CN105050621B - 防止和治疗多发性硬化症的方法 - Google Patents

防止和治疗多发性硬化症的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105050621B
CN105050621B CN201480013215.5A CN201480013215A CN105050621B CN 105050621 B CN105050621 B CN 105050621B CN 201480013215 A CN201480013215 A CN 201480013215A CN 105050621 B CN105050621 B CN 105050621B
Authority
CN
China
Prior art keywords
etx
antibody
toxin
cell
perfringens
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201480013215.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105050621A (zh
Inventor
蒂莫西·瓦塔尼安
卡里姆·拉希德·鲁玛
V·A·菲谢蒂
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Rockefeller University
Cornell University
Original Assignee
Rockefeller University
Cornell University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rockefeller University, Cornell University filed Critical Rockefeller University
Publication of CN105050621A publication Critical patent/CN105050621A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105050621B publication Critical patent/CN105050621B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1282—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Clostridium (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/742—Spore-forming bacteria, e.g. Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, clostridium or Lactobacillus sporogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/142—Toxicological screening, e.g. expression profiles which identify toxicity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01017—Lysozyme (3.2.1.17)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/33—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Clostridium (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/285—Demyelinating diseases; Multipel sclerosis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)

Abstract

本发明提供了由产气荚膜梭菌B型或D型产生的作为人多发性硬化症(MS)的致病毒素的ε毒素(ETX)。本发明还鉴定了进行MS中的ETX介导的细胞死亡和其它毒理活性的ETX结合受体MAL。提供了通过直接或间接干扰ε毒素(ETX)、其结合受体(例如，MAL)或ETX‑受体相互作用以抑制或阻遏下游ETX介导的受体信号转导活性来预防人发生多发性硬化症(MS)和/或治疗MS的方法和组合物。还提供了通过测定ETX基因或其编码蛋白在怀疑患有多发性硬化症(MS)和/或处于发生所述疾病危险的人患者中的表达水平来检测、诊断、监测、评估多发性硬化症(MS)的各种方法。

