JP6281163B2 - クロストリジウム・ディフィシレ抗体 - Google Patents
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Description
本出願書類は2011年8月22日出願の米国仮出願第61/526,031号の優先権を請求するものであり、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある(国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む)。
(先行技術文献)
(特許文献)
(特許文献1) 米国特許出願公開第2010/0233181号明細書
(特許文献2) 米国特許出願公開第2009/0087478号明細書
(特許文献3) 米国特許出願公開第2009/0269336号明細書
(特許文献4) 米国特許出願公開第2004/0137601号明細書
(特許文献5) 国際公開第2011/067616号
経粘膜または経皮投与については、浸透するバリアに適した浸透剤を前記製剤に使用することができる。そのような浸透剤は当該分野で既知であり、例えば、経粘膜投与、胆汁酸塩、フシジン酸誘導体を含む。加えて、浸透を促すために洗剤を利用することができる。経粘膜投与はスプレー式点鼻薬または坐薬により行うことができる。Sayani, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 13: 85−184, 1996.局部の経皮投与については、前記薬物は軟膏剤、クリーム、軟膏、粉末、およびゲルに製剤化される。経皮的送達系には、例えば、パッチを含むことができる。
古典的なハイブリドーマの融合を行った。マウスに完全フロインドアジュバント(CFA)を用いたトキソイドAの初回免疫付与を行い、続いて28日目および48日目にトキソイドAおよび不完全フロインドアジュバント(IFA)の追加免疫付与を行った。55日目に試験的に採血を行い、血清を検査し、抗トキソイドA抗体の力価を確認した。IgG力価が十分高ければ、融合を行った。十分でない場合は、さらに2回IFAの追加免疫付与を行い、2回目の採血を行った。融合は一度に2匹のマウスを用いて行った。融合の3日前、マウスの腹腔内(i.p.)にトキソイドAのPBS溶液を最終投与した。
次の段階は、増殖しているハイブリドーマのスクリーニングである。三次元基質で細胞の「ボール」として細胞が増殖する、市販の半固体アガロースを使用した。これにより(目視検査により)手でこれらのボールを選別し、これらのクローンボールを適切な培地を含む96ウェルプレートに移しやすくなる。前記細胞を3〜7日間増殖させた後、スクリーニングを行うため上清を取り除き、調製直後の培地と交換した。ELISA(または他の検査)で結合が陽性の場合は、増量してより大きな組織培養容器に移すと、前記ハイブリドーマの増殖が持続した。使用済み上清を用いたマウスmAbsの適切な市販アイソタイプ判定キットにより、mAbsのアイソタイプを判定した。次の選択段階にクローンを移すか否かの決定は、ELISAおよびその生存を用い、天然型毒素Aに対する反応性を基に行い、通常は少なくとも1/8または1/16以上の段階希釈および反応性、およびIgGクラスを基にしているため、前記選択手順の間、クローン数が減少する。さらに特徴決定を行ったmAbsは、CAN20G2、CAN20G1、CAN20G5およびCAN20G8およびCAN19G1、CAN19G2、CAN19G3であった。
毒素A全体および組み換え型毒素Aフラグメント4に対するtoxA mAbsの結合を検討するため、また毒素B全体および毒素Bフラグメント4に対して交差反応するか否かを判定するため、ELISAを利用した。mAbクローンをCDA1と比較した(Merckの抗毒素A mAbを対照として用いた)。ELISAプレートを100μg/mlの毒素フラグメント4および400μg/mlの毒素全体でコーティングし、前記コーティングが等モルになるようにした。前記ウェルを1%スキムミルクでブロッキングした後、段階希釈したCAN19またはCAN20 mAbs(0.1μg/ml〜1μg/ml)をプローブとし、市販のヤギ抗マウスIgG−HRP抗体を用いて結合を検出した。陰性および陽性対照も検討した。キメラヒトmAb 13C6はエボラウイルスGPに特異的であり、ヒトCDA−1のFcに対する陰性対照とすることができる。前記CDA−1 mAbおよびポリクローナルトキソイドA抗体(pAb)を陽性対照としたが、前記CDA−1 mAbはヒトであり、前記ポリクローナル抗体はウサギであるため、これらの抗体はいずれも異なる二次抗体を利用し、この2つの抗体とマウスmAbsを直接比較することができない。前記二次抗体の対照はマウス二次抗体用のものである。基質を用いて60分インキュベートした後、前記プレートを405nmで読み取った。各抗体の滴定データは図1に示している。
