BR112016005408B1 - Anticorpos anti-pd1, f(ab) ou f(ab)2 e uso referido anticorpo para tratamento de cancer ou infecção viral - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS ANTI-PD1 E SEU USO COMO TERAPÊUTICA E DIAGNÓSTICO. São providos anticorpos que se ligam especificamente a morte programada -1 (PD1, Pdcd-1, ou CD279) e inibem sinalização PD1-mediada e atividades em imunocélulas, anticorpos que se ligam a um jogo de resíduos aminoácido necessários para sua ligação de ligante e usos de anticorpos para tratar ou diagnosticar câncer, doenças infecciosas ou outras desordens patológicas moduladas por funções PD1- mediadas.

Description

[001] Proteina de morte programada-1 (PD-1, também chamada de CD279) é uma proteína receptora 55 KD relacionada à família receptora CD28/CTLA4 co-estimulatório/inibitório (Blank et al., 2005 Cancer Immunol Immunother 54:307-314). Os genes e cDNAs que codificam PD-1 foram clonados e caracterizados no camundongo e humano (Ishida et al., 1992 EMBO J 11:3887-3395; Shinohara et al., 1994 Genomics 23:704-706). O comprimento total PD-1 contém 288 resíduos aminoácido (numero de acessão NCBI: NP_005009). Seu domínio extracelular consiste de resíduos aminoácido 1-167, e cauda terminal-C citoplásmica compreende resíduos 191-288, que apresenta dois padrões imuno-regulatórios hipotéticos, um padrão inibitório a base de tirosina imunoreceptor (ITIM; Vivier et al., 1997 Immunol Today 18:286-291) e um padrão de troca baseado em tirosina imunoreceptora (ITSM; Chemnitz et al., 2004 J Immunol 173:945-954).

[002] Atualmente, dois ligantes relacionados a sequência, PD-L1 (B7-H1) e PD-L2 (B7-DC), foram identificados para interagirem especificamente com PD-1, induzindo transdução de sinal intracelular que inibe ativação de célula -T mediada por CD3 e CD28 (Riley, 2009 Immunol Rev 229:114-125), que por sua vez atenua atividades de célula-T, por exemplo, redução de proliferação celular, secreção IL-2 e IFN-Y assim como outro fator de crescimento e secreção de citoquina.

[003] Expressão de PD-1 foi frequentemente encontrada em células imune tais como células-T, células B, monócitos e células exterminadoras naturais (NK). Ela era raramente expressa em outros tecidos humanos tais como músculo, epitélio, tecidos neurais, etc. Além disso, elevado nível de expressão PD-1 é muitas vezes associado à ativação de células imunes. Por exemplo, quando a linhagem de célula T humana, Jurkat, foi ativada por fitohemaglutinina (PHA) ou forbol ester (12-O-tetradecanoilforbol-13- acetato, ou TPA), a expressão de PD-1 era visível acima-regulada em Western Blot (Vibharka et al., 1997 Exp Cell Res 232:25-28). O mesmo fenômeno foi observado em linfócitos T e B murina estimulada e em células T CD4+ T humanas primárias após estimulação por anticorpo anti-CD3 (Agata et al., 1996 Int Immunol 8:765-772; Bennett et al., 2003 J Immunol 170:711-118). O aumento de expressão PD-1 após estimulação de celulas efetoras T redireciona as células efetoras T ativadas em direção a exaustão e imuno-atividades reduzidas. Portanto, o sinal inibitório PD-1-mediado desempenha um importante papel na imuno-tolerância (Bour-Jordan et al., 2011 Immunol Rev 241:180-205).

[004] Aumento da expressão PD-1 em linfócitos tumor-infiltrantes (TILs) e expressão de ligante PD-1 em células tumorais foram relatados em variedades de cânceres envolvidos em diferentes tipos de tecidos e órgãos tais como pulmão (Konishi et al., 2004 Clin Cancer Res 10:5094-5100), fígado (Shi et al., 2008 Int J Cancer 128:887-896; Gao et al., 2009 Clin Cancer Res 15:971979), estômago (Wu et al., 2006 Acta Histochem 108:19-24), rim (Thompson et al., 2004 Proc Natl Acad Sci 101:17174-17179; Thompson et al., 2007 Clin Cancer Res 13:1757-1761), mama (Ghebeh et al., 2006 Neoplasia 8:190-198), ovário (Hamanishi et al. 2007 Proc Natl Acad Sci 104:3360-3365), pâncreas (Nomi et al., 2007 Clin Cancer Res 13:2151-2157), melanócitos (Hino et al., 2010 Cancer 116:1757-1766) e esôfago (Ohigashi et al., 2005 Clin Cancer Res 11:2947-2953). Mais frequentemente, a expressão aumentada de PD-1 e PD- L1 naqueles cânceres está associada ao fraco diagnóstico de resultado de sobrevida de paciente. Camundongo transgênico com nocaute gênico PD-1 que inibe crescimento de célula cancerosa de xenoenxerto também elucidou a significância de sinalização PD-1 na modulação de imunosistema para erradicação ou tolerância de câncer (Zhang et al., 2009 Blood 114:1545-1552).

[005] Não só regulação-acima de sinalização PD-1 leva a imunotolerância em relação ao crescimento canceroso mas também à infecção viral e expansão em humanos. Os virus de infecção hepatica prevalentes, HBV e HCV, induzem a sobreexpressão de ligantes PD-1 em hepatócitos e ativam sinalização PD-1 em células efetoras T resultando na exaustão de célula T e tolerância à infecção viral (Boni et al., 2007 J Virol 81:4215-4225; Golden-Mason et al., 2008 J Immunol 180:3637-3641). Do mesmo modo, a infecção HIV evade muitas vezes o imunosistema humano por mecanismos similares. Modulação terapêutica de Sinalização PD-1 por moléculas antagonistas pode reverter células imune da tolerância e reativadas para erradicar câncer e infecção viral crônica (Blank et al., 2005 Cancer Immunol Immunother 54:307-314; Okazaki et al., 2007 Int Immunol 19:813-824).

[006] Descrição Resumida Da Invenção

[007] A invenção provê métodos e composições para imune- inibição de PD-1. Em um aspecto a invenção provê domínio que se liga ao antígeno por anticorpo que se liga especificamente a PD-1 humano, e compreende uma região de determinação de complementaridade (CDR) apresentando uma sequência selecionada de SEQ ID NOS 11-22, 31-42 e 5963.

[008] Os CDRs são amenos à recombinação na região variável de cadeia pesada (Vh) e regiões variáveis de cadeia leve (Vk) que compreendem sequências (CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3) e (CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3) respectivamente e retém ligação PD-1-específica e/ou funcionalidade.

[009] Em concretizações específicas, o domínio compreende uma região variável de cadeia pesada (Vh) ou uma região variável de cadeia leve (Vk) compreendendo:

[010] Em concretizações particulares, o domínio compreende uma região variável de cadeia pesada (Vh) e/ou uma região variável de cadeia leve (Vk) compreendendo:

[011] a) mu317 CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 (SEQ ID NOS:11-13);

[012] CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 (SEQ ID NOS:14-16);

[013] b) mu326 CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 (SEQ ID NOS:17-19); CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 (SEQ ID NOS:20-22);

[014] c) 317-4B6 CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 (SEQ ID NOS:31-33);

[015] CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 (SEQ ID NOS:34-36);

[016] d) 326-4A3 CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 (SEQ ID NOS:37-39);

[017] CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 (SEQ ID NOS:40-42);

[018] e) 317-1 CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 (SEQ ID NOS:11, 59, 13);

[019] CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 (SEQ ID NOS:14-16);

[020] f) 317-4B2 CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 (SEQ ID NOS:11, 60, 13);

[021] CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 (SEQ ID NOS:61, 15, 16);

[022] g) 317-4B5 CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 (SEQ ID NOS:11, 60, 13);

[023] CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 (SEQ ID NOS:61, 15, 16);

[024] h) 317-4B6 CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 (SEQ ID NOS:11, 32, 13);

[025] CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 (SEQ ID NOS:61, 15, 16);

[026] i) 326-1 CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 (SEQ ID NOS:17, 62, 19);

[027] CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 (SEQ ID NOS:20-22);

[028] j) 326-3B1 CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 (SEQ ID NOS:17, 62, 19);

[029] CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 (SEQ ID NOS:20-22);

[030] k) 326-3G1 CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 (SEQ ID NOS:17, 62, 19); ou

[031] CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 (SEQ ID NOS:20-22).