Description

防止和治疗多发性硬化症的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年2月14日提交的美国临时申请No.61/764,836和2013年3月27日提交的美国临时申请No.61/805,788(所述临时申请的完整内容并此通过引用并入)的优先权。
发明领域
本发明涉及检测、诊断、监测、评估、防止和治疗多多发性硬化症的方法。
发明背景
多发性硬化症(MS)是如何开始的仍然未知。已研究的最早病变，在症状发作后的固定小时，展现少突胶质细胞凋亡、血脑屏障(BBB)通透性和早期小胶质细胞的活化1-6。在这些初生病变中，脱髓鞘尚不明显，不存在载脂巨噬细胞并且明显不存在浸润淋巴细胞1-8。初生病变中炎性浸润的不存在反驳了MS始于自身免疫现象，并且相反地支持毒素或病毒病因学。因此，似乎合理的是，基于初生病变的组织病理学特性，MS中初始病变形成的环境触发剂是可溶性毒素。
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)为革兰阳性产芽胞厌氧菌，其基于α、β、ε和ι毒素的组合运输被细分成5个毒素类型9-11(表1)。
表1.产气荚膜梭菌毒素类型和已知的相关人疾病
产气荚膜梭菌B型和D型携带ε毒素(ETX)基因，所述基因编码ε毒素的33kD原毒素。通过对数期生长，原毒素被分泌并且被胃肠(GI)道中的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶或被产气荚膜梭菌编码的λ-蛋白酶切割，从而产生效力为原毒素～1,000倍的活性ε毒素(ETX)11。
产气荚膜梭菌毒素类型B和D的天然宿主是反刍动物，在所述反刍动物中当富含糖类的饲料或过度放牧有利于杆菌(bacilli)的指数生长时，ETX介导的神经病症状发生11。ETX通过肠被吸收，进入血液并透化BBB，从而导致MS样症状(例如视力障碍、不协调和痉挛性瘫痪)。由于对CNS的这些作用12,13，Murrell和同事首次建议ETX作为动物诸如绵羊的潜在MS触发剂，尽管人不是B或D型的天然宿主11,14。
ETX结合存在于脑血管和有髓脑区例如胼胝体中的先前已知的受体15-17。一旦结合于其受体，ETX便整合进质膜作为七聚体孔，从而导致渗透裂解(osmolysis)11,14。当向啮齿类动物施用ETX时，BBB破坏发生并且白质血管系统特别易受损伤16,17。有趣地，在大鼠中腹膜内施用原毒素导致在胼胝体内形成局灶性病变，其中卵圆体的长轴与侧脑室的表面垂直18。Dawson首次描述该特殊的病变形态学，并且围绕中心血管的脱髓鞘的放射线照相术的等同物是临床确诊多发性硬化症的特异病征19。
发明概述
本发明提供，由产气荚膜梭菌B型或D型产生的ε毒素(ETX)或由已通过水平质粒转移获得其的其它细菌产生的ETX是多发性硬化症(MS)中的初生病变形成的致病毒素并且是MS的起始所需的。本发明还提供，ETX与作为其同源受体的四跨膜整合膜蛋白MAL(髓鞘及淋巴细胞蛋白)相互作用并且MAL对于ETX的作用是必需的和充分的。鉴于这些发现，本发明提供通过测定怀疑患有多发性硬化症(MS)和/或处于患多发性硬化症(MS)的危险的受试者的ETX基因或其编码蛋白的表达水平，来检测、诊断、监测和评估多发性硬化症(MS)的各种方法。本发明还提供防止人患有多发性硬化症(MS)或治疗患有MS的人的各种方法，所述方法通过a)直接或间接干扰产气荚膜梭菌B型或D型的ε毒素(ETX)；b)直接或间接干扰ETX相互作用受体，诸如MAL和/或病毒细胞受体-1(HAVcR-1)；c)直接和/或间接干扰ETX与其关联受体的相互伤作用以及下游信号转导活性；和d)直接或间接干扰、抑制或杀伤产乞荚膜杆菌。
在某些实施方案中，本发明提供了通过向有此需要的人施用包含有效量的ε毒素的抑制剂的组合物来防止人发展多发性硬化症(MS)或治疗人的MS的方法。一种此类抑制剂是针对ε毒素(ETX)的抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)。针对该毒素的单克隆抗体已被报导33-35并且经显示在动物模型中中和该毒素的体内作用35。
在其它实施方案中，本发明提供通过向有此需要的受试者施用包含有效量的ε毒素(ETX)所结合的受体的抑制剂的组合物，来防止人受试者患多发性硬化症(MS)或治疗人的MS的方法。在某些实施方案中，本发明发现MAL受体作为ETX关联受体，并且该受体的抑制剂/拮抗剂是用于防止和/或治疗MS的治疗性候选者。在其它实施方案中，本发明提供血脑屏障(BBB)上的受体诸如MAL或甲型肝炎病毒细胞受体-1(HAVcR-1)(所述受体已被报导参与内皮细胞的紧密连接的控制36-37)的抑制剂也可以是防止和/或治疗MS的治疗性候选者。已被发现潜在地抑制ETX对MAL或HAVcR-1的结合的化合物包括但不限于突变的ε毒素(ETX-Y29E、ETX-Y30E、ETX-Y36E和ETX-Y196E)37。在某些实施方案中，ETX-H106P突变体41是ETX受体拮抗剂的另一个候选者。
此外，本发明提供了通过向有此需要的受试者施用包含有效量的抗产气荚膜梭菌B型或D型或从其产生的ε毒素的疫苗的组合物来防止所述受试者发展多发性硬化症(MS)或治疗所述受试者的MS的方法。几种这样的疫苗已被开发，并且已被用于保护动物免受产气荚膜梭菌感染，而重组形式正处于开发中38-39。
本发明还提供通过向有此需要的受试者施用有效量的含有在竞争中胜过产气荚膜梭菌B型的细菌菌株的益生菌补充剂，来防止受试者发展多发性硬化症(MS)或治疗受试者的MS的方法。在某些实施方案中，益生菌补充剂含有产气荚膜梭菌A型细菌菌株，因为已显示其毒素类型在竞争中胜过产气荚膜梭菌B型。益生菌补充制剂中包含的典型细菌菌株包括，但不限于嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)、干酪乳杆菌(L.casie)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、植物乳杆菌(L.Plantarum)、沼泽红假单胞菌(Rhodoseudomonas palustris)、发面酵母(Saccharomyces cerevisiae)和嗜热链球菌(Steptococcus thermophiles)。这些菌株常见于各种人食物中并且被广泛用于制造用于人、动物和水产养殖健康的益生菌膳食补充剂产品。
本发明还提供通过向有此需要的受试者施用包含有效量的足以消灭产气荚膜梭菌B型和/或D型细菌菌株的一个疗程的抗生素的组合物，来治疗受试的MS的方法。经发现有效地抗产气荚膜梭菌的抗生素包括，但不限于青霉素、氨苄青霉素、阿莫西林、甲硝哒唑、红霉素和泰乐菌素。
本发明还提供通过噬菌体疗法防止MS或治疗受试者的MS的方法。产气荚膜梭菌特异性噬菌体消除宿主中的产气荚膜梭菌而对健康微生物群几无或无影响。产气荚膜梭菌特异性噬菌体包括，但不限于长尾噬菌体科(Siphoviridae)以及对于短的非收缩性尾，短尾噬菌体科(Podoviridae)的成员。已鉴定了几种噬菌体基因，所述基因编码N-乙酰胞壁酰-1-丙氨酸酰胺酶、溶菌酶-内肽酶和先前在病毒基因组中未曾报导过的锌羧肽酶结构域。克隆假定的噬菌体溶素基因(ply)，并将其在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达。重组溶素是能够在斑点和浊度还原测定中裂解产气荚膜梭菌的两个亲代噬菌体宿主菌株以及所述细菌的其它菌株，但不裂解超出种以外的任何梭菌属的酰胺酶类。因此，噬菌体基因产物最终可用于通过种特异性策略靶向细菌平原体，诸如产气荚膜梭菌，以控制动物和人疾病而对有益的益生菌无有害作用。
在某些实施方案中，所述噬菌体是噬菌体ΦCPV1和指定的多价噬菌体混合物。在其它实施方案中，所述噬菌体包含对于产气荚膜梭菌B型和/或D是特异性的噬菌体裂解酶，诸如溶素。已鉴定了一种这样的溶素，来自菌株ATCC 13124的胞壁酸酶(称为PlyCM)。32还可通过基因工程益生菌将对于产气荚膜梭菌是特异的溶素递送至受试者。表达特异性水解肽聚糖或产气荚膜梭菌细胞壁的其它组分的溶素基因的益生菌菌株可用于杀伤产气荚膜梭菌。
在某些实施方案中，可在各自包含与药剂混合的适合药用和药学上可接受的载体或佐剂的单独配制的组合物中，分别施用在上述方法中用于防止和/或治疗MS的一种或多种所述药剂。在其它实施方案中，可将一种或多种此类药剂一起组合和/或配制于组合物中，所述组合物还包含与这些药剂混合的适合药用和药学上可接受的载体或佐剂。本发明的组合物可被配制于任何适合药用和/或药学上可接受的制剂中，以用于任何合适和/或可接受的施用途径，包括但不限于口服片剂或胶囊、亲代可注射溶液或悬浮液或皮下贴剂。本发明的组合物可被单独施用，或与任何合适的药剂或化合物组合施用以增强预防和治疗MS的作用，和/或减轻与MS疾病直接或间接相关的任何综合征和/或因治疗引起的副作用。
本发明还提供用于通过测定处于危险中的患者的生物样本中的ε毒素(ETX)基因和/或其编码蛋白的水平或活性来诊断和/或预后MS患者的病程和危险的方法，其中ETX基因或蛋白质的升高的水平和/或活性表明患者处于发生MS的危险中。在本发明中还提供了用于诊断和/或预后患者的组织中的MS的试剂盒、设备和/或研究工具，其包含至少一种或多种用于测定患者样本的ETX基因和/或其编码蛋白的水平或活性的试剂。
本发明还提供筛选靶向ETX基因或其编码蛋白本身、ETX结合受体诸如MAL和HAVcR-1，或ETX与其结合受体之间的相互作用的药剂、化合物(肽或小分子)或药物以及用于预测、预防、改善和/或治疗MS的有用的治疗剂的方法。此类筛选法包括如下步骤：将候选药剂暴露于ETX或其结合受体MAL，测定候选药剂对ETX或其结合受体MAL的结合亲和力，以及当候选药剂结合ETX或MAL基因或蛋白质或调节其在下游信号转导途径中的活性或导致ETX介导的细胞死亡的证据时，将候选药剂鉴定为ETX或MAL调节剂。如本文中所用，术语“调节”或“调节剂”意指“抑制”或“抑制剂”、“拮抗”或“拮抗剂”，其中在将候选药剂暴露于ETX或MAL后，ETX或MAL的水平或活性被降低或升高。在某些实施方案中，候选药剂是ETX或MAL抑制剂、拮抗剂、反义物(antisense)或抗体。
附图简述
参考下文中简要描述的图可更容易地理解本发明。对图中显示的颜色的引用对应于附图中显示的灰度级别。
图1.具有MS、SLE、副肿瘤病(PND)的人和健康对照(HC)中的对ETX的免疫反应性。上图框显示免疫印迹。所显示的两个MS印迹是真阳性的特征：对37kD的产气荚膜梭菌proETX蛋白但非对存在于印迹上的其它毒素(包括63kD的PA63)的免疫反应性。利用SLE血清探测的两个印迹是假阳性的特征，因为还存在对于PA63的免疫反应性。显示的副肿瘤病(PND)和健康对照(HC)呈真阴性，在印迹上不存在对任何蛋白质的免疫反应性。注意，proETX基因编码具有预测的33kD的MW的蛋白质，该蛋白质以37kD的表观MW在SDS-PAGE上电泳。下图框显示具有MS的人(N＝118)和健康对照(N＝100)的血清和/或CSF中对针ETX的免疫反应发生率。
图2.测定MS患者和健康对照中的产气荚膜梭菌A型(一种人共生体)的发生率。在产气荚膜梭菌相容性生长培养基培养粪便显示，52％的健康对照在胃肠道中具有产气荚膜梭菌A型，然而仅23％的MS患者具有A型。
图3.患者73F的脑MRI。图3(A)2011年9月的FLAIR图像显示旁矢状平面的病变的特征。图3(B-F)2012年5月的MRI显示如先前的FLAIR图像上的特征病变图(B)、T1低强度(图3C)、IV钆后特征对比增强病变(图3D、3E)和T2加权轴图像上的特征病变(图3F)。
图4.具有复发-缓解型MS(RRMS)的妇女中的产气荚膜梭菌B型以及MS和健康对照中产气荚膜梭菌A型的发生率。图4(A)左图框显示ATCC 3626 B型菌株和来自患者73F的基于PCR的基因分型。在两者中鉴定了α、β和ε毒素的PCR产物。图4(B)为了排除在患者73F的粪便中鉴定的B型菌株是污染物的可能性，在实验室菌株和患者分离株中测定潜溶性原噬菌体基因的特征谱(右图框)。ATCC 3626参考菌株具有所有3个原噬菌体插入，然而，患者的菌株仅具有A6(弱)和N7原噬菌体插入。噬菌体基因和PCR产物大小：B1RBB5，1000bp；B1RAA6，300bp；Q8SBN7，300bp。
图5.ETX特异性结合髓鞘。对穿过胼胝体的成年小鼠大脑的固定冷冻冠状切片的蛋白脂质蛋白质(PLP，绿色)和Alexa 594-ETX(红色)进行染色。在所有PLP阳性白质束中观察到对ETX的强染色。合并的PLP和ETX图像显示基本上完全重合的荧光信号。比例尺＝500μm。
图6.MAL-1赋予CHO细胞对ETX的敏感性。用500pM ETX孵育CHOEGFP和CHOEGFP-MAL细胞，进行指定的时间(h＝小时)。通过荧光显微镜检查研究活的未固定的培养物的GFP表达和DNA的碘化丙啶(PI)染色(作为细胞死亡的指标)。
图7.使用PrestoBlue(基于刃天青)测定进行的ETX介导的CHOEGFP-MAL细胞死亡的剂量反应分析。CHOEGFP-MAL但非CHOEGFP细胞以剂量依赖性方式对ETX敏感。
图8.ETXAlexa-647对稳定地表达单独的EGFP-MAL或EGFP的CHO细胞的结合的荧光激活细胞分选(FACS)分析。点阵图显示表达EGFP-MAL的细胞的基本上100％的与ETXAlexa-647的双标记(第二图)。相反地，表达单独的EGFP的CHO细胞未显示与ETXAlexa-647的共标记(第四图)。第一和第三点阵图代表表达单独的EGFP-MAL和EGFP而无ETXAlexa-647的CHO细胞。
图9.ETX对髓鞘的结合需要MAL。对穿过胼胝体的成年小鼠大脑的冷冻的冠状切片的蛋白脂质蛋白质(PLP，绿色)和Alexa 594-EXT(红色)进行染色。只在野生型小鼠中观察到强ETX染色与白质束中的PLP阳性重合。缺乏MAL(MAL KO)的小鼠未显示任何ETX-594染色。
图10.中和ε-毒素抗体防止少突胶质细胞发生细胞死亡。图10A举例说明指定稀释度的抗ε-毒素中和抗体(NAB)和ε-毒素剂量处理混合原代胶质细胞培养物，进行24小时。通过PI包含估计细胞活力。图10B.来自研究的PI染色的定量示于图10A中。中和ε-毒素抗体防止少突胶质细胞发生细胞死亡。利用指定稀释度的抗ε-毒素中和抗体(NAB)处理原代混合胶质细胞并施用ε-毒素，进行24小时。通过Image J定量通过细胞核的PI染色估计的细胞活力。显示的结果为作为对照的百分比的荧光强度。
图11A-11F.ε-毒素特异性结合CNS中的少突胶质细胞。从p0-6幼崽收集混合的鼠胶质细胞，并在促进少突胶质细胞分化的培养基中培养10天。将细胞在4％PFA中进行固定，并用对于不同胶质细胞群(包括GFAP(针对星形星形胶质细胞)(A)、CD68(针对小神经胶细胞)(B)、Olig2(针对所有少突胶质细胞谱系)(C)和MAG(D)、MPB(E)和PLP(F)(针对成熟少突胶质细胞))是特异性的抗体进行染色。为了确定ε-毒素结合的特异性，用缀合有Alexaflour 598的ε-原毒素(proETX)探测细胞。利用DAPI显现细胞核。
图12.ETX特异性结合CNS内皮细胞的腔(顶)表面。通过尾静脉注射向野生型小鼠(n＝4)和MAL KO小鼠(n＝3)施用缀合有Alexa594的原ε毒素(红色)，随后通过尾静脉注射施用缀合有Alexa488的BSL1(绿色)。10分钟后，用PBS灌注被麻醉的动物，随后将其处死。检查大脑的12微米冷冻切片的BSL1与原ε毒素染色的重合。大脑内的微血管系统显示原ε毒素与BSL1的重合标记。BSL1阳性血管的大多数但非全部区段呈原ε毒素阳性，从而产生ε毒素受体表达的异质性对比结合动力学的问题。重要地，MAL KO小鼠未显示原ε毒素对大脑中的微血管系统的结合，从而证明野生型动物中的结合特异性和对MAL的需要。ETX＝ε毒素。
图13A和13B.针对ETX的中和抗体(4D7和5B7)在小脑切片中阻断ETX诱导的MBP减少。图13A提供针对暴露于PBS(媒介物对照，第一栏)或5nM ETX(第2-4栏)20小时的切片的MBP-免疫染色(绿色)的代表性图像(顶行)和定量(底图框)。ETX中和单克隆抗体4D7被省略(第1和2栏)或在如下2个不同的时间点被添加于切片培养物中：在ETX处理之前2小时(第3栏)和与ETX处理同时(第4栏)。进行DAPI(蓝色)复染以鉴定细胞核。对于每一个条件n＝5-6个切片，针对各自对照(100％)进行标准化；***p<0.001，双尾t-检验。在3个独立实验中获得相似的结果。比例尺代表500μm。图13B提供针对暴露于PBS(媒介物对照，第1栏)或5nMETX(第2-4栏)20小时的切片的MBP(第1和2行，左底图框，绿色)免疫染色和环核苷酸磷酸二脂酶(第3和4行，右底图框，绿色)免疫染色的代表性图像(顶行)和定量(底图框)。ETX中和单克隆抗体5B7被省略(第1和2栏)或在如下2个不同的时间点被添加于切片培养物中：在ETX处理之前2小时(第3栏)和与ETX处理同时(第4栏)。进行DAPI(蓝色)复染以鉴定细胞核。对于每一个条件n＝5-6个切片，针对各自对照(100％)进行标准化；***p<0.001，双尾t-检验。在2个独立实验中获得相似的结果。比例尺代表500μm。
图14a-14d.ETX暴露导致小脑切片培养物中MBP表达的浓度和时间依赖性减少。图14a和14b提供针对暴露PBS(媒介物对照)或指定剂量的ETX 20小时的切片的MBP免疫染色(绿色)的代表性图像(a)和定量(b)。图14c和14d提供针对在指定的时间点上用5nM ETX处理的切片的MBP免疫染色(绿色)的代表性图像(c)和定量(d)。进行DAPI(蓝色)复染以鉴定所有细胞的细胞核。针对DAPI的染色强度的MBP免疫荧光强度的定量(b，d)显示ETX不影响总细胞存活率，但相反地侵害表达MBP的细胞。对于每一个条件，n＝6-8(a，b)和5-6(c，d)，针对各自的对照(100％)标准化的；**p<0.01，***p<0.001，双尾t-检验。注意，(a，b)和(c，d)中的切片来自独立实验。在至少3个独立实验中获得相似的结果。比例尺代表500μm。
图15.MAL缺失使得小脑切片抗ETX诱导的MBP减少。顶行提供针对从野生型(Mal+/+)和缺失Mal的(Mal-/-)小鼠制备的切片的MBP免疫染色(绿色)的定量。将切片暴露于PBS(媒介物对照)或指定剂量的ETX，进行20小时。对DAPI(蓝色)进行复染以鉴定细胞核。对于每一条件，n＝5-6个切片，针对各自的对照进行标准化(100％)；***p<0.001，双尾t-检验。在3个独立的实验中获得相似的结果。比例尺代表500μm。
图16.失活的原ETX-Alexa 594缀合物选择笥结合小脑切片上的MBP阳性细胞。用缀合有荧光的ETX对小脑切片进行染色，并对MBP进行染色。随机选择的具有低MBP免疫染色(绿色)密度的视野显示原ETX(红色)与MBP阳性细胞/结构共定位，从而表明ETX选择性结合MBP生成性成熟少突胶质细胞。大部分细胞(通过DAPI复染鉴定的，蓝色)对于MBP免疫染色和原ETX结合呈阴性。注意，原ETX标记与MBP免疫染色不完全重合，从而表明ETX靶向与MBP表达的位置至少部分不同的亚细胞位置。比例尺代表100μm。
图17.GFAP表达在暴露于更高剂量的ETX刺激的小脑切片中被适度上调，作为对ETX诱导的对少突胶质细胞的作用的二次应答。顶行提供代表性影象并且右底图框提供暴露于PBS(媒介物对照)或指定剂量的ETX 20小时的切片上的针对环核苷酸磷酸二脂酶(少突胶质细胞标志物，绿色)和GFAP(星形胶质细胞标志物，红色)的免疫染色的定量。进行DAPI(蓝色)复染以鉴定细胞核。在更高放大倍数的图像(左底图框)中显示低放大倍数的图像(第三行)中的加框区域以举例说明代表性条件下的免疫染色细节。对环核苷酸磷酸二脂酶和GFAP免疫荧光强度的定量表明与GFAP相反，响应ETX的环核苷酸磷酸二脂酶的浓度依赖性减少仅在更高浓度(50nM)上增加。对于每一个条件，n＝6-8个切片，针对各自的对照(100％)标准化的；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，双尾t-检验。在两个独立的放实验中获得相似的结果。在低放大倍数下(第1-3行)比例尺代表500μm，在高放大倍数下(左底图框)代表100μm。
图18a-18-d.ETX暴露对小脑切片中的神经元和小神经胶质细胞没有影响。图18a和18b提供针对暴露于PBS(媒介物对照)或10nM ETX 20小时的切片的NeuN免疫染色(绿色)的图像(左图框)和定量(右图框)。插图(顶行)以更高放大倍数显示对应条件下的低放大倍数中的加框区域，以举例说明NeuN(神经元标志物)的细胞核染色模式。图18c和18d提供针对在指定的时间点上暴露于PBS(媒介物对照)或5nM ETX的切片的CD68免疫染色(绿色)的代表性图像(顶行)和定量(底图框)。(c)中的底行以更高的放大倍数显示对应条件下的低放大倍数(顶行)中的加框区域，以举例说明CD68(小神经胶细胞标志物)的免疫染色模式。进行DAPI(蓝色)复染以鉴定细胞核。对于每一个条件，n＝5-6个切片，针对各自的对照(100％)标准化的；双尾t-检验。在两个(a，b)或三个(c，d)独立的放实验中获得相似的结果。比例尺代表500μm(a，低放大倍数)、10μm(a，插图)、500μm(c，第一和第二行)和20μm(c，底行)。
图19A-19B.ε-毒素杀伤少突胶质细胞。图19A.通过活O1染色鉴定了在促进少突胶质细胞成熟的培养基中生长的混合原代神经胶质细胞培养物。用指定的ε-毒素剂量处理培养物1和4小时。通过PI包含估计细胞活力。通过将PI阳性O1+细胞的数目除以O1+细胞的总数来计算死亡细胞的百分比。结果为平均值±STEDV。图19B.利用A2B5和O1抗体染色的活的混合原代神经胶质细胞培养物的典型显微照片示于左侧。利用100nM的ε-毒素处理培养物4小时，并通过PI包含估计细胞活力。箭头指向PI阳性O1+细胞。在1小时的ε-毒素100nM处理后死亡的A2B5+细胞和O1+细胞的百分比的定量示于右侧。
图20.小脑切片中的Olig2阳性细胞呈MBP阳性。利用对于olig2(红色)和MBP(绿色)是特异的抗体双标记小脑切片。如显微照片中显示的，绝大部分olig2阳性细胞也呈MBP阳性。
图21A-21B.ε-毒素不杀伤富集的星形胶质细胞。从混合原代胶质细胞培养物富集星形胶质细胞。图21A.通过用针对星形胶质细胞标志物GFAP、小神经胶质细胞标志物CD68和少突胶质细胞标志物MBP的抗体对固定的细胞进行染色来测定培养物的纯度。图21B.利用指定剂量的ε-毒素处理富集的星形胶质细胞24小时。通过PI包含估计细胞活力。
图22A-22B.ε-毒素不杀伤富集的小神经胶质细胞。从混合原代胶质细胞培养物富集小神经胶质细胞。图22A.通过用针对星形胶质细胞标志物GFAP、小神经胶质细胞标志物CD68、OPC标志物NG2和少突胶质细胞标志物MBP的抗体对固定的细胞进行染色来测定培养物的纯度。图22B.针对荧光标记的外源凝集素BSL1对活的小神经胶质细胞进行染色，并用指定的ε-毒素剂量处理24小时。通过PI包含估计细胞死亡。24小时处理后的典型显微照片示于右侧。死亡细胞的百分比的定量示于左侧。通过将呈PI阳性的BSL1+细胞的数目除以BSL1+细胞的总数来计算死亡细胞的百分比。结果为平均值±STDEV。
图23A-23C.ε-毒素杀伤富集的少突胶质细胞。图23A.为了估计富集的少突胶质细胞培养物的纯度，对细胞的星形胶质细胞标志物GFAP、小神经胶质细胞标志物CD6和OPC标志物NG2进行染色。图23B.对富集的少突胶质细胞的MBP和proETX-594进行染色。图23C.利用O1抗体染色的活的少突胶质细胞培养物的典型显微照片示于右边。利用100nMε-毒素处理细胞，并通过PI包含估计细胞活力。箭头指向PI阳性O1细胞。在ε-毒素处理1和6小时后死亡的O1阳性细胞的百分比的定量示于左侧。通过将PI阳性O1+细胞的数目除以O1细胞的总数来计算死亡细胞的百分比。结果为平均值±STDEV。
图24A-24D.图24A.MAL是ε-毒素对CNS白质和CNS内皮细胞的结合所必需的。对野生型小鼠(顶图框)的脑切片的PLP(髓鞘)和ε毒素-594进行染色。合并的图像显示几乎完全的重叠。对MAL敲除小鼠(底图框)的脑切片的PLP而非对ε毒素-594进行染色。图24B.MAL是ε-毒素对视网膜血管的结合所必需的。野生型小鼠的视网膜血管对于BSL(泛内皮细胞微血管系统标志物)、ε毒素-594和DAPI的染色呈阳性。MAL敲除小鼠的视网膜血管对于BSL和DAPI可被染色，但对于ε毒素-594不能染色。图24C.MAL是ε-毒素对角膜的结合所必需的。野生型小鼠的角膜的鳞状上皮对于BSL外源凝集素、BSL外源凝集素、ε毒素-594和DAPI的染色呈阳性。MAL敲除小鼠的角膜对于BSL外源凝集素和DAPI可被染色，但对于ε毒素-594不能被染色。图24D.MAL是ε-毒素对肾小管的结合所必需的。野生型小鼠的肾组织切片对于志贺毒素-488(绿色)、ε毒素-594(红色)和DAPI(蓝色)的染色呈阳性。MAL敲除小鼠的肾组织切片对于志贺毒素-488和DAPI可被染色，但对于ε毒素-594结合呈阴性。
发明详述
在以下描述中，参考形成其部分并且其中通过举例说明可被实践的特定实施方案来显示的附图。详细地描述这些实施方案以使得本领域普通技术人员能够实践本发明，并且应理解，可使用其它实施方案以及可在不背离本发明的范围的情况下产生逻辑变化。示例性实施方案的以下描述因而不应被视为具有限制意义，并且本发明的范围由所附的权利要求限定。
提供符合37C.F.R.§1.72(b)的摘要，以允许读者快速地确定技术公开内容的性质和要点。提交摘要，并要理解，它不会被用来解释或限制权利要求的范围或含义。
本发明首次将由产气荚膜梭菌B型或D型细菌菌株产生的ε毒素(ETX)鉴定为人中多发性硬化症(MS)的初生病变形成的致病毒素。本发明还提供，ETX结合在髓鞘和淋巴细胞中表达的四跨膜整合膜MAL受体，以在人MS中进行ETX介导的细胞死亡和其它毒理学活性。
鉴于这些发现，本发明提供通过测定ETX基因或其编码蛋白在怀疑患有多发性硬化症(MS)和/或处于发生多发性硬化症(MS)的人受试者中的表达水平来检测、诊断、监测、评估多发性硬化症(MS)的各种方法。本发明还提供防止人患有多发性硬化症(MS)或治疗具有MS的人的各种方法，其通过a)直接或间接干扰产气荚膜梭菌B型或D型的ε毒素(ETX)；b)直接或间接干扰ETX相互作用受体，诸如MAL和/或甲型肝炎病毒细胞受体-1(HAVcR-1)；和c)直接和/或间接干扰ETX与其关联受体的相互作用以及下游信号转导活性来实现该目的。
在某些实施方案中，本发明提供用于预防或治疗有此需要的人受试者的多发性硬化症(MS)的方法，其包括：向所述受试者施用包含有效量的药剂的组合物，所述药剂直接或间接干扰由产气荚膜梭菌B型或D型细菌菌株产生的ε毒素(ETX)、ETX-结合受体或ETX与其结合受体的相互作用，以抑制或阻遏ETX调节的受体信号转导途径。在某些实施方案中，所述药剂是ETX或在血脑屏障(BBB)、血视网膜屏障(BRB)的内皮细胞、少突胶质细胞或ETX为其配体的髓鞘上表达的其结合受体的抑制剂。在某些实施方案中，ETX-结合受体是四跨膜整合膜受体MAL，其在髓鞘中表达，并且由CNS内皮细胞、少突胶质细胞、肠上皮淋巴细胞表达。在其它实施方案中，ETX-结合受体为HAVcR-1受体。
在某些实施方案中，所述抑制剂为针对ETX或其结合受体诸如MAL和/或HAVcR-1的抗体，或其功能性片段，例如抗原结合片段或抗原结合部分。用于产生针对产气荚膜梭菌的ε-毒素的抗体的方法在本领域中是公知的，并且被包括在本发明的范围内。针产气荚膜梭菌的ε-毒素的抗体和抗体反应的实例例如由Bentancor等人(J Infect Dev Ctries 2009,3(8):624-627)；Laine等人(Veterinary Immunology and Immunopathology 125,2008,198-202)；Uzal等人(Veterinary Research Communications,23,1999,143-150)；Percival等人(Infection and Immunity,1990,2487-2492)(所述每一个参考文献的完整内容并此通过引用并入)进行了描述。
如本文中所用，术语“抗体”包括完整抗体和其任何抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少2条重(H)链和2条轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。每一条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每一条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可被进一步细分成间插有更保守的称为框架区(FR)的区域的高变区(称为互补决定区(CDR))。每一个VH和VL由按照以下序列从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。“失活的抗体”是指不诱导补体系统的抗体。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”，当在本文中使用时是指在序列上是高度可变的和/或形成结构上确定的环的抗体可变结构域的区域。一般地，抗体包含6个HVR；3个在VH中(H1、H2、H3)，并且3个在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3展示6个HVR的大部分多样性，并且H3特别地被认为在赋予抗体精细特异性中起着独特作用。参见，例如，Xu等人Immunity 13:37-45(2000)；Johnson和Wu于Methods in Molecular Biology 248:1-25(Lo，编辑，Human Press,Totowa,N.J.,2003)中。事实上，仅由重链组成的天然存在的骆驼抗体在轻链不存在的情况下是有功能的并且是稳定的。参见，例如，Hamers-Casterman等人，Nature 363:446-448(1993)和Sheriff等人，Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。
“框架区”或“FR”残基是除除如本文中定义的HVR残基外的那些可变结构域残基。术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，包括天然序列Fc区和变异Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可变化，但人IgG重链Fc区通常被定义来从位置Cys226或从Pro230上的氨基酸残基延伸至其羧基末端。可以例如在抗体的产生或纯化过程中或通过重组工程化编码抗体的重链的核酸除去Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统残基447)。因此，完整抗体的组合物可包含所有K447残基都被除去的抗体群体、没有K447残基被除去的抗体群体以及拥有具有K447残基的抗体和不具有K447残基的抗体的混合物的抗体群体。用于本发明的抗体的合适的天然序列Fc区域包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。
