BR112019023855B1 - Proteínas de ligação à mesotelina - Google Patents

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Bryan D. Lemon
Richard J. Austin
Robert B. Dubridge
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Abstract

a invenção refere-se a proteína de ligação msln tendo afinidades de ligação melhoradas e uma melhor capacidade para mediar a eliminação de linfócitos de células de cancro dependentes de t que expressam mesotelina. a invenção refere-se a composições farmacêuticas que compreendem e métodos de proteínas de ligação usando tais formulações.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA
[0001] Este pedido reivindica o benefício dos Pedidos Provisórios US Nos. 62/505.719, depositado em 12 de maio de 2017 e 62/657.417, depositado em 13 de abril de 2018, cada incorporado por referência aqui em sua totalidade.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência que foi apresentada eletronicamente em formato ASCII sendo aqui incorporada por referência em sua totalidade. A dita cópia ASCII, criada em 11 de maio de 2018, é denominada 47517-719_601_SL.txt e tem 145.039 bytes de tamanho.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
[0003] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são aqui incorporados por referência na mesma extensão como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporada por referência e como especificado em sua totalidade.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0004] A presente divulgação provê proteínas de ligação à mesotelina (MSLN) que podem ser usadas para diagnosticar e tratar indicações correlacionadas com a expressão de MSLN. Mesotelina (MSLN) é um antígeno de tumor ligado à membrana ligada em GPI. MSLN são cânceres superexpressados ovariano, pancreático, pulmonar e mama triplo-negativo. Expressão normal de tecido de MSLN é restrita às camadas mesoteliais de célula única que forram as cavidades pleural, pericárdica e peritoneal. Superexpressão de MSLN está associada a um prognóstico ruim em adenocarcinoma de pulmão e câncer de mama triplo negativo. MSLN tem sido usada como antígeno de câncer para várias modalidades, incluindo imunotoxinas, vacinas, conjugados de anticorpo-fármaco e células CAR-T. Sinais iniciais de eficácia clínica validaram MSLN como um alvo, mas as terapias com eficácia melhorada são necessárias para tratar cânceres expressando MSLN.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0005] Uma modalidade provê uma proteína de ligação à mesotelina de domínio único, em que dita proteína compreende uma ou mais regiões conservadas compreendendo uma sequência idêntica a ou compreendendo uma ou mais substituições de resíduo de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 41, 42, 43, ou 44. Em algumas modalidades, dita proteína compreende uma região conservada compreendendo uma sequência idêntica a ou compreendendo uma ou mais substituições de resíduo de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 41. Em algumas modalidades, dita proteína compreende uma região conservada compreendendo uma sequência idêntica a ou compreendendo uma ou mais substituições de resíduo de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 42. Em algumas modalidades, dita proteína compreende uma região conservada compreendendo uma sequência idêntica a ou compreendendo uma ou mais substituições de resíduo de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 43. Em algumas modalidades, dita proteína compreende uma região conservada compreendendo uma sequência idêntica a ou compreendendo uma ou mais substituições de resíduo de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 44. Em algumas modalidades, dita proteína compreende (i) uma extensão de aminoácidos correspondendo a SEQ ID NO: 41; (ii) uma extensão de aminoácidos correspondendo a SEQ ID NO: 42; (iii) uma extensão de aminoácidos correspondendo a SEQ ID NO: 43; e (iv) uma extensão de aminoácidos correspondendo a SEQ ID NO: 44.
[0006] Uma modalidade provê uma proteína de ligação à mesotelina de domínio único, em que dita proteína compreende a seguinte fórmula: f1-r1-f2-r2-f3-r3-f4 em que, r1 é idêntico a ou compreende uma ou mais substituições de resíduo de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 51; r2 é idêntico a ou compreende uma ou mais substituições de resíduo de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 52; e r3 é idêntico a ou compreende uma ou mais substituições de resíduo de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 53; e em que f1, f2, f3 e f4 são resíduos de arcabouço. Em algumas modalidades, dita proteína compreende uma sequência que é pelo menos 80% idêntica a uma sequência selecionada dentre o grupo consistindo de SEQ ID NOs: 1-29, 30-40, 58, e 60-62. Em algumas modalidades, dita proteína compreende uma ou mais modificações que resultam em humanização da proteína de ligação. Em algumas modalidades, a modificação compreende substituições, adições, ou deleções de resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, dita proteína compreende 111 aminoácidos a 124 aminoácidos. Em algumas modalidades, dita proteína compreende um domínio VHH derivado de uma fonte não humana. Em algumas modalidades, dita proteína compreende um domínio VHH de lhama. Em algumas modalidades, dito epítopo está localizado em região I, compreendendo resíduos de aminoácidos 296-390 de SEQ ID NO: 57, região II compreendendo resíduo de aminoácidos 391-486 de SEQ ID NO: 57, ou região III compreendendo resíduos de aminoácidos 487-598 de SEQ ID NO: 57.
[0007] Uma modalidade provê uma proteína de ligação à mesotelina de domínio único, em que dita proteína compreende uma ou mais regiões conservadas compreendendo uma sequência idêntica a ou compreendendo uma ou mais substituições de resíduo de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 45, 46, 47, 48, 49, ou 50. Em algumas modalidades, dita proteína compreende uma região conservada compreendendo uma sequência idêntica a ou compreendendo uma ou mais substituições de resíduo de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 45. Em algumas modalidades, dita proteína compreende uma região conservada compreendendo uma sequência idêntica a ou compreendendo uma ou mais substituições de resíduo de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 46. Em algumas modalidades, dita proteína compreende uma região conservada compreendendo uma sequência idêntica a ou compreendendo uma ou mais substituições de resíduo de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 47. Em algumas modalidades, dita proteína compreende uma região conservada compreendendo uma sequência idêntica a ou compreendendo uma ou mais substituições de resíduo de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 48. Em algumas modalidades, dita proteína compreende uma região conservada compreendendo uma sequência idêntica a ou compreendendo uma ou mais substituições de resíduo de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 49. Em algumas modalidades, dita proteína compreende uma região conservada compreendendo uma sequência idêntica a ou compreendendo uma ou mais substituições de resíduo de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 50. Em algumas modalidades, dita proteína compreende (i) uma extensão de aminoácidos correspondendo a SEQ ID NO: 45; (ii) uma extensão de aminoácidos correspondendo a SEQ ID NO: 46; (iii) uma extensão de aminoácidos correspondendo a SEQ ID NO: 47, (iv) uma extensão de aminoácidos correspondendo a SEQ ID NO: 48, (v) uma extensão de aminoácidos correspondendo a SEQ ID NO: 49, e (vi) uma extensão de aminoácidos correspondendo a SEQ ID NO: 50.
[0008] Uma modalidade provê uma proteína de ligação à mesotelina de domínio único, em que dita proteína compreende a seguinte fórmula: f1-r1-f2-r2-f3-r3-f4 em que, r1 é idêntico a ou compreende uma ou mais substituições de resíduo de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 54; r2 é idêntico a ou compreende uma ou mais substituições de resíduo de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 55; e r3 é idêntico a ou compreende uma ou mais substituições de resíduo de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 56; e em que f1, f2, f3 e f4 são resíduos de arcabouço. Em algumas modalidades, dita proteína compreende uma sequência que é pelo menos 80% idêntica a uma sequência selecionada dentre o grupo consistindo de SEQ ID Nos: 3040, 58, e 60-62. Em algumas modalidades, dita proteína compreende 111 aminoácidos a 119 aminoácidos. Em algumas modalidades, dita proteína compreende um domínio VHH derivado de uma fonte não humana. Em algumas modalidades, dita proteína compreende um domínio VHH de lhama. Em algumas modalidades, dita proteína se liga a uma proteína de mesotelina humana compreendendo a sequência especificada como SEQ ID NO: 57. Em algumas modalidades, dita proteína se liga a um epítopo de mesotelina, em que dito epítopo está localizado em região I, compreendendo resíduos de aminoácidos 296-390 de SEQ ID NO: 57, região II compreendendo resíduo de aminoácidos 391-486 de SEQ ID NO: 57, ou região III compreendendo resíduos de aminoácidos 487-598 de SEQ ID NO: 57. Em algumas modalidades, dita proteína de ligação é um anticorpo quimérico, ou um anticorpo humanizado. Em algumas modalidades, dita proteína de ligação é um anticorpo de domínio único. Em algumas modalidades, dita proteína de ligação é um anticorpo de domínio único humanizado.
[0009] Uma modalidade provê uma proteína de ligação à mesotelina de domínio único, em que dita proteína compreende uma ou mais CDRs selecionadas dentre SEQ ID Nos.: 51-56 e 63-179. Em algumas modalidades, dita proteína compreende uma CDR1 compreendendo uma sequência especificada em qualquer uma de SEQ ID Nos.: 51, 54, e 63101. Em algumas modalidades, dita proteína compreende uma CDR2 compreendendo uma sequência especificada em qualquer uma de SEQ ID Nos.: 52, 55, e 102-140. Em algumas modalidades, dita proteína compreende uma CDR3 compreendendo uma sequência especificada em qualquer uma de SEQ ID Nos.: 53, 56, e 141-179. Em algumas modalidades, dita proteína compreende uma região de arcabouço 1 (f1) compreendendo uma sequência como especificada em qualquer uma das SEQ ID Nos.: 180-218. Em algumas modalidades, dita proteína compreende uma região de arcabouço 2 (f2) compreendendo uma sequência como especificada em qualquer uma das SEQ ID Nos.: 219-257. Em algumas modalidades, dita proteína compreende uma região de arcabouço 3 (f3) compreendendo uma sequência como especificada em qualquer uma das SEQ ID Nos.: 258-296. Em algumas modalidades, dita proteína compreende uma região de arcabouço 4 (f4) compreendendo uma sequência como especificada em qualquer uma das SEQ ID Nos.: 297-335. Em algumas modalidades, dita proteína compreende uma sequência de aminoácidos como especificada em qualquer uma das SEQ ID Nos.: 1-40, e 58.
[0010] Uma modalidade provê um polinucleotídeo codificando uma proteína de ligação à mesotelina de domínio único de acordo com qualquer uma das modalidades acima. Uma modalidade adicional provê um vetor compreendendo o polinucleotídeo da modalidade acima. Uma modalidade adicional provê uma célula hospedeira transformada com o vetor de acordo com a modalidade acima.
[0011] Uma modalidade provê a composição farmacêutica compreendendo (i) uma proteína de ligação à mesotelina de domínio único de acordo com qualquer uma das modalidades acima, o polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das modalidades acima, o vetor de acordo com qualquer uma das modalidades acima, ou a célula hospedeira de acordo com qualquer uma das modalidades acima, e (ii) um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0012] Uma modalidade adicional provê a processo para a produção de uma proteína de ligação à mesotelina de domínio único de acordo com qualquer uma das modalidades acima, dito processo compreendendo cultivar um hospedeiro transformado ou transfectado com um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína de ligação à mesotelina de domínio único de acordo com qualquer uma das modalidades acima sob condições permitindo a expressão da proteína de ligação à mesotelina e recuperar e purificar a proteína produzida a partir da cultura.
[0013] Uma modalidade provê um método para o tratamento ou melhora de uma doença proliferativa, ou uma doença tumoral, compreendendo a administração da proteína de ligação à mesotelina conforme qualquer uma das modalidades acimas, a um indivíduo em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, o indivíduo é humano. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente administração de um agente em combinação com a proteína de ligação à mesotelina de domínio único de acordo com qualquer uma das modalidades acima. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à mesotelina de domínio único seletivamente se liga a células de tumor expressando mesotelina. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à mesotelina de domínio único medeia Morte de célula T de células de tumor expressando mesotelina. Em algumas modalidades, o doença de tumor compreende uma doença de tumor sólido. Em algumas modalidades, a doença de tumor sólido compreende mesotelioma, câncer de pulmão, câncer gástrico câncer ovariano, ou câncer de mama negativo triplo. Em algumas modalidades, a doença de tumor sólido é metastática.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0014] As novas características da invenção são apresentadas com particularidade nas reivindicações em anexo. Uma melhor compreensão das características e vantagens da presente invenção será obtida por referência à seguinte descrição detalhada que especifica modalidades ilustrativas, nas quais os princípios da invenção são utilizados, e nos desenhos em anexo:
[0015] Figura 1 ilustra a efetividade de moléculas triespecíficas alvejando MSLN exemplares (2A2 e 2A4), contendo uma proteína de ligação anti-MSLN de acordo com a presente divulgação, em morte de células OVCAR8 que expressam a proteína MSLN alvo.
[0016] Figura 2 ilustra que uma proteína de ligação a antígeno triespecífica de alvo MSLN contendo um domínio de ligação à MSLN exemplar desta divulgação (MH6T) dirige as células T de cinco doadores (doador 02; doador 86; doador 41; doador 81; e doador 35) para matar células Caov3. A figura também ilustra que uma proteína triespecífica de controle (GFP TriTAC) não dirige células T a partir dos cinco doadores (doador 02; doador 86; doador 41; doador 81; e doador 35) para matar células Caov3.
[0017] Figura 3 ilustra que uma proteína de ligação a antígeno triespecífica de alvo MSLN contendo um domínio de ligação à MSLN exemplar desta divulgação (MH6T) dirige as células T de cinco doadores (doador 02; doador 86; doador 41; doador 81; e doador 35) para matar OVCAR3 células. A figura também ilustra que uma proteína triespecífica de controle (GFP TriTAC) não dirige células T dos cinco doadores (doador 02; doador 86; doador 41; doador 81; e doador 35) para matar células OVCAR3.
[0018] Figura 4 ilustra que uma proteína de ligação a antígeno triespecífica de alvo MSLN contendo um domínio de ligação à MSLN exemplar desta divulgação (MH6T) foi capaz de dirigir as células T de um doador saudável para matar células que expressam MSLN (células OVCAR3; células Caov4; células OVCAR3; e células OVCAR8). A figura também ilustra que a proteína de ligação a antígeno triespecífica de alvo MSLN contendo um domínio de ligação à MSLN exemplar desta divulgação (MH6T) não foi capaz de dirigir células T do doador saudável para matar células que não expressam MSLN (células MDAPCa2b; e células NCI-H510A).
[0019] Figura 5 ilustra que uma proteína de ligação a antígeno triespecífica de alvo MSLN contendo um domínio de ligação à MSLN exemplar desta divulgação (MH6T) foi capaz de dirigir células T de macacos cinomolgos para matar células de câncer ovariano humano (células OVCAR3; células Caov3). A figura também ilustra que uma proteína triespecífica de controle (GFP TriTAC) não foi capaz de dirigir as células T dos macacos cinomolgos para matar linhagens de células de câncer ovariano humano (células OVCAR3; células Caov3).
[0020] Figura 6 ilustra que uma proteína de ligação a antígeno triespecífica de alvo MSLN contendo um domínio de ligação à MSLN exemplar desta divulgação (MH6T) foi capaz de dirigir a morte de células de mesotelioma NCI-H2052 expressando MSLN por células T, na presença ou ausência de albumina de soro humano (HSA).
[0021] Figura 7 ilustra que uma proteína de ligação a antígeno triespecífica de alvo MSLN contendo um domínio de ligação à MSLN exemplar desta divulgação (MH6T) foi capaz de ativar células T de quatro doadores saudáveis (doador 2; doador 86; doador 35; e doador 81), como demonstrado por secreção de TNF-α das células T, na presença de células Caov4 expressando MSLN.
[0022] Figura 8 ilustra que uma proteína de ligação a antígeno triespecífica de alvo MSLN contendo um domínio de ligação à MSLN exemplar desta divulgação (MH6T) foi capaz de ativar células T de quatro doadores saudáveis (doador 2; doador 86; doador 35; e doador 81), como demonstrado por ativação de expressão de CD69 nas células T, na presença de células OVCAR8 expressando MSLN.
[0023] Figura 9 ilustra ligação de uma proteína de ligação a antígeno triespecífica de alvo MSLN contendo um domínio de ligação à MSLN exemplar desta divulgação (MH6T) para linhagens de células expressando MSLN ou linhagens de células não expressando MSLN. Figura 9A mostra ligação com células expressando MSLN (células Caov3-painel à esquerda de topo; células Caov4-painel à direita de topo; células OVCAR3-painel à esquerda de fundo; células OVCAR8- painel à direita de fundo) ligadas à proteína de ligação a antígeno triespecífica de alvo MSLN contendo um domínio de ligação à MSLN exemplar desta divulgação (MH6T); Figura 9A ilustra adicionalmente a falta de ligação de uma proteína triespecífica de controle (GFP TriTAC) para as mesmas linhagens de células. Figura 9B mostra a falta de ligação de ambas a proteína de ligação a antígeno triespecífica de alvo MSLN contendo um domínio de ligação à MSLN exemplar desta divulgação (MH6T) e de GFP TriTAC a linhagens de células não expressando MSLN (células MDCA2b-painel à esquerda; células NCI-H510A-painel à direita).
[0024] Figura 10 ilustra ligação de uma proteína de ligação a antígeno triespecífica de alvo MSLN contendo um domínio de ligação à MSLN exemplar desta divulgação (MH6T) a células T de quatro doadores saudáveis (doador 2-painel à esquerda de topo; doador 35-painel à direita de topo; doador 41-painel à esquerda de fundo; doador 81-painel à direita de fundo).
[0025] Figura 11 ilustra que uma proteína de ligação a antígeno triespecífica de alvo MSLN contendo um domínio de ligação à MSLN exemplar desta divulgação (MH6T) foi capaz de inibir o crescimento de tumor em camundongos NCG implantado com células NCI-H292 expressando MSLN.
