.,1988,80:1553-1559。国际专利WO1987002671和WO86/01533。欧洲专利申请184,187;171,496;125,023和173,494。美国专利4,816,567。
抗体可以是全长或可以包括具有抗原结合部分的抗体的片段(或多个片段),包括但不限于由抗体片段形成的Fab、F(ab')2、Fab'、F(ab)'、Fv、单链Fv(scFv)、二价scFv(bi-scFv)、三价scFv(tri-scFv)、Fd、dAb片段(例如,Ward等人,Nature,341:544-546(1989))、分离的CDR、双抗体、三抗体、四抗体、线性抗体、单链抗体分子和多特异性抗体。本发明也包括通过使用重组方法或合成接头连接抗体片段而产生的单链抗体。Bird等人Science,1988,242:423-426。Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1988,85:5879-5883。
本发明的抗体或其抗原结合部分可以是单特异性、双特异性或多特异性的。多特异性或双特异性抗体或其片段可以特异于一个靶多肽(例如,毒素A)的不同表位或可以包含特异于一个以上的靶多肽的抗原结合域(例如,特异于毒素A和毒素B的抗原结合域;或特异于毒素A和其它艰难梭菌的抗原的抗原结合域;或特异于毒素A和其它种类的细菌或病毒的抗原结构域)。在一个实施方式中,多特异性抗体或其抗原结合部分包含至少两个不同的可变域,其中每个可变域能够特异性地结合到单独的抗原或相同抗原的不同表位。Tutt等人,1991,J.Immunol.147:60-69。Kufer等人,2004,Trends Biotechnol.22:238-244。本发明的抗体可以连接到另一个功能性分子或同另一个功能性分子共表达,例如另一种肽或蛋白。例如,抗体或其片段可功能性地连接(例如,通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其它方式)至一个或多个其它分子实体,诸如另一种抗体或抗体片段以产生具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗体。例如,本发明包括双特异性抗体,其中免疫球蛋白的一条臂特异于毒素A,并且免疫球蛋白的另一条臂特异于第二治疗性靶或结合到治疗部分,如胰蛋白酶抑制剂。
本发明所包括的所有抗体同种型包括IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(IgA1、IgA2)、IgD或IgE。抗体或其抗原结合部分可以是哺乳动物(如小鼠、人类)的抗体或其抗原结合部分。抗体的轻链可以是κ或λ型。
本发明的抗体或其抗原结合部分的CDR可以来自非人类或人类来源。本发明的抗体或其抗原结合部分的框架可以是人类的、人源化的、非人类的(例如,修改的鼠框架,以减少在人类中的抗原性),或合成的框架(例如,共有序列)。
在一个实施方式中,本发明的抗体或其抗原结合部分包含至少一个重链可变区和/或至少一个轻链可变区。重链可变区(或轻链可变区)包含3个CDR和4个框架区(FR),从氨基末端到羧基末端按下述顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。Kabat,E.A.等人Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242,1991。Chothia,C.等人,J.Mol.Biol.196:901-917,1987。
本发明的抗体或其抗原结合部分特异性结合毒素A,其解离常数(KD)小于约10-7M、小于约10-8M、小于约10-9M、小于约10-10M、小于约10-11M或小于约10-12M。
具有对于由克隆CAN20G1、CAN20G2、CAN20G5、CAN20G8、CAN19G1、CAN19G2或CAN19G3产生的抗体的重链可变区和轻链可变区至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%的、至少约99%、约70%、约75%、约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%的、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%同源性的重链可变区和轻链可变区的抗体也可以结合毒素A。
在相关实施方式中,抗毒素A抗体或其抗原结合部分包括例如CAN20G1、CAN20G2、CAN20G5、CAN20G8、CAN19G1、CAN19G2或CAN19G3的重链可变和/或轻链可变的CDR。来自这些克隆的重链可变区的CDR以及来自这些克隆的轻链可变区的CDR示于表1中。
表1Seq IN No.3-104。
表1中,CDR是IMGT编号。H:重链;K:κ链。
在某些实施方式中,抗体或其抗原结合部分包括包含对于由克隆CAN20G1(SEQ IDNO:12)、CAN20G2(SEQ ID NO:28)、CAN20G5(SEQ ID NO:44)或CAN20G8(SEQ ID NO:60)产生的抗体的重链可变区氨基酸序列有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%、约70%、约75%、约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%同源性的氨基酸序列的重链可变区。
在某些实施方式中,抗体或其抗原结合部分包括包含对于由CAN20G1(SEQ ID NO:4)、CAN20G2(SEQ ID NO:20)、CAN20G5(SEQ ID NO:36)或CAN20G8(SEQ ID NO:52)产生的抗体的轻链可变区氨基酸序列有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%、约70%、约75%、约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%同源性的氨基酸序列的轻链可变区。
在某些实施方式中,各个抗体或其抗原结合部分包括包含对于由克隆CAN20G1(SEQ ID NO:12)、CAN20G2(SEQ ID NO:28)、CAN20G5(SEQ ID NO:44)或CAN20G8(SEQ IDNO:60)产生的抗体的重链可变区氨基酸序列有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%、约70%、约75%、约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%同源性的氨基酸序列的重链可变区,以及包含对于由克隆CAN20G1(SEQ ID NO:4)、CAN20G2(SEQ ID NO:20)、CAN20G5(SEQ ID NO:36)或CAN20G8(SEQID NO:52)产生的抗体的轻链可变区氨基酸序列有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%的中、至少约95%、至少约99%、约70%、约75%、约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%同源性的氨基酸序列的轻链可变区。
在各个实施方式中,抗体或其抗原结合部分特异性地结合到表位,其与由克隆CAN20G1、CAN20G2、CAN20G5或CAN20G8产生的抗体所结合的表位和/或与克隆CAN20G1、CAN20G2、CAN20G5或CAN20G8产生的抗体竞争结合毒素A的表位重叠或有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%、约70%、约75%、约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%同源性。
抗体或其抗原结合部分的重链可变区可以包括1个、2个、3个或更多个互补决定区(CDR),其与克隆CAN20G1(SEQ ID NO:13、14、15)、CAN20G2(SEQ ID NO:29、30、31)、CAN20G5(SEQ ID NO:45、46、47)或CAN20G8(SEQ ID NO:61、62、63)产生的抗体的CDR具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%、约70%、约75%、约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%同源性。
抗体或其抗原结合部分的轻链可变区可以包括1个、2个、3个或更多个CDR,其与克隆CAN20G1(SEQ ID NO:5、6、7)、CAN20G2(SEQ ID NO:21、22、23)、CAN20G5(SEQ ID NO:37、38、39)或CAN20G8(SEQ ID NO:53、54、55)产生的抗体的轻链可变区的CDR具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%、约70%、约75%、约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%同源性。
抗体或其抗原结合部分的重链可变区可以包括1个、2个、3个或更多个互补决定区(CDR),其与克隆CAN20G1(SEQ ID NO:13-15)、CAN20G2(SEQ ID NO:29-31)、CAN20G5(SEQID NO:45-47)或CAN20G8(SEQ ID NO:61-63)产生的抗体的CDR具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%、约70%、约75%、约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%的、约98%、约99%或约100%同源性,并且抗体或其抗原结合部分的轻链可变区可以包括1个、2个、3个或更多个CDR,其与克隆CAN20G1(SEQ ID NO:5-7)、CAN20G2(SEQ IDNO:21-23)、CAN20G5(SEQ ID NO:37-39)或CAN20G8(SEQ ID NO:53-55)产生的抗体的轻链可变区的CDR具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%、约70%、约75%、约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%的、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%同源性。
抗体或其抗原结合部分的重链可变区可包括3个CDR,其与克隆CAN20G1(SEQ IDNO:13-15)、CAN20G2(SEQ ID NO:29-31)、CAN20G5(SEQ ID NO:45-47)或CAN20G8(SEQ IDNO:61-63)产生的抗体的重链可变区的CDR具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、在至少约95%、至少约99%、约70%、约75%、约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%的、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%同源性。