“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体的Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和选择性剪接形式，FcγRII受体包括FcγRIIA(“失活的受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，其具有差异主要在其胞质结构域中的相似氨基酸序列。失活的受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITIM)。(参见M.Daeron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997)。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4:25-34(1994)；和de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中对FcR进行了综述。其它FcR，包括将来被鉴定的那些FcR，包含在本文中的术语“FcR”中。
术语“CDR”及其复数“CDRs”是指互补决定区(CDR)，3个所述互补决定区组成轻链可变区(CDRL1、CDRL2和CDRL3)的结合特性，并且3个所述互补决定区组成重链可变区(CDRH1、CDRH2和CDRH3)的结合特性。CDR促成抗体分子的功能活性并且被包含支架或框架区的氨基酸序列分隔。将精确确定的CDR边界和长度经历不同的分类和编号系统。尽管存在不同的边界，但这些系统的每一个在构成可变序列内的所谓的“高变区”的区域中具有一定程度的重叠。根据这些系统的CDR定界从而可在长度和相对于邻框架区的边界区域上不同。参见例如Kabat,Chothia，和/或MacCallum等人，(Kabat等人，于“Sequences of Proteinsof Immunological Interest”，第5补充版，美国卫生及公共服务部，1992；Chothia等人，J.Mol.Biol.,1987,196:901；和MacCallum等人，J.Mol.Biol.,1996,262:732，其每一个通过引用整体并入)。
如本文中所用，术语抗体的“抗原结合部分”(或简单地“抗体部分”)是指保持特异性结合抗原(例如，ETX或其结合受体，诸如MAL)的能力的抗体的一个或多个片段。已显示抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来进行。包含在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VH、VL、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含通过铰链区上的二硫键连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单个臂的VH和VL结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341:544546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)可任选地通过合成接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合。此外，虽然Fv片段的两个结构域VH和VL由单独的基因编码，但可使用重组方法，通过合成接头来连接它们，所述合成接头使得它们能够被产生为其中VH和VL区域配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人(1988)Science 242:423 426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879 5883)的单个蛋白质链。此类单链抗体也意欲被包含在术语抗体的“抗原结合部分”中。这些抗体片段可使用对于本领域普通技术人员来说是已知的常规技术来获得，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式来筛选所述片段的效用。
在某些实施方案中，抗体是选自多克隆或单克隆抗体、其异种形式、同种异体形式或同系形式或修饰形式(例如，人源化形式、嵌合形式、重组形式等)。抗体还可以是完全人的。优选地，本发明的抗体特异性或基本上特异性地结合ETX多肽或其结合蛋白诸如MAL。如本文中所用，术语“单克隆抗体”是指展示对于特定表位的单一结合特异性和亲和力的抗体。因此，术语“人单克隆抗体”是指展示单一结合特异性并且具有来源于人种系或非种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括融合于永生化细胞的获自转基因非人动物例如转基因小鼠的，具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组的B细胞。
如本文中所用，术语“分离的抗体”意欲指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，分别特异性结合ETX或其结合受体诸如MAL或HAvR-1的分离的抗体分别地基本上不含不结合ETX或其结合受体的抗体)。然而，特异性结合ETX和/或其结合受体的表位的分离的抗体可具有分别与来自不同细菌菌株的其它ETX蛋白或其结合受体的交叉反应性。此外，分离的抗体通常基本上不含其它细胞材料和/或化学药品。
如本文中所用，术语“人源化抗体”是指由来源于除人外的哺乳动物的抗体的CDR和人抗体的FR区及恒定区组成的抗体。人源化抗体在根据本发明的治疗剂中用作有效组分，因为人源化抗体在人体中的抗原性被降低。
如本文中所用，术语“复合抗体”是指具有包含来自两个或更多个无关可变区的种系或非种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，术语“复合人抗体”是指具有来源于人种系或非种系免疫球蛋白序列的恒定区和包含来自两个或更多个无关人可变区的人种系或非种系序列的可变区的抗体。复合人抗体在根据本发明的治疗剂中用作有效组分，因为复合人抗体在人体中的免疫原性被降低。
如本文中所用，术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、生成或分离的所有人抗体，诸如(a)从对于人免疫球蛋白基因是转基因的或转染色体的动物(例如，小鼠)或从其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从经转化表达抗体的宿主细胞，例如从转染瘤分离的抗体，(c)从重组组合人抗体文库分离的抗体，和(d)通过牵涉将人免疫球蛋白基因序列与其它DNA序列拼接的其它方法制备、表达、生成或分离的抗体。此类重组人抗体具有来源于人种系和/或非种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，可将此类重组人抗体经历体外诱变(或，当使用人Ig序列的转基因动物时，体内诱变)，从而重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，所述序列，当来源于人种系VH和VL序列和与其相关时，不能天然地存在于体内人抗体种系库内。
如本文中所用，术语“异源抗体”根据产生此种抗体的转基因非人生物体来定义。该术语是指具有对应于在不由转基因非人动物组成的生物体中发现的氨基酸序列或编码核酸序列的氨基酸序列或编码核酸序列，并且通常来自除转基因非人动物的物种外的物种抗体。
在某些实施方案中，抗体是任何已知的或以后开发的针对ETX蛋白的中和抗体。此类ETX抗体的实例由Bentancor等人，Percival等人，Uzal等人和Veschi等人(每一个所述参考文献的完整内容并此通过引用并入)进行了描述。在某些实施方案中，针对ETX蛋白的中和抗体包含与任何已知的或以后开发的ETX抗体的多肽具有至少约71％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％或更多同一性的氨基酸序列。
本文中描述的针对ETX或其结合受体的抗体可使用本文中描述的或本领域中已知的任何方法来产生。分别特异性结合ETX或其结合蛋白诸如MAL蛋白的单克隆抗体(例如，人抗体)可使用多种已知的技术，诸如由Kohler和Milstein,Nature 256:495(1975)描述的标准体细胞杂交瘤技术来产生。尽管体细胞杂交方法是优选的，但原则上，也可使用用于产生单克隆抗体的其它技术，例如，B淋巴细胞的病毒或致癌性转化、使用人抗体基因的文库的噬菌体展示技术。用于生成产生分别针对ETX或其结合受体诸如MAL的单克隆抗体的杂交瘤的一个方法是鼠系统。在小鼠中进行的杂交瘤产生在本领域中是公知的，包括免疫方案和用于分离和融合免疫的脾细胞的技术。
可如上所述，通过用多肽免疫原免疫适当的受试进来制备多克隆抗体。可通过标准技术，诸如利用酶联免疫测定(ELISA)，使用固定的多肽随时间推移监测被免疫的受试者中的多肽抗体滴度。必要时，可从哺乳动物(例如，从血液)分离针对抗原的抗体，并通过公知的技术诸如蛋白A层析来进一步纯化，以获得IgG级分。在免疫后的适当的时间上，例如，当抗体滴度最高时，可从受试者获得抗体生成细胞，并将其用于通过标准技术诸如最初由Kohler和Milstein(1975)Nature 256:495-497)(也参见Brown等人(1981)J.Immunol.127:539-46；Brown等人(1980)J.Biol.Chem.255:4980-83；Yeh等人(1976)Proc.Natl.Acad.Sci.76:2927-31；和Yeh等人(1982)Int.J.Cancer 29:269-75)的杂交瘤技术、更近以来的人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人(1983)Immunol.Today 4:72)、EBV-杂交瘤技术(Cole等人(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.，第77-96页)或三源杂交瘤技术来制备单克隆抗体。用于产生单克隆抗体杂交瘤的技术在本领域中是公知的。简言之，将永生化细胞系(通常地骨髓瘤)融合于来自利用上述免疫原免疫的哺乳动物的淋巴细胞(通常地脾细胞)，和筛选所得的要杂交瘤细胞的培养上清液以鉴定产生优选地特异性结合所述多肽抗原诸如ETX或其结合受体，例如MAL蛋白的单克隆抗体的杂交瘤。
可将用于融合淋巴细胞与永生化细胞系的许多公知方案中的任何方案用于产生抗-ETX或抗-MAL或抗-HAvR-1单克隆抗体的目的。此外，本领域普通技术人员将理解，存在也可以是有用的此类方法的许多变型。通常地，永生化细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)来源于与淋巴细胞相同的哺乳动物物种。例如，鼠杂交瘤可通过将来自用本发明的免疫原性制剂免疫的小鼠的淋巴细胞与永生化小鼠细胞系融合来产生。优选的永生化细胞系是对含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基(“HAT培养基”)敏感的小鼠骨髓瘤细胞系。可按照标准技术将许多骨髓瘤细胞系的任何细胞系用作融合伴侣，诸如P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14骨髓瘤细胞系。此类骨髓瘤细胞系可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC),Rockville,Md。通常地，使用聚乙二醇(“PEG”)将HAT敏感性小鼠骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞融合。随后使用HAT培养基选择由融合产生的杂交瘤细胞，所述培养基杀伤未融合的和非生产性融合骨髓瘤细胞(在数天后未融合的脾细胞死亡，因为它们未被转化)。通过使用标准ELISA测定筛选杂交瘤培养上清液的结合给定的多肽例如分别地ETX或其结合受体的抗体，来检测产生分别针对ETX或其结合受体的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
作为对制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的另一选择，可通过用适当的多肽筛选重组组合免疫球蛋白文库(例如，抗体噬菌体展示文库)，从而分离结合所述适当的多肽的免疫球蛋白文库成员来鉴定和分离分别特异于ETX或其结合受体多肽的单克隆抗体。用于产生和筛选噬菌体展示文库的试剂盒是商购可得的(例如，Pharmacia Recombinant PhageAntibody System,Catalog No.27-9400-01；和Stratagene SurfZAPTM Phage Display试剂盒，Catalog No.240612)。此外，特别适宜用于产生和筛选抗体展示文库的方法和药剂的实例在本领域中是已知的。
此外，可产生可使用标准重组DNA技术产生的重组抗-ETX、抗-MAL或抗-HAvR-1抗体，诸如嵌合单克隆抗体、复合单克隆抗体和人源化单克隆抗体。此类嵌合单克隆抗体、复合克隆抗体和人源化克隆抗体可利用本领域中已知的重组DNA技术来产生。
此外，可按照本领域中已知的标准方案产生人源化抗体。在另一个实施方案中，可使用本领域中已知的技术，通过包含编码特定结合对成员的多肽链与可复制的一般展示包的组分的融合物的核酸分子的载体与含有编码单结合对成员的第二多肽链的核酸分子的载体之间的重组来产生抗体链或特定结合对成员。细胞内抗体用于抑制细胞中的蛋白质功能的用途在本领域中也是已知的。
在另一个实施方案中，分别针对ETX或其结合受体(诸如MAL或HAvR-1)的人单克隆抗体可使用携带人免疫系统而非小鼠系统的部分的转基因或转染色体小鼠来产生。在一个实施方案中，转基因小鼠，在本文中称为“HuMAb小鼠”，其含有编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白的免疫球蛋白基因微型基因座和使内源性μ和κ链基因座失活的靶向突变(Lonberg,N.等人(1994)Nature 368(6474):856 859)。因此，所述小鼠展示减少的小鼠IgM或κ的表达，并且响应于免疫，引入的人重链和轻链转基因经历类型转换和体细胞突变，以产生高亲和力人IgGκ单克隆抗体(Lonberg,N.等人(1994)，同上；综述于Lonberg,N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113:49 101；Lonberg,N.和Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.第13卷：65 93以及Harding,F.和Lonberg,N.(1995)Ann.N.Y Acad.Sci 764:536 546)中。HuMAb小鼠的制备在本领域中是已知的。
在另一个实施方案中，用于本发明的抗体是双特异性抗体。双特异性抗体在单一抗体多肽内具有两个不同抗原的结合位点。抗原结合可以是同时的或相继的。三源杂交瘤和杂交杂交瘤是可分泌双特异性抗体的细胞系的2个实例。双特异性抗体已通过本领域中已知的化学方法构建。双特异性药剂还可通过融合产生不同抗体的杂交瘤或其它细胞产生异源杂交瘤，随后鉴定产生和共组装两种抗体的克隆来产生。它们还可通过完整免疫球蛋白链或其部分诸如Fab和Fv序列的化学或基因缀合来产生。抗体组分可结合ETX及其结合受体多肽。在一个实施方案中，双特异性抗体可同时特异性结合ETX和其结合受体多肽MAL或HAvR-1。
本发明的另一个方面涉及可通过方法获得的抗-ETX、抗-MAL或抗-HAvR-1抗体，所述方法包括，分别用免疫原性ETX、MAL或HAvR-1多肽或其免疫原性部分免疫动物；和随后从动物分离特异性结合所述多肽的抗体。
在本发明的另一个方面，部分或已知的抗体序列可用于产生和/或表达新的抗体。抗体主要通过位于6个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。因此，CDR内的氨基酸序列在个体抗体之间比CDR外的序列更具多样性。因为CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，因此有可能通过构建表达载体来表达模拟特定的天然存在的抗体的性质的重组抗体，所述表达载体包含移植至来自具有不同性质的不同抗体的框架序列上的来自所述特定的天然存在的抗体的CDR序列。此类框架序列可获自包括种系或非种系抗体基因序列的公共DNA数据库。这些种系序列将与成熟抗体基因序列不同，因为它们将不包括完整组装的可变基因，所述可变基因在B细胞成熟过程中通过V(D)J联接而形成。种系基因序列也将与高亲和力的第二库抗体的序列相异在于整个可变区上的个体均衡性。例如，体细胞突变在框架区的氨基末端部分中是相对不常见的。例如，体细胞突变在框架区1的氨基末端部分中和在框架区4的羧基末端部分中是相对不常见的。此外，许多体细胞突变不显著地改变抗体的结合性质。因此，不必获得特定抗体的完整DNA序列以重新生成具有与原始抗体的结合性质相似的结合性质的完整重组抗体。跨越CDR区的部分重链和轻链序列对于该目的通常是足够的。部分序列用于确定种系和/或非种系可变基因区段和联接基因区段是否促成重组抗体可变基因。随后将种系和/或非种系序列用于填充可变区的缺失部分。重链和轻链前导序列在蛋白质成熟过程中被切除，从而对最终的抗体的性质没有贡献。为了添加缺失的序列，可通过连接或PCR扩增将克隆的cDNA序列与合成寡核苷酸组合。或者，可将完整可变区合成为一组短的、交叠的寡核苷酸并通过PCR扩增进行组合，以生成完整合成的可变区克隆。该方法具有某些有利方面，诸如特定限制位点的消除或包含，或特定密码子的最优化。所述方法还可用于筛选一个物种(例如，人)中的特定免疫球蛋白编码序列的文库，以设计来自另一个物种(例如，小鼠)中的已知抗体序列的同源免疫球蛋白编码序列。
来自杂交瘤的重链和轻链转录物的核苷酸序列被用于设计一组交叠的合成寡核苷酸，以生成具有与天然序列相同的氨基酸编码能力的合成V序列。合成重链和κ链序列可与天然序列相异在于3种方式：成串的重复核苷酸碱基被间断以有利于寡核苷酸合成和PCR扩增；根据Kozak法则(Kozak,1991,J.Biol.Chem.266L19867019870)掺入最佳翻译起始位点；和，在翻译起始位点的上游通过工程添加HindIII位点。
对于重链和轻链可变区，优化的编码链序列和对应的非编码链序列被分解成30-50个核苷酸，大致为对应的非编码寡核苷酸的中点。因此，对于每一条链，寡核苷酸可被组装成跨越150-400个核苷酸的区段的交叠双链组。随后将库用作模板来产生150-400个核苷酸的PCR扩增产物。通常地，可将单可变区寡核苷酸组分解成两个库，所述库被分别扩增以产生两个交叠PCR产物。随后通过PCR扩增将这些交叠产物组合以形成完整可变区。还可期望在PCR扩增中包括重链或轻链恒定区的交叠片段以产生可被容易地克隆进表达载体构建体的片段。
随后可将所重建的重链和轻链可变区与克隆的启动子、前导序列、翻译起始序列、前导序列、恒定区、3’非翻译序列、多腺苷酸化序列和转录终止序列组合以形成表达载体构建体。可将重链和轻链表达构建体组合进单一载体，将其共转染、连续地转染进宿主细胞或单独地转染进宿主细胞，随后将所述宿主细胞融合以形成表达两种链的宿主细胞。
用于该用途的质粒在本领域中是已知的。分别针对ETX或其结合受体的完全人抗体和嵌合抗体还包括IgG2、IgG3、IgE、IgA、IgM和IgD抗体。相似的质粒可被构建来用于表达其它重链同种型，或用于表达包含λ轻链的抗体。因此，已知的非人或人抗体(例如，小鼠抗-人抗-ETX或抗-MAL抗体)的结构特征被用于生成结构上相关的人抗-人抗-ETX或抗-MAL抗体，所述抗体保留抗体的至少一个功能性质，诸如分别对ETX或MAL的结合。另一个功能性质包括在竞争性ELISA测定中抑制抗-ETX对ETX或抗-MAL对MAL的结合。此外，可将这些抗体的一个或多狐假虎威CDR或可变区与已知的人框架区和CDR重组地组合，以生成另外的重组工程人抗-ETX或抗-MAL抗体。
由于在本领域众所周知抗体的重链和轻链CDR3结构域在抗体对于抗原的结合特异性/亲和力中起着重要作用，因此，如上所示制备的重组抗-ETX或抗-MAL或抗-HAvR-1抗体优选地包含可变区的重链和轻链CDR3。在某些实施方案中，抗体还可包含可变区的CDR2。在其它实施方案中，抗体还可包含可变区的CDR1。抗体还可包含CDR的任意组合。
上述工程化抗体的CDR1、2和/或3区可包含确切的氨基酸序列作为本文中公开的本发明的可变区的氨基酸序列。然而，本领域普通技术人员将理解，与确切的CDR序列具有一定的偏差同时仍然保持抗体有效地结合ETX和/或其结合受体MAL或HAvR-1的能力(例如，保守氨基酸修饰)可以是可能的。因此，在另一个实施方案中，工程化抗体可由例如与这些抗体的一个或多个CDR具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的一个或多个CDR组成。
除了只结合ETX和/或其结合受体以外，可筛选工程化抗体诸如上述抗体的它们的其它功能性质的保留，诸如：(1)结合人ETX或其结合受体例如MAL或HAvR-1；(2)抑制抗-ETX对ETX、抗-MAL对MAL或抗-HAvR-1对HAvR-1的结合；(3)结合MAL并抑制结合的MAL结合ETX的能力；(4)结合HAvR-1并抑制结合的HAvR-1结合ETX的能力。
抗体在抑制ETX对其结合受体的结合中的活性可通过测试抗体阻断ETX对其结合受体的结合的能力来测定。可使用在经标记的配体和/或抗体存在的情况下的竞争性ELISA测定。例如，为了确定抗-ETX抗体是否可阻断ETX与MAL或HAcR-1之间的相互作用，进行竞争性结合实验。用抗-ETX抗体预孵育表达MAL或HAvR-1的细胞，随后添加生物素化MAL-Ig融合蛋白。如果抗-ETX抗体以剂量依赖性方式和以高亲合力阻断MAL-Ig的结合，则抗-ETX抗体被认为在抑制ETX与MAL的相互作用中是有效的。可进行类似的测试来测试在抑制ETX与HAvR-1的相互作用中是有效的抗体。
本发明的一个方面涉及ETX、其结合受体MAL或HAvR-1的分离的多肽，和本文中描述的抗体及其抗原结合片段(“本发明的多肽”)，以及其生物活性部分。在一个实施方案中，可使用标准蛋白质纯化技术，通过适当的纯化方案从细胞或组织来源分离本发明的多肽及其生物活性部分。在另一个实施方案中，本发明的多肽及其生物活性部分通过重组DNA技术来产生。或者，本发明的多肽及其生物活性部分可使用标准肽合技术来化学合成。
“分离的”或“纯化的”多肽或其生物活性部分基本上不含来自本发明的多肽所源自的细胞或组织来源的细胞材料或其它污染性蛋白质，或当化学合成时基本上不含化学药品前体或其它化学药品。专门用语“基本上不含细胞材料”包括本发明的多肽及其生物活性部分的制剂，其中所述多肽与从其分离或重组产生所述多肽的细胞的细胞组相分离。在一个实施方案中，专门用语“基本上不含细胞材料”包括本发明的多肽和其生物活性部分的制剂，所述制剂具有少于约30％、20％、10％、5％(按干重计)的其它“污染性蛋白”。当重组产生本发明的多肽或其生物活性部分时，其也基本上不含培养基，即培养基代表少于约20％、10％、5％的蛋白质制剂的体积。
专门用语“基本上不含化学药品前体或其它化学药品”包括本发明的多肽或其生物活性部分的制剂，其中所述多肽与参与所述多肽的合成的化学药物前体或其它化学药品相分离。在一个实施方案中，专门用语“基本上不含化学药品前体或其它化学药品”包括具有少于约30％、20％、10％或5％(按干重计)的本发明的化学药品前体或蛋白质的本发明的多肽或其生物活性部分的制剂。
如本文中所用，本发明的多肽的“生物活性部分”包括参与ETX与其结合受体诸如MAL或HAvR-1之间、或抗-ETX与ETX之间、或抗-MAL与MAL之间或抗-HAvR-1与HAvR-1之间的相互作用的多肽。本发明的多肽的生物活性部分包括包含与本发明的多肽的氨基酸序列充分同一或来源于所述氨基酸序列的氨基酸序列的肽，其包括比本发明的各自的全长多肽少的氨基酸，并且展示本发明的各自多肽的至少一种活性。在一个实施方案中，生物活性部分包含具有分别特异性结合ETX或根据抗原的其结合受体的能力的结构域或基序，可针对所述抗原产生或设计结合其的所述生物活性部分。本发明的多肽的生物活性部分可用作用于开发调节由ETX或其结合受体MAL介导的活性例如免疫细胞活化或抑制的药剂的靶。
在某些实施方案中，本发明的ETX多肽具有如SEQ ID NO:1(氨基酸序列)和2(核苷酸序列)中所示的氨基酸序列。在其它实施方案中，本发明的MAL蛋白具有至少4个同种型(a、b、c和d)，每一个同种型具有如SEQ ID NO:3、4、5和6中所示的氨基酸序列。在其它实施方案中，HAvR-1蛋白具有如SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。在其它实施方案中，本发明的多肽与上述多肽的氨基酸序列基本上相同，并且保留各自多肽的功能活性。因此，在另一个实施方案中，本发明的多肽是包含与上述SEQ ID NO:1、3、4、5、6和7中所示的多肽具有至少约71％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％或更多同一性的氨基酸序列的多肽。
为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，将序列对齐以用于最佳比较目的(例如，可将缺口引入第一和第二氨基酸或核酸序列之一或两者中，以进行最佳比对并且为了比较目的可忽视非相同的序列)。在一个实施方案中，为了比较目的被比对的参照序列的工度为参照序列的长度的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％。随后比较对应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在该位置上是相同的(如本文中所用，氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的百分比同一性是由所述序列共有的相同位置的数目的函数，其考虑到需要被引用以进行两个序列的最佳比对的缺口的数目和每一个缺口的长度。
本发明还提供嵌合或融合蛋白。如本文中所用，“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含有效地连接于非本发明的多肽的本发明的多肽。“本发明的多肽”是指具有对应于ETX、MAL或HAvR-1的多肽以及它们的抗体或其抗原结合部分的氨基酸序列的多肽，而“非本发明的多肽”是指不具有对应于与SEQ ID NO.:1-7中显示的多肽非基本上同源的多肽的氨基酸序列的多肽，例如与上文中提及的多肽不同并且来源于相同或不同生物体的多肽。在融合蛋白内，术语“有效地连接的”意欲表示本发明的多肽和非本发明的多肽彼此在框内融合。非本发明的多肽可被融合于本发明的多肽的N末端或C末端并且对应于改变本发明的多肽的可溶性、结合亲和力、稳定性或效价的部分。
例如，在一个实施方案中，融合蛋白是与本发明的多肽的GST融合蛋白。此类融合蛋白可有利于本发明的重组多肽的纯化。在另一个实施方案中，融合蛋白在其N末端含有异源信号序列。在某些宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中，本发明的多肽的表达和/或分泌可通过使用异源信号序列来增加。
本发明的嵌合或融合多肽可通过标准重组DNA技术来产生。例如，可按照常规技术，例如通过使用平端或交错末端(以进行连接)、提供限制性酶消化(以提供适当的末端)、粘性末端的填充(视情况而定)、碱性磷酸酶处理(以避免不期望的联接)和酶促连接，将编码不同多肽序列的DNA片段在框内连接在一起。在另一个实施方案中，可通过常规技术包括自动化DNA合成仪来合成融合基因。或者，基因片段的PCR扩增可使用锚定引物来进行，所述引物在两个连续基因片段之间产生互补悬突，随后可使所述悬突退火和扩增，以产生嵌合基因序列(参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等人编辑，John Wiley & Sons:1992)。此外，已编码融合部分(例如，GST多肽)的许多表达载体是商购可得的。
本文中鉴定的本发明的多肽的氨基酸序列将使得本领域普通技术人员能够产生对应于本发明的多肽的多肽。可通过表达编码本发明的多肽的多核苷酸在原核细胞或真核细胞中产生此类多肽。或者，可通过化学方法合成此类肽。用于在重组宿主中表达异源多肽、化学合成多肽以及体外翻译的方法在本领域中是公知的，并且进一步描述于Maniatis等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1989)，第2版，Cold Spring Harbor,N.Y.；Berger和Kimmel,Methods in Enzymology，第152卷，Guide to Molecular CloningTechniques(1987),Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.；Merrifield,J.(1969)J.Am.Chem.Soc.91:501；Chaiken I.M.(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.11:255；Kaiser等人(1989)Science 243:187；Merrifield,B.(1986)Science 232:342；Kent,S.B.H.(1988)Annu.Rev.Biochem.57:957；和Offord,R.E.(1980)Semisynthetic Proteins,WileyPublishing(所述文献通过引用并入本文)中。
在某些实施方案中，本发明提供血脑屏障(BBB)上的受体诸如HAVcR-1的抑制剂也可以是用于防止和/或治疗MS的治疗剂候选者。已被发现潜在地抑制HAVcR-1的化合物包括，但不限于突变的ε毒素诸如ETX-Y29E、ETX-Y30E、ETX-Y36E和ETX-Y196E。在某些实施方案中，ETX-H106P突变体是ETX受体拮抗剂的另一个候选者。BBB上的其它受体的抑制剂也包含在本发明中。如本文中所用，术语“抑制剂”或“拮抗剂”是指减少、限制或阻断例如特定作用、功能或相互作用的药剂或分子。在某些实施方案中，抑制剂是产气荚膜梭菌ε毒素的细胞毒性的小分子抑制剂，此类抑制剂是本领域中现在已知的或以后开发的。此类抑制剂的实例描述于Lewis等人(Toxins 2010,2,1825-1847)(其完整内容并此通过引用并入)中。
在某些实施方案中，本发明的方法包含为对于产气荚膜梭菌B型或D型细菌菌株是特异的噬菌体裂解酶的药剂。在一个实施方案中，此类噬菌体裂解酶为来源于菌株ATCC13124的胞壁酸酶PlyCM。在某些实施方案中，用于防止或治疗人的MS的本发明的药剂是含有产气荚膜梭菌A型或可有效地竞争过产气荚膜梭菌B型或D型而无其它产气荚膜梭菌毒素类型的其它细菌类型的益生菌补充剂。在某些实施方案中，益生菌补充剂含有产气荚膜梭菌A型细菌菌株，因为已显示其毒素类型竞争过产气荚膜梭菌B型。益生菌方法在不同市场中正被开发。益生菌补充制剂中包含的典型细菌菌株包括，但不限于嗜酸乳酸杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、沼泽红假单胞菌、发面酵母和嗜热链球菌。这些菌株在各种人食物中常见的，并且被广泛用于制造用于人、动物和水产养殖健康的益生菌膳食补充剂产品。本发明包括现在已知的或以后开发的对于产气荚膜梭菌B型或D型细菌菌株是特异的和/或竞争过其的任何细菌噬菌体裂解酶和/或益生菌补充剂。在一些情况下，可通过基因工程益生菌生物体以表达特异性裂解产气荚膜梭菌的酶来在该生物体中递送噬菌体裂解酶。