C.ディフィシレタンパク質である毒素A全体、トキソイドA(市販品)、組み換え型毒素フラグメント4および毒素B(全体、トキソイド、およびフラグメント4)を組み合わせ、4〜12% SDS−PAGEゲルを200ボルトで1.5時間泳動した。次に、45分、45ボルトで前記ゲルをニトロセルロース膜に移した。前記膜は1xTBST中、1%スキムミルクを用いて4℃で一晩ブロッキングし、翌日1xTBSTで洗い、スキムミルクを除去した。前記mAbs (1°Ab)を1xTBST中、1μg/mlの濃度で希釈し、振盪機に載せ、室温(RT)で2時間、移動した生成物を含む膜のプローブに用いた。前記膜を1xTBSTで洗い流し、結合していない1°Abを除去し、振盪機に載せ、RTで1時間、1:4000の希釈率で抗マウスIgG−HRP(2°Ab)をプローブとして検討した。
バイオレイヤー干渉法を利用し、毒素A全体と抗毒素A抗体との相互作用を測定した。Octet QKe装置(ForteBio)にストレプトアビジン(SA)バイオセンサーを設置した。40μg/mlのビオチン化毒素A全体をSAセンサーに結合し、100nM〜1.56nMの段階希釈とした前記毒素A mAbsを10分間毒素コーティングしたピンで反応させ、さらに10分間、PBS中で解離させた。この後、結果をForteBioデータ解析ソフトウェアで解析して解離定数(KD)を決定したが、これは抗体と抗原との結合の強さを説明するために用いられる指標であり、kon(1/Ms)は抗体抗原複合体が生成する速度、kdis(1/s)は前記抗体抗原複合体が解離する速度である。前記サンプルは2日に分けて測定した。表4は、精製したCAN20G、およびCDA1の親和性データを示している。
Octet QKeは、バイオレイヤー干渉法により生体分子の相互作用を検出する、ディスポーザブル光ファイバーセンサーを使用した無標識リアルタイムバイオセンサーである。すでに特徴解析が行われているCDA1抗毒素A mAbに対してエピトープビニングアッセイを行い、本毒素A mAbがCDA−1と同じエピトープを共有しているのか、または異なるエピトープを有しているのかを検討した。次に、前記アッセイを利用し、前記毒素A mAbs間で単一のエピトープを共有しているのか、または複数のエピトープを有している可能性があるのかを確認した。古典的なサンドイッチ法を利用したが、これには前記mAbのセンサーへの結合、抗原の結合、別のmAbへの結合が関与する。第2のmAbは、そのエピトープが固定されたmAbのエピトープと重複する場合にのみ、捕捉されたAgと結合することができる。
本明細書で説明されるin vitro中和アッセイは、List Biological Laboratoriesから購入したVERO(ミドリザル)細胞および毒素Aを用いて行った。(BIAD報告書:クロストリジウム・ディフィシレ毒素Aモノクローナル抗体の特徴解析)。xCelligence(Roche Diagnostics)およびバイオアッセイ法で使用したプロトコールについて以下にまとめる。
(1)カラム2の適切なウェルに150μLのサンプルを加えた。プレート#1でCDA、CAN19G1(精製済み)、およびCAN19G1の上清を加えた。プレート#2でCDA、CAN19G2(精製済み)、およびCAN19G2の上清を加えた。プレート#3でCDA、CAN19G3(精製済み)、およびCAN19G3の上清を加えた。(2)カラム2からカラム3に75μLを移した。マルチチャンネルで混合した。.カラム9までこの手順を繰り返した。(3)カラム10から75μLを取り出し、最終容積を100μLとした。(4)適切なウェルに対照(75μL)と75μLのAMを加えた。(5)サンプルのウェルに75μLの毒素Aを重ねた。
我々は前記データを解析し、CDAと比較したCAN19 mAbsの力価を決定した。
中和率(%)はxCelligenceでは以下のとおり計算する。
中和率(%)=(サンプルCI指数/抗体対照CI指数)×100
中和率(%)はバイオアッセイの蛍光発光では以下のとおり計算する。
中和率(%)=(平均サンプルRFU/平均毒素RFU)/(平均細胞RFU/平均毒素FRU)×100
この例の手順はCAN20 mAbsでも行った。
マウスにおけるin vivoでの毒素負荷試験は、既発表文献を基にしている(Babcock et al., Human Monoclonal Antibodies Directed against Toxins A and B prevent Clostridium difficile−Induced Mortality in Hamsters. Infection and Immunity (2006) 74(11):6339)。0日目、体重20〜30gのスイスウェブスターマウスに250μgのmAbまたは対照を投与し、休息させた。24時間後(1日目)、前記マウスに致死量のTcdA(100ng)を投与した。この用量では、保護していない状態で、24時間までに90〜100%の動物が死亡する。異常および局所および全身疾患の兆候がないか、7日間(1〜7日目)観察した。マウスは7日目に安楽死させた。すべての所見を記録し、投与群ごとに生存率(%)を決定した。
RNeasy Mini Kitを用い、CAN20G2親ハイブリドーマクローン細胞からRNAを単離した。Qiagen OneStep RT−PCR Kitを用い、前記RNAからV遺伝子の増幅を行った。いくつかの組み合わせのプライマーセットを使用し、前記ハイブリドーマの免疫グロブリン可変領域の遺伝子配列を確認するため、可変領域遺伝子(V遺伝子)サブグループ特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのセットを使用する。これには、5’mVK−Lead−1、3’KappaConstRT、5’mVH−Lead−2,5’mVH−Lead−2A、および3’mIG1−2C RTを含む。既知の内因性異常κ軽鎖V遺伝子mRNA(P3X63骨髄腫症内にみられる)の可能性を除外するため(Yuan, X. et al., J. Immunol. Methods, 294: 199−207 (2004))、非サブグループ特異的プライマーとして5’mVK−Lead−1A、5’mVK−Lead−1A、5’mVK−Lead−3、5’mVK−Lead−3A、5’mVH−IGHV1−Lead、5’mVH−Lead−1、5’mVH−Lead−3, 5’mVH−Lead−4、および5’mVH−Lead−5を用い、RT−PCRも行った。プライマーとその配列リストについては図10を参照。PCR増幅反応の結果は、解析用アガロースゲル上で前記PCR産物を検討することで判定し、約500bpに見えたバンドはクローニング用にゲルを単離した。抽出したDNAは、TOPO TAクローニングマニュアルの低融点アガロース法により、直接TAをpCR2.1−TOPOベクターにクローニングした。M13フォワードおよびM13リバースプライマーを用い、両方向でCAN20Gクローン反応のそれぞれ5つのコロニーの配列を決定した。配列データはDNAStar Lasergeneソフトウェアを用いて解析した。得られた再配列V遺伝子配列を、IMGT/V−Quest参照用ディレクトリセットおよびNCBIの免疫グロブリンblast検索と比較した(図11)。
CAN20G2 mAbの3つのヒト化IgG/kとキメラIgG/kを作成した。ヒト化IgG/kについては、(IMGTおよびNCBIのウエブサイトから)ヒト生殖系列の対立遺伝子との最大同一性アラインメントを受容体フレームワークの同定に用いた。全部で6つのCDRが挿入された。他の残基は、それぞれ表面が露出しているか、折り畳みまたは鎖間の接触のため、変化または維持された。前記マウスmAb配列のCDR(CAN20G2)は、最も近いヒト対立遺伝子の生殖系列CDRsと非常によく一致している。これは、受容体フレームワークとして生殖系列の配列を使用する変形形態において、フレームワーク全体ではなくCDRのマッチングを利用する「超ヒト化(superhumanization)」アプローチに似ている。Tan et al., J. Immunol. 2002, 169:1119−1125のケースでは、著者らがCDR配列を利用し、Chothiaの分類システムに基づき、いわゆる正準CDR構造型とマッチさせようとした。しかし、特定のCDRsはコードされた生殖系列であり、特定の正準構造型は特定のフレームワークにみられる傾向があるため、受容体フレームワークを選択する「超ヒト化」法では、すべての場合に異なる候補受容体フレームワークが選択されるわけではない。これは経験的なもので、複数のmAb特異性についてまだ検討されていない。これは一部、同一性を決めるフレームワークの正しいアラインメントの比較では、本質的に前記CDRsも含まれるためである。図11は、アミノ酸レベルで、CAN20G2のヒト化構造型それぞれのヒト化の割合を示している。
HEK293F細胞で大量の形質移入(300ml)を行い、各huCAN20G2 mAbを大量に得た。合計3×108個の細胞に300μgのhuCAN20G2プラスミドDNAを形質移入した。形質移入後3日および7日に遠心分離(3000rpm、15分、室温)により上清を取り出した。形質移入した上清は0.22μmのフィルターでろ過した。ろ過した上清は、AktaPurifier FPLCを利用したProtein Gカラム(HiTRAP HP、GE Healthcare)で精製した。溶出されたタンパク質は緩衝液をD−PBSに交換し、濃度をBCAアッセイにより決定した。30〜45mgの範囲を300mlの培地から精製した。精製したタンパク質にSDS−pageを行い、そのサイズを確認した(図22)。精製したmAbも利用し、毒素A全体および毒素Aフラグメント4を用いて膜を調査し、前記mAbsの結合特性を確認した(図23)。