[0026] Figura 12 ilustra perfil farmacocinético de uma proteína de ligação a antígeno triespecífica de alvo MSLN contendo um domínio de ligação à MSLN exemplar desta divulgação (MH6T). Os níveis de soro da proteína de ligação a antígeno triespecífica de alvo MSLN contendo um domínio de ligação à MSLN exemplar desta divulgação (MH6T), em vários pontos no tempo após a injeção em dois macacos cinomolgos, são mostrados no gráfico.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0027] Embora as modalidades preferidas da presente invenção tenham sido mostradas e descritas aqui, será óbvio para os versados na técnica que tais modalidades são dadas apenas a título de exemplo. Numerosas variações, alterações e substituições ocorrerão agora para os especialistas na técnica sem sair da invenção. Deve ser entendido que várias alternativas para as modalidades da invenção aqui descritas podem ser empregadas na prática da invenção. Pretende-se que as seguintes reivindicações definam o escopo da invenção e que métodos e estruturas dentro do escopo dessas reivindicações e seus equivalentes sejam assim cobertos.
Determinadas definições
[0028] A terminologia usada aqui tem o objetivo de descrever apenas casos particulares e não se destina a ser limitativa. Como usado aqui, as formas no singular “um" e "uma" e "o", “a” também pretendem incluir as formas no plural, a salvo se o contexto indicar claramente o contrário. Além disso, na medida em que os termos “incluindo”, “inclui”, “tendo”, “tem”, “com” ou variantes dos mesmos são usados na descrição detalhada e/ou nas reivindicações, esses termos se destinam a ser inclusivos de modo similar ao termo "compreendendo".
[0029] O termo "cerca de" ou "aproximadamente" significa dentro de uma faixa de erro aceitável para o valor particular como determinado por um versado na técnica, o que dependerá em parte de como o valor é medido ou determinado, por exemplo, as limitações do sistema de medição. Por exemplo, "cerca de" pode significar dentro de 1 ou mais de 1 desvio padrão, de acordo com a prática no valor dado. Onde valores particulares são descritos no pedido e nas reivindicações, salvo indicado de outra forma, o termo "cerca de" deve ser assumido como significando uma faixa de erro aceitável para o valor particular.
[0030] Os termos "indivíduo", "paciente" ou "indivíduo" são usados de forma intercambiável. Nenhum dos termos exige ou está limitado à situação caracterizada pela supervisão (por exemplo, constante ou intermitente) de um profissional de saúde (por exemplo, um médico, uma enfermeira registrada, um profissional de enfermagem, um auxiliar médico, um assistente médico, uma pessoa ordenada ou um trabalhador de hospício).
[0031] O termo resíduos de “arcabouço” ou “FR” (ou regiões) refere-se a resíduos de domínio variável diferentes de uma CDR ou resíduos de região hipervariável, como aqui definido. Um “arcabouço de consenso humano” é um arcabouço que representa o resíduo de aminoácido de ocorrência a mais comum em uma seleção de sequências de arcabouço VL ou VH de imunoglobulina humana.
[0032] Como usado aqui, "região variável" ou "domínio variável" refere-se ao fato de que certas porções dos domínios variáveis diferem extensivamente em sequência entre os anticorpos e são usadas na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para seu antígeno particular. No entanto, a variabilidade não é distribuída uniformemente através dos domínios variáveis de anticorpos. Ela está concentrada em três segmentos chamados regiões determinantes de complementaridade (CDRs) ou regiões hipervariáveis, tanto nos domínios variáveis da cadeia leve como de cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são chamadas de arcabouço (FR). Os domínios variáveis das cadeias nativas pesada e leve compreendem quatro regiões FR, adotando amplamente uma configuração de folha β, conectada por três CDRs, que formam alças conectando e, em alguns casos formando parte de, da estrutura de folha β. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas em proximidade íntima pelas regiões FR e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação a antígeno de anticorpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,), 5a. Edição, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)). Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, como participação do anticorpo em toxicidade celular dependente de anticorpo. "Numeração de resíduo de domínio variável como em Kabat" ou "numeração de posição de aminoácido como em Kabat", e variações das mesmas, refere-se ao sistema de numeração usado para domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve da compilação de anticorpos em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). Usando este sistema de numeração, a sequência de aminoácido linear real pode conter menos ou aminoácidos adicionais correspondendo a um encurtamento de, ou inserção em, um FR ou CDR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável da cadeia pesada pode incluir um inserto de aminoácido único (resíduo 52a de acordo com Kabat) após resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b e 82c, etc, de acordo com Kabat) após o resíduo 82 FR de cadeia pesada. A numeração Kabat de resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo por alinhamento em regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada Kabat "padrão". Não se pretende que as CDRs da presente divulgação correspondam necessariamente à convenção de numeração de Kabat.
[0033] Como usado aqui, o termo "Porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoácido" com relação a uma sequência é definido como a porcentagem de resíduos de aminoácido em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência específica, após alinhamento das sequências e introdução de lacunas, se necessário, para alcançar a identidade de sequência percentual máxima, e não considerar quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade de sequência. Alinhamento para fins de determinação da porcentagem de identidade de sequência de aminoácido pode ser alcançado de vários modos que estão dentro da especialidade na técnica, por exemplo, usando softwares de computador disponíveis publicamente, como os softwares EMBOSS MATCHER, EMBOSS WATER, EMBOSS STRETCHER, EMBOSS NEEDLE, EMBOSS LALIGN, BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os versados na técnica podem determinar parâmetros apropriados para medir alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências sendo comparadas.
[0034] Como usado aqui, “meio-tempo de eliminação” é usado no sentido comum, como é descrito em Goodman and Gillman's o Pharmaceutical Basis of Therapeutics 21-25 (Alfred Goodman Gilman, Louis S. Goodman, e Alfred Gilman, eds., 6a. ed. 1980). Brevemente, o termo pretende englobar uma medição quantitativa do curso de tempo de eliminação do fármaco. A eliminação da maioria dos fármacos é exponencial (isto é, segue cinética de primeira ordem), uma vez que as concentrações de fármacos geralmente não se aproximam daquelas necessárias para saturação do processo de eliminação. A taxa de um processo exponencial pode ser expressa por sua constante de taxa, k, que expressa a mudança fracional por unidade de tempo, ou por seu meio- tempo, t1/2 do tempo requerido para a conclusão de 50% do processo. As unidades dessas duas constantes são tempo-1 e tempo, respectivamente. Uma constante de taxa de primeira ordem e meio-tempo da reação são simplesmente relacionados (kxtx/2=0,6 93) e podem ser trocados de acordo. Como a cinética de eliminação de primeira ordem determina que uma fração constante do fármaco é perdida por unidade de tempo, um gráfico do log da concentração do fármaco versus tempo é linear o tempo todo após a fase inicial de distribuição (isto é, após a absorção e a distribuição do fármaco estarem completas). O meio-tempo para eliminação do fármaco pode ser determinado com precisão a partir de tal gráfico.
[0035] Como aqui usado, o termo "afinidade de ligação" refere-se à afinidade das proteínas descritas na divulgação para seus alvos de ligação e é expressado numericamente usando valores "Kd". Se duas ou mais proteínas são indicadas como tendo afinidades de ligação comparáveis com seus alvos de ligação, então, os valores de Kd para ligação das respectivas proteínas em direção a seus alvos de ligação, estão dentro de ± 2 vezes um do outro. Se duas ou mais proteínas são indicadas como tendo afinidades de ligação comparáveis em direção ao único alvo de ligação, então, os valores de Kd para ligação das respectivas proteínas em direção ao referido alvo de ligação único, estão dentro de ± 2 vezes um do outro. Se uma proteína for indicada para ligar dois ou mais alvos com afinidades de ligação comparáveis, então, os valores de Kd para ligação de referida proteína aos dois ou mais alvos estão dentro de ± 2 vezes um do outro. Em geral, um valor Kd mais alto corresponde a uma ligação mais fraca. Em algumas modalidades, o "Kd" é medido por um ensaio de ligação a antígeno radiomarcado (RIA) ou ensaios de ressonância plasmônica de superfície usando um BIAcore™-2000 ou um BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.). Em algumas modalidades, um “taxa ‘ligada’” ou “taxa de associação” ou “proporção de associação” ou “kon” e uma “taxa ‘desligada’” ou “taxa de dissociação” ou “proporção de dissociação” ou “koff” são também determinados com a técnica de ressonância plasmônica de superfície usando um BIAcore™-2000 ou um BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.). Em modalidades adicionais, “Kd”, “kon”, e “koff” são medidos usando OCTET® Systems (Pall Life Sciences). Em um método exemplar para medir a afinidade de ligação usando sistemas OCTET®, o ligando, por exemplo, MSLN biotinilado de humano ou cinomolgo, é imobilizado na superfície de ponta do sensor capilar de estreptavidina OCTET®, cujas pontas de estreptavidina são então ativadas de acordo com as instruções do fabricante usando cerca de 20-50 μg/ml MSLN proteína de humano ou cinomolgo. Uma solução de PBS/Caseína é também introduzida como um agente de bloqueio. Para as medições da cinética de associação, variantes da proteína de ligação à MSLN são introduzidas a uma a concentração na faixa de cerca de 10 ng/mL a cerca de 100 μg/mL, cerca de 50 ng/mL a cerca de 5 μg/mL, ou cerca de 2 ng/mL a cerca de 20 μg/mL. Em algumas modalidades, o proteínas de domínio único de ligação à MSLN são usados a uma concentração na faixa de cerca de 2 ng/mL a cerca de 20 μg/mL. A dissociação completa é observada no caso do tampão de teste de controle negativo, sem as proteínas de ligação. Os parâmetros cinéticos das reações de ligação são então determinados usando uma ferramenta apropriada por exemplo, software ForteBio.
[0036] São descritas aqui as proteínas de ligação à MSLN, composições farmacêuticas assim como ácidos nucleicos, vetores de expressão recombinantes e células hospedeiras para obter tais proteínas de ligação à MSLN. Também são providos métodos de utilização das proteínas de ligação à MSLN descritas na prevenção, e/ou tratamento de doenças, condições e distúrbios. As proteínas de ligação à MSLN são capazes de especificamente se ligar a MSLN. Em algumas modalidades, as proteínas de ligação à MSLN incluem domínios adicionais, tal como um domínio de ligação a CD3 e um domínio de ligação a albumina. Mesotelina (MSLN) e seu papel em doenças de tumor
[0037] São contempladas aqui as proteínas de ligação à mesotelina. Mesotelina é uma glicoproteína presente sobre a superfície das células do forro mesotelial das cavidades corporais peritoneal, pleural e pericardial. O gene de mesotelina (MSLN) codifica uma proteína de precursor de 71 kilodaltons (kDa) que é processada em uma proteína de 40- kDa chamada mesotelina, que é uma glicoproteína ancorada em glicosil-fosfatidilinositol presente sobre a superfície celular (Chang, et al, Proc Natl Acad Sci USA (1996) 93:136-40). O cDNA de mesotelina foi clonado a partir de uma biblioteca preparada a partir da linhagem celular HPC- Y5 (Kojima et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:21984-21990). O cDNA também foi clonado usando o anticorpo monoclonal K1, que reconhece mesoteliomas (Chang e Pastan (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:136-40). Mesotelina é um antígeno de diferenciação cuja expressão em tecidos normais humanos é limitada a células mesoteliais forrando a cavidade corporal, como a pleura, pericárdio e peritôneo. Mesotelina é também altamente expressada em vários cânceres humanos diferentes, incluindo mesoteliomas, adenocarcinomas pancreáticos, cânceres ovarianos, e adenocarcinomas do estômago e pulmão. (Hassan, et al., Eur J Cancer (2008) 44:46-53) (Ordonez, Am J Surg Pathol (2003) 27:1418-28; Ho, et al., Clin Cancer Res (2007) 13:1571-5). Mesotelina é superexpressada em uma grande maioria de adenocarcinomas pancreáticos primários com expressão rara e fraca vista em tecido pancreático benigno. Argani P, et al. Clin Cancer Res. 2001; 7(12):3862-3868. Mesotelioma pleural maligna epitelial (MPM) expressa universalmente mesotelina, enquanto MPM sarcomatóide provavelmente não expressa mesotelina. A maioria dos carcinomas ovarianos epiteliais serosos e os carcinomas peritoneais primários relacionados expressam mesotelina.
[0038] Mesotelina é também derramada de células de tumor como uma forma solúvel da proteína, como comparada com a versão ligada à membrana nativa (Hellstrom, et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev (2006) 15:1014-20; Ho, et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev (2006) 15:1751). Estruturalmente, mesotelina é expressada na superfície celular como um polipeptídeo precursor de 60 kDa, que é proteoliticamente processado em um componente derramado de 31 kDa (correspondendo a MPF) e um componente ligado a membrana de 40 kDa (Hassan et al. (2004) Clin. Cancer. Res. 10:3937-3942). Mesotelina foi demonstrada como interagindo com CA125 (também conhecido como MUC-16), uma glicoproteína tipo mucina presente sobre a superfície de células de tumor que foram previamente identificada como um antígeno de câncer ovariano. Ademais, ligação de CA125 a mesotelina ligada à membrana medeia a adesão celular heterotípica e CA125 e mesotelina são co-expressadas em adenocarcinoma ovariano de tipo avançado (Rump, A. et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:9190-9198). Expressão de mesotelina no forro do peritônio está correlacionada com o sítio preferido de formação de metástase de câncer ovariano e a ligação a mesotelina-CA125 é pensada como facilitando a metástase peritoneal de tumores ovarianos (Gubbels, J. A. et al. (2006) Mol. Cancer. 5:50).
[0039] Mesotelina é um alvo de uma resposta imune natural em câncer ovariano, e foi proposta como sendo um alvo para imunoterapia de câncer. Bracci L, et al. Clin Cancer Res. 2007; 13(2 Pt 1):644-653; Moschella F, et al. Cancer Res. 2011; 71(10):3528-3539; Gross G, et al. FASEB J. 1992; 6(15):3370-3378; Sadelain M, et al. Nat Rev Cancer. 2003; 3(1):35-45; Muul L M, et al. Blood. 2003; 101(7):2563-2569; Yee C, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99(25):16168-16173. A presença de CTLs mesotelina- específicos em pacientes com câncer pancreático está correlacionado com sobrevivência global. Thomas A M, et al. J Exp Med. 2004; 200:297-306. Além disso, Pastan e colaboradores usaram fragmentos de anticorpo solúvel de um anticorpo anti-mesotelina conjugado a imunotoxinas para tratar pacientes com câncer com tumores positivos para mesotelina. Essa abordagem demonstrou segurança apropriada e alguma atividade clínica no câncer pancreático. Hassan R, et al. Cancer Immun. 2007; 7:20 e Hassan R, et al. Clin Cancer Res. 2007; 13(17):5144-5149. No câncer ovariano, essa estratégia terapêutica produziu uma resposta menor pelos critérios RECIST e doença estável em um segundo paciente que também apresentou resolução completa de seus ascites.
[0040] Mesotelina também pode ser usada como um marcador para diagnóstico e prognóstico de certos tipos de câncer, porque quantidades de traço de mesotelina podem ser detectadas no sangue de alguns pacientes com câncer positivo para mesotelina (Cristaudo et al., Clin. Cancer Res. 13: 5076-5081, 2007). Foi relatado que mesotelina pode ser liberada no soro através da deleção em seu término carboxila ou por clivagem proteolítica de sua forma ligada à membrana (Hassan et al., Clin. Cancer Res. 10: 3937-3942, 2004). Um aumento na forma solúvel de mesotelina foi detectável vários anos antes da ocorrência de mesoteliomas malignos entre trabalhadores expostos ao amianto (Creaney e Robinson, Hematol. Oncol. Clin. North. Am. 19: 1025-1040, 2005). Além disso, pacientes com câncer ovariano, pancreático e pulmonar também apresentam mesotelina solúvel elevada no soro (Cristaudo et al., Clin. Cancer Res. 13: 5076-5081, 2007; Hassan et al., Clin. Cancer Res. 12: 447 - 453, 2006; Croso et al., Cancer Detect. Prev. 30: 180-187, 2006). Consequentemente, a mesotelina é um alvo apropriado para métodos de prevenção ou tratamento de doenças e existe uma necessidade para anticorpos eficazes específicos para mesotelina.
[0041] Foi demonstrado que a mesotelina madura de superfície celular compreende três domínios distintos, ou seja, regiões I (compreendendo resíduos 296-390), II (compreendendo resíduos 391-486) e III (compreendendo resíduos 487-598). (Tang et al., A human single-domain antibody elicits potent antitumor activity by targeting an epitope in mesothelin close to o cancer cell surface, Mol. Can. Therapeutics, 12(4): 416-426, 2013).
[0042] Os primeiros anticorpos gerados contra mesotelina para intervenção terapêutica foram projetados para interferir na interação entre mesotelina e CA-125. Exibição de fagos identificou Fv SS, que foi otimizado por afinidade e usado para gerar uma imunotoxina recombinante alvejando mesotelina, SS1P. O anticorpo MORAb-009 amatuximab, que também usa SS1, reconhece um epítopo não linear nos 64 aminoácidos amino-terminais, dentro da região I. O SS1 Fv também foi usado para gerar células T modificadas geneticamente por receptor de antígeno quimérico. Recentemente, novos anticorpos anti-mesotelina foram relatados que reconhecem outras regiões da proteína mesotelina.
[0043] Ainda é necessário ter opções adicionais disponíveis para o tratamento de doenças de tumor sólido relacionadas com a superexpressão de mesotelina, como câncer ovariano, câncer pancreático, mesotelioma, câncer de pulmão, câncer gástrico e câncer de mama triplo negativo. A presente divulgação provê, em certas modalidades, proteínas de domínio único que se ligam especificamente a MSLN na superfície de células alvo de tumor. Proteínas de ligação à MSLN
[0044] Em determinadas modalidades, são providas aqui proteínas de ligação, tal como anticorpos de domínio único anti-MSLN ou variantes de anticorpo, que se ligam a um epítopo na proteína MSLN. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN se liga a uma proteína compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 57. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN se liga a uma proteína compreendendo uma sequência truncada comparada a SEQ ID NO: 57.
[0045] Em algumas modalidades, as proteínas de ligação à MSLN aqui descritas reconhecem mesotelina de comprimento completo. Em certos casos, as proteínas de ligação à MSLN aqui descritas reconhecem um epítopo em região I (compreendendo resíduos de aminoácidos 296-390 de SEQ ID NO: 57), região II (compreendendo resíduo de aminoácidos 391-486 de SEQ ID NO: 57), ou região III (compreendendo resíduos de aminoácidos 487-598 de SEQ ID NO: 57) de mesotelina. É contemplado que as proteínas de ligação à MSLN da presente divulgação podem, em algumas modalidades, reconhecer e se ligar aos epítopos que estão localizados fora de regiões I, II, ou III de mesotelina. Em ainda outras modalidades são descritas proteínas de ligação à MSLN que reconhecem e se ligam a um epítopo diferente do anticorpo MORAb-009.
[0046] Em algumas modalidades, as proteínas de ligação à MSLN da presente divulgação são expressadas dentro de uma proteína multidomínio que inclui domínios adicionais de imunoglobulina. Tais proteínas multidomínios podem atuar via inibição à base de imunotoxina de crescimento de tumor e indução de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Em algumas modalidades, as proteínas multidomínios contendo as proteínas de ligação à MSLN da presente divulgação exibem atividade de citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Em algumas modalidades, as proteínas multidomínios contendo as proteínas de ligação à MSLN da presente divulgação exibem tanto atividade ADCC como CDC contra células de câncer expressando mesotelina.
[0047] Além disso, em algumas modalidades, onde as proteínas multidomínios contendo as proteínas de ligação à MSLN atuam via CDC, a proteína de ligação MLSN por reconhecer um epítopo conformacional na extremidade C- terminal de proteína mesotelina, próximo da superfície da célula Em algumas modalidades, a proteína mesotelina compreende a sequência como especificada em SEQ ID NO: 57, e a extremidade C-terminal compreende os resíduos de aminoácidos 539-588.
[0048] Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN é um anticorpo anti-MSLN ou uma variante de anticorpo. Como usado aqui, o termo "variante de anticorpo" refere-se a variantes e derivados de um anticorpo descrito aqui. Em algumas modalidades, variantes de sequência de aminoácido dos anticorpos anti-MSLN descritos aqui são contempladas. Por exemplo, em algumas modalidades, variantes de sequência de aminoácido de anticorpos anti-MSLN descritos aqui são contempladas para melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas dos anticorpos. Método exemplar para preparar variantes de aminoácido incluem, mas não são limitados a, introdução de modificações apropriadas na sequência de nucleotídeos codificando o anticorpo, ou por síntese de peptídeos. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções de, e/ou inserções em /ou substituições de resíduos dentro de uma sequência de aminoácidos do anticorpo.
[0049] Qualquer combinação de deleção, inserção, e substituição pode ser feita para chegar ao construto final, desde que o construto final possua as características desejadas, por exemplo, ligação a antígeno. Em algumas modalidades, variantes de anticorpo tendo uma ou mais substituições de aminoácido são providas. Sítios de interesse para a substituição de mutagenese incluem CDRs e regiões de arcabouço. Exemplos de tais substituições são descritos abaixo. As substituições de aminoácido podem ser introduzidas em um anticorpo de interesse e os produtos triados para a atividade desejada, por exemplo, ligação a antígeno retida/melhorada, diminuída imunogenicidade, ou melhorada citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC) ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Ambas as substituições de aminoácidos conservativas e não conservativas são contempladas para a preparação das variantes de anticorpo.
[0050] Em outro exemplo da substituição para criar um anticorpo anti-MSLN variante, um ou mais resíduos de região hipervariável do anticorpo parental são substituídos. Em geral, variantes são então selecionadas com base em melhoras nas propriedades desejadas comparadas com um anticorpo parental, por exemplo, afinidade aumentada, afinidade reduzida, imunogenicidade reduzida, aumentada dependência do pH da ligação. Por exemplo, um anticorpo variante maturado por afinidade, por exemplo, usando técnicas de maturação por afinidade com base em exibição de fagos, tal como as descritas aqui e conhecidas no campo.
[0051] Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN descrita aqui é um anticorpo de domínio único tal como um domínio variável de cadeia pesada (VH), um domínio variável (VHH) de sdAb derivado de lhama, peptídeo, ligando ou uma entidade de molécula pequena específica para mesotelina. Em algumas modalidades, o domínio de ligação à mesotelina da proteína de ligação à MSLN descrita aqui é qualquer domínio que liga a mesotelina incluindo, mas não limitados a, domínios de um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN é um anticorpo de domínio único. Em outras modalidades, a proteína de ligação à MSLN é um peptídeo. Em modalidades adicionais, a proteína de ligação à MSLN é uma molécula pequena.
[0052] Em geral, deve ser notado que o termo anticorpo de domínio único como usado aqui em seu sentido mais amplo não é limitado a uma fonte biológica específica ou a um método específico de preparação. Anticorpos de domínio único são anticorpos cujas regiões determinantes complementares são parte do polipeptídeo de domínio único. Exemplos incluem, mas não são limitados a, anticorpos de cadeia pesada, anticorpos naturalmente isentos de cadeia leve, anticorpos de domínio único derivados de anticorpos de 4 cadeias convencionais, anticorpos modificados geneticamente e andaimes de domínio único diferentes dos derivados de anticorpos. Anticorpos de domínio único podem ser qualquer um da técnica, ou quaisquer anticorpos futuros de domínio único. Anticorpos de domínio único podem ser derivados de quaisquer espécies incluindo, mas não limitados a, camundongo, humano, camelo, lhama, cabra, coelho, bovino. Por exemplo, em algumas modalidades, os anticorpos de domínio único da divulgação são obtidos: (1) por isolamento do domínio VHH de um anticorpo de cadeia pesada de ocorrência natural; (2) por expressão da sequência de nucleotídeo codificando o domínio VHH de ocorrência natural; (3) por "humanização" de um domínio VHH de ocorrência natural ou por expressão da ácido nucleico codificando um tal VHH domínio humanizado; (4) por "camelização" de um domínio VH de ocorrência natural de qualquer espécie animal, e em particular de uma espécie de mamífero, tal como de um ser humano, ou por expressão da ácido nucleico codificando tal domínio VH camelizado; (5) por "camelização" de um "anticorpo de domínio " ou "Dab", ou por expressão da ácido nucleico codificando um tal domínio VH camelizado; (6) usando técnicas sintéticas ou semissintéticas para preparar proteínas, polipeptídeos ou outras sequências de aminoácido; (7) por preparação de um ácido nucleico codificando um anticorpo de domínio único usando técnicas para a síntese de ácido nucleico conhecidas no campo, seguido por expressão do ácido nucleico assim obtido; e/ou (8) por qualquer combinação de um ou mais dos acima.
[0053] Em uma modalidade, um anticorpo de domínio único corresponde aos domínios VHH de anticorpos de cadeia pesada de ocorrência natural dirigidos contra MSLN. Como ainda descrito aqui, tais sequências VHH podem ser geralmente geradas ou obtidas por imunização apropriada de uma espécie de Lhama com MSLN, (isto é, de modo a criar uma resposta imune e/ou anticorpos de cadeia pesada dirigidos contra MSLN), por obtenção de uma apropriada amostra biológica de dita Lhama (tal como amostra de sangue, amostra de soro ou amostra de células B), e por geração de sequências VHH dirigidas contra MSLN, partindo da dita amostra, usando qualquer técnica apropriada conhecida no campo.
[0054] Em outra modalidade, tais domínios VHH de ocorrência natural contra MSLN, são obtidos de bibliotecas tipo naive de sequências de VHH Camelídeo, por exemplo por triagem de uma tal biblioteca usando MSLN, ou pelo menos uma parte, fragmento, determinante antigênico ou epítopo do mesmo, usando uma ou mais técnicas de triagem conhecidas no campo. Tais bibliotecas e técnicas são descritas, por exemplo, em WO 99/37681, WO 01/90190, WO 03/025020 e WO 03/035694. Alternativamente, bibliotecas sintéticas ou semissintéticas aperfeiçoadas, derivadas de bibliotecas VHH naive são usadas, tal como bibliotecas VHH obtidas a partir de bibliotecas VHH naive por técnicas tal como mutagenese aleatória e/ou embaralhamento CDR, como descrito, por exemplo, em WO 00/43507.
[0055] Em uma modalidade adicional, ainda outra técnica para obtenção de sequências VHH dirigidos contra MSLN, envolve imunizar de modo apropriado um mamífero transgênico que é capaz de expressar anticorpos de cadeia pesada (isto é, de modo a criar uma resposta imune e/ou anticorpos de cadeia pesada dirigidos contra MSLN), obter uma amostra biológica de dito mamífero transgênico (tal como a amostra de sangue, amostra de soro ou amostra de células B), e então gerar sequências VHH dirigidas contra MSLN, partindo de dita amostra, usando quaisquer técnicas apropriadas conhecidas no campo. Por exemplo, para este fim, os ratos ou camundongos expressando anticorpo de cadeia pesada e métodos e técnicas adicionais descritos em WO 02/085945 e in WO 04/049794 podem ser usados.
[0056] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-MSLN, como descrito aqui, compreende anticorpo de domínio único com uma sequência de aminoácidos que corresponde a uma sequência de aminoácidos de um domínio VHH de ocorrência natural, mas que foi "humanizado", isto é, por substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos em uma sequência de aminoácidos de dita sequência VHH de ocorrência natural (e em particular nas sequências de arcabouço) por um ou mais dos resíduos de aminoácidos que ocorrem na(s) posição(ões) correspondente(s) em um domínio VH de um anticorpo de 4 cadeias convencional de um ser humano (por exemplo, como indicado acima). Isto pode ser realizado em um modo conhecido no campo, que será evidente para o versado, por exemplo com base na descrição adicionado aqui. Novamente, deve ser notado que, os anticorpos de domínio único anti- MSLN humanizados da divulgação são obtidos em qualquer modo apropriado conhecido per se (isto é, como indicado nos pontos (1)-(8) acima) e assim não são estritamente limitados a polipeptídeos que foram obtidos usando um polipeptídeo que compreende um domínio VHH de ocorrência natural como um material de partida. Em algumas modalidades adicionais, um anticorpo MSLN de domínio único, como descrito aqui, compreende um anticorpo de domínio único com uma sequência de aminoácidos que corresponde a uma sequência de aminoácidos de um domínio VH de ocorrência natural, mas que foi "camelizado", isto é, por substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos em uma sequência de aminoácidos de um domínio VH de ocorrência natural a partir do anticorpo de 4 cadeias convencional por um ou mais dos resíduos de aminoácidos que ocorrem na(s) posição(s) correspondente(s) em um anticorpo de cadeia pesada de domínio VHH. Tais substituições de "camelização" são preferivelmente inseridas em posições de aminoácido que formam e/ou estão presente na interface VH-VL, e/ou nos assim chamados resíduos de marca Camelidae (ver, por exemplo WO 94/04678 e Davies e Riechmann (1994 e 1996)). Preferivelmente, a sequência VH que é usada como um material de partida ou ponto de partida para gerar ou planejar o domínio único camelizado é preferivelmente uma sequência VH de um mamífero, mais preferivelmente a sequência VH de ser humano, tal como a sequênciaVH3. No entanto, deve ser notado que tais anticorpos camelizados de domínio único anti-MSLN da divulgação, em algumas modalidades, são obtidos em qualquer modo apropriado conhecido no campo (isto é, como indicado sob os pontos (1)-(8) acima) e assim não são estritamente limitados a polipeptídeos que foram obtidos usando um polipeptídeo que compreende um domínio VH de ocorrência natural como um material de partida. Por exemplo, como ainda descrito aqui, ambas a "humanização" e a "camelização" são realizadas fornecendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um domínio VHH ou domínio VH de ocorrência natural, respectivamente e, então, mudando um ou mais códons em dita sequência de nucleotídeo de tal modo que a nova sequência de nucleotídeo codifica um anticorpo de domínio único "humanizado" ou "camelizado", respectivamente. Este ácido nucleico pode ser então expressado, de modo a prover o anticorpo de domínio único anti-MSLN desejado da divulgação. Alternativamente, em outras modalidades, com base em uma sequência de aminoácidos de um domínio VHH ou domínio VH de ocorrência natural, respectivamente, a sequência de aminoácidos do anticorpo de domínio único anti-MSLN humanizado ou camelizado desejado da divulgação, respectivamente, é projetada e então sintetizada de novo usando técnicas conhecidas para a síntese de peptídeo. Em algumas modalidades, com base em uma sequência de aminoácidos ou sequência de nucleotídeo de um domínio VHH ou domínio VH de ocorrência natural, respectivamente, a sequência de nucleotídeo codificando o anticorpo de domínio único anti-MSLN humanizado ou camelizado desejado da divulgação, respectivamente, é projetada e sintetizada de novo usando técnicas conhecidas para a síntese de ácido nucleico, após o que o ácido nucleico assim obtido é expressado usando técnica de expressão conhecidas, de modo a prover o anticorpo de domínio único anti-MSLN desejado da divulgação.
[0057] Outros métodos e técnicas apropriados para obter o anticorpo anti-MSLN de domínio único da divulgação e/ou ácidos nucleicos codificando o mesmo, partindo das VH sequências ou sequências VHH de ocorrência natural, por exemplo, compreendem combinar uma ou mais partes de uma ou mais de sequências VH de ocorrência natural (tal como uma ou mais sequências de arcabouço (FR) e/ou sequências de região determinante de complementaridade (CDR)), uma ou mais partes de uma ou mais de sequências VHH de ocorrência natural (tal como uma ou mais sequências FR ou sequências CDR), e/ou uma ou mais sequências sintéticas ou semissintéticas, em um modo apropriado, de modo a prover um anticorpo de domínio único anti-MSLN da divulgação ou a sequência de nucleotídeo ou ácido nucleico codificando o mesmo.
[0058] É contemplado que, em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN é muito pequeno e não mais de 25 kD, não mais de 20 kD, não mais de 15 kD, ou não mais de 10 kD em algumas modalidades. Em certos casos, a proteína de ligação à MSLN é de 5 kD ou menor, se for um peptídeo ou entidade de molécula pequena.
[0059] Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN é um anticorpo específico anti-MSLN compreendendo uma região determinante de complementaridade CDR1 variável de cadeia pesada, uma CDR2 variável de cadeia pesada, uma CDR3 variável de cadeia pesada, uma CDR1 variável de cadeia leve, uma CDR2 variável de cadeia leve, e uma CDR3 variável de cadeia leve. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN compreende qualquer domínio que liga a MSLN incluindo, mas não limitado a, domínios de um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, ou fragmentos de ligação a antígeno tal como anticorpos de fragmentos de domínio único (sdAb), Fab, Fab’, F(ab)2, e Fv, fragmentos compreendendo uma ou mais CDRs, anticorpos de cadeia única (por exemplo, fragmentos Fv de cadeia única (scFv)), fragmentos Fv estabilizados em dissulfeto (dsFv), anticorpos heteroconjugados (por exemplo, anticorpos biespecíficos), fragmentos pFv, monômeros ou dímeros de cadeia pesada, monômeros ou dímeros de cadeia leve, e dímeros consistindo em um de cadeia pesada e um de cadeia leve. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN é um anticorpo de domínio único. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MSLN de domínio único compreende regiões determinantes de complementaridade variáveis de cadeia pesada (CDR), CDR1, CDR2, e CDR3.
[0060] Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN da presente divulgação é um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é constituída de quatro regiões/sequências de arcabouço (f1-f4) interrompidas por três regiões determinantes de complementaridade/sequências, como representado pela fórmula: f1-r1-f2-r2-f3-r3-f4, em que r1, r2, e r3 são regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2, e CDR3, respectivamente, e f1, f2, f3, e f4 são resíduos de arcabouço. Os resíduos de arcabouço da proteína de ligação à MSLN da presente divulgação compreendem, por exemplo, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, ou 94 resíduos de aminoácidos, e as regiões determinantes de complementaridade compreendem, por exemplo, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, ou 36 resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID NOs: 1-40.
[0061] Em algumas modalidades, a CDR1 compreende a sequência de aminoácidos como especificada em SEQ ID NO: 51 ou uma variante tendo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácido em SEQ ID NO: 51. Em algumas modalidades, a CDR2 compreende uma sequência como especificada em SEQ ID NO: 52 ou uma variante tendo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácido em SEQ ID NO: 52. Em algumas modalidades, a CDR3 compreende uma sequência como especificada em SEQ ID NO: 53 ou uma variante tendo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácido em SEQ ID NO: 53.
[0062] Em algumas modalidades, a CDR1 compreende a sequência de aminoácidos como especificada em SEQ ID NO: 54 ou uma variante tendo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácido em SEQ ID NO: 54. Em algumas modalidades, a CDR2 compreende uma sequência como especificada em SEQ ID NO: 55 ou uma variante tendo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácido em SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, a CDR3 compreende uma sequência como especificada em SEQ ID NO: 56 ou uma variante tendo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de aminoácido em SEQ ID NO: 56.
[0063] As proteínas de ligação à MSLN da presente divulgação, em alguns exemplos, compreendem uma ou mais regiões conservadas. As regiões conservadas compreendem sequências como especificadas em SEQ ID NOs: 41-50, ou variantes compreendendo uma ou mais substituições de resíduo de aminoácido em relação a dito sequências. As modalidades exemplares incluem proteínas de ligação à MSLN compreendendo uma ou mais regiões conservadas selecionadas dentre SEQ ID NOs: 41-44, ou variantes compreendendo uma ou mais substituições de resíduo de aminoácido em relação a ditas sequências. Em alguns casos, a proteína de ligação à MSLN compreende (i) uma extensão de aminoácidos correspondendo a SEQ ID NO: 41, (ii) uma extensão de aminoácidos correspondendo a SEQ ID NO: 42, iii) uma extensão de aminoácidos correspondendo a SEQ ID NO: 43, e (iv) uma extensão de aminoácidos correspondendo a SEQ ID NO: 44.
[0064] Modalidades exemplares adicionais incluem proteínas de ligação à MSLN compreendendo uma ou mais regiões conservadas selecionadas dentre SEQ ID NOs: 45-50, ou variantes compreendendo uma ou mais substituições de resíduo de aminoácido em relação a dito sequências. Em alguns casos, a proteína de ligação à MSLN compreende (i) uma extensão de aminoácidos correspondendo a SEQ ID NO: 45, (ii) uma extensão de aminoácidos correspondendo a SEQ ID NO: 46, (iii) uma extensão de aminoácidos correspondendo a SEQ ID NO: 47, (iv) uma extensão de aminoácidos correspondendo a SEQ ID NO: 48, (v) uma extensão de aminoácido correspondendo a SEQ ID NO: 49, e (vi) uma extensão de aminoácidos correspondendo a SEQ ID NO: 50.
[0065] Em várias modalidades, a proteína de ligação à MSLN da presente divulgação é pelo menos cerca de 75%, cerca de 76%, cerca de 77%, cerca de 78%, cerca de 79%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou cerca de 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionadas dentre SEQ ID NOs: 1-29, 58, e 60-62.
[0066] Em várias modalidades, a proteína de ligação à MSLN da presente divulgação é pelo menos cerca de 75%, cerca de 76%, cerca de 77%, cerca de 78%, cerca de 79%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou cerca de 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionadas dentre SEQ ID NOs: 30-40, 58, e 60-62.
[0067] Em várias modalidades, uma região determinante de complementaridade da proteína de ligação à MSLN da presente divulgação é pelo menos cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou cerca de 100% idêntica à sequência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 51, ou SEQ ID NO: 54.
[0068] Em várias modalidades, uma região determinante de complementaridade da proteína de ligação à MSLN da presente divulgação é pelo menos cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou cerca de 100% idêntica à sequência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 52, ou SEQ ID NO: 55.
[0069] Em várias modalidades, uma região determinante de complementaridade da proteína de ligação à MSLN da presente divulgação é pelo menos cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou cerca de 100% idêntica à sequência de aminoácidos especificada em SEQ ID NO: 53, ou SEQ ID NO: 56.
[0070] Em várias modalidades, uma região determinante de complementaridade 1 (CDR1) da proteína de ligação à MSLN da presente divulgação é pelo menos cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% , ou cerca de 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos como especificada em qualquer uma das SEQ ID Nos.: 63-101.
[0071] Em várias modalidades, uma região determinante de complementaridade 2 (CDR2) da proteína de ligação à MSLN da presente divulgação é pelo menos cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou cerca de 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos como especificada em qualquer uma das SEQ ID Nos.: 102-140.
[0072] Em várias modalidades, uma região determinante de complementaridade 3 (CDR3) da proteína de ligação à MSLN da presente divulgação é pelo menos cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% , ou cerca de 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos como especificada em qualquer uma das SEQ ID Nos.: 141-179.
[0073] Em várias modalidades, uma região de arcabouço 1 (f1) da proteína de ligação à MSLN da presente divulgação é pel o menos cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 9 7%, cerca de 98 %, cerca de 99% , ou cerca de 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos como especificada em qualquer uma das SEQ ID Nos.: 180-218.
[0074] Em várias modalidades, uma região de arcabouço 1 (f1) da proteína de ligação à MSLN da presente divulgação é pelo menos cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou cerca de 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos como especificada em qualquer uma das SEQ ID Nos.: 219-257.
[0075] Em várias modalidades, uma região de arcabouço 2 (f2) da proteína de ligação à MSLN da presente divulgação é pelo menos cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30 cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70 cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83 cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87 cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91 cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95 cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou cerca de 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos como especificada em qualquer uma das SEQ ID Nos.: 258-296.
[0076] Em várias modalidades, uma região de arcabouço 3 (f3) da proteína de ligação à MSLN da presente divulgação é pelo menos cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou cerca de 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos como especificada em qualquer uma das SEQ ID Nos.: 297-335.
[0077] Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 17. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 19. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 20. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 21. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 22. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 24. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 25. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 27. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 28. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 28.
[0078] Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único humanizado compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único humanizado compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 31. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único humanizado compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único humanizado compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 33. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único humanizado compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 34. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único humanizado compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 35. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único humanizado compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único humanizado compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único humanizado compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 38. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único humanizado compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 39. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único humanizado compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 40. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único humanizado compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 58. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único humanizado compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 60. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único humanizado compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 61. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, é um anticorpo de domínio único humanizado compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 62.
[0079] Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN é reativa cruzada com mesotelina de humano e cinomolgo. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN é específica para mesotelina humana. Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN aqui descrita se liga à mesotelina humana com um Kd humano (hKd). Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN aqui descrita se liga a mesotelina cinomolgo com um Kd cyno (cKd). Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN aqui descrita se liga a ambas a mesotelina cinomolgo e a mesotelina humano, com um Kd cyno (cKd) e um Kd humano, respectivamente (hKd). Em algumas modalidades, a proteína de ligação à MSLN se liga à mesotelina humano e cinomolgo com afinidades de ligação comparáveis (isto é, valores hKd e cKd não diferem em mais do que ± 10%). Em algumas modalidades, o hKd e o cKd estão na faixa de cerca de 0,1 nM a cerca de 500 nM. Em algumas modalidades, o hKd e o cKd estão na faixa de cerca de 0,1 nM a cerca de 450 nM. Em algumas modalidades, o hKd e o cKd estão na faixa de cerca de 0,1 nM a cerca de 400 nM. Em algumas modalidades, o hKd e o cKd estão na faixa de cerca de 0,1 nM a cerca de 350 nM. Em algumas modalidades, o hKd e o cKd estão na faixa de cerca de 0,1 nM a cerca de 300 nM. Em algumas modalidades, o hKd e o cKd estão na faixa de cerca de 0,1 nM a cerca de 250 nM. Em algumas modalidades, o hKd e o cKd estão na faixa de cerca de 0,1 nM a cerca de 200 nM. Em algumas modalidades, o hKd e o cKd estão na faixa de cerca de 0,1 nM a cerca de 150 nM. Em algumas modalidades, o hKd e o cKd estão na faixa de cerca de 0,1 nM a cerca de 100 nM. Em algumas modalidades, o hKd e o cKd estão na faixa de cerca de 0,1 nM a cerca de 90 nM. Em algumas modalidades, o hKd e o cKd estão na faixa de cerca de 0,2 nM a cerca de 80 nM. Em algumas modalidades, o hKd e o cKd estão na faixa de cerca de 0,3 nM a cerca de 70 nM. Em algumas modalidades, o hKd e o cKd estão na faixa de cerca de 0,4 nM a cerca de 50 nM. Em algumas modalidades, o hKd e o cKd estão na faixa de cerca de 0,5 nM a cerca de 30 nM. Em algumas modalidades, o hKd e o cKd estão na faixa de cerca de 0,6 nM a cerca de 10 nM. Em algumas modalidades, o hKd e o cKd estão na faixa de cerca de 0,7 nM a cerca de 8 nM. Em algumas modalidades, o hKd e o cKd estão na faixa de cerca de 0,8 nM a cerca de 6 nM. Em algumas modalidades, o hKd e o cKd estão na faixa de cerca de 0,9 nM a cerca de 4 nM. Em algumas modalidades, o hKd e o cKd estão na faixa de cerca de 1 nM a cerca de 2 nM.
[0080] Em algumas modalidades, qualquer uma das proteínas de ligação à MSLN acima (por exemplo, anticorpos de domínio único anti-MSLN de SEQ ID NOs: 1-40, e 58) são peptídeo de afinidade marcados para facilidade de purificação. Em algumas modalidades, a marcador de peptídeo de afinidade e de seis resíduos consecutivos de histidina, também referido como 6X-his.
[0081] Em algumas modalidades, as proteínas de ligação à MSLN de acordo com a presente divulgação podem ser incorporadas em proteínas triespecíficas alvejando MSLN. Em alguns exemplos, a proteína de ligação triespecífica compreende um domínio de ligação CD3, um domínio de ligação de albumina de soro humano (HSA) e um domínio de ligação anti-MSLN de acordo com a presente divulgação. Em alguns casos, a proteína de ligação triespecífica compreende os domínios descritos acima na seguinte orientação: MSLN-HSA- CD3.
[0082] Em algumas modalidades, as proteínas de ligação à MSLN da presente divulgação preferivelmente se ligam à mesotelina ligada à membrana em vez da mesotelina solúvel. Mesotelina ligada à membrana refere-se à presença de mesotelina dentro ou fora da superfície da membrana da célula que expressa mesotelina. Mesotelina solúvel refere- se à mesotelina que não está mais dentro ou sobre superfície da membrana da célula que expressa ou mesotelina expressada. Em certos casos, a mesotelina solúvel está presente no sangue e/ou circulação linfática em um indivíduo. Em uma modalidade, as proteínas de ligação à MSLN se ligam na mesotelina ligada à membrana pelo menos 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 500 vezes, ou 1000 vez mais do que a mesotelina solúvel. Em uma modalidade, as proteínas de ligação a antígeno da presente divulgação preferivelmente se ligam na mesotelina ligada à membrana 30 vez a mais do que na mesotelina solúvel. Determinação da ligação preferencial de uma proteína de ligação a antígeno a MSLN ligada à membrana sobre a MSLN solúvel pode ser prontamente determinado usando ensaios bem conhecidos na técnica. Integração em receptores de antígenos quiméricos (CAR)
[0083] As proteínas de ligação à MSLN da presente divulgação, por exemplo, um anticorpo de domínio único anti-MSLN, podem ser, em alguns exemplos, incorporadas em um receptor de antígeno quimérico (CAR). Uma célula efetora imune modificada geneticamente, por exemplo, uma célula T ou célula NK, pode ser usada para expressar um CAR que inclui um anticorpo de domínio único anti-MSLN como descrito aqui. Em uma modalidades, o CAR incluindo um anticorpo de domínio único anti-MSLN como descrito aqui é conectado a um domínio transmembranar via uma região de dobradiça, e ainda a um domínio co-estimulatório, por exemplo, um domínio de sinalização funcional obtido de OX40, CD27, CD28, CD5, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), ou 4-1BB. Em algumas modalidades, o CAR compreende adicionalmente uma sequência codificando um domínio de sinalização intracelular, tal como 4-1BB e/ou CD3 zeta. Propriedades de redução do crescimento de tumor
[0084] Em algumas modalidades, as proteínas de ligação à MSLN da divulgação reduzem o crescimento de células de tumor in vivo quando administradas a um indivíduo que tem células de tumor que expressam mesotelina. Medição da redução do crescimento de células de tumor pode ser determinada por diferentes metodologias múltiplas bem conhecidos na técnica. Os exemplos não limitativos incluem medição direta da dimensão do tumor, medição de massa excisada do tumor e comparação como os indivíduos de controle, medição via técnicas de formação de imagem (por exemplo, CT ou MRI) que podem ou não usar isótopos ou moléculas luminescentes (por exemplo, luciferase) para uma análise intensificada e similares. Em modalidades específicas, administração do agente de ligação a antígenos da divulgação resulta em uma redução de crescimento in vivo de células de tumor como comparada com um agente de ligação a antígeno de controle por pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%, com uma redução de cerca de 100% em crescimento de tumor indicando uma resposta completa e desaparecimento do tumor. Em modalidades adicionais, administração do agente de ligação a antígenos da divulgação resulta em uma redução de crescimento in vivo de células de tumor como comparado com um agente de ligação a antígeno de controle por cerca de 50-100%, cerca de 75-100% ou cerca de 90-100%. Em modalidades adicionais, administração do agente de ligação a antígenos da divulgação resulta em uma redução de crescimento in vivo de células de tumor como comparada com um agente de ligação a antígeno de controle por cerca de 50-60%, cerca de 60-70%, cerca de 70-80%, cerca de 80-90%, ou cerca de 90-100%. Modificações de proteínas de ligação à MSLN
[0085] As proteínas de ligação à MSLN descritas aqui englobam derivados ou análogos em que (i) um aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido que não é um codificado pelo código genético, (ii) polipeptídeo maturo é fusionado com outro composto tal como polietileno glicol, ou (iii) aminoácidos adicionais são fusionados à proteína, tal como uma sequência líder ou secretória ou uma sequência para bloquear um domínio imunogênico e/ou para purificação da proteína.
[0086] As modificações típicas incluem, mas não são limitados a, acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, fixação covalente de flavina, fixação covalente de porção heme, fixação covalente de nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, fixação covalente de lipídeo ou derivado de lipídeo, fixação covalente de fosfatidilinositol, reticulação, ciclização, formação de ligação dissulfeto, desmetilação, formação de reticulações covalentes, formação de cistina, formação de piroglutamato, formilação, gama carboxilação, glicosilação, formação de âncora GPI, hidroxilação, iodação, metilação, miristilação, oxidação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfação, adição mediada por RNA-transferência para aminoácidos em proteínas tal como arginilação, e ubiquitinação.
[0087] Modificações são feitas em qualquer ponto das proteínas de ligação à MSLN descritas aqui, incluindo a estrutura dorsal do peptídeo, as cadeias laterais de aminoácido, e os términos amino ou carboxila. Algumas modificações comuns de peptídeos que são utilizáveis para a modificação de proteínas de ligação à MSLN incluem glicosilação, fixação de lipídeos, sulfação, gama- carboxilação de resíduos de ácido glutâmico, hidroxilação, bloqueio do grupo amino ou carboxila em um polipeptídeo, ou ambos, por uma modificação covalente, e ADP-ribosilação. Polinucleotídeos codificando proteínas de ligação à MSLN
[0088] Também são fornecidas, em algumas modalidades, moléculas de polinucleotídeo codificando a proteína de ligação à MSLN como descrito aqui. Em algumas modalidades, as moléculas de polinucleotídeo são providas como construtos de DNA. Em outras modalidades, as moléculas de polinucleotídeo são providas como transcritos de RNA mensageiro.
[0089] As moléculas de polinucleotídeo são construídas por métodos conhecidos, como por combinação dos genes codificando a proteína de ligação anti-MSLN, operavelmente ligada a um promotor apropriado e, opcionalmente, um terminador de transcrição apropriado e expressando o mesmo em bactérias ou outro sistema apropriado de expressão como, por exemplo, células CHO.
[0090] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é inserido em um vetor, preferivelmente um vetor de expressão, que representa uma modalidade adicional. Este vetor recombinante pode ser construído de acordo com métodos conhecidos. Vetores de particular interesse incluem plasmídeos, fagemídeos, derivados de fagos, vírus (por exemplo, retrovírus, adenovírus, vírus adeno-associado, herpes vírus, lentivírus, e similares), e cosmídeos.
[0091] Vários sistemas de vetor de expressão/hospedeiro podem ser utilizados para conter e expressar o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo da proteína de ligação à MSLN descrita. Exemplos de vetores de expressão para expressão em E.coli são pSKK (Le Gall et al., J Immunol Methods. (2004) 285(1):111-27), pcDNA5 (Invitrogen) para expressão em células de mamíferos, sistemas de expressão de levedura PICHIAPINK™ (Invitrogen), e sistemas de expressão de baculovírus BACUVANCE™ (GenScript).
[0092] Assim, as proteínas de ligação à MSLN como descritas aqui, em algumas modalidades, são produzidas introduzindo um vetor codificando a proteína como descrito acima em uma célula hospedeira e cultivando dita célula hospedeira sob condições pelas quais os domínios de proteína são expressados, podem ser isolados e, opcionalmente, ainda purificados. Composições farmacêuticas
[0093] Também são providas, em algumas modalidades, composições farmacêuticas compreendendo a proteína de ligação à MSLN descrita aqui, um vetor compreendendo o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo do proteínas de ligação à MSLN ou uma célula hospedeira transformada por este vetor e pelo menos um carreador farmaceuticamente aceitável. O termo "carreador farmaceuticamente aceitável" inclui, mas não é limitado a, qualquer carreador que não interfere com a eficácia da atividade biológica dos ingredientes e que não é tóxico para o paciente ao qual ele é administrado. Exemplos de carreadores farmacêuticos apropriados são bem conhecidos na técnica e incluem soluções salinas tamponadas com fosfato, água, emulsões, como emulsões óleo/água, vários tipos de agentes umectantes, soluções estéreis, etc. Esses carreadores podem ser formulados por métodos convencionais e podem ser administrados ao indivíduo em uma dose apropriada. Preferivelmente, as composições são estéreis. Estas composições também podem conter adjuvantes, tais como conservantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes. A prevenção da ação de microrganismos pode ser assegurada pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos. Uma modalidade adicional fornece uma ou mais das proteínas de ligação descritas acima, tais como anticorpos de domínio único anti-MSLN ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, embalados em forma liofilizada ou embalados em um meio aquoso.
[0094] Em algumas modalidades das composições farmacêuticas, a proteína de ligação à MSLN aqui descrita é encapsulada em nanopartículas. Em algumas modalidades, as nanopartículas são fulerenos, cristais líquidos, lipossomas, pontos quânticos, nanopartículas super paramagnéticas, dendrímeros ou nanobastões. Em outras modalidades das composições farmacêuticas, a proteína de ligação à MSLN está fixada aos lipossomas. Em alguns casos, a proteína de ligação à MSLN é conjugada à superfície dos lipossomas. Em alguns casos, a proteína de ligação à MSLN é encapsulada dentro do envoltório de um lipossoma. Em alguns casos, o lipossoma é um lipossoma catiônico.
[0095] As proteínas de ligação à MSLN aqui descritas são contempladas para uso como um medicamento. Administração é realizada de diferentes modos, por exemplo, por administração intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, tópica ou intradérmica. Em algumas modalidades, a via de administração depende do tipo de terapia e do tipo de composto contido na composição farmacêutica. O regime de dosagem será determinado pelo médico assistente e por outros fatores clínicos. Dosagens para qualquer paciente dependem de muitos fatores, incluindo o tamanho do paciente, a área de superfície corporal, a idade, o sexo, o composto específico a ser administrado, o tempo e a via de administração, o tipo de terapia, a saúde geral e outros fármacos sendo administrados simultaneamente. Uma "dose eficaz" refere-se às quantidades do ingrediente ativo que são suficientes para afetar o curso e a severidade da doença, levando à redução ou remissão de tal patologia e pode ser determinada usando métodos conhecidos.
[0096] Em algumas modalidades, os ligadores a MSLN desta divulgação são administrados a uma dosagem de até 10 mg/kg a uma frequência de uma vez por semana. Em alguns casos, a dosagem está na faixa de cerca de 1 ng/kg a cerca de 10 mg/kg. Em algumas modalidades, a dose é de cerca de 1 ng/kg a cerca de 10 ng/kg, cerca de 5 ng/kg a cerca de 15 ng/kg, cerca de 12 ng/kg a cerca de 20 ng/kg, cerca de 18 ng/kg a cerca de 30 ng/kg, cerca de 25 ng/kg a cerca de 50 ng/kg, cerca de 35 ng/kg a cerca de 60 ng/kg, cerca de 45 ng/kg a cerca de 70 ng/kg, cerca de 65 ng/kg a cerca de 85 ng/kg, cerca de 80 ng/kg a cerca de 1 μg/kg, cerca de 0,5 μg/kg a cerca de 5 μg/kg, cerca de 2 μg/kg a cerca de 10 μg/kg, cerca de 7 μg/kg a cerca de 15 μg/kg, cerca de 12 μg/kg a cerca de 25 μg/kg, cerca de 20 μg/kg a cerca de 50 μg/kg, cerca de 35 μg/kg a cerca de 70 μg/kg, cerca de 45 μg/kg a cerca de 80 μg/kg, cerca de 65 μg/kg a cerca de 90 μg/kg, cerca de 85 μg/kg a cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,095 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Em alguns casos, a dosagem é cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 0,2 mg/kg; cerca de 0,25 mg/kg a cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 0,45 mg/kg a cerca de 1 mg/kg, cerca de 0,75 mg/kg a cerca de 3 mg/kg, cerca de 2,5 mg/kg a cerca de 4 mg/kg, cerca de 3,5 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 4,5 mg/kg a cerca de 6 mg/kg, cerca de 5,5 mg/kg a cerca de 7 mg/kg, cerca de 6,5 mg/kg a cerca de 8 mg/kg, cerca de 7,5 mg/kg a cerca de 9 mg/kg, ou cerca de 8,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. A frequência de administração, em algumas modalidades, é cerca de menos que diariamente, em dias alternados, menos de uma vez por dia, duas vezes por semana, semanalmente, uma vez em sete dias, uma vez em duas semanas, uma vez em duas semanas, uma vez em três semanas, uma vez em quatro semanas, ou uma vez por mês. Em alguns casos, a frequência de administração é semanalmente. Em alguns casos, a frequência de administração é semanalmente e a dosagem é de até 10 mg/kg. Em alguns casos, duração de administração é de cerca de 1 dia a cerca de 4 semanas ou mais longo. Métodos de tratamento
[0097] Também são providos aqui, em algumas modalidades, métodos e usos para estimular o sistema imune de um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo a administração de uma proteína de ligação à MSLN, como aqui descrito. Em alguns casos, a administração de uma proteína de ligação à MSLN aqui descrita induz e/ou sustenta citotoxicidade em relação a uma célula expressando um antígeno alvo. Em alguns casos, a célula expressando um antígeno alvo é uma célula de câncer ou tumor, uma célula infectada por vírus, uma célula infectada por bactérias, uma célula T ou B autorreativa, glóbulos vermelhos danificados, placas arteriais ou tecido fibrótico.
[0098] Também são providos aqui métodos e usos para um tratamento de uma doença, distúrbio ou condição associado com um antígeno alvo compreendendo administração a um indivíduo em necessidade do mesmo de uma proteína de ligação à MSLN ou uma proteína de ligação multiespecífica compreendendo a proteína de ligação à MSLN descrita aqui. Doenças, distúrbios ou condições associadas com um antígeno alvo incluem, mas não são limitados a, infecção viral, infecção bacteriana, doença auto-imune, rejeição a transplante, aterosclerose, ou fibrose. Em outras modalidades, a doença, distúrbio ou condição associado com um antígeno alvo é uma doença proliferativa, uma doença tumoral, uma doença inflamatória, um distúrbio imunológico, uma doença autoimune, uma doença infecciosa, uma doença viral, uma reação alérgica, uma reação parasitária, uma doença do enxerto-versus-hospedeiro ou uma doença de hospedeiro-versus-enxerto. Em uma modalidade, a doença, distúrbio ou condição associada a um antígeno alvo é câncer. Os cânceres que podem ser tratados, prevenidos ou controlados pelas proteínas de ligação à MSLN da presente divulgação, e métodos para usar os mesmos, incluem, mas não estão limitados a, cânceres de origem celular epitelial. Exemplos de tais cânceres incluem os seguintes: leucemias, como, mas não limitados a, leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemias mielocíticas agudas, como leucemias mieloblásticas, promielocíticas, mielomonocíticas, monocíticas e eritroleucemia e síndrome mielodisplásica; leucemias crônicas, tais como, mas não limitadas a, leucemia mielocítica (granulocítica) crônica, leucemia linfocítica crônica, leucemia de células pilosas; policitemia vera; linfomas tais como, mas não limitados a, doença de Hodgkin, doença não de Hodgkin; mielomas múltiplos, tais como, mas não limitados a, mieloma múltiplo latente, mieloma não secretor, mieloma osteosclerótico, leucemia de células plasmáticas, plasmocitoma solitário e plasmocitoma extramedular; macroglobulinemia de Waldenstrom; gamopatia monoclonal de significado indeterminado; gamopatia monoclonal benigna; doença da cadeia pesada; sarcomas de tecidos ósseos e conjuntivos, tais como, mas não limitados a, sarcoma ósseo, osteossarcoma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, tumor maligno de células gigantes, fibrossarcoma ósseo, cordoma, sarcoma periosteal, sarcomas de tecidos moles, angiossarcoma (hemangiosarcoma), fibrosarcoma, sarcoma de Kaposi, leiomiossarcoma, lipossarcoma, linfangiossarcoma, neurilemoma, rhabdomiossarcoma, sarcoma sinovial; tumores cerebrais tais como, mas não limitados a, glioma, astrocitoma, glioma do tronco encefálico, ependimoma, oligodendroglioma, tumor não glial, neurinoma acústico, craniofaringioma, meduloblastoma, meningioma, pineocitoma, pineoblastoma, linfoma primário do cérebro; câncer de mama incluindo, mas não limitado a, carcinoma ductal, adenocarcinoma, carcinoma lobular (de células pequenas), carcinoma intraductal, câncer de mama medular, câncer de mama mucinoso, câncer de mama tubular, câncer de mama papilar, doença de Paget e câncer de mama inflamatório; câncer adrenal tal como, mas não limitado a, feocromocitoma e carcinoma adrenocortical; câncer de tireóide, como, mas não limitado a, câncer de tireóide papilar ou folicular, câncer de tireóide medular e câncer de tireoide anaplásico; câncer do pâncreas tal como, mas não limitado a, insulinoma, gastrinoma, glucagonoma, vipoma, tumor secretor de somatostatina e tumor de células carcinóides ou ilhotas; cânceres pituitários, tais como, mas limitados a, doença de Cushing, tumor secretor de prolactina, acromegalia e diabetes insipius; cânceres oculares, tais como, mas não limitados a, melanoma ocular, como melanoma da íris, melanoma coróide e melanoma do corpo ciliar e retinoblastoma; cânceres vaginais tais como carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma e melanoma; câncer vulvar tal como carcinoma de células escamosas, melanoma, adenocarcinoma, carcinoma de células basais, sarcoma e doença de Paget; cânceres do colo do útero tais como, mas não limitados a, carcinoma de células escamosas e adenocarcinoma; cânceres uterinos tais como, mas não limitados a, carcinoma endometrial e sarcoma uterino; cânceres ovarianos, tais como, mas não limitados a, carcinoma epitelial ovariano, tumor limítrofe, tumor de células germinativas e tumor estromal; cânceres esofágicos tais como, mas não limitados a, câncer escamoso, adenocarcinoma, carcinoma cístico adenoide, carcinoma mucoepidermóide, carcinoma adenoescamoso, sarcoma, melanoma, plasmacitoma, carcinoma verrucoso e carcinoma de celulas “oat” (células pequenas); cânceres estomacais tais como, mas não limitados a, adenocarcinoma, fungos (polipóide), ulceração, espalhamento superficial, espalhamento difuso, linfoma maligno, lipossarcoma, fibrossarcoma e carcinossarcoma; cânceres do cólon; cânceres retais; cânceres do fígado tais como, mas não limitados a, carcinoma hepatocelular e hepatoblastoma; cânceres da vesícula biliar, tais como adenocarcinoma; colangiocarcinomas tais como, mas não limitados a, papilares, nodulares e difusos; cânceres do pulmão, tais como câncer do pulmão de células não pequenas, carcinoma de células escamosas (carcinoma epidermóide), adenocarcinoma, carcinoma de células grandes e câncer do pulmão de células pequenas; cânceres testiculares tais como, mas não limitados a, tumor germinal, seminoma, anaplásico, clássico (típico), espermatocítico, não-seminoma, carcinoma embrionário, carcinoma de teratoma, coriocarcinoma (tumor do saco vitelino), cânceres da próstata tais como, mas não limitados a, neoplasia intra-epitelial prostática, adenocarcinoma, leiomiossarcoma e rhabdomiossarcoma; cânceres penais; cânceres orais tais como, mas não limitados a, carcinoma de células escamosas; cânceres basais; cânceres da glândula salivar, tais como, mas não limitados a, adenocarcinoma, carcinoma mucoepidermóide e carcinoma adenoidecístico; cânceres da faringe, tais como, mas não limitados a, carcinoma de célula escamosa e verrucoso; cânceres da pele, tais como, mas não limitados a, carcinoma basocelular, carcinoma de célula escamosa e melanoma, melanoma de espalhamento superficial, melanoma nodular, melanoma maligno lentigo, melanoma acraç lentiginoso; cânceres nos rins, tais como, mas não limitados a, carcinoma de células renais, adenocarcinoma, hipernefroma, fibrossarcoma, câncer de células de transição (pelvis renal e/ou uretra); tumor de Wilms; cânceres da bexiga, tais como, mas não limitados a, carcinoma de células transicionais, câncer de células escamosas, adenocarcinoma, carcinosarcoma. Além disso, os cânceres incluem mixossarcoma, sarcoma osteogênico, endoteliossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, mesotelioma, sinovioma, hemangioblastoma, carcinoma epitelial, cistadenocarcinoma, carcinoma broncogênico, carcinoma da glândula sudorípara, carcinoma da glândula sebácea, carcinoma papilar e adenocarcinomas papilares (para uma revisão de tais distúrbios, ver Fishman et al., 1985, Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia e Murphy et al., 1997, Informed Decisions: the Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of America).
[0099] As proteínas de ligação à MSLN da divulgação também são úteis no tratamento ou prevenção de uma variedade de cânceres ou outras doenças proliferativas anormais, incluindo (mas não limitados a) os seguintes: carcinoma, incluindo o da bexiga, mama, cólon, rim, fígado, pulmão, ovário, pâncreas, estômago, colo do útero, tireóide e pele; incluindo carcinoma de células escamosas; tumores hematopoiéticos da linhagem linfoide, incluindo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Burkitt; tumores hematopoiéticos da linhagem mielóide, incluindo leucemias mielógenas agudas e crônicas e leucemia promielocítica; tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma e rhabdomioscarcoma; outros tumores, incluindo melanoma, seminoma, tetratocarcinoma, neuroblastoma e glioma; tumores do sistema nervoso central e periférico, incluindo astrocitoma, neuroblastoma, glioma e schwannomas; tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma, rhabdomioscarama e osteossarcoma; e outros tumores, incluindo melanoma, xeroderma pigmentoso, queratoactantoma, seminoma, câncer folicular da tireóide e teratocarcinoma. Também é contemplado que os cânceres causados por aberrações na apoptose também sejam tratados pelos métodos e composições da divulgação. Tais cânceres podem incluir, mas não são limitados a, linfomas foliculares, carcinomas com mutações na p53, tumores dependentes de hormônios da mama, próstata e ovário e lesões pré-cancerosas, como polipose adenomatosa familiar e síndromes mielodisplásicas. Em modalidades específicas, malignidade ou mudanças disproliferativas (como metaplasias e displasias) ou distúrbios hiperproliferativos, são tratadas ou prevenidas na pele, pulmão, cólon, mama, próstata, bexiga, rim, pâncreas, ovário ou útero. Em outras modalidades específicas, sarcoma, melanoma ou leucemia é tratado ou evitado.
[00100] Como usado aqui, em algumas modalidades, "tratamento" ou "tratamento" ou "tratado" refere-se ao tratamento terapêutico em que o objetivo é retardar (diminuir) uma condição fisiológica, distúrbio ou doença indesejados, ou obter resultados clínicos benéficos ou desejados. Para os fins aqui descritos, os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a, alívio dos sintomas; diminuição da extensão da condição, distúrbio ou doença; estabilização (isto é, sem piora) do estado da condição, distúrbio ou doença; atraso no início ou maior lentidão da progressão da condição, distúrbio ou doença; melhora da condição, distúrbio ou estado da doença; e remissão (parcial ou total), detectável ou não detectável, ou intensificação ou melhora da condição, distúrbio ou doença. O tratamento inclui elicitar uma resposta clinicamente significativa sem níveis excessivos de efeitos colaterais. Tratamento também inclui prolongar a sobrevida em comparação com a sobrevida esperada se não estiver recebendo tratamento. Em outras modalidades, "tratamento" ou "tratar" ou "tratado" refere- se a medidas profiláticas, em que o objetivo é atrasar o início ou reduzir a severidade de uma condição fisiológica, distúrbio ou doença indesejada, como, por exemplo, uma pessoa que está predisposta a uma doença (por exemplo, um indivíduo que carrega um marcador genético para uma doença como câncer de mama).
[00101] Em algumas modalidades dos métodos aqui descritos, as proteínas de ligação à MSLN, como aqui descritas, são administradas em combinação com um agente para tratamento da doença, distúrbio ou condição particular. Agentes incluem, entre outros, terapias envolvendo anticorpos, moléculas pequenas (por exemplo, quimioterapêuticas), hormônios (esteróides, peptídeos e similares), radioterapias (raios y, raios X e/ou entrega dirigida de radioisótopos, microondas, radiação UV e similares), terapias gênicas (por exemplo, antissenso, terapia retroviral e similares) e outras imunoterapias. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação à MSLN, como aqui descrita, é administrada em combinação com agentes antidiarréicos, agentes antieméticos, analgésicos, opióides e/ou agentes anti-inflamatórios não esteróides. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação à MSLN, como aqui descrita, é administrada em combinação com agentes anticâncer. Exemplos não limitativos de agentes anticâncer que podem ser usados nas várias modalidades da divulgação, incluindo composições farmacêuticas e formas de dosagem e kits da divulgação, incluem: acivicina; aclarubicina; cloridrato de acodazol; acronina; adozelesina; aldesleucoma; altretamina; ambomicina; acetato de ametantrona; aminoglutetimida; amsacrina; anastrozol; antramicina; asparaginase; asperlina; azacitidina; azetepa; azotomicina; batimastat; benzodepa; bicalutamida; cloridrato de bisantreno; dimesilato de bisnafida; bizelesina; sulfato de bleomicina; brequinar sódico; bropirimina; bussulfano; cactinomicina; calusterona; caracemida; carbetimer; carboplatina; carmustina; cloridrato de carubicina; carzelesina; cedefingol; clorambucil; cirolemicina; cisplatina; cladribina; mesilato de crisnatol; ciclofosfamida; citarabina; dacarbazina; dactinomicina; cloridrato de daunorubicina; decitabina; dexormaplatina; dezaguanina; mesilato de dezaguanina; diaziquona; docetaxel; doxorubicina; cloridrato de doxorubicina; droloxifeno; citrato de droloxifeno; propionato de dromostanolona; duazomicina; edatrexato; cloridrato de eflornitina; elsamitrucina; enloplatina; enpromato; epipropidina; cloridrato de epirubicina; erbulozol; cloridrato de esorubicina; estramustina; estramustina fosfato sódico; etanidazol; etoposídeo; fosfato de etoposídeo; etoprina; cloridrato de fadrozol; fazarabina; fenretinida; floxuridina; fosfato de fludarabina; fluorouracil; flurocitabina; fosquidona; fostriecina sódica; gemcitabina; cloridrato de gemcitabina; hidroxiureia; cloridrato de idarubicina; ifosfamida; ilmofosina; interleucina II (incluindo interleucina recombinante II, ou rIL2), interferon alfa-2a; interferon alfa-2b; interferon alfa-n1 interferon alfa-n3; interferon beta-I a; interferon gama-I b; iproplatina; cloridrato de irinotecano; acetato de lanreotídeo; letrozol; acetato de leuprolida; cloridrato de liarozol; lometrexol sódico; lomustina; cloridrato de losoxantrona; masoprocol; maitansina; cloridrato de mecloretamina; acetato de megestrol; acetato de melengestrol; melfalan; menogaril; mercaptopurina; metotrexato; metotrexato sódico; metoprina; meturedepa; mitindomida; mitocarcina; mitocromina; mitogillina; mitomalcina; mitomicina; mitosper; mitotana; cloridrato de mitoxantrona; ácido micofenólico; nocodazol; nogalamicina; ormaplatina; oxisuran; paclitaxel; pegaspargase; peliomicina; pentamustina; sulfato de peplomicina; perfosfamida; pipobroman; piposulfan; cloridrato de piroxantrona; plicamicina; plomestana; porfímero sódico; porfiromicina; prednimustina; cloridrato de procarbazina; puromicina; cloridrato de puromicina; pirazofurina; riboprina; rogletimida; safingol; cloridrato de safingol; semustina; simtrazena; esparfosato sódico; esparsomicina; cloridrato de espirogermânio; espiromustina; espiroplatin; estreptonigrina; estreptozocina; sulofenur; talisomicina; tecogalan sódico; tegafur; cloridrato de teloxantrona; temoporfina; teniposídeo; teroxirona; testolactona; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofurina; tirapazamina; citrato de toremifeno; acetato de trestolona; fosfato de triciribina; trimetrexato; glucuronato de trimetrexato; triptorelina; cloridrato de tubulozol; uracil mostarda; uredepa; vapreotídeo; verteporfina; sulfato de vinblastina; sulfato de vincristina; vindesina; sulfato de vindesina; sulfato de vinepidina; sulfato de vinglicinato; sulfato de vinleurosina; tartrato de vinorelbina; sulfato de vinzolidina; sulfato de vinzolidina; vorozol; zeniplatina; zinostatina; cloridrato de zorubicina. Outros exemplos de fármacos anticâncer incluem, mas não são limitados a: 20-epi-1,25 dihidroxivitamina D3; 5- etiniluracil; abiraterona; aclarubicina; acilfulvena; adecipenol; adozelesina; aldesleuquina; antagonistas ALL- TK; altretamina; ambamustina; amidox; amifostina; ácido aminolevulínico; amrubicina; amsacrina; anagrelídeo; anastrozol; andrografolídeo; inibidores de angiogenese; antagonista D; antagonista G; antarelix; proteína-1 morfogenética anti-dorsalizante; antiandrogênio, carcinoma prostático; antiestrogênio; antineoplaston; oligonucleotídeos antissenso; glicinato de afidicolina; moduladores do gene de apoptose; reguladores de apoptose; ácido apurínico; ara-CDP-DL-PTBA; arginina desaminase; asulacrina; atamestana; atrimustina; axinastatin 1; axinastatina 2; axinastatin a3; azasetron; azatoxina; azatirosina; derivados de baccatin III; balanol; batimastat; antagonistas de BCR/ABL; benzoclorinas; benzoilstaurosporina; derivados de beta lactama; beta- aletina; betaclamicina B; ácido betulínico; inibidor de bFGF; bicalutamida; bisantreno; bisaziridinilspermina; bisnafida; bistrateno A; bizelesina; breflato; bropirimina; budotitana; butionina sulfoximina; calcipotriol; calfostina C; derivados de camptotecina; canaripox IL-2; capecitabina; carboxamida-amino-triazol; carboxiamidotriazol; CaRest M3; CARN 700; inibidor derivado de cartilagem; carzelesin; inibidores de caseina quinase (ICOS); castanospermina; cecropina B; cetrorelix; clorinas; cloroquinoxalina sulfonamida; cicaprost; cis-porfirina; cladribina; análogos de clomifeno; clotrimazol; collismicina A; collismicina B; combretastatina A4; análogo de combretastatina; conagenina; crambescidina 816; crisnatol; criptoficina 8; derivados de criptoficina A; curacina A; ciclopentantraquinonas; cicloplatam; cipemicina; ocfosfato de citarabina; fator citolítico; citostatina; dacliximab; decitabina; dehidrodidemnina B; deslorelina; dexametasona; dexifosfamida; dexrazoxana; dexverapamil; diaziquona; didemnin B; didox; dietilnorspermina; di-hidro-5- azacitidina; dihidrotaxol, 9-; dioxamicina; difenil espiromustina; docetaxel; docosanol; dolasetron; doxifluridina; droloxifeno; dronabinol; duocarmicina SA; ebselen; ecomustina; edelfosina; edrecolomab; eflornitina; elemena; emitefur; epirubicina; epristerida; análogo de estramustina; agonistas de estrogênio; antagonistas de estrogênio; etanidazol; fosfato de etoposídeo; exemestana; fadrozol; fazarabina; fenretinida; filgrastim; finasterida; flavopiridol; flezelastina; fluasterona; fludarabina; cloridrato de fluorodaunorunicina; forfenimex; formestana; fostriecina; fotemustina; texafirino de gadolínio; nitrato de gálio; galocitabina; ganirelix; inibidores de gelatinase inhibitors; gemcitabina; glutatione inhibitors; hepsulfam; heregulin; hexametilene; hipericina; ácido ibandrônico; idarubicina; idoxifeno; idramantona; ilmofosina; ilomastat; imidazoacridonas; imiquimod; peptídeos imunoestimulantes; inibidor de receptor de fator-1 de crescimento tipo insulina; agonistas de interferon; interferons; interleucinas; iobenguana; iododoxorubicina; ipomeanol, 4-; iroplact; irsogladina; isobengazol; isohomohalicondrina B; itasetron; jasplakinolídeo; kahalalide F; N triacetato de lamellarin; lanreotídeo; leinamicina; lenograstim; sulfato de lentinan; leptolstatina; letrozol; fator de inibição de leucemia; alfa interferon de leucócito; leuprolídeo+estrogênio+progesterona; leuprorelin; levamisol liarozol; análogo de poliamina linear; peptídeo dissacarídeo lipofílico; compostos de platina lipofílicos; lissoclinamida 7; lobaplatina; lombricina; lometrexol; lonidamina; losoxantrona; inibidor de HMG-CoA reductase (tal como mas não limitado a, Lovastatina, Pravastatina, Fluvastatina, Estatina, Simvastatina, e Atorvastatina); loxoribina; lurtotecan; lutécio texafirina; lisofilina; peptídeos líticos; maitansina; manostatina A; marimastat; masoprocol; maspin; inibidores de matrilisina; inibidores de metaloproteinase de matriz; menogaril; merbarona; meterelina; metioninase; metoclopramida; inibidor de MIF; mifepristona; miltefosina; mirimostim; double RNA fita dupla mismatched; mitoguazona; mitolactol; análogos de mitomicina; mitonafida; mitotoxina, fator de crescimento de fibroblastos-saporina; mitoxantrona; mofarotena; molgramostim; anticorpo monoclonal, gonadotrofina coriônica humana; parede celular sk monofosforil lipídeo A+miobactéria; mopidamol; inibidor de gene de resistência a fármaco múltiplo; terapia com base em supressor 1 de tumor múltiplo, agente anticâncer mostarda, micaperóxido B; extrato de parede celular micobacteriano; miriaporona; N- acetildinalina; N-substituídas benzamidas; nafarelina; nagrestip; naloxona+pentazocina; napavina; nafterpin; nartograstim; nedaplatin; nemorubicina; neridronic acid; neutral endopeptidase; nilutamida; nisamicina; moduladores de óxido nítrico; antioxidante nitróxido; nitrullina; O6- benzilguanina; octreotídeo; okicenona; oligonucleotídeos; onapristona; ondansetron; ondansetron; oracina; indutor de citocina oral; ormaplatina; osaterona; oxaliplatina; oxaunomicina; paclitaxel; análogos de paclitaxel; derivados de paclitaxel; palauamina; palmitoilrhizoxin; ácido pamidrônico; panaxitriol; panomifena; parabactina; pazelliptina; pegaspargase; peldesina; pentosano polissulfatp sódico; pentoestatina; pentrozol; perflubron; perfosfamida; álcool perilílico; fenazinomicina; fenilacetato; inibidores de fosfatase; picibanil; cloridrato de pilocarpina; pirarubicina; piritrexim; placetina A; placetina B; inibidores de ativador de plasminogênio; complexo de platina; compostos de platina; complexo de platina-triamina; porfimero sódico; porfiromicina; prednisona; propil bis-acridona; prostaglandina J2; inibidores de proteasoma; modulador imune à base d eproteína A; inibidor de proteína quinase C; inibidores de proteína quinase C, microalgas; inibidores de proteína tirosina fosfatase; inibidores de purina nucleosídeo fosforilase; purpurinsa; pirazoloacridina; conjugado de hemoglobina piridoxilada polioxietileno; antagonistas de raf; raltitrexed; ramosetron; inibidores de ras farnesil proteína transferase; inibidores de ras; inibidor de ras-GAP; reteliptina deametilada; etidronato de rênio Re 186; rhizoxina; ribozimas; RII retinamida; rogletimida; rohitukina; romurtida; roquinimex; rubiginona B1; ruboxil; safingol; saintopin; SarCNU; sarcofitol A; sargramostim; mimétidos de Sdi 1; semustina; inibidor 1 derivado de senescência; oligonucleotídeos semsp; inibidores de transdução de sinal; moduladores de de transdução de sinal; proteína de ligação a antígeno de cadeia única; sizofiran; sobuzoxana; borocaptato sódico; fenilacetato de sódio; solverol; proteína de ligação a somatomedina; sonermina; ácido esparfósico; espicamicina D; espiromustina; esplenopentina; espongistatina 1; esqualamina; inibidor de células-tronco; inibidores de divisão de células-tronco; estipiamida; inibidores de estromelisina; sulfinosina; antagonista de peptídeo intestinal vasoativo superativo; suradista; suramin; swainsonina; glicosaminoglicanos sintéticos; tallimustina; metiodeto de tamoxifeno; tauromustina; tazarotena; tecogalan sódico; tegafur; tellurapirílio; inibidores de telomerase; temoporfina; temozolomida; teniposídeo; tetraclorodecaoxida; tetrazomina; taliblastina; tiocoralina; trombopoietina; mimético de trombopoietina; timalfasin; agonista de receptor de timopoietina; timotrinan; hormônio estimulante da tireóide; etil etiopurpurina de estanho; tirapazamina; bicloreto de titanoceno; topsentina; toremifeno; fator de células-tronco totipotente; inibidores de tradução; tretinoina; triacetiluridina; triciribina; trimetrexato; triptorelin; tropisetron; turosterídeo; inibidores de tirosine quinase; tirfostins; inibidores de UBC; ubenimex; fator inibidor de crescimento derivado de sino urogenital; antagonistas de receptor de uroquinase; vapreotídeo; variolina B; sistema de vetor, terapia gênica com eritrócitos; velaresol; veramina; verdins; verteporfina; vinorelbina; vinxaltina; Vitaxin®; vorozol; zanoterona; zeniplatina; zilascorb; e estimalâmero de zinostatina. Fármacos anticâncer adicionais são 5-fluorouracil e leucovorina. Estes dois agentes são particularmente utilizáveis quando usados emn métodos empregando talidomida e um inibidor de topoisomerase. Em algumas modalidades, a proteína de ligação anti-MSLN de domínio único da presente divulgação é usada em combinação com gencitabina.
[00102] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação à MSLN como descrita aqui é administrada antes, durante ou após a cirurgia. Métodos de detecção de expressão de mesotelina e diagnose de câncer associado com mesotelina
[00103] De acordo com outra modalidade da divulgação, kits para detectar a expressão de mesotelina in vitro ou in vivo são providos. Os kits incluem as proteínas de ligação à MSLN anteriores (por exemplo, um anticorpo de domínio único anti-MSLN marcado ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo) e um ou mais compostos para detectar o marcador. Em algumas modalidades, o marcador é selecionada do grupo consistindo em um marcador fluorescente, um marcador enzimático, um marcador radioativo, um marcador ativo de ressonância magnética nuclear, um marcador luminescente e um marcador cromóforo.
[00104] Em alguns casos, a expressão de mesotelina é detectada em uma amostra biológica. A amostra pode ser qualquer amostra, incluindo, entre outras, tecidos de biópsias, autópsias e espécimes de patologia. As amostras biológicas também incluem seções de tecidos, por exemplo, seções congeladas feitas para fins histológicos. Amostras biológicas incluem ainda fluidos corporais, como sangue, soro, plasma, escarro, líquido espinhal ou urina. Uma amostra biológica é tipicamente obtida de um mamífero, como um primata não humano ou humano.
[00105] Em uma modalidade, é provido um método para determinar se um indivíduo tem câncer colocando em contato uma amostra do indivíduo com um anticorpo de domínio único anti-MSLN, como divulgado aqui; e detectar a ligação do anticorpo de domínio único à amostra. Um aumento na ligação do anticorpo à amostra em comparação com a ligação do anticorpo a uma amostra de controle identifica o indivíduo como tendo câncer.
[00106] Em outra modalidade, é provido um método para confirmar um diagnóstico de câncer em um indivíduo, colocando em contato uma amostra de um indivíduo diagnosticado com câncer com um anticorpo de domínio único anti-MSLN, como divulgado aqui; e detectando a ligação do anticorpo à amostra. Um aumento na ligação do anticorpo à amostra em comparação com a ligação do anticorpo a uma amostra de controle confirma o diagnóstico de câncer no indivíduo.
[00107] Em alguns exemplos dos métodos divulgados, o anticorpo de domínio único é diretamente marcado.
[00108] Em alguns exemplos, os métodos incluem adicionalmente colocar em contato um segundo anticorpo que se liga especificamente o anticorpo de domínio único à amostra; e detectar a ligação do segundo anticorpo. Um aumento na ligação do segundo anticorpo à amostra em comparação com a ligação do segundo anticorpo a uma amostra de controle detecta câncer no indivíduo ou confirma o diagnóstico de câncer no indivíduo.
[00109] Em alguns casos, o câncer é mesotelioma, câncer de próstata, câncer de pulmão, câncer de estômago, carcinoma de células escamosas, câncer de pâncreas, colangiocarcinoma, câncer de mama triplo negativo ou câncer de ovário ou qualquer outro tipo de câncer que expressa mesotelina.
[00110] Em alguns exemplos, a amostra de controle é uma amostra de um indivíduo sem câncer. Em exemplos particulares, a amostra é uma amostra de sangue ou tecido.
[00111] Em alguns casos, o anticorpo que se liga (por exemplo, se liga especificamente) à mesotelina é diretamente marcado com um marcador detectável. Em outra modalidade, o anticorpo que se liga (por exemplo, se liga especificamente) à mesotelina (o primeiro anticorpo) não é marcado e um segundo anticorpo ou outra molécula que pode se ligar ao anticorpo que se liga especificamente à mesotelina é marcado. Um segundo anticorpo é escolhido de modo que seja capaz de se ligar especificamente às espécies e classes específicas do primeiro anticorpo. Por exemplo, se o primeiro anticorpo é uma IgG de lhama, então o anticorpo secundário pode ser uma IgG anti-lhama. Outras moléculas que podem se ligar a anticorpos incluem, sem limitação, proteína A e proteína G, ambas sendo disponíveis comercialmente. Os marcadores apropriados para o anticorpo ou anticorpo secundário são descritos acima e incluem várias enzimas, grupos protéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, agentes magnéticos e materiais radioativos. Exemplos não limitativos de enzimas apropriadas incluem peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou acetilcolinesterase. Exemplos não limitativos de complexos de grupos protéticos apropriados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina. Exemplos não limitativos de materiais fluorescentes apropriados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina, fluoresceína, dansil cloreto ou ficoeritrina. Um material luminescente exemplar não limitativo é o luminol; um exemplo não limitativo de um agente magnético é gadolínio e marcadores radioativos exemplares não limitativos incluem 125I, 131I, 35S ou 3H.
[00112] Em uma modalidade alternativa, mesotelina pode ser analisada em uma amostra biológica por um imunoensaio de competição utilizando padrões de mesotelina marcados com uma substância detectável e um anticorpo não marcado que se liga especificamente à mesotelina. Neste ensaio, a amostra biológica, os padrões de mesotelina marcados e o anticorpo que se liga especificamente à mesotelina são combinados e a quantidade de padrão de mesotelina marcado ligado ao anticorpo não marcado é determinada. A quantidade de mesotelina na amostra biológica é inversamente proporcional à quantidade de padrão de mesotelina marcado ligado ao anticorpo que se liga especificamente à mesotelina.
[00113] Os imunoensaios e o método descritos aqui podem ser utilizados para vários fins. Em uma modalidade, o anticorpo que se liga especificamente à mesotelina pode ser usado para detectar a produção de mesotelina nas células em cultura de células. Em outra modalidade, o anticorpo pode ser usado para detectar a quantidade de mesotelina em uma amostra biológica, como uma amostra de tecido ou uma amostra de sangue ou soro. Em alguns exemplos, a mesotelina é mesotelina de superfície celular. Em outros exemplos, a mesotelina é mesotelina solúvel (por exemplo, mesotelina em um sobrenadante da cultura de células ou mesotelina solúvel em uma amostra de fluido corporal, como uma amostra de sangue ou soro).