在某些实施方案中，本发明的方法包含为抗产气荚膜梭菌B型或D型细菌菌株或从其产生的ε毒素(ETX)的疫苗的药剂。增强对特定疾病的免疫的疫苗的生物制剂在本领域中是公知的。几种此类疫苗已被开发并用于防止动物感染产气荚膜梭菌，并且重组形式正处于开发之中。更具体地，针对产气荚膜梭菌细菌菌株的疫苗和/或其制备方法在本领域中是公知的和/或描述于例如属于Titball等人的美国专利No.6,403,094；Titball(Vaccine27,2009,D44-D47)；以及其它文献，例如，Chandran等人(Clinical and VaccineImmunology,2010，第1013-1016页)；和de la Rosa等人(J ANIM Sci 1997,75:2328-2334)(所述每一篇文献的完整内容通过引用整体并入)中。
本发明的方法还包含足以消灭产气荚膜梭菌B型或D型细菌菌株的抗生素。经发现有效地抗产气荚膜梭菌的抗生素包括，但不限于青霉素、氨苄青霉素、阿莫西林、甲硝哒唑、红霉素和泰乐菌素。本发明包括任何已知的和目前可获得的或任何以后开发的有效地抗产气荚膜梭菌B型或D型细菌菌株的抗生素。
在某些实施方案中，可在各自包含与药剂混合的适合药用和药学上可接受的载体或佐剂的单独配制的组合物中，分别施用在本发明的方法中用于防止和/或治疗人的MS的一种或多种所述药剂。在其它实施方案中，可将一种或多种此类药剂一起组合和/或配制于组合物中，所述组合物还包含与这些药剂混合的适合药用和药学上可接受的载体或佐剂。本发明的组合物可被配制于任何适合药用和/或药学上可接受的制剂中，以用于任何合适和/或可接受的施用途径，包括但不限于口服片剂或胶囊、亲代可注射溶液或悬浮液或皮下贴剂。本发明的组合物可被单独施用，或与任何合适的药剂或化合物组合施用以增强预防和治疗人的MS的作用，和/或减轻与MS疾病直接或间接相关的任何综合征和/或因治疗引起的副作用。
本发明还提供组合物，例如药物组合物，其含有与药学上可接受的载体一起配制的本发明的单克隆抗体、其抗原结合部分(诸如抗原结合片段)的一种或组合。在一个实施方案中，组合物包括多种(例如，两种或更多种)本发明的分离的抗体的组合，所述组合物的每一种抗体结合ETX或其结合受体诸如MAL或HAvR-1的不同的预先选择的表位。本发明还提供用于预防或治疗有此需要的人受试者的多发性硬化症(MS)的组合物，其包含有效量的直接或间接干扰由产气荚膜梭菌B型或D型细菌菌株产生的ε毒素(ETX)、ETX-结合受体或ETX与其结合受体的相互作用(以抑制或阻遏ETX调节的受体的信号转导活性)的药剂。
还可在联合疗法中(即与其它药剂组合)施用本发明的药物组合物。例如，联合疗法可包括具有至少一种或多种另外的治疗剂的本发明的组合物。还可将本发明的药物组合物与任何其它疗法结合施用。本发明还包括与其它抗体的共施用。
如本文中所用，“药学上接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，所述载体适合用于静脉内、肌内、皮下、胃肠外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。取决于施用途径，可用材料涂覆活性化合物即抗体、双特异性和多特异性分子中以保护所述化合物免受酸和可使所述化合物失活的其它天然条件的作用。
“药学上可接受的盐”是指保留亲代化合物的期望的生物活性并且不赋予任何不期望的毒理学效应的盐。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括从无毒性无机酸诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等，以及从无毒性有机酸诸如脂肪族单羧酸或二羧酸、苯基-取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂肪酸和芳香磺酸等衍生的那些盐。碱加成盐包括从碱土金属诸如钠、钾、镁、钙等以及从无毒性有机胺诸如N,N’-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等衍生的那些碱。
本发明的组合物可通过多种本领域中已知的方法施用。如将由本领域普通技术人中所理解的，施用途径和/或模式可根据期望的结果而变化。活性化合物可利用防止所述化合物快速释放的载体来制备，诸如受控制释放制剂，包括埋植剂、透皮贴剂和微胶囊化递送系统。可使用生物可降解的生物相容性聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的许多方法已获得专利或对于本领域普通技术人员来说通常是已知的。
为了通过特定施用途径施用本发明的化合物，可能必需用材料涂覆所述化合物或将所述化合物与材料共施用以防止其失活。例如，可将化合物于适当的载体例如脂质体或稀释剂中向受试者施用。药学上可接受的稀释剂包括盐水和含水缓冲溶液。脂质体包括水包油包水型CGF乳液以及常规脂质体。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体以及用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途在本领域是已知的。除了任何常规介质或药剂都与活性化合物不相容的情况之外，设想了其在本发明的药物组合物中的用途。还可以向组合物中掺入补充性的活性化合物。
治疗性组合物在生产和贮存条件下通常必须是无菌的和稳定的。可将组合物配制成溶液、微乳液、脂质体或适于高药物浓度的其它有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。可以例如通过使用包衣诸如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持期望粒度，及通过使用表面活性剂，来保持适当的流动性。在许多情况下，优选地可在组合物中包含等渗剂，例如糖类、多元醇诸如甘露醇、山梨醇或氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可以造成可注射组合物的延长吸收。
可通过将所需量的所述活性化合物与根据需要的一种或一组上文中列举的成分掺入合适的溶剂中，然后微量过滤灭菌，来制备无菌注射液。一般地，通过将活性化合物掺入含有基本分散介质和来自上文中列举的那些成分的所需其它成分的无菌媒介物中，来制备分散剂。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，所述方法产生活性成分加上来自其先前过滤灭菌的溶液的任何另外的所需成分的粉剂。
可调整剂量方案以提供最佳的期望应答(例如治疗性应答)。例如，可以施用单次推注，可随时间施用数个分开的剂量，或者可根据治疗情况的紧急程度所指示的，按比例降低或提高剂量。例如，可通过皮下注射每周1次或2次或通过皮下注射每月1次或2次施用本发明的人抗体。以剂量单位形式配制胃肠外组合物对于易于施用和统一剂量而言是尤其有利的。如本文中所用，剂量单位形式是指在物理上离散的单位，适于作为单位剂量用于待治疗的受试者；每一个单位都含有与所需药物载体结合的经计算产生所期望的疗效的预定量的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格取决于且直接依赖于(a)活性化合物的独特特性以及要实现的特定治疗效果，和(b)技术上固有的配制用于治疗个体的敏感性的这样的活性化合物的局限。
在一个实施方案中，本发明的药剂是抗体。如本文中定义的，治疗有效量的抗体(即，有效剂量)的范围为约0.001至30mg/kg体重、或约0.01至25mg/kg体重、或约0.1至20mg/kg体重、或约1至10mg/kg、2至9mg/kg、3至8mg/kg、4至7mg/kg、或5至6mg/kg体重。本领域普通技术人员将理解，某些因素可影响有效地治疗受试者所需的剂量，包括但不限于疾病或病症的严重度、先前的治疗、受试者的一般健康和/或年龄以及存在的其它疾病。此外，利用治疗有效量的抗体治疗患者可包括单次治疗或，优选地可包括一系列治疗。还应理解，用于治疗的有效剂量的抗体可在特定治疗过程中增加或减少。剂量的变化可因诊断测定的结果而导致。
药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)，卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
对于治疗性组合物，本发明的制剂包括适合用于口服、经鼻、局部(包括口腔和舌下)、直肠、阴道和/或胃肠外施用的的那些制剂。制剂可方便地以单位剂量形式提供，并且可通过药学领域中已知的任何方法来制备。可与载体材料组合以产生单次剂量形式的活性成分的量将根据待治疗的受试者和具体施用模式而变化。可与载体材料组合以产生单次剂量形式的活性成分的量将通常是产生疗效的组合物的那个量。通常地，在100％中，该量的范围为约0.001％至约90％，可选择地约0.005％至约70％，或可选择地约0.01％至约30％的活性成分。
适合用于阴道施用的本发明的制剂还包括含有在本领域中已知是合适的此类载体的子宫托、止血栓、乳膏剂、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂。用于本发明的组合物的局部或经皮肤施用的剂量形式包括粉剂、喷雾剂，软膏、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶、溶液、贴剂和吸入剂。可在无菌条件下将活性化合物与药学上可接受的载体以及与可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或喷射剂混合。
如本文中所用，短语“胃肠外施用”和“从胃肠外施用”意指除经肠或局部施用外的施用模式，通常通过注射施用，包括，但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
可用于本发明的药物组合物的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油诸如橄榄油，和可注射的有机酯诸如油酸乙酯。通过例如使用包衣材料诸如卵磷脂，通过在分散体的情况下保持期望颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，可维持适当的流动性。
这些组合物还可包含佐剂，诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。通过灭菌方法(同上)和通过包含各种抗细菌和抗真菌剂，诸如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、酚、山梨酸等，可以确保对微生物存在的预防。可能还希望向组合物中加入等渗剂，诸如糖类、氯化钠等。此外，通过加入延迟吸收的药剂，诸如单硬脂酸铝和明胶，可以导致可注射药物形式的延长吸收。
当将本发明的化合物作为药物向人施用时，可单独地或作为含有与药学上可接受的载体组合的例如0.001至90％(例如，0.005至70％，诸如0.01至30％)的活性成分的药物组合物提供它们。
无论选择的施用途径是什么，可通过本领域普通技术人员已知的常规方法将可以以合适的水合形式使用的本发明的化合物和/或本发明的药物组合物配制成药学上可接受的剂量形式。
可改变本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平，以获得对于特定患者、组合物和施用模式有效地实现期望的治疗性应答而对患者是无毒的活性成分量。选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本发明的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，施用途径，施用时间，所采用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与所采用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料，待治疗患者的年龄、性别、体重、状况、大体健康状态和先前病历以及医学领域公知的类似因素。具有本领域中的普通技术能力的医生可容易地确定和开出有效量的所需药物组合物。例如，医生可以以低于为了实现期望的疗效所需的水平的水平开始用于药物组合物的本发明的化合物的剂量，然后逐渐增加剂量直至实现所需疗效。一般地，本发明的组合物的适当日剂量是作为有效地产生疗效的最低剂量的化合物的那个量。这样的有效剂量通常取决于上述因素。优选地，施用是静脉内、肌内、腹膜内或皮下施用，优选地靠近目标位置施用。必要时，可在一天中以适当的间隔，任选地以单位剂量形式以分开施用的2、3、4、5、6或更多个亚剂量施用有效日剂量的治疗性组合物。虽然可能单独施用本发明的化合物，但优选地将化合物作为药物制剂(组合物)来施用。
可以用本领域已知的医疗装置来施用治疗性组合物。例如，在一个实施方案中，可以用无针皮下注射装置来施用本发明的治疗性组合物。可用于本发明的公知的植入物和模块的实例包括可用于以受控速率分配药物的植入的微输注泵；用于通过皮肤施用药物的治疗用装置；用于以精确输注速率递送药物的的药物输注泵；用于持续的药物递的送的变流可植入输注装置；具有多室隔室的渗透性药物递送系统；和渗透性药物递送系统。许多其它的此类植入物、递送系统、和模块对于本领域普通技术人员来说是已知的。
在某些实施方案中，可配制本发明的人单克隆抗体以确保在体内的适当分布。例如，血脑屏障(BBB)排除了许多高亲水性化合物。为了确保本发明的治疗化合物穿过BBB(如有需要)，可以将它们配制在例如脂质体中。有关制造脂质体的方法本领域中是公知的。脂质体可包含被选择性地转运到特定细胞或器官、从而增强靶向药物递送的一个或多个部分。示例性靶向部分包括叶酸或生物素；甘露糖苷；抗体；表面活性剂A蛋白受体，其不同种类可包含本发明的制剂以及发明的分子的组分。在本发明的一个实施方案中，将本发明的治疗化合物配制在脂质体中；在另一个实施方案中，脂质体包括靶向部分。在另一个实施方案中，通过单次推注将脂质体中的治疗化合物递送至靠近肿瘤或感染的部位。组合物必须具有达到易注射性存在的程度的流动性。其在生产和贮存条件下必须是无菌的，并且必须进行防腐以避免微生物诸如细菌和真菌的污染作用。
组合物必须是无菌的并且具有达到组合物可通过注射器递送的程度的流动性。除了水以外，载体还可以是等渗缓冲盐溶液、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适混合物。可以例如通过使用包衣诸如卵磷脂，在分散体的情况中通过维持期望粒度，及通过使用表面活性剂，来保持适当的流动性。在许多情况下，优选地在组合物中包含等渗剂，例如糖类、多元醇诸如甘露醇、山梨醇和氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可以造成可注射组合物的长期吸收。
当活性化合物如上所述得到适当保护时，可以例如将化合物与惰性稀释剂或可同化的可食用载体一起口服施用。
可在多种体外和体内诊断和治疗应用中使用本文中描述的抗体(包括抗体的衍生物和缀合物)和/或抑制剂或拮抗剂以及含有所述抗体和/或抑制剂或拮抗剂的组合物。例如，抗-ETX对ETX的结合通过其与其结合受体MAL或HAvR-1的相互作用传递抑制性信号。因此，ETX与其结合受体(例如，MAL或HAvR-1)之间的相互作用的调节导致下游信号转导活性的调节/抑制。具体地，本文中描述的抗体对于与由通过产气荚膜梭菌B型和/或D型细菌菌株产生的ETX介导的人的MS相关的诊断、预防、预防和治疗性应用是有用的。
如果获得一个或多个有益的或期望的结果，包括期望的临床结果，则人受试者得到治疗。为了本发明的目的，有益或期望的临床结果包括，但不限于以下方面的一个或多个方面：减少因疾病引起的一个或多个症状，提高患有疾病的那些受试者的生活质量，减少治疗疾病所需的其它药物的剂量，延迟疾病的进展和/或延长个体的存活时间。
在一个方面，本发明涉及预防人受试者患MS的方法。可以例如通过通过本领域已知的诊断或预后测定的任一种或组合鉴定将从利用所述抗体或方法的治疗受益的处于发生MS的危险的人受试者。预防性抗体或疫苗的施用可在与MS相关的症状表现之前进行。用于预防或治疗的适当的抗体和/或抑制剂或拮抗剂可基于临床指征来确定，并且可以例如使用本文中描述的筛选测定来鉴定。
本发明还提供用于诊断或预后处于发生多发性硬化症(MS)的危险的人受试者的方法，其包括：a)从所述受试者获得生物样本；b)检测ETX基因或蛋白质表达或活性水平，或产气荚膜梭菌B型或D型细菌菌株在来自所述受试者的生物样本中的存在，和c)当相较于参照水平检测到ETX基因或蛋白质的升高的表达或活性水平或产气荚膜梭菌B型或D型细菌菌株的存在时，诊断受试者处于发生MS的危险中。在某些实施方案中，生物样本是选自由以下组成的组的生物流体：全血、血浆、血清、泪液、唾液、粘液、脑脊髓液、尿和粪便。
用于诊断处于发生多发性硬化症(MS)的危险中的人受试者或提供具有多发性硬化症(MS)的人受试者的预后的试剂盒也被涵盖在本发明中。所述试剂盒包含：a)含有对于ETX基因或蛋白质或对于产气荚膜梭菌B型或D型细菌菌株是特异的一种或多种检测剂的捕获试剂；b)检测试剂；和c)说明书，其用于使用试剂盒诊断处于发生MS的危险中的所述受试者或当相较于参照水平检测到ETX基因或蛋白质的升高的表达或活性水平或产气荚膜梭菌B型或D型细菌菌株的存在时，提供具有MS的所述受试者的预后。
如上文中所论述的，本发明提供作为多发性硬化症的致病因子的产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)。产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)籍以在MS中引发新的病变形成的病理生理机制中的重要步骤需要毒素从胃肠道进入血流。淋巴细胞表达产气荚膜梭菌ε毒素受体(髓鞘和淋巴细胞蛋白：MAL)，从而血液中的毒素以高亲和力结合人淋巴细胞。因此，在某些实施方案中，本发明提供通过使用针对产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)的特异性抗体检测结合于淋巴细胞的产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)的方法。用产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)特异性抗体孵育人淋巴细胞或血液单核细胞，洗涤所述细胞，随后用相关荧光标记的第二抗体进行孵育。可使用荧光激活细胞分选术或流式细胞术来检测结合产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)特异性抗体和人淋巴细胞特异性抗体(诸如但不限于抗-CD3)的细胞。除了检测产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)特异性抗体对淋巴细胞的结合以外，本发明还提供检测由ε毒素诱导的淋巴细胞体积和膜特征的改变。
本发明还提供筛选能够抑制或阻遏ETX或ETX-结合受体的基因或蛋白质表达或活性水平，或抑制ETX对其结合受体的结合能力以抑制或阻遏ETX-受体信号转导功能的候选药剂的方法。筛选方法包括以下步骤：a)将候选药剂暴露于ETX或ETX-结合受体的基因或蛋白质，b)测定所述候选药剂对ETX或ETX-结合受体的所述基因或蛋白质的结合亲和力；和c)当候选药剂结合ETX或ETX-结合受体的所述基因或蛋白质或调节它们的活性时，将所述候选药剂鉴定为ETX或ETX-结合受体的抑制剂或阻遏剂。
本发明的一个方面涉及利用筛选测定(包括基于细胞和非基于细胞的测定)的方法。在一个实施方案中，测定提供用于鉴定调节ETX与其结合受体诸如MAL或HAvR-1的相互作用的抗体的方法。在一个实施方案中，本发明涉及用于筛选结合ETX或调节其活性，例如调节所述多肽与(例如，结合于)其同源结合伴侣或受体(例如MAL或HAvR-1)相互作用的能力的候选药剂或抗体的测定。
在一个实施方案中，测定是基于细胞的测定，包括将表达ETX或其结合受体的细胞与候选化合物或抗体接触和测定候选化合物或抗体调节(例如抑制)ETX对其结合受体MAL或HAvR-1的结合的能力。测定ETX结合其结合受体MAL或HAvR-1或与其相互作用的能力可以例如通过测量直接结合或通过测量下游信号转导活性的参数来实现。
例如，在直接结合测定中，可将ETX、其结合受体(或它们各自的靶多肽)与放射性同位素或酶促标记偶联，以便可通过检测复合物中的标记的蛋白质来测定结合ETX或其结合受体MAL或HAvR-1的候选化合物或抗体的结合。例如，可用125I、35S、14C或3H直接或间接标记EXT或其结合受体MAL或HAvR-1，并且通过射电辐射的直接计算或通过闪烁计数检测放射性同位素。或者，可用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶酶促标记EXT或其结合受体MAL或HAvR-1，并通过测定适当的底物至产物的转化来检测所述酶促标记。
也在本发明的范围内的是测定化合物或抗体调节ETX与其结合受体MAL或HAvR-1之间的相互作用的能力而不标记任何相互作用物。例如，可使用微生理记录仪检测ETX与其结合受体MAL或HAvR-1的相互作用。如本文中所用，“微生理记录仪”(例如，细胞传感仪)是使用光寻址电位传感器(LAPS)测量细胞酸化环境的速率的分析仪。该酸化速率的变化可用作化合物与受体之间的相互作用的指征。
在另一个实施方案中，测定抗体拮抗给定组的多肽之间的相互作用的能力可通过测定该组多肽的一个或多个成员的活性来实现。例如，ETX或其结合受体的活性可通过检测细胞第二信使的诱导，检测适当的底物的催化/酶促活性，检测报告基因(包含有效地连接于编码可检测标记例如氯酶素乙酰转移酶的核酸的靶应答调控元件)的诱导或检测受ETX或其结合受体调节的细胞应答来实现。测定抗体结合所述多肽或与所述多肽相互作用的能力可以例如通过如下方式来实现：在增殖测定中测量化合物调节免疫细胞共刺激或抑制的能力，或干扰所述多肽结合识别其部分的抗体的能力。
阻断或抑制ETX与其结合受体的相互作用的抗体可通过它们抑制免疫细胞增殖和/或效应子功能，或当添加至体外测定中时诱导无反应性的能力来鉴定。例如，可在通过激活受体刺激信号转导的药剂存在的情况下培养细胞。许多细胞活化的确认读出可用于测量在激活剂存在的情况下的细胞增殖或效应子功能(例如，抗体产生、细胞因子产生、吞噬作用)。测试抗体阻断该激活的能力可通过使用本领域已知的技术测量所述抗体导致待测量的增殖或效应子功能下降的能力来容易地测定。
在其它实施方案中，本发明的测定是其中将ETX、其结合受体或其生物活性部分与候选化合物或抗体接触，并测定所述候选化合物或抗体结合ETX或其结合受体多肽或其生物活性部分的能力的无细胞测定。可如上所述，直接或间接地测定候选化合物或抗体对ETX或其结合受体多肽的结合。在另一个实施方案中，测定包括将多肽或其生物活性部分与其结合伴侣接触以形成测定混合物，将测定混合物与候选化合物或抗体接触，和在测定混合物中测定候选化合物或抗体与多肽相互作用的能力，其中测定候选化合物或抗体与多肽的相互作用的能力包括测定候选化合物或抗体相较于结合伴侣优先结合多肽或其生物活性部分的能力。
例如，ETX或其结合受体多肽可用于形成测定混合物，并且候选化合物或抗体阻断该相互作用的能力可通过利用上述用于测定结合的方法之一测定ETX结合其结合受体的能力以及测定ETX结合其结合受体的能力来测试。测定ETX结合其结合受体MAL或HAvR-1的能力还可使用技术诸如实时生物分子相互作用分析(BIA)(Sjolander,S.和Urbaniczky,C.(1991)Anal.Chem.63:2338-2345和Szabo等人(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5:699-705)来实现。如本文中所用，“BIA”是用于实时研究生物特异性相互作用而无需标记任何相互作用物的技术(例如，BIAcore)。表面等离子体共振(SPR)的光学现象的变化可用作生物多肽之间的实时反应的指示。可将ETX或其结合受体多肽固定在BIAcore芯片上，并且可测试抗体的对ETX或其结合受体的结合。使用BIA技术的实例由Fitz等人(1997)Oncogene 15:613描述。
本发明的无细胞测定适合蛋白质(例如，ETX或其结合受体MAL或HAvR-1，或其生物活性部分)的可溶性和/或膜结合形式的使用。在其中使用膜结合形式蛋白质的无细胞测定的情况下，可能期望利用增溶剂，以便在溶液中维持蛋白质的膜结合形式。此类增溶剂的实例包括非离子型去垢剂诸如正辛基葡糖苷、正十二烷基糖苷、正十二烷基麦芽糖苷、辛酰基-N-甲基葡糖酰胺，癸酰基-N-甲基葡糖酰胺、TritonTM X-100、TritonTM X-114、ThesitTM、异十三烷基聚(乙二醇醚)n、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHAPSO)或N-十二烷基＝N,N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐。
在上述测定方法的一个或多个实施方案中，可能期望固定ETX或其结合受体MAL或HAvR-1或适当的靶多肽，以有利于所述蛋白之一或两者的复合形式与非复合形式分离，以及容许测定的自动化。可在适合用于包含反应物的任何容器中进行候选化合物或抗体对ETX或其结合受体的结合。此类容器的实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。可使用FACS通过荧光检测来实现候选化合物或抗体对ETX的结合。例如，可使用针对ETX的抗体和针对第一抗-ETX抗体的荧光标记的第二抗体检测结合于来源于MS患者的淋巴细胞的ETX。随后通过FACS实现荧光标记的细胞的检测。在一个实施方案中，可提供添加允许所述蛋白之一或两者结合于基质的结构域的融合蛋白。例如，可将谷胱甘肽-S-转移酶/ETX、/MAL或/HAvR-1多肽融合蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶/候选融合蛋白吸附至谷胱甘肽琼脂糖珠粒(Sigma Chemical,St.Louis,Mo.)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，随后将所述珠粒或微量滴定板与测试化合物或抗体组合，并在有助于复合物形成的条件下(例如，在盐和pH的生理条件下)孵育混合物。孵育后，洗涤珠粒或微量滴定板孔以除去任何未结合的组分、在珠粒的情况下固定的基质，例如，如上所述，直接或间接测定复合物。或者，可将复合物与基质分离，并使用标准技术测定ETX或其结合受体多肽结合或活性的水平。
在替代实施方案中，测定候选化合物或抗体调节ETX或其结合受体的活性的能力，可通过如下方式来实现：测定候选化合物或抗体调节在ETX-受体信号转导的下游起作用的多肽，例如与ETX相互作用的多肽，或在ETX-受体结合的下游起作用的多肽的活性的能力。例如，可测定第二信使的水平，可测定相互作用者多肽对适当的靶的活性，或可如先前所述测定相互作用者对适当的靶的结合。
本发明还涉及通过上述筛选测定鉴定的新型抑制剂、拮抗剂和/或抗体。因此，在本发明的范围内的是在适当的动物模型中进一步使用如本文中描述的候选抑制剂、拮抗剂和/或抗体。例如，如本文中所述鉴定的抗体可在动物模型中用于测定利用此类抗体的治疗的功效、毒性或副作用。或者，如本文中所述鉴定的抗体可在动物模型中用于测定此类抗体的作用机制。此外，本发明涉及通过上述筛选测定法鉴定的新型候选抑制剂、拮抗剂和/或抗体用于如本文中所述的治疗的用途。
实施例
通过以下实施例进一步举例说明本说明书，所述实施例不应当被解释为以任何方式限制。所有引用的参考资料(包括如在整个本申请中引用的文献参考资料、发布的专利、公开的专利申请)的内容在此通过引用并入。
实施例1
一般方法
ETX的荧光标记和免疫荧光
His标记的原毒素获自BEI Resources，并且按照制造商的说明书使用AlexaFluor 594蛋白质标记试剂盒(Invitrogen)荧光标记1mg。将固定的冷冻冠状切片在4℃于1％胆酸钠,1％ BSA,10％驴血清,PBST溶液中透化过夜20。随后在4℃用1:1000的兔抗-PLP(ThermoScientific)孵育切片过夜。在用PBS洗涤3次后，随后用1:1000的驴抗-兔Alexa488(Jackson ImmunoResearch)孵育切片，随后在RT用标记有Alexa 594的His标记的原毒素(50nM)孵育2小时。将染色的组织在PBS中洗涤3次，并在Rockefeller生物影像中心制备用于显微镜检查。
样本收集/粪便培养/PCR分析
粪便样本由患者和健康对照自已收集在干净的单个使用容器中，并于，-20℃下贮存直至返回至MS中心。收集约1克的粪便并在IRB方案号1003010940下，将其贮存在含有9ml的缓冲甘油-盐溶液(在蒸馏水中制备的10％甘油,71.2mM K2HPO4,29.4mM KH2PO4,71.9mMNaCl，被调节至pH 7.2并经高压灭菌的)的粪便收集管(Sarstedt)中。在收到后，将样本重悬浮于40ml的改良快速产气荚膜杆菌培养基中21；用D-环丝氨酸(400mg/L)取代新霉素/多粘菌素B，并省略石蕊牛奶以改善DNA提取。将重悬浮的样本在47℃ ON于盖紧盖子的50ml法尔肯管中进行培养。
使用Qiagen血液和组织试剂盒从1ml的培养上清液提取DNA。将分离的DNA用作用于以下PCR反应的模板；使用以下引物：
1)16S rRNA(阳性对照)正向引物：AGAGTTTGATCCTGGCTCA(SEQ ID NO:8)，反向引物：GGTTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID NO:9)
2)α毒素(泛产气荚膜梭菌标志物)正向引物：GCTAATGTTACTGCCGTTGA(SEQ ID NO:10)10，反向引物：CCTCTGATACATCGTGTAAG(SEQ ID NO:11)10
3)β毒素正向引物：GCGAATATGCTGAATCATCTA(SEQ ID NO:12)10，反向引物：GCAGGAACATTAGTATATCTTC(SEQ ID NO:13)10
4)ε毒素正向引物：GCGGTGATATCCATCTATTC(SEQ ID NO:14)10，反向引物：CCACTTACTTGTCCTACTAAC(SEQ ID NO:15)10
5)B1RBB5噬菌体基因正向吲物：AAATGGACAAGAGGGATAAGGAT(SEQ ID NO:16)，反向引物：TTTTCATCACAAATACCAGCCTC(SEQ ID NO:17)
6)B1RAA6噬菌体基因正向吲物：TTACAATAAAACCACATGAGCTT(SEQ ID NO:18)，反向引物：TTTTATTTAACATACTCCGTTTT(SEQ ID NO:19)
7)Q8SBN7噬菌体基因正向吲物：GGGTGTCAAAGAAGATTTTAAAG(SEQ ID NO:20)，反向引物：TTCTATCTTGCAACATTATATTT(SEQ ID NO:21)。
血清和CSF收集
在Weill Cornell MS Center(IRB方案号1003010940)收集具有MS的人和健康对照的CSF和血清。另外的MS和卒中的CSF和血清获自Brain Research Institute,UCLA。SLE血清购自Vital Products Inc。
统计分析
进行双尾卡方检验以(1)比较MS患者相对健康对照中的共生产气荚膜梭菌A型的发生率和(2)比较MS患者相对健康对照的针对产气荚膜梭菌的血清反应性。
实施例2
MS和健康对照中的ETX免疫反应性