[032] In concretizações particulares, o domínio compreende uma região variável de cadeia pesada (Vh) e uma região variável de cadeia leve (Vk) compreendendo:

[033] (a) CDR-H1 (SEQ ID NO 31), CDR-H2 (SEQ ID NO 12, 32, 59 ou 60) e CDR-H3 (SEQ ID NO 33),

[034] CDR-L1 ( SEQ ID NO 14, 34 ou 61), CDR-L2 (SEQ ID NO 35) e CDR-L3 (SEQ ID NO 36); ou

[035] (b) CDR-H1 (SEQ ID NO 37), CDR-H2 (SEQ ID NO 18, 38 ou 62) e CDR-H3 (SEQ ID NO 39),

[036] CDR-L1 (SEQ ID NO 40), CDR-L2 (SEQ ID NO 41) e CDR-L3 (SEQ ID NO 42).

[037] Em concretizações particulares, o domínio compreende uma região variável de cadeia pesada (Vh) ou uma região variável de cadeia leve (Vk) compreendendo:

[038] Em concretizações particulares, o domínio compreende uma região variável de cadeia pesada (Vh) e uma região variável de cadeia leve (Vk) compreendendo:

[039] Em concretizações particulares, o domínio se liga especificamente a resíduos de PD1: (a) K45 e I93 (numeração AA com base em 2008 PNAS, 105:10483; equivalente a K58 e I106 na SEQ ID NO 2); ou (b) I93, L95 e P97(numeração AA cm base em 2008 PNAS, 105:10483; equivalente a I106, L108 e P110 na SEQ ID NO 2).

[040] Em concretizações particulares, o domínio induz liberação IL-2 em células HuT78/PD-1 co-cultivadas com células HEK293/OS8/PD-L1 ou com células EK293/OS8/PD-L2, e/ou inibe secreção IL-2 em células HuT78/P3Z co-cultivadas com células HEK293/PD-L1 ou com células HEK293/PD-L2.

[041] A invenção também provê um domínio efetor de cadeia pesada anticorpo IgG4 ou domínio constante compreendendo qualquer SEQ ID NO:83-88, particularmente SEQ ID NO 87 ou 88.

[042] A invenção também provê anticorpos, F(ab) ou F(ab)2 compreendendo um domínio que liga a PD-1 objeto.

[043] A invenção também prove anticorpos compreendendo um domínio que se liga PD-1 objeto e um domínio constante ou efetor de cadeia pesada IgG4 compreendendo qualquer SEQ ID NO:83-88, particularmente SEQ ID NO 87 ou 88.

[044] A invenção também provê um polinucleotídeo que codifica um domínio que se liga PD-1 objeto, particularmente sequências cDNA.

[045] A invenção provê métodos de uso dos domínios objeto mediante administração do domínio a para pessoa determinada a apresentar câncer ou infecção viral a de outro forma que necessite de antagonismo PD-1.

[046] A invenção também provê proteínas de fusão compreendendo: (a) um fragmento variável de cadeia simples (scFv) de um CD3 mAb OKT3 anti-humano fusionado ao domínio de terminal C (113-220) de rato CD8α (SEQ ID NO:89); ou (b) os domínios extracelular e de transmembrana de PD-1 humano fusionado ao domínio citoplásmico de cadeia CD3Z humano (SEQ ID NO: 90).

[047] A invenção também provê métodos de uso d proteínas de fusão objeto compreendendo realização de testes, varreduras ou seleção de anticorpos anti-PD-1 a com uma linhagem celular que expressa a proteína de fusão.

[048] Breve Descrição Dos Desenhos

[049] A figura 1. Apresentação esquemática de PD-1/Fc (topo) e PD-1/His (fundo). ECD: domínio extracelular. L: linker. H: His tag. Fc: fragmento □4Fc de IgG4 humano . N: terminal N. C: terminal C.

[050] A figura 2. Curvas de reação dose-dependente de mAbs murinho que se liga a PD-1 humano em ELISA. Os mAbs murino foram indicados no canto topo—esquerda de cada figura. MAb 317 e 517 compartilham elevado grau de homologia da região variável de cadeia pesada e cadeia leve. A potência de sinal ligante foi indicada por leituras OD450 diretas. O antígeno, PD-1/His, foi revestido em concentrações crescentes de até 70 nanogramas por cavidade em um volume de 50 microlitros. O método foi descrito no Exemplo 1.

[051] Figura 3. Curva de reação dose-dependente de mAbs murino que se liga a PD-1 humano expresso em células vivas por análises FACS. Códigos de anticorpo murinho e EC50 foram indicados em cada painel. MFI significa intensidade de fluorescência media. Células HuT78/PD-1 foram suspensas em placa de 96 cavidades em células 5 X 104 por cavidade para FACS. mAbs PD-1 que se ligam ao alvo de superfície celular e detecção FACS foram executadas conforme descrito no Exemplo 1.

[052] Figura 4. Apresentação esquemática dos sistemas de co- cultura celular usados para atividades funcionais de testes de mAbs Anti-PD- 1. Células T (seja CD4+ ou CD8+) representam HuT78/PD-1 ou células T primárias em PBMCs. TCR: Receptor de célula T. N: nucleo. C: citoplasma

[053] Figura 5. Curva de reação dose-dependente de secreção IL-2 mAb-murino induzida em células HuT78/PD-1 co-cultivadas com células HEK293/OS8/PD-L1. Linha de base: Liberação IL-2 média induzida por mIgGs em todas as concentrações testadas. Linha de topo: Liberação IL-2 maior baseada em cálculo de regressão pelo software Prizm.

[054] Figura 6. (A) Histogramas mostrando secreção IFN- induzida por mAbs Anti-PD-1 em PBMCs (Doador-19) co-cultivada com linhagem celular HEK293/OS8/PD-L1. (B) Histogramas mostrando secreção IFN- I induzida por mAbs Anti-PD-1 em PBMCs ( Donor-20) co-cultivada com linhagem celular HEK293/OS8/PD-L1.

[055] Figura 7. Atividades de (A) e (B) ADCC de mAbs Anti-PD-1 por co-cultura de células efetoras (NK92MI/PD-1) e células-alvo (HuT78/PD-1). Meios foram calculados a partir de dois pontos de dados dos testes representativos. Os mAbs foram adicionados à concentração de 10ng/ml. Teste executado como descrito no Exemplo 9.

[056] Figura 8. Mapeamento dos epitópos de ligação de mAbs Anti-PD-1 por ELISA (painel superior) e Western Blot (painel inferior). Meio condicionado contendo WT ou Mt PD-1 foram usados para acessar atividade de ligação por ELISA e Western Blot. ** indica os resíduos AA para os quais a atividade de ligação a mAb reduzido a 25-50% de WT PD-1. *** indica os resíduos AA para os quais a atividade de ligação a mAb reduzido abaixo de 25% de WT PD-1.

[057] Figura 9. Liberação IFN- induzida por mAbs Anti-PD-1 humanizado em PBMCs humanos primários de diferentes doares saudáveis que eram co-cultivadas com células HEK293/OS8/PD-L1.

[058] Figura 10. Citotoxicidade de células NK92MI/PD-1 aumentada por mAbs Anti-PD-1 humanizadas, hu317 (A) e hu326 (B). As células cancerígenas de pulmão-alvo, SK-MES-1/PD-L1, foram co-cultivadas com as células efetoras na razão (T a E) de 1 a 2, e testada como descrito no Exemplo 12.

[059] Figura 11. Curvas de crescimento tumoral individual em três grupos de tratamento, veículos (PBS), IgGs (huIgGs) humanos e mAb PD- 1 (hu317-1/IgG4mt2). Cada curva representa uma via de crescimento tumoral, o camundongo portador de tumor codificado por números indicados à direita de cada painel. Células Hep3B/OS8/PD-L1 (estabelecidas a partir de linhagem de carcinoma hepatocelular Hep3B) foram semeadas no dia 1, PBMCs foram implantados no dia 15 e três doses de hu317-1/IgG4mt2 foram injetadas no dia 18, 28 e 38, respectivamente. Métodos descritos no Exemplo 12.

[060] Descrição De Concretizações Particulares Da Invenção

[061] PD-1 inicia sinalização inibitória em células imunes quando engatadas por seus ligantes, PD-L1 ou PD-L2. Os casos de crescimento de cancer e infecção viral, a ativação de Sinalização PD-1 promove tolerância imune, levando aos cânceres ou células vírus-infectadas escapando de vigilância imunológica e metástases de câncer ou aumento de carga viral. Inibição de sinalização celular PD-1 -mediada por agentes terapêuticos pode ativar células imunológicas incluindo célulasT, células B e células NK e portanto aumentam funções celulares imunológicas inibindo o crescimento celular cancerígeno ou infecção viral e restauram sobrevivência imunológica e função de memória imune para tratar tais doenças humanas.

[062] A invenção provê anticorpos cujas funções são antagonísticas para a sinalização celular PD-1-mediada e ligante-induzida em células imunes. Anticorpos anti-PD-1 murino foram humanizados a um elevado grau de similariedade para anticorpos humanos nas regiões estruturais. Os anticorpos completos feitos no formato de variante IgG4 humano modificado apresentam um único jogo de características nos aspectos de funções efetoras e propriedades fisico-químicas. Os anticorpos anti-PD-1 descritos são adequados para usos terapêuticos no tratamento de câncer controlando infecções virais e outras doenças humanas que estão mecanisticamente envolvidas na imunotolerância exarcebada.

[063] Definições

[064] A menos que o contexto apresente indicação diferente, o termo "anticorpo" é usado num sentido mais amplo e especificamente abrange anticorpos (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento completo) e fragmentos de anticorpos enquanto eles reconhecerem PD-1. Uma molécula de anticorpo é usualmente monoespecífica mas pode também ser descrita como idioespecífica, heteroespecífica ou poliespecífica. Moléculas de Anticorpo se ligam por meio de sítios de ligação específicos a determinantes antigenóicos específicos ou epítopos em antígenos. "Fragmentos de Anticorpo " compreendem uma porção de um anticorpo de comprimento completo, geralmente a região variável ou de ligação de antígeno deste. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab').sub.2, e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo.

[065] Anticorpos monoclonais (MAbs) podem ser obtidos por métodos conhecidos pelo versado na técnica. Vide, por exemplo Kohler et al (1975); U.S. Pat. No. 4,376,110; Ausubel et al (1987-1999); Harlow et al (1988); e Colligan et al (1993). Os mAbs da invenção podem ser de qualquer classe de imunoglobulina incluindo IgG, IgM, IgE, IgA, e qualquer subclasse desta. Uma hibridoma que produz um mAb pode ser cultivada in vitro ou in vivo. Títulos altos de mAbs podem ser obtidos em produção in vivo onde células das hibridomas individuais são injetadas por via intraperitoneal no camundongo tais como camundongo Balb/c pristina-primado para produzir fluido ascítico contendo elevadas concentrações de mAbs desejados. MAbs de isótopo IgM ou IgG podem ser purificados a partir de fluídos ascíticos ou a partir de sobrenadantes de cultura utilizando métodos de cromatografia de coluna bastante conhecidos pelo versado na técnica.

[066] Um " polinucleotídeo isolado" refere-se a um segmento de polinucleotídeo ou fragmento que haviam sido separados de sequências que o flanqueiam em um estado de ocorrência natural, por exemplo, um Fragmento de DNA que havia sido removido das sequências que ficam normalmente adjacentes ao fragmento, por exemplo, as sequências adjacentes ao fragmento em um genoma no qual ele ocorre naturalmente. O termo deste inclui, por exemplo, um DNA recombinante que é incorporado em um vetor, em um plasmídeo autonomamente replicante ou vírus ou no DNA genômico de um procarioto ou eucarioto ou que existe como uma molécula separada (por exemplo, como um cDNA ou um genômico ou cFragmento de DNA produzido por PCR ou digestão de enzima de restrição) independente de outras sequências. Ele também inclui um DNA recombinante, que é parte de um gene híbrido que codifica sequência de polipetpídeo adicional.

[067] Um "construto" significa qualquer molécula de polinucleotídeo recombinante tal como um plasmídeo, cosmídeo, vírus, molécula de polinucleotídeo autonomamente replicante, fágo, ou molécula de polinucleotídeo DNA e RNA de fita dupla, ou fita simples linear ou circular derivada de qualquer fonte, capaz de integração genômica ou replicação autônoma compreendendo uma molécula de polinucleotídeo onde uma ou mais molécula de polinucleotídeo havia sido ligada de modo funcionalmente operacional, i.e. operacionalmente ligada. Um construto recombinante compreenderá tipicamente os polinucleotídeos da invenção operacionalmente ligados a sequências de iniciação transcricional regulatórias que direcionam a transcrição do polinucleotídeo na célula hospedeira pretendida. Tanto promotores heterólogos como não-heterólogos (i.e., endógenos) podem ser empregados para direcionar a expressão dos ácidos nucléicos da invenção.

[068] Um "vetor" refere-se a qualquer construto polinucleotídeo recombinante que pode ser usado para fins de transformação, i.e. a introdução de DNA heterólogo em uma célula hospedeira. Um tipo de vetor é um um "plasmídeo ", que refere-se a um loop DNA de fita dupla circular no qual segmentos DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, sendo que segmentos DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira que eles podem ser introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação e vetores mamíferos epissomais). Outros vetores (por exemplo, vetores mamíferos não-epissomais) são integrados no genoma de uma célula hospedeiras pós introdução na célula hospedeira e portanto são replicadas junto com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles estão operacionalmente ligados. Tais vetores são chamados aqui de "vetores de expressão ".

[069] Um "vetor de expressão" conforme aqui usado refere-se a uma molécula de acido nucléico capaz de replicação e expressão de um gene de interesse quando transformado, transfectado ou transduzido em uma célula hospedeira. Os vetores de expressão compreendem um ou mais marcadores selecionáveis fenotípicos e uma origem de replicação para assegurar a manutenção do vetor e se desejado, para prover amplificação dentro do hospedeiro. O vetor de expressão também compreende um promotor para conduzir a expressão do polipeptídeo dentro das células. Vetores de expressão adequados podem ser plasmídeos derivados, por exemplo, de pBR322 ou vários plasmídeos pUC, que são comercialmente disponíveis. Outros vetores de expressão podem ser derivados de vetores de expressão bacteriófagos, fagemídeos, ou cosmídeos.

[070] Concretizações adicionais da invenção

[071] Em concretizações específicas a invenção provê anticorpos monoclonais de camundongo identificado de varredura de clones de hibridoma murinho como descrito aqui.

[072] Em outras concretizações a invenção provê composições das sequências de proteína e polinucleotídeo seguintes :

[073] a) A sequência cDNA, SEQ ID NO 3, codificando a região variável de cadeia pesada de mAb 317 murino;

[074] b) A sequência de proteína da região variável de cadeia pesada de mAb 317 murino ou mu317_Vh (SEQ ID NO 4);

[075] c) A sequência cDNA, SEQ ID NO 5, codificando a região variável de cadeia leve de mAb 317 murino;

[076] d) A sequência de proteína da região variável de cadeia leve de mAb 317 murino ou mu317_Vk (SEQ ID NO 6);

[077] e) A sequência de cDNA, SEQ ID NO 7, codificando a região variável de cadeia pesada de mAb 326 murino;

[078] f) A sequência de proteína da região variável de cadeia pesada de mAb 326 murino ou mu326_Vh (SEQ ID NO 8);

[079] g) A sequência cDNA, SEQ ID NO 9, codificando a região variável de cadeia leve de mAb 326 murino;

[080] h) A sequência de proteína da região variável de cadeia leve of mAb 326 murino or mu326_Vk (SEQ ID NO 10).

[081] Em um aspecto, a invenção provê composições compreendendo sequências (CDR) de região determinante de complementariedade que mediam a ligação ao antígenos-alvo, PD-1, incluindo as sequências CDR de mu317 e m326:

[082] a) A CDR1 de cadeia pesada de mu317 (mu317 H-CDR1) contém sequência de aminoácido de GFSLTSYGVH (SEQ ID NO 11);

[083] b) A mu317 H-CDR2 contém sequência de aminoácido de VIWAGGSTNYNSALMS (SEQ ID NO 12);

[084] c) A mu317 H-CDR3 contém sequência de aminoácido de ARAYGNYWYIDV (SEQ ID NO 13);

[085] d) A CDR1 de cadeia leve mu317 (mu317 L-CDR1) contém sequência de aminoácido de KASQSVSNDVA (SEQ ID NO 14);

[086] e) A mu317 L-CDR2 contém sequência de aminoácido de YAFHRFT (SEQ ID NO 15);

[087] f) A mu317 L-CDR3 contém sequência de aminoácido de HQAYSSPYT (SEQ NO 16);

[088] g) O mu326 H-CDR1 contém sequência de aminoácido de GYTFTNYGMN (SEQ ID NO 17);

[089] h) O mu326 H-CDR2 contém sequência de aminoácido de WINNNNGEPTYAEEFKG (SEQ ID NO 18);

[090] i) O mu326 H-CDR3 contém sequência de aminoácido de ARDVMDY (SEQ ID NO 19);

[091] j) O mu326 L-CDR1 contém sequência de aminoácido de RASESVDNYGYSFMH (SEQ ID NO 20);

[092] k) O mu326 L-CDR2 contém sequência de aminoácido de RASNLES (SEQ ID NO 21);

[093] l) O mu326 L-CDR3 contém sequência de aminoácido de QQSKEYPT (SEQ ID NO 22).

[094] Em outra concretização a invenção provê composições compreendendo as sequências dos anticorpos monoclonais de humanização emanadas de mAbs murino mu317 e mu326, incluindo:

[095] a) O mAb hu317-4B6 humanizado compreende sequência de proteína de região variável de cadeia pesada (Vh) como SEQ ID NO 24, que é codificada por

[096] b) o cDNA de hu317-4B6_Vh (SEQ ID NO 23);

[097] c) O mAb hu317-4B6 humanizado também compreende sequência de proteína de região variável de cadeia leve (Vk) como SEQ ID NO 26, que é codificado por

[098] d) o cDNA de hu317-4B6 (SEQ ID NO 25);

[099] e) O mAb hu326-4A3 humanizado compreende sequência de proteína de Vh como SEQ ID NO 28, que é codificado por

[0100] f) o cDNA de hu326-4A3-Vh (SEQ ID NO 27);

[0101] g) O mAb hu326-4A3 humanizado também compreende sequência de proteína de Vk como SEQ ID NO 30, que é codificada por

[0102] h) o cDNA de hu326-4A3_Vk (SEQ ID NO 29);

[0103] i) as sequências de proteína de hu317-4B2_Vh (SEQ ID NO 43) e hu317-4B2_Vk (SEQ ID NO 44);

[0104] j) As sequências de proteína de hu317-4B5_Vh (SEQ ID NO 45) e hu317-4B5_Vk (SEQ ID NO 46);

[0105] k) A sequência de proteína de hu317-1_Vh (SEQ ID NO 48) e o cDNA codifica hu317-1_Vh (SEQ ID NO 47);

[0106] l) A sequência de proteína de hu317-1_Vk (SEQ ID NO 50) e o cDNA que codifica hu317-1_Vk (SEQ ID NO 49);

[0107] m) As sequências de proteína de hu326-3B1_Vh (SEQ ID NO 51) e hu326-3B1_Vk (SEQ ID NO 52);

[0108] n) As sequências de proteína de hu326-3G1_Vh (SEQ ID NO 53) e hu326-3G1_Vk (SEQ ID NO 54);

[0109] o) A sequência de proteína de hu326-1_Vh (SEQ ID NO 56) e o cDNA codifica hu326-1_Vh (SEQ ID NO 55);

[0110] p) A sequência de proteína de hu326-1_Vk (SEQ ID NO 58) e o cDNA codifica hu326-1_Vk (SEQ ID NO 57);

[0111] q) As sequências de proteína de outros mAbs humanizados emanados de mu317 (SEQ ID NO 63-74);

[0112] r) As sequências de proteína de outros mAbs humanizados de mu326 (SEQ ID NO 75-82);

[0113] Em um aspecto, a invenção provê composições compreendendo as sequências CDR dos anticorpos monoclonais humanizados. Os CDRs podem ser compartilhados entre as mesmas séries de mAbs humanizados, tais como hu317 ou hu326 (vide tabela 15-16). CDRs não- redundantes são listados a seguir:

[0114] a) Sequência H-CDR1 de GFSLTSYGVH (SEQ ID NO 31), compartilhada por todos mAbs hu317 e mu317 humanizados nas cadeias pesadas;

[0115] b) Sequência H-CDR3 de ARAYGNYWYIDV (SEQ ID NO 33), compartilhada por todos os mAbs hu317 e mu317 humanizados nas cadeias pesadas;

[0116] c) Sequência L-CDR1 de KSSESVSNDVA (SEQ ID NO 34), compartilhada por todos os mAbs hu317-4B2, hu317-4B5 e hu317-4B6 humanizados nas cadeias leves;

[0117] d) Sequência L-CDR2 de YAFHRFT (SEQ ID NO 35), compartilhada por todos os mAbs hu317 e mu317 humanizados nas cadeias leves;

[0118] e) Sequência L-CDR3 de HQAYSSPYT (SEQ ID NO 36), compartilhada por todos os mAbs hu317 e mu317 humanizados nas cadeias leves;

[0119] f) Sequência H-CDR2 de VIYADGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO 32) em hu317-4B6_Vh;

[0120] g) Sequência H-CDR2 de VIYAGGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO 60) em hu317-4B2_Vh e hu317-4B5_Vh;

[0121] h) Sequência H-CDR2 de VIWAGGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO 59) em hu317-1_Vh;

[0122] i) Sequência L-CDR1 de KASQSVSNDVA (SEQ ID NO 11) em hu317-1_Vk;

[0123] j) Sequência H-CDR1 de GYTFTNYGMN (SEQ ID NO 37), compartilhada totalmente por mAbs hu326 e mu326 humanizados nas cadeias pesadas;

[0124] k) Sequência H-CDR3 de ARDVMDY (SEQ ID NO 39), compartilhada totalmente por mAbs hu326 e mu326 humanizados nas cadeias pesadas;

[0125] l) Sequência L-CDR1 de RASESVDNYGYSFMH (SEQ ID NO 40), compartilhada totalmente por mAbs hu326 e mu326 humanizados nas cadeias leves;

[0126] m) Sequência L-CDR2 de RASNLES (SEQ ID NO 41), compartilhada totalmente por mAbs hu326 e mu326 humanizados nas cadeias leves;

[0127] n) Sequência L-CDR3 de QQSKEYPT (SEQ ID NO 42), compartilhada totalmente por mAbs hu326 e mu326 humanizados nas cadeias leves;

[0128] o) Sequência H-CDR2 de WINNNNAEPTYAQDFRG (SEQ ID NO 38) em hu326_4A3_Vh;

[0129] p) Sequência H-CDR2 de WINNNNGEPTYAQGFRG (SEQ ID NO 62) no Vh de hu326_1 e outros hu317 mAbs.

[0130] Em outro aspecto, a invenção provê epítopos de ligação específica do mAbs Anti-PD-1 humanizado no antígeno, e uso funcional destes. Seis resíduos de aminoácido (AA) críticos em PD-1 necessários para a ligação de ligante foram mutados individualmente e proteínas mutantes e do tipo selvagem PD-1 foram usadas para acessar os epítopos de ligação. O resíduo cuja mutação danificou significativamente a ligação de anticorpo é reconhecido como uma chave ou epítopo de ligação significativa. Epítopos de ligação significativa de mAbs hu317-4B5 e hu317-4B6 são K45 e I93 (numeração AA com base em 2008 PNAS, 105:10483; equivalente a K58 e I106 na SEQ ID NO 2); e epítopos de ligação significativa de mAbs hu326-3B1 e hu317-4A3 são I93, L95 e P97 (numeração AA com base em 2008 PNAS, 105:10483; equivalente a I106, L108 e P110 na SEQ ID NO 2).

[0131] Em um outro aspecto, a invenção provê composições compreendendo as sequências de região constantes de variantes IgG4 humanas recombinantes, que podem ser ligadas às regiões variáveis dos anticorpos- objeto incluindo os mAbs Anti-PD-1 humanizados, que mostraram funções efetoras preferidas e propriedades fisico-químicas. As sequências são como segue:

[0132] A sequência de região constante de IgG4mt10 (SEQ ID NO 88);

[0133] a) A sequência de referência de IgG4mt1 (SEQ ID NO 83);

[0134] b) A sequência de referência de IgG4mt2 (SEQ ID NO 84);

[0135] c) A sequência de referência de IgG4mt6 (SEQ ID NO 85);

[0136] d) A sequência de referência de IgG4mt8 (SEQ ID NO 86);

[0137] e) A sequência de referência de IgG4mt9 (SEQ ID NO 87).

[0138] Em outra concretização, a invenção provê métodos para realização de testes de funções de anticorpo anti-PD-1 utilizando um plasmídeo que expressa a proteína de fusão recombinante, OS8, para gerar linhagens celulares estáveis, HEK293/OS8/PD-L1 ou HEK293/OS8/PD-L2, que co- expresse OS8 (uma molécula de ativação de célula T) e um ligante PD-1. As linhagens celulares foram usadas para engatar células T e PBMCs por co- cultura para acessar a funcionalidade de mAbs Anti-PD-1 (vide Exemplo 3 e Exemplo 4). Alternativamente, outro plasmídeo que expressa a proteína de fusão recombinante, P3Z, foi usado para gerar linhagem celular estável, HuT78/P3Z, na qual P3Z funciona como sensor molecular e mediador de transdução de sinal. Quando P3Z é engatado pelo ligante PD-1 ele irá transmitir sinal intracelular para ativar a liberação IL-2 nas células HuT78. Os sistemas podem ser usados para acessar efeito inibitório de mAbs Anti-PD-1 (vide Exemplo 3).

[0139] Em um aspecto, a invenção provê composições compreendendo a sequência de aminoácidos da proteína de fusão recombinantes como segue:

[0140] a) sequência de proteína de OS8 (SEQ ID NO 89);

[0141] b) sequência de proteína de P3Z (SEQ ID NO 90).

[0142] Em outro aspecto, a invenção prove métodos de geração das linhagens celulares estáveis que expressam |as proteínas de fusão recombinantes aqui descritas e métodos de utilização do sistema para testar quantitativamente as atividades funcionais de mAbs Anti-PD-1.

[0143] Em outra concretização a invenção provê polinucleotídeos codificando uma proteína-objeto. Os polinucleotídeos podem ser ligados operacionalmente a uma transcrição heteróloga que regula a sequência para expressão e podem ser incorporadas em vetores, células, etc.

[0144] Em outra concretização, a invenção provê os anticorpos anti-PD-1 murino e anticorpos anti-PD-1 versão humanizada, incluindo hu317- 4B6, hu317-4B5, hu317-4B2, etc., e hu326-4A3, hu326-3B1, hu326-3G1, etc., apresentando funções para suprimir transdução de sinal PD-1-mediado e para ativar imunocélulas que disparam uma cascata de imunorespostas incluindo secreção de citoquina e citotoxicidade na direção de células-alvo tais como células cancerígenas e tal uso funcional dos anticorpos.

[0145] Em um aspecto, a invenção provê anticorpos anti-PD-1 humanizados que ativam diversos tipos de imunocélulas que expressam PD- 1, incluindo célula T humanas, células NK e PBMCs, cujas funções são para amplificar os sinais de imunoresposta para mobilizar imunosistema e agir como imunocélulas efetoras para eliminação de células cancerígenas e infecções virais e tal uso funcional dos anticorpos.

[0146] Em outro aspecto, os mAbs Anti-PD-1 humanizados são usados como agentes terapêuticos para tratar doenças humanas que estão envolvidas na supressão de imunocélulas por sinalização intracelular PD-1- mediada levando a uma progressão, particularmente cânceres e infecções virais.

[0147] As composições da invenção são úteis para o tratamento de câncer, doenças neurodegenerativas e infeciosas, particularmente virais e outras condições nas quais a expressão inapropriada ou prejudicial do PD-1 humano e/ou é um componente da etiologia ou patologia da condição. Portanto, a invenção provê métodos para o tratamento de câncer ou inibição de progressão tumoral em um indivíduo que necessite deste com uma proteína anti-PD-1 - objeto. A invenção também provê o uso de polinucleotídeos-objeto para a fabricação de um medicamento para tratamento de câncer ou inibição de progressão tumoral em um indivíduo.

[0148] A invenção inclui combinações das concretizações particulares indicadas. Outras concretizações e o escopo complete de aplicabilidade da invenção ficarão aparentes a partir da descrição detalhada apresentada a seguir. Porém, naturalmente que a descrição detalhada e exemplos específicos, indicando ao mesmo tempo concretizações preferidas da invenção, são indicados a título de ilustração somente, já que várias alterações e modificações dentro do espírito e do escopo da invenção ficarão patentes ao versado na técnica a partir desta descrição detalhada. Todas as publicações, patentes, e pedidos de patente aqui citados, incluindo ali citações, são aqui incorporados por referência em sua totalidade para todos os fins.

[0149] Exemplos

[0150] Exemplo 1. Geração de anticorpo monoclonal anti-PD-1

[0151] Anticorpos monoclonais Anti-PD-1 (mAbs) foram gerados com base na tecnologia de fusão hibridoma convencional (Kohler e Milstein 1976 Eur J Immunol 6:511-519; de St Groth and Sheidegger 1980, J Immunol Methods 35:1-21; Mechetner 2007 Methods Mol Biol 378:1-13) com modificações pequenas. MAbs com atividades de ligação elevadas no ensaio imunosorbente ligado à enzima (ELISA) e ensaio de separação de células ativadas por fluorescência (FACS) foram selecionados para posterior caracterização.

[0152] Proteina PD-1 recombinante para ensaios de imunização e ligação

[0153] Plasmídeo de expressão contendo cDNA de PD-1 humano de comprimento completo foi obtido a partir de Origene (Cat. No. SC117011, NCBI Acesso No: NM_005018.1, Beijing, China). O domínio extracelular consistindo em aminoácido (AA) 1-168 de PD-1 (SEQ NO.1, SEQ NO.2) era amplificado por PCR e subclonado no vetor de expressão a base de pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) com terminal-C fusionado seja para um domínio His6 tag ou para domínio uFc de cadeia pesada de IgG4 humano que resultou em dois plasmídeos de expressão de proteínas de fusão recombinantes, PD-1-EC/His e PD-1-EC/Fc (abreviado como PD-1/His e PD-1/Fc). A apresentação esquemática de proteínas de imunogene/antígeno está mostrada na figura 1. Para a produção de proteína de fusão recombinante, plasmídeos PD-1/His e PD-1/Fc foram transfectados transientemente nas células 293-F em 1-3 litros de meio (Invitrogen), e cultivadas por 5-7 dias em um incubador CO2 equipado com agitador por rotação. O sobrenadante contendo a proteína recombinante foi coletado e eliminado por centrifugação em 15000g para 30 minutos. PD-1/His foi purificado através da cromatografia de afinidade de metal imobilizada utilizando Ni-Sepharose Fast Flow (Cat. No. 17531801, GE Lifesciences, Shanghai, China), seguido por cromatografia de exclusão por tamanho utilizando uma coluna HiLoad 16/60 Superdex 200 (Cat. No. 17106901, GE Lifesciences, Shanghai, China). PD-1/Fc foi purificado utilizando uma coluna de fluxo rápido Sepharose de proteína G (Cat. No. 17061805, GE Lifesciences). Ambas as proteínas Both PD-1/His e PD-1/Fc foram dializadas em relação a solução salina tamponada de fosfato (PBS) e armazenadas em congelador a -80oC em pequenas alíquotas.

[0154] O cDNA que codifica PD-L1 humano foi quimicamente sintetizado por Genescript (Nanjing, China) com base na sequência publicada (NCBI acesso No. NM_014143). O plasmídeo de expressão PD-L2 foi adquirido da Origene (Cat. No. SC108873, NCBI Acesso No. NM_025239.2, Beijing, China). Ambos cDNAs foram clonados em pcDNA3.1/Higromicina (Cat. No. V870-20, Invitrogen), e pcDNA3.1/V5-His (Cat. No. V810-20, Invitrogen), respectivamente.

[0155] Linhagem celular estável

[0156] Linhagens celulares estáveis que expressam PD-1 humano, PD-L1 ou PD-L2 foram estabelecidos por transfecção de plasmídeos pcDNA3.1 contendo PD-1, PD-L1 e PD-L2 to HUT78 (ATCC, Manassas, VA, USA) e HEK293 (ATCC), respectivamente, e seguido por seleção com meio contendo 200 microgramas de higromicina (Cat. No. 10687-010, Invitrogen) ou 1 mg de G418 (Sigma) por mililitro. Clones simples foram isolados por método convencional seja diluição limitada ou captação de colônias simples a partir de superfície de cavidade. Todos os clones foram varridos por análise Western blot e FACS utilizando anticorpos anti-PD-1, PD-L1 e PD-L2 (Cat. No. 12-9969, 17-5983, 12-5888, eBioscience, San Diego, USA), respectivamente, e os clones de expressão de topo foram selecionados para ensaio de ligação de FACS para varrer anticorpos monoclonais de hibridoma ou usados em ensaios funcionais.

[0157] Imunização, fusão de hibridoma e clonagem

[0158] Camundongos Balb/c de oito a doze semanas de vida (da BEIJING HFK BIOCSIENCE CO.,LTD, Beijing, China) foram imunizados por via subcutânea com 100ul de adjuvante (Cat. No. KX0210041, KangBiQuan, Beijing, China) contendo 5 microgramas de PD-1/Fc. A imunização foi conduzida por duas injeções do imunogeno acima com três semanas à parte. Duas semanas após 2a imunização os camundongos sera foram analisados por ligação de PD-1 por FACS (seções seguintes). Os camundongos com títulos de anticorpo anti-PD-1 elevados em sera foram selecionados e reforçados por via intraperitoneal com 50 microgramas de PD-1/Fc na ausência de qualquer adjuvante. Três dias após o reforço, os esplenócitos foram isolados e fusionados com a linhagem celular de mieloma murino, células SP2/0 (ATCC), utilizando técnicas padrão (Gefter, M.L. et al., 1977 Somat Cell Genet, 3:231236).

[0159] Atividade de ligação de PD-1 de acesso de anticorpos por ELISA e FACS

[0160] Os sobrenadantes de clones de hibridoma foram inicialmente varridos por ensaio de imuno-sorbente ligado à enzima (ELISA) conforme descrito em “Flanagan, M.L. et al. 2007 Methods in Molecular Biology 378:33-52” com algumas modificações. Resumidamente, 50-200 nanogramas de protéina PD-1/His ou PD-1/Fc em 50 microlitros de solução salina de fosfato (PBS) foram revestidos em placa de 96 cavidades (Shenzhen JinCanHua Industry Co., Ltd, Shenzhen, China) por base de cavidade. O anticorpo de IgC anti-camundongo ligado à HRP (Cat. No. 7076S, Cell Signaling Technology, USA e Shanghai, China) e reagente quimioluminescente (Cat. No. PA107-01, TIANGEN, China) foram usados para detectar e desenvolver o sinal ELISA que foram lidos por um leitor de placa (PHREAstar FS, BMG LABTECH, Alemanha) em comprimento de onda de 450 nm. Os clones de produtos de anticorpo ELISA-positivo foram depois analisados por separação de célula fluorescência-ativada (FACS) utilizando-se um método convencional. Linhagens celulares de expressão estável PD-1, HuT78/PD-1 (105 células/cavidade), descritas acima foram tingidas com sobrenadantes de hibridomas anti-PD-1 em placas de 96 cavidades de fundo V (Cat. No. 3897, Corning, USA e Shanghai, China). Para bloquear receptores Fc humanos, células foram pré-incubadas com IgG humano (20 g/ml) (Cat. No. H11296, LifeHolder, USA e Shanghai, China). Anticorpos PD-1 foram detectados com anticorpo IgG anti-camundongo goat DylightTM 649-marcado (Cat. No. 405312, Biolegend, San Diego, USA) e fluorescência celular foi monitorada utilizando-se um citômetro de fluxo (Guava easyCyte 8HT, Merck-Millipore, USA e Shanghai, China).

[0161] Os meios condicionados de células de hibridoma que mostraram sinal positivo em ambos os ensaios ELISA e FACS foram submetidos a ensaios funcionais para identificar anticorpos com boa atividade funcional em ensaios a base de imunocelula humana (neste caso). Os anticorpos com atividade funcional positiva foram depois subclonados e caracterizados.

[0162] Subclonagem e adaptação ao meio livre de soro ou com pouco soro

[0163] Os clones de hibridoma de varredura primária através de ELISA, FACS e ensaios funcionais foram subclonados pelo método convencional de diluição limitada. Cada um dos clones positivos foram colocados em placas de 96 cavidades cultivados em meios RPMI1640 (Cat. No. SH30809.01B, Hyclone, Shanghai, China) com soro bovino fetal a 10% (FBS, Cat. No. SH30084.03, Hyclone, Beijing, China) em incubador CO2. Três subclones de cada placa de diluição limitada foram selecionados e caracterizados por FACS e ensaios funcionais. Os subclones selecionados através de ensaios funcionais foram definidos como anticorpo monoclonal. Os subclones de topo foram adaptados para crescimento no meio CDM4MAb (Cat. No. SH30801.02, Hyclone) com 1-3% FBS.

[0164] Expressão e purificação de anticorpos monoclonais

[0165] Tanto células de hibridoma produtoras de anticorpo monoclonal murinho como células 293-F plasmídeo-transfectadas de anticorpo recombinante (Cat. No. R79007, Invitrogen) foram cultivadas no meio CDM4MAb (Cat. No. SH30801.02, Hyclone) ou meio de expressão Freestyle293 (Cat. No. 12338018, Invitrogen), respectivamente, em um incubador CO2 a 37oC por 5 a 7 dias. O meio condicionado foi coletado através da centrifugação em 10,000g por 30 minutos para remover todas as células e detritos celulares, e filtrado através da membrana 0.22 m antes da purificação. Anticorpos murinho e recombinantes foram aplicados e ligados a uma coluna de proteina A (Cat. No. 17127901, GE Life Sciences) seguindo as especificações do fabricante lavados com PBS, eluidos no tampão contendo citrato 20mM, 150mM NaCl, pH3.5. Os materiais eluidos foram neutralizados com 1M Tris pH8.0, e usualmente continham anticorpos superior a 90% de pureza. Os anticorpos purificados por afinidade de proteína A foram ou dializados em relação a PBS ou posteriormente purificados utilizando uma coluna HiLoad 16/60 Superdex200 (Cat. No. 17531801, GE Life Sciences) para remover agregados. Concentrações de proteína foram determinadas pela medição de aborvância e 280nm ou pelo ensaio Bradford (Cat. No. 1856210, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) utilizando IgG bovino de concentração definida (Cat. No. 23212, Thermo Scientific) como padrões. Os anticorpos purificados foram armazenados em alíquotas no congelador a -80oC.

[0166] Exemplo 2. Comparação de atividades de ligação entre anticorpos anti-PD-1

[0167] Através de milhares de varreduras de clones hibridomais identificamos alguns anticorpos monoclonais de topo (mAb), que se ligam a PD-1 humano com elevada especificidade e resistência. Conforme mostrado no ensaio de ELISA (figura 2), três dos anticorpos de topo elicidaram tal resistência e especificidade. Resultados de análise de FACS demonstraram os anticorpos monoclonais selecionados que se ligam às proteínas PD-1 nativas expressadas na superfície celular. mAb317 murino (mu317), mu326 e mu150 mostraram atividade de ligação concentração-dependente e sua ligação EC50 (concentração efetiva a 50% de atividade) foi significativamente menor do que do controle mu55 (Figura 3).

[0168] Afinidade de ligação de mAb de acesso por Ressonância de Plasmon de Superfície (SPR)

[0169] Os mAbs com elevadas atividades de ligação em ELISA e FACS, assim como com atividades funcionais potentes nos ensaios a base de célula (aqui) foram examinados quanto á sua cinética de ligação constante em reações de ligação em tempo real. mAbs murino anti-PD-1 foram purificados a partir de sobrenadantes de hibridoma que utilizam coluna de fluxo de proteina A (Cat. No. 17531801, GE Life Sciences) seguido por cromatografia de exclusão utilizando uma coluna HiLoad 16/60 Superdex200 (Cat. No. 17106901, GE Life Sciences). Os anticorpos anti-PD-1 purificados foram concentrados a 0.5-1 mg/mL em PBS e armazenados em alíquotas em congelador a -800C.

[0170] Para determinação de afinidades de ligação de mAbs PD- 1, medições SPR foram executadas no tampão HBS-N (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v surfactante P20, GE Healthcare) utilizando o instrumento BIAcoreTM T-200 (GE Life Sciences). Chip biosensor Fc CM5 anti- camundongo (GE Healthcare) foi gerad utilizando um protocolo de acoplamento de amina primária padrão. mAbs PD-1 em 0.3 Dg/ml foram capturados na superfície Fc anti-camundongo por 1 minuto em 10 Dl/min. PD-1/Fc em uma diluição serial a partir de 3.3nM a 120nM foram injetados sobre superfície ligada ao anticorpo por 3 minutos em 30 Dl/min seguido por uma fase de dissociação de 10 min. Taxas de associação (Ka or kon) e taxas de dissociação (Kd ou koff) foram calculadas utilizando o modelo de ligação Langmuir um-para-um (BIA Evaluation Software, GE Life Sciences). A constante de dissociação de equilíbrio (KD) foi calculada como a razão koff/kon.

[0171] Conforme mostrado na tabela 1, tanto mu326 como mu517, um membro de família de sequência cognata relacionado a mu317, apresentam um KD subnanomolar igual a 0.324 nM e 0.289 nM, respectivamente, que é significativamente melhor do que aquele de mu134. A taxa Kon era similar entre os três mAbs listados na tabela 1, ainda a taxa Koff era significativamente diferente, dissociação mito mais rápida foi observada em mu134.

[0172] Tabela 1. Constante de ligação de certos anticorpos de topo

[0173]

[0174] Determinação de afinidade de Fabs Anti-PD-1 por SPR

[0175] mAbs Anti-PD-1 foram convertidos na versão Fab por PCR para fusionar as regiões variáveis de cadeias pesadas e cadeias leves para o terminal N de IgG2-CH1 humano e região constante de cadeia kappa, respectivamente, e subclonado no vetor pcDNA3.1 (Invitrogen). Ambos vetores de expressão foram co-expressados em células 293-F utilizando um protocolo de transfecção transiente similar à expressão transiente de anticorpos inteiros. Resumidamente, a cadeia Fab kappa era PCR amplificado e subclonado no vetor de expressão a base de pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Em um plasmídeo separado, a região variável de cadeia pesada (VH) junto com a sequência de codificação CH1 a partir de IgG2 humano foi fusionada com uma marcação c-Myc-His8 de C-terminal por PCR de sobreposição, e em seguida subclonada no vetor de expressão. As mutações C232S e C233S (Kabat residue numbering, Kabat et al. Sequence of proteins of immunologic interest, 5a ed Bethesda, MD, NIH 1991) foram introduzidas na cadeia pesada IgG2 a fim de impedir a troca de ligação de dissulfeto e para estabilizar IgG2 humano na conformação IgG2-A (Lightle et al. 2010 Protein Sci 19(4): 753-762). Ambos construtos continham um peptídeo sinal a montante das sequências maduras Fab. Expressão secretada de Fab foi obtida por co-transfecção de 2 plasmídeos acima em células 293-F e sobrenadantes de cultura celular foram colhidos 6-7 dias pós transfecção. Fabbs marcados por His8 foram purificados de sobrenadantes de cultura celular utilizando uma coluna de fluxo rápido Ni- sepharose (Cat. No. 17531801, GE Life Sciences) seguido por cromatografia de exclusão por tamanho utilizando uma coluna HiLoad 16/60 Superdex200 (Cat. No. 17106901, GE Life Sciences). Os Fabs purificados foram concentrados a 0.5-5 mg/mL em PBS e armazenados em alíquotas em congelador a -80oC.

[0176] Para determinações de afinidade de Fabs anti-PD-1, ensaios por SPR foram usados com o instrumento BIAcoreTM T-200 (GE Life Sciences). Resumidamente, PD-1 humano/His ou PD-1/His de macaco cinomolgos foi acoplado a chips de biosensor CM5 ativados (Cat. No. BR100530, GE Life Sciences) para obter aproximadamente 100-200 unidades de resposta (RU), seguido por bloqueio de grupos não reagidos com 1M de etanolamina. Amostras Fab de aumento de concentração de 0.12nM a 90nM foram injetadas no tampão de corrida SPR (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20, pH7.4) em 30 L/minuto, e respostas de ligação em PD-1 humano/His ou PD-1/His de macaco foram calculadas pela subtração de RU de uma célula de fluxo em branco. Taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (koff) foram calculadas utilizando-se o modelo de ligação Langmuir um-para-um (BIA Evaluation Software, GE Life Sciences). A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) foi calculada como a razão koff/kon.

[0177] As afinidades de ligação SPR-determinadas de Fabs anti- PD-1 foram listadas na tabela 18. Cada ligação Fab anti-PD-1 com elevada afinidade (Kd = 0.15-1 nM) para PD-1 humano. Todos Fabs, exceto 326-3G1, ligados com afinidades ligeiramente inferiores mas comparáveis (dentro da 5 dobra em Kd) para PD-1 de macaco cinomologus.

[0178] Exemplo 3. Atividade funcional de anticorpos anti-PD-1 em células T humanas.

[0179] Geração de linhagens celulares estáveis

[0180] Linhagem celular de empacotamento retroviral PT67, linhagens de célula T humana HuT78 e HEK293 foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Uma sublinhagem HuT78 - HuT78/PD- 1 que expressa PD-1 foi gerada por transdução retroviral utilizando vetor pFB- neo (Strategene/Agilent Tech, Santa Clara, CA) contendo o gene PD-1, de acordo com o protocolo descrito anteriormente (Zhang et al. 2005 Blood 106: 1544-1551). O engager de célula T, um Ab quimérico membrana-ancorado (OS8), foi construído pela fusão do fragmento variável de cadeia simples (scFv) de um CD3 mAb OKT3 anti-humano (Kipriyanov et al. 1997, PEDS 10:445-453) para o domínio C-terminal (113-220) de rato CD8α (NCBI Acesso No: NP_001074579.1) que inclui articulação, transmembrana e domínios citoplásmicos. Ao faze-lo, anti-CD3 scFv é ancorado á superfície da célula como um ativador de célula T. PD-L1, PD-L2 humanos e OS8 cDNAs foram subclonados no vetor pcDNA3.1. Linhagens celulares estáveis HEK293/OS8/PD-L1, Hep3B/OS8/PD-L1 e HEK293/OS8/PD-L2 que co- expressam tanto OS8 como PD-L1 ou PD-L2 cDNAs foram geradas por co- transfecção de células HEK293 e Hep3B (ATCC) com plasmídeos emparelhados, seguido por seleção com higromicina ou G418 por 10-14 dias. Linhagens celulares foram então clonadas pela diluição limitativa conforme descrito anteriormente (Fuller SA, et al. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 11:Unit11.8., 2001). Receptor PD-1 quimérico, chamado P3Z, foi construído por fusão dos domínios extracelulares e de transmembrana) de PD-1 humano ao domínio citoplásmico de cadeia CD3Z humano (NCBI Acesso No. NP_932170.1). Sequência de Cdna que codifica P3Z foi clonada em pFB-neo e fornecida em células HuT78 via transdução retroviral para gerar células HuT78/P3Z.

[0181] Determinação de funções de anticorpo PD-1 por liberação IL-2 em células HuT78/PD-1

[0182] Para determinar se anticorpos anti-PD-1 podem bloquear a interação de sinalização PD-L1-induzida de células PD-1, HuT78/PD-1 (1.5x104 células por cavidade em placa de 96 cavidades) foram pré-incubadas com sobrenadantes de hibridoma ou anticorpos PD-1 por 15 minutos antes da co-cultura com células HEK293/OS8/PD-L1 ou HEK293/OS8/PD-L2 (4x104 por cavidade) em um fundo plano alimentado com 200 μl de meio de crescimento RPMI1640 por cavidade a 37°C. Após 16-18 horas, sobrenadantes da co-cultura foram coletados. IL-2 foi testado por ELISA utilizando kits Ready-Set-Go! ELISA de IL-2 humano (Cat. No. 88-7025, eBiosciences, San Diego, CA). Neste teste, bloqueio de sinalização PD-1 com anticorpos de anti-PD-1 resultaram em sinalização TCR aumentada e produção de IL-2 (Fig. 4).

[0183] Conforme mostrado na figura 5 e tabela 2, anti-PD-1 murino mAb, mu317 e mu326, elicidaram atividade funcional significativamente mais elevada do que mu30, inibindo sinalização PD-L1-induzida de PD-1 que leva a secreção IL-2 aumentada. Ambos tinham secreção IL-2 mais elevada (linha de topo, tabela 2), 675 e 634 pg/ml, respectivamente, e ambos tinham EC50 inferior (concentração efetiva de mAb em nível 50% de indução de secreção IL-2) ao anticorpo mu30.

[0184] Tabela 2. Liberação IL-2 induzida por mAbs Anti-PD-1 em células HuT78/PD-1 co-cultivadas com células HEK293/OS8/PD-L1.

[0185] Não apenas o engajamento de células HuT78/PD-1 por ativação de célula T PD-L1 induzida de bloqueio de mAbs Anti-PD-1 mas também liberação IL-2 PD-L2-induzida bloqueado. A tabela 3 apresenta os dados mostrando que mu317 e mu326 tinham potência muito mais elevada na ativação das células T conforme indicado pelos parâmetros (EC50) de secreção IL-2 do que aqueles de mu476 .

[0186] Tabela 3. Liberação IL-2 induzida por mAbs Anti-PD-1 em células HuT78/PD-1 co-cultivadas com células HEK293/OS8/PD-L2

[0187] Determinação de funções de anticorpo PD-1 por sinalização reversa de liberação IL-2 em células HuT78/P3Z

[0188] No receptor quimérico P3Z, domínio PD-1 de sinalização foi substituído com o domínio citoplásmico de CD3Z. Portanto, P3Z media ativação após engajamento com PD-L1, ao invés de inibição como receptor PD-1 original. Neste teste, células HuT78/P3Z (3x104/well) foram pré-incubadas com sobrenadantes de hibridoma ou anticorpos PD-1 por 15 minutos antes da co- cultura com células HEK293/PD-L1 ou HEK293/PD-L2 (5x104/cavidade) em placas de fundo planas de 96 cavidades (um volume total de 200 μl/cavidade) a 37°C. Após 16-18 horas, sobrenadantes foram coletados e produção de IL-2 foi testada por SA conforme acima descrito.

[0189] A atividade funcional de mAbs anti-PD-1 murino foi depois confirmada pela leitura direta de ativação de célula T no teste de sinalização reversa acima descrito. Consistente ao resultado acima descrito, mu317 e mu326 tinham atividade funcional melhor entre os mAbs que varremos. Conforme mostrado na tabela 4 e tabela 5, mu317 e mu326 eram muito mais potentes do que um dos mAbs de baixa atividade, mu37, tanto em termos de IC50 como de inibição máxima.

[0190] Tabela 4. Inibição de secreção IL-2 por mAbs Anti-PD-1 em células HuT78/P3Z co-cultivadas com células HEK293/PD-L1

[0191] Tabela 5. Inibição de secreção IL-2 por mAbs anti-PD-1 em células HuT78/P3Z co-cultivadas com células HEK293/PD-L2

.

[0192] Exemplo 4. Ativação de secreção IFN- I por mAb anti-PD- 1 em PBMCs primários humanos co-cultivados com células HEK293/OS8/PD-L1

[0193] Verificar se os mAbs de topo selecionado em relação ao PD- 1 também exercem efeito funcional sobre imunocélulas humanas primárias, nos testados a função de anticorpo pelo uso de células mononucleares de sangue periférico recentemente isoladas (PBMCs), que são principalmente compostas de células T (50-70%), células B e células NK (15-30%),e monócitos (2-10%). PBMCs humanos foram isolados de doares saudáveis por centrifugação de gradiente de densidade utilizando meio de separação de limfócito ficoll (Histopaque-1077; Sigma-Aldrich, MO) de acordo com as instruções de fabricante. Toda a coleta de sangue humano seguiu procedimento interno de Beigene. PBMCs foram em seguida estimulados com anti-CD3 mAb (40 ng/mL) OKT3 (Cat. No. 16-0037, eBioscience, CA) por 