在一个实施方式中,抗体或其抗原结合部分的轻链可变区包括3个CDR,其与CAN20G1(SEQ ID NO:5-7)、CAN20G2(SEQ ID NO:21-23)、CAN20G5(SEQ ID NO:37-39)或CAN20G8(SEQ ID NO:53-55)产生的抗体的轻链可变区的CDR具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%、约70%、约75%、约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%同源性。
在一个实施方式中,抗体或其抗原结合部分的重链可变区包括3个CDR,其与克隆CAN20G1(SEQ ID NO:13-15)、CAN20G2(SEQ ID NO:29-31)、CAN20G5(SEQ ID NO:45-47)或CAN20G8(SEQ ID NO:61-63)产生的抗体的重链可变区的CDR具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%、约70%、约75%、约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%同源性,并且抗体或其抗原结合部分的轻链可变区包括1个、2个或3个CDR,其与克隆CAN20G1(SEQ ID NO:5-7)、CAN20G2(SEQ ID NO:21-23)、CAN20G5(SEQ ID NO:37-39)或CAN20G8(SEQ ID NO:53-55)产生的抗体的轻链可变区的CDR具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%、约70%、约75%、约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%同源性。
在某些实施方式中,抗体或其抗原结合部分的重链可变区包含3个CDR,其与克隆CAN20G1(SEQ ID NO:13-15)、CAN20G2(SEQ ID NO:29-31)、CAN20G5(SEQ ID NO:45-47)或CAN20G8(SEQ ID NO:61-63)产生的抗体的重链可变区的CDR有同源性,并且抗体或其抗原结合部分的轻链可变区包含3个CDR,其与克隆CAN20G1(SEQ ID NO:5-7)、CAN20G2(SEQ IDNO:21-23)、CAN20G5(SEQ ID NO:37-39)或CAN20G8(SEQ ID NO:53-55)产生的抗体的轻链可变区的CDR有同源性。
在某些实施方式中,对应于表1中的CDR的CDR具有序列变异。例如,其中1、2、3、4、5、6、7或8个残基,或小于总残基的20%,小于总残基的30%或小于总残基的约40%的被取代或删除的CDR可以存在于结合毒素A的抗体(或其抗原结合部分)中。
在一个实施方式中,抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区和重链可变区,其与克隆CAN20G1(分别是SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:12)、CAN20G2(分别是SEQ ID NO:20和SEQID NO:28)、CAN20G5(分别是SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:44)或CAN20G8(分别是SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:60)产生的抗体的轻链可变区和重链可变区具有同源性。
抗体或其抗原结合部分是肽。肽还可以包括肽的变体、类似物、直系同源物、同源物和衍生物,其表现出生物学活性,例如结合抗原。肽可以包括一种或多种氨基酸的类似物(包括例如非天然产生的氨基酸,只天然存在于不相关生物系统中的氨基酸,来自哺乳动物系统等的修饰的氨基酸),具有取代的连接的肽以及本领域已知的其它修饰。
其中特异性氨基酸被取代、缺失或添加的抗体或其抗原结合部分也在本发明的范围内。这些改变对于肽的生物学性质如结合活性并没有实质的影响。例如,抗体在框架区可以有氨基酸取代,以提高与抗原的结合。在另一个实例中,选定的小数量的受体框架残基可以由相应的供体氨基酸所替换。供体框架可以是成熟的或种系的人类抗体框架序列或共有序列。关于如何制备表型沉默的氨基酸替换的指导提供自Bowie等人,Science,247:1306-1310(1990)。Cunningham等人,Science,244:1081-1085(1989)。Ausubel(编),CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley和Sons公司(1994)。T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,冷泉港实验室,Cold Spring Harbor,纽约(1989)。Pearson,Methods Mol.Biol.243:307-31(1994)。Gonnet等人,Science256:1443-45(1992)。
抗体或其抗原结合部分可以被衍生化或连接至另一个功能性分子。例如,抗体可以功能性连接(通过化学偶联、遗传融合、非共价相互作用等)至一个或多个其它分子实体,例如另一个抗体、可检测剂、细胞毒性剂、药剂、能介导与另一个分子关联的蛋白或肽(如链亲和素核心区或多组氨酸标签)、氨基酸接头、信号序列、免疫原性载体或用于蛋白纯化的配体如谷胱甘肽-S-转移酶、组氨酸标签和葡萄球菌蛋白A。一种类型的衍生化蛋白通过交联两种或多种(不同类型的或相同类型的)蛋白而产生。合适的交联剂包括那些异双功能的,其具有由适当的隔离物分隔的两个不同的活性基团(如,间-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双功能的(如,二琥珀酰亚胺辛二酸酯)。此类接头可购自Pierce化学公司,Rockford,Ill。可用其衍生化(或标记)蛋白的有用的可检测剂包括荧光化合物、各种酶、辅基、发光材料、生物发光材料和放射性材料。非限制性的示例性的荧光可检测剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明以及藻红蛋白。还可以用可检测的酶衍生化蛋白或抗体,如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶等。蛋白还可以被辅基衍生化(例如,链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素)。
本发明的肽可以是本文公开的抗体或其抗原结合部分的功能活性变体,例如具有小于约30%、约25%、约20%、约15%、约10%、约5%或约1%的氨基酸残基被取代或被删除,但保留基本相同的免疫学性质,包括但不限于结合毒素A。
本发明还包括编码特异性结合到艰难梭菌毒素A的本发明的抗体或其抗原结合部分的核酸。核酸可以在细胞中表达以产生本发明的抗体或其抗原结合部分。本发明的分离的核酸包含编码与SEQ ID NO:4、12、20、28、36、44、52或60具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%、约70%、约75%、约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%同源性的肽的序列。
分离的核酸可包括与SEQ ID NO:68、69、70、71、72、73、74或75具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%、约70%、约75%、约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%同源性的序列。
本发明还提供了表达载体,其包括编码与SEQ ID NO:4、12、20、28、36、44、52或60具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%、约70%、约75%、约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%同源性的肽的核酸。表达载体可以包括与SEQ ID NO:68、69、70、71、72、73、74或75具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%、约70%、约75%、约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%同源性的核酸序列。
编码本发明的抗体或其抗原结合部分的功能活性变体的核酸分子也包括在本发明中。这些核酸分子可以在中度严谨、高度严谨或非常高度严谨条件下与编码任何本发明的抗体或其抗原结合部分的核酸杂交。用于进行杂交反应的指导可在Current Protocolsin Molecular Biology,John Wiley&Sons,纽约6.3.1-6.3.6,1989中找到,其通过引用并入本文。本文参考的特异性杂交条件如下:1)中度严谨杂交条件:在约45℃的6×SSC,随后在60℃在0.2X SSC、0.1%SDS中洗涤一次或多次;2)高度严谨杂交条件:在约45℃的6×SSC,随后在65℃在0.2X SSC、0.1%SDS中洗涤一次或多次;以及3)非常高度严谨杂交条件:在65℃的0.5M磷酸钠、7%SDS,随后在65℃在0.2X SSC、1%SDS中洗涤一次或多次。
编码本发明的抗体或其抗原结合部分的核酸可以被引入可在合适的表达系统中表达的表达载体中,随后分离或纯化所表达的抗体或其抗原结合部分。任选地,编码本发明的抗体或其抗原结合部分的核酸可以在无细胞翻译系统中翻译。美国专利第4,816,567号。Queen等人,Proc Natl Acad Sci USA,86:10029-10033(1989)。
抗毒素抗体或其部分可以由转化了编码所需抗体的轻链和重链(或其部分)的DNA的宿主细胞来制备。可以使用标准技术将抗体从这些培养物上清和/或细胞中分离和纯化。例如,宿主细胞可以转化有编码抗体的轻链、重链或两者的DNA。重组DNA技术也可用于去除一些或全部的编码对于结合没有必要的轻链和重链中的一个或两个的DNA,如恒定区。
本发明的核酸可以表达于各种合适的细胞中,包括原核和真核细胞,如细菌细胞(如大肠杆菌)、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。许多哺乳动物细胞系是本领域已知的,并且包括可自美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系。细胞的非限制性实例包括哺乳动物来源或哺乳动物样特征的所有细胞系,包括但不限于下述细胞的亲本细胞、衍生物和/或工程化的变体:猴肾细胞(COS,例如COS-1、COS-7)、HEK293、幼仓鼠肾(BHK,例如BHK21)、中国仓鼠卵巢(CHO)、NS0、PerC6、BSC-1、人肝细胞癌细胞(例如HepG2)、SP2/0、HeLa、Madin-Darby牛肾(MDBK)、骨髓瘤和淋巴瘤细胞。工程化的变体包括例如聚糖分布被修饰的和/或位点特异性整合位点的衍生物。
本发明还提供了包括本文所述核酸的细胞。细胞可以是杂交瘤或转染子。细胞的种类如上所述。
本发明的抗体或其抗原结合部分可以在各种细胞中表达。细胞的种类如上所述。