使用人血清/CSF作为第一抗体进行免疫印迹。进行SDS PAGE电泳，用100ng的His标记的proETX(BEI Resources)和等摩尔的PA63(EMD Millipore)190ng、霍乱毒素βFITC(Sigma Aldrich)36ng、His标记的志贺毒素1β(BEI Resources)26ng和His标记的志贺毒素2β(BEI Resources)26ng的混合物加载每一孔。将蛋白质转移至Immobilon P膜(Millipore)，并用稀释的血清/CSF进行探测。将所有血清和CSF分别稀释10,000倍和27倍，同时将SLE血清稀释100,000倍以标准化本底。使用缀合有HRP的驴抗-人IgG 1:10,000(Jackson Immunoresearch)来显现人抗体结合。
哺乳动物中的对ε毒素的体液免疫是瞬时的和不完全的。例如，当用ε类毒素在t＝0周和t＝6周接种时，仅50％的山羊在第9周具有保护性抗-毒素滴度22。到第30周，在第3次接种时，仅2％的山羊保持保护性滴度。在第32周(第3次接种后2周)，100％具有保护性滴度，但到第56周，仅11％显示保护性滴度22。因此，在暴露于ε毒素的哺乳动物中，即使在将毒素与佐剂一起施用时，血清阴性和血清逆转也是常见的。
使用proETX蛋白，通过免疫印迹筛选来自MS患者、健康对照和其它疾病的队列的血清和CSF的对ETX的免疫反应性。免疫印迹测定被开发来严格排除假阳性的可能性。如果结合无对4种对照毒素的免疫反应性存在明确的对ETX的免疫反应性，则样本被评分为阳性的。对照中的3个被选择来代表已知的肠来源的毒素：霍乱毒素β、志贺毒素1β和志贺毒素2β；对于这些对照毒素未曾发生交叉反应性。选择第四对照来自炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)的保护性抗原63(PA63)，因为与ETX一样，PA63是具有与ε毒素相似的疏水性图谱的成孔毒素23。PA63也被选择，因为大多数灵敏人应当呈血清阴性。对PA63的血清反应仅在接种或暴露于炭疽的情况下发生。大多数人未接种炭疽疫苗，并且在本研究中，没有一个患者或对照被接种。也可在已感染了炭疽芽孢杆菌并且存活的人中观察到针对PA63的血清反应性。由于肺和胃肠道炭疽通常是致命的或因为与ETX一样，因此PA63是具有与ε毒素相似的疏水性图谱的成孔毒素23。也在已感染衰弱的人中被观察到针对PA63的血清反应性，并且由于皮肤炭疽导致特征性黑色痂皮，因此在定向健康问卷上不可能会漏掉先前的炭疽。因此，针对PA63的阳性免疫反应性强有力地表明宿主抗体与PA63的非特异性相互作用或先前对具有共有表位的抗原的暴露。因此，显示针对ETX和PA63的免疫反应性的样本被排除，因为这些样本显示不明确的结果。在其中存在增强的体液免疫的SLE中，交叉反应是常见的(图1)。由于疏水性蛋白质更可能显示与抗体的非特异性相互作用，因此假定对PA63的免疫反应性在自然界中是非特异性的。
已发现10％的MS患者和1％的健康对照在横断面分析中具有ETX特异性抗体(p＝0.0044)(图1)。基于免疫后已知的低血清阳性率，和共同的血清逆转率22，该10％的阳性据推测低估了ETX暴露的真实值。
实施例3
MS中相较于健康对照的减少的产气荚膜梭菌A型发生率
土壤研究已确定产气荚膜梭菌A型的存在与其它毒素类型的不存在巧合，这表明毒素类型A可与其它产气荚膜梭菌毒素类型竞争资源24。因此，在MS和健康对照中估量A型(一种人共生型)的发生率。培养来自30个具有MS的个体和31个健康对照的粪便。裂解细菌，分离DNA，随后通过PCR分析测定毒素类型10。先前公开的研究已表明A型存在于约50％的健康人中25。与此相一致地，该研究发现52％的健康对照(n＝31)携带可检测的A型(图2)。然而，在具有MS的个体(n＝30)中只发现23％的产气荚膜梭菌A型运输，χ2p＝0.0227(图2)。该发现支持MS易感性可部分归因于宿主-微生物群影响以及共生产气荚膜梭菌A型可以是保护性的。
实施例4
具有多发性硬化症的妇女中的产气荚膜梭菌B型的鉴定
21岁的妇女(患者73F)发生左底肢协调运动障碍和在3天的时间中进展至其最大的不平衡。发作后2周，她因持续的症状而引见给神经病学家，并且大脑的神经成像显示多个深部和皮质下白质中的具有增强的T2/flair信号的病灶，在MS的特征性胼胝体内具有几个卵形病变。在施用IV钆后，几个病变增强。CSF分析在等电聚焦上显示5个IgG条带，所述条带不存在于对应的血清样本中。她满足处于最早临床表现的称为临床孤立综合征(CIS)的临床确诊复发缓解型MS的修正标准。她接受5天的IV甲泼尼龙，每日1克，并且她的症状在3周内消退至正常神经功能。她被介绍至Weill Cornell MS Center以确认诊断和治疗计划。Weill Cornell的重复神经成像显示多发性硬化症在形态学和位置上独有的病变特征(图3)。症状发作后约3个月，她被招募进HITMS(具有多发性硬化症的初始触发)研究，IRB方案号1003010940，并且获得自我收集的粪便样本。开始疾病改善治疗。治疗开始后8个月，她保持无症状，随后进行她的第一治疗评估MRI，该治疗评估MRI显示几个新的对比度增强病变(图3)。
在她的第一症状发作后3个月，发现患者73F在她的GI道中具有产气荚膜梭菌B型。PCR分析显示编码α、β和ε毒素的基因的运输(图4A)。这代表第一个已知具有B型的人和第一个被发现具有ETX生成性产气荚膜梭菌的MS患者。为了排除可能的实验室来源的污染物，对实验室(ATCC 3626)和患者来源的产气荚膜梭菌菌株进行溶源性噬菌体足亦分析。在实验室菌株中鉴定了3个溶源性噬菌体插入物，其与已知的全基因组序列匹配(图4B)。患者的菌株含有正好两个溶源性噬菌体插入物，从而确认患者来源的ETX扩增子不是实验室污染物(图4B)。由于毒素类型C和D的组合也可导致α、β和ε毒素基因的鉴定，因此，对患者来源的ETX基因进行测序，从而确认其来源于B型ETX质粒9。有趣地，在于患者73F中检测到产气荚膜梭菌B型后8个月，重复分析显示她呈阴性，从而突显了产气荚膜梭菌B型定殖的动力学性质。
实施例5
产气荚膜梭菌ε毒素对于CNS中的白质、少突胶质细胞和脑膜的特异性
先前已报导了对CNS血管系统和白质的ETX结合15-17。然而，这些研究缺乏相关对照来证明对这些结构的ETX结构是特异性的，并且报导了明显教导并非ETX可籍以引发MS的病理生理学的发现。这些研究仅显示对白质的ETX结合并且不显示对CNS的髓鞘形成细胞少突胶质细胞的结合。此外，这些研究不教导或表明ETX与MS之间的关系。首先，这些研究显示ETX对小脑神经元的结合，教导ETX非为负责MS病变形成的环境因子(因为小脑神经元在MS中不是细胞靶)的发现。其次，这些研究报导ETX结合CNS和PNS的髓鞘。
通过使用MAL功能丧失突变小鼠，本发明显示所有对CNS血管系统和对白质的ETX结合都被消除，从而提供明确的证据：这些神经解剖部位是毒素的特异性靶。本发明还提供明确的证据：ε毒素既不结合也杀伤小脑神经元(参见，例如，下文中的图18a-18d)，并且ETX不杀伤支持其在MS初生病变形成中的特异性的神经元。本发明进一步确认对CNS髓鞘和周围神经系统(PNS)髓鞘的ETX结合的该发现是真实的。然而，MS被定义为特征独特地在于CNS髓鞘但非PNS髓鞘的参与的疾病。靶向CNS和PNS髓鞘的药剂无疑教导与MS无任何关系。
ETX介导的脱髓鞘的病理生理学机制包括(但不限于)以下关键步骤：GI道或其它身体栖息地中的毒素产生；通过肠或其它身体栖息地中的蛋白酶产生的毒素激活；ETX从肠或其它身体栖息地至血液/血管内隔室的进入；ETX对CNS而不是其它内皮细胞的顶(腔)表面的结合；ETX至CNS实质的进入(在这里其结合并损伤/杀伤少突胶质细胞，从而导致脱髓鞘)。由于ETX不结合PNS的内皮细胞，因此ETX不能进入PNS隔室，从而即使PNS髓鞘结合ETX，所述毒素也从不遭遇PNS髓鞘，因为其不能进入离开PNS的血管内隔室。多发性硬化症影响CNS髓鞘但不影响PNS髓鞘的该惊人的特异性是该疾病的如此独特的特征以至ε对PNS髓鞘的结合几乎将ε排除为疾病的可能病因。一个合理的解释是ε结合CNS而非PNS内皮细胞的顶表面以及血神经屏障，与血脑屏障和血-视网膜屏障不同，对ε不敏感。
因此，当在血流中时，ETX设法进入CNS，并通过首先对CNS内皮细胞的结合和其次因可逆和/或不可逆的内皮细胞损伤而破坏生理屏障功能来起始血脑屏障破坏的过程。实验显示ETX结合脑内皮细胞的腔表面，结合公开的文献，这提供提供了支持ETX靶向血脑屏障的令人信服的证据。将荧光标记的proETX注射进小鼠的尾静脉，并且在用PBS输注后，检查脑内的组织学切片以评估ETX的腔结合。在脑内观察到ETX对内皮细胞的顶(腔)表面的明确的强劲结合(图12)。ETX对CNS微血管系统的结合需要MAL，因为MAL KO小鼠未能显示ETX结合(图12)。MAL KO小鼠未能显示对微血管系统的任何ETX结合的事实确认了野生型动物中的ETX结合的特异性并且提供了MAL是ETX受体的证据。
为了确认CNS中的ETX结合定局限于有髓鞘，荧光标记的ETX被开发来对小鼠脑冷冻切片进行染色。髓鞘通过针对蛋白脂质蛋白质(PLP)的免疫反应性来鉴定。小鼠CNS中的ETX结合显示基本上与CNS髓鞘完全重合(图5和24)。结合先前公开的对脑血管系统的ETX结合和BBB的破坏的报导，ETX对白质的结合呈现了清晰的ETX、BBB破坏与少突胶质细胞/髓鞘损伤之间的机械关联性。为了提供ETX结合对于少突胶质细胞是特异的，从小鼠或大鼠CNS产生原代细胞培养物(参见例如，下文中的图11A-11F)。在混合培养物中，发现ETX结合少突胶质细胞谱系中的细胞但不结合星形胶质细胞或小神经胶质细胞(参见例如，图17，图19A-19B，和图23A-23C)但不结合星形胶质细胞或小神经胶质细胞(参见例如，图21A-21B和图22A-22B)。
此外，还鉴定了CNS脑膜和脑膜内的微血管系统的ETX染色。ε毒素的脑膜结合的意义是已知局灶性脑膜炎症在MS中发生，但起始该过程的机制还不清楚。本工作提供了脑膜炎症的独特且明确的机制，凭借该机制血液中的ETX结合脑膜血管；内皮损伤接着导致ETX外渗进入脑膜组织；ETX结合并损伤/杀伤脑膜细胞；受损的脑膜细胞释放良好描述的危险相关分子模式(DAMPS)，从而通过宿主的模式识别受体的激活导致继发性炎症反应。此外，ETX通过脑膜血管的外渗提供了已挑战先前的机械解释的软膜下皮质MS病变的机制。
为了确定ε-毒素在CNS中特异性结合的细胞，将混合神经胶质细胞生长在培养基中以促进少突胶质细胞成熟，并用缀合有Alexaflour-594的原毒素(proETX-594)进行探测。在原毒素与活性ε-毒素结合之间未观察到差异27。通过ε-毒素与细胞特定标志物的共定位来确定对特定神经胶质细胞群体的结合(参见例如，图11A-11F；图16；图17以及图19A-19B至图23A-23C)。ε-毒素不与星形胶质细胞标志物GFAP或小神经胶细胞标志物CD68共定位(参见例如，图11A和11B；图17；和图21A；22A；和23A)。可在一些Olig2阳性细胞周围看到结合的ε-毒素，并且该毒素与少突胶质细胞标志物MAG、MBP和PLP共定位(参见例如，图11C-11F；图20)。这表明ε-毒素只结合混合原代培养物中的少突胶质细胞谱系的细胞。
因为只观察到ε-毒素结合少突胶质细胞，因此确定ε-毒素是否可杀伤混合神经胶质细胞培养物中的少突胶质细胞。用O1抗体对活细胞进行染色，以鉴定少突胶质细胞，并用活性ε-毒素处理1和4小时(参见例如，图19A-19B)。通过碘化丙啶(PI)包含来估计细胞活力。当与未处理的对照相比较时，ε-毒素处理显著增加死亡的O1+细胞的百分比。在1小时的处理后，当用用10nM、50nM和100nM的ε毒素处理时，分别有18.1％、35.1％、41.8％和45.7％的O1+细胞死亡。未处理的对照仅展现7.0％的死亡细胞。对于5nM和10nM的ε-毒素处理，将处理时间从1小时增加至4小时也显著地增加死亡O1+细胞的百分比；分别为11.1％至26.5％和18.1％至29.9％。ε-毒素依赖性少突胶质细胞死亡是剂量和时间依赖性的。
为了确保ε-毒素特异性杀伤少突胶质细胞，用ε毒素处理星形胶质细胞、小神经胶质细胞和少突胶质细胞的富集的培养物。富集的星形胶质细胞培养物主要呈GFAP阳性，具有一些污染性CD68阳性小神经胶细胞细胞和少突胶质细胞碎片(参见例如，图21A-21B；22A-22B；和23A-23C)。用5nM、10nM和50nMε-毒素处理富集的星形胶质细胞24小时，并通过PI染色估计细胞活力。在未处理的对照与ε-毒素处理的星形胶质细胞之间未观察到差异(参见例如，图21A-21B；22A-22B；和23A-23C)。富集的小神经胶质细胞培养物展示类似的结果(参见例如，图21A-21B)。富集的培养物主要呈CD68阳性(参见例如，图22A-22B)并且相较于未处理的对照在24小时的ε-毒素处理后未展示细胞死亡的显著增加(参见例如，图21A，22A和23A)。为了获得富集的少突胶质细胞培养物，从混合培养物分离OPC，并将其生长在少突胶质细胞分化培养基中。富集的少突胶质细胞培养物主要呈MPB阳性，具体少量GFAP和CD68阳性污染性细胞(参见例如，图21A，22A以及23A和23B)。大部分MBP阳性细胞也结合proETX-594(参见图23B)。用O1对活的富集的少突胶质细胞培养物进行染色，并用50nMε-毒素处理1小时和6小时。通过PI染色估计细胞死亡。在1小时的处理后，相较于未处理的对照，ε-毒素显著增加PI阳性O1细胞的百分比，分别为48.2％对25.9％(参见图23C)。在6小时的ε-毒素处理后，相较于阳性对照的仅25.6％，58％的O1+细胞呈PI阳性(图图23C)。总之，这表明ε-毒素特且快速地杀伤少突胶质细胞，并且ε-毒素介导的细胞死亡依赖于少突胶质细胞的成熟。
尽管新形成的MS病变的特征在于少突胶质细胞的细胞死亡，但OPC似乎未受到损害。为了确定ε-毒素是否结合OPC，对混合原代神经胶质细胞培养物的OPC标志物进行染色，并用ε毒素探测。在体外未观察到ε-毒素与OPC标志物PDGFR的共定位，尽管观察到proETX-594与成熟少突胶质细胞标志物O1的强劲共定位(参见例如，图23B和23C)。使用来自出生后第17天(p17)的幼崽的组织切片的免疫组织化学(IHC)来确认这些结果。尽管存在MPB与ε-毒素的强劲共定位(参见例如，图11E；14a-14b；16；20；21A，22A和23B)，但完全缺乏ε-毒素与OPC标志物NG2的共定位(参见例如，图22A和23A)，这表明ε-毒素只结合成熟少突胶质细胞。
更具体地，图11A-11F举例说明ε-毒素特异性结合CNS中的少突胶质细胞。从p0-6幼崽收获混合鼠神经胶质细胞，并将其在促进少突胶质细胞分化的培养基中培养10天。将细胞在4％PFA中固定，随后用对于不同神经胶质细胞群体是特异的抗体染色，所述抗体包括针对星形胶质细胞的GFAP(A)、针对小神经胶细胞的CD68(B)、针对所有少突胶质细胞谱系的Olig2(C)和MAG(D)、MPB(E)，以及针对成熟少突胶质细胞的PLP(F)。为了确定ε-毒素结合的特异性，用缀合有Alexaflour 598的ε-原毒素(proETX)探测细胞。用DAPI显现细胞核。
为了证明ETX特异性靶向CNS中的少突胶质细胞，用荧光标记的pro-ETX探测混合胶质培养物。混合胶质神经细胞培养物含有少突胶质细胞、少突胶质细胞的祖细胞、星形胶质细胞、小胶质神经细胞、脑膜细胞和罕见的其它细胞类型。发现荧光标记的pro-ETX只标记少突胶质细胞，从而显示其对于该细胞类型的特异性。从p0-6幼崽收获混合鼠神经胶质细胞，并将其在促进少突胶质细胞分化的培养基中培养10天。将细胞在4％PFA中固定，随后用对于不同神经胶质细胞群体是特异的抗体染色，所述抗体包括针对星形胶质细胞的GFAP(图11A)、针对小神经胶细胞的CD68(图11B)、针对所有少突胶质细胞谱系的Olig2(图11C)和MAG(图11D)、MPB(图11E)，以及针对成熟少突胶质细胞的PLP(图11F)。为了确定ε-毒素结合的特异性，用缀合有Alexaflour 598的ε-原毒素(proETX)探测细胞。用DAPI显现细胞核。
图12举例说明ETX特异性结合CNS内皮细胞的腔表面。MAL KO小鼠中ETX标记的不存在证明了ETX与野生型内皮细胞之间的相互作用的特异性。ETX对CNS内皮细胞的结合提供了ETX进入CNS以靶向少突胶质细胞和髓鞘的机制。
图14A-14D提供ETX暴露导致小脑切片培养物中的MBP表达的浓度和时间依赖性减少。为了确定ETX是否以剂量和时间依赖性方式诱导脱髓鞘，用递增剂量的ETX或用单一浓度的ETX(持续递增的时间)处理完全有髓器官型小脑切片培养物。在两种情况下，存在ETX对诱导脱髓鞘的明确的浓度和时间依赖性作用。使用Image J通过MPB免疫荧光估量髓鞘含量以进行定量。图14A和14B提供针对暴露于PBS(媒介物对照)或指定剂量的ETX 20小时的切片的MBP-免疫染色(绿色)的代表性图像(a)和定量(b)。图14C和14D提供针对在指定的时间点用5nM ETX处理的切片的MBP-免疫染色(绿色)的代表性图像(c)和定量(d)。进行DAPI(蓝色)复染以鉴定所有细胞的细胞核。针对DAPI的荧光强度的MBP免疫荧光强度的定量(b，d)显示ETX不影响总细胞存活率但相反地侵害表达MBP的细胞。在至少3个独立的实验中获得相似的结果。比例尺代表500μm。
图15举例说明MAL缺失使得小脑切片抗ETX-诱导的MBP减少。为了确定MAL是否是ETX对诱导脱髓鞘的作用所需要的，从野生型(Mal+/+)和MAL KO(Mal-/-)小鼠产生完全具有髓小脑切片。虽然野生型小鼠对于ETX处理显示几乎完全脱髓鞘，但MAL KO小鼠相反地完全抗ETX的作用。这些结果支持两个重要发现。第一，MAL是ETX的作用所需要的；和第二，ETX是即使在高浓度下也不引发非特异性细胞损伤的高度特异性毒素。
图16举例说明失活的pro-ETX-Alexa 594缀合物选择性结合小脑切片上的MBP-阳性细胞。为了验证ETX只结合少突胶质细胞，用缀合荧光的ETX对小脑切片培养物以及对其的MBP进行染色。随机选择的具有低MBP-免疫染色(绿色)密度的视野显示pro-ETX(红色)与MBP-阳性细胞/结构共定位，这表明ETX选择性结合MBP-生成性成熟少突胶质细胞。大部分细胞(通过DAPI复染鉴定的，蓝色)对于MBP免疫染色和pro-ETX结合呈阴性。注意，pro-ETX标记与MBP染色不完全重合，从而表明ETX靶向与MBP表达的位置至少部分不同的亚细胞位置。比例尺代表100μm。
图17举例说明GFAP表达在暴露于更高剂量的ETX刺激的小脑切片中被适度上调，作为对ETX-诱导的对少突胶质细胞的作用的二次应答。为了验证ETX对于少突胶质细胞和髓鞘的特异性，针对暴露于PBS(媒介物对照)或指定剂量的ETX 20小时的切片的针对环核苷酸磷酸二脂酶(少突胶质细胞标志物，绿色)和GFAP(星形胶质细胞标志物，红色)的免疫染色的代表性图像(顶行)和定量(右底图框)。进行DAPI(蓝色)复染以鉴定细胞核。以更高的放大倍数(左底图框)显示低放大倍数图像中加框的区域(第三行)以举例说明在各自条件下的免疫染色细节。与GFAP只在更高浓度(50nM)下增相反，对环核苷酸磷酸二脂酶和GFAP免疫荧光强度的定量显示环核苷酸磷酸二脂酶响应ETX的浓度依赖性减少。这表明星形胶质细胞不直接参与介导ETX对少突胶质细胞的作用。
图18A-18D表明ETX暴露对小脑切片中的神经元和小神经胶质细胞没有作用。为了进一步验证ETX对于CNS中的少突胶质细胞和髓鞘的特异性，在小脑切片中估量ETX对神经元和小神经胶质细胞的作用。通过使用Image J来定量免疫荧光图像，未观察到ETX对神经元或小神经胶质细胞数目的影响。图18A和18B提供针对暴露于PBS(媒介物对照)或10nMETX 20小时的切片的NeuN-免疫染色(绿色)的代表性图像(左图框)和定量(右图框)。插图(顶行)以更高的放大倍数显示对应条件下低放大倍数中的加框区域，以举例说明NeuN(一种神经元标志物)的细胞核染色模式。图18C和18D提供针对在指定的时间点暴露于PBS(媒介物对照)或5nM ETX的切片的CD68-免疫染色(绿色)的代表性图像(顶行)和定量(底图框)。(c)中底行以更高的放大倍数显示低放大倍数(顶行)中加框的区域，以举例说明CD68(一种小神经胶细胞标志物)的免疫染色模式。进行DAPI(蓝色)复染以鉴定细胞核。
图19A-19B举例说明ε-毒素杀伤少突胶质细胞。图19A显示通过活O1染色鉴定生长在促进少突胶质细胞成熟的培养基中的混合原代神经胶质细胞培养物。图19B提供利用A2B5和O1抗体(在左侧)染色的活的混合原代神经胶质培养物的典型显微照片。用100nM的ε-毒素处理培养物4小时，并利用PI包含估计细胞活力。在1小时的ε-毒素100nM处理后死亡A2B5+细胞和O1+细胞的百分比的定量呈现于右侧。
图20举例说明小脑切片中的Olig2-阳性细胞呈MBP阳性。为了证明小脑切片外植体中的大部分olig2-阳性细胞也标记髓鞘标志物MBP，用对于olig2(红色)和MBP(绿色)是特异的抗体双标记小脑切片。如显微照片中显示的，绝大部分olig2阳性细胞也呈MBP阳性(图20)。
图21A-21B举例说明ε-毒素不杀伤富集的星形胶质细胞。从混合原代神经胶质细胞培养物富集小神经胶质细胞。图21A显示通过用针对星形胶质细胞标志物GFAP、小神经胶质细胞标志物CD68和少突胶质细胞标志物MBP的抗体对固定的细胞染色来测定培养物的纯化，图21B显示用指定剂量的ε-毒素处理富集的星形胶质细胞24小时。通过PI包含估计细胞活力。
图22A-22B举例说明ε-毒素不杀伤富集的小神经胶质细胞。从混合原代神经胶质细胞培养物富集小神经胶质细胞。图22A显示通过用针对星形胶质细胞标志物GFAP、小神经胶质细胞标志物CD68、OPC标志物NG2和少突胶质细胞标志物MBP的抗体对固定的细胞染色来测定培养物的纯化，图22B显示用荧光标记的外源凝集素BSL1对活的小神经胶质细胞染色，并用指定剂量的ε-毒素处理24小时。通过PI包含估计细胞活力。24小时的处理后的典型显微照片呈现于右侧。
图23A-23C举例说明ε-毒素杀伤富集的少突胶质细胞。为了估计富集的少突胶质细胞培养物的纯度，对细胞的星形胶质细胞标志物GFAP、小神经胶质细胞标志物CD6和OPC标志物NG2进行染色(参见图23A)。对富集的少突胶质细胞的MBP和proETX-594进行染色(参见图23B)。利用O1抗体染色的活的少突胶质细胞培养物的典型显微照片呈现于右侧(参见图23C)。利用100nMε-毒素处理细胞，并通过PI包含估计细胞活力。在ε-毒素处理1小时和6小时后死亡的O1阳性细胞的百分比的定量呈现于左侧。通过将PI阳性O1+细胞的数目除以O1细胞的总数来计算死亡细胞的百分比。
实施例6
ε毒素受体的鉴定
推断ETX受体必须由在BBB内皮细胞和少突胶质细胞(因此这些细胞是已知的ETX靶)中表达的基因编码而非由在CNS外的内皮细胞中表达的基因编码；进行在BBB内皮细胞中而非在肝和肺内皮细胞中表达的基因的数据搜索。此外，还对在少突胶质细胞中相对于神经元和星形胶质细胞富集的基因进行搜索。对于两种搜索是共同的是19个注释的基因。在这些基因中，MAL是最吸引人的候选者，因为其组织分布平行于ETX的已知靶。MAL是因其在髓鞘和淋巴细胞中的已知表达而命名的四跨膜整合膜蛋白42。稳定的表达MAL的CHO细胞显示显著的对ETX的敏感性(图6)。与亲代CHO细胞系一样，表达GFP的CHO对照不赋予ETX敏感性。类似地，如图7中显示的(使用当细胞活着时发荧光的PrestoBlue测定的分析)，CHOEGFP-MAL细胞而非CHOEGFP细胞以剂量依赖性方式对ETX敏感。这进一步支持MAL表达对于ETX介导的细胞死亡是足够的，以及ETX活性遵照常规药理学模式。
通过在FACS研究中使用荧光标记的ETX(ETXAlexa-647)，对于具有和不具有MAL受体的CHO细胞，发现，如图8中显示的，ETXAlexa-647只结合于具有MAL受体的CHO细胞。
在野生型和MAL敲除(KO)小鼠进行先导性毒性研究，并且发现单次50ng IP剂量的活性ETX导致野生型但非MAL KO小型的快速神经功能缺损。
为了确定MAL是否是ETX对诱导脱髓鞘的作用所需要的，从野生型(Mal+/+)和MALKO(Mal-/-)小鼠产生完全有髓小脑切片。图19显示对髓鞘的ETX结合需要MAL。对通过胼胝体的成年小鼠大脑的冷冻冠状切片的蛋白脂质蛋白(PLP，绿色)和Alexa 594-EXT(红色)进行染色。只在野生型小鼠中观察到强ETX染色与白质中的PLP-阳性重叠。不存在MAL(MALKO)的小鼠不显示任何ETX-594染色。虽然对于ETX处理野生型显示几乎完全的脱髓鞘，但MAL KO小鼠相反地完全抗ETX的作用。这些结果支持两个重要概念：第一，MAL是ETX的作用所需要的；和第二，ETX是即使在高浓度下也不引起非特异性细胞损伤的高度特异的毒素。
此外，图24A举例说明MAL是对CNS白质的ε-毒素结合所必需的。对野生型小鼠(顶图框)的脑切片的PLP(髓鞘标志物)和ε毒素-594进行染色。合并的图像显示几乎完全的重合。对MAL敲除小鼠(底图框)的脑切片的PLP而非对ε毒素-594进行染色。图24B举例说明MAL是对视网膜血管的ε-毒素结合所必需的。野生型小鼠的视网膜血管对BSL(泛内皮细胞微血管系统标志物)、ε毒素-594和DAPI染色呈阳性。MAL敲除小鼠的视网膜血管对BSL和DAPI染色呈阳性，但对于ε毒素-594不能染色。此外，图24C举例说明MAL是对角膜的ε-毒素结合所必需的。野生型小鼠的角膜鳞状上皮对BSL外源凝集素、ε毒素-594和DAPI染色呈阳性。MAL敲除小鼠的角膜对BSL外源凝集素和DAPI染色呈阳性，但对ε毒素-594不能染色。此外，图24D举例说明MAL是对肾小管的ε-毒素结合所必需的。野生型小鼠的肾组织切片对志贺毒素-488(绿色)、ε毒素-594(红色)和DAPI(蓝色)染色呈阳性。MAL敲除小鼠的肾组织切片对志贺毒素-488和DAPI染色呈阳性，但对ε毒素-594结合呈阴性。
实施例7
筛选MAL受体的抑制剂
由于已通过一系列功能获得和丧失实验(如实施例2中描述的)将髓鞘和淋巴细胞MAL蛋白鉴定为ETX受体，因此通过使用由本发明人开发的稳定的表达MAL的CHO细胞，已开了两个针对ε毒性的高通量筛选。第一个利用PrestoBlue，其是灵敏的和特异的，并且具有0.7至0.85的Z’。PrestoBlue是基于刃天青的细胞渗透化合物，在具有代谢活性细胞的还原环境中被转化成具有荧光活性的试卤灵。将细胞在Cellstar 384孔微量板上生长并利用Perkin-Elmer Envision板读数器测量荧光。针对细胞密度和ETX剂量对测定进行最优化，所述测定已被用于筛选药理活性化合物的文库。
第二测定利用碘化丙啶作为细胞死亡的指示剂。将表达EGFP-或EGFP-MAL的细胞培养过夜，随后用ETX处理30分钟至4小时。用碘化丙啶孵育未固定的培养物。在IsoCyte激光扫描细胞计数器上读取板。
实施例8
ETX-抗体抑制混合神经胶质细胞培养物中的原代少突胶质细胞的杀伤
产气荚膜梭菌ε毒素选择性靶向CNS内皮细胞和少突胶质细胞。为了确定ε-毒素是否诱导少突胶质细胞死亡和脱髓鞘是否可被抑制，在毒素处理之前用针对ε-毒素的中和抗体(NAB)处理细胞。在富集的培养物中或在混合CNS培养的环境中产生原代少突胶质细胞。图10A和10B显示中和ε毒素抗体(NAB)防止少突胶质细胞发生细胞死亡。当用单独的ε-毒素处理混合原代神经胶质细胞培养物时，在处理后24小时通过PI染色可见大量细胞死亡。如果用中和抗体(NAB)和ε毒素两者处理细胞，观察到PI染色的显著减少。
用1:100和1:1,000稀释度的NAB处理的细胞完全免受持续24小时的利用10nM或100nMε-毒素的处理的侵害。利用1:10,000稀释度的NAB处理的细胞完全免受10nMε-毒素的侵害并且部分免受100nMε毒素的侵害。使用image J测量平均荧光强度或PI+细胞核的数目来进行定量。利用Image J对荧光强度和细胞数目的测定：将利用安装在Axiskop2荧光显微镜(Carl Zeiss)上的SPOT冷却相机(Diagnostic Instruments)拍摄的单通道/单色图像直接输入ImageJ64(NIH)并将其转化成8位灰色格式。针对作为整体(或目标区域)的图像调整阈值以挑拣待测量的信号。为了进行比较分析，将相同阈值用于从所有实验组获取的所有图像。应用阈值调整以将图像转化成二元图像。为了进行荧光强度分析，对二元图像的平均和积分密度进行自动化测量。为了进行细胞计数，选择分析颗粒功能来自动计数颗粒(细胞、细胞核等)数目，分析颗粒性质(尺寸、形状等)和分布。将测量数据直接输出至Excel(Microsoft)中以进行统计分析。
这些研究表明针对ε-毒素的中和抗体(NAB)足以阻断ε-毒素对少突胶质细胞的细胞毒性作用。少突胶质细胞是CNS中的髓鞘形成细胞，并且是在髓鞘已产生后维持其所必需的。当少突胶质细胞在新形成的MS病变中死亡时，它们不再能够支持和维持髓鞘，从而脱髓鞘发生。ε毒素从而可通过对髓鞘的直接攻击和通过将少突胶质细胞靶向死亡来诱导脱髓鞘。针对ε-毒素的NAB的使用将从而提供防止少突胶质细胞死亡和阻止脱髓鞘的方法。可向患者直接施用NAB，或可通过接种程序来诱导它们。在任一情况下，都提供使少突胶质细胞免受损伤和脱髓鞘的保护作用。
实施例9
中和抗体对器官型小脑切片中的ETX-诱导的少突胶质细胞死亡和脱髓鞘的阻断
新的MS病变显示少突胶质细胞死亡、因产生和维持髓鞘节间的少突胶质细胞的损失而导致的继发性脱髓鞘的证据，但神经元、星形胶质细胞或小神经胶细胞损伤/死亡不存在。测试ETX是否适合新的MS病变的特定表型的最有效方式是测试ETX在CNS的复杂组织微环境的背景中的作用。为了实现该目的，产生器官型小脑切片培养物。小脑切片培养物的有利方面是复杂组织的细胞构造得以完全维持，因为细胞关系未被组织破坏瓦解。此外，器官型培养物允许不可用于完整动物工作的高度定量方法法。最后，器官型培养物使作为所有IACUC和美国国立卫生研究院的授权的脊椎动物的使用减少至最少。因此，如先前所述从出生后第8天(P8)的小鼠产生小脑切片培养物，并在4周后用Ε或PBS处理培养物。由于构建MS的初生病变模型是有趣的，因此用毒素处理培养物仅20小时，随后针对olig2和环核苷酸磷酸二酯酶评估少突胶质细胞，和针对MBP和MAG评估髓鞘。在对照培养物中，存在许多olig2阳性细胞以及利用MBP和MAG染色检测的广泛髓鞘形成。在50pM的剂量上进行正好20小时，保持MBP染色的olig2阳性细胞的数目急剧减少。通过利用递增的剂量，存在olig2阳性细胞的更大减少，并且在最高剂量上，也存在髓鞘染色的减少。MAL少突胶质细胞的胞体、致密髓鞘和结侧区中表达。低剂量的Ε足以引起少突胶质细胞死亡，髓鞘构造保持数天，随后髓鞘因逆死性而退化。在E的高剂量上，毒素杀伤少突胶质细胞，而且还结合髓鞘并在其中形成孔，从而导致更快速的渗透裂解。对前一种情况(髓鞘得以保持的少突胶质细胞死亡)建模。
图13A和13B举例说明针对ETX的中和抗体(4D7和5B7)在小脑切片中阻断ETX-诱导的MBP减少。在培养中维持小脑切片4周，从而导致强健有髓外植体。在ETX-中和抗体不存在或存在的情况下将Ε毒素(ETX)添加至外植体，进行指定的时间。对于中和抗体的两个克隆，存在针对ε毒素对脱髓鞘的作用的强劲阻滞，如利用MBP染色指示的。图13A提供针对暴露于PBS(媒介物对照，第一栏)或5nM ETX(第2-4栏)20小时的切片的MBP-免疫染色(绿色)的代表性图像(顶行)和定量(底图框)。ETX-中和单克隆抗体4D7被省略(第1和2栏)或在指定的时间点：ETX处理前2小时(第3栏)和与ETX处理同时(第4栏)被添加至切片培养物中。进行DAPI(复染)以鉴定细胞核。对于每一个条件，n＝5-6个切片，针对各自的对照(100％)标准化的；***p<0.001，双尾t-检验。在3个独立的实验中获得相似的结果。比例尺代表500μm。图13B提供针对暴露于PBS(媒介物对照，第一栏)或5nM ETX(第2-4栏)20小时的切片的MBP(第1和2行，底图框，绿色)和环核苷酸磷酸二脂酶(第3和4行，右底图框，绿色)的代表性图像(顶行)和定量(底图框)。ETX-中和单克隆抗体5B7被省略(第1和2栏)或在指定的时间点：ETX处理前2小时(第3栏)和与ETX处理同时(第4栏)被添加至切片培养物中。进行DAPI(复染)以鉴定细胞核。对于每一个条件，n＝5-6个切片，针对各自的对照(100％)标准化的；***p<0.001，双尾t-检验。在2个独立的实验中获得相似的结果。比例尺代表500μm。