[00114] Em uma modalidade, um kit é fornecido para detectar mesotelina em uma amostra biológica, como uma amostra de sangue ou amostra de tecido. Por exemplo, para confirmar um diagnóstico de câncer em um indivíduo, uma biópsia pode ser realizada para obter uma amostra de tecido para exame histológico. Alternativamente, uma amostra de sangue pode ser obtida para detectar a presença de proteína de mesotelina solúvel ou fragmento. Kits para detectar um polipeptídeo tipicamente compreenderão um anticorpo de domínio único, de acordo com a presente divulgação, que se liga especificamente à mesotelina. Em algumas modalidades, um fragmento de anticorpo, como um fragmento scFv, um domínio VH ou um Fab é incluído no kit. Em uma modalidade adicional, o anticorpo é marcado (por exemplo, com um marcador fluorescente, radioativo ou enzimático).
[00115] Em uma modalidade, um kit inclui materiais de instrução que divulgam meios de uso de um anticorpo que se liga à mesotelina. Os materiais de instrução podem ser escritos em formato eletrônico (como um disquete ou disco compacto de computador) ou podem ser visuais (como arquivos de vídeo). Os kits também podem incluir componentes adicionais para facilitar a aplicação específica para a qual o kit foi projetado. Assim, por exemplo, o kit pode conter adicionalmente meios para detectar um marcador (como substratos enzimáticos para marcadores enzimáticos, conjuntos de filtros para detectar marcadores fluorescentes, marcadores secundários apropriados, como um anticorpo secundário ou similar). Os kits podem adicionalmente incluir tampões e outros reagentes usados rotineiramente para a prática de um método particular. Esses kits e conteúdo apropriados são bem conhecidos dos versados na técnica.
[00116] Em uma modalidade, o kit de diagnóstico compreende um imunoensaio. Embora os detalhes dos imunoensaios possam variar com o formato específico empregado, o método de detecção de mesotelina em uma amostra biológica geralmente inclui as etapas de contato da amostra biológica com um anticorpo que reage especificamente, sob condições imunologicamente reativas, a um polipeptídeo de mesotelina. O anticorpo é deixado se ligar especificamente sob condições imunologicamente reativas para formar um complexo imune, e a presença do complexo imune (anticorpo ligado) é detectada diretamente ou indiretamente.
[00117] Métodos para determinar a presença ou ausência de um marcador de superfície celular são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, os anticorpos podem ser conjugados com outros compostos, incluindo, mas não limitados a, enzimas, contas magnéticas, contas magnéticas coloidais, haptenos, fluorocromos, compostos de metal, compostos radioativos ou fármacos. Os anticorpos também podem ser utilizados em imunoensaios, tais como, mas não limitados a, radioimunoensaios (RIAs), ELISA ou ensaios imuno- histoquímicos. Os anticorpos também podem ser usados para a classificação de células ativadas por fluorescência (FACS). FACS emprega uma pluralidade de canais coloridos, canais de detecção de espalhamento de luz de ângulo baixo e obtuso, e canais de impedância, entre outros níveis mais sofisticados de detecção, para separar ou classificar células (ver Patente US No. 5.061.620). Qualquer um dos anticorpos de domínio único que se liga à mesotelina, como descrito aqui, pode ser usado nesses ensaios. Assim, os anticorpos podem ser usados em um imunoensaio convencional, incluindo, sem limitação, um ELISA, um RIA, FACS, imuno-histoquímica de tecido, Western blot ou imunoprecipitação. EXEMPLOS
[00118] Os exemplos ainda ilustram abaixo modalidades descritas sem limitar o escopo da invenção. Exemplo 1: Capacidade de um anticorpo de domínio único anti-MSLN exemplar da presente divulgação para mediar a morte de células T de células de câncer expressando mesotelina
[00119] Uma sequência de anticorpo de domínio único anti-MSLN exemplar é transfectada em células Expi293 (Invitrogen). A quantidade do anticorpo anti-MSLN exemplar no meio condicionado das células Expi293 transfectadas é quantificada usando um instrumento Octet com pontas de proteína A e usando um anticorpo anti-MSLN de controle como uma curva padrão.
[00120] Titulações de meios condicionados são adicionadas aos ensaios de TDCC (ensaios de citotoxicidade de células dependentes de células T) para avaliar se o anticorpo de domínio único anti-MSLN é capaz de formar uma sinapse entre células T e uma linhagem celular de câncer de ovário expressando mesotelina, OVCAR8. Viabilidade das células OVCAR8 é medida após 48 horas. É visto que o anticorpo de domínio único anti-MSLN exemplar medeia a morte de células T.
[00121] Além disso, é visto que a atividade TDCC do anticorpo anti-MSLN de domínio único exemplar é específica para células expressando mesotelina, porque o anticorpo exemplar não medeia a morte de células T de células LNCaP, que não expressam mesotelina. Exemplo 2: Métodos para avaliar atividades citotóxicas e ligação de várias proteínas de ligação a antígenos triespecíficos alvejando MSLN contendo um domínio de ligação à MSLN de acordo com a presente divulgação Produção de proteínas
[00122] Sequências de moléculas triespecíficas alvejando MSLN, contendo uma proteína de ligação à MSLN de acordo com a presente divulgação, foram clonadas no vetor de expressão de mamífero pCDNA 3.4 (Invitrogen) precedido por uma sequência líder e seguido por uma etiqueta 6x histidina. Células Expi293F (Life Technologies A14527) foram mantidas em suspensão em frascos Optimum Growth Flasks (Thomson) entre 0,2 a 8 x 1e6 células/mL em meio Expi 293. DNA plasmídeo purificado foi transfectado em células Expi293 de acordo com os protocolos do kit Expi293 Expression System Kit (Life Technologies, A14635) e mantido por 4-6 dias após a transfecção. A quantidade de proteínas triespecíficas exemplares sendo testadas, no meio condicionado, a partir das células Expi293 transfectadas foi quantificada usando um instrumento Octet com pontas de proteína A e usando uma proteína triespecífica de controle para uma curva padrão. Ensaios de citotoxicidade
[00123] Um ensaio de citotoxicidade celular dependente de célula T humana (TDCC) foi usado para medir a capacidade dos engajadores de células T, incluindo moléculas triespecíficas, para direcionar as células T para matar células de tumor (Nazarian et al. 2015. J Biomol Screen. 20: 519-27). Neste ensaio, células T e células da linhagem celular do câncer alvo são misturadas juntas em uma razão de 10:1 em uma placa de 384 cavidades, e são adicionadas quantidades variáveis das proteínas triespecíficas sendo testadas. As linhagens de células de tumor são modificadas geneticamente para expressar proteína luciferase. Após 48 horas, para quantificar as células de tumor viáveis restantes, foi usado o ensaio luminescente Steady-Glo® (Promega).
[00124] No presente estudo, titulações de meios condicionados foram adicionadas aos ensaios de TDCC (ensaios de citotoxicidade de células dependentes de células T) para avaliar se o anticorpo de domínio único anti-MSLN era capaz de formar uma sinapse entre células T e um câncer de ovário e uma linhagem de células de câncer ovariano expressando mesotelina, OVCAR8. A viabilidade das células OVCAR8 foi medida após 48 horas. Foi observado que as proteínas triespecíficas mediaram a morte de células T. Figura 1 mostra um exemplo de ensaio de viabilidade celular com proteínas triespecíficas de teste 2A2 e 2A4. O EC50 para a atividade TDCC de várias outras proteínas triespecíficas de teste está listado abaixo na Tabela 1. Tabela 1: Atividade TDCC de proteínas triespecíficas alvejando MSLN contendo uma proteína de ligação à MSLB de acordo com a presente divulgação
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[00125] Adicionalmente, foi observado que a atividade TDCC das proteínas triespecíficas alvejando MSLN sendo testada foi específicas para células expressando o mesotelina, porque as proteínas triespecíficas sendo testadas não mediaram a morte de célula T das células LNCaP, que não expressam mesotelina. As proteínas triespecíficas 2A2, 11F3, 9H2, 5C2, 10B3, 2F4, 5F2, 7F1, 2F4, 5H1, 3B4, e 7H2, em particular, não mostraram qualquer atividade TDCC com as células LnCaP. Exemplo 3: Atividade ADCC de um anticorpo de domínio único anti-MSLN exemplar da presente divulgação
[00126] Este estudo é dirigido para determinar a capacidade de um anticorpo de domínio único anti-MSLN exemplar da presente divulgação para mediar ADCC como comparado com um anticorpo anti-MSLN de lhama comparador que não tem modificações ou substituições de sequência como o anticorpo exemplar da divulgação. Ambos os anticorpos são expressados como proteínas multidomínios que incluem adicionais domínios de imunoglobulina. Materiais
[00127] Doadores são submetidos a leucoforese, e células NK são isoladas do leukopack por um grupo de purificação celular usando o sistema de seleção negativa Milteni AutoMacs Pro. As células NK são mantidas durante a noite a 4°C em um agitador, então lavadas e recolocadas em suspensão 4x106 células/mL em RPMI completo para uso em um teste ADCC.
[00128] Alvos: Alvos de células de tumor são selecionados com base na expressão de mesotelina. Alvos são lavados e contados. 6x106 alvos são recolocados em suspensão em RPMI completo e marcados em uma concentração final de 10 μM calceína (Sigma #C1359-00UL CALCEIN AM 4 MM IN ANHYDROUS DMSO) durante 4 0 minutos a 37°C, 5% CO2. As células são lavadas duas vezes em PBS, recolocadas em suspensão em RPMI completo e incubadas a 37°C, 5% CO2 por 2 h. Após a marcação, as células alvo são lavadas, recontadas e recolocadas em suspensão a 0,2x106 células/mL em RPMI completo para uso no ensaio ADCC. Métodos
[00129] O ensaio ADCC é realizado em uma placa de cultura de tecidos com 96 cavidades de fundo redondo (Corning 3799). As proteínas de teste são tituladas de 20 μg/mL a 0,0002 μg/mL, carregando 10 μL em 1000 μL de RPMI completo contendo 10% de FCS (uma diluição de 1:10). Alvos marcados com calceína são adicionados, 50 μL para conter 10.000 células. Células-alvo e várias concentrações das proteínas multidomínios que contêm o anticorpo de domínio único anti-MSLN exemplar ou o anticorpo comparador são incubadas por 40 minutos a 4°C; então, efetores de células NK adicionados, 50 μL para conter 100.000 células (razão E:T 10:1). As culturas são incubadas durante 4 horas a 37°C e os sobrenadantes são puxados e analisados quanto à liberação de calceína, medindo a fluorescência a 485-535 nm em um contador Wallac Victor II 1420 Multilable HTS. Os valores de lise de 100% são determinados por lise de seis cavidades dos alvos marcados com detergente Igepal 630 (3 μL por cavidade) e os valores de lise espontânea determinados pela medição da fluorescência nos sobrenadantes dos alvos sozinhos. Análise estatística
[00130] A porcentagem de lise específica (%) é definida como (fluorescência da amostra) - (fluorescência de lise espontânea)/(100% lise- fluorescência de lise espontânea). Lise espontânea é determinada por cavidades contendo apenas alvos e 100% de lise é determinada por cavidades em que os alvos são lisados com detergente IGEPAL CA 630. Os dados brutos são inseridos em uma planilha do Excel com fórmulas incorporadas para calcular a % de lise específica e valores resultantes transferidos para o programa gráfico (GraphPad Prism), onde os dados são transformados em um gráfico de ajuste de curva Análises subsequentes (cálculos de regressão linear) são feitas no GraphPad para gerar os valores EC50. Resultados e discussão
[00131] As células NK efetoras nas cavidades incubados com a proteína multidomínios contendo o anticorpo anti-MSLN comparador são incapazes de mediar a morte das células alvo marcadas com calceína, enquanto os efetores nas cavidades com a proteína multidomínios contendo o anticorpo de domínio único anti-MSLN exemplar da presente divulgação são, conforme medida pela atividade lítica específica (% de lise específica) capaz de mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo. Conclusões
[00132] O anticorpo de domínio único anti-MSLN exemplar da presente divulgação medeia um nível significativamente maior de morte de células alvo que expressam mesotelina, do que o anticorpo de domínio único anti-MSLN de lhama comparador sem substituições, modificação ou humanização de sequência. Exemplo 4: Atividade CDC de anticorpo de domínio único anti-MSLN exemplar da presente divulgação
[00133] Para avaliar a atividade anti-tumor de um anticorpo de domínio único anti-MSLN exemplar, de acordo com a presente divulgação, contra células de câncer, a atividade citotóxica nos modelos de células A431/H9 e NCI- H226 na presença de soro humano como um fonte de complemento é testada. O anticorpo de domínio único anti- MSLN exemplar é expressado como uma proteína multidomínios contendo domínios adicionais de imunoglobulina. Observa-se que a proteína multidomínios contendo o anticorpo de domínio único anti-MSLN exemplar da presente divulgação exerce atividade potente de CDC matando cerca de 40% das linhagens de células A431/H9 e mais de 30% das linhagens celulares de mesotelioma NCI-H226 e não mostra atividade na linhagem celular A431 mesotelina-negativa. Um anticorpo anti-MSLN de lhama comparador, que não tem modificações ou substituições de sequência como o anticorpo exemplar da divulgação, não mostra atividade nas mesmas concentrações.
[00134] A fim de analisar o papel do complemento na atividade anti-tumor do anticorpo de domínio único anti- MSLN exemplar, a citometria de fluxo é usada para determinar a ligação de C1q a células de câncer reagidas com mAbs humanos anti-mesotelina após um protocolo bem estabelecido para caracterização de rituximab, ofatumumab e outros mAbs terapêuticos anti-CD20 (Pawluczkowycz et al., J. Immunol 183: 749-758, 2009; Li et al., Cancer Res 68: 2400-2408, 2008). Foi demonstrado previamente que, como MORAb-009, o mAb humano HN1 específico para a Região I da mesotelina de superfície celular (longe da superfície celular), não exibia nenhuma atividade de CDC contra células de câncer expressando mesotelina (Ho et al., Int J Cancer 128: 2020-2030, 2011).
[00135] No entanto, é visto que o complemento C1q se liga a células A431/H9 ou NCI-H226 na presença de um anticorpo de domínio único anti-MSLN exemplar. Em contraste, nenhuma ligação de C1q é encontrada na presença do anticorpo anti-MSLN de lhama comparador. Além disso, a ligação de C1q a células de câncer está associada à ligação celular de anticorpo de domínio único anti-MSLN exemplar, de um modo dose-resposta. Estes resultados demonstram que o anticorpo de domínio único anti-MSLN exemplar demonstra atividade CDC melhorada em relação ao anticorpo anti-MSLN de lhama comparador.
[00136] Embora modalidades preferidas da presente invenção tenham sido mostradas e descritas aqui, será óbvio para os versados na técnica que tais modalidades são dadas apenas a título de exemplo. Numerosas variações, mudanças e substituições ocorrerão agora aos versados na técnica sem sair da invenção. Deve ser entendido que várias alternativas para as modalidades da invenção aqui descritas podem ser empregadas na prática da invenção. Pretende-se que as seguintes reivindicações definam o escopo da invenção e que métodos e estruturas dentro do escopo dessas reivindicações e seus equivalentes sejam assim cobertos. Exemplo 5: Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN contendo um domínio de ligação à MSLN (MH6T) de acordo com a presente divulgação dirige as células T para matar células de câncer ovariano expressando MSLN
[00137] Um ensaio de citotoxicidade celular dependente de célula T humana (TDCC) foi usado para medir a capacidade dos engajadores de células T, incluindo moléculas triespecíficas, de dirigir células T para matar células de tumor (Nazarian et al. 2015. J Biomol Screen. 20: 519-27). As células Caov3 usadas neste ensaio foram modificadas geneticamente para expressar luciferase. As células T de 5 diferentes doadores saudáveis (doador 02, doador 86, doador 41, doador 81 e doador 34) e células de câncer alvo Caov3 foram misturadas e quantidades variadas de uma proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN contendo o domínio de ligação à MSLN (MH6T) (SEQ ID NO: 58) foram adicionadas e a mistura foi incubada por 48 horas a 37 °C. As células Caov3 e as células T também foram incubadas por 48 horas a 37°C com uma molécula triespecífica de controle, GFP TriTAC (SEQ ID NO: 59), que alveja GFP. Após 48 horas, as células de tumor viáveis restantes foram quantificadas por um ensaio de luminescência.
[00138] Observou-se que a proteína de ligação ao antígeno triespecífica alvejando MSLN que contém o domínio de ligação à MSLN (MH6T) foi capaz de dirigir as células T de todos os 5 doadores saudáveis para matar as células de câncer alvo Caov3 (como mostrado na Figura 2) enquanto que a molécula GFP TriTAC de controle não foi capaz de dirigir as células T de nenhum dos cinco doadores saudáveis para matar as células Caov3 (também mostradas na Figura 2).
[00139] Um outro ensaio, usando o mesmo protocolo descrito acima, foi realizado usando células OVCAR3. Observou-se que a Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN contendo o domínio de ligação à MSLN (MH6T) foi capaz de dirigir as células T de todos os 5 doadores saudáveis para matar as células de câncer alvo OVCAR3 (como mostrado na Figura 3), enquanto a molécula GFP TriTAC de controle não foi capaz de dirigir as células T de nenhum dos cinco doadores de saúde para matar as células OVCAR3 (também mostradas na Figura 3).
[00140] Os valores de EC50 para matar as células alvo expressando MSLN são listados abaixo na Tabela II. Tabela II: Valores de EC50 para morte dirigida por Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T) de linhagens de célula de câncer ovariano expressando MSLN por células T de 5 doadores saudáveis diferentes. Gráficos representados dos dados brutos são mostrados nas Figuras 2 e 3.
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Exemplo 6: Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN contendo um domínio de ligação à MSLN (MH6T) de acordo com a presente divulgação dirige as células T para matar células expressando MSLN mas não células que não expressam MSLN
[00141] Neste ensaio, células T de um doador saudável foram incubadas com células de câncer alvo que expressam MSLN (células Caov3, células Caov4, células OVCAR3, e células OVCAR8) ou células de câncer alvo que não expressam MSLN (células NCI-H510A, células MDAPCa2b). Cada uma das células alvo usadas neste estudo foram modificadas geneticamente para expressar luciferase. Quantidades variadas de uma proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN contendo o domínio MH6T (SEQ ID NO: 58) foram adicionadas para a mistura de células T e as células de câncer alvo listadas acima. A mistura foi incubada durante 48 hours a 37°C. Após 48 horas, as células de câncer alvo viáveis restantes foram quantificadas usando um ensaio luminescente.
[00142] Foi observado que a Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN contendo o domínio MH6T foi capaz de dirigir células T para matar células de câncer alvo expressando MSLN (isto é, células Caov3, Caov4, OVCAR3, e OVCAR8, como mostrado em Figura 4). No entanto, a Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN contendo o domínio MH6T não foi capaz de dirigir células T para matar células de câncer alvo não expressando MSLN (MDAPCa2b e células NCI-H510A), também mostrado na Figura 4.
[00143] Os valores de EC50 para matar as células de câncer expressando MSLN são listados abaixo na Tabela III. Tabela III: Valores EC50 para morte de células T dirigida por Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T) de linhagens de células de câncer expressando MSLN.
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Exemplo 7: Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN contendo uma proteína de ligação à MSLN (MH6T) de acordo com esta divulgação dirigida a células T de macacos cinomolgos para matar linhagens celulares de câncer ovariano humano
[00144] Neste ensaio, células mononucleares do sangue periférico (PBMCs; células T são um componente dos PBMCs) de um doador de macaco cinomolgo foram misturadas com células de câncer alvo que expressam MSLN (células CaOV3 e células OVCAR3) e quantidades variáveis de uma proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T, SEQ ID NO: 58) e incubadas por 48 horas a 37°C. Em paralelo, uma mistura de PBMCs de cinomolgo e células expressando MSLN, como acima, foram incubadas com quantidades variadas de uma molécula TriTAC de controle GFP TriTAC (SEQ ID NO: 59) que alveja GFP, por 48 horas a 37°C. As células de câncer alvo usadas neste ensaio foram projetadas para expressar luciferase. Após 48 horas, as restantes células alvo viáveis foram quantificadas utilizando um ensaio de luminescência.
[00145] Foi observado que a proteína de ligação ao antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T) foi capaz de dirigir eficientemente PBMCs de cinomolgo para matar as células expressando MSLN (isto é, Caov3 e OVCAR), como mostrado na Figura 5, enquanto a molécula GFP TriTAC de controle não foi capaz de dirigir os PBMCs de cinomolgo para matar as células (também mostrado na Figura 5). Os valores de EC50 para a Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T) foram de 2,9 pM para células OVCAR3 e 3,0 pM para células Caov3, que não foram significativamente diferentes dos valores de EC50 observados em células T humanas, como mostrado na Tabela II. Exemplo 8: Morte dirigida por Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T) de células do mesotelioma NCI-H2052 expressando MSLN por células T na presença ou na ausência de albumina de soro humano
[00146] O objetivo deste estudo foi avaliar se a ligação à albumina de soro humano (HSA) por uma proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T; SEQ ID NO: 58) impactou a capacidade da proteína de dirigir células T para matar células expressando MSLN. Células do mesotelioma NCI-H2052 usadas neste estudo foram modificadas geneticamente para expressar luciferase. As células T de um doador saudável e as células expressando MSLN (NCI-H2052) foram misturadas e quantidades variadas de proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T) foram adicionadas à mistura. A mistura foi incubada por 48 horas a 37°C, na presença ou na ausência de HSA. Uma mistura de células NCI- H2052 e células T também foi incubada por 48 horas a 37°C com uma molécula triespecífica de controle, GFP TriTAC (SEQ ID NO: 59), que alveja GFP, na presença ou ausência de HSA. Após 48 horas, as restantes células alvo viáveis foram quantificadas usando um ensaio de luminescência.
[00147] Foi observado que a proteína de ligação ao antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T) foi capaz de dirigir eficientemente as células T para matar as células NCI-H2052 (como mostrado na Figura 6) na presença ou ausência de HSA, enquanto a molécula GFP TriTAC de controle não foi capaz de fazer isso (também mostrado na Figura 6). Também foi observado que na presença de HSA, o valor de EC50 para a morte celular foi aumentado em cerca de 3,2 vezes (como mostrado na Tabela IV).
[00148] Outros ensaios de TDCC foram realizados com a Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T), na presença ou ausência de 15 mg/ml de HSA, com linhagens celulares adicionais expressando MSLN e os valores de EC50 são apresentados na Tabela IV. Tabela IV: Valores EC50 para morte dirigida por Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínioMH6T) de células de câncer expressando MSLN por células T na presença ou ausência de HSA
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Exemplo 9: Células T de 4 doadores diferentes secretam TNF- α na presença de proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T) e células Caov4 expressando MSLN
[00149] As células de câncer alvo CaOv4 usadas neste ensaio foram modificadas geneticamente para expressar luciferase. Neste ensaio, células T de 4 doadores saudáveis diferentes (doador 02, doador 86, doador 35 e doador 81) e células Caov4 foram misturadas juntas e quantidades variadas de uma proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T; SEQ ID NO: 58) foram adicionadas e a mistura foi incubada por 48 horas a 37°C. Células Caov4 e células T também foram incubadas por 4 8 horas a 37°C com uma molécula triespecífica de controle, GFP TriTAC (SEQ ID NO: 59), que alveja GFP. O meio condicionado do ensaio TDCC foi coletado em 48 horas, antes de medir a viabilidade das células de câncer alvo, usando um ensaio de luminescência. A concentração de TNF-α no meio condicionado foi medida usando um kit de teste AlphaLISA (Perkin Elmer).
[00150] Foi observado que TNF-α foi secretado no meio na presença de células Caov4 e a Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T), mas não na presença de células Caov4 e da molécula de controle GFP TriTAC, como mostrado na Figura 7.
[00151] Além disso, morte eficiente foi observada com células T de todos os 4 doadores saudáveis, na presença da Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T), mas não na presença da molécula GFP TriTAC de controle. Ensaios de TDCC também foram definidos para linhagens celulares expressando MSLN adicionais (células Caov3, células OVCAR3 e células OVCAR8) e foi observada expressão de TNF-α similar. Os valores de EC50 para a expressão induzida por Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T) de TNF-α são apresentados na Tabela V. No entanto, quando o ensaio foi realizado usando células de câncer que não expressam MSLN (células NCI-H510A, ou células MDAPCa2b), nenhuma secreção dirigida por proteína de ligação ao antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T) de TNF-α foi observada (dados não mostrados). Assim, este estudo demonstrou que a Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T) foi capaz de ativar células T na presença de células de câncer expressando MSLN. Tabela V: Valores de EC50 para expressão induzida por Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T) de TNF-α por células T de 4 doadores de célula T diferentes e 4 linhagens de células expressando MSLN diferentes
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Exemplo 10: Ativação de expressão de CD69 em células T de 4 diferentes doadores na presença de proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T) e células OVCAR8 expressando MSLN
[00152] As células OVCAR8 usadas neste ensaio forma modificadas geneticamente para expressar luciferase. Neste ensaio, células T de 4 doadores saudáveis diferentes (doador 02, doador 86, doador 35, e doador 81) e células OVCAR8 foram misturadas juntas e quantidades variadas da Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T; SEQ ID NO: 58) foram adicionadas e a mistura incubada 48 horas a 37°C. Células OVCAR8 e células T também foram incubadas por 48 horas a 37°C com uma molécula triespecífica de controle, GFP TriTAC (SEQ ID NO: 59), que alveja GFP. Após 48 horas, células T foram coletadas, e expressão de CD69 nas células T foi medida para citometria de fluxo.
[00153] Expressão de CD69 foi detectada em células T de todos os 4 doadores saudáveis na presença de células OVCAR8 e a Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T) mas não na presença do controle negativo GFP TriTAC e células OVCAR8, como mostrado na Figura 8. Os ensaios TDCC também foram definidos para células expressando MSLN adicionais (células Caov3, células OVCAR3, e células OVCAR8) e expressão similar de CD69 foi observada. Os valores de EC50 para a ativação induzida por Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T) de CD69 em células Caov3 e células OVCAR8 são apresentados na Tabela VI. Tabela VI: Valores de EC50 para ativação de expressão de CD69 em células T de 4 diferentes doadores na presença de proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T) e células OVCAR8 ou células Caov3 expressando MSLN.
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[00154] Quando o ensaio foi realizado usando células de câncer que não expressam MSLN (células NCI-H510A ou células MDAPCa2b), a ativação induzida por Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínioMH6T) CD69 foi observada (dados não mostrados). Assim, este estudo demonstrou que a Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T) foi capaz de ativar células T na presença de células de câncer alvo expressando MSLN. Exemplo 11: Medição de ligação de proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T) a linhagens de células expressando MSLN/não expressando MSLN
[00155] Para este estudo, algumas células de câncer alvo que expressam MSLN (células Caov3, células CaOV4, células OVCAR3, e células OVCAR8) e algumas células de câncer que não expressam MSLN (células MDAPCa2b, e células NCI-H510A) foram incubadas com a Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T; SEQ ID NO: 58) ou uma molécula de GFP TriTAC de controle (SEQ ID NO: 59). Após a incubação, as células foram lavadas para remover moléculas MH6T ou GFP TriTAC não ligadas e ainda incubadas com um anticorpo secundário, que é capaz de reconhecer o domínio anti-albumina nas moléculas TriTAC, conjugadas a Alexa Fluor 647. A ligação da Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T) ou a de GFP TriTAC a células expressando MSLN ou não expressando MSLN foi medida por citometria de fluxo.
[00156] Ligação robusta da Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T) a linhagens de células que expressam MSLN (Caov3, Caov4, OVCAR3, e OVCAR8) foi observada, como visto em Figura 9A (painel à esquerda de topo mostra a ligação da proteína de ligação a antígeno alvo triespecífica alvejando MSLN contendo o domínio MH6T para células Caov3; painel à direita de topo mostra a ligação de proteína de ligação a antígeno alvo triespecífica alvejando MSLN contendo o domínio MH6T para células Caov4; painel à esquerda de fundo mostra a ligação de proteína de ligação a antígeno alvo triespecífica alvejando MSLN contendo o domínio MH6T para células OVCAR3; painel à direita de fundo mostra a ligação de proteína de ligação a antígeno alvo triespecífica alvejando MSLN contendo o domínio MH6T para células OVCAR8); e como visto em Figura 9B, nenhuma ligação foi observada em linhagens celulares que não expressam MSLN (painel à esquerda mostra falta de ligação de proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T) para células MDAPCa2b e o painel à direita mostra falta de ligação de proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T) para células NCI-H510A). Além disso, nenhuma ligação foi observada qualquer um dos tipos celulares foi incubado com a molécula GFP TriTAC, como mostrado em ambas as Figuras 9A e 9B. Exemplo 12: Medição da ligação da Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínioMH6T) a células T de doadores
[00157] Para este estudo, células T de 4 doadores saudáveis foram incubadas com uma proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T; SEQ ID NO: 58) ou um tampão como um controle negativo. Após a incubação, as células foram lavadas para remover Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN não ligada (contendo o domínio MH6T) e ainda incubadas com um anticorpo secundário conjugado a Alexa Fluor 647, que foi capaz e reconhecer o domínio anti- albumina na Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T). A ligação foi medida por citometria de fluxo.
[00158] Ligação robusta foi observada em células T de todos os quatro doadores, tratados com a Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T), como mostrado na Figura 10 (painel à esquerda de topo mostra ligação de proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T) a células T de doador 2; painel à direita de topo mostra a ligação de proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T) para células T de doador 35; painel à esquerda de fundo mostra a ligação de proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T) para células T de doador 41; painel à direita de fundo mostra a ligação de proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T) para células T de doador 81). Exemplo 13: Inibição de crescimento de tumor em camundongos tratados com Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T)
[00159] Para este estudo, 107 células NCI-H292 e 107 PBMCs humano foram co-implantados subcutaneamente em dois grupos de camundongos NCG (8 camundongos por grupo). Após 5 dias, camundongos em um grupo foram injetados com a Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T; SEQ ID NO: 58), diariamente durante 10 dias (dias 5-14) a uma dose de 0,25 mg/kg; e camundongos no outro grupo foram injetados com um controle de veículo. Os volumes de tumor foram medidos após alguns dias e o estudo foi terminado em dia 36. Inibição significante de crescimento de tumor foi observada nos camundongos injetados com a Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T), comparados como os injetados com o controle de veículo, como mostrado na Figura 11. Exemplo 12: Farmacocinética de proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T) em macacos cinomolgos
[00160] Para este estudo, dois macacos cinomolgos foram injetados com dose de 10 mg/kg de uma proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T; SEQ ID NO: 58), intravenosamente, e amostras de soro foram coletadas em após pontos no tempo após a injeção. A quantidade da Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T) no soro foi medida usando anticorpos anti-idiotipo reconhecendo a Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T), em um eletroquimioluminescente. Figura 12 mostra um gráfico para os níveis no soro da Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN no soro (contendo o domínio MH6T) em vários pontos no tempo. Os dados foram então usados para calcular as propriedades farmacocinéticas da Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T), como mostrado na Tabela VII. Tabela VII: Parâmetros farmacocinéticos para Proteína de ligação a antígeno triespecífica alvejando MSLN (contendo o domínio MH6T)
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Tabela de Sequências
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Sequências de CDR1 para vários domínios de ligação à MSLN exemplares desta divulgação Sequência
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Sequências de CDR2 para vários domínios de ligação à MSLN exemplares desta divulgação
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Sequências de CDR3 para vários domínios de ligação à MSLN exemplares desta divulgação
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Sequências de região de arcabouço 1 (f1) para vários domínios de ligação à MSLN exemplares
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Sequências de região de arcabouço 2 (f2) para vários domínios de ligação à MSLN exemplares Sequência
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Sequências de região de arcabouço 3 (f3) para vários domínios de ligação à MSLN exemplares
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Sequências de região de arcabouço 4 (f4) para vários domínios de ligação à MSLN exemplares
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Claims (8)

1. Proteína de ligação à mesotelina de domínio único, caracterizada pelo fato de que dita proteína compreende a seguinte fórmula: f1-r1-f2-r2-f3-r3-f4 em que, r1 é CDR1; r2 é CDR2; e r3 é CDR3; e em que f1, f2, f3 e f4 são resíduos de arcabouço, e em que: (i) o CDR1 compreende a sequência GSTFSIRAMR (SEQ ID Nos.: 88, e 96-98), o CDR2 compreende a sequência VIYGSSTYYADAVKGRFT (SEQ ID Nos.: 127, 135-137), e o CDR3 compreende a sequência DTIGTARDY (SEQ ID Nos.: 166, 174176); (ii) o CDR1 compreende a sequência GRTSTIDTMY (SEQ ID Nos.: 89, 99-101), o CDR2 compreende YVTSRGTSNVADSVKGRFT (SEQ ID Nos.: 128, 138-140), e o CDR3 compreende a sequência RTTSYPVDF (SEQ ID Nos.: 167, 177-179); (iii) o CDR1 compreende a sequência GSTSSINTMY (SEQ ID Nos.: 82, 86, 90, 93-95), o CDR2 compreende a sequência FISSGGSTNVRDSVKGRFT (SEQ ID Nos. 132-134), o CDR3 compreende a sequência YIPYGGTLHDF (SEQ ID Nos.: 164, 168, 171-173); (iv) o CDR1 compreende a sequência GGDWSANFMY (SEQ ID Nos.: 54, 91-92), o CDR2 compreende a sequência RISGRGVVDYVESVKGRFT (SEQ ID Nos.: 130-131), o CDR3 compreende a sequência ASY (SEQ ID Nos.: 169-170); ou (v) o CDR1 compreende a sequência GSTFRIRVMR (SEQ ID NO: 79), o CDR2 compreende a sequência VISGSSTYYADSVKGRFT (SEQ ID NO: 118), e o CDR3 compreende a sequência DDSGIARDY (SEQ ID NO: 157).
2. Proteína de ligação à mesotelina de domínio único, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita proteína se liga a um epítopo de mesotelina, em que dito epítopo está localizado em região I, compreendendo resíduos de aminoácidos 296-390 de SEQ ID NO: 57, região II compreendendo resíduo de aminoácidos 391-486 de SEQ ID NO: 57, ou região III compreendendo resíduos de aminoácidos 487598 de SEQ ID NO: 57.
3. Proteína de ligação à mesotelina de domínio único, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que dita proteína compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecida em qualquer uma das SEQ ID Nos.: 17, 26, 27, 32-40, 58 e 60-62.
4. Proteína de ligação à mesotelina de domínio único, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que f1 compreende uma sequência como estabelecida em qualquer uma das SEQ ID Nos.: 196, 205, e 208-218.
5. Proteína de ligação à mesotelina de domínio único, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que f2 compreende uma sequência como estabelecida em qualquer uma das SEQ ID Nos.: 235, 244 e 247-257.
6. Proteína de ligação à mesotelina de domínio único, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que f3 compreende uma sequência como estabelecida em qualquer uma das SEQ ID Nos.: 274, 283, e 286-296.
7. Proteína de ligação à mesotelina de domínio único, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que f4 compreende uma sequência como estabelecida em qualquer uma das SEQ ID Nos.: 313, 322, e 325-335.
8. Proteína de ligação à mesotelina de domínio único, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos como estabelecida em qualquer uma das SEQ ID Nos.: 17, 26, 27, 32-40, 58 e 60-62.
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