或者,本发明的抗体或其抗原结合部分可以通过本领域公知的固相方法进行合成。在牛津大学出版社由IRL出版的E.Atherton和R.C.Sheppard 著的Solid PhasePeptide Synthesis:A Practical Approach(1989)。Methods in Molecular Biology,Vol.35:Peptide Synthesis Protocols(M.W.Pennington和B.M.Dunn编),第7章。SolidPhase Peptide Synthesis,第2版,Pierce化学公司,Rockford,IL(1984)。G.Barany和R.B.Merrifield,The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,编辑E.Gross和J.Meienhofer,卷1和卷2,Academic Press,纽约,(1980),pp.3-254。M.Bodansky,Principles of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,柏林(1984)。
本发明提供了用于制造特异性结合艰难梭菌毒素A的抗体或其抗原结合部分的方法。例如,非人类动物用包括灭活的毒素A的组合物进行免疫,再从动物中分离特异性抗体。方法可以进一步包括评估抗体与毒素A的结合。
多种艰难梭菌毒素蛋白的任何一种,尤其是毒素A,可以用于本发明的实施。艰难梭菌疾病主要由毒素A和毒素B介导。当通过静脉内注射或腹膜内注射到小鼠中时,两个毒素都是细胞毒性的和致命的。毒素A也是强力的肠毒素,如通过在小鼠结扎肠袢腹泻模型中流体积累的诱导所证实的。参见,例如Babcock,G.J.等人,Infection and Immunity,74:6339-6347(2006)及其中所包括的作为背景的参考文献。
表2提供了艰难梭菌毒素A的氨基酸序列。下述提供的序列的变体和片段也可以用作抗原以产生抗体。
表2
表3提供了编码表2的蛋白的核酸序列。
在一个实施方式中,本发明提供了用于制备表达特异性结合艰难梭菌毒素A的抗体的杂交瘤的方法。方法包含以下步骤:用包括灭活的毒素A(如类毒素A)的组合物对动物进行免疫;从动物分离脾细胞;从脾细胞产生杂交瘤;并选择产生特异性结合毒素A的抗体的杂交瘤。Kohler和Milstein,Nature,256:495,1975。Harlow,E.和Lane,D.antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988。
毒素可被灭活,例如通过用甲醛、戊二醛、UDP-二醛、过氧化氢、氧气处理或通过突变(例如,使用重组方法)。Relyveld等人,Methods in Enzymology,93:24,1983。Woodrow和Levine编,New Generation Vaccines,Marcel Dekker Inc.,New York,1990。Genth等人,Inf.and Immun.,68(3):1094-1101,2000。具有降低的毒性的艰难梭菌毒素突变体可以使用重组方法来制备。美国专利第5085862;5221618;5244657;5332583;5358868和5433945号。毒素或类毒素的全长或片段可以用作免疫原。
在一个实施方式中,灭活的毒素A用于经腹膜内或静脉内注射对小鼠进行免疫。可以施予或不施予一个或多个加强免疫(boost)。血浆中的抗体滴度可以通过如ELISA(酶联免疫吸附测定)或流式细胞术监测。将具有充足滴度的抗毒素A抗体的小鼠用于融合。小鼠在处死之前3天时用或不用抗原进行加强,并切除脾脏。分离小鼠脾细胞并用PEG融合至小鼠骨髓瘤细胞系。所得到的杂交瘤再进行筛选以产生抗原特异性抗体。将细胞铺板,再培养于选择性培养基中。再通过ELISA筛选各个孔的上清液中的人抗毒素单克隆抗体。将分泌抗体的杂交瘤重新铺板,再次筛选,并且如果对于抗毒素单克隆抗体仍呈阳性,可以通过有限稀释进行亚克隆。例如,本发明的杂交瘤克隆CAN20G2被亚克隆。一个亚克隆是CAN20G2-2-1。
可用于增加一种或多种艰难梭菌毒素抗原尤其是毒素A的免疫原性的佐剂包括作用为增加对肽或肽组合物的免疫应答的任意化合物或多个化合物。佐剂的非限制性实例包括明矾、磷酸铝、氢氧化铝、MF59(4.3%w/v的角鲨烯,0.5%w/v的聚山梨酯80(吐温80),0.5%w/v的山梨醇三油酸酯(司盘85))、含CpG的核酸、QS21(皂素佐剂)、MPL(单磷酸脂质A)、3DMPL(3-O-脱酰化MPL)、来自Aquilla的提取物、ISCOMS(参见,例如Sjolander等人(1998)J.Leukocyte Biol.64:713;WO90/03184;WO96/11711;WO00/48630;WO98/36772;WO00/41720;WO06/134423和WO07/026190)、LT/CT突变体、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、Quil A、白介素、弗氏佐剂、N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(CGP11637,称为正-MDP)、N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP19835A,称为MTP-PE)和RIBI,其包含溶于2%的角鲨烯/吐温80乳剂中的从细菌中提取的3种组分:单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。
免疫的动物可以是当对其施用免疫原时能够产生可回收的抗体的任何动物,例如但不限于兔、小鼠、大鼠、仓鼠、山羊、马、猴、狒狒和人类。在一个方面,宿主是转基因的并产生人类抗体,例如表达人类免疫球蛋白基因片段的小鼠。美国专利第8236311、7625559和5770429号,每个专利所公开的内容以其整体通过引用并入本文。Lonberg等人,Nature368(6474):856-859,1994。Lonberg,N.,Handbook of Experimental Pharmacology113:49-101,1994。Lonberg,N.和Huszar,D.,Intern.Rev.Immunol.,13:65-93,1995。Harding,F.和Lonberg,N.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,764:536-546,1995。
在对宿主进行免疫且产生抗体之后,对抗体进行检测以确认其对目标抗原具有特异性,并确定其是否表现出与其它抗原的任何交叉反应性。进行此类分析的一种方法是如美国专利公开号2004/0126829中所述的血清筛选分析。抗毒素抗体可通过各种已知的技术对毒素结合进行表征。例如,在ELISA中,微量滴定板用在PBS中的毒素或类毒素抗原进行包被,再用稀释于PBS中的不相关的蛋白如牛血清白蛋白(BSA)进行封闭。将来自毒素免疫的小鼠的血浆稀释物加入到每个孔中并孵育。洗涤板,然后用结合到酶(如碱性磷酸酶)的二抗进行孵育。洗涤后,将板用酶底物(如ABTS)进行显色,并在特定OD下进行分析。在其他实施方式中,为了确定所选择的单克隆抗体是否结合至独特的表位上,抗体可被生物素化,其之后可以用抗生蛋白链菌素标记的探针进行检测。可通过Western印迹法检测抗毒素抗体对毒素的反应性。
中和分析也可用于测定抗毒素抗体的活性。例如,体外中和分析可用于测量抗体抑制培养基中细胞的细胞病变效果的能力(参见实施例7和12)。在一个实施方式中,在体外中和分析中,浓度范围为约1μM至约50μM、约2μM至约40μM、约3μM至约30μM、约4μM至约20μM、约4μM至约17μM、约5μM至约15μM或约10μM的本发明的抗体或其抗原结合部分中和约150ng/ml艰难梭菌毒素A的大于约20%、大于约30%、大于约40%、大于约50%、大于约60%、大于约70%、大于约80%或大于约90%。体内分析也可用于测量毒素中和。在另一个实施方式中,在体内毒素A攻毒实验中(如实施例5、6和7中所述的过程,和Babcock等人,Human MonoclonalAntibodies Directed against Toxins A and B prevent Clostridium difficile-Induced Mortality in Hamsters.Infection and Immunity(2006)74(11):6339),将哺乳动物暴露于大于约100ng或约100ng的艰难梭菌毒素A约24小时之前,对哺乳动物施用剂量范围约1mg/kg体重至约50mg/kg体重、约2mg/kg体重至约40mg/kg体重、约3mg/kg体重至约30mg/kg体重、约5mg/kg体重至约20mg/kg体重、约8mg/kg体重至约13mg/kg体重或约10mg/kg体重的抗体或其抗原结合部分时,哺乳动物在约7天内的生存机会大于约40%、大于约50%、大于约60%、大于约70%、大于约80%或大于约90%。
产生结合毒素(优选具有高亲和力)的抗体的杂交瘤可以被亚克隆并且进一步被表征。然后选择取自每个保持亲本细胞反应性的杂交瘤的一个克隆(通过ELISA),用于制造细胞库,并用于抗体纯化。
为了纯化抗毒素抗体,在用蛋白A-Sepharose(Pharmacia,Piscataway,N.J.)亲和层析之前,过滤并浓缩所培养的杂交瘤的上清液。
本发明的抗体或抗原结合片段、变体或其衍生物也可以依据其对抗原的结合亲和力进行描述和详细说明。抗体对抗原的亲和力可以通过使用任何合适的方法实验性地判断(参见,例如,Berzofsky等人,“Antibody-Antigen Interactions,”In FundamentalImmunology,Paul,W.E.编,Raven Press:New York,N.Y.(1984);Kuby,Janis Immunology,W.H.Freeman and Company:New York,N.Y.(1992)以及本文所述的方法)。如果在不同条件(例如盐浓度、pH值)下进行测量,所测量的特定抗体-抗原相互作用的亲和力可以不同。因此,亲和力和其它抗原结合参数(如KD、Ka、Kd)的测量优选使用抗体和抗原的标准化溶液及标准化缓冲液进行。
本发明的抗体或其抗原结合部分具有体外和体内的治疗性的、预防性的和/或诊断性的用途。例如,这些抗体可以施用于培养中的细胞,如体外或离体,或者施予受试者,如体内,以治疗、抑制、预防复发,和/或诊断艰难梭菌和与艰难梭菌相关的疾病。
抗体或其抗原结合部分可用于培养中的细胞,例如体外或离体。例如,细胞可以在体外在培养基中进行培养,并与抗毒素抗体或其片段进行接触。方法可以在存在于受试者中的细胞上进行,作为体内(如治疗性的或预防性的)方案的一部分。对于体内实施方式,接触步骤受试者中生效并包括在允许抗体或其部分与受试者中(如肠道中)的艰难梭菌表达的毒素(如毒素A)结合的条件下对受试者施用抗毒素抗体或其部分。
抗体或其抗原结合部分可以单独施用或与另一种治疗剂组合施用,例如第二单克隆或多克隆抗体或其抗原结合部分。在一个实施例中,特异性结合艰难梭菌毒素A的抗体或其抗原结合部分与特异性结合艰难梭菌毒素B的抗体(单克隆或多克隆)或其抗原结合部分组合。在另一个实施例中,第二试剂为抗生素,如万古霉素、杆菌肽或甲硝唑。抗体可与益生菌剂如布拉酵母菌(Saccharomyces boulardii)组合使用。抗体也可与艰难梭菌疫苗如类毒素疫苗组合施用。
本发明还提供了包含本文所述的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体的组合物。组合物可以包含分离的编码本发明的抗体或其抗原结合部分的核酸和药学上可接受的载体。药学上可接受的载体包括任何和所有的生理上相容的溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。在一个实施方式中,组合物可有效地减少、消除或预防受试者的艰难梭菌细菌感染。
本发明还提供了通过对受试者施用有效抑制艰难梭菌疾病的量的本发明的抗体或其抗原结合部分以治疗受试者艰难梭菌疾病的方法。本发明的组合物的施用途径包括但不限于静脉内、肌内、皮下、经口、局部、皮下、皮内、经皮、皮下(subdermal)、肠胃外、直肠、脊柱或表皮给药。
本发明的组合物可以制备成可注射的液体溶液或悬浮液形式或固体形式,其适用于在注射前溶于液体载体的溶液或悬浮液。组合物还可以以固体形式进行制备、乳化或将活性成分封装在脂质体载体或其它用于持续递送的颗粒载体中。例如,组合物的形式可以是油乳剂、油包水乳剂、水包油包水乳剂、位点特异性乳剂、长停留乳剂、粘性乳剂、微乳剂、纳米乳剂、脂质体、微粒、微球、纳米球、纳米颗粒和各种天然或合成的聚合物,例如不透不可吸收的聚合物如乙烯乙酸乙烯共聚物和共聚物、可溶胀的聚合物如水凝胶或者可再吸收的聚合物如胶原蛋白以及某些多元酸或聚酯,如那些用于制造允许疫苗缓释的可吸收缝合线的多元酸或聚酯。
本发明的抗体或其抗原结合部分被配制到用于递送至哺乳动物受试者的组合物中。组合物单独施用和/或与药学上可接受的载体或赋形剂混合。合适的载体是如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等和其组合。此外,载体可以包含少量的辅助物质,如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂或佐剂。本发明的组合物还可以包括补充物质,如药物制剂、细胞因子或其它生物反应调节剂。
此外,组合物可以以中性或盐形式配制于组合物中。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与活性多肽的游离氨基形成)并且其与无机酸如盐酸或磷酸形成,或者与有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。由游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物以及有机碱如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
制备这类剂型的实际方法是已知的,或对于本领域技术人员是显而易见的。参见,例如,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Compnay,Easton,Pennsylvania,第21版。
组合物可以按时间表在一段时期内以根据受试者的年龄、体重和病况、所使用的特定组合物以及给药途径调整的单剂量治疗或多剂量治疗进行给药。
在一个实施方式中,施用单剂量的本发明的组合物。在其它的实施方式中施用多剂量。施用频率可以根据多种因素的任意种而变化,例如症状的严重程度、所期望的免疫保护程度、组合物是否用于预防或治疗的目的等。例如,在一个实施方式中,每月1次、每月2次、每月3次、每隔1周1次(qow)、每周1次(qw)、每周2次(biw)、每周3次(tiw)、每周4次、每周5次、每周6次、每隔1天1次(qod)、每天1次(qd)、每天2次(qid)或每天3次(tid)施用本发明的组合物。
本发明多肽的给药持续时间,例如,施用组合物的时间段可以根据多种因素的任意种而变化,例如受试者的反应等。例如,施用组合物的时间范围为约1天至约1周、约2周至约4周、约1个月至约2个月、约2个月至约4个月、约4个月至约6个月、约6个月至约8个月、约8个月至约1年、约1年至约2年或约2年至约4年或更长。
组合物可以与药学上可接受的载体(赋形剂)进行组合以形成药物组合物。药学上可接受的载体可以包含生理学上可接受的化合物,其用于例如稳定或提高或降低本发明的药物组合物的吸收或清除率。生理学上可接受的化合物可包括例如碳水化合物如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖、抗氧化剂如抗坏血酸或谷胱甘肽、螯合剂、低分子量蛋白质、清洁剂、脂质体载体或赋形剂或其它稳定剂和/或缓冲剂。其它生理学上可接受的化合物包括润湿剂、乳化剂、分散剂或防腐剂。参见,如Remington’s Pharmaceutical Science,Mack PublishingCompany,Easton,Pa。(“Remington’s”)的第21版。
在一个方面中,组合物的溶液溶解于药学上可接受的载体中,如水性载体(如果组合物是水溶性的)。水溶液的实例包括如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、Hank’s溶液、Ringer’s溶液、葡萄糖/盐水、葡萄糖溶液等。制剂可以包含接近生理条件所需要的药学上可接受的辅助物质,如缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、洗涤剂等。添加剂还可以包括另外的活性成分,例如杀菌剂或稳定剂。例如,溶液可以包含乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨醇单月桂酸酯或油酸三乙醇胺。
固体制剂可以用于本发明。其可以配制成例如丸剂、片剂、粉剂或胶囊剂。对于固体组合物,可以使用常规的固体载体,其包括如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。合适的药物赋形剂包括例如淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁,硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯乙二醇、水、乙醇。
当口服给药时,本发明的组合物可免受消化。这可以通过将抗体或其抗原结合部分与组合物相络合以使其耐受酸性和酶促水解,或通过将抗体或其抗原结合部分封装在适当的抗性载体如脂质体中来实现。保护化合物免受消化的手段是本领域公知的。Fix,PharmRes.13:1760-1764,1996。Samanen,J.Pharm.Pharmacol.48:119-135,1996。美国专利第5391377号。
对于经粘膜或透皮给药,可以在制剂中使用适用于待渗透屏障的渗透剂。这样的渗透剂通常是本领域已知的,并包括如用于经粘膜给药的胆盐和夫西地酸衍生物。此外,去污剂可以用于促进渗透。粘膜给药可以通过鼻腔喷雾或使用栓剂。Sayani,Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst。13:85-184,1996。对于局部给药、透皮给药,将制剂配制成软膏剂、乳膏剂、油膏剂、粉末和凝胶。透皮递送系统还可以包括如贴剂(patch)。
本发明的组合物也可通过持续递送或持续释放的机制进行给药。例如,可生物降解的微球或胶囊或其它能够持续递送肽的生物可降解聚合物结构可以包括于本发明的制剂中(参见,例如Putney,Nat.Biotechnol.16:153-157,1998)。
对于吸入剂,本发明的组合物可以使用任何本领域已知的系统进行递送,包括干粉气雾剂、液体递送系统、空气喷射喷雾器、喷射系统等。Patton,Biotechniques16:141-143,1998。本发明还可以使用用于多肽大分子的产品和吸入递送系统,如DuraPharmaceuticals(San Diego,Calif.)、Aradigrn(Hayward,Calif.)、Aerogen(SantaClara,Calif.)、Inhale Therapeutic Systems(San Carlos,Calif.)等。例如,药物制剂可以以气雾剂或喷雾的形式进行给药。对于气雾剂给药,制剂可以以细碎的形式与表面活性剂和推进剂一起提供。在另一个方面,用于将制剂递送到呼吸组织的装置是使制剂汽化的吸入器。其它液体递送系统包括如喷气喷雾器。
本发明的组合物或核酸、多肽或抗体可以通过本领域已知的任何手段单独递送或作为药物组合物进行递送,例如全身性、区域性或局部地;通过动脉内、鞘内(IT)、静脉内(IV)、肠胃外、内胸膜腔、局部(topical)、口服或局部给药,如皮下、气管内(如通过气雾剂)或经粘膜(如口腔、膀胱、阴道、子宫、直肠、鼻腔粘膜)。对于“区域效应”,例如集中于特定器官,给药的一个模式包括动脉内或鞘内(IT)注射,例如集中于特定器官如大脑和CNS(参见,如Gurun,Anesth Analg。85:317-323,1997)。例如,内颈动脉注射可用于希望能够将本发明的核酸、肽或多肽直接递送至脑。用于制备肠胃外给药的组合物的实际方法对于本领域技术人员是已知的或显而易见的,并已经被详细说明。Bai,J.Neuroimmunol.80:65-75,1997。Warren,J.Neurol.Sci.152:31-38,1997。Tonegawa,J.Exp.Med.186:507-515,1997。
在一个方面中,包含本发明的组合物或核酸、多肽或抗体的药物制剂被并入脂质单层或脂质双层如脂质体中。美国专利第6110490、6096716、5283185和5279833号。本发明的方面还提供了其中将本发明的水溶性核酸、肽或多肽附着于单层或双层的表面的制剂。例如,肽可以附着于含有酰肼-PEG-(二硬脂酰磷脂)乙醇胺的脂质体上(参见,例如,Zalipsky,Bioconjug.Chem.6:705-708,1995)。脂质体或任何形式的脂质膜,如平面脂质膜或完整细胞如血红细胞的细胞膜都可以使用。脂质体制剂可以通过任何方式,包括静脉内、透皮(参见,例如,Vutla,J.Pharm.Sci.85:5-8,1996)、经粘膜或口服给药。本发明还提供了其中将本发明的核酸、肽和/或多肽引入微粒和/或脂质体中的药物制剂(参见,例如,Suntres,J.Pharm.Pharmacol.46:23-28,1994;Woodle,Pharm.Res.9:260-265,1992)。脂质体和脂质体制剂可以根据本领域公知的标准方法来制备。Akimaru,CytokinesMol.Ther.1:197-210,1995。Alving,Immunol.Rev.145:5-31,1995。Szoka,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467,1980。美国专利第4235871、4501728和4837028号。
在一个方面中,组合物用载体进行制备,其将保护肽免于从体内快速消除,如控释制剂,包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物,如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的方法对于本领域技术人员是显而易见的。脂质体悬浮物也可用作药学上可接受的载体。美国专利第4522811号。
有利的是,为了便于给药并使剂量均匀,以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物。如本文所用的剂量单位形式是指和待治疗受试者的单一剂量相匹配的物理离散单元;每个单元含有经计算产生所期望治疗效果的预定量的活性化合物和所需的药物载体。
从细胞培养分析和动物研究所获得的数据可用于配制一系列用于人类使用的剂量。在一个实施方式中,此类化合物的剂量位于包括具有很小或没有细胞毒性的ED50的循环浓度范围内。剂量可以依据所用的剂量形式和给药途径在此范围内变化。在另一个实施方式中,治疗有效剂量可以从细胞培养分析开始进行估计。可以在动物模型中配制剂量以获得包括在细胞培养中所测定的IC50(即,测试的化合物获得症状的最大抑制的一半的浓度)的循环血浆浓度范围。Sonderstrup,Springer,Sem.Immunopathol.25:35-45,2003。Nikula等人,Inhal.Toxicol.4(12):123-53,2000。
本发明的抗体或其抗原结合部分的治疗或预防有效量的示例性的、非限制性范围为约0.001至约60mg/kg体重、约0.01至约30mg/kg体重、约0.01至约25mg/kg体重、约0.5至约25mg/kg体重、约0.1至约20mg/kg体重、约10至约20mg/kg体重、约0.75至约10mg/kg体重、约1至约10mg/kg体重、约2至约9mg/kg体重、约1至约2mg/kg体重、约3到约8mg/kg体重、约4到约7mg/kg体重、约5至约6mg/kg体重、约8至约13mg/kg体重、约8.3至约12.5mg/kg体重、约4至约6mg/kg体重、约4.2至约6.3mg/kg体重、约1.6至约2.5mg/kg体重、约2至约3mg/kg体重或约10mg/kg体重。
配制组合物以包含有效量的本发明的抗体或其抗原结合部分,其中所述量取决于待治疗的动物和待治疗的病症。在一个实施方式中,施用本发明的抗体或其抗原结合部分的剂量范围为约0.01mg至约10g、约0.1mg至约9g、约1mg至约8g、约1mg至约7g、约5mg至约6g、约10mg至约5g、约20mg至约1g、约50mg至约800mg、约100mg至约500mg、约0.01mg至约10g、约0.05μg至约1.5mg、约10μg至约1mg蛋白、约30μg至约500μg、约40pg至约300pg、约0.1μg至约200mg、约0.1μg至约5μg、约5μg至约10μg、约10μg至约25μg、约25μg至约50μg、约50μg至约100μg、约100μg至约500μg、约500μg至约1mg、约1mg至约2mg。对于任何特定受试者的特定剂量水平取决于多种因素,包括具体肽的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径以及排泄速率、药物组合和受治疗的特定疾病的严重程度。
在治疗应用中,本发明的组合物以足够的量施与具有艰难梭菌细菌感染风险的或患有活性感染的受试者以至少部分地阻止或预防病况或疾病和/或其并发症。
抗毒素抗体(如单克隆抗体)也可用于通过标准技术如亲和层析或免疫沉淀来分离毒素。此外,抗毒素抗体可用于检测毒素,例如,用于筛选样品(例如,粪便样品)中艰难梭菌的存在。抗毒素抗体可用于诊断性地监测组织中毒素的水平,以作为临床检测程序的一部分,例如,以确定给定治疗方案的效力。
本发明还提供了含有抗毒素抗体或其抗原结合部分的试剂盒。试剂盒的其他组成可以包括如下的一种或多种:使用说明;其它试剂,治疗剂,或用于连接抗体与标签或治疗剂的试剂,或其它用于制备用于给药的抗体的材料;药学上可接受的载体;和用于对受试者给药的装置或其它材料。
抗体的不同组合可以包装在一起。例如,试剂盒可以包括结合毒素A的抗体和结合毒素B的抗体(例如,抗毒素B单克隆抗体或与毒素B反应的多克隆抗血清)。抗体可以混合在一起,或在试剂盒中分开包装。
使用说明可以包括包含例如在患有CDAD症状的患者中建议的剂量和/或给药方式的治疗应用说明。其它说明可包括偶联抗体与标签或治疗性试剂或例如从未反应的结合组分纯化结合的抗体,的说明。
试剂盒可以包含或不包含至少一种编码抗毒素抗体或其片段的核酸,以及用于表达核酸的说明。试剂盒的其它可能的组分包括表达载体和细胞。
本发明的抗体、抗原结合部分、组合物和方法可以用于所有脊椎动物,如哺乳动物和非哺乳动物,包括人类、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、狗、猫、牛、马、山羊、绵羊、猪、猴、猩猩、大猩猩、黑猩猩、兔、鸭、鹅、鸡、两栖动物、爬行动物和其它动物。
用于实施本发明的特定方面的下述实施例仅用于说明的目的,并不意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1:杂交瘤融合
进行经典的杂交瘤融合。利用完全弗氏佐剂(CFA)使小鼠获得首次类毒素A免疫接种,并在28天和48天用类毒素A和不完全弗氏佐剂(IFA)进行2个随后的加强免疫。在55天进行实验性抽血并进行血清测试以检查抗类毒素A抗体的滴度。如果IgG滴度足够高则进行融合。如果不够高,小鼠再次接受两个IFA的加强免疫并进行第二次实验性抽血。同时用2只小鼠进行融合。融合前3天用PBS中的类毒素A对小鼠进行最后的推注法腹腔内注射(i.p.)。
融合当天,处死小鼠并移除其脾。用注射器和针头从脾中洗涤脾细胞并收集于50ml管中,以用于与骨髓瘤细胞融合。骨髓瘤是用作融合伴侣的永生化肿瘤细胞系,在存在8-氮鸟嘌呤时生长,8-氮鸟嘌呤是能阻断补救途径的有毒的核苷酸类似物。在8-aza存在时生长的细胞仅在次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)基因发生缺陷突变时才能存活。通过使用聚乙二醇(PEG)1500将B细胞与骨髓瘤细胞融合。融合的细胞混合到具有药物选择的半固体琼脂中并铺于培养皿中。含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的HAT培养基用于药物选择。氨基蝶呤是抑制核苷酸代谢从头合成途径的药物,其是HGPRT缺陷的骨髓瘤细胞系生存/细胞生长所绝对需要的,并通常允许在24-48小时内进行选择。
实施例2:杂交瘤的筛选
下一步是对生长的杂交瘤进行筛选。使用市售的半固体琼脂,在该琼脂中细胞生长为3-D基质中的细胞“球”。这利于这些球的手工挑选(通过视觉检查),并转移这些克隆球到含有合适的培养基的96孔板中。使细胞生长3-7天,然后除去上清液以用于筛选并用新鲜培养基替换。通过将ELISA(或其它测试)中阳性的结合转移到具有更大体积的更大组织培养皿中,使杂交瘤继续生长。使用用于鼠mAb的合适商用同种型(isotyping)试剂盒并使用消耗的上清将mAb分出同种型(isotyped)。将克隆移到选择的下一个阶段的决定是基于使用ELISA的其对原生毒素A的反应以及其存活,通常基于系列稀释和至少1/8或1/16或更高的反应性,以及IgG种类;因此在整个选择过程中克隆的数量减少了。进一步表征的mAb为:CAN20G2、CAN20G1、CAN20G5&CAN20G8和CAN19G1、CAN19G2、CAN19G3。
实施例3:小鼠单克隆抗体的ELISA分析
使用ELISA测试toxA mAb对完整毒素A和重组毒素A片段4的结合,以及确定其是否对完整毒素B和毒素B片段4是交叉反应的。mAb克隆与CDA1相比较(Merck抗毒素A mAb作为对照)。用100μg/ml毒素片段4和400μg/ml完整毒素包被ELISA平板,以使包被是等摩尔的。用1%脱脂牛奶将孔封闭,然后用系列稀释的CAN19或CAN20mAb(0.1μg/ml至1μg/ml)进行探针检测并用市售山羊抗小鼠IgG-HRP抗体检测结合。也进行阴性和阳性对照。嵌合人mAb13C6对埃博拉病毒GP是特异性的并用作人类CDA-1的Fc的阴性对照。CDA-1mAb和多克隆类毒素A抗体(pAb)用作阳性对照,但是,CDA-1mAb是人的且多克隆是兔的,因此,它们都使用了直接比较它们且不能比较鼠mAb的不同的二抗。二抗对照用于鼠二抗。用底物孵育60分钟后,板于405nm进行读数。每个抗体的滴定数据显示于图1中。
结果:如图2和3所示,CAN19G1和CAN19G2mAb以与CDA1结合水平相似的水平结合到完整毒素A和毒素A片段4上。CAN19mAb对于毒素B几乎不显示交叉反应性。CAN20mAb结合毒素A。CAN20G2和CAN20G5以与CDA1结合水平相似的水平结合毒素A片段4。CAN20mAb均未表现出对毒素B的交叉反应性。
实施例4:小鼠单克隆抗体的Western印迹
将艰难梭菌蛋白的组合于200伏特下跑4-12%的SDS-PAGE胶1.5小时;完整毒素A、类毒素A(商业化)、重组毒素片段4和毒素B(完整、类毒素和片段4)。然后于45伏特转移凝胶到硝酸纤维素膜45分钟。在4℃用1xTBST中的1%脱脂牛奶将膜封闭过夜,第二天用1xTBST洗涤以除去脱脂牛奶。mAb(1°Ab)以1μg/ml的浓度稀释于1xTBST,并用于在室温(RT)下、在振荡器上探测含有转移产物的膜2小时。然后将膜用1xTBST洗涤以除去未结合的1°Ab并用1:4000稀释的抗小鼠IgG-HRP(2°Ab)于室温在振荡器上探测1小时。
结果:如图4和5所示,所有3个CAN19mAb均显示结合到完整毒素A、类毒素A和毒素A片段4。它们都仅显示对毒素B或阴性对照的弱的交叉反应性或无交叉反应性。CAN20G1、CAN20G2、CAN20G5和CAN20G8mAb都显示出强的对完整毒素A和毒素A片段4的结合。它们对毒素B或阴性对照没有交叉反应性。
实施例5:小鼠单克隆抗体的亲和性分析
生物层干涉技术(biolayer interferometry)用来测量完整毒素A和抗毒素A抗体之间的相互作用。Octet QKe仪器(ForteBio)配备了链霉亲和素(SA)生物传感器。40μg/ml的生物素化的完整毒素A偶联到SA传感器,且从100nM至1.56nM系列稀释的毒素A mAb在毒素包被的针上反应10分钟,随后在PBS中进行另外10分钟的解离步骤。之后用ForteBio数据分析软件分析结果以确定解离常数(KD),解离常数是用于描述抗体和抗原之间的结合强度的量度,kon(1/Ms)是抗体抗原复合物形成的结合速率(on-rate),kdis(1/s)是抗体抗原复合物解离的解离速率(off-rate)。在2个分别的日子运行样品。表4显示了对于纯化的CAN20G版本以及CDA1的亲和数据。
表4对于纯化的CAN20G版本和CDA1的亲和数据
ID名称 |
KD(M) |
kon(1/Ms) |
kdis(1/s) |
CAN20G1 |
1.79E-09 |
1.23E+05 |
2.19E-04 |
CAN20G2 |
4.19E-12 |
1.04E+05 |
4.35E-07 |
CAN20G5 |
2.01E-09 |
8.38E+04 |
1.68E-04 |
CAN20G8 |
1.65E-09 |
l.31E+05 |
2.16E-04 |
CDA1 |
6.24E-10 |
4.80E+05 |
2.91E-04 |
实施例6:小鼠单克隆抗体的表位框并(Epitope Binning)
Octet QKe是实时无标记生物传感器,其使用一次性光纤传感器,通过生物层干涉检测生物分子相互作用。对先前表征的CDA1抗毒素A mAb进行表位框并分析以检测所述毒素A mAb是否与CDA-1共享相似或不同的表位。其次,分析用于确认毒素A mAb之间共享的单个或潜在的多个表位框。使用经典的夹心法,并且包括连接mAb到传感器、结合抗原,然后结合到另一个mAb。只有当其表位不与固定化的mAb的表位重叠时,次级mAb才能结合捕获的Ag。
结果:CAN20G1和PBS对照上的波长的强nM漂移(在结合曲线上的垂直增加)表示能够产生更多的结合且测试抗体结合到暴露的且不同的表位。如图6a和6b所示,结果表明,CDA1抗体具有波长的升高的漂移。这表明CDA1和CAN20mAb结合到不同的表位。所有CAN20mAb共享相同的表位。CAN20G2的轻微nm升高表明结合的轻微增加,其可能是由于CAN20G1和CAN20G2的已知的VH和VL链、不同的抗体表位或两者之间的体细胞突变。
实施例7:小鼠单克隆抗体的体外中和
使用从List Biological Laboratories购入的VERO(绿猴)细胞和毒素A进行本文所述的体外中和分析。(BIAD报告:艰难梭菌毒素A单克隆抗体的表征)。用于xCelligence(罗氏诊断)和Bioassy法的规程总结如下。
细胞附着阶段-xCelligence法。(1)在源瓶(source flask)中胰蛋白酶消化细胞。(2)加2mL的胰蛋白酶至瓶中并洗涤细胞以去除痕量的培养基再抽出。(3)加入3mL胰蛋白酶并在37℃下孵育约10分钟,直到细胞分离。(4)添加6mL的分析培养基或生长培养基于瓶中。(4)1300rpm离心8分钟。(5)抽出上清并用6mL分析培养基或生长培养基重悬细胞。(6)细胞计数并计算所需的细胞密度。(对于Vero细胞,1×105个细胞/mL;对于T84细胞,8×105个细胞/mL)。(7)向96孔E板(E-plate)中加入100μL分析培养基至孔A1至H10,并加入100μL的T84培养基至孔A11至H12。(8)在xCelligence上进行背景读数。(9)从孔A1-H10中移除50μL的分析培养基。(10)加入50μL的1.0×105个细胞/mL的悬浮液至这些孔,使达到最终的5.0x104个细胞/mL的接种密度。(11)加100μL的T848x105个细胞/mL的细胞悬浮液到A11和A12中。(12)从H11和H12进行2倍系列稀释。(13)从H11和H12取出100μL。(14)加100μL的T84培养基至A11-H12,使终体积为200μL。(15)在室温下孵育板20-30分钟,以使细胞沉降均匀。(16)将板置于37℃培养箱中,5%CO2覆盖20-24小时。
细胞附着阶段-Bioassy法。(1)在源瓶中胰蛋白酶消化细胞。(2)从源瓶中合并细胞。(3)以1270RPM离心细胞8分钟。(4)去除上清,并重悬细胞于分析培养基中。(5)每个合并的瓶中使用6mL培养基。(6)细胞计数以确定细胞生存力和以1.0×105个细胞/ml铺板所需的细胞数量。(7)铺板时终浓度为0.5×105个细胞/mL。(8)添加50μL的10%分析培养基于96孔黑色透明底微孔板的孔B2-G11中。(9)以1.0×105个细胞/mL覆盖50μL的细胞于96孔平底微量培养板的孔B2-G11中。(10)对于外缘孔,加入100μL温的分析培养基。(11)在平板振荡器上混合为均质悬浮液。(12)在室温下放置板20-30分钟,以使细胞沉降均匀地分布在孔中。(13)将细胞板置于37℃、5%CO2的湿润培养箱中20-24小时。
毒素A的制备:(1)通过加入100μL无菌LW到毒素A的一个小瓶(2.0μg)中以制备毒素A主要储备液(20μg/ml)。(2)如表5所示稀释主要储备液。
表5
样品制备:为了测试效价,所有单克隆抗体的初始浓度为30μg/mL。如表6所示制备样品。
表6
稀释板制备-xCelligence:(1)添加分析培养基和150μL的样品至孔中,如下述表7所示。(2)列中的每个样品连续稀释2倍,从行A取出75μL并加入到行B,混合3至5次并重复至行G。(3)添加合适的对照到孔中,如表5所示。(4)用75μL毒素A覆盖样品孔。在板振荡器上振荡直至均质。(5)在37℃下孵育1小时。
表7:xCelligence稀释板设计
Bioassy法:添加分析培养基至孔,如表8所示。
(1)添加150μL样品到列2的合适孔中。在板#1上添加CDA、CAN19G1(纯化的)和CAN19G1上清。在板#2上添加CDA、纯化的CAN19G2和CAN19G2上清。在板#3上添加CDA、纯化的CAN19G3和CAN19G3上清。(2)从列2转移75μL至列3。用多通道混合。重复过程至列9。(3)从列10移除75μL,留下的终体积为100μL。(4)添加对照(75μL)及75μL的AM至合适的孔中。(5)用75μL毒素A覆盖样品孔。
表8:Bioassay稀释板设计
样品添加至细胞板:(1)孵育1小时后,从培养箱中取出细胞板。(2)用多通道移液器小心地移除50μL细胞悬浮液,确保不破坏细胞单层。(3)从稀释板转移100μL样品到细胞板的合适孔中。(4)于平板振摇器上混合以均质溶液。于37℃、5%CO2覆盖孵育72小时。
数据分析:xCelligence系统实时采集数据。出于与常规生物分析方法比较的目的,分析最终读出时间数据。为此,我们在毒素/抗体加到板中之前的时间点通过使用合适的毒素孔作为基线将细胞指数归一化。这将创建Y轴的基线归一化的细胞指数对抗体浓度的对数。
我们分析数据以确定与CDA相比的CAN19mAb的效价。
用xCelligence计算%中和,如下:
%中和=(样品CI指数/抗体对照CI指数)*100
用生物分析荧光计算%中和,如下:
%中和=(平均样本RFU/平均毒素RFU)/(平均细胞RFU/平均毒素RFU)*100
对CAN20mAb也进行了此实施例的程序。
结果:CAN19mAb比CDA1中和更少。CAN20G2是体外最有效的mAb且比CDA1更有效。CAN20G3、G5和G8也是中和的。
表9总结了每个CAN19mAb所产生的IC50数据,证明CAN19克隆比CDA1中和更少。
表9
样品 |
IC50 |
|
CDA |
0.347ug/mL |
标准 |
1 |
2.31ug/mL |
CAN19G1 |
2 |
2.17ug/mL |
CAN19G2 |
3 |
2.44ug/mL |
CAN19G3 |
表10总结了每个CAN20mAb产生的EC50数据,表明CAN20G2、CAN20G3、CAN20G5和CAN20G8是克隆中最中和的。
表10
1EC50值是中和50%的TcdA毒素剂量的抗体浓度。
实施例8:小鼠体内毒素攻毒
小鼠体内毒素攻毒测试基于之前的出版物(Babcock等人,Human MonoclonalAntibodies Directed against Toxins A and B prevent Clostridium difficile-Induced Mortality in Hamsters。Infection and Immunity(2006)74(11):6339)。体重20-30g的瑞士Webster小鼠于第0天给予250μg的mAb或对照,并允许休息。24小时后(1天),对小鼠给予致死剂量的TcdA(100ng)。该剂量在24小时杀死90-100%的处于无保护状态的动物。观察小鼠7天(1-7天),以观察异常以及局部和全身性疾病的迹象。在第7天处死小鼠。记录所有的观察结果并确定每个治疗组的%生存率。
结果:如图7、图8和9所示,研究结果表明,CAN19和CAN20mAb保护小鼠抵抗毒素A。用CAN19G1、G2和G3时有>90%的生存。所有三个CAN19mAb均显示了效力。所有CAN20mAb是有效的。剂量为0.25mg/小鼠的CAN20G1、G2、G5和G8显示出100%的保护。0.125mg/小鼠的CAN20G2显示出100%的保护。重复实验以确认CAN20G2的效力。结果证实了以前的研究。CAN20G2在全剂量0.25mg/小鼠时显示出100%的保护并且在半剂量0.125mg/小鼠时显示出90%的保护。
实施例9:muCAN20G2V基因测序
从CAN20G2亲本杂交瘤克隆细胞系使用RNeasy Mini试剂盒分离RNA。使用QiagenOneStep RT-PCR试剂盒从RNA扩增V基因。所使用的引物组的几种组合如下:为了从杂交瘤确认免疫球蛋白可变区基因序列,使用一组可变区基因(V基因)亚组-特异的寡核苷酸引物。其包括5’mVK-Lead-1、3’KappaConstRT、5’mVH-Lead-2、5’mVH-Lead-2A和3’mIG1-2CRT。为了从已知的和内源的异常κ轻链V基因mRNA(发现于P3X63骨髓瘤)(Yuan,X.等人,J.Immunol.Methods,294:199-207(2004))排除潜在污染,还使用非亚群特异性引物组进行RT-PCR,5’mVK-Lead-1A、5’mVK-Lead-1A、5’mVK-Lead-3、5’mVK-Lead-3A、5’mVH-IGHV1-Lead、5’mVH-Lead-1、5’mVH-Lead-3、5’mVH-Lead-4和5’mVH-Lead-5。参考图10的引物和其序列的列表。PCR扩增反应的结果通过在分析性琼脂糖凝胶上检测PCR产物来确定,并且在约500bp的可视化的带从凝胶中分离以用于克隆。所提取的DNA用TOPO TA克隆手册中的低熔点琼脂糖法直接TA克隆到pCR2.1-TOPO载体中。每个CAN20G克隆反应的5个群落使用M13正向和M13反向引物进行双向测序。用DNAStar lasergene软件进行序列数据分析。所得到的重排V基因序列与IMGT/V-Quest参考目录组进行比较并进行NCBI免疫球蛋白blast搜索(图11)。
实施例10:muCAN20G2的人源化
已创建了3个人源化的CAN20G2mAb的IgG/k版本以及嵌合IgG1/k。对于人源化版本,使用与人类种系等位基因的最大同一性比对(来源于IMGT和NCBI网站)以帮助识别受体框架。所有的6个CDR都被插入。分别由于表面暴露或参与折叠或链间接触,其它残基被改变或保持。鼠mAb序列(CAN20G2)的CDR与最接近的人类等位基因的种系CDR匹配很好。这类似于“超人源化(superhumanization)”法,其中CDR匹配而不是总框架被用于使用种系序列作为受体框架的的改变中。在Tan等人,J.Immunol.2002,169:1119-1125的例子中,作者使用了CDR序列,并试图匹配基于Chothia分类系统的所谓的CDR的典型类。但是,由于特定的CDR是种系编码的且特定的典型构象倾向于被发现于某些框架,选择受体框架的“超人源化”法不会在所有情况下导致不同的候选受体框架的选择。其是经验性的并仍要对多个mAb特异性进行测试。这部分地是因为用于框架同一性的直接(straight-up)比对也在比较中内在包含CDR。表11显示了每个CAN20G2的人源化构建体的氨基酸水平的人源化百分比。
表11
图12显示了muCAN20G2V-区与最接近的人类种系V-区的比对。人类种系用作人源化的受体框架。
CDR-huCAN20G2-仅移植CDR。VH和Vk二者的最佳匹配种系等位基因被用作移植CDR的受体框架。对受体框架没有进行其它变化。图13a和13b显示了我们使用的CDR-huCAN20G2设计的设计。最接近的匹配的人类框架是IGHV7-4-1*02和IGKV1-39*01。muCAN20G2的CDR(IMGT编号)被插入到人类框架。包含HpaI酶切位点的重链CDR3被改变用于克隆到pcDNA3002Neo中。添加5’Kozak和HAVT20前导序列以正确翻译和转运。
HE-huCAN20G2“人类工程化”使用与Studnicka等人(1994)中所使用的用于人源化鼠mAb至CD5的“人类工程化”策略最相似的策略产生该人源化的版本。本质上,单独鉴定CAN20G2VH和Vk二者的最接近的人类种系等位基因,并设计用作受体框架。CAN20G2VH与人类IgVH7-4-1*02等位基因具有76%的同一性。移植或改变CDR以匹配CAN20G2mAb序列。HE-hCAN20G2抗体示于图14、15和16。如图例说明所示,某些残基被修饰或被保留。在这种情况下,晶体结构推断取自阿伐斯汀/贝伐单抗(Avastin/Bevacizumab)。阿伐斯汀是人源化单克隆抗体,其识别并阻断血管内皮生长因子A(VEGF-A),并市场化用于晚期结直肠癌的治疗。阿伐斯汀与相同的人类种系基因如CAN20G2VH具有最高的同一性且其可变区结构的晶体结构已被确定。
AVA-huCAN20G2“阿伐斯汀化”-阿伐斯汀VH和Vκ/Jκ等位基因与各自的人源化CAN20G2VH和Vκ免疫球蛋白可变区的翻译的比对示于图17。利用通过晶体结构数据发现于其它mAb的VH和VL的自然顺序配对将许多mAb人源化。在这种情况下,我们使用与版本1-HE(其与阿伐斯汀VH具有高同一性)中相同的VH,并且我们使用阿伐斯汀Vk作为轻链受体框架。这使我们能够在我们的设计中利用已知的链间接触和修饰(图18)。
嵌合-huCAN20G2嵌合版本:设计嵌合CAN20G2作为对照。CDR以外的某些残基参与了超变区的结构。在人源化过程中一些残基可被改变。因为典型结构内的序列变化将调节互补位的构象,确定亲和力/功能/中和的损失/获得是否是由于人源化过程或人Fc区是必要的。设计CAN20G2鼠V-区到人IgG1和人κ恒定区。结构包含Kozak、HAVT20前导和双终止序列(图19A和19B)。
实施例11:人源化抗体的SDS Page和Western印迹分析
在HEK293F细胞中进行大规模转染(300ml)以获得大量的各个huCAN20G2mAb。用300μg的huCAN20G2质粒DNA转染共计3×108个细胞。转染后3天和7天时通过离心(3000rpm,15分钟,RT)收集上清。转染的上清通过0.22μm滤器进行过滤。经过滤的上清使用AktaPurifierFPLC在蛋白G柱(HiTRAP HP,GE Healthcare)上进行纯化。洗脱的蛋白的缓冲液被交换到D-PBS中,并用BCA分析测定浓度。从300ml培养物纯化30-45mg的范围。纯化的蛋白跑SDS-page以确认其大小(图22)。纯化的mAb也用来探测具有完整毒素A和毒素A片段4的膜,以确认mAb的结合特征(图23)。
实施例12:人源化抗体的体外中和分析
进行使用CT-26细胞的艰难梭菌毒素的体外中和分析以测试人源化mAb克隆对艰难梭菌毒素A的中和能力。CT-26细胞以2.5-3×104个细胞/100ul/孔的浓度接种于96孔板中并于37℃在CO2培养箱中孵育4-5小时。仅含培养基(无细胞)的2个空白孔也包括在该板中。
于管中制备毒素和毒素/Ab混合物,并用RPMI培养基稀释至所需的浓度。将管留在室温下孵育1小时。从板的孔和每个管中移除含有单独的培养基、单独的毒素或毒素/Ab混合物的培养基,转移到其指定的孔中。将板在37℃和5%CO2下孵育48小时。将WST-1检测试剂加入到每个孔中(孔中10μl试剂/100μl体积)并在37℃和5%CO2下孵育1小时。振摇板1分钟,然后在450nm处读数。
基于细胞对照测定细胞活力,如下:
%细胞活力=待测细胞的平均OD/细胞对照的平均OD×100。
通过如下公式计算毒素中和:
%中和=(样品OD-对照毒素OD)/(细胞对照OD-毒素对照OD)*100
结果:如图20a和20b所示,嵌合CAN20G2和HE-CAN20G2在所有的mAb浓度中是最中和的。HE-CAN20G2在大多数mAb浓度中对于任一毒素A浓度更加中和。Medarex CDA IgG和hCDR mAb表现出相似的温和中和能力,且AVA-CAN20G2显示出极小的中和能力。
实施例13:人源化抗体的亲和分析
使用生物层干涉法测量完整毒素A和人源化CAN20G2抗体之间的相互作用。OctetQKe仪器配备了链霉亲和素(SA)生物传感器。40μg/ml的生物素化的完整毒素A偶联到SA传感器,且人源化版本(从100nM至1.56nM的系列稀释)与毒素连接10分钟,随后在PBS中进行另一个10分钟的解离步骤。然后使用ForteBio数据分析软件分析结果以确定KD(nM),KD是用来描述抗体和抗原之间结合强度的量度,kon(1/Ms)是抗体抗原复合物形成的速率,以及kdis(1/s)是抗体抗原复合物解离的速率。
结果:来自2个实验的结果取平均值,并表明muCAN20G2和chCAN20G2在三倍之内,表明亲和力无损失(表10)。相反,AVA-CAN20G2显示亲和力几乎完全损失。CDR-huCAN20G2表现出的亲和力损失与AVA人源化版本相近。HE-huCAN20G2版本的结合亲和力比所有其它人源化版本略高,但处于与嵌合CAN20G2相比亲和力损失极小或没有损失的可接受的三倍范围之内。我们相信这是最佳的比较者,因为我们无法预知交换人类恒定区与鼠IgG2a恒定区的效果,且该比较考虑到这一点。通过ForteBio专家系统(experts),认为3倍范围比较是无关紧要的变化。
表12纯化的人类CAN20G2版本的亲和力数据。
|
KD(M) |
kon(1/Ms) |
kais(1/s) |
muCAN20G2-2-1 |
1.66E-10 |
1.08E+05 |
1.80E-05 |
chCAN20G2 |
1.72E-10 |
1.14E+05 |
1.93E-05 |
AVA-CAN20G2 |
1.33E-09 |
5.45E+04 |
9.02E-05 |
HE-huCAN20G2 |
3.32E-10 |
9.39E+04 |
3.14E-05 |
CDR-huCAN20G2 |
8.00E-10 |
6.76E+04 |
5-41E-05 |
实施例14:人源化抗体的ELISA试验
在HEK293F细胞中进行中等规模(150m1)的转染,以测试huCAN20G2mAb的表达。用150μg的DNA转染总计1.5×108细胞。转染后3天和7天通过离心(3000rpm,15分钟,RT)收集上清。转染的上清通过0.22μm滤器进行过滤。来自中等规模转染的过滤的上清在纯化前用ELISA进行筛选。进行ELISA以测试人类mAb克隆对完整毒素A和毒素A片段4的结合。人类mAb克隆与CDA1和嵌合CAN20G2相比。ELISA板用100μg/ml的毒素A片段4和400μg/ml完整毒素A包被,以使包被等摩尔。用连续稀释的mAb(0.128ng/ml至10μg/m1)对包被进行探测并用抗人类IgG-HRP抗体检测结合。板在与底物孵育60分钟之后在405nm处读数。
结果:如图21a-d所示,除了嵌合版本之外,所有3个mAb CAN20G2的人源化版本也在ELISA中以相似的强度结合完整全毒素A。相反,人源化mAb与重组毒素A片段4的结合存在明显不同,其是已知的与亲本CAN20G2定位和结合的TcdA的域。这可能是功能性的指示,如果这个与片段4的结合与体外和体内保护相关,并可以允许开发域4分析以作为CAN20G2效力的替代。嵌合和HE mAb似乎结合相似,而CDR mAb结合程度更低且AVA mAb似乎并不结合毒素A片段4。
实施例15:TcdA的体内攻毒
基于体外数据,CAN20G2的CDR和HE人源化版本在小鼠致死毒素攻毒模型中进行体内测试并与嵌合版本相比较(如上述实施例8所述)。体重为20-30g的瑞士Webster小鼠在0天施予250ug的mAb或对照,并使其休息。24小时后,对小鼠施用致死剂量的TcdA(100ng)。这个剂量在24小时100%杀死处于无保护状态的动物。4天内观察小鼠的临床症状、异常以及局部和全身性疾病。记录所有的观察结果并且结果总结于13,其显示所有测试的抗体(包括HE和CDR版本)对中和毒素A有效并且在体内保护对抗毒素A攻毒。
表13小鼠中Can20G2人源化mAb对抗TcdA攻毒的效果。
实施例16:人源化抗体的免疫原性分析
为了确定其免疫原性,于EpiScreenTM(Antitope Ltd)时程T细胞分析中对CDR-huCAN20G2和HE-huCAN20G2进行测试,使用两个标记物(增殖和IL-2生产)以测量T细胞活化。
具体来说,从21个表现有HLA(人类白细胞抗原)同种异型的健康供体的组群中制备外周血单核细胞(PBMC)。使用CD8+-去除的PBMC建立批量培养。在加入抗体后的不同时间点通过掺入[3H]-胸苷测量CD4+T细胞的增殖。平行于增殖分析,还使用ELISpot分析测定IL-2的分泌。
方法
供体PBMC的制备和选择
从健康的社会性供体(community donor)的血沉棕黄层(来自24小时内抽出的血)分离外周血单核细胞(PBMC)。利用Lymphoprep(Axis-shield,Dundee,英国)密度离心从血沉棕黄层分离PBMC并使用CD8+RosetteSepTM(StemCell Technologies Inc,London,英国)去除CD8+T细胞。通过使用基于HLA SSP-PCR的组织分型试剂盒(Biotest,Solihull,英国)鉴定HLA-DR单倍型表征供体。也确定了对对照抗原(匙孔血蓝蛋白(KLH),[Pierce(Perbio),Cramlington,英国)]以及来源于A型流感和EB(EpsteinBarr)病毒的肽的T细胞响应。然后冷冻PBMC并保存于液氮中直至需要。
抗体制备
恰于使用前于培养基(Invitrogen,Paisley,英国)中稀释2个测试抗体且终分析浓度为0.3mM。KLH用作为再现性对照并作为水中的10mg/ml储备液储存于-20℃。对于研究,等份的KLH解冻,之后立即于中稀释成400μg/ml(终浓度100μg/ml)。ELISpot中使用植物性凝血素(Phytohaemagglutanin,PHA,Sigma,Poole,英国)作为阳性对照,并且在用细胞培养基稀释至2.5μg/ml的终浓度之前,将1mg/ml的储备液储存于-20℃。
细胞活力评估
在7天,批量培养物(之前用于增殖分析建立的)轻柔地再悬浮并从所有供体的每个样品移除10ml并与10ml台盼蓝混合。然后,通过使用用自动细胞计数仪(Invitrogen)进行的台盼蓝染色排除评估这些样品的活力。
EpiScreen
T
M时程T细胞增殖分析
来自每个供体的PBMC被解冻、计数和活力评估。于室温的培养基中将细胞复苏、洗涤并重悬浮于中,达到4-6x106PBMC/ml。对于每个供体,将1ml增殖细胞储备液加入到24孔板的相应孔中建立批量培养。将0.5ml的培养基和0.5ml的各个稀释的抗体加入到PBMC中,以获得0.3μM的终浓度。对于各个供体,还包括再现性对照(用100μg/mlKLH培养的细胞)、阳性对照(用2.5μg/ml PHA孵育的细胞)和仅有培养基的孔。培养物在37℃、5%CO2中共计孵育8天。在5、6、7和8天,将每孔中的细胞轻柔地重悬浮并将3×100μl的等份转移到圆底96孔板的各个孔中。培养物在100μl AIM-VR培养基中用0.75μCi[3H]-胸苷(Perkin ElmerR,Beaconsfield,英国)脉冲并在用Skatron Micro96S-10056细胞收获仪收集到过滤垫(Perkin ElmerR)之前再孵育18小时。在1450型Microbeta Wallac Trilux液体闪烁计数器(Perkin ElmerR)上用paralux、低背景计数通过MeltilexTM(Perkin ElmerR)闪烁计数测定每个孔的每分钟计数(cpm)。
EpiScreen
T
MIL-2ELISpot分析
那些增殖分析中所使用的同源供体也用于IL-2ELISpot分析。如上所述,细胞解冻并复苏。预润湿ELISpot板(Millipore,Watford,英国)并用PBS中的100μl/孔的IL-2捕获抗体(R&D Systems,Abingdon,英国)包被过夜。然后将板在PBS中洗涤3次,在封闭缓冲液(PBS中的1%BSA)中孵育过夜,并用培养基洗涤。每个供体的细胞密度调整为在培养基中的4-6x106PBMC/ml,并且每个孔加入100μl细胞。将50μl的样品和对照以及50ml的AIMV加到合适的孔中,使总体积为200ml/孔。在一式六份的培养物中测试抗体,并且对于每个供体,每块板上还包括阴性对照(仅培养基)、无细胞对照和促细胞分裂原阳性对照(2.5μg/ml的PHA-用作用于ELISpot功能和细胞活力的内部测试)。经过8天的孵育期,ELISpot板通过蒸馏水和PBS顺序洗涤(×3)后再加入100μl的PBS/1%BSA中的过滤的生物素化的检测抗体(R&D Systems)来显色。在37℃孵育1.5小时后,将板进一步在PBS中洗涤(×3),加入100μl的PBS/1%BSA中的过滤的链霉亲和素-AP(R&D Systems)1.5小时(室温下孵育)。丢弃链霉亲和素-AP,将板用PBS洗涤(×4)。将100μl的BCIP/NBT底物(R&D Systems)加入到每个孔中并室温孵育30分钟。通过用蒸馏水3次洗涤孔和孔的背面而停止斑(spot)的显色。干燥的板在分析仪上扫描并用ImmunoscanR第4版软件确定每孔的斑(spw)。
EpiScreen
T
M数据分析
对于增殖和IL-2ELISpot分析,预先确立了等于或大于2(SI≥2.00)的刺激指数(SI)的经验阈值,借此样本诱发高于此阈值的响应被认为是阳性的(边界线SI≥1.90也高亮)。广泛分析发展和之前的研究已经表明,这是允许最大灵敏度而不检测到大量假阳性响应或忽略细微的免疫原性事件的最小信号-噪声阈值。对于增殖(n=3)和IL-2ELISpot数据(n=6)组二者,利用如下的统计和经验阈值定义阳性响应:
1.通过使用非成对双样本学生t检验比较测试孔与培养基对照孔的cpm或spw的响应的显著性(p<0.05)。
2.刺激指数大于或等于2(SI≥2.00),其中SI=测试孔(cpm或spw)/基准线(cpm或spw)的平均值。以这种方式给出的数据表示为SI≥2.00,P<0.05。
此外,批内分析变异性通过计算来自平行培养物的原始数据的变异系数和标准差(SD)进行评估。
结果与讨论
尽管当T细胞被激活之后,在IL-2产生和增殖之间普遍有良好的相关性,增殖和IL-2ELISpot分析被独立地解释。用KLH作为再现性对照评估批间分析变异性,其中在2个独立的EpiScreenTM分析中比较阳性T细胞对KLH的响应频率。结果表明,对于KLH-特异性T细胞响应的批间分析变异性在可接受的范围内并与先前研究相符(≤10%)。
细胞活力评估
对在EpiScreenTM时程分析中使用的10个供体进行抗体和缓冲液对PBMC活力的任意总效果的初步评估。在用抗体培养7天后,使用PBMC的台盼蓝染料排除法计算细胞活力。清楚地,2个测试抗体和缓冲液配方没有显著影响细胞活力,因为来自仅有培养基的培养物的PBMC具有类似于样品和KLH处理的细胞的平均活力(93-97%之间)。
EpiScreenT
M
时程增殖分析
图24和表12显示了在由抗体诱导的CD4+T细胞响应的EpiScreenTM时程T细胞增殖分析中所获得的结果。两个测试抗体都在增殖分析中的一个或多个供体中诱导SI≥2.00(P<0.05)的阳性增殖响应。SI≥1.90(P<0.05)的临界响应也被高亮。阳性增殖响应范围为供体组群的5%和24%之间(表14)。表14T细胞增殖和IL-2ELISpot响应的总结
表14中,在整个时程中(5-8天),阳性T细胞增殖响应(SI≥2.00,显著性P<0.05)表示为“P”,且阳性T细胞IL-2ELISpot响应(SI≥2.00,显著性P<0.05)表示为“E”。临界响应(显著性P<0.05且SI≥1.90)显示为(*)。对于供体7,增殖分析的第8天未获得数据。制剂缓冲液在供体1-10上测试,仅供体11-21未用缓冲液测试(灰框)。N/A表示没有数据可用。
抗体CDR-HuCAN20G2与最多的T细胞增殖响应相关,在24%的研究组群(5个供体)中都诱导了阳性响应。相反,抗体HE-HuCAN20G2仅在5%的阳性响应的组群中诱导较少的T细胞增殖响应。这些结果表明,抗体CDR-HuCAN20G2的T细胞增殖响应频率高,而HE-HuCAN20G2则低。在缓冲液对照中未检测出T细胞增殖响应。
T细胞增殖响应等级的分析表明,虽然抗体CDR-HuCAN20G2有高响应频率,响应的等级是低的(平均SI2.13)。对于抗体HE-HuCAN20G2,关于T细胞响应等级未得到结论,这是由于响应供体的数量低(表15)。因此,基于研究组群中阳性T细胞增殖响应的频率(%)确定抗体的总体免疫原性潜力时,CDR-HuCAN20G2比HE-HuCAN20G2有更多的免疫原性。
表15阳性T细胞增殖响应对抗体的的平均等级(±SD)的总结。
样品 |
平均SI |
+/-SD |
响应频率(%) |
CDR-HuCAN20G2 |
2.13 |
0.09 |
24 |
HE-HuCAN20G2 |
2.25 |
0.13 |
5 |
KLH |
2.60 |
0.78 |
86 |
从整个时程(5-8天)内所观察到的所有阳性供体响应的平均值计算平均SI。数据包括边界增殖响应(SI≥1.90,P<0.05)。
T细胞响应的动力学
增殖响应的总体用时可以提供关于T细胞响应潜在类型的信息(首次的或唤起的)。第5天检测到的最大的T细胞增殖表明存在的T细胞前体频率是高的,而在随后几天中的最大增殖表示低的存在的T细胞前体频率。高免疫原性潜力与时程早期阶段的T细胞刺激一致。图25总结了在四天时程中的每一天中对样品所发生的阳性增殖响应的数目。对抗体CDR-HuCAN20G2的T细胞响应最多是在7和8天观察到,这表明,对于该抗体,存在的T细胞前体的数目是低的。抗体HE-HuCAN20G2诱导一个供体作出响应,这是在6、7和8天观察到的。然而,由于只检测到1个响应供体,因此,对于抗体HE-HUCAN20G2,对T细胞前体的数目难以得出结论。
EpiScreen
T
MIL-2ELISpot分析
图26和表12显示了在IL-2ELISpot分析中获得的响应,其在用2个测试抗体刺激后测量了CD4+T细胞的IL-2分泌。与增殖分析类似,在供体中记录了阳性响应,其产生了在测试spw和背景(未处理的培养基对照)之间观察到的SI≥2.00且显著的(P<0.05)的差异。临界响应SI≥1.90(P<0.05)也被高亮。所有样品在一个或多个供体中诱导阳性IL-2ELISpot响应且其在非配对双样本学生t检验中都是显著的(P<0.05)。所有PHA孔对于斑存在都呈阳性,虽然对于ELISpot数据未计算SI值,因为8天后,多数孔包含数量太多以至于无法计数的斑(数据未显示)。
对于2个测试抗体,IL-2ELISpot分析的总体结果与那些在用诱导相同频率的T细胞响应的2个抗体的增殖分析中所获得的结果一致(表16)。由于在增殖分析中抗体CDR-HuCAN20G2在研究组群中诱导最频繁的T细胞响应,具有24%的阳性响应供体(SI≥2.00,P<0.05),而抗体HE-HuCAN20G2在5%的研究组群中诱导T细胞响应。对2个抗体的阳性(包括临界SI≥1.90,P<0.05)T细胞响应的平均等级的评估是低的(对于CDR-HuCAN20G2,平均阳性SI2.39)。
HE-HuCAN20G2的T细胞响应频率是低的,其排除了T细胞响应强度(等级)和免疫原性之间的任何直接相关性。测试抗体的免疫原性的相对风险评估(基于IL-2ELISpot分析中的阳性响应频率)表明,CDR-HuCAN20G2比HE-HuCAN20G2具有更强的免疫原性。
表16对抗体的阳性T细胞IL-2分泌响应的平均等级(±SD)的总结。
样品 |
平均SI |
+/-SD |
响应的频率(%) |
CDR-HuCAN20G2 |
2.39 |
0.52 |
24 |
HE-HuCAN20G2 |
2.63 |
N/A |
5 |
KLH |
4.13 |
1.48 |
95 |
数据包括临界响应(SI≥1.90,P<0.05)。N/A表示没有数据可利用。
结果解释
增殖和IL-2ELISpot分析数据显示,在部分供体中检测到针对2种测试抗体的阳性T细胞响应。增殖和IL-2ELISpot分析之间的总体相关性较高(对于KLH是94%,表14),因此,如前述研究,响应的供体被定义为那些在IL-2ELISpot和增殖分析二者中对每个样本都有阳性响应的。表14显示了在增殖和IL-2ELISpot分析二者中对抗体的阳性响应的总结。从增殖和IL-2ELISpot分析中所获得的数据的比较表明,测试的抗体在分析之间诱导一致频率的阳性T细胞响应。在IL-2ELISpot分析中,所有供体产生对PHA的阳性T细胞响应,这表明在离体培养物中的细胞是有功能的(数据未显示)。来自这2个分析的组合数据组的分析揭示了,在增殖和ELISpot分析二者中具有24%响应供体的抗体CDR-HuCAN20G2的总体响应频率和等级是高的,而具有5%响应供体的抗体HE-HuCAN20G2是低的。
结论
增殖和IL-2ELISpot分析之间的总体相关性是高的,响应供体被定义为那些在2个分析中对每个样本都有阳性响应的。来自2个分析的组合数据组的分析揭示了,具有24%响应供体的抗体CDR-huCAN20G2在2个分析中的总体响应是高的,,而具有5%响应供体的抗体HE-huCAN20G2是低的。先前用一系列生物制品进行的EpiScreenTM T细胞分析表明了分析中供体T细胞响应百分比和临床观察的免疫原性水平之间的明显相关性,而诱导>10%阳性响应的蛋白疗法与在临床中的免疫原性风险相关。目前的研究结果表明,与在EpiScreenTM分析中所测试的其它蛋白疗法相比,抗体CDR-huCAN20G2会被视为具有临床免疫原性风险。相反,抗体HE-huCAN20G2会被视为具有风险低的临床免疫原性。
实施例17:人源化CAN20G2mAb对毒素A攻毒的体内效力
通过测试低剂量抗体,在小鼠致死毒素攻毒模型(如上述实施例8中所述)中对2个人源化CAN20G2抗TcdA mAb:HE-CAN20G2和CDR-CAN20G2的体内保护效力进行了评估。体重为20-30g的瑞士Webster小鼠在0天施予50ug的mAb或对照,并使其休息。24小时后,给小鼠施予致死剂量的TcdA(100ng)。这个剂量在24小时杀死90-100%的处于无保护状态的动物。在14天中观察小鼠的临床症状、异常以及局部和全身性疾病。记录所有观察结果并确定每个治疗组的%存活率。
结果
如图27和28所示,在体内攻毒中,2个人源化CAN20G2mAb在抵抗毒素A中都是有效的。与CDA1和CDR-CAN20G2相比,HE-CAN20G2给予了更好的体内保护。在0.05mg/小鼠的低剂量时,对TcdA致死性攻毒,施予HE-CAN20G2的小鼠与施予CDA1(80%)和CDR-CAN20G2(70%)的小鼠相比具有较高的生存率(90%)。
实施例18:人源化抗体的药代动力学分析
在仓鼠模型和大鼠模型中对CDR-huCAN20G2和HE-huCAN20G2进行药代动力学研究。在仓鼠研究中,用50mg/kg的CDR-huCAN20G2对金色毛发叙利亚仓鼠进行腹膜内注射。在注射后的2h、24h、48h、72h、96h、168h、240h和336h收集血液样本。在注射前5天自测试动物和在不同时间点自标记组(sentinel group)收集对照样品。将血液样品以8000rpm离心10分钟以得到血清。在大鼠研究中,2组的斯泼累格·多雷(Sprague-Dawley)大鼠安装了用于静脉内给药的股静脉导管(FVC)和用于血液收集的颈静脉导管(JVC)。2种抗体CDR-huCAN20G2和HE-huCAN20G2通过单次IV推注以10mg/kg的剂量水平注射给各组大鼠,接着用0.5mL生理盐水冲洗。在给药前、给药后的0.083、1、2、4、8、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、288和312小时从JVC中收集血液样品。全血液(300μL)样品以2200×g离心10分钟以分离血清。
通过ELISA确定血清中的抗体浓度。96孔ELISA板用山羊抗人类IgG包被过夜,亲和纯化和1μg/ml的猴血清(Novus生物制品)吸附。用PBS-T洗涤板并用封闭缓冲液封闭。于1%混合的未经实验的仓鼠血清中稀释抗体参考标准,以产生0.098-100ng/ml范围的标准曲线。稀释的测试样品和标准品在室温下孵育1.5小时。洗涤板,并用HRP-山羊抗人IgG孵育,亲和纯化和猴血清(Novus生物制品)吸附,用TMB过氧化物酶底物系统(R&D系统)显色并用TMB过氧化物酶终止溶液(R&D系统)终止。平板在450nm处在SpectraMax平板阅读器上读取。使用标准曲线计算不同时间点的每个动物的抗体浓度。
结果:对于仓鼠的PK研究,使用用于Windows系统的SAS9.2版进行非房室药代动力学分析,数据列于表17。如所示,CDR-huCAN20G2证实了50mg/kg的给药剂量的终半衰期约6天,其确保了在进一步的效力研究中的抗体保留。
对于大鼠的PK研究,使用Watson7.2.0.02版进行非房室药代动力学分析且数据列于表18和图29A和29B。如所示,2个单克隆抗体的PK概况非常相似。揭示了可比较的暴露水平并且代谢速度接近相同。
表17仓鼠中的人源化抗体的PK研究
表18大鼠中的人源化抗体的PK研究
尽管对本发明的具体方面进行了描述和阐释,这些方面应仅被视为为了说明本发明,而并不视为限制如依照所附权利要求所解释的本发明。本说明书所引的所有出版物和专利申请通过引用以其全文并入本文以用于所有目的,好像通过为了所有目的而引用的每个单独的出版物或专利申请已经被具体地和单独地说明。虽然前述发明已经为了清楚理解的目的,以说明和举例的方式进行了相当详细地描述,但显而易见地,对于本领域普通技术人员而言,可以根据本发明的教导对其作出某些变化和修改而不脱离所附权利要求的精神或范围。