实施例10
针对ε毒素的抗体保护小鼠
为了确定针对ε-毒素的中和抗体是否能够预防神经残疾，通过尾静脉注射给小鼠施用毒素和抗体。用100微升针对ETX的中和抗体注射小鼠#1，10分钟后注射10ng/g的ETX。在小鼠1接受给药的同时用10ng/g的单独的ETX注射小鼠#2。在ETX施用后10分钟获取视频。ETX剂量：10ng/g的小鼠或约5nM(基于血液体积)；抗体剂量：100微升的抗体(1:20的稀释度)。随后观察动物的神经缺损。观察到小鼠#1是活跃的，能够正常走动，并且显示正常的笼探查。相反地，小鼠#2是不运动的，具有显著的运动和小脑缺损，并且不探查笼子。该实验表明针对ε-毒素的中和抗体足以在动物中防止ε-毒素的神经病学后果。在临床上，可直接施用NAB或可通过接种在宿主中产生NAB。
实施例11
针对ETX和/或产气荚膜梭菌B和D型细菌菌株的疫苗
针对ETX的接种被设计来：阻止ETX对其细胞受体的结合；阻止受体单体缔合成寡聚体，从而阻止孔形成；封闭孔本身；或以任何方式抑制ETX的细胞毒性作用。疫苗的免疫原组分来源于完整ETX蛋白，具有一个或多个定点氨基酸突变的ETX蛋白，或一个或多个来自所述蛋白的多肽。待用于疫苗制备的ETX的突变体形式包括但不限于：突变的重组ETXH106P(组氨酸106被脯氨酸取代)(Oysten等人1998)；突变的重组ETX W190K(Oysten等人1998)；突变的重组ETX H149A(Oysten等人1998)；突变的重组ETX Y29E(Ivie和McClain,2012)；突变的重组ETX Y30E(Ivie和McClain,2012)；突变的重组ETX Y36E(Ivie和McClain,2012)；和突变的重组ETX Y196E(Ivie和McClain,2012)。
将利用具有两个或更多个引用的突变的突变的重组ETX(例如：具有H106P和H149A突变的突变的重组ETX、具有H106P和W190K突变的突变的重组ETX、具有W190K和H149A突变的突变的重组ETX和具有H106P、H149A和W190K突变的突变的重组ETX)。突变的重组ETX蛋白被单独地表达或作为与谷胱甘肽-S-转移酶或被设计来提供蛋白质稳定性和/或快速纯化的另一种序列的融合蛋白来表达。
由于已知产气荚膜梭菌β-毒素在内皮细胞中形成孔，从而当存在时，β-毒素可加重来自ETX的毒血症，针对ETX和β-毒素的接种可以是有用的。将ETX与β-毒素的无毒融合物产生为用于接种的免疫原(Langroudi等人2013)。
在另一个策略中，将抗独特型抗体用于疫苗策略。将用于中和ETX的单克隆或多克隆抗体内的相关独特型区域用于产生抗独特型抗体。抗独特型抗体与导致保护性免疫的ETX的原始免疫原性部分相似，从而被用于疫苗策略以增强针对ETX的免疫而无施用毒素或类毒素的危险。实例包括产生针对mAb A5C12(Percival等人，1990)；mAb 4D7、mAb 5B7(Dev Biol Stand.1999；101:85-94；McClain和Cover 2007)的抗独特型抗体。
接种还可通过用ε毒素内的被鉴定为中和表位的被识别的氨基酸序列进行免疫来实现。这些序列包括但不限于先前描述的ε毒素的氨基酸序列134-145(McClain和Cover2007)。将代表被中和抗体识别的表位的序列本身用作免疫原或缀合于其它肽或蛋白质序列。
ε类毒素是用于接种的常规方法。通过活性ε毒素或原毒素的化学修饰制备类毒素。化学修饰可通过利用福尔马林、甲醛、多聚甲醛的处理或通过其它化学修饰方法来实现。随后在如先前描述的利用类毒素的有效免疫(Uzal,Wong，等人1999；Bentancor等人，2009；Titball,2009；Chandran等人，2010；Uzal等人，1997；Blackwell等人，1983；Mathur等人2010；LoBato等人，2010)后，在宿主中产生中和ε毒素抗体。
实施例12
噬菌体裂解酶用于抵抗产气荚膜梭菌定殖/感染的用途
内裂解酶(Endolysin)是靶向细菌的肽聚糖中的键的噬菌体酶。内裂解酶通常在感染了噬菌体的细菌内产生，并且需要第二蛋白(打孔)以在细菌细胞膜上产生孔，从而允许过量的内裂解酶进入细胞壁。内裂解酶介导的肽聚糖的切割导致细胞壁的破坏，从而杀伤细菌。对于产气荚膜梭菌是特异的内裂解酶已显示抗该生物体的杀细菌作用(Allaart等人，2013)。内裂解酶至MS患者的递送通过直接消化制剂中的保护其免受蛋白水解降解的蛋白质、通过噬菌体或通过口服施用表达内裂解酶的基因工程化益生菌菌株来实现(Allaart等人2013)。所使用的对于产气荚膜梭菌是特异的内裂解酶或相关噬菌体包括但不限于：内裂解酶CP25L(Gervasi等人，2013)；MurNAc-LAA(也称为肽聚糖氨基水解酶、NAMLA酰胺酶、NAMLAA酰胺酶3和肽聚糖酰胺酶；EC 3.5.1.28)和分离的基因PlyCpAmi(Tillman等人，2013)；内裂解酶PF01520(一种N-乙酰胞壁酰-1-丙氨酸酰胺酶(Seal,2013)；由Schmitz等人，2010的图1中注释的基因编码的裂解酶；Acp(Camiade等人，2010)；裂解酶Ply3626(一种肽聚糖水解酶)(Zimmer等人，2002)。产气荚膜梭菌噬菌体株包括但不限于：ΦCPV4、ΦZP2、ΦCP7R(Volozhantsev等人，2012)；Φ3626(Zimmer等人，2002)。
讨论和结论
Kurtzke和Hyllested报导了法罗群岛上的MS流行的详细分析26。在1943年以前，在法罗群岛上无MS病例被记录，鉴于相邻的冰岛、瑞典和丹麦各自报导了高MS年发病率，这是令人印象深刻的不存在。对于法罗人、冰岛人、瑞典人和丹麦人的共同北欧祖先，1943年之前法罗群岛的MS的不存在强有力的表明环境抑制剂的存在。在第二次世界大战期间，与英国军队的到来相一致地，本地法罗人中的4次记录的MS流行中的第一次被报导26-28。由于单倍型在该短时期中无疑是稳定的，因此该信息进一步认为MS必须始于环境触发剂。Kurtzke还确定在英国军队占领后胃肠道感染的一致升高，并且假定触发剂是通过粪口传播传播的病原体29。T.C.G.Murrell指出，在其中绵羊被集中的地区MS的流行程度高，并就ETX或其它绵羊相关病原体可能是引发MS的原因的可能性进行推测13。
假定MS始于环境触发剂，并且最早的病变特征在于BBB破坏和少突胶质细胞凋亡，似乎可能的是，环境触发剂必须靶向这两种细胞/结构。此处提供的数据显示产气荚膜梭菌ETX满足MS疾病引发剂的相关标准。ETX结合BBB的内皮，破坏BBB功能并结合CNS白质15-17。在约10％的具有MS的人中鉴定了针对ETX的免疫反应性。MS中的针对ETX的免疫反应性的该低值可通过处境艰难的哺乳动物一直维持针对ETX的体液免疫来解释22。这些研究还发现具有MS的人不太可能具有产气荚膜梭菌A型(一种被认为在对生态位中的资源竞争中胜过产气荚膜梭菌B型和D型的毒素类型)24。鉴定了一个其中新诊断的患者具有产气荚膜梭菌B型的案例。在测试对于产气荚膜梭菌B型呈阳性后8个月，该患者对于所有产气荚膜梭菌毒素类型回复成阴性，一个芽孢杆菌生长的瞬时性质和/或检测限的实例。在人中鉴定产气荚膜梭菌B型或D型可能是困难的，因为产气荚膜梭菌形成抗标准DNA提取法的内生孢子。此外，所述生物体可以低丰度存在于上GI道中，只有极少数进入使得其可被检测的生长期。
尽管ETX结合周围神经系统(PNS)髓鞘，正如其对CNS髓鞘一样15，放射自显影术研究显示ETX只靶向CNS但不靶向PNS30。ETX似乎不可能结合包含血神经屏障的PNS内皮细胞；从而PNS髓鞘暴露于毒素。此外，ETX对形成血视网膜屏障(BRB)(类似于BBB的CNS屏障)的视网膜静脉的结合可解释具有MS的人中的视网膜静脉周围炎的令人困惑的观察。人视网膜通常不具有髓鞘，然而血管性瘢痕仍然发生31。ETX对BRB的主要作用可导致不依赖于少突胶质细胞或髓鞘的视网膜静脉炎。此外，通常在病理性MS脑样本中观察到在少突胶质细胞凋亡或脱髓鞘不存在的情况下的血清蛋白渗漏和小静脉周围单核细胞的积累。这些观察可类似地归因于内皮微小创伤和继发性先天性免疫反应6。
因此，随同提供的研究将产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)鉴定为多发性硬化症(MS)的主要环境触发剂。总之，初生MS病变的特征在于在适当的免疫浸润不存在的情况下的血脑屏障(BBB)通透性和少突胶质细胞。ETX靶向脑血管系统和少突胶质细胞/髓鞘，初生MS病变的主要特征。在就产气荚膜梭菌运输和对ETX的体液免疫而言得以良好表征的MS患者和健康对照的群体的研究中，发现对ETX的免疫反应性在具有MS的人中的发生率为在健康对照中的10倍，这表明MS群体中先前对ETX的暴露。MS患者和健康对照的胃肠道中的不同产气荚膜梭菌毒素类型的运输的研究显示人共生产气荚膜梭菌A型存在于约50％的健康人对照中(相较于仅23％的MS患者中)。已知不具有编码ETX的质粒的产气荚膜梭菌A型竞争过产气荚膜梭菌B型和D型(产ε毒素的毒素类型)。在处于MS的临床表现(根据脑MRI，活跃地增加病变)的年轻妇女中鉴定了产气荚膜梭菌B型(分泌ε毒素的芽孢杆菌)。这些发现第一次代表已在人中检测到产气荚膜梭菌B型。ε毒素的对于BBB的向性和对少突胶质细胞/髓鞘的结合使其成为MS中的初生病变形成的刺激性候选者，从而显示人微生物群如何可能地通过阻止致病生物的运输影响对MS的易感性。
参考资料
1.Adams RD，K.C.(1952).″The morbid anatomy of the demyelinativedisease.″Am J Med 12(5)：510-546.
2.Barnett，M.H.，A.P.Henderson，et al.(2006).″The macrophage in MS：justa scavenger after all？ Pathology and pathogenesis of the acute MS lesion.″Mult Scler 12(2)：121-132.
3.Barnett，M.H.，J.D.Parratt，et al.(2009).″Immunoglobulins andcomplement in postmortem multiple sclerosis tissue.″Annals of neurology 65(1)：32-46.
4.Barnett，M.H.，J.D.Parratt，et al.(2009).″MS：is it one disease？″Int MS J 16(2)：57-65.
5.Barnett，M.H.and J.W.Prineas(2004).″Relapsing and remitting multiplesclerosis：Pathology of the newly forming lesion.″Annals of Neurology 55(4)：458-468.
6.Prineas，J.W.and J.D.Parratt(2012).″Oligodendrocytes and the earlymultiple sclerosis lesion.″Annals of neurology 72(1)：18-31.
7.Henderson，A.P.D.，M.H.Barnett，et al.(2009).″Multiple sclerosis：Distribution of inflammatory cells in newly forming lesions.″Annals of Neurology 66(6)：739-753.
8.Lassmann，H.(2011).″Review：the architecture of inflammatorydemyelinating lesions：implications for studies on pathogenesis.″Neuropathology and applied neurobiology 37(7)：698-710.
9.Havard，H.L.，S.E.Hunter，et al.(1992).″Comparison of the nucleotidesequence and development of a PCR test for the epsilon toxin gene ofClostridium perfringens type B and type D.″FEMS microbiology letters 76(1-2)：77-81.
10.Meer，R.R.and J.G.Songer(1997).″Multiplex polymerase chain reactionassay for genotyping Clostridium perfringens.″American journal of veterinary research 58(7)：702-705.
11.Popoff，M.R.(2011).″Epsilon toxin：a fascinating pore-formingtoxin.″FEBS Journal 278(23)：4601-15.
12.Murrell，T.G.，L.S.Harbige，et al.(1991).″A review of the aetiologyof multiple sclerosis：an ecological approach.″Ann Hum Biol 18(2)：95-112.
13.Murrell，T.G.，P.J.O′Donoghue，et al.(1986).″A review of the sheep-multiple sclerosis connection.″Med Hypotheses 19(1)：27-39.
14.Bokori-Brown，M.，C.G.Savva，et al.(2011).″Molecular basis oftoxicity of Clostridium perfringens epsilon toxin.″FEBS Journal 278(23)：4589-601.
15.Dorca-Arévalo，J.，A.Soler-Jover，et al.(2008).″Binding of ε-toxinfrom Clostridium perfringens in the nervous system.″Veterinary Microbiology131(1-2)：14-25.
16.Finnie，J.W.(1984).″Histopathological changes in the brain of micegiven Clostridium perfringens type D epsilon toxin.″J Comp Pathol 94(3)：363-370.
17.Finnie，J.W.(1984).″Ultrastructural changes in the brain of micegiven Clostridium perfringens type D epsilon toxin.″J Comp Pathol 94(3)：445-452.
18.Zhu，C.，M.N.Ghabriel，et al.(2001).″Clostridium perfringensprototoxin-induced alteration of endothelial barrier antigen(EBA)immunoreactivity at the blood-brain barrier(BBB)″Experimental neurology 169(1)：72-82.
19.Dawson，J.(1916)The histology of multiple sclerosis.Trans R Soc Edinburgh 50：517-578.
20.Dorca-Arevalo，J.，M.Martin-Satue，et al.(2012).″Characterization ofthe high affinity binding of epsilon toxin from Clostridium perfringens tothe renal system.″Veterinary Microbiology 157(1-2)：179-189.
21.Erickson，J.E.and R.H.Deibel(1978).″New medium for rapid screeningand enumeration of Clostridium perfringens in foods.″Appl Environ Microbiol36(4)：567-571.
22.Blackwell，T.E.，D.G.Butler，et al.(1983).″Enterotoxemia in the goat：the humoral response and local tissue reaction following vaccination with twodifferent bacterin-toxoids.″Canadian journal of comparative medicine.Revue canadienne de medecine comparee 47(2)：127-132.
23.Knapp，O.，E.Maier，et al.(2009).″ldentification of the channel-forming domain of Clostridium perfringens Epsilon-toxin(ETX).″Biochimica et Biophysiea Acta (BBA)-Biomembranes 1788(12)：2584-2593.
24.Itodo，A.E.，A.A.Adesiyun，et al.(1986).″Toxin-types of Clostridiumperfringens strains isolated from sheep，cattle and paddock soils in Nigeria.″Vet Microbiol 12(1)：93-96.
25.Carman，R.J.，S.Sayeed，et al.(2008).″Clostridium perfringens toxingenotypes in the feees of healthy North Americans.″Anaerobe 14(2)：102-108.
26.Kurtzke，J.F.and K.Hyllested(1975).″Multiple sclerosis：an epidemicdisease in the Faeroes.″Transactions of the American Neurological Association100：213-215.
27.Kurtzke，J.F.(1993).″Epidemiologic evidence for multiple sclerosisas an infection.″Clinical microbiology reviews 6(4)：382-427.
28.Kurtzke，J.F.and A.Heltberg(2001).″Multiple sclerosis in the FaroeIslands：an epitome.″Journal of clinical epidemiology 54(1)：1-22.
29.Wallin，M.T.，A.Heltberg，et al.(2010).″Multiple sclerosis in theFaroe Islands.8.Notifiable diseases.″Acta Neurologica Scandinavica 122(2)：102-9.
30.Tamai，E.，T.Ishida，et al.(2003).″Accumulation of Clostridiumperfringens Epsilon-Toxin in the Mouse Kidney and Its Possible BiologicalSignificance.″Infection and Immunity 71(9)：5371-5375.
31.Kerrison，J.B.，T.Flynn，et al.(1994).″Retinal pathologic changes inmultiple sclerosis.″Retina 14(5)：445-451.
32.Schmitz JE，Ossiprandi MC，Rumah KR，Fischetti VA(2011)″Lytic enzymediscovery through multigenomic sequence analysis in Clostridiumperfringens.Appl Microbiol Biotechnol.89(6)：1783-95.
33.McClain MS & Cover TL(2007)“Functional analysis of neutalizingantibodies against Clostridum perfringens epsilon-toxin.”Infect Immun 75(4)：1785-1793.
34.Hauer PJ & Clough NE(1999).“Development of monoclonal antibodiessuitable for use in antigen quantification potency tests for clostridialveterinary vaccines.Dev.Biol.Stand.101：85-94.
35.Sayeed S，Fernandez-Miyakawa ME et al.(2005)“Epsilon-toxin isrequired for most Clostridium perfringens type D vegetative culturesupernatants to cause lethality in the mouse intravenous injection model.”Infect Immun.73(11)：7413-21.
36.Martin TA，Harrison GM et al(2011)“HAVcR-1 reduces the integrity ofhuman endothelial tight junctions.”Anticancer Res.31(2)：467-73.
37.Ivie SE，McClain MS.(2012)“Identification of Amino Acids Importantfor Binding of Clostridium perfringens Epsilon Toxin to Host Cells and toHAVCR1.”Biochemistry.2012 Sep 12.[Epub ahead of print]
38.Titball RW，Williamson ED et al(2002)“Clostridium perfringensVaccines”US Patent No 6,403,094.
39.Souza AM，Reis JK et al(2010)“Molecular cloning and expression ofepsilon toxin from Clostridium perfringens type D and tests of animalimmunization.Genet Mol Res.18；9(1)：266-76.
40.Ivie SE，Fennessey CM，et al(2011)“Gene-Trap Mutagenesis IdentifiesMammalian Genes Contributing to Intoxication by Clostridium perfringens ε-Toxin”.PLoS ONE 6(3)：e17787.doi：10.1371/journal.pone.0017787
41.Oyston PC，Payne DW，et al.(1998)″Production of a non-toxic site-directed mutant of Clostridium perfringens epsilon-toxin which inducesprotective immunity in mice.″Microbiology.144(Pt 2)：333-41.
42.Schaeren-Wiemers，N.Valenzuela，D.M.Frank，M.& Schwab，M.E.Characterization of a rat gene rMAL，encoding a protein with fourhydrophobic domains in central and peripheral myelin.J Neorsci 15，5753-5764(1995).
43.Allart，et al.(2013)“Predisposing factors and prevention oClostridium perfringens-associated enteritis，”Comparative Immunology， Microbiology and Infectious Diseases，36：449-464.
44.Gervasi et al.(2013)“Expression and delivery of an endolysin tocombat Clostridium perfringens，”Appl.Microbiol.Biotechnol.，DOI 10.1007/s00253-013-5128-y.
45.Seal(2013)“Characterization of bacteriophages virulent forClostridium perfringens and identification of phage lytic enzymes asalternatives to antibiotics for potential control of the bacterium，”Tomorrow’ s Poultry：Sustainability and Safety Symposium，526-533
46.Tillman et al.(2013)“Expression of Clostridium perfringens genome-encoded putative N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase as a potentialantimicrobial to control the bacterium，”Arch Microbiol.，195：675-681.
47.Volozhantsev，et al.(2012)“Molecular characterization of podoviralbacteriophages virulent for Clostridium perfringens and their comparison withmembes of the Picovirinae，”PLoS ONE，7(5)：1-12.
48.Camiade et al.，(2010)“Characterization of Acp，a peptidoglycanhydrolase of Clostridium perfringens with N-acetylglucosaminidase activitythat is implicated in cell separation and stress-induced autolysis，”J.Bacteriol.，192(9)：2373-84.
49.Zimmer et al.(2002)“The murein hydrolase of the bacteriophagephi3626 dual lysis system is active against all tested Clostridiumperfringens strains，”Appl.Environ.Microbiol.，68(11)：5311-7.
以下声明是可在将来的申请中被转化成权利要求的潜在的权利要求。不应当改动以下声明来进行当本临时申请被转化成常规实用程序时可起草的权利要求的解释。
序列表
SEQ ID NO：1-ETX肽的氨基酸序列
SEQ ID NO：2-编码ETC肽的核苷酸序列
SEQ ID NO：3-髓鞘和淋巴细胞蛋白同种型a[智人，NP_002362.1，GI 4505091]
MAPAAATGGS TLPSGFSVFT TLPDLLFIFE FIFGGLVWIL VASSLVPWPL
VQGWVMFVSV FCFVATTTLI ILYIIGAHGG ETSWVTLDAA YHCTAALFYL
SASVLEALAT ITMQDGFTYR HYHENIAAVV FSYIATLLYV VHAVFSLIRW KSS
SEQ ID NO：4-髓鞘和淋巴细胞蛋白同种型b[智人，NP_071885.1，GI 12408665]
SEQ ID NO：5-髓鞘和淋巴细胞蛋白同种型c[智人，NP_071884.1，GI 12408663]
MAPAAATGGS TLPSGFSVFT TLPDLLFIFE FDAAYHCTAA LFYLSASVLE
ALATTTMQDG FTYRHYHENI AAVVFSYIAT LLYVVHAVFS LIRWKSS
SEQ ID NO：6-髓鞘和淋巴细胞蛋白同种型d[智人，NP_071885.1，GI 12408665]
MAPAAATGGS TLPSGFSVFT TLPDLLFIFE FVFSYIATLL YVVHAVFSLI RWKSS
SEQ ID NO：7-HAvR-1蛋白的氨基酸序列[智人，NP_001092884.1]
SEQ ID NO：8 16S rRNA(阳性对照)正向引物
AGAGTTTGATCCTGGCTCA
SEQ ID NO：9反向引物
GGTTACCTTGTTACGACTT
SEQ ID NO：10-α毒素(泛产气荚膜梭菌标志物)正向引物
GCTAATGTTACTGCCGTTGA
SEQ ID NO：11-反向引物
CCTCTGATACATCGTGTAAG
SEQ ID NO：12-β毒素正向引物
GCGAATATGCTGAATCATCTA
SEQ ID NO：13-反向引物
GCAGGAACATTAGTATATCTTC
SEQ ID NO：14-ε毒素正向引物
GCGGTGATATCCATCTATTC
SEQ ID NO：15-反向引物
CCACTTACTTGTCCTACTAAC
SEQ ID NO：16-B1RBB5噬菌体基因的正向引物
AAATGGACAAGAGGGATAAGGAT
SEQ ID NO：17-反向引物
TTTTCATCACAAATACCAGCCTC SEQ ID NO：18-B1RAA6噬菌体基因的正向引物
TTACAATAAAACCACATGAGCTT
SEQ ID NO：19-反向引物
TTTTATTTAACATACTCCGTTTT
SEQ ID NO：20-Q8SBN7噬菌体基因的正向引物
GGGTGTCAAAGAAGATTTTAAAG
SEQ ID NO：21-反向引物
TTCTATCTTGCAACATTATATTT