CT−26細胞を用いたC.ディフィシレ毒素のin vitro中和アッセイは、ヒト化mAbクローンのC.ディフィシレ毒素Aに対する中和能力を検討するために行った。CT−26細胞を2.5〜3×104細胞/100ul/ウェルの濃度で96ウェルプレートに播種し、前記プレートを37℃で4〜5時間、CO2インキュベーターでインキュベートした。培地のみを含む2つのブランクウェル(細胞なし)もプレートに含めた。
細胞の生存度は、細胞対照を基に、以下のとおり決定した。
細胞の生存率(%)=被験物の平均OD/細胞対照の平均OD×100
毒素の中和は以下の式で計算した。
中和率(%)=(サンプルのOD−毒素対照のOD)/(細胞対照のOD−毒素対照のOD)×100
結果:図20aおよび20bに示すとおり、前記キメラCAN20G2および前記HE−CAN20G2がすべてのmAb濃度で最も中和している。前記HE−CAN20G2は、どちらの毒素A濃度でも、ほとんどのmAb濃度で中和力が高い。Medarex CDA IgGおよびhCDR mAbsは同様の中等度の中和力を示し、AVA−CAN20G2は中和力が非常に低いことを示している。
バイオレイヤー干渉法を利用し、毒素A全体とヒト化CAN20G2抗体との相互作用を測定した。Octet QKe装置にストレプトアビジン(SA)バイオセンサーを設置した。40μg/mlのビオチン化毒素A全体にSAセンサーを結合し、100nM〜1.56nMの段階希釈とした前記ヒト化抗体を10分間前記毒素と結合させ、さらに10分間、PBS中で解離させた。この後、結果をForteBioデータ解析ソフトウェアで解析してKD(nM)を決定したが、これは抗体と抗原との結合の強さを説明するために用いられる指標であり、kon(1/Ms)は抗体抗原複合体が生成する速度、kdis(1/s)は前記抗体抗原複合体が解離する速度である。
HEK293F細胞で中量スケール(150ml)の形質移入を行い、huCAN20G2 mAbの発現を検討した。合計1.5×108個の細胞に150μgのDNAを形質移入した。形質移入後3日および7日に遠心分離(3000rpm、15分、室温)により上清を取り出した。形質移入した上清は0.22μmのフィルターでろ過した。中量スケールの形質移入からろ過した上清は、精製前にELISAでスクリーニングした。ヒトmAbクローンの毒素A全体および毒素Aフラグメント4に対する結合を検討するため、ELISAを行った。前記ヒトmAbクローンはCDA1およびキメラCAN20G2と比較した。前記ELISAプレートを100μg/mlの毒素Aフラグメント4および400μg/mlの毒素A全体でコーティングし、前記コーティングが等モルになるようにした。前記コーティングを段階希釈したmAb(0.128ng/ml〜10μg/ml)でプローブし、結合を抗ヒトIgG−HRP抗体で検出した。基質を用いて60分インキュベートした後、前記プレートを405nmで読み取った。
in vitroデータに基づき、CAN20G2のCDR型およびHEヒト化型をin vivoで検討し、(上述の実施例8に示すとおり)マウスにおける致死量毒素負荷モデルでキメラ型と比較した。0日目、体重20〜30gのスイスウェブスターマウスに250ugのmAbまたは対照を投与し、休息させた。24時間後、前記マウスに致死量のTcdA(100ng)を投与した。この用量では、保護していない状態で、24時間までに100%の動物が死亡する。前記マウスの臨床症状、異常、および局所および全身の疾患を4日間観察した。すべての所見を記録し、結果を検討したすべての抗体を示している表13にまとめたが、この表は、前記HE型およびCDR型が毒素Aの中和およびin vivoでの毒素A負荷に対する保護に有効であることを示している。
免疫原性を決定するため、2つのマーカー(増殖およびIL−2産生)を用い、CDR−huCAN20G2およびHE−huCAN20G2をEpiScreen(商標)(Antitope Ltd)による時間経過を伴うT細胞アッセイで検討し、T細胞活性を測定した。具体的には、代表的なHLA(ヒト白血球抗原)アロタイプを持つ健常ドナー21例のコホートから末梢血単核細胞(PBMC)を用意した。CD8+−枯渇PBMCsを用い、バルク培養を確立した。[3H]−チミジンを組み込んだCD4+ T細胞の増殖を、抗体追加後の様々な時点で測定した。増殖解析と並行してELISpotアッセイも利用し、IL−2の分泌も測定した。
ドナーPBMCsの調製および選択
(24時間以内に採血した)地域の健常ドナーのバフィーコートから末梢血単核細胞(PBMCs)を単離した。Lymphoprep(Axis−shield、英国ダンディー)密度勾配遠心法によりバフィーコートからPBMCsを単離し、CD8+ RosetteSep(商標)(StemCell Technologies Inc、英国ロンドン)を用いて、CD8+ T細胞を枯渇させた。HLA SSP−PCRに基づく組織適合検査キット(Biotest、英国ソーリハル)を用い、HLA−DRハプロタイプを同定することでドナーの特徴を決定した。対照抗原(キーホールリンペットヘモシニアン(KLH)、[Pierce(Perbio)、英国クラムリントン])、およびインフルエンザAおよびエプスタイン・バー・ウイルス由来のペプチドに対するT細胞応答も判定した。次にPBMCsを凍結し、必要時まで液体窒素に保存した。
2つの被験抗体は使用直前にAIM−V(登録商標)培地(Invitrogen、英国ペーズリー)で希釈し、最終アッセイ濃度を0.3mMとした。KLHを再現性の対照として使用し、10mg/mlの原液水溶液として−20℃で保存した。試験では、AIM−V(登録商標)中、400μg/mlに希釈する直前に一定量のKLHを希釈した(最終濃度100μg/ml)。フィトヘマグルチニン(PHA、Sigma、英国プール)をELISpotにおいて陽性対照として使用し、1mg/ml原液を−20℃で保存してから、細胞培養での最終濃度2.5μg/mlに希釈した。
7日目、バルク培養(増殖アッセイ用に事前に確立)を優しく再懸濁し、すべてのドナーから10mlずつ採血し、10mlのトリパンブルーと混合した。Countess(登録商標)自動セルカウンター(Invitrogen)によりトリパンブルー色素を取り除き、これらのサンプルの生存度を評価した。
各ドナーのPBMCsを解凍、計数し、生存度を評価した。室温のAIM−V(登録商標)培地で細胞を回復させ、洗浄し、AIM−V(登録商標)で4〜6×106PBMC/mlに再懸濁した。ドナーごとにバルク培養を確立し、24ウェルプレートの適切なウェルに1mlの増殖細胞原液を追加した。0.5mlの培地および各0.5mlの希釈した抗体を前記PBMCに追加し、最終濃度を0.3μMとした。ドナーごとに再現性の対照(100μg/ml KLHでインキュベートした細胞)、陽性対照(2.5μg/ml PHAでインキュベートした細胞)、および培地のみのウェルも含めた。培養液は、合計8日間、37℃、5%CO2でインキュベートした。5、6、7、および8日目、各ウェルの細胞を優しく再懸濁し、3×100μを丸底96ウェルプレートの各ウェルに移した。100μlのAIM−VR培地中、0.75μCi[3H]−チミジン(Perkin ElmerR、英国ビーコンズフィールド)を用いて前記培養液にパルス照射し、さらに18時間インキュベートしてから、Skatron Micro 96S−10056セルハーベスターを利用し、フィルターマット(Perkin ElmerR)に取り出した。paraluxの低バックグラウンドカウンティングとし、1450 Microbeta Wallac Trilux液体シンチレーションカウンター(Perkin ElmerR)のMeltilex(商標)(Perkin ElmerR)シンチレーションカウンティングで各ウェルの秒当たりカウント(cpm)を決定した。
増殖アッセイで使用したものと相同的なドナーをIL−2 ELISpotアッセイにも使用した。細胞を解凍し、上述のとおり回復させた。ELISpotプレート(Millipore、英国ウォトフォード)をあらかじめ湿らせておき、PBS中、100μl/ウェルのIL−2キャプチャー抗体(R&D Systems、英国アビンドン)で一晩コーティングした。次にプレートをPBSで3回洗い、ブロッキングバッファー(PBS中1%のBSA)で一晩インキュベートし、AIM−V(登録商標)培地で洗った。各ドナーの細胞密度をAIM−V(登録商標)培地中、4〜6×106PBMC/mlに調節し、100μlの細胞を各ウェルに追加した。50μlのサンプルおよび対照を適切なウェルおよび50mlのAIMVに追加し、最終容積を200ml/ウェルとした。抗体は各ドナー6つ組み(sextuplicate)の培養で検討し、陰性対照群(AIM−V(登録商標)培地のみ)、無細胞対照群、およびマイトジェン陽性対照群(2.5μg/mlでPHA−ELISpot機能および細胞生存度の内部試験として使用)も各プレートに含めた。8日間のインキュベーション期間後、ELISpotプレートをdH2OおよびPBS(×3)で順次洗って展開した後、100μlのろ過済みビオチン化検出抗体(R&D Systems)のPBS溶液/1% BSAを加えた。37℃で1.5時間インキュベートした後、さらにプレートをPBS(×3)で洗い、100μlのろ過済みストレプトアビジン−AP(R&Dシステム)のPBS溶液/1% BSAを1.5時間かけて加えた(室温でインキュベート)。ストレプトアビジン−APを捨て、プレートをPBS(×4)で洗った。100μlのBCIP/NBT基質(R&D Systems)を各ウェルに加え、30分間室温でインキュベートした。dH2Oで3回前記ウェルおよび前記ウェル背面を洗うことで、スポット展開を停止した。乾燥したプレートをImmunoscan(登録商標)アナライザーでスキャンし、ウェルごとのスポット(spw)をImmunoscanRバージョン4ソフトウェアを用いて決定した。
増殖およびIL−2 ELISpotアッセイについては、刺激指数(SI)の経験的閾値が2以上(SI≧2.00)であることがすでに確立されており、この閾値以上の反応を示すサンプルを陽性とみなす(ボーダーラインのSIs≧1.90であることも強調されている)。広範にアッセイが展開されたこととこれまでの研究から、これが最小の信号対雑音閾値であり、擬陽性反応を多数検出する、またはわずかな免疫原性事象を見逃すことなく、最大限の感度とすることができることが示された。増殖(n=3)およびIL−2 ELISpotデータ(n=6)セットの両方について、陽性反応は統計的および経験的閾値から以下のように定義した。
2. 刺激指数(SI)が2以上(SI≧2.00)であり、SI=被験ウェルの平均(cpmまたはspw)/ベースライン(cpmまたはspw)。このようにして提示されたデータはSI≧2.00、p<0.05と示される。
T細胞が活性化された後、IL−2産生と増殖との間には一般に良好な関係があるが、増殖アッセイとIL−2 ELISpotアッセイは独立して解釈されてきた。アッセイ内のばらつきは再現性の対照としてKLHを用いて評価し、KLHに対してT細胞反応が陽性となる頻度を2回の別のEpiScreen(商標)アッセイで比較した。この結果は、KLH特異的T細胞反応のアッセイ内のばらつきが許容できる範囲内であり、これまでの研究と一致している(≦10%)ことを示している。
前記抗体および前記緩衝液がPBMCの生存度に与える全効果の初期評価は、EpiScreen(商標)による時間経過を伴うアッセイで使用された10例のドナーについて行った。細胞の生存度は、前記抗体の培養後7日にPBMCのトリパンブルー色素を除去して計算した。培地のみのPBMCはサンプルおよびKLH処理細胞と平均生存度が同等であったため(93〜97%)、2つの被験抗体および緩衝製剤は前記細胞の生存度に有意な影響を及ぼしていないことは明らかであった。
図24および表12は、抗体によって誘導されたCD4+T細胞について、EpiScreen(商標)による時間経過を伴うT細胞増殖アッセイで得られた結果を示している。いずれの被験抗体も増殖反応を陽性とし、前記増殖アッセイでは1例若しくはそれ以上のドナーでSI≧2.00(p<0.05)であった。ボーダーライン反応のSI≧1.90(p<0.05)であることも強調されている増殖反応陽性の範囲は、ドナーコホートの5%〜24%の範囲である(表14)。
前記増殖反応の全体的な時間から、T細胞反応で考えられるタイプ(ナイーブまたはリコール)に関する情報を提供することができる。5日目に検出されたT細胞の増殖が最大であったことは、既存のT細胞前駆体の発生頻度が高いことを示しているが、後半に増殖が最大となったことは既存のT細胞前駆体の発生頻度が低いことを示している。免疫原性の可能性は、時間経過初期のT細胞刺激と一致している可能性がある。図25は、4日間の時間経過の中で各日のサンプルに発生した陽性増殖反応数をまとめている。抗体CDR−HuCAN20G2に対するT細胞反応はほとんどが7日目および8日目に観察され、この抗体では既存のT細胞前駆体数が少ないことを示している。抗体HE−HuCAN20G2は1ドナーに反応を誘発し、これは6、7、および8日目に観察された。しかし、反応を示したドナーは1例しか検出されなかったため、抗体HE−HUCAN20G2のT細胞前駆体数について結論を出すことは難しい。
図26および表12は、2つの被験抗体による刺激後、CD4+ T細胞によるIL−2分泌を測定するIL−2 ELISpotアッセイで得られた反応を示している。増殖アッセイ同様、SI≧2.00となったドナーで陽性反応を記録し、被験抗体のspwとバックグラウンド(非投与の対照培地)との間に有意な(p<0.05)差が観察された。ボーダーラインの反応ではSI≧1.90(p<0.05)であることも強調されているすべてのサンプルで1若しくはそれ以上のドナーでIL−2 ELISpot反応が陽性となり、対応のない2サンプルのstudent t検定によりすべて有意であった(p<0.05)。すべてのPHAウェルはスポット陽性であったが、8日後、大部分のウェルに計数できないほど多くのスポットが含まれていたため、SI値はELISpotデータで用意されなかった(データ図示せず)。
前記増殖およびIL−2 ELISpotアッセイのデータは、前記ドナー集団の被験抗体いずれに対しても、陽性T細胞反応が検出されたことを示している。増殖アッセイとIL−2 ELISpotアッセイの関連性は全体的に高かったため(KLHで94%、表14)、これまでの研究同様、反応を示したドナーは、IL−2 ELISpotアッセイおよび増殖アッセイのいずれにおいても、各サンプルに陽性反応を示したドナーと定義した。表14は、IL−2 ELISpotアッセイおよび増殖アッセイ両方で前記抗体に対して陽性の反応の概要を示している。前記増殖およびIL−2 ELISpotアッセイから得られたデータの比較は、検討した抗体が、アッセイ間で一致した頻度でT細胞反応が陽性となったことを示していた。ドナー全員が前記IL−2 ELISpotアッセイでPHAに対してT細胞反応陽性を示し、ex vivo培養の細胞が機能的であることを示していた(データは図示せず)。これら2つのアッセイのデータセットを合わせた解析では、反応の全体的な頻度および大きさが抗体CDR−HuCAN20G2で高く(24%のドナーが増殖アッセイおよびELISpotアッセイの両方に反応)、抗体HE−HuCAN20G2では低い(5%のドナーが反応)ことが明らかとなった。
増殖アッセイおよびELISpotアッセイの関連性は全体的に高く、反応を示したドナーは、両アッセイの各サンプルに陽性反応を示したドナーと定義した。これら2つのアッセイのデータセットを合わせた解析からは、全体的な反応が抗体CDR−HuCAN20G2で高く(24%のドナーが両アッセイに反応)、抗体HE−HuCAN20G2では低い(5%のドナーが反応)ことが明らかである。一連の生物製剤を用いたこれまでのEpiScreen(商標)T細胞アッセイでは、前記アッセイのドナーT細胞反応の割合とクリニックで観察された免疫原性の程度との間に明らかな相関関係が示されたが、10%を超えて反応が陽性となったタンパク質治療はクリニックでの免疫原性のリスクと関連している。今回の研究結果は、EpiScreen(商標)アッセイで検討されたタンパク質治療と比較し、抗体CDR−huCAN20G2には臨床的な免疫原性のリスクがあると考えられることを示していた。対照的に、抗体HE−huCAN20G2は臨床的な免疫原性のリスクが低いと考えられる。
2つのヒト化CAN20G2抗TcdA mAbs、HE−CAN20G2、およびCDR−CAN20G2のin vivo保護効果は、低用量の抗体を検討することで、(上述の実施例8に示したとおり)マウス致死量毒素負荷モデルにおいて評価した。0日目、体重20〜30gのスイスウェブスターマウスに50ugのmAbまたは対照を投与し、休息させた。24時間後、前記マウスに致死量のTcdA(100ng)を投与した。この用量では、保護していない状態で、24時間までに90〜100%の動物が死亡する。前記マウスの臨床症状、異常、および局所および全身の疾患を14日間観察した。すべての所見を記録し、投与群ごとに生存率(%)を決定した。
図27および28に示したとおり、いずれのヒト化CAN20G2 mAbsも、毒素Aのin vivo負荷に対して保護効果があった。HE−CAN20G2は、CDA1およびCDR−CAN20G2と比較し、in vivoで優れた保護効果を示した。0.05mg/マウスの低用量では、致死量のTcdA負荷に対してCDA1(80%)およびCDR−CAN20G2(70%)を投与したマウスと比較し、HE−CAN20G2を投与したマウスの生存率が高かった(90%)。
ハムスターモデルおよびラットモデルにおいて、CDR−huCAN20G2およびHE−huCAN20G2の薬物動態試験を実施した。ハムスターの試験では、ゴールデンハムスターに50mg/kgのCDR−huCAN20G2を腹腔内注射した。注射後2時間、24時間、48時間、72時間、96時間、168時間、240時間、および336時間で採血を行った。対照サンプルは注射5日前に被験動物から、異なる時点で指標群から採血した。血液サンプルは10分間800rpmで遠心分離し、血清を得た。ラットの試験では、2群のSprague−Dawleyラットに対し、静脈内投与用に大腿静脈カテーテル(FVC)、および採血用に頸静脈カテーテル(JVC)を取り付けた。2つの抗体CDR−huCAN20G2およびHE−huCAN20G2を各群のラットに10mg/kgの用量レベルで単回IVボーラス投与を行った後、0.5mLの食塩水で洗い流した。投与前、投与後0.083、1、2、4、8、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、288、および312時間でJVCから採血した。全血(300μL)サンプルを2200×gで10分間遠心分離し、血清を単離した。
Claims (20)
- 単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを有し、前記重鎖可変領域は、それぞれ配列ID番号29、30、および31で示されるアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、およびCDR3の3つの相補性決定領域(CDR)を有し、前記軽鎖可変領域は、それぞれ配列ID番号21、22、および23で示されるアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、およびCDR3の3つのCDRを有し、前記抗体またはその抗原結合部分はクロストリジウム・ディフィシレ(C.ディフィシレ)毒素Aに特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
- 請求項1記載の抗体またはその抗原結合部分において、前記抗体またはその抗原結合部分の解離定数(KD)は8×10−10M未満である、抗体またはその抗原結合部分。
- 請求項1または2記載の抗体またはその抗原結合部分において、前記抗体またはその抗原結合部分はヒト化型またはキメラ型である、抗体またはその抗原結合部分。
- 請求項1〜3のいずれか1つに記載の抗体またはその抗原結合部分において、前記重鎖可変領域が配列ID番号89で示されるアミノ酸配列を有し、且つ前記軽鎖可変領域が配列ID番号91で示されるアミノ酸配列を有するものである、抗体またはその抗原結合部分。
- 請求項1〜3のいずれか1つに記載の抗体またはその抗原結合部分において、前記重鎖可変領域が配列ID番号93で示されるアミノ酸配列を有し、且つ前記軽鎖可変領域が配列ID番号95で示されるアミノ酸配列を有するものである、抗体またはその抗原結合部分。
- 請求項1〜5のいずれか1つに記載の抗体またはその抗原結合部分において、前記抗体またはその抗原結合部分は、(a)免疫グロブリン分子全体、(b)scFv、(c)Fabフラグメント、(d)F(ab’)2、および(e)ジスルフィド結合Fvから成る群から選択されるものである、抗体またはその抗原結合部分。
- 請求項1〜6のいずれか1つに記載の抗体またはその抗原結合部分において、前記抗体またはその抗原結合部分は、(a)IgG定常領域、および(b)IgA定常領域から成る群から選択される少なくとも1つの定常領域を有するものである、抗体またはその抗原結合部分。
- 請求項1〜7のいずれか1つに記載の抗体またはその抗原結合部分において、前記抗体またはその抗原結合部分はC.ディフィシレ毒素Aのフラグメント4に結合するものである、抗体またはその抗原結合部分。
- 請求項1記載の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域は、配列ID番号28で示されるアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域は、配列ID番号20で示されるアミノ酸配列を有する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
- ATCC受託番号がPTA−13175であるCAN20G2で指定されるハイブリドーマによって産生される抗体。
- ATCC受託番号がPTA−13175であるCAN20G2で指定されるハイブリドーマ。
- 請求項1〜10のいずれか1つに記載の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、in vivo毒素A負荷実験において、哺乳類に100ng以上のC.ディフィシレ毒素Aを曝露する24時間前に、8mg/kg体重〜13mg/kg体重の範囲の用量で前記抗体またはその抗原結合部分を哺乳類に投与する場合、前記哺乳類の生存確率は7日以内で80%以上である、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
- 請求項1〜10のいずれか1つに記載の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、前記抗体またはその抗原結合部分は、in vitro中和試験において、4μM〜17μMの範囲の濃度で、150ng/mlのC.ディフィシレ毒素Aの40%以上を中和するものである、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
- 請求項1〜10のいずれか1つに記載の抗体または抗原結合部分と、少なくとも1つの薬学的に許容される担体とを有する組成物。
- 請求項1〜10のいずれか1つに記載の抗体または抗原結合部分を有する、C.ディフィシレ関連疾患を治療するための医薬組成物。
- 請求項15記載の医薬組成物において、前記抗体またはその抗原結合部分が静脈内、皮下、筋肉内、または経皮的に投与されるものである、医薬組成物。
- 前記医薬組成物が第2の薬物をさらに有する、請求項15記載の医薬組成物。
- 請求項17記載の医薬組成物において、前記第2の薬物は異なる抗体またはそのフラグメントである、医薬組成物。
- 請求項17記載の医薬組成物において、前記第2の薬物は抗生物質である、医薬組成物。
- 請求項19記載の医薬組成物において、前記抗生物質がバンコマイシン、メトロニダゾール、またはフィダキソマイシンである、医薬組成物。
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