JP2014529610A - クロストリジウム・ディフィシレ抗体 - Google Patents

Abstract

【解決手段】 被験者におけるクロストリジウム・ディフィシレ感染を治療または予防する組成物および方法が提供される。前記組成物はクロストリジウム・ディフィシレ毒素Ａに対する抗体を有する。前記方法は、クロストリジウム・ディフィシレ菌感染の再発を減少または撲滅または予防するために効果的な量で被験者に前記抗体を投与する工程を提供する。【選択図】 図１

Description

関連出願書類の相互参照
本出願書類は２０１１年８月２２日出願の米国仮出願第６１／５２６，０３１号の優先権を請求するものであり、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、抗クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ａモノクローナル抗体に関する。本発明はさらに、被験脊椎動物における前記クロストリジウム・ディフィシレ菌感染を治療または予防する組成物および方法に関する。感染の再発を減少、撲滅、または予防するために効果的な量で被験脊椎動物に抗体を投与する方法が提供される。生物におけるクロストリジウム・ディフィシレ感染を治療または予防する方法が提供される。

クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ディフィシレ）は一般的な院内病原菌であり、世界中で入院患者の罹患および死亡の主な原因となっている。Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｗ Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３３０：２５７−６２， １９９４．広域スペクトル抗生物質の使用が増加し、異常に伝染力の強いＣ．ディフィシレ株が出現したことで、この細菌による疾患および死亡を減少させるためにはワクチンが適しているという考えが生まれた。Ｃ．ディフィシレは、従来の抗生物質の選択肢が少なく、再発性疾患を引き起こすことが多い（症例の２５％）。Ｃ．ディフィシレは米国だけで年間約２０，０００例の命を奪っており、確認されたＣ．ディフィシレが原因の感染症は約５００，０００例である。最近では、Ｂ１／ＮＡＢ１／０２７株など、多くの毒素を産生するさらに伝染力の強いＣ．ディフィシレ株が出現し、メトロニダゾールに対する感受性も低下している。Ｃ．ディフィシレが大発生し、病棟および病院の一部が閉鎖を余儀なくされた。高齢人口が増加し、人口動態が変化したことで、Ｃ．ディフィシレは２１世紀における重大問題となっている。Ｃ．ディフィシレ疾患の範囲は、無症候性キャリアから軽度の下痢、また劇症型偽膜性大腸炎にまで及ぶ。

Ｃ．ディフィシレは二形性の生活環を有しており、そのために感染体および固い胞子の形状、また代謝的に活性な毒素産生栄養細胞のいずれとしても存在する。Ｃ．ディフィシレ関連疾患（ＣＤＡＤ）は、前記栄養細胞、より具体的には、エンドトキシン毒素Ａおよびサイトトキシン毒素Ｂの２つの毒素の作用により引き起こされると考えられている。Ｃ．ディフィシレのワクチンおよび治療では、今日まで、前記毒素（ＡおよびＢ）、ＡおよびＢのトキソイド、ＡおよびＢの組み換え型フラグメント、栄養細胞表層タンパク質（ＳＬＰＡ）に焦点を当ててきた。

毒素Ａは、複数の機能ドメインを有する分子量の大きなタンパク質である。前記毒素は４つの機能ドメイン、つまり、上皮細胞の細胞骨格調節不全を引き起こすＲｈｏ様ＧＴＰアーゼを修飾するアミノ末端グルコシルトランスフェラーゼ、自己触媒システインプロテアーゼドメイン、疎水性膜貫通配列、および非常に繰り返しの多いカルボキシ末端宿主細胞結合ドメインに分解される。前記カルボキシ末端ドメインは、前記毒素を腸上皮細胞上の宿主細胞糖鎖受容体に固定し、これが内部移行プロセスを開始することで、アミノ末端酵素ドメインを標的細胞の細胞質に送達する。酵素ドメインが送達され、グルコシルトランスフェラーゼの活性により、毒素が入った細胞がアポトーシス細胞死を起こすために、下痢および炎症が引き起こされる。

多くの研究で、疾患の転帰に影響を与えるという点で、抗体が毒素に対して重要であることが示されてきた。研究からは、血清抗毒素Ａ抗体とＣＤＡＤおよび再発の予防との関連性も示されている。これらの研究から、ＣＤＡＤを対象とした毒素ｍＡｂ療法が作られた。

このような進歩にもかかわらず、ＣＤＡＤの再発予防を含め、Ｃ．ディフィシレ関連感染症の効果的な治療および／または予防の必要性は満たされていない。本発明では、このような必要性を満たすため、マウスおよび抗ヒト化毒素Ａ抗体を提供する。

本発明は、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ディフィシレ）毒素Ａに結合する抗体、またはその抗原結合部分を提供する。前記抗体またはその抗原結合部分は、Ｃ．ディフィシレ毒素Ａのフラグメント４に結合することができる。

１つの実施形態では、本発明が重鎖領域と軽鎖領域を有する単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供し、前記重鎖領域は、それぞれ、配列ＩＤ番号２９、３０、および３１で示されるアミノ酸配列に約８０％〜約１００％相同的なアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲｓ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の３つを含み、前記軽鎖領域は、それぞれ、配列ＩＤ番号２１、２２、および２３で示されるアミノ酸配列に約８０％〜約１００％相同的なアミノ酸配列を含むＣＤＲｓのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の３つを含む。

Ｃ．ディフィシレ毒素Ａに結合し、重鎖領域を有する単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分も提供され、前記重鎖領域は、それぞれ、配列ＩＤ番号２９、３０、および３１で示されるアミノ酸配列に約８０％〜約１００％相同的なアミノ酸配列を含むＣＤＲｓのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の３つを含む。

本発明はさらに、Ｃ．ディフィシレ毒素Ａに結合し、軽鎖領域を有する単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分も提供し、前記軽鎖領域は、それぞれ、配列ＩＤ番号２１、２２、および２３で示されるアミノ酸配列に約８０％〜約１００％相同的なアミノ酸配列を含むＣＤＲｓのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の３つを含む。

前記抗体またはその抗原結合部分は、約１×１０^−１１Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）を有すると考えられる。前記抗体またはその抗原結合部分は、ヒト化されているか、またはキメラである可能性がある。

１つの実施形態では、前記抗体またはその抗原結合部分の重鎖領域が配列ＩＤ番号８９で示されるアミノ酸配列に約８０％〜約１００％相同的なアミノ酸配列を含み、前記抗体またはその抗原結合部分の軽鎖領域が配列ＩＤ番号９１で示されるアミノ酸配列に約８０％〜約１００％相同的なアミノ酸配列を含む。

別の実施形態では、前記抗体またはその抗原結合部分の重鎖領域が配列ＩＤ番号９３で示されるアミノ酸配列に約８０％〜約１００％相同的なアミノ酸配列を含み、前記抗体またはその抗原結合部分の軽鎖領域が配列ＩＤ番号９５で示されるアミノ酸配列に約８０％〜約１００％相同的なアミノ酸配列を含む。

前記抗体またはその抗原結合部分は、（ａ）免疫グロブリン分子全体、（ｂ）ｓｃＦｖ、（ｃ）Ｆａｂフラグメント、（ｄ）Ｆ（ａｂ’）２、および（ｅ）ジスルフィド結合Ｆｖである可能性がある。

前記抗体またはその抗原結合部分は、（ａ）ＩｇＧ定常領域、および（ｂ）ＩｇＡ定常領域から成る群から選択される少なくとも１つの定常領域を有する可能性がある。

本発明の１つの実施形態では、Ｃ．ディフィシレ毒素Ａに結合し、重鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分も提供され、前記重鎖可変領域は、配列ＩＤ番号１２、２８、４４、または６０で示されるアミノ酸配列に約８０％〜約１００％相同的なアミノ酸配列を含む。

本発明の別の実施形態では、Ｃ．ディフィシレ毒素Ａに結合し、軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分も提供され、前記軽鎖可変領域は、配列ＩＤ番号４、２０、３６、または５２で示されるアミノ酸配列に約８０％〜約１００％相同的なアミノ酸配列を含む。

本発明のさらに別の実施形態では、単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分も提供され、前記抗体、またはその抗原結合部分は、それぞれ配列ＩＤ番号２８および２０で示されるアミノ酸配列に約８０％〜約１００％相同的なアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体によって認識されるＣ．ディフィシレ毒素Ａの同じエピトープに結合する。

ＣＡＮ２０Ｇ２で指定されるハイブリドーマおよびＣＡＮ２０Ｇ２で指定されるハイブリドーマによって産生される抗体も本発明に含まれる。

本発明は、単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供し、ｉｎ ｖｉｖｏ毒素Ａ負荷実験では、前記抗体、またはその抗原結合部分を哺乳類に約１００ｎｇ以上のＣ．ディフィシレ毒素Ａを投与する約２４時間前に、約８ｍｇ／ｋｇ体重〜約１３ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で、前記哺乳類に投与する場合、前記哺乳類の生存確率は約７日以内で約８０％以上となる。

単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分も本発明に含まれ、前記抗体、またはその抗原結合部分は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ中和アッセイにおいて、約４μＭ〜約１７μＭの範囲の濃度で、約１５０ｎｇ／ｍｌのＣ．ディフィシレ毒素Ａの約４０％以上を中和する。

本発明は、配列ＩＤ番号：１２、２８、４４、６０、４、２０、３６、または５２で示されるアミノ酸配列に約８０％〜約１００％相同的なアミノ酸配列を含むペプチドをコードする単離核酸を提供する。本発明は、配列ＩＤ番号：６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、または７５で示される核酸配列に約８０％〜約１００％相同的な核酸配列を含む単離核酸も提供する。上記核酸のいずれかを有する細胞も提供される。前記細胞は、細菌性細胞、または哺乳類細胞などの真核細胞とすることができる。前記細胞の限定されない例には、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ Ｇ２、ＳＰ２／０、ＨｅＬａ、骨髄腫、またはリンパ腫細胞を含む。

本発明は、前記抗体またはその抗原結合部分を有する組成物、および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を提供する。

本発明は、被験者に有効量の前記抗体またはその抗原結合部分を投与する工程を有する、Ｃ．ディフィシレ関連疾患を予防または治療する方法を提供する。前記抗体またはその抗原結合部分は、静脈内、皮下、筋肉内、または経皮投与することができる。前記方法は、前記被験者に第２の薬物を投与する別の工程を含むこともある。例えば、前記第２の薬物は異なる抗体またはそのフラグメントとすることができ、または、バンコマイシン、メトロニダゾール、またはフィダキソマイシンなどの抗生物質とすることもできる。

図１は、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ａに対する精製マウスｍＡｂｓの反応性を示した標準的なＥＬＩＳＡを示している。 図２は、毒素Ａ（ＴｏｘＡ）および毒素Ａフラグメント４（ＴｏｘＡＦ４）に対する精製した１μｇ／ｍｌのＣＡＮ１９ ｍＡｂｓの結合活性を示したＥＬＩＳＡである。ＴｏｘＢは毒素Ｂ、ＴｏｘＢＦ４は毒素Ｂフラグメント４である。 図３は、毒素Ａおよび毒素Ａフラグメント４に対する精製した１μｇ／ｍｌのマウスＣＡＮ１９ ｍＡｂｓの結合活性を示したＥＬＩＳＡアッセイである。 図４は、精製したマウスＣＡＮ１９ ｍＡｂｓ（０．５μｇ／ｍｌ）のウエスタンイムノブロットを示している。レーン１：毒素Ａ、レーン２：トキソイドＡ、レーン４：毒素Ａフラグメント４、レーン５：毒素Ｂ、レーン７：毒素Ｂフラグメント４、レーン８：ＰｉｌＦ（ネガティブコントロール）予想サイズ：毒素Ａ（３０８ｋＤａ）、毒素Ａフラグメント４（１１４ｋＤａ）、毒素Ｂ（２８０ｋＤａ）。 図５は、精製したＣＡＮ２０クローン（１μｇ／ｍｌ）のウエスタンブロットを示している。ブロットＡはＣＡＮ２０Ｇ１をプローブとし、ブロットＢはＣＡＮ２０Ｇ２をプローブとし、ブロットＣはＣＡＮ２０Ｇ５をプローブとし、ブロットＤはＣａｎ２０Ｇ８をプローブとした。（レーン１：毒素Ａ（３０８ｋＤａ）、レーン２：毒素Ａフラグメント４（１１４ｋＤａ）、レーン３：毒素Ｂ（２８０ｋＤａ）、レーン４：破傷風トキソイド）。 図６ａは、ＳＡ（ストレプトアビジン）バイオセンサーに結合するビオチン化ＣＡＮ２０Ｇ１抗体を示したエピトープビニングのグラフである。結合した抗体は、次に遊離毒素Ａおよび遊離ＣＡＮ２０Ｇ１とインキュベートしている。前記ＣＡＮ２０Ｇ１−毒素Ａ複合体は、遊離抗体と一緒に再インキュベートしている。波長（ｎｍ）が大きくシフトしたことは、前記分析対象物が結合したことを示し、ＣＡＮ２０Ｇ１と前記遊離抗体が異なるエピトープを有していることを示している。１，ＳＡバイオセンサーに対するビオチン化ＣＡＮ２０Ｇ１。２，ＣＡＮ２０Ｇ１と複合体を形成する遊離全毒素Ａ。３，ビオチン化ＣＡＮ２０Ｇ１−毒素Ａ複合体と結合した遊離ＣＡＮ２０Ｇ１。４，結合サンプルの曲線。５，解離段階。

図６ｂは全プログラムの最初の３段階（３〜５）を示したグラフである。波長（ｎｍ）が大きくシフトしたことは、前記分析対象物が結合したことを示し、ＣＡＮ２０Ｇ１と前記遊離抗体が異なるエピトープを有していることを示している。この場合、ＣＤＡ１のみ（対照として用いたＭｅｒｃｋ抗毒素Ａ ｍＡｂ）で波長（ｎｍ）が有意にシフトし、ＣＤＡ１は異なるエピトープに結合しているが、ＣＡＮ２０Ｇ１、Ｇ２、Ｇ５、およびＧ８はＣＡＮ２０Ｇ１と同じエピトープビンに結合することを証明している。
図７は、Ｃ．ディフィシレ毒素Ａがマウスの生存に及ぼす作用および前記毒素Ａの負荷に対する前記ＣＡＮ１９ ｍＡｂの効果を示した棒グラフである。 図８は、Ｃ．ディフィシレ毒素Ａがマウスの生存に及ぼす作用および毒素Ａの負荷に対するＣＡＮ１９およびＣＡＮ２０ ｍＡｂｓの効果を示した棒グラフである。 図９は、Ｃ．ディフィシレ毒素Ａがマウスの生存に及ぼす作用および毒素Ａの負荷に対するマウスＣＡＮ２０Ｇ２ ｍＡｂの全量および半量での効果を示した棒グラフである。 図１０は、ＲＮＡからのＶ遺伝子の増幅に用いるプライマーを示している。縮重塩基の記号は、縮重ヌクレオチド配列パターンを示すＩＵＰＡＣ（国際純正応用化学連合）のコードである。 図１１は、ｍｕＣＡＮ２０Ｇ２親クローンのＶＨおよびＶＬ配列をいずれも含む、ｍｕＣＡＮ２０Ｇ２のＶ遺伝子配列決定の結果を示している。 図１２は、最も近いヒト生殖系列のｖ領域とｍｕＣＡＮ２０Ｇ２のｖ領域の配列アラインメントを示している。ヒト生殖系列はヒト化の受容体フレームワークとして用いた。 図１３ａおよび１３ｂは、ＣＤＲ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２のデザインを示している。最も近いマッチしたヒトフレームワークはＩＧＨＶ７−４−１＊０２およびＩＧＫＶ１−３９＊０１である。ｍｕＣＡＮ２０Ｇ２のＣＤＲｓ（ＩＭＧＴナンバリング）はヒトフレームワークに挿入した。図１３Ａは重鎖可変領域を示しており、核酸配列とアミノ酸配列をいずれも含む。ＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３はＩＧＨＶ７−４−１＊０２のものであり、ＦＲ４はＩＧＨＪ６＊０１のものである。図１３Ｂは軽（κ）鎖可変領域を示しており、核酸配列とアミノ酸配列をいずれも含む。ＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３はＩＧＫＶ１−３９＊０１のものであり、ＦＲ４はＩＧＫＪ４＊０１のものである。 図１４ａおよび１４ｂは、ＨＥ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２のデザインを示している。表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ）および変化したコドンは太字になっている。前記ヌクレオチド配列は翻訳され、正しいフレームを確保した。図１４Ａは重鎖可変領域を示しており、核酸配列とアミノ酸配列をいずれも含む。図１４Ｂは軽（κ）鎖可変領域を示しており、核酸配列とアミノ酸配列をいずれも含む。 図１５は、ＨＥ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２重鎖を示している。表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ）および変化したコドンは太字になっている。ｖ領域をデザイン後、ＩｇＧ１定常領域を追加した。イントロンは削除され、前記ヌクレオチド配列は翻訳され、正しいフレームを確保した。 図１６は、ＨＥ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２のκ鎖を示している。表面再構成および変化したコドンは太字になっている。ｖ領域をデザイン後、κ定常領域を追加した。イントロンは削除され、前記ヌクレオチド配列は翻訳され、正しいフレームを確保した。 図１７は、ＡＶＡ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２κのＶ領域の配列アラインメントを示している。アバスチンκのｖ領域は、ＩＭＧＴドメインのディレクトリとアラインメントし、最も近い生殖系列のｖ領域を同定した。ＩＧＫＶ１Ｄ−３３−０１をＡＶＡ ｍＡｂデザインの受容体フレームワークとして用いた。 図１８はＡＶＡ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２を示している。アバスチンκのｖ領域は、ＩＭＧＴドメインのディレクトリとアラインメントし、最も近い生殖系列のｖ領域を同定した。分析およびデザインを行った後、κ定常領域を加えた。これまで同様、前記定常領域にはイントロンを含む。ＡＶＡ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２の重鎖については、すでにデザインされた表面再構成型のＨＥ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２重鎖を用いた。ＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３はＩＧＫＶ１Ｄ−３３−０１のものであり、ＦＲ４はＩＧＫＪ１−０１のものである。 図１９ａおよび１９ｂはキメラＣＡＮ２０Ｇ２を示している。マウスのＶ領域はヒト定常領域を用いてデザインされた。イントロンは削除され、前記ヌクレオチド配列は翻訳され、正しいフレームを確保した。図１９Ａは重鎖を示しており、核酸配列とアミノ酸配列をいずれも含む。図１４Ｂは軽（κ）鎖を示しており、核酸配列とアミノ酸配列をいずれも含む。 図２０ａは、精製したヒトＣＡＮ２０Ｇ２クローンを１５０ｎｇ／ｍｌで中和したデータを棒グラフとして示している。 図２０ｂは、精製したヒトＣＡＮ２０Ｇ２クローンを２５０ｎｇ／ｍｌで中和したデータを棒グラフとして示している。 図２１ａは、ＥＬＩＳＡを示しており、４５分で発現されたヒトＣａｎ２０Ｇ２ ｍＡｂｓの毒素Ａへの結合について、形質移入の上清をスクリーニングしている。 図２１ｂは、ＥＬＩＳＡを示しており、４５分で発現されたヒトＣａｎ２０Ｇ２ ｍＡｂｓの毒素Ａフラグメント４への結合について、形質移入の上清をスクリーニングしている。 図２１ｃは、ＥＬＩＳＡを示しており、６０分で発現されたヒトＣａｎ２０Ｇ２ ｍＡｂｓの毒素Ａへの結合について、形質移入の上清をスクリーニングしている。 図２１ｄは、ＥＬＩＳＡを示しており、６０分で発現されたヒトＣａｎ２０Ｇ２ ｍＡｂｓの毒素Ａフラグメント４への結合について、形質移入の上清をスクリーニングしている。 図２２は、精製したヒトＣＡＮ２０Ｇ２クローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。 図２３は、精製したヒトＣＡＮ２０Ｇ２クローンのウエスタンブロット解析を示している。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、破傷風トキソイド、毒素Ａ全体、毒素Ａフラグメント、およびＢＳＡを用いて実行した。前記ゲルはニトロセルロース膜に移し、各ヒトＣＡＮ２０Ｇ２ ｍＡｂｓ（１μｇ／ｍｌ）をプローブとした。（レーン１：毒素Ａ、レーン２：毒素Ａフラグメント４、レーン３：破傷風トキソイド、レーン４：ＢＳＡ）。 図２４ａおよび２４ｂは、インキュベーション後５、６、７、および８日の被験抗体ＣＤＲ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２（図２４Ａ）およびＨＥ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２（図２４Ｂ）に対する健常ドナーＴ細胞の増殖反応を示している。対応のない２サンプルのｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて有意であった（ｐ<０．０５）、ＳＩ≧２．００（点線）の増殖反応を陽性とみなした。バーは左から右に、ドナーごとにそれぞれ５日目、６日目、７日目、および８日目を示している。 図２５は、４時点で検出された抗体ＣＤＲ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２（Ｃ００１）およびＨＥ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２（Ｈ００１）に対するＴ細胞増殖反応陽性数を示している。 図２６は、被験抗体ＣＤＲ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２（Ｃ００１）およびＨＥ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２（Ｈ００１）に対する健常ドナーＴ細胞のＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔ反応を示している。ＰＢＭＣｓを用いて、８日間のインキュベーション中、２つの抗体による刺激に反応したＩＬ−２分泌を評価した。対応のない２サンプルのｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて有意であった（ｐ<０．０５）、ＳＩ≧２．００のＴ細胞反応を陽性とみなした。境界域の反応（ＳＩ≧１．９０としてｐ<０．０５で有意）が示されている（＊）。 図２７は、０．０５ｍｇ／マウスの低用量で検討したＨＥ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２（「ＨＥ−ＣＡＮ２０Ｇ２」）、ＣＤＲ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２（「ＣＤＲ−ＣＡＮ２０Ｇ２」）、およびＣＤＡ１（Ｍｅｒｃｋ／Ｍｅｄａｒｅｘ）抗Ｃ．ディフィシレ毒素Ａ（抗ＴｃｄＡ）ｍＡｂｓの比較を示している。対照動物（ＴｃｄＡ／ＰＢＳ）と比較した生存率（％）として、ｍＡｂｓの有効性を示している。＊統計的に有意かどうかはＦｉｓｈｅｒの直接確率検定を用いた。 図２８は、ＴｃｄＡ負荷後、経時的にＣＤＡ１と比較した生存に対するヒト化ＣＡＮ２０Ｇ２ ｍＡｂｓ、ＨＥ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２、ＣＤＲ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２の効果を示している。Ａｂ（０．０５ｍｇ）またはＰＢＳのみ（対照）を低用量とし、ＴｃｄＡ負荷後の時間について、生存に対するｍＡｂｓの効果を示している。このグラフには、示された時間でのＴｃｄＡ負荷後の各群の動物の生存率を図に示している。 図２９ａおよび２９ｂは、ラットにおけるヒト化抗体ＣＤＲ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２（図２９ａ）およびＨＥ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２（図２９ｂ）のＰＫ研究データを示している。

本発明は、クロストリジウム・ディフィシレ菌感染または保菌の予防または治療を行うための組成物および方法を提供する。前記組成物は、マウスモノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、または前述の抗体いずれかの抗原結合部分を含む、Ｃ．ディフィシレの毒素Ａを認識する抗体（またはその抗原結合部分）を含む。これらの抗体（またはその抗原結合部分）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで毒素Ａを中和する、および／または毒素Ａの哺乳類細胞への結合を阻害することができる。したがって、本抗体またはその抗原結合部分は、Ｃ．ディフィシレ関連疾患（ＣＤＡＤ）を予防または治療する受動免疫法に利用することができる。

１つの実施形態では、本抗体またはその抗原結合部分が、被験者のＣ．ディフィシレ感染性大腸炎、抗生物質関連大腸炎、偽膜性大腸炎（ＰＭＣ）または他の腸疾患を予防および治療する、被験者の下痢を予防または治療する、および／またはＣ．ディフィシレ感染性疾患の再発を治療または予防することの１若しくはそれ以上の効果を提供する。哺乳類に投与する場合、本抗体またはその抗原結合部分は、本抗体またはその抗原結合部分が投与されていない哺乳類が死に至る量で投与された毒素Ａに対して前記哺乳類を保護する。

本抗体またはその抗原結合部分は、本明細書で説明されたハイブリドーマクローンＣＡＮ２０Ｇ２、ＣＡＮ２０Ｇ１、ＣＡＮ２０Ｇ５、ＣＡＮ２０Ｇ８、ＣＡＮ１９Ｇ１、ＣＡＮ１９Ｇ２、またはＣＡＮ１９Ｇ３によって産生される抗体を含む。

ハイブリドーマクローンＣＡＮ２０Ｇ２、ＣＡＮ２０Ｇ１、ＣＡＮ２０Ｇ５、ＣＡＮ２０Ｇ８、ＣＡＮ１９Ｇ１、ＣＡＮ１９Ｇ２、またはＣＡＮ１９Ｇ３によって産生される抗体の抗原結合部分を含む、抗体またはその抗原結合部分も本発明に含まれる。

本明細書で用いるとおり、ＣＡＮ２０Ｇ１、ＣＡＮ２０Ｇ２、ＣＡＮ２０Ｇ５、ＣＡＮ２０Ｇ８、ＣＡＮ１９Ｇ１、ＣＡＮ１９Ｇ２、およびＣＡＮ１９Ｇ３は、ハイブリドーマクローンまたは対応するハイブリドーマクローンにより生成されたモノクローナル抗体を指す。

前記抗体またはその抗原結合部分は、毒素Ａのフラグメント４にあるエピトープ、例えば、毒素Ａのアミノ酸残基１８５３〜２７１０の間にあるエピトープに特異的に結合することができる。Ｂａｂｃｏｃｋ， Ｇ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ７４： ６３３９−６３４７ （２００６）．他の実施形態では、前記抗体またはその抗原結合部分が毒素Ａのフラグメント１（アミノ酸残基１〜６５９）、フラグメント２（アミノ酸残基６６０〜１２５６）、またはフラグメント３（アミノ酸残基１２５７〜１８５２）にあるエピトープに特異的に結合する。他の実施形態では、前記抗体またはその抗原結合部分が毒素Ａのアミノ酸残基１〜６００、４００〜６００、４１５〜５４０、１〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００、９００〜１０００、１１００〜１２００、１２００〜１３００、１３００〜１４００、１４００〜１５００、１５００〜１６００、１６００〜１７００、１８００〜１９００、１９００〜２００、２１００〜２２００または２２００〜２３００、２３００〜２４００、２４００〜２５００、２５００〜２６００、２６００〜２７１０、またはそのすべての間隔、部分、または範囲にあるエピトープに特異的に結合する。

本抗体、またはその抗原結合部分は、これに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ポリクローナル抗体、組み換え型抗体、および前述の抗体の抗原結合部分を含む。抗体の抗原結合部分には、Ｃ．ディフィシレの毒素（例えば、毒素Ａ）に特異的に結合する抗体の一部を含むこともある。

本発明のヒト化抗体は、前記抗体がよりヒトの抗体に近くなり、それでも元の結合力を保持するように、非抗原結合領域（および／または抗原結合領域）のアミノ酸配列が変化した、非ヒト種の抗体である。

ヒト化抗体は、抗原結合に直接関与しない可変領域の配列を、ヒト可変領域の対応する配列と置換することで作成することができる。上記方法には、重鎖または軽鎖の少なくとも１つの可変領域全体またはその一部をコードする核酸配列を単離、操作、または発現させる工程を含む。そのような核酸の原料は当業者に周知であり、例えば、抗毒素Ａ抗体を産生するハイブリドーマから得ることができる。次に、ヒト化抗体、またはそのフラグメントをコードする組み換えＤＮＡは、適切な発現ベクターにクローニングすることができる。

抗体の軽鎖または重鎖可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）と呼ばれる３つの超可変領域で分断されたフレームワーク領域から成る。１つの実施形態では、ヒト化抗体が、非ヒト種のＣＤＲを１つ、２つ、またはすべてと、ヒト免疫グロブリン分子のフレームワーク領域を有する非ヒト種の抗体分子である。

本発明のヒト化抗体は、当該分野で既知の方法により産生することができる。例えば、非ヒト（例えば、マウス）抗体が得られたら、可変領域の配列を決定することができ、ＣＤＲｓおよびフレームワーク残基の位置が決定される。 Ｋａｂａｔ， Ｅ． Ａ．， ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１−３２４２． Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９６：９０１−９１７．軽鎖および重鎖の可変領域は、選択的に、対応する定常領域に結合することができる。ＣＤＲ移植（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ）抗体分子は、ＣＤＲ移植またはＣＤＲ置換により生成することができる。免疫グロブリン鎖の１つ、２つ、またはすべてのＣＤＲｓを置換することができる。例えば、特定抗体のすべてのＣＤＲｓが非ヒト動物の少なくとも一部に由来するか（例えば、表１に示したＣＤＲｓなどのマウス）、ＣＤＲｓの一部のみを置換することもできる。所定の抗原（例えば、Ｃ．ディフィシレの毒素Ａ）に前記抗体を結合させるために必要なＣＤＲｓを維持すればよい。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ． Ｌ．， １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９：１２０２−１２０７． Ｏｉ ｅｔ ａｌ．， １９８６， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ４：２１４． Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ． ５，５８５，０８９； ５，２２５，５３９； ５，６９３，７６１ ａｎｄ ５，６９３，７６２． ＥＰ ５１９５９６． Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｎａｔｕｒｅ， ３２１：５５２−５２５． Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９：１５３４． Ｂｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４１：４０５３−４０６０．

ヒト、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、サル、類人猿、ゴリラ、チンパンジー、アヒル、ガチョウ、ニワトリ、両生類、は虫類などの動物を含む少なくとも１種類の異なる種の配列によって置換された他の領域と、本明細書で開示される１つ、２つ、またはすべてのＣＤＲｓを含む抗体またはその抗原結合部分も本発明に含まれる。

キメラ抗体とは、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。例えば、抗体にはマウスｍＡｂに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域が含まれる可能性がある。キメラ抗体は、組み換えＤＮＡ技術により産生することができる。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ８１：６８５１−６８５５ （１９８４）。例えば、マウス（または他の種）のモノクローナル抗体分子をコードする遺伝子は、制限酵素により消化して、マウスＦｃをコードする領域を除去し、ヒトＦｃの定常領域をコードする遺伝子の相当する部分を弛緩する。キメラ抗体は、マウスＶ領域をコードするＤＮＡを前記ヒト定常領域をコードするＤＮＡに結合する組み換えＤＮＡ技術により作成することもできる。 Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８８， ２４０：１０４１−１０４３． Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ， １９８７ ８４：３４３９−３４４３． Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９８７， １３９：３５２１−３５２６． Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ， １９８７， ８４：２１４−２１８． Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ．， １９８７， ４７：９９９−１００５． Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ， １９８５， ３１４：４４６−４４９． Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．， １９８８， ８０：１５５３−１５５９． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｓ． ＷＯ１９８７００２６７１ ａｎｄ ＷＯ ８６／０１５３３． Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｓ． １８４， １８７； １７１，４９６； １２５，０２３； ａｎｄ １７３，４９４． Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４，８１６，５６７．

前記抗体は全長であるか、または、これに限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’、Ｆｖ、短鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二価ｓｃＦｖ（ｂｉ−ｓｃＦｖ）、三価ｓｃＦｖ（ｔｒｉ−ｓｃＦｖ）、Ｆｄ、ｄＡｂフラグメント（例えば、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３４１：５４４−５４６ （１９８９））、単離ＣＤＲ、二重特異性抗体（ダイアボディ：ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、直鎖抗体、一本鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を含む、抗原結合部分を有する抗体のフラグメントを含む可能性がある。組み換え法により抗体フラグメントを結合することで生成した短鎖抗体、または合成リンカーも本発明に含まれる。 Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８８， ２４２：４２３−４２６． Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８８， ８５：５８７９−５８８３．

本発明の抗体またはその抗原結合部分は、一重特異性、二重特異性、または多重特異性とすることができる。多重特異性または二重特異性抗体またはそのフラグメントは、１つの標的ポリペプチド（例えば、毒素Ａ）の異なるエピトープに対して特異的であるか、または、２つ以上の標的ポリペプチドに対して特異的な抗原結合ドメイン（例えば、毒素Ａおよび毒素Ｂに対して特異的な抗原結合ドメイン、または毒素Ａおよび他のＣ．ディフィシレ抗原に対して特異的な抗原結合ドメイン、または毒素Ａおよび他の細菌またはウイルス種に対して特異的な抗原結合ドメイン）を含む可能性がある。１つの実施形態では、多重特異性抗体またはその抗原結合部分が少なくとも２種類の可変領域を有し、各可変領域は別の抗原または同じ抗原の異なるエピトープに特異的に結合することができる。Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７：６０−６９． Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２２：２３８−２４４．本抗体は別の機能的分子、例えば別のペプチドまたはタンパク質に結合するか、または同時に発現させることができる。例えば、抗体またはそのフラグメントは、第二の結合特異性と二重特異性または多重特異性抗体を生成する別の抗体またはそのフラグメントなどの、１若しくはそれ以上の他の分子に（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合などにより）機能的に結合させることができる。例えば、本発明は二重特異性抗体を含み、１群の免疫グロブリンが毒素Ａに特異的であり、他の群の免疫グロブリンが第二の治療ターゲットに特異的であるか、またはトリプシンインヒビターなどの治療用分子に結合する。

すべての抗体アイソタイプが本発明に含まれ、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、またはＩｇＥを含む。前記抗体またはその抗原結合部分は哺乳類（例えば、マウス、ヒト）の抗体またはその抗原結合部分とすることができる。前記抗体の軽鎖はκまたはλ型とすることができる。

本抗体またはその抗原結合部分のＣＤＲｓは、非ヒトまたはヒト原料由来のものである可能性がある。本抗体またはその抗原結合部分のフレームワークは、ヒト、ヒト化、非ヒト（例えば、ヒトの抗原性を低下させるように修飾したマウスフレームワーク）、または合成フレームワーク（例えば、コンセンサス配列）とすることができる。

１つの実施形態では、本抗体、またはその抗原結合部分が、少なくとも１つの重鎖可変領域および／または少なくとも１つの軽鎖可変領域を含む。前記重鎖可変領域（または軽鎖可変領域）は、３つのＣＤＲｓと４つのフレームワーク領域（ＦＲｓ）を含み、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシ末端に配列されている。 Ｋａｂａｔ， Ｅ． Ａ．， ｅｔ ａｌ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１−３２４２， １９９１． Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１−９１７， １９８７．

本抗体またはその抗原結合部分は毒素Ａに特異的に結合し、解離定数（ＫＤ）は約１０^−７Ｍ未満、約１０^−８Ｍ未満、約１０^−９Ｍ未満、約１０^−１０Ｍ未満、約１０^−１１Ｍ未満、または約１０^−１２Ｍ未満である。

クローンＣＡＮ２０Ｇ１、ＣＡＮ２０Ｇ２、ＣＡＮ２０Ｇ５、ＣＡＮ２０Ｇ８、ＣＡＮ１９Ｇ１、ＣＡＮ１９Ｇ２、またはＣＡＮ１９Ｇ３により産生される抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域に少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％相同的な重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する抗体も毒素Ａに結合することができる。

関連する実施形態では、抗毒素Ａ抗体またはその抗原結合部分が、例えば、ＣＡＮ２０Ｇ１、ＣＡＮ２０Ｇ２、ＣＡＮ２０Ｇ５、ＣＡＮ２０Ｇ８、ＣＡＮ１９Ｇ１、ＣＡＮ１９Ｇ２、またはＣＡＮ１９Ｇ３の可変重鎖および／または可変軽鎖のＣＤＲｓを含む。これらのクローンの重鎖可変領域のＣＤＲｓ、およびこれらのクローンの軽鎖可変領域のＣＤＲｓを表１に示す。

表１では、ＣＤＲｓがＩＭＧＴナンバリングである。Ｈ：重鎖、Ｋ：κ鎖。

特定の実施形態では、前記抗体またはその抗原結合部分に、クローンＣＡＮ２０Ｇ１（配列ＩＤ番号：１２）、ＣＡＮ２０Ｇ２（配列ＩＤ番号：２８）、ＣＡＮ２０Ｇ５（配列ＩＤ番号：４４）、またはＣＡＮ２０Ｇ８（配列ＩＤ番号：６０）により産生される抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列に少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％相同的なアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。

特定の実施形態では、前記抗体またはその抗原結合部分に、クローンＣＡＮ２０Ｇ１（配列ＩＤ番号：４）、ＣＡＮ２０Ｇ２（配列ＩＤ番号：２０）、ＣＡＮ２０Ｇ５（配列ＩＤ番号：３６）、またはＣＡＮ２０Ｇ８（配列ＩＤ番号：５２）により産生される抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列に少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％相同的なアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。

特定の実施形態では、前記抗体またはその抗原結合部分それぞれに、クローンＣＡＮ２０Ｇ１（配列ＩＤ番号：１２）、ＣＡＮ２０Ｇ２（配列ＩＤ番号：２８）、ＣＡＮ２０Ｇ５（配列ＩＤ番号：４４）、またはＣＡＮ２０Ｇ８（配列ＩＤ番号：６０）により産生される抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列に少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％相同的なアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、およびクローンＣＡＮ２０Ｇ１（配列ＩＤ番号：４）、ＣＡＮ２０Ｇ２（配列ＩＤ番号：２０）、ＣＡＮ２０Ｇ５（配列ＩＤ番号：３６）、またはＣＡＮ２０Ｇ８（配列ＩＤ番号：５２）の軽鎖可変領域アミノ酸に少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％相同的なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

様々な実施形態において、前記抗体またはその抗原結合部分は、クローンＣＡＮ２０Ｇ１、ＣＡＮ２０Ｇ２、ＣＡＮ２０Ｇ５、またはＣＡＮ２０Ｇ８により産生される抗体に結合するエピトープと重複するか、またはこれらに少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％相同的なエピトープに特異的に結合し、および／またはクローンＣＡＮ２０Ｇ１、ＣＡＮ２０Ｇ２、ＣＡＮ２０Ｇ５、またはＣＡＮ２０Ｇ８により産生される抗体と、毒素Ａに対する結合で競合する。

前記抗体またはその抗原結合部分の重鎖可変領域は、クローンＣＡＮ２０Ｇ１（配列ＩＤ番号：１３、１４、１５）、ＣＡＮ２０Ｇ２（配列ＩＤ番号：２９、３０、３１）、ＣＡＮ２０Ｇ５（配列ＩＤ番号：４５、４６、４７）、またはＣＡＮ２０Ｇ８（配列ＩＤ番号：６１、６２、６３）により産生される抗体の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）に少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％相同的な１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のＣＤＲｓを有する可能性がある。

前記抗体またはその抗原結合部分の軽鎖可変領域は、クローンＣＡＮ２０Ｇ１（配列ＩＤ番号：５、６、７）、ＣＡＮ２０Ｇ２（配列ＩＤ番号：２１、２２、２３）、ＣＡＮ２０Ｇ５（配列ＩＤ番号：３７、３８、３９）、またはＣＡＮ２０Ｇ８（配列ＩＤ番号：５３、５４、５５）により産生される抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲｓに少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％相同的な１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のＣＤＲｓを有する可能性がある。

前記抗体またはその抗原結合部分の重鎖可変領域は、クローンＣＡＮ２０Ｇ１（配列ＩＤ番号：１３〜１５）、ＣＡＮ２０Ｇ２（配列ＩＤ番号：２９〜３１）、ＣＡＮ２０Ｇ５（配列ＩＤ番号：４５〜４７）、またはＣＡＮ２０Ｇ８（配列ＩＤ番号：６１〜６３）により産生される抗体の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）に少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％相同的な１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のＣＤＲｓを有し、前記抗体またはその抗原結合部分の軽鎖可変領域は、クローンＣＡＮ２０Ｇ１（配列ＩＤ番号：５〜７）、ＣＡＮ２０Ｇ２（配列ＩＤ番号：２１〜２３）、ＣＡＮ２０Ｇ５（配列ＩＤ番号：３７〜３９）、またはＣＡＮ２０Ｇ８（配列ＩＤ番号：５３〜５５）により産生される抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲｓに少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％相同的な１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のＣＤＲｓを有する可能性がある。

前記抗体またはその抗原結合部分の重鎖可変領域は、クローンＣＡＮ２０Ｇ１（配列ＩＤ番号：１３〜１５）、ＣＡＮ２０Ｇ２（配列ＩＤ番号：２９〜３１）、ＣＡＮ２０Ｇ５（配列ＩＤ番号：４５〜４７）、またはＣＡＮ２０Ｇ８（配列ＩＤ番号：６１〜６３）により産生される抗体の重鎖可変領域のＣＤＲｓに少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％相同的な３つのＣＤＲｓを含む可能性がある。

１つの実施形態では、前記抗体またはその抗原結合部分の軽鎖可変領域は、ＣＡＮ２０Ｇ１（配列ＩＤ番号：５〜７）、ＣＡＮ２０Ｇ２（配列ＩＤ番号：２１〜２３）、ＣＡＮ２０Ｇ５（配列ＩＤ番号：３７〜３９）、またはＣＡＮ２０Ｇ８（配列ＩＤ番号：５３〜５５）により産生される抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲｓに少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％相同的な３つのＣＤＲｓを含む。

１つの実施形態では、前記抗体またはその抗原結合部分の重鎖可変領域は、クローンＣＡＮ２０Ｇ１（配列ＩＤ番号：１３〜１５）、ＣＡＮ２０Ｇ２（配列ＩＤ番号：２９〜３１）、ＣＡＮ２０Ｇ５（配列ＩＤ番号：４５〜４７）、またはＣＡＮ２０Ｇ８（配列ＩＤ番号：６１〜６３）により産生される抗体の重鎖可変領域のＣＤＲｓに少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％相同的な３つのＣＤＲｓを含み、前記抗体またはその抗原結合部分の軽鎖可変領域は、クローンＣＡＮ２０Ｇ１（配列ＩＤ番号：５〜７）、ＣＡＮ２０Ｇ２（配列ＩＤ番号：２１〜２３）、ＣＡＮ２０Ｇ５（配列ＩＤ番号：３７〜３９）、またはＣＡＮ２０Ｇ８（配列ＩＤ番号：５３〜５５）により産生される抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲｓに少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％相同的な１つ、２つ、または３つのＣＤＲｓを含む。

特定の実施形態では、前記抗体またはその抗原結合部分の重鎖可変領域がクローンＣＡＮ２０Ｇ１（配列ＩＤ番号：１３〜１５）、ＣＡＮ２０Ｇ２（配列ＩＤ番号：２９〜３１）、ＣＡＮ２０Ｇ５（配列ＩＤ番号：４５〜４７）、またはＣＡＮ２０Ｇ８（配列ＩＤ番号：６１〜６３）により産生された抗体の重鎖可変領域のＣＤＲｓに相同的な３つのＣＤＲｓを含み、前記抗体またはその抗原結合部分の軽鎖可変領域がクローンＣＡＮ２０Ｇ１（配列ＩＤ番号：５〜７）、ＣＡＮ２０Ｇ２（配列ＩＤ番号：２１〜２３）、ＣＡＮ２０Ｇ５（配列ＩＤ番号：３７〜３９）、またはＣＡＮ２０Ｇ８（配列ＩＤ番号：５３〜５５）により産生された抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲｓに相同的な３つのＣＤＲｓを含む。

特定の実施形態では、表１のＣＤＲｓに対応するＣＤＲｓは配列にばらつきを有する。例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８残基、またはＣＤＲの全残基の２０％未満、３０％未満、または約４０％未満が置換または欠失しているＣＤＲｓが、毒素Ａに結合する抗体（またはその抗原結合部分）に存在する可能性がある。

１つの実施形態では、前記抗体またはその抗原結合部分は、クローンＣＡＮ２０Ｇ１（それぞれ、配列ＩＤ番号：４および配列ＩＤ番号：１２）、ＣＡＮ２０Ｇ２（それぞれ、配列ＩＤ番号：２０および配列ＩＤ番号：２８）、ＣＡＮ２０Ｇ５（それぞれ、配列ＩＤ番号：３６および配列ＩＤ番号：４４）、またはＣＡＮ２０Ｇ８（それぞれ、配列ＩＤ番号：５２および配列ＩＤ番号：６０）により産生される抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域に相同的な軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。

前記抗体またはその抗原結合部分はペプチドである。前記ペプチドには、生物活性、例えば抗原結合性を示すペプチドの変異型、アナローグ、オルソログ、ホモログ、および誘導体も含む。前記ペプチドは、１若しくはそれ以上のアミノ酸アナローグ（例えば、天然アミノ酸、天然では関係のない生物系でしか発生しないアミノ酸、哺乳類系の修飾アミノ酸などを含む）、つまり、置換された結合、および当該分野で既知の他の修飾を有するペプチドを含む。

特異的アミノ酸が置換、欠失、または追加された抗体またはその抗原結合部分も本発明の範囲内である。これらの変化は、結合活性などのペプチドの生物学的特性に大きな影響を与えない。例えば、前記抗原への結合を改善するように、抗体が前記フレームワーク領域にアミノ産置換を有していてもよい。別の実施例では、特定、少数の受容体フレームワーク残基を対応する供与体アミノ酸で置換することができる。前記供与体フレームワークは、成熟または生殖系列のヒト抗体フレームワーク配列またはコンセンサス配列である可能性がある。表現型がでない（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ ｓｉｌｅｎｔ）アミノ酸置換を行う方法に関するガイドラインは、Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４７： １３０６−１３１０ （１９９０）． Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４： １０８１−１０８５ （１９８９）． Ａｕｓｕｂｅｌ （ｅｄ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． （１９９４）． Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）． Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４３：３０７−３１ （１９９４）． Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３−４５ （１９９２）で提供されている。

前記抗体、またはその抗原結合部分は、別の機能分子に誘導体化または結合することができる。例えば、抗体は、別の抗体、検出可能な因子、細胞毒性薬、医薬品、別の分子（ストレプトアビジンのコア領域またはポリヒスチジンタグなど）との結合に介在するタンパク質またはペプチド、アミノ酸リンカー、シグナル配列、免疫原性キャリア、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、およびブドウ球菌プロテインＡなどのタンパク質精製に有用なリガンドなど、１若しくはそれ以上の他の分子に、（化学カップリング、遺伝子融合、非共有相互作用などにより）機能的に結合することができる。１種類の誘導体化タンパク質は、（同じ種類または異なる種類の）２若しくはそれ以上のタンパク質を架橋することで生成される。適切な架橋剤には、適切なスペーサー（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）またはホモ二官能性（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）により分かれた２つの異なる反応基を有する、ヘテロ二官能性の架橋剤を含む。そのようなリンカーは、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（イリノイ州ロックフォード）から入手可能である。タンパク質を誘導体化（または標識）することのできる、有用な検出可能試薬には、蛍光化合物、様々な酵素、補欠分子族、発光体、生物発光体、および放射性物質を含む。限定されない典型的な蛍光検出可能試薬には、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、およびフィコエリトリンを含む。タンパク質または抗体も、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出可能な酵素を用いて誘導体化することができる。タンパク質は補欠分子族（例えば、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン）を用いて誘導体化することができる。

本ペプチドは、本明細書で開示される抗体またはその抗原結合部分の機能的に活性な変異体とすることができ、例えば、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、または約１％未満のアミノ酸残基が置換または欠失しているが、これに限定されるものではないが、毒素Ａへの結合性を含め、基本的に同じ免疫学的特性を保持している。

本発明には、Ｃ．ディフィシレの毒素Ａに特異的に結合する本抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸も含まれる。前記核酸は細胞で発現され、本抗体またはその抗原結合部分を産生する。本発明の単離核酸は、配列ＩＤ番号：４、１２、２０、２８、３６、４４、５２、または６０に少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％相同的なペプチドをコードする配列を有する。

前記単離核酸は、配列ＩＤ番号：６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、または７５に少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％相同的な配列を有する。

本発明は、配列ＩＤ番号：４、１２、２０、２８、３６、４４、５２、または６０に少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％相同的なペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターも特色としている。前記発現ベクターは、配列ＩＤ番号：６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、または７５に少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％相同的な核酸配列を含む。

本抗体またはその抗原結合部分の機能的に活性な変異体をコードする核酸分子も本発明に含まれる。これらの核酸分子は、中等度に厳密、高度に厳密、または非常に高度に厳密な条件下、本抗体またはその抗原結合部分のいずれかをコードする核酸とハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーション反応を行うためのガイドラインは、この参照により本明細書に組み込まれるＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ． ６．３．１−６．３．６， １９８９に見ることができる。本明細書に言及されている特定のハイブリダイゼーション条件は、１）中等度に厳密なハイブリダイゼーション条件：約４５℃で６ＸＳＳＣ、続いて６０℃にて０．２ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳで１回若しくはそれ以上洗浄、２）高度に厳密なハイブリダイゼーション条件：約４５℃で６ＸＳＳＣ、続いて６５℃にて０．２ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳで１回若しくはそれ以上洗浄、３）非常に高度に厳密なハイブリダイゼーション条件：６５℃にて０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ ＳＤＳ、続いて６５℃にて０．２ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳで１回若しくはそれ以上洗浄、である。

本抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸は、適切な発現系で発現することのできる発現ベクターに導入後、発現された抗体またはその抗原結合部分を単離または精製する。選択的に、本抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸は、無細胞翻訳系で翻訳することができる。Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４，８１６，５６７． Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ８６：１００２９−１００３３ （１９８９）．

抗毒素抗体またはその一部は、望みの抗体の軽鎖および重鎖（またはその一部）をコードするＤＮＡを用いて形質転換された宿主細胞によって産生することができる。抗体は、標準的な手法を用い、これらの培養上清および／または細胞から単離および精製することができる。例えば、宿主細胞は抗体の軽鎖、重鎖、またはその両方をコードするＤＮＡを用いて形質転換することができる。組み換えＤＮＡ技術を利用し、結合に必要のない軽鎖および重鎖の一方または両方をコードするＤＮＡ、例えば定常領域の一部または全体を削除することもできる。

本核酸は、例えば細菌細胞（例えば、大腸菌）、酵母、植物細胞、昆虫細胞、および哺乳類細胞などの原核および真核細胞を含む、様々な適切な細胞で発現させることができる。当該分野では多数の哺乳類細胞株が知られており、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）より入手可能な不死化細胞株を含む。前記細胞の限定されない例には、これに限定されるものではないが、サル腎細胞（ＣＯＳ、例えば、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７）、ＨＥＫ２９３細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ、例えば、ＢＨＫ２１）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ＢＳＣ−１細胞、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、ＳＰ２／０細胞、ＨｅＬａ細胞、マディン−ダービーウシ腎細胞（ＭＤＢＫ）、骨髄腫細胞、およびリンパ腫細胞の親細胞、誘導体、および／または遺伝子組み換え変異株を含む哺乳類由来または哺乳類様の特徴を持つすべての細胞株を含む。遺伝子組み換え変異株には、例えば、グリカンプロフィールを改変した、および／または部位特異的組込み部位を持つ誘導体を含む。

本発明は、本明細書に説明された核酸を有する細胞も提供する。前記細胞はハイブリドーマまたは形質転換体とすることができる。前記細胞の種類については上述している。

本抗体またはその抗原結合部分は、様々な細胞で発現することができる。前記細胞の種類については上述している。

代わりに、本抗体またはその抗原結合部分は、当該分野で周知の固相合成法により合成することができる。 Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｂｙ Ｅ． Ａｔｈｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｒ． Ｃ． Ｓｈｅｐｐａｒｄ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＲＬ出版（１９８９）． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ３５： Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （ｅｄ． Ｍ． Ｗ．Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｂ． Ｍ． Ｄｕｎｎ）， ｃｈａｐｔｅｒ ７． Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ （１９８４）． Ｇ． Ｂａｒａｎｙ ａｎｄ Ｒ． Ｂ． Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｅｄｉｔｏｒｓ Ｅ． Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｊ． Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ， Ｖｏｌ． １ ａｎｄ Ｖｏｌ． ２， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９８０）， ｐｐ． ３−２５４． Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｋｙ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｅｒｌｉｎ （１９８４）．

本発明には、Ｃ．ディフィシレの毒素Ａに特異的に結合する本抗体またはその抗原結合部分を作成する方法も含まれる。例えば、ヒト以外の動物に不活性化された毒素Ａを含む組成物を用いて免疫性を与え、次に前記動物から特異的抗体を単離する。前記方法はさらに、毒素Ａに対する抗体の結合を評価する工程を含む。

様々なロストリジウム・ディフィシレ毒素タンパク質のすべて、特に毒素Ａは、本発明の実施形態で用いることができる。Ｃ．ディフィシレ疾患には、主に毒素Ａおよび毒素Ｂが介在している。いずれの毒素も細胞毒性があり、マウスに静脈内または腹腔内注射した場合、死に至る。マウスの腸係蹄結紮下痢モデルで体液貯留が誘導されたことから証明されるとおり、毒素Ａの強力なエンテロトキシンである。背景については、例えば、Ｂａｂｃｏｃｋ， Ｇ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ７４： ６３３９−６３４７ （２００６）および本書に含まれる参考文献を参照。

表２は、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ａのアミノ酸配列提供している。以下に示される配列の変異体およびフラグメントも、抗体を作成するための抗原として利用することができる。

表３は、表２のタンパク質をコードする核酸配列を提供する。

１つの実施形態では、本発明がＣ．ディフィシレの毒素Ａに特異的に結合する抗体を発現するハイブリドーマの作成方法を提供する。前記方法には、不活性化毒素Ａ（例えば、トキソイドＡ）を含む組成物により動物に免疫性を与える工程、前記動物から脾細胞を単離する工程、および毒素Ａに特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程を含む。 Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６： ４９５， １９７５． Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ． ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ｄ． Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８８．

毒素は、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ＵＤＰ−ジアルデヒド、ペルオキシド、酸素処理、または（遺伝子組み換え法を用いた）変異により不活性化することができる。Ｒｅｌｙｖｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ９３：２４， １９８３． Ｗｏｏｄｒｏｗ ａｎｄ Ｌｅｖｉｎｅ， ｅｄｓ．， Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９０． Ｇｅｎｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ．， ６８（３）：１０９４−１１０１， ２０００．毒性を低下させた変異型Ｃ．ディフィシレ毒素を遺伝子組み換え法により産生することができる。米国特許第５，０８５，８６２号、第５，２２１，６１８号、第５，２４４，６５７号、第５，３３２，５８３号、第５，３５８，８６８号、および第５，４３３，９４５号明細書。前記毒素またはトキソイドの全長またはフラグメントを免疫原として用いることができる。

１つの実施形態では、不活性化毒素Ａを用い、腹腔内または静脈内からマウスに免疫性を与えている。１回若しくはそれ以上の追加免疫を与えることも、与えないこともある。血漿中の抗体力価は、例えばＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着測定法）またはフローサイトメトリーによりモニターすることができる。抗毒素Ａ抗体の力価が十分なマウスを融合に用いる。マウスを殺処分し、脾臓を摘除する３日前に、抗原で追加免疫を与えることも、与えないこともある。前記マウス脾細胞を単離し、ＰＥＧを用いてマウス骨髄腫細胞株に融合する。次に、抗原特異的抗体を産生するため、得られたハイブリドーマをスクリーニングする。細胞を播種し、選択培地でインキュベートする。次に、個々のウェルの上清のヒト抗毒素モノクローナル抗体をＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。抗体を分泌するハイブリドーマを再度播種し、もう一度スクリーニングし、抗毒素モノクローナル抗体がまだ陽性の場合は、限界希釈法によりサブクローニングすることができる。例えば、本発明のハイブリドーマクローンＣＡＮ２０Ｇ２をサブクローニングした。サブクローンの１つはＣＡＮ２０Ｇ２−２−１である。

クロストリジウム・ディフィシレ毒素抗原の１つ若しくはそれ以上、特に毒素Ａの免疫原性を上昇させるために用いることのできるアジュバントには、ペプチドまたはペプチドの組み合わせに対する免疫反応を亢進するように作用する、すべての化合物を含む。アジュバントの限定されない例には、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＭＦ５９（４．３％ ｗ／ｖスクアレン、０．５％ ｗ／ｖポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０）、０．５％ ｗ／ｖソルビタントリオレアート（Ｓｐａｎ ８５））、ＣｐＧ含有核酸、ＱＳ２１（サポニンアジュバント）、ＭＰＬ（モノホスホリルリピドＡ）、３ＤＭＰＬ（３−Ｏ脱アシル化ＭＰＬ）、Ａｑｕｉｌｌａ抽出物、ＩＳＣＯＭＳ（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ． ６４：７１３； ＷＯ９０／０３１８４； ＷＯ９６／１１７１１； ＷＯ ００／４８６３０； ＷＯ９８／３６７７２； ＷＯ００／４１７２０； ＷＯ０６／１３４４２３およびＷＯ０７／０２６１９０を参照）、ＬＴ／ＣＴ変異体、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）微小粒子、Ｑｕｉｌ Ａ、インターロイキン、フロイントアジュバント、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ １１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと呼ばれる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ｄｉｐ− アルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）、およびＲＩＢＩを含み、ＲＩＢＩには、２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ ８０エマルジョン中、細菌、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコラート、細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）から抽出された３つの成分を含む。

免疫性を与える動物は、これに限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ウマ、サル、ヒヒ、およびヒトなど、免疫原を投与した場合に再生可能な抗体を産生することのできるいかなる動物とすることもできる。１つの態様では、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを発現したマウスなど、宿主が遺伝子組み換え体であり、ヒト抗体を産生する。それぞれの開示がこの参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，２３６，３１１号、第７，６２５，５５９号、および第５，７７０，４２９号明細書。 Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）： ８５６−８５９， １９９４． Ｌｏｎｂｅｒｇ， Ｎ．， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９−１０１， １９９４． Ｌｏｎｂｅｒｇ， Ｎ． ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ， Ｄ．， Ｉｎｔｅｒｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３： ６５−９３， １９９５． Ｈａｒｄｉｎｇ， Ｆ． ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ， Ｎ．， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ７６４：５３６−５４６， １９９５．

前記宿主に免疫性を与え、前記抗体が産生された後、前記抗体を測定し、目的の抗原に特異性があることを確認し、他の抗原と交差反応性を示しているか否かを決定する。そのような測定を行う１つの方法は、米国特許公開第２００４／０１２６８２９号に説明されているとおり、血清スクリーニングアッセイである。抗毒素抗体は、様々な既知の技術により前記毒素に対する結合の特徴を決定することができる。例えば、ＥＬＩＳＡでは、マイクロタイタープレートをＰＢＳ中、前記毒素またはトキソイド抗原でコーティングし、ＰＢＳ中で希釈したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの関係のないタンパク質でブロッキングする。毒素で免疫性を与えたマウスの血漿希釈液を各ウェルに加え、インキュベートする。前記プレートを洗浄し、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）に結合した二次抗体をインキュベートする。洗浄後、前記プレートを酵素基質（例えば、ＡＢＴＳ）を用いて展開し、特定のＯＤで分析した。他の実施形態では、選択したモノクローナル抗体が独特のエピトープに結合するか否かを決定するため、前記抗体をビオチン化することができ、これはストレプトアビジン標識プローブで検出することができる。抗毒素抗体の反応性は、毒素を用いたウエスタンブロット法により検査することができる。

中和アッセイを用い、抗毒素抗体の活性を測定することもできる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏの中和アッセイを用い、抗体が培地中の細胞に対する細胞変性効果を阻害する能力を測定することができる（以下の実施例７および１２を参照）。１つの実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ中和アッセイにおいて、本抗体、またはその抗原結合部分が、約１μＭ〜約５０μＭ、約２μＭ〜約４０μＭ、約３μＭ〜約３０μＭ、約４μＭ〜約２０μＭ、約４μＭ〜約１７μＭ、約５μＭ〜約１５μＭ、または約１０μＭの範囲の濃度で、約１５０ｎｇ／ｍｌのＣ．ディフィシレ毒素Ａの約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、または約９０％以上を中和する。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを利用し、毒素の中和も測定することができる。別の実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏの毒素Ａ負荷実験（例えば、実施例５、６、および７、およびＢａｂｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ Ｔｏｘｉｎｓ Ａ ａｎｄ Ｂ ｐｒｅｖｅｎｔ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｉｎ Ｈａｍｓｔｅｒｓ． Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ （２００６） ７４（１１）：６３３９で説明される方法）において、哺乳類に約１００ｎｇ、または約１００ｎｇ以上のＣ．ディフィシレ毒素Ａに曝露する２４時間前に、抗体、またはその抗原結合部分を約１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約２ｍｇ／ｋｇ体重〜約４０ｍｇ／ｋｇ体重、約３ｍｇ／ｋｇ体重〜約３０ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約８ｍｇ／ｋｇ体重〜約１３ｍｇ／ｋｇ体重、または約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で哺乳類に投与した場合、前記哺乳類が生存する可能性は、約７日以内で約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、または約９０％以上である。

次に、おそらく高い親和性で前記毒素に結合する抗体を産生するハイブリドーマをサブクローニングし、さらに特徴を決定することができる。各ハイブリドーマから（ＥＬＩＳＡにより）前記親細胞の反応性を保持するクローンを１つ選択し、細胞バンクの作成、および抗体の精製に使用することができる。

前記抗毒素抗体を精製するため、培養したハイブリドーマの上清をろ過、濃縮してから、プロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行うことができる。

本開示の抗体、またはその抗原結合フラグメント、変異体、または誘導体は、抗原に対する結合親和性の点で説明または特定することができる。抗原に対する抗体の親和性は、適切な方法を用い、実験的に決定することができる（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，"Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，" Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｐａｕｌ， Ｗ． Ｅ．， Ｅｄ．， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ． （１９８４）； Ｋｕｂｙ， Ｊａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ． （１９９２）； ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｈｅｒｅｉｎを参照）。特定の抗体−抗原相互作用の親和性測定は、異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ）で測定した場合、変化する可能性がある。したがって、親和性および他の抗原結合パラメーター（例えば、Ｋ_Ｄ、Ｋ_ａ、Ｋ_ｄ）の測定は、おそらく、標準化された抗体および抗原溶液、および標準化された緩衝液を用いて行われる。

本抗体またはその抗原結合部分は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの治療、予防、および／または診断に有用性がある。例えば、これらの抗体は、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで培地中の細胞に、または例えばｉｎ ｖｉｖｏで被験者に投与し、Ｃ．ディフィシレおよびＣ．ディフィシレ関連疾患の治療、阻害、再発予防、および／または診断を行うことができる。

例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで培地中の細胞に対し、前記抗体またはその抗原結合部分を用いることができる。例えば、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏの培地中で培養し、抗毒素抗体またはそのフラグメントに接触させることができる。Ｉｎ ｖｉｖｏ（例えば治療用または予防用）プロトコールの一環として、前記方法を被験者内に存在する細胞に対して行うことができる。ｉｎ ｖｉｖｏ実験については、前記接触させる工程を被験者に対して行い、前記抗体、またはその一部の、被験者内、例えば腸内で発現された毒素（例えば、毒素Ａ）に対する結合を引き起こすために有効な条件下、前記被験者に対して抗毒素抗体またはその一部を投与する工程を含む。

前記抗体またはその抗原結合部分は、単独で、または別の治療薬、例えば第２のモノクローナルまたはポリクローナル抗体またはその抗原結合部分と併用して投与することができる。１つの実施例では、前記抗体またはその抗原結合部分がＣ．ディフィシレ毒素Ａに特異的に結合し、抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）またはその抗原結合部分と併用すると、Ｃ．ディフィシレ毒素Ｂに特異的に結合する。別の例では、第２の試薬が抗生物質、例えば、バンコマイシン、バシトラシン、またはメトロニダゾールである。前記抗体は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉなどのプロバイオティクス試薬と併用することができる。前記抗体は、Ｃ．ディフィシレワクチン、例えば、トキソイドワクチンとも併用投与することができる。

本発明では、本明細書で説明する抗体または抗原結合部分を含む組成物、および薬学的に許容される担体も提供する。前記組成物には、本抗体または抗原結合部分をコードする単離核酸、および薬学的に許容される担体を含むことができる。薬学的に許容される担体には、生理学的に適合する溶媒、分散媒、等張剤および吸収遅延剤などのいずれかおよびすべてを含む。１つの実施形態では、前記組成物が、被験者におけるクロストリジウム・ディフィシレ菌感染を減少、排除、または予防するために効果的である。

本発明は、前記被験者にＣ．ディフィシレ疾患を阻害するために効果的な量で本抗体またはその抗原結合部分を投与することで、被験者のＣ．ディフィシレ疾患を治療する方法も特徴としている。本組成物の投与経路には、これに限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、皮下、経口、局部、皮下、皮内、経皮、皮下、非経口、直腸、脊髄、または表皮投与を含む。

本発明の組成物は、液体溶液または懸濁液の注射剤として、または注射前に液体溶媒に溶解または懸濁するのに適した固体形態として調製することができる。前記組成物は、乳化固体形態、または徐放に使用されるリポソーム溶媒または他の粒子担体にカプセル化した活性成分としても調製することができる。例えば、前記組成物は、前記ワクチンを持続的に放出させることのできる、エチレン酢酸ビニルコポリマーおよびＨｙｔｒｅｌ（登録商標）コポリマーなどの非吸収性不浸透性ポリマー、ヒドロゲルなどの膨潤性ポリマー、または吸収性縫合糸の作成に利用されるようなコラーゲンおよび特定のポリ酸またはポリエステルなどの吸収性ポリマーなど、油乳剤、油中水型乳剤、水中油中水型乳剤、部位特異的乳剤、持続性（ｌｏｎｇ−ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ）乳剤、粘着性乳剤（ｓｔｉｃｋｙｅｍｕｌｓｉｏｎ）、マイクロエマルション、ナノエマルション、リポソーム、微小粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、ナノ粒子、および様々な天然または合成ポリマーの形態とすることができる。

本抗体またはその抗原結合部分は、哺乳類被験者に送達するための組成物に製剤化される。前記組成物は、単独で、および／または薬学的に許容される溶媒または賦形剤と混合して投与される。適切な溶媒は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびその組み合わせである。さらに、前記溶媒は湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはアジュバントなどの補助物質を少量含むことができる。本発明の組成物には、薬物、サイトカイン、または他の生物反応調整剤などの補助物質も含むことができる。

さらに、前記組成物は中性または塩の形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩には酸付加塩（活性ポリペプチドの遊離アミノ基を用いて形成）を含み、例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸を用いて形成される。遊離カルボキシル基から形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの無機塩基由来とすることができる。

そのような投与形態を調製する実際の方法は当業者に周知であるか、または今後明らかとなる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ， ２１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎを参照。

組成物は、前記被験者の年齢、体重、および疾患、使用される特定の化合物、および投与経路に適したスケジュールおよび期間で単回または複数回投与することができる。

１つの実施形態では、本発明に従い、前記組成物が単回投与される。他の実施形態では、複数回投与される。投与頻度は、様々な要因、例えば、症状の重症度、望ましい免疫保護の程度、前記組成物を予防または治療目的などで使用するか否かなどによって変化する可能性がある。例えば、１つの実施形態では、本発明に従う前記組成物が月１回、月２回、月３回、隔週（ｑｏｗ）、週１回（ｑｗ）、週２回（ｂｉｗ）、週３回（ｔｉｗ）、週４回、週５回、週６回、隔日（ｑｏｄ）、毎日（ｑｄ）、１日２回（ｑｉｄ）、または１日３回（ｔｉｄ）投与される。

本発明に従うポリペプチドの投与期間、例えば、前記組成物が投与される期間は、例えば被験者の反応など、様々な要因によって変化する可能性がある。例えば、前記組成物は、約１日〜約１週間、約２週間〜約４週間、約１ヵ月〜約２ヵ月、約２ヵ月〜約４ヵ月、約４ヵ月〜約６ヵ月、約６ヵ月〜約８ヵ月、約８ヵ月〜約１年、約１年〜約２年、または約２年〜約４年、またはそれ以上の範囲の期間で投与することができる。

前記組成物は薬学的に許容される担体（賦形剤）と併用し、薬理学的組成物を形成することができる。薬学的に許容できる担体には、本発明の薬学的組成物の吸収またはクリアランス速度を例えば安定化、または増減させるように作用する、薬学的に許容される化合物を含むことができる。生理学的に許容される化合物には、例えば、グルコース、スクロース、またはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸またはグルタチオンなどの抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、洗剤、リポソーム担体、または賦形剤または他の安定剤および／または緩衝剤を含めることができる。他の薬学的に許容される化合物には、湿潤剤、乳化剤、分散剤、または保存剤を含む。例えば、ｔｈｅ ２１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ． （"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ"）を参照。

１つの態様において、前記組成物の溶液は、薬学的に許容される担体、例えば、前記組成物が水溶性の場合は水性担体に溶解される。水溶液の例には、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ハンクス液、リンガー液、デキストロース／食塩水、グルコース溶液などを含む。前記製剤には、緩衝剤、等張化剤、湿潤剤、洗剤などの生理的条件に近づけるために必要な、薬学的に許容される補助物質を含むことができる。添加物には、殺菌剤、または安定剤などの追加活性成分も含むことができる。例えば、前記溶液には酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンラウリン酸モノエステル、またはオレイン酸トリエタノールアミンを含むことができる。

本発明には、固体製剤を利用することができる。これらは、例えば丸剤、錠剤、粉末、またはカプセルなどとして製剤化することができる。固体組成物では、従来の固体担体を使用することができ、例えば、マンニトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを使用できる。適切な医薬品賦形剤には、例えば、でんぷん、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールを含む。

経口投与する場合、本組成物は消化から保護することができる。これは、前記抗体またはその抗原結合部分と酸および酵素加水分解に耐性を与える組成物を錯体化する、またはリポソームなどの適切な耐性を持つ担体に前記抗体またはその抗原結合部分を詰め込むことで達成できる。消化から化合物を保護する方法は、当該分野で周知である。 Ｆｉｘ， Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ． １３： １７６０−１７６４， １９９６． Ｓａｍａｎｅｎ， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４８： １１９−１３５， １９９６． Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，３９１，３７７．
経粘膜または経皮投与については、浸透するバリアに適した浸透剤を前記製剤に使用することができる。そのような浸透剤は当該分野で既知であり、例えば、経粘膜投与、胆汁酸塩、フシジン酸誘導体を含む。加えて、浸透を促すために洗剤を利用することができる。経粘膜投与はスプレー式点鼻薬または坐薬により行うことができる。Ｓａｙａｎｉ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ． １３： ８５−１８４， １９９６．局部の経皮投与については、前記薬物は軟膏剤、クリーム、軟膏、粉末、およびゲルに製剤化される。経皮的送達系には、例えば、パッチを含むことができる。

本組成物は、徐放または持続放出のメカニズムで投与することができる。例えば、ペプチドの持続送達を行うことができる生分解可能なミクロスフェアまたはカプセルまたは他の生分解可能なポリマー形状を、本発明の製剤に含めることができる（例えば、Ｐｕｔｎｅｙ， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６： １５３−１５７， １９９８を参照）。

吸入については、ドライパウダーエアロゾル、液体送達システム、エアジェット噴霧器、噴霧システムなどを含む、当該分野で既知の系を用い、本組成物を送達することができる。Ｐａｔｔｏｎ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １６： １４１−１４３， １９９８．例えば、Ｄｕｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（カリフォルニア州サンディエゴ）、Ａｒａｄｉｇｒｎ（カリフォルニア州ヘイワード）、Ａｅｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州サンタクララ）、Ｉｎｈａｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州サンカルロス）などによるポリペプチド高分子の製剤および吸入送達システムも本発明に使用することができる。例えば、前記薬学的製剤は、エアロゾルまたはミストの形態で投与することができる。エアロゾルの投与については、前記製剤を界面活性剤および噴霧剤とともに微粉化した形態で提供することができる。別の態様では、呼吸組織に前記製剤を送達する装置が吸入器であり、この中で前記製剤は気化する。他の液体送達システムには、例えば、エアジェット噴霧器を含む。

本発明の組成物または核酸、ポリペプチド、または抗体は単独で、または例えば全身的、局部的または局所的など、当該分野で既知のすべての方法、動脈内、くも膜下腔内（ＩＴ）、静脈内（ＩＶ）、非経口、胸膜腔内、局部、経口、または皮下、気管内（例えば、エアロゾル）または経粘膜的（例えば、口腔、膀胱、膣、子宮、直腸、鼻粘膜）などの局所投与により、薬学的組成物として送達することができる。例えば、特定の臓器に焦点を当てる「局所的効果」については、１つの投与方法に、例えば、特定の臓器（脳およびＣＮＳなど）に焦点を当てる動脈内またはくも膜下腔内（ＩＴ）注射を含む（例えば、Ｇｕｒｕｎ， Ａｎｅｓｔｈ Ａｎａｌｇ． ８５： ３１７−３２３， １９９７を参照）。例えば、頸動脈内動脈注射は、本発明の核酸、ペプチド、またはポリペプチドを脳に直接送達することが望ましい場合に利用することができる。非経口投与可能な組成物を調製する実際の方法は、当業者に周知または明らかであり、詳述されている。 Ｂａｉ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ． ８０： ６５−７５， １９９７． Ｗａｒｒｅｎ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｌ． Ｓｃｉ． １５２： ３１−３８， １９９７． Ｔｏｎｅｇａｗａ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６： ５０７−５１５， １９９７．

１つの態様では、本発明の組成物または核酸、ポリペプチド、または抗体を有する薬学的製剤が、脂質単層または二重層、例えばリポソームに取り込まれる。Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ． ６，１１０，４９０； ６，０９６，７１６； ５，２８３，１８５ ａｎｄ ５，２７９，８３３．本発明の態様は、本発明の水溶性核酸、ペプチド、またはポリペプチドが前記単層または二重層の表面に結合した製剤も提供する。例えば、ペプチドはヒドラジド−ＰＥＧ−（ジステアロイルホスファチジル）エタノールアミン含有リポソームに結合することができる（例えば、Ｚａｌｉｐｓｋｙ， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ． ６： ７０５−７０８， １９９５参照）。平面脂質膜または無傷細胞（例えば、赤血球細胞）の細胞膜などのリポソームまたは何らかの形態の脂質膜を利用することができる。リポソーム製剤は、静脈内、経皮（例えば、Ｖｕｔｌａ， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８５： ５−８， １９９６参照）、経粘膜、または経口投与を含む何らかの方法で投与することができる。本発明は、本発明の核酸、ペプチド、および／またはポリペプチドがミセルおよび／またはリポソーム内に取り込まれている薬学的製剤も提供する（例えば、Ｓｕｎｔｒｅｓ， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４６： ２３−２８， １９９４； Ｗｏｏｄｌｅ， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ９： ２６０−２６５， １９９２を参照）。リポソームおよびリポソーム製剤は、標準的な方法に従って調製することができ、当該分野で周知である。Ａｋｉｍａｒｕ， Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． １： １９７−２１０， １９９５． Ａｌｖｉｎｇ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． １４５： ５−３１， １９９５． Ｓｚｏｋａ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｅｎｇ． ９： ４６７， １９８０．米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、および第４，８３７，０２８号明細書。

１つの態様では、前記組成物が、インプラントおよびマイクロカプセル化された送達系を含む放出制御製剤など、前記ペプチドが身体から急速に排泄されないようにする担体を用いて調製される。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ酢酸などの生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製する方法は当業者に明らかとなる。薬学的に許容される担体として、リポソーム懸濁液も使用することができる。米国特許第４，５２２，８１１号明細書。

投与を簡便にし、用量を均一にするため、経口または非経口組成物を投与単位で製剤化することは好都合である。本明細書で使用される「投与単位形態」という用語は、治療を受ける被験者に対する単位用量として適した物理的不連続単位を指し、各単位は、必要な薬学的担体と関連して、望みの治療効果を生じるように計算された所定量の活性物質を含む。

細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトで使用される用量範囲の製剤化に利用することができる。１つの実施形態では、そのような化合物の用量が、ＥＤ_５０を含む血中濃度の範囲内にあり、毒性はほとんどまたは全くない。前記用量は、採用した剤形および利用した投与経路により、この範囲内で変化する可能性がある。別の実施形態では、最初に前記治療有効量を細胞培養アッセイから推定することができる。動物モデルで用量を定め、細胞培養で決定されたＩＣ_５０（つまり、症状の半値抑制を達成する被験化合物の濃度）を含む血中濃度の範囲を達成することができる。 Ｓｏｎｄｅｒｓｔｒｕｐ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｓｅｍ． Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ． ２５： ３５−４５， ２００３． Ｎｉｋｕｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｈａｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ４（１２）： １２３−５３， ２０００．

本発明の抗体または抗原結合部分の治療または予防に有効な量について、典型的な制限のない範囲は、約０．００１〜約６０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１〜約３０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．５〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．７５〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、約２〜約９ｍｇ／ｋｇ体重、約１〜約２ｍｇ／ｋｇ体重、約３〜約８ｍｇ／ｋｇ体重、約４〜約７ｍｇ／ｋｇ体重、約５〜約６ｍｇ／ｋｇ体重、約８〜約１３ｍｇ／ｋｇ体重、約８．３〜約１２．５ｍｇ／ｋｇ体重、約４〜約６ｍｇ／ｋｇ体重、約４．２〜約６．３ｍｇ／ｋｇ体重、約１．６〜約２．５ｍｇ／ｋｇ体重、約２〜約３ｍｇ／ｋｇ体重、または約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。

前記組成物は、有効量の本抗体またはその抗原結合部分を含むように製剤化され、前記有効量は、治療される動物および治療される状態に依存する。１つの実施形態では、本抗体またはその抗原結合部分が約０．０１ｍｇ〜約１０ｇ、約０．１ｍｇ〜約９ｇ、約１ｍｇ〜約８ｇ、約１ｍｇ〜約７ｇ、約５ｍｇ〜約６ｇ、約１０ｍｇ〜約５ｇ、約２０ｍｇ〜約１ｇ、約５０ｍｇ〜約８００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約５００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約１０ｇ、約０．０５μｇ〜約１．５ｍｇ、約１０μｇ〜約１ｍｇタンパク質、約３０μｇ〜約５００μｇ、約４０ｐｇ〜約３００ｐｇ、約０．１μｇ〜約２００ｍｇ、約０．１μｇ〜約５μｇ、約５μｇ〜約１０μｇ、約１０μｇ〜約２５μｇ、約２５μｇ〜約５０μｇ、約５０μｇ〜約１００μｇ、約１００μｇ〜約５００μｇ、約５００μｇ〜約１ｍｇ、約１ｍｇ〜約２ｍｇの範囲の用量で投与される。特定の被験者に対する特定の用量レベルは、特定のペプチドの活性、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、および排泄率、薬物の併用、および治療を行っている特定疾患の重症度など、様々な因子によって変化する。

治療用途では、本組成物がクロストリジウム・ディフィシレ菌感染のリスクがある、または活動性感染に罹患している被験者に対し、前記状態または疾患および／またはその合併症を少なくとも部分的に停止または予防するために十分な量で投与される。

抗毒素抗体（例えば、モノクローナル抗体）を用い、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準的な技術により毒素を単離することができる。さらに、抗毒素抗体は、前記毒素の検出するため、例えば、Ｃ．ディフィシレの有無についてサンプル（例えば糞便サンプル）をスクリーニングするために用いることができる。抗毒素抗体を診断に用い、臨床検査手順の一環として、組織中の前記毒素の量をモニターする、例えば、特定の治療法の有効性を判定することができる。

本発明は、抗毒素抗体またはその抗原結合部分を含むキットも提供する。前記キットの追加要素には、使用説明書、他の試薬、治療薬、または抗体を標識または治療薬にカップリングするために有用な試薬、または前記抗体を投与用に調製するための他の材料、薬学的に許容される担体、および被験者に投与するための装置または他の材料を含むことができる。

様々な組み合わせの抗体を一緒に包装することができる。例えば、キットには、毒素Ａに結合する抗体および毒素Ｂに結合する抗体（例えば、モノクローナル抗毒素Ｂ抗体、または毒素Ｂと反応するポリクローナル抗血清）を含めることができる。前記抗体は一緒に混合するか、または前記キット内で別に包装することができる。

使用説明書には、例えばＣＤＡＤの症状がみられる患者における推奨用量および／または投与方法を含む治療用途での指示を含めることができる。他の指示には、前記抗体の標識または治療薬へのカップリング、または例えば未反応の結合化合物からの結合抗体の精製に関する指示を含めることができる。

前記キットには、抗毒素抗体またはそのフラグメントをコードする少なくとも１つの核酸、および前記核酸の発現に関する指示を含めても含めなくてもよい。前記キットで他に考えられる要素には、発現ベクターおよび細胞が含まれる。

本抗体、その抗原結合部分、組成物、および方法は、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、サル、類人猿、ゴリラ、チンパンジー、ウサギ、アヒル、ガチョウ、ニワトリ、両生類、は虫類、および他の動物を含む、哺乳類および非哺乳類などのすべての脊椎動物で使用することができる。

以下の本発明を実施するための具体的な態様の例は、図示する目的でのみ提供され、いかなる方法でも、本発明の範囲を制限する意図はない。

ハイブリドーマの融合
古典的なハイブリドーマの融合を行った。マウスに完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）を用いたトキソイドＡの初回免疫付与を行い、続いて２８日目および４８日目にトキソイドＡおよび不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）の追加免疫付与を行った。５５日目に試験的に採血を行い、血清を検査し、抗トキソイドＡ抗体の力価を確認した。ＩｇＧ力価が十分高ければ、融合を行った。十分でない場合は、さらに２回ＩＦＡの追加免疫付与を行い、２回目の採血を行った。融合は一度に２匹のマウスを用いて行った。融合の３日前、マウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）にトキソイドＡのＰＢＳ溶液を最終投与した。

融合を行う日にマウスを殺処分し、脾臓を摘出した。シリンジと針を用いて脾細胞を脾臓から洗い出し、５０ｍｌの試験管に回収し、骨髄腫細胞と融合した。骨髄腫は融合パートナーとして用いた不死化腫瘍細胞であり、サルベージ経路を遮断する毒性ヌクレオチド類似体の８−アザグアニン存在下で増殖した。８−アザグアニン存在下で増殖した細胞は、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）遺伝子に欠損変異を発生させることでしか生存することができない。Ｂ細胞は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５００を用いて骨髄腫細胞と融合する。融合した細胞は薬物を選択して半固体アガロースに混合し、ペトリ皿に播種する。ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含むＨＡＴ培地を薬物の選択に用いる。アミノプテリンはＨＧＰＲＴが欠損した骨髄腫細胞株における生存／細胞増殖に確実に必要なヌクレオチド代謝のデノボ経路を阻害する薬物であり、通常は２４〜４８時間以内に選択が可能である。

ハイブリドーマのスクリーニング
次の段階は、増殖しているハイブリドーマのスクリーニングである。三次元基質で細胞の「ボール」として細胞が増殖する、市販の半固体アガロースを使用した。これにより（目視検査により）手でこれらのボールを選別し、これらのクローンボールを適切な培地を含む９６ウェルプレートに移しやすくなる。前記細胞を３〜７日間増殖させた後、スクリーニングを行うため上清を取り除き、調製直後の培地と交換した。ＥＬＩＳＡ（または他の検査）で結合が陽性の場合は、増量してより大きな組織培養容器に移すと、前記ハイブリドーマの増殖が持続した。使用済み上清を用いたマウスｍＡｂｓの適切な市販アイソタイプ判定キットにより、ｍＡｂｓのアイソタイプを判定した。次の選択段階にクローンを移すか否かの決定は、ＥＬＩＳＡおよびその生存を用い、天然型毒素Ａに対する反応性を基に行い、通常は少なくとも１／８または１／１６以上の段階希釈および反応性、およびＩｇＧクラスを基にしているため、前記選択手順の間、クローン数が減少する。さらに特徴決定を行ったｍＡｂｓは、ＣＡＮ２０Ｇ２、ＣＡＮ２０Ｇ１、ＣＡＮ２０Ｇ５およびＣＡＮ２０Ｇ８およびＣＡＮ１９Ｇ１、ＣＡＮ１９Ｇ２、ＣＡＮ１９Ｇ３であった。

マウスモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡアッセイ
毒素Ａ全体および組み換え型毒素Ａフラグメント４に対するｔｏｘＡ ｍＡｂｓの結合を検討するため、また毒素Ｂ全体および毒素Ｂフラグメント４に対して交差反応するか否かを判定するため、ＥＬＩＳＡを利用した。ｍＡｂクローンをＣＤＡ１と比較した（Ｍｅｒｃｋの抗毒素Ａ ｍＡｂを対照として用いた）。ＥＬＩＳＡプレートを１００μｇ／ｍｌの毒素フラグメント４および４００μｇ／ｍｌの毒素全体でコーティングし、前記コーティングが等モルになるようにした。前記ウェルを１％スキムミルクでブロッキングした後、段階希釈したＣＡＮ１９またはＣＡＮ２０ ｍＡｂｓ（０．１μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ）をプローブとし、市販のヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体を用いて結合を検出した。陰性および陽性対照も検討した。キメラヒトｍＡｂ １３Ｃ６はエボラウイルスＧＰに特異的であり、ヒトＣＤＡ−１のＦｃに対する陰性対照とすることができる。前記ＣＤＡ−１ ｍＡｂおよびポリクローナルトキソイドＡ抗体（ｐＡｂ）を陽性対照としたが、前記ＣＤＡ−１ ｍＡｂはヒトであり、前記ポリクローナル抗体はウサギであるため、これらの抗体はいずれも異なる二次抗体を利用し、この２つの抗体とマウスｍＡｂｓを直接比較することができない。前記二次抗体の対照はマウス二次抗体用のものである。基質を用いて６０分インキュベートした後、前記プレートを４０５ｎｍで読み取った。各抗体の滴定データは図１に示している。

結果：図２および３に示すとおり、ＣＡＮ１９Ｇ１およびＣＡＮ１９Ｇ２ ｍＡｂｓはＣＤＡ１と同じレベルで毒素Ａ全体および毒素Ａフラグメント４に結合する。ＣＡＮ１９ ｍＡｂｓは毒素Ｂに対してほとんど交差反応性を示さなかった。ＣＡＮ２０ ｍＡｂｓは毒素Ａに結合する。ＣＡＮ２０Ｇ２およびＣＡＮ２０Ｇ５はＣＤＡ１と同じレベルで毒素Ａフラグメント４に結合する。ＣＡＮ１９ ｍＡｂｓは毒素Ｂに対して交差反応性を示さなかった。

マウスモノクローナル抗体のウエスタンブロット
Ｃ．ディフィシレタンパク質である毒素Ａ全体、トキソイドＡ（市販品）、組み換え型毒素フラグメント４および毒素Ｂ（全体、トキソイド、およびフラグメント４）を組み合わせ、４〜１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを２００ボルトで１．５時間泳動した。次に、４５分、４５ボルトで前記ゲルをニトロセルロース膜に移した。前記膜は１ｘＴＢＳＴ中、１％スキムミルクを用いて４℃で一晩ブロッキングし、翌日１ｘＴＢＳＴで洗い、スキムミルクを除去した。前記ｍＡｂｓ （１°Ａｂ）を１ｘＴＢＳＴ中、１μｇ／ｍｌの濃度で希釈し、振盪機に載せ、室温（ＲＴ）で２時間、移動した生成物を含む膜のプローブに用いた。前記膜を１ｘＴＢＳＴで洗い流し、結合していない１°Ａｂを除去し、振盪機に載せ、ＲＴで１時間、１：４０００の希釈率で抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（２°Ａｂ）をプローブとして検討した。

結果：図４および５に示すとおり、ＣＡＮ１９ ｍＡｂｓは３つすべてが毒素Ａ、トキソイドＡ、および毒素Ａフラグメントへの結合を示した。これらはすべて、毒素Ｂまたは陰性対照に対する交差反応性が弱いか、または全く示されなかった。ＣＡＮ２０Ｇ１、ＣＡＮ２０Ｇ２、ＣＡＮ２０Ｇ５、およびＣＡＮ２０Ｇ８ ｍＡｂｓはすべて、毒素Ａおよび毒素Ａフラグメント４に対して強い結合性を示した。毒素Ｂまたは陰性対照に対して交差反応性はなかった。

マウスモノクローナル抗体の親和性解析
バイオレイヤー干渉法を利用し、毒素Ａ全体と抗毒素Ａ抗体との相互作用を測定した。Ｏｃｔｅｔ ＱＫｅ装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）にストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサーを設置した。４０μｇ／ｍｌのビオチン化毒素Ａ全体をＳＡセンサーに結合し、１００ｎＭ〜１．５６ｎＭの段階希釈とした前記毒素Ａ ｍＡｂｓを１０分間毒素コーティングしたピンで反応させ、さらに１０分間、ＰＢＳ中で解離させた。この後、結果をＦｏｒｔｅＢｉｏデータ解析ソフトウェアで解析して解離定数（ＫＤ）を決定したが、これは抗体と抗原との結合の強さを説明するために用いられる指標であり、ｋ_ｏｎ（１／Ｍｓ）は抗体抗原複合体が生成する速度、ｋ_ｄｉｓ（１／ｓ）は前記抗体抗原複合体が解離する速度である。前記サンプルは２日に分けて測定した。表４は、精製したＣＡＮ２０Ｇ、およびＣＤＡ１の親和性データを示している。

マウスモノクローナル抗体のエピトープビニング（Ｂｉｎｎｉｎｇ）
Ｏｃｔｅｔ ＱＫｅは、バイオレイヤー干渉法により生体分子の相互作用を検出する、ディスポーザブル光ファイバーセンサーを使用した無標識リアルタイムバイオセンサーである。すでに特徴解析が行われているＣＤＡ１抗毒素Ａ ｍＡｂに対してエピトープビニングアッセイを行い、本毒素Ａ ｍＡｂがＣＤＡ−１と同じエピトープを共有しているのか、または異なるエピトープを有しているのかを検討した。次に、前記アッセイを利用し、前記毒素Ａ ｍＡｂｓ間で単一のエピトープを共有しているのか、または複数のエピトープを有している可能性があるのかを確認した。古典的なサンドイッチ法を利用したが、これには前記ｍＡｂのセンサーへの結合、抗原の結合、別のｍＡｂへの結合が関与する。第２のｍＡｂは、そのエピトープが固定されたｍＡｂのエピトープと重複する場合にのみ、捕捉されたＡｇと結合することができる。

結果：ＣＡＮ２０Ｇ１およびＰＢＳの対照では波長（ｎＭ）が強くシフトしていることから（結合曲線の垂直上昇）、さらに結合することができ、被験抗体が露出した、明確に異なるエピトープに結合していることを示している。図６ａおよび６ｂに示されるとおり、前記結果は、前記ＣＤＡ１抗体では、波長が上方シフトしていることを示している。このことは、ＣＤＡ１とＣＡＮ２０ ｍＡｂｓが明確に異なるエピトープに結合していることを示している。すべてのＣＡＮ２０ ｍＡｂｓが同じエピトープを共有している。ＣＡＮ２０Ｇ２ではｎｍがわずかに上昇しているが、これは結合がわずかに増加したことを示しており、その原因はＣＡＮ２０Ｇ１およびＣＡＮ２０Ｇ２、つまり異なる抗体エピトープまたは両方の既知のＶＨ鎖とＶＬ鎖との間の体細胞変異である可能性がある。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでのマウスモノクローナル抗体の中和
本明細書で説明されるｉｎ ｖｉｔｒｏ中和アッセイは、Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入したＶＥＲＯ（ミドリザル）細胞および毒素Ａを用いて行った。（ＢＩＡＤ報告書：クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ａモノクローナル抗体の特徴解析）。ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）およびバイオアッセイ法で使用したプロトコールについて以下にまとめる。

細胞接着期−ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ法。（１）供給フラスコにトリプシン処理細胞を入れた。（２）フラスコに２ｍＬのトリプシンを加え、細胞を洗って微量の培地を取り除き、吸引した。（３）３ｍＬのトリプシンを加え、細胞が剥離するまで約１０分間、３７℃でインキュベートした。（４）６ｍＬのアッセイ培地または増殖培地をフラスコに加えた。（４）１３００ｒｐｍで８分間遠心分離した。（５）上清を吸引し、６ｍＬのアッセイ培地または増殖培地で細胞を再懸濁した。（６）細胞を計数し、必要な細胞密度を計算した。（Ｖｅｒｏ細胞は１×１０^５細胞／ｍＬ、Ｔ８４細胞は８×１０^５細胞／ｍＬ。）（７）９６ウェルのＥプレートのウェルＡ１〜Ｈ１０に１００μＬのアッセイ培地を加え、ウェルＡ１１〜Ｈ１２に１００μＬのＴ８４培地を加えた。（８）ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅでバックグラウンドを読み取った。（９）ウェルＡ１〜Ｈ１０からアッセイ培地５０μＬを取りだした。（１０）これらのウェルに５０μＬの１．０×１０^５細胞／ｍＬの懸濁液を加え、最終播種密度を５．０×１０^４細胞／ｍＬとした。（１１）Ａ１１〜Ａ１２に１００μＬのＴ８４ ８×１０^５細胞／ｍＬの細胞懸濁液を加えた。（１２）Ｈ１１〜Ｈ１２で降順に２倍の段階希釈を行った。（１３）Ｈ１１およびＨ１２から１００μＬを取り出した。（１４）Ａ１１〜Ｈ１２に１００μＬのＴ８４培地を加え、最終容積を２００μＬとした。（１５）２０〜３０分間室温でプレートをインキュベートし、細胞を均等に定着させた。（１６）５％ ＣＯ_２雰囲気下、２０〜２４時間、３７℃のインキュベーターにプレートを入れた。

細胞接着期−バイオアッセイ法。（１）供給フラスコにトリプシン処理細胞を入れた。（２）供給フラスコにプールした細胞を入れた。（３）１２７０ｒｐｍで８分間遠心分離した。（４）上清を取り除き、アッセイ培地に細胞を再懸濁した。（５）プールしたすべてのフラスコに６ｍＬの培地を使用することとした。（６）細胞を計数し、１．０×１０^５細胞／ｍＬで播種するために必要な細胞の生存度と量を決定した。（７）播種したときの最終濃度は０．５×１０^５細胞／ｍＬとなる。（８）底が透明な９６ウェルの黒色マイクロプレートのウェルＢ２〜Ｇ１１に、５０μＬの１０％アッセイ培地を加えた。（９）９６ウェル平底マイクロプレートのウェルＢ２〜Ｇ１１に１．０×１０^５細胞／ｍＬで５０μＬの細胞を重ねた。（１０）外縁のウェルに、温めたアッセイ培地１００μＬを加えた。（１１）均一に懸濁させるため、プレート振盪機で混合した。（１２）２０〜３０分間室温にプレートを放置し、細胞をウェル間で均等に定着させた。（１３）２０〜２４時間、３７℃、５％ ＣＯ_２で加湿したインキュベーターに細胞プレートを入れた。

毒素Ａの調製：（１）毒素Ａの一次原液（２０μｇ／ｍＬ）は、１００μＬの滅菌ＬＷを毒素Ａのバイアル１本（２．０μｇ）に加えて調製した。（２）一次原液の希釈は表５に示すとおりである。

サンプルの調製：力価を検討するため、すべてのモノクローナル抗体の開始濃度を３０μｇ／ｍＬとした。サンプルは表６に示すとおり調製した。

希釈プレートの調製−ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ：（１）以下の表７に示すとおり、ウェルにアッセイ培地および１５０μＬのサンプルを加えた。（２）７５μＬを列Ａから取り、列Ｂに加えて、各サンプルをカラムで２倍に段階希釈し、３〜５倍に混合し、列Ｇまで繰り返した。（３）表５に示すとおり、ウェルに適切な対照を加えた。（４）サンプルのウェルに７５μＬの毒素Ａを重ねた。均一になるまでプレート振盪機で振盪する。（５）３７℃で１時間インキュベートした。

バイオアッセイ法：表８に示すとおり、ウェルにアッセイ培地を加えた。
（１）カラム２の適切なウェルに１５０μＬのサンプルを加えた。プレート＃１でＣＤＡ、ＣＡＮ１９Ｇ１（精製済み）、およびＣＡＮ１９Ｇ１の上清を加えた。プレート＃２でＣＤＡ、ＣＡＮ１９Ｇ２（精製済み）、およびＣＡＮ１９Ｇ２の上清を加えた。プレート＃３でＣＤＡ、ＣＡＮ１９Ｇ３（精製済み）、およびＣＡＮ１９Ｇ３の上清を加えた。（２）カラム２からカラム３に７５μＬを移した。マルチチャンネルで混合した。．カラム９までこの手順を繰り返した。（３）カラム１０から７５μＬを取り出し、最終容積を１００μＬとした。（４）適切なウェルに対照（７５μＬ）と７５μＬのＡＭを加えた。（５）サンプルのウェルに７５μＬの毒素Ａを重ねた。

細胞プレートへのサンプルの追加：（１）１時間インキュベートした後、細胞プレートをインキュベーターから取り出した。（２）細胞単層を壊さないように、マルチチャネルピペットにより５０μＬの細胞懸濁液を慎重に取り除いた。（３）希釈プレートから細胞プレートの適切なウェルに１００μＬのサンプルを移した。（４）均一な溶液を得るため、プレート振盪機で混合した。５％ ＣＯ_２雰囲気下、３７℃で７２時間インキュベートした。

データ解析：ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅシステムでは、リアルタイムにデータを取得する。従来のバイオアッセイ法と比較するため、最後に読み取った時間データを解析する。このため、ベースラインとして適切な毒素を用い、前記プレートに毒素／抗体を追加する前の時点で、細胞指数を正規化した。こうすることで、抗体のｌｏｇ濃度と比較し、Ｙ軸にベースラインで正規化した細胞指数ができる。
我々は前記データを解析し、ＣＤＡと比較したＣＡＮ１９ ｍＡｂｓの力価を決定した。
中和率（％）はｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅでは以下のとおり計算する。
中和率（％）＝（サンプルＣＩ指数／抗体対照ＣＩ指数）×１００
中和率（％）はバイオアッセイの蛍光発光では以下のとおり計算する。
中和率（％）＝（平均サンプルＲＦＵ／平均毒素ＲＦＵ）／（平均細胞ＲＦＵ／平均毒素ＦＲＵ）×１００
この例の手順はＣＡＮ２０ ｍＡｂｓでも行った。

結果：ＣＡＮ１９ ｍＡｂｓはＣＤＡ１よりも中和されにくかった。ＣＡＮ２０Ｇ２はｉｎ ｖｉｔｒｏで最も強力なｍＡｂであり、ＣＤＡ１よりも効果が高い。ＣＡＮ２０Ｇ３、Ｇ５、およびＧ８も中和している。

表９は、各ＣＡＮ１９ ｍＡｂについて作成したＩＣ_５０データをまとめ、ＣＡＮ１９クローンがＣＤＡ１と比較し、中和されにくいことを証明している。

表１０は、各ＣＡＮ２０ ｍＡｂについて作成されたＥＣ_５０データをまとめ、ＣＡＮ２０Ｇ２、ＣＡＮ２０Ｇ３、ＣＡＮ２０Ｇ５、およびＣＡＮ２０Ｇ８は前記クローンの中で最も中和されることを証明している。

マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの毒素負荷
マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの毒素負荷試験は、既発表文献を基にしている（Ｂａｂｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ Ｔｏｘｉｎｓ Ａ ａｎｄ Ｂ ｐｒｅｖｅｎｔ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｉｎ Ｈａｍｓｔｅｒｓ． Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ （２００６） ７４（１１）：６３３９）。０日目、体重２０〜３０ｇのスイスウェブスターマウスに２５０μｇのｍＡｂまたは対照を投与し、休息させた。２４時間後（１日目）、前記マウスに致死量のＴｃｄＡ（１００ｎｇ）を投与した。この用量では、保護していない状態で、２４時間までに９０〜１００％の動物が死亡する。異常および局所および全身疾患の兆候がないか、７日間（１〜７日目）観察した。マウスは７日目に安楽死させた。すべての所見を記録し、投与群ごとに生存率（％）を決定した。

結果：図７、８、および９に示すとおり、研究結果は、ＣＡＮ１９およびＣＡＮ２０ ｍＡｂｓが毒素Ａからマウスを保護することを示している。ＣＡＮ１９Ｇ１、Ｇ２、およびＧ３では生存率が９０％を超えた。３つのＣＡＮ１９ ｍＡｂｓがすべて有効性を示した。ＣＡＮ２０ ｍＡｂｓもすべて有効であった。ＣＡＮ２０Ｇ１、Ｇ２、Ｇ５、およびＧ８は用量０．２５ｍｇ／マウスで１００％の保護効果を示した。ＣＡＮ２０Ｇ２は０．１２５ｍｇ／マウスで１００％の保護効果を示した。実験を繰り返し、ＣＡＮ２０Ｇ２の有効性を確認した。前記結果はこれまでの研究を確認するものであった。ＣＡＮ２０Ｇ２は全量の０．２５ｍｇ／マウスで１００％の保護効果、半量の０．１２５ｍｇ／マウスで９０％の保護効果を示した。

ｍｕＣＡＮ２０Ｇ２ Ｖ遺伝子の配列決定
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用い、ＣＡＮ２０Ｇ２親ハイブリドーマクローン細胞からＲＮＡを単離した。Ｑｉａｇｅｎ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔを用い、前記ＲＮＡからＶ遺伝子の増幅を行った。いくつかの組み合わせのプライマーセットを使用し、前記ハイブリドーマの免疫グロブリン可変領域の遺伝子配列を確認するため、可変領域遺伝子（Ｖ遺伝子）サブグループ特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのセットを使用する。これには、５’ｍＶＫ−Ｌｅａｄ−１、３’ＫａｐｐａＣｏｎｓｔＲＴ、５’ｍＶＨ−Ｌｅａｄ−２，５’ｍＶＨ−Ｌｅａｄ−２Ａ、および３’ｍＩＧ１−２Ｃ ＲＴを含む。既知の内因性異常κ軽鎖Ｖ遺伝子ｍＲＮＡ（Ｐ３Ｘ６３骨髄腫症内にみられる）の可能性を除外するため（Ｙｕａｎ， Ｘ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２９４： １９９−２０７ （２００４））、非サブグループ特異的プライマーとして５’ｍＶＫ−Ｌｅａｄ−１Ａ、５’ｍＶＫ−Ｌｅａｄ−１Ａ、５’ｍＶＫ−Ｌｅａｄ−３、５’ｍＶＫ−Ｌｅａｄ−３Ａ、５’ｍＶＨ−ＩＧＨＶ１−Ｌｅａｄ、５’ｍＶＨ−Ｌｅａｄ−１、５’ｍＶＨ−Ｌｅａｄ−３， ５’ｍＶＨ−Ｌｅａｄ−４、および５’ｍＶＨ−Ｌｅａｄ−５を用い、ＲＴ−ＰＣＲも行った。プライマーとその配列リストについては図１０を参照。ＰＣＲ増幅反応の結果は、解析用アガロースゲル上で前記ＰＣＲ産物を検討することで判定し、約５００ｂｐに見えたバンドはクローニング用にゲルを単離した。抽出したＤＮＡは、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングマニュアルの低融点アガロース法により、直接ＴＡをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。Ｍ１３フォワードおよびＭ１３リバースプライマーを用い、両方向でＣＡＮ２０Ｇクローン反応のそれぞれ５つのコロニーの配列を決定した。配列データはＤＮＡＳｔａｒ Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアを用いて解析した。得られた再配列Ｖ遺伝子配列を、ＩＭＧＴ／Ｖ−Ｑｕｅｓｔ参照用ディレクトリセットおよびＮＣＢＩの免疫グロブリンｂｌａｓｔ検索と比較した（図１１）。

ｍｕＣＡＮ２０Ｇ２のヒト化
ＣＡＮ２０Ｇ２ ｍＡｂの３つのヒト化ＩｇＧ／ｋとキメラＩｇＧ／ｋを作成した。ヒト化ＩｇＧ／ｋについては、（ＩＭＧＴおよびＮＣＢＩのウエブサイトから）ヒト生殖系列の対立遺伝子との最大同一性アラインメントを受容体フレームワークの同定に用いた。全部で６つのＣＤＲが挿入された。他の残基は、それぞれ表面が露出しているか、折り畳みまたは鎖間の接触のため、変化または維持された。前記マウスｍＡｂ配列のＣＤＲ（ＣＡＮ２０Ｇ２）は、最も近いヒト対立遺伝子の生殖系列ＣＤＲｓと非常によく一致している。これは、受容体フレームワークとして生殖系列の配列を使用する変形形態において、フレームワーク全体ではなくＣＤＲのマッチングを利用する「超ヒト化（ｓｕｐｅｒｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）」アプローチに似ている。Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２， １６９：１１１９−１１２５のケースでは、著者らがＣＤＲ配列を利用し、Ｃｈｏｔｈｉａの分類システムに基づき、いわゆる正準ＣＤＲ構造型とマッチさせようとした。しかし、特定のＣＤＲｓはコードされた生殖系列であり、特定の正準構造型は特定のフレームワークにみられる傾向があるため、受容体フレームワークを選択する「超ヒト化」法では、すべての場合に異なる候補受容体フレームワークが選択されるわけではない。これは経験的なもので、複数のｍＡｂ特異性についてまだ検討されていない。これは一部、同一性を決めるフレームワークの正しいアラインメントの比較では、本質的に前記ＣＤＲｓも含まれるためである。図１１は、アミノ酸レベルで、ＣＡＮ２０Ｇ２のヒト化構造型それぞれのヒト化の割合を示している。

図１２は、最も近いヒト生殖系列のｖ領域とＣＡＮ２０Ｇ２のｖ領域の配列アラインメントを示している。ヒト生殖系列はヒト化の受容体フレームワークとして用いた。

ＣＤＲ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２−ＣＤＲ移植型のみ。Ｖ_ＨおよびＶ_ｋの両方について、最もマッチした生殖系列の対立遺伝子を、前記ＣＤＲｓを移植するための受容体フレームワークとして利用した。前記受容体フレームワークに他の変更は行っていない。図１３ａおよび１３ｂは、我々が使用したＣＤＲ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２のデザインを示している。最も近いマッチしたヒトフレームワークはＩＧＨＶ７−４−１＊０２およびＩＧＫＶ１−３９＊０１である。ｍｕＣＡＮ２０Ｇ２のＣＤＲｓ（ＩＭＧＴナンバリング）はヒトフレームワークに挿入した。重鎖ＣＤＲ３には、ｃＤＮＡ３００２Ｎｅｏへのクローニングが変更されたＨｐａＩ制限酵素認識部位が含まれていた。正しい翻訳とトラフィッキングを行うため、５’ＫｏｚａｋおよびＨＡＶＴ２０リーダー配列が追加された。

ＨＥ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２「ヒト遺伝子組み換え」型−このヒト化型は、マウスｍＡｂをＣＤ５にヒト化するために用いたＳｔｕｄｎｉｃｋａら（１９９４）による「ヒト遺伝子組み換え」戦略と最も類似した戦略を用いて作成された。本質的には、ＣＡＮ２０Ｇ２ Ｖ_ＨおよびＶ_ｋの両方に最も近いヒト生殖系列対立遺伝子が個別に同定され、受容体フレームワークとして使用するためにデザインされた。ＣＡＮ２０Ｇ２ Ｖ_ＨはヒトＩｇＶＨ７−４−１＊０２対立遺伝子と７６％同一である。前記ＣＤＲｓは、ＣＡＮ２０Ｇ２ ｍＡｂ配列とマッチするように移植または変化させた。ＨＥ−ｈＣＡＮ２０Ｇ２抗体を図１４、１５、および１６に示している。説明に示したとおり、一部の残基は修飾または維持した。このケースでは、アバスチン／ベバシズマブから結晶構造を推定した。アバスチンは、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）を認識および遮断するヒト化モノクローナル抗体であり、進行大腸癌の治療用に市販されている。アバスチンは最も高い同一性を有し、ＣＡＮ２０Ｇ２ ＶＨとヒト生殖系列遺伝子が同じであることが分かり、その可変領域構造の結晶構造が決定された。

ＡＶＡ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２「アバスチン化」型−アバスチンＶ_ＨおよびＶ_κ／Ｊκ対立遺伝子とそれぞれのヒト化ＣＡＮ２０Ｇ２ Ｖ_ＨおよびＶ_κ免疫グロブリン可変領域の翻訳のアラインメントを図１７に示している。結晶構造データがある他のｍＡｂｓにみられるＶ_ＨおよびＶ_Ｌの天然配列ペアを利用し、多くのｍＡｂｓがヒト化された。このケースでは、（アバスチンＶ_Ｈと高い同一性を有する）１型−ＨＥと同じＶ_Ｈを使用し、軽鎖受容体フレームワークとしてアバスチンＶ_ｋを利用した。これにより、我々のデザインの中で既知の鎖間接触および修飾を活用することができた（図１８）。

キメラ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２キメラ型：対照としてキメラＣＡＮ２０Ｇ２をデザインした。ＣＤＲｓ外にある特定の残基は超可変領域の構造に関与している。ヒト化のプロセス中、一部の残基が変化する可能性がある。正準構造内の配列の変動がパラトープの立体配座を調節するため、親和性／機能／中和の増減がヒト化プロセスまたはヒトＦｃ領域のためであるか否かを決定することは重要である。ＣＡＮ２０Ｇ２マウスｖ領域はヒトＩｇＧ１およびヒトκ定常領域上にデザインされた。前記作成物はＫｏｚａｋ、ＨＡＶＴ２０リーダーおよびダブルストップ配列を含む（図１９Ａおよび１９Ｂ）。

ヒト化抗体のＳＤＳ Ｐａｇｅおよびウエスタンブロット解析
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞で大量の形質移入（３００ｍｌ）を行い、各ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２ ｍＡｂを大量に得た。合計３×１０^８個の細胞に３００μｇのｈｕＣＡＮ２０Ｇ２プラスミドＤＮＡを形質移入した。形質移入後３日および７日に遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分、室温）により上清を取り出した。形質移入した上清は０．２２μｍのフィルターでろ過した。ろ過した上清は、ＡｋｔａＰｕｒｉｆｉｅｒ ＦＰＬＣを利用したＰｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（ＨｉＴＲＡＰ ＨＰ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。溶出されたタンパク質は緩衝液をＤ−ＰＢＳに交換し、濃度をＢＣＡアッセイにより決定した。３０〜４５ｍｇの範囲を３００ｍｌの培地から精製した。精製したタンパク質にＳＤＳ−ｐａｇｅを行い、そのサイズを確認した（図２２）。精製したｍＡｂも利用し、毒素Ａ全体および毒素Ａフラグメント４を用いて膜を調査し、前記ｍＡｂｓの結合特性を確認した（図２３）。

ヒト化抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ中和アッセイ
ＣＴ−２６細胞を用いたＣ．ディフィシレ毒素のｉｎ ｖｉｔｒｏ中和アッセイは、ヒト化ｍＡｂクローンのＣ．ディフィシレ毒素Ａに対する中和能力を検討するために行った。ＣＴ−２６細胞を２．５〜３×１０^４細胞／１００ｕｌ／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播種し、前記プレートを３７℃で４〜５時間、ＣＯ_２インキュベーターでインキュベートした。培地のみを含む２つのブランクウェル（細胞なし）もプレートに含めた。

毒素および毒素／Ａｂ混合物を試験管に調製し、ＲＰＭＩ培地により望みの濃度に希釈した。前記試験管を室温で１時間インキュベートした。前記培地は、培地のみ、毒素のみ、または毒素／Ａｂ混合物を含む前記プレートのウェルおよび各試験から取り除き、指定されたウェルに移した。前記プレートは３７℃および５％ ＣＯ_２で４８時間インキュベートした。ＷＳＴ−１検出試薬を各ウェルに加え（ウェル中の試薬１０μｌ／１００μｌ容量）、３７℃および５％ ＣＯ_２で１時間インキュベートした。前記プレートを１分間振盪し、４５０ｎｍで読み取った。
細胞の生存度は、細胞対照を基に、以下のとおり決定した。
細胞の生存率（％）＝被験物の平均ＯＤ／細胞対照の平均ＯＤ×１００
毒素の中和は以下の式で計算した。
中和率（％）＝（サンプルのＯＤ−毒素対照のＯＤ）／（細胞対照のＯＤ−毒素対照のＯＤ）×１００
結果：図２０ａおよび２０ｂに示すとおり、前記キメラＣＡＮ２０Ｇ２および前記ＨＥ−ＣＡＮ２０Ｇ２がすべてのｍＡｂ濃度で最も中和している。前記ＨＥ−ＣＡＮ２０Ｇ２は、どちらの毒素Ａ濃度でも、ほとんどのｍＡｂ濃度で中和力が高い。Ｍｅｄａｒｅｘ ＣＤＡ ＩｇＧおよびｈＣＤＲ ｍＡｂｓは同様の中等度の中和力を示し、ＡＶＡ−ＣＡＮ２０Ｇ２は中和力が非常に低いことを示している。

ヒト化抗体の親和性アッセイ
バイオレイヤー干渉法を利用し、毒素Ａ全体とヒト化ＣＡＮ２０Ｇ２抗体との相互作用を測定した。Ｏｃｔｅｔ ＱＫｅ装置にストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサーを設置した。４０μｇ／ｍｌのビオチン化毒素Ａ全体にＳＡセンサーを結合し、１００ｎＭ〜１．５６ｎＭの段階希釈とした前記ヒト化抗体を１０分間前記毒素と結合させ、さらに１０分間、ＰＢＳ中で解離させた。この後、結果をＦｏｒｔｅＢｉｏデータ解析ソフトウェアで解析してＫＤ（ｎＭ）を決定したが、これは抗体と抗原との結合の強さを説明するために用いられる指標であり、ｋ_ｏｎ（１／Ｍｓ）は抗体抗原複合体が生成する速度、ｋ_ｄｉｓ（１／ｓ）は前記抗体抗原複合体が解離する速度である。

結果：２つの実験の結果は平均し、前記ｍｕＣＡＮ２０Ｇ２と前記ｃｈＣＡＮ２０Ｇ２が３倍以内にあり、親和性が低下していないことを示している（表１０）。対照的に、前記ＡＶＡ−ＣＡＮ２０Ｇ２では、親和性がほぼ１ ｌｏｇ低下していることが示された。前記ＣＤＲ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２は、前記ＡＶＡヒト化型に近い親和性の低下を示した。前記ＨＥ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２型の結合親和性は他のすべてのヒト化型よりもわずかに高いが、許容できる３倍の範囲内であり、キメラＣＡＮ２０Ｇ２と比較して親和性の低下は少ないか、全くないことを示している。我々は、ヒトの定常領域とマウスＩｇＧ２ａの定常領域を交換する効果を予測することができず、この比較でこれを考慮しているため、これが最適な比較であると考えている。３倍の範囲の比較は、ＦｏｒｔｅＢｉｏの専門家が差異は有意ではないと考えている。

ヒト化抗体のＥＬＩＳＡ検査
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞で中量スケール（１５０ｍｌ）の形質移入を行い、ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２ ｍＡｂの発現を検討した。合計１．５×１０^８個の細胞に１５０μｇのＤＮＡを形質移入した。形質移入後３日および７日に遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分、室温）により上清を取り出した。形質移入した上清は０．２２μｍのフィルターでろ過した。中量スケールの形質移入からろ過した上清は、精製前にＥＬＩＳＡでスクリーニングした。ヒトｍＡｂクローンの毒素Ａ全体および毒素Ａフラグメント４に対する結合を検討するため、ＥＬＩＳＡを行った。前記ヒトｍＡｂクローンはＣＤＡ１およびキメラＣＡＮ２０Ｇ２と比較した。前記ＥＬＩＳＡプレートを１００μｇ／ｍｌの毒素Ａフラグメント４および４００μｇ／ｍｌの毒素Ａ全体でコーティングし、前記コーティングが等モルになるようにした。前記コーティングを段階希釈したｍＡｂ（０．１２８ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）でプローブし、結合を抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ抗体で検出した。基質を用いて６０分インキュベートした後、前記プレートを４０５ｎｍで読み取った。

結果：図２１ ａ〜ｄに示すとおり、キメラ型に加えてｍＡｂ ＣＡＮ２０Ｇ２の３つのヒト化型すべては、ＥＬＩＳＡでは同様の強度で毒素Ａ全体に結合している。対照的に、前記ヒト化ｍＡｂｓの組み換え型毒素Ａフラグメント４への結合には明らかに差があり、毒素Ａフラグメント４は親ＣＡＮ２０Ｇ２が位置し、結合することが知られているＴｃｄ Ａのドメインである。このフラグメント４への結合がｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの保護と関連しているのであれば、これは機能性を示していると考えられ、ドメイン４アッセイの展開をＣＡＮ２０Ｇ２の有効性の代用とすることができる。前記キメラｍＡｂおよびＨＥ ｍＡｂは同様に結合するようにみえるが、前記ＣＤＲ ｍＡｂの結合は少なく、前記ＡＶＡ ｍＡｂは前記毒素Ａフラグメント４に結合しないようにみえる。

ｉｎ ｖｉｖｏでのＴｃｄ Ａ負荷
ｉｎ ｖｉｔｒｏデータに基づき、ＣＡＮ２０Ｇ２のＣＤＲ型およびＨＥヒト化型をｉｎ ｖｉｖｏで検討し、（上述の実施例８に示すとおり）マウスにおける致死量毒素負荷モデルでキメラ型と比較した。０日目、体重２０〜３０ｇのスイスウェブスターマウスに２５０ｕｇのｍＡｂまたは対照を投与し、休息させた。２４時間後、前記マウスに致死量のＴｃｄＡ（１００ｎｇ）を投与した。この用量では、保護していない状態で、２４時間までに１００％の動物が死亡する。前記マウスの臨床症状、異常、および局所および全身の疾患を４日間観察した。すべての所見を記録し、結果を検討したすべての抗体を示している表１３にまとめたが、この表は、前記ＨＥ型およびＣＤＲ型が毒素Ａの中和およびｉｎ ｖｉｖｏでの毒素Ａ負荷に対する保護に有効であることを示している。

ヒト化抗体の免疫原性解析
免疫原性を決定するため、２つのマーカー（増殖およびＩＬ−２産生）を用い、ＣＤＲ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２およびＨＥ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２をＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）（Ａｎｔｉｔｏｐｅ Ｌｔｄ）による時間経過を伴うＴ細胞アッセイで検討し、Ｔ細胞活性を測定した。具体的には、代表的なＨＬＡ（ヒト白血球抗原）アロタイプを持つ健常ドナー２１例のコホートから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用意した。ＣＤ８^＋−枯渇ＰＢＭＣｓを用い、バルク培養を確立した。［^３Ｈ］−チミジンを組み込んだＣＤ４^＋ Ｔ細胞の増殖を、抗体追加後の様々な時点で測定した。増殖解析と並行してＥＬＩＳｐｏｔアッセイも利用し、ＩＬ−２の分泌も測定した。

方法
ドナーＰＢＭＣｓの調製および選択
（２４時間以内に採血した）地域の健常ドナーのバフィーコートから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を単離した。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−ｓｈｉｅｌｄ、英国ダンディー）密度勾配遠心法によりバフィーコートからＰＢＭＣｓを単離し、ＣＤ８^＋ ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ、英国ロンドン）を用いて、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞を枯渇させた。ＨＬＡ ＳＳＰ−ＰＣＲに基づく組織適合検査キット（Ｂｉｏｔｅｓｔ、英国ソーリハル）を用い、ＨＬＡ−ＤＲハプロタイプを同定することでドナーの特徴を決定した。対照抗原（キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、［Ｐｉｅｒｃｅ（Ｐｅｒｂｉｏ）、英国クラムリントン］）、およびインフルエンザＡおよびエプスタイン・バー・ウイルス由来のペプチドに対するＴ細胞応答も判定した。次にＰＢＭＣｓを凍結し、必要時まで液体窒素に保存した。

抗体の調製
２つの被験抗体は使用直前にＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、英国ペーズリー）で希釈し、最終アッセイ濃度を０．３ｍＭとした。ＫＬＨを再現性の対照として使用し、１０ｍｇ／ｍｌの原液水溶液として−２０℃で保存した。試験では、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）中、４００μｇ／ｍｌに希釈する直前に一定量のＫＬＨを希釈した（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）。フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、Ｓｉｇｍａ、英国プール）をＥＬＩＳｐｏｔにおいて陽性対照として使用し、１ｍｇ／ｍｌ原液を−２０℃で保存してから、細胞培養での最終濃度２．５μｇ／ｍｌに希釈した。

細胞の生存度評価
７日目、バルク培養（増殖アッセイ用に事前に確立）を優しく再懸濁し、すべてのドナーから１０ｍｌずつ採血し、１０ｍｌのトリパンブルーと混合した。Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）自動セルカウンター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりトリパンブルー色素を取り除き、これらのサンプルの生存度を評価した。

ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）による時間経過を伴うＴ細胞アッセイ
各ドナーのＰＢＭＣｓを解凍、計数し、生存度を評価した。室温のＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地で細胞を回復させ、洗浄し、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）で４〜６×１０^６ＰＢＭＣ／ｍｌに再懸濁した。ドナーごとにバルク培養を確立し、２４ウェルプレートの適切なウェルに１ｍｌの増殖細胞原液を追加した。０．５ｍｌの培地および各０．５ｍｌの希釈した抗体を前記ＰＢＭＣに追加し、最終濃度を０．３μＭとした。ドナーごとに再現性の対照（１００μｇ／ｍｌ ＫＬＨでインキュベートした細胞）、陽性対照（２．５μｇ／ｍｌ ＰＨＡでインキュベートした細胞）、および培地のみのウェルも含めた。培養液は、合計８日間、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。５、６、７、および８日目、各ウェルの細胞を優しく再懸濁し、３×１００μを丸底９６ウェルプレートの各ウェルに移した。１００μｌのＡＩＭ−ＶＲ培地中、０．７５μＣｉ［^３Ｈ］−チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒＲ、英国ビーコンズフィールド）を用いて前記培養液にパルス照射し、さらに１８時間インキュベートしてから、Ｓｋａｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏ ９６Ｓ−１００５６セルハーベスターを利用し、フィルターマット（Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒＲ）に取り出した。ｐａｒａｌｕｘの低バックグラウンドカウンティングとし、１４５０ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｗａｌｌａｃ Ｔｒｉｌｕｘ液体シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒＲ）のＭｅｌｔｉｌｅｘ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒＲ）シンチレーションカウンティングで各ウェルの秒当たりカウント（ｃｐｍ）を決定した。

ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）ＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
増殖アッセイで使用したものと相同的なドナーをＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにも使用した。細胞を解凍し、上述のとおり回復させた。ＥＬＩＳｐｏｔプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、英国ウォトフォード）をあらかじめ湿らせておき、ＰＢＳ中、１００μｌ／ウェルのＩＬ−２キャプチャー抗体（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、英国アビンドン）で一晩コーティングした。次にプレートをＰＢＳで３回洗い、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ中１％のＢＳＡ）で一晩インキュベートし、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地で洗った。各ドナーの細胞密度をＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地中、４〜６×１０^６ＰＢＭＣ／ｍｌに調節し、１００μｌの細胞を各ウェルに追加した。５０μｌのサンプルおよび対照を適切なウェルおよび５０ｍｌのＡＩＭＶに追加し、最終容積を２００ｍｌ／ウェルとした。抗体は各ドナー６つ組み（ｓｅｘｔｕｐｌｉｃａｔｅ）の培養で検討し、陰性対照群（ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地のみ）、無細胞対照群、およびマイトジェン陽性対照群（２．５μｇ／ｍｌでＰＨＡ−ＥＬＩＳｐｏｔ機能および細胞生存度の内部試験として使用）も各プレートに含めた。８日間のインキュベーション期間後、ＥＬＩＳｐｏｔプレートをｄＨ_２ＯおよびＰＢＳ（×３）で順次洗って展開した後、１００μｌのろ過済みビオチン化検出抗体（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のＰＢＳ溶液／１％ ＢＳＡを加えた。３７℃で１．５時間インキュベートした後、さらにプレートをＰＢＳ（×３）で洗い、１００μｌのろ過済みストレプトアビジン−ＡＰ（Ｒ&Ｄシステム）のＰＢＳ溶液／１％ ＢＳＡを１．５時間かけて加えた（室温でインキュベート）。ストレプトアビジン−ＡＰを捨て、プレートをＰＢＳ（×４）で洗った。１００μｌのＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を各ウェルに加え、３０分間室温でインキュベートした。ｄＨ_２Ｏで３回前記ウェルおよび前記ウェル背面を洗うことで、スポット展開を停止した。乾燥したプレートをＩｍｍｕｎｏｓｃａｎ（登録商標）アナライザーでスキャンし、ウェルごとのスポット（ｓｐｗ）をＩｍｍｕｎｏｓｃａｎＲバージョン４ソフトウェアを用いて決定した。

ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）データ解析
増殖およびＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイについては、刺激指数（ＳＩ）の経験的閾値が２以上（ＳＩ≧２．００）であることがすでに確立されており、この閾値以上の反応を示すサンプルを陽性とみなす（ボーダーラインのＳＩｓ≧１．９０であることも強調されている）。広範にアッセイが展開されたこととこれまでの研究から、これが最小の信号対雑音閾値であり、擬陽性反応を多数検出する、またはわずかな免疫原性事象を見逃すことなく、最大限の感度とすることができることが示された。増殖（ｎ＝３）およびＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔデータ（ｎ＝６）セットの両方について、陽性反応は統計的および経験的閾値から以下のように定義した。

１．対応のない対応のない２サンプルのｓｔｕｄｅｎｔ ｔ−検定を利用した被験ウェルと対照培地のｃｐｍまたはｓｐｗを比較し、反応が有意である（ｐ<０．０５）。
２． 刺激指数（ＳＩ）が２以上（ＳＩ≧２．００）であり、ＳＩ＝被験ウェルの平均（ｃｐｍまたはｓｐｗ）／ベースライン（ｃｐｍまたはｓｐｗ）。このようにして提示されたデータはＳＩ≧２．００、ｐ<０．０５と示される。

さらに、同型培養の生データの変動係数および標準偏差（ＳＤ）を計算することで、アッセイ内のばらつきを評価した。

結果および考察
Ｔ細胞が活性化された後、ＩＬ−２産生と増殖との間には一般に良好な関係があるが、増殖アッセイとＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは独立して解釈されてきた。アッセイ内のばらつきは再現性の対照としてＫＬＨを用いて評価し、ＫＬＨに対してＴ細胞反応が陽性となる頻度を２回の別のＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイで比較した。この結果は、ＫＬＨ特異的Ｔ細胞反応のアッセイ内のばらつきが許容できる範囲内であり、これまでの研究と一致している（≦１０％）ことを示している。

細胞の生存度評価
前記抗体および前記緩衝液がＰＢＭＣの生存度に与える全効果の初期評価は、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）による時間経過を伴うアッセイで使用された１０例のドナーについて行った。細胞の生存度は、前記抗体の培養後７日にＰＢＭＣのトリパンブルー色素を除去して計算した。培地のみのＰＢＭＣはサンプルおよびＫＬＨ処理細胞と平均生存度が同等であったため（９３〜９７％）、２つの被験抗体および緩衝製剤は前記細胞の生存度に有意な影響を及ぼしていないことは明らかであった。

ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）による時間経過を伴う増殖アッセイ
図２４および表１２は、抗体によって誘導されたＣＤ４^＋Ｔ細胞について、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）による時間経過を伴うＴ細胞増殖アッセイで得られた結果を示している。いずれの被験抗体も増殖反応を陽性とし、前記増殖アッセイでは１例若しくはそれ以上のドナーでＳＩ≧２．００（ｐ<０．０５）であった。ボーダーライン反応のＳＩ≧１．９０（ｐ<０．０５）であることも強調されている増殖反応陽性の範囲は、ドナーコホートの５％〜２４％の範囲である（表１４）。

表１４では、全体の時間経過の中で（５〜８日）、Ｔ細胞増殖反応陽性（ＳＩ≧２．００、ｐ<０．０５で有意）を「Ｐ」と示し、Ｔ細胞ＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔ反応陽性（ＳＩ≧２．００、ｐ<０．０５で有意）を「Ｅ」と示した。ボーダーラインの反応（ｐ<０．０５で有意、ＳＩ≧１．９０）は（＊）と示した。ドナー７については、増殖アッセイ８日目のデータが得られなかった（‡）。緩衝製剤はドナー１〜１０で検討し、ドナー１１〜２１のみは前記緩衝液を検討しなかった（灰色のボックス）。Ｎ／Ａはデータが得られなかったことを示している。

抗体ＣＤＲ−ＨｕＣＡＮ２０Ｇ２はＴ細胞増殖反応の発生頻度が最も高いことと関連しており、研究コホートの２４％（ドナー５例）で反応が陽性となった。対照的に、抗体ＨＥ−ＨｕＣＡＮ２０Ｇ２ではＴ細胞増殖反応の誘発が少なく、コホートの５％のみで反応が陽性であった。これらの結果は、Ｔ細胞増殖反応の頻度が抗体ＣＤＲ−ＨｕＣＡＮ２０Ｇ２では高いが、ＨＥ−ＨｕＣＡＮ２０Ｇ２では低いことを示していた。対照緩衝液ではＴ細胞増殖反応が検出されなかった。

Ｔ細胞増殖反応の大きさの解析では、抗体ＣＤＲ−ＨｕＣＡＮ２０Ｇ２では反応頻度が高いが、反応の大きさは小さい（平均ＳＩ ２．１３）ことが示された。抗体ＨＥ−ＨｕＣＡＮ２０Ｇ２については、反応を示したドナー数が少なかったため、Ｔ細胞反応の大きさについて結論を出すことはできない（表１５）。したがって、全体的な前記抗体の免疫原性の可能性は、研究コホートのＴ細胞増殖反応陽性率（％）を基に決定し、ＣＤＲ−ＨｕＣＡＮ２０Ｇ２はＨＥ−ＨｕＣＡＮ２０Ｇ２よりも免疫原性が高かった。

平均ＳＩは全時間経過（５〜８日）で観察された全陽性ドナー反応の平均から計算した。このデータには、ボーダーラインの増殖反応が含まれる（ＳＩ≧１．９０、ｐ<０．０５）。

Ｔ細胞反応の速度論
前記増殖反応の全体的な時間から、Ｔ細胞反応で考えられるタイプ（ナイーブまたはリコール）に関する情報を提供することができる。５日目に検出されたＴ細胞の増殖が最大であったことは、既存のＴ細胞前駆体の発生頻度が高いことを示しているが、後半に増殖が最大となったことは既存のＴ細胞前駆体の発生頻度が低いことを示している。免疫原性の可能性は、時間経過初期のＴ細胞刺激と一致している可能性がある。図２５は、４日間の時間経過の中で各日のサンプルに発生した陽性増殖反応数をまとめている。抗体ＣＤＲ−ＨｕＣＡＮ２０Ｇ２に対するＴ細胞反応はほとんどが７日目および８日目に観察され、この抗体では既存のＴ細胞前駆体数が少ないことを示している。抗体ＨＥ−ＨｕＣＡＮ２０Ｇ２は１ドナーに反応を誘発し、これは６、７、および８日目に観察された。しかし、反応を示したドナーは１例しか検出されなかったため、抗体ＨＥ−ＨＵＣＡＮ２０Ｇ２のＴ細胞前駆体数について結論を出すことは難しい。

ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）ＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
図２６および表１２は、２つの被験抗体による刺激後、ＣＤ４＋ Ｔ細胞によるＩＬ−２分泌を測定するＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで得られた反応を示している。増殖アッセイ同様、ＳＩ≧２．００となったドナーで陽性反応を記録し、被験抗体のｓｐｗとバックグラウンド（非投与の対照培地）との間に有意な（ｐ<０．０５）差が観察された。ボーダーラインの反応ではＳＩ≧１．９０（ｐ<０．０５）であることも強調されているすべてのサンプルで１若しくはそれ以上のドナーでＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔ反応が陽性となり、対応のない２サンプルのｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定によりすべて有意であった（ｐ<０．０５）。すべてのＰＨＡウェルはスポット陽性であったが、８日後、大部分のウェルに計数できないほど多くのスポットが含まれていたため、ＳＩ値はＥＬＩＳｐｏｔデータで用意されなかった（データ図示せず）。

２つの被験抗体についてＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイの全体的な結果は、同じ頻度のＴ細胞反応を誘発する２つの抗体の増殖アッセイで得られた結果と一致した。増殖アッセイについては、抗体ＣＤＲ−ＨｕＣＡＮ２０Ｇ２が陽性反応を示したドナーの２４％を用いた研究コホートで最もＴ細胞反応を誘発し（ＳＩ≧２．００、ｐ<０．０５）、一方、抗体ＨＥ−ＨｕＣＡＮ２０Ｇ２は研究コホートの５％でＴ細胞反応を誘発した。２つの抗体に対する陽性（ボーダーラインのＳＩ≧１．９０を含む、ｐ<０．０５）Ｔ細胞反応の大きさの平均は低く評価された（ＣＤＲ−ＨｕＣＡＮ２０Ｇ２の平均陽性ＳＩ ２．３９）。

Ｔ細胞反応の頻度はＨＥ−ＨｕＣＡＮ２０Ｇ２では低く、Ｔ細胞反応の強さ（大きさ）と免疫原性を直接関連付けることができない。（ＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイの陽性反応頻度に基づく）被験抗体の免疫原性の相対リスク評価では、ＣＤＲ−ＨｕＣＡＮ２０Ｇ２の免疫原性がＨＥ−ＨｕＣＡＮ２０Ｇ２よりも高いことが示された。

このデータには、ボーダーラインの反応が含まれる（ＳＩ≧１．９０、ｐ<０．０５）。Ｎ／Ａはデータが得られなかったことを示している。

結果の解釈
前記増殖およびＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイのデータは、前記ドナー集団の被験抗体いずれに対しても、陽性Ｔ細胞反応が検出されたことを示している。増殖アッセイとＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイの関連性は全体的に高かったため（ＫＬＨで９４％、表１４）、これまでの研究同様、反応を示したドナーは、ＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイおよび増殖アッセイのいずれにおいても、各サンプルに陽性反応を示したドナーと定義した。表１４は、ＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイおよび増殖アッセイ両方で前記抗体に対して陽性の反応の概要を示している。前記増殖およびＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイから得られたデータの比較は、検討した抗体が、アッセイ間で一致した頻度でＴ細胞反応が陽性となったことを示していた。ドナー全員が前記ＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイでＰＨＡに対してＴ細胞反応陽性を示し、ｅｘ ｖｉｖｏ培養の細胞が機能的であることを示していた（データは図示せず）。これら２つのアッセイのデータセットを合わせた解析では、反応の全体的な頻度および大きさが抗体ＣＤＲ−ＨｕＣＡＮ２０Ｇ２で高く（２４％のドナーが増殖アッセイおよびＥＬＩＳｐｏｔアッセイの両方に反応）、抗体ＨＥ−ＨｕＣＡＮ２０Ｇ２では低い（５％のドナーが反応）ことが明らかとなった。

結論
増殖アッセイおよびＥＬＩＳｐｏｔアッセイの関連性は全体的に高く、反応を示したドナーは、両アッセイの各サンプルに陽性反応を示したドナーと定義した。これら２つのアッセイのデータセットを合わせた解析からは、全体的な反応が抗体ＣＤＲ−ＨｕＣＡＮ２０Ｇ２で高く（２４％のドナーが両アッセイに反応）、抗体ＨＥ−ＨｕＣＡＮ２０Ｇ２では低い（５％のドナーが反応）ことが明らかである。一連の生物製剤を用いたこれまでのＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞アッセイでは、前記アッセイのドナーＴ細胞反応の割合とクリニックで観察された免疫原性の程度との間に明らかな相関関係が示されたが、１０％を超えて反応が陽性となったタンパク質治療はクリニックでの免疫原性のリスクと関連している。今回の研究結果は、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイで検討されたタンパク質治療と比較し、抗体ＣＤＲ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２には臨床的な免疫原性のリスクがあると考えられることを示していた。対照的に、抗体ＨＥ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２は臨床的な免疫原性のリスクが低いと考えられる。

毒素Ａ負荷に対するヒト化ＣＡＮ２０Ｇ２ ｍＡｂｓのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性
２つのヒト化ＣＡＮ２０Ｇ２抗ＴｃｄＡ ｍＡｂｓ、ＨＥ−ＣＡＮ２０Ｇ２、およびＣＤＲ−ＣＡＮ２０Ｇ２のｉｎ ｖｉｖｏ保護効果は、低用量の抗体を検討することで、（上述の実施例８に示したとおり）マウス致死量毒素負荷モデルにおいて評価した。０日目、体重２０〜３０ｇのスイスウェブスターマウスに５０ｕｇのｍＡｂまたは対照を投与し、休息させた。２４時間後、前記マウスに致死量のＴｃｄＡ（１００ｎｇ）を投与した。この用量では、保護していない状態で、２４時間までに９０〜１００％の動物が死亡する。前記マウスの臨床症状、異常、および局所および全身の疾患を１４日間観察した。すべての所見を記録し、投与群ごとに生存率（％）を決定した。

結果
図２７および２８に示したとおり、いずれのヒト化ＣＡＮ２０Ｇ２ ｍＡｂｓも、毒素Ａのｉｎ ｖｉｖｏ負荷に対して保護効果があった。ＨＥ−ＣＡＮ２０Ｇ２は、ＣＤＡ１およびＣＤＲ−ＣＡＮ２０Ｇ２と比較し、ｉｎ ｖｉｖｏで優れた保護効果を示した。０．０５ｍｇ／マウスの低用量では、致死量のＴｃｄＡ負荷に対してＣＤＡ１（８０％）およびＣＤＲ−ＣＡＮ２０Ｇ２（７０％）を投与したマウスと比較し、ＨＥ−ＣＡＮ２０Ｇ２を投与したマウスの生存率が高かった（９０％）。

ヒト化抗体の薬物動態解析
ハムスターモデルおよびラットモデルにおいて、ＣＤＲ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２およびＨＥ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２の薬物動態試験を実施した。ハムスターの試験では、ゴールデンハムスターに５０ｍｇ／ｋｇのＣＤＲ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２を腹腔内注射した。注射後２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１６８時間、２４０時間、および３３６時間で採血を行った。対照サンプルは注射５日前に被験動物から、異なる時点で指標群から採血した。血液サンプルは１０分間８００ｒｐｍで遠心分離し、血清を得た。ラットの試験では、２群のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに対し、静脈内投与用に大腿静脈カテーテル（ＦＶＣ）、および採血用に頸静脈カテーテル（ＪＶＣ）を取り付けた。２つの抗体ＣＤＲ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２およびＨＥ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２を各群のラットに１０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで単回ＩＶボーラス投与を行った後、０．５ｍＬの食塩水で洗い流した。投与前、投与後０．０８３、１、２、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、２１６、２４０、２６４、２８８、および３１２時間でＪＶＣから採血した。全血（３００μＬ）サンプルを２２００×ｇで１０分間遠心分離し、血清を単離した。

前記血清中の抗体濃度はＥＬＩＳＡにより決定した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを一晩ヤギ抗ヒトＩｇＧでコーティングし、アフィニティー精製し、１μｇ／ｍＬでサル血清を吸着させた（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗い、ブロッキングバッファーでブロッキングした。抗体標準品を１％のプールした未処置ハムスター血清で希釈し、０．０９８〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲で標準曲線を作成した。希釈した被験サンプルおよび標準品を室温で１．５時間インキュベートした。プレートをＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＩｇＧで洗い、インキュベートし、アフィニティー精製し、サル血清を吸着させ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質系（Ｒ&Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）で展開し、ＴＭＢペルオキシダーゼ停止液（Ｒ&Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）で停止させた。プレートを４５０ｎｍにおいてＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーで読み取った。異なる時点で各動物の抗体濃度を標準曲線により計算した。

結果：ハムスターのＰＫ試験では、ウインドウズ用ＳＡＳバージョン９．２を利用して非コンパートメント薬物動態解析を行い、データは表１７に示している。示されているとおり、ＣＤＲ−ｈｕＣＡＮ２０Ｇ２は５０ｍｇ／ｋｇの投与量で最終的な半減期が約６日であることが証明され、この投与量では、さらなる有効性研究で抗体が確実に貯留された。

ラットのＰＫ試験では、Ｗａｔｓｏｎバージョン７．２．０．０２を利用して非コンパートメント薬物動態解析を行い、データは表１８におよび図２９Ａおよび２９Ｂに図示している。示されているとおり、２つのモノクローナル抗体のＰＫプロフィールは非常に似ている。曝露レベルは同等であることが示され、代謝はほぼ同じ速度であった。

本発明の具体的な態様を説明、図示してきたが、そのような態様は本発明を説明するものとしてのみ考えるべきであり、本発明を添付の請求項に沿って理解するものに制限すべきではない。本明細書で引用されたすべての参考文献および特許出願は、それぞれ個別の参考文献または特許出願がすべての目的でこの参照により組み込まれると具体的および個別に示されているように、すべての目的でこの参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。前述の発明は、明確に理解するために説明と例により少し詳しく説明してきたが、本発明の教示を踏まえると、添付の請求項の精神または範囲から離れずに、そこに特定の変更および修正を加えることができることは、当業者には容易に明確になるだろう。

Claims (26)

1. 単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、重鎖領域と軽鎖領域とを有し、前記重鎖領域は、それぞれ配列ＩＤ番号２９、３０、および３１で示されるアミノ酸配列に約８０％〜約１００％相同的なアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有し、前記軽鎖領域は、それぞれ配列ＩＤ番号２１、２２、および２３で示されるアミノ酸配列に約８０％〜約１００％相同的なアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の３つのＣＤＲを有する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
2. 単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ディフィシレ）毒素Ａに結合し、且つ重鎖領域を有し、前記重鎖領域は、それぞれ配列ＩＤ番号２９、３０、および３１で示されるアミノ酸配列に約８０％〜約１００％相同的なアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の３つのＣＤＲを有する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
3. 単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、Ｃ．ディフィシレ毒素Ａに結合し、且つ軽鎖領域を有し、前記軽鎖領域は、それぞれ配列ＩＤ番号２１、２２、および２３で示される前記アミノ酸配列に約８０％〜約１００％相同的なアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の３つのＣＤＲを有する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
4. 請求項１記載の抗体またはその抗原結合部分において、前記抗体またはその抗原結合部分はＣ．ディフィシレ毒素Ａに結合し、且つ前記抗体またはその抗原結合部分の解離定数（Ｋ_Ｄ）は約１×１０^−１１Ｍ未満である、抗体またはその抗原結合部分。
5. 請求項１記載の抗体またはその抗原結合部分において、前記抗体またはその抗原結合部分はヒト化型またはキメラ型である、抗体またはその抗原結合部分。
6. 請求項１記載の抗体またはその抗原結合部分において、前記重鎖領域が配列ＩＤ番号８９で示されるアミノ酸配列に約８０％〜約１００％相同的なアミノ酸配列を有し、且つ前記軽鎖領域が配列ＩＤ番号９１で示されるアミノ酸配列に約８０％〜約１００％相同的なアミノ酸配列を有するものである、抗体またはその抗原結合部分。
7. 請求項１記載の抗体またはその抗原結合部分において、前記重鎖領域が配列ＩＤ番号９３で示されるアミノ酸配列に約８０％〜約１００％相同的なアミノ酸配列を有し、且つ前記軽鎖領域が配列ＩＤ番号９５で示されるアミノ酸配列に約８０％〜約１００％相同的なアミノ酸配列を有するものである、抗体またはその抗原結合部分。
8. 請求項１記載の抗体またはその抗原結合部分において、前記抗体またはその抗原結合部分は、（ａ）免疫グロブリン分子全体、（ｂ）ｓｃＦｖ、（ｃ）Ｆａｂフラグメント、（ｄ）Ｆ（ａｂ’）２、および（ｅ）ジスルフィド結合Ｆｖから成る群から選択されるものである、抗体またはその抗原結合部分。
9. 請求項１記載の抗体またはその抗原結合部分において、前記抗体またはその抗原結合部分は、（ａ）ＩｇＧ定常領域、および（ｂ）ＩｇＡ定常領域から成る群から選択される少なくとも１つの定常領域を有するものである、抗体またはその抗原結合部分。
10. 請求項１記載の抗体またはその抗原結合部分において、前記抗体またはその抗原結合部分はＣ．ディフィシレ毒素Ａのフラグメント４に結合するものである、抗体またはその抗原結合部分。
11. 単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、Ｃ．ディフィシレ毒素Ａに結合し、且つ重鎖可変領域を有し、前記重鎖可変領域は、配列ＩＤ番号１２、２８、４４、または６０で示されるアミノ酸配列に約８０％〜約１００％相同的なアミノ酸配列を有する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
12. 単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、Ｃ．ディフィシレ毒素Ａに結合し、且つ軽鎖可変領域を有し、前記軽鎖可変領域は、配列ＩＤ番号４、２０、３６、または５２で示されるアミノ酸配列に約８０％〜約１００％相同的なアミノ酸配列を有する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
13. 単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、前記抗体またはその抗原結合部分は、それぞれ配列ＩＤ番号２８および２０で示されるアミノ酸配列に約８０％〜約１００％相同的なアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する抗体によって認識されるＣ．ディフィシレ毒素Ａの同じエピトープに結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
14. ＣＡＮ２０Ｇ２で指定されるハイブリドーマによって産生される抗体。
15. ＣＡＮ２０Ｇ２で指定されるハイブリドーマ。
16. 単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、ｉｎ ｖｉｖｏ毒素Ａ負荷実験において、哺乳類に約１００ｎｇ以上のＣ．ディフィシレ毒素Ａを曝露する約２４時間前に、約８ｍｇ／ｋｇ体重〜約１３ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で前記抗体またはその抗原結合部分を哺乳類に投与する場合、前記哺乳類の生存確率は約７日以内で約８０％以上である、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
17. 請求項１７記載の抗体またはその抗原結合部分において、前記抗体またはその抗原結合部分は重鎖領域および軽鎖領域を有し、
    前記重鎖領域は、それぞれ配列ＩＤ番号２９、３０、および３１で示されるアミノ酸配列に約８０％〜約１００％相同的なアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の３つのＣＤＲを有し、
    前記軽鎖領域は、それぞれ配列ＩＤ番号２１、２２、および２３で示されるアミノ酸配列に約８０％〜約１００％相同的なアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の３つのＣＤＲを有するものである、抗体またはその抗原結合部分。
18. 単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、前記抗体またはその抗原結合部分は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ中和試験において、約４μＭ〜約１７μＭの範囲の濃度で、約１５０ｎｇ／ｍｌのＣ．ディフィシレ毒素Ａの約４０％以上を中和するものである、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
19. 請求項１８記載の抗体またはその抗原結合部分において、前記抗体またはその抗原結合部分は重鎖領域および軽鎖領域を有し、
    前記重鎖領域は、それぞれ配列ＩＤ番号２９、３０、および３１で示されるアミノ酸配列に約８０％〜約１００％相同的なアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の３つのＣＤＲを有し、
    前記軽鎖領域は、それぞれ配列ＩＤ番号２１、２２、および２３で示されるアミノ酸配列に約８０％〜約１００％相同的なアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の３つＣＤＲを有するものである、抗体またはその抗原結合部分。
20. 請求項１記載の抗体または抗原結合部分と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを有する組成物。
21. Ｃ．ディフィシレ関連疾患を予防または治療する方法であって、被験者に有効量の請求項１記載の抗体またはその抗原結合部分を投与する工程を有する方法。
22. 請求項２１記載の方法において、前記抗体またはその抗原結合部分が静脈内、皮下、筋肉内、または経皮的に投与されるものである方法。
23. 請求項２１記載の方法であって、さらに、前記被験者に第２の薬物を投与する工程を有するものである方法。
24. 請求項２３記載の方法において、前記第２の薬物は異なる抗体またはそのフラグメントである方法。
25. 請求項２３記載の方法において、前記第２の薬物は抗生物質である方法。
26. 請求項２５記載の方法において、前記抗生物質がバンコマイシン、メトロニダゾール、またはフィダキソマイシンである方法。

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