Claims (9)

1.抑制ε毒素(ETX)结合受体与ETX结合以抑制或阻遏ETX调节的受体信号转导活性的抗体在制备用于预防或治疗需要帮助的人受试者的多发性硬化症(MS)的组合物中的用途，其中所述ETX由产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)B型或D型细菌菌株产生，并且其中所述ETX结合受体是四跨膜整合膜受体MAL或HAVcR-1受体，其中所述组合物包含有效量的所述抗体。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述抗体选自由以下组成的组：单克隆抗体、多克隆抗体和重组抗体。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述抗体是针对ETX或其功能性组分的中和抗体。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述ETX-结合受体在ETX是针对其的配体的血脑屏障(BBB)的内皮细胞上表达。
6.用于检测ETX基因或蛋白质的表达或活性水平，或产气荚膜梭菌(C.perfringens)B型或D型细菌菌株的存在的药剂在制备用于诊断或预后处于发生多发性硬化症(MS)的危险的人受试者的试剂盒中的用途，当所述试剂盒被使用时包括下列步骤：
a)从所述人受试者获得生物样本；
b)使用所述药剂检测ETX基因或蛋白质的表达或活性水平，或产气荚膜梭菌B型或D型细菌菌株在来自所述人受试者的生物样本中的存在，和
c)当相较于非MS受试者的参照水平检测到ETX基因或蛋白质的升高的表达或活性水平或产气荚膜梭菌B型或D型细菌菌株的存在时，诊断所述人受试者处于发生MS的危险。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述生物样本是选自由以下组成的组的生物流体：全血、血浆、血清、泪液、唾液、粘液、脑脊髓液、尿和粪便。
8.对于ETX基因或蛋白质或对于产气荚膜梭菌B型或D型细菌菌株是特异的一种或更多种检测剂在制备用于诊断处于发生多发性硬化症(MS)的危险的人受试者或提供具有多发性硬化症(MS)的人受试者的预后的试剂盒中的用途，所述试剂盒包含：
a)含有所述一种或更多种检测剂的捕获试剂；
b)检测试剂；和
c)说明书，其被设置用来使用所述试剂盒诊断处于发生MS的危险的所述人受试者或当相较于非MS受试者的参照水平检测到ETX基因或蛋白质的升高的表达或活性水平或产气荚膜梭菌B型或D型细菌菌株的存在时，提供具有MS的所述人受试者的预后。
9.抑制ε毒素(ETX)结合受体与ETX结合以抑制或阻遏ETX调节的受体信号转导活性的抗体在制备预防或治疗需要帮助的患者的多发性硬化症(MS)的组合物中的用途，其中所述ETX由产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)B型或D型细菌菌株产生，并且其中所述ETX结合受体是四跨膜整合膜受体MAL或HAVcR-1受体，其中所述组合物包含药学上可接受的赋形剂和有效量的所述抗体。
CN201480013215.5A 2013-02-14 2014-02-14 防止和治疗多发性硬化症的方法 Active CN105050621B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361764836P 2013-02-14 2013-02-14
US61/764,836 2013-02-14
US201361805788P 2013-03-27 2013-03-27
US61/805,788 2013-03-27
PCT/US2014/016522 WO2014127258A2 (en) 2013-02-14 2014-02-14 Methods to protect against and treat multiple sclerosis

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105050621A CN105050621A (zh) 2015-11-11
CN105050621B true CN105050621B (zh) 2018-10-23

Family

ID=51354688

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480013215.5A Active CN105050621B (zh) 2013-02-14 2014-02-14 防止和治疗多发性硬化症的方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US9758573B2 (zh)
EP (1) EP2956171B1 (zh)
JP (1) JP6448554B2 (zh)
CN (1) CN105050621B (zh)
AU (1) AU2014216127B2 (zh)
CA (1) CA2899961C (zh)
WO (1) WO2014127258A2 (zh)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170246259A1 (en) * 2014-09-10 2017-08-31 Georgetown University Compositions and Methods of Using Interleukin-4 Induced Gene 1 (IL-4I1)
TW201718627A (zh) * 2015-06-11 2017-06-01 梅茲製藥有限兩合公司 重組梭菌神經毒素及其使用與形成方法、包括其之醫藥組合物及對應其之前驅物、編碼前驅物之核酸序列及其獲得方法與前驅物之形成方法、載體與包括核酸序列之重組宿主細胞
EP3109257B1 (en) * 2015-06-26 2021-01-06 Prindex S.r.l. Diagnosis and therapy of multiple sclerosis
WO2017070589A1 (en) * 2015-10-22 2017-04-27 Duke University Methods and compositions for the diagnosis and treatment of central nervous system autoimmune diseases
JP2019507118A (ja) 2016-03-02 2019-03-14 メルツ ファルマ ゲーエムベーハー ウント コンパニー カーゲーアーアー ボツリヌス毒素を含む組成物
CN106148548B (zh) * 2016-08-31 2019-12-06 青海省畜牧兽医科学院 一种能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和b型诺维氏梭菌的多重pcr检测试剂盒及其应用
EP3642222A1 (en) 2017-06-20 2020-04-29 Merz Pharma GmbH & Co. KGaA Novel recombinant botulinum toxin with increased duration of effect
WO2019007509A1 (en) 2017-07-06 2019-01-10 Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa NOVEL RECOMBINANT BOTULINUM NEUROTOXINS WITH INCREASED DURATION
US20200405836A1 (en) * 2018-03-02 2020-12-31 One Health Ventures Ltd Epsilon toxin from clostridium perfringens as a vaccine
GB201803387D0 (en) * 2018-03-02 2018-04-18 One Health Ventures Ltd Disease detection
KR102337954B1 (ko) * 2018-08-16 2021-12-10 차의과학대학교 산학협력단 뇌졸중 치료용 조성물 및 이를 스크리닝하는 방법
CN113881607A (zh) * 2021-11-17 2022-01-04 宜兴市天石饲料有限公司 一种防治禽产气荚膜梭菌的研发方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1192693A (zh) * 1995-07-05 1998-09-09 奥拉托尔有限公司 自身免疫疾病的治疗剂
US6869600B1 (en) * 1999-04-08 2005-03-22 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Combined treatment of multiple sclerosis
CN101653599A (zh) * 2006-10-20 2010-02-24 比奥根艾迪克Ma公司 利用可溶性淋巴毒素β受体的脱髓鞘病的治疗

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9605222D0 (en) 1996-03-12 1996-05-15 Secr Defence Clostridium perfringens epsilon toxin vaccines
US7740861B2 (en) * 2004-06-16 2010-06-22 University Of Massachusetts Drug delivery product and methods

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1192693A (zh) * 1995-07-05 1998-09-09 奥拉托尔有限公司 自身免疫疾病的治疗剂
US6869600B1 (en) * 1999-04-08 2005-03-22 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Combined treatment of multiple sclerosis
CN101653599A (zh) * 2006-10-20 2010-02-24 比奥根艾迪克Ma公司 利用可溶性淋巴毒素β受体的脱髓鞘病的治疗

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Development of a cell culture assay for the quantitative determination of vaccination-induced antibodies in rabbit sera against Clostridium perfringens epsilon toxin and Clostridium novyi alpha toxin;E. Borrmann等;《Veterinary Microbiology》;20061231;第114卷;第2.1-2.7部分 *
D型产气荚膜梭菌ξ毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究;王光华等;《中国畜牧兽医》;20121231;第39卷(第3期);第36页左栏第1段至第38页1.5.7部分 *
SDS—PAGE法检测产气荚膜梭茵毒素型研究;于晓霞等;《西北农林科技大学学报(自然科学版)》;20071231;第35卷(第12期);第30-36页 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20160017022A1 (en) 2016-01-21
JP2016511763A (ja) 2016-04-21
CA2899961C (en) 2022-08-09
CA2899961A1 (en) 2014-08-21
EP2956171A2 (en) 2015-12-23
US9758573B2 (en) 2017-09-12
AU2014216127A1 (en) 2015-08-20
WO2014127258A2 (en) 2014-08-21
AU2014216127B2 (en) 2018-07-12
EP2956171A4 (en) 2016-07-20
JP6448554B2 (ja) 2019-01-09
CN105050621A (zh) 2015-11-11
EP2956171B1 (en) 2020-11-25
WO2014127258A3 (en) 2014-10-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105050621B (zh) 防止和治疗多发性硬化症的方法
CN101928343B (zh) 针对clfa蛋白质的单克隆抗体和在治疗或预防感染中的利用方法
CN103917559B (zh) 艰难梭菌抗体
CN108350067A (zh) 抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体及其用途
CN109071645A (zh) 抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体及其使用方法
CN109553681A (zh) 金黄色葡萄球菌表面决定簇的抗体
CN104072614A (zh) 抗-αvβ6 抗体及其用途
CN103380145A (zh) 人类抗-sod1抗体
CN103396491A (zh) 针对人抗苗勒激素ii型受体的单克隆抗体及其制备方法和应用
KR102405278B1 (ko) Alk7 결합 단백질 및 이들의 용도
CN105025926B (zh) 针对艰难梭菌的抗体
CN109069620A (zh) 拮抗剂ccr7受体的人源化抗体
CN106046158A (zh) 针对人前列腺素e2 受体ep4 的抗体
CN101675158A (zh) 癌性疾病调节抗体
CN103429260A (zh) 用于治疗神经疾病的人抗体及其诊断和治疗用途
CA3041325A1 (en) Use of beta-catenin as a biomarker for treating cancers using anti-dkk-1 antibody
KR20220128332A (ko) Lilrb2에 대항하는 단일-도메인 항체
CN104797597B (zh) 针对胞壁肽的单克隆抗体
CN101547936A (zh) 癌性疾病调节抗体
JP2007014267A (ja) Ｂ型肝炎ウイルスのＨＢｓ抗原に対するモノクローナル抗体、それに関連する遺伝子およびペプチド、並びにＢ型肝炎ウイルスの検定方法、Ｂ型肝炎の診断方法、治療方法
CN110300761A (zh) 抗pcna单克隆抗体及其用途
US9845350B2 (en) Monoclonal antibodies that react with the capsule of bacillus anthracis
CA3137403A1 (en) Netrin g1 and netrin g1 ligand peptides and antibodies and uses thereof
EA046196B1 (ru) Однодоменные антитела, направленные против lilrb2
CN103492419B (zh) 可中和狂犬病病毒的结合分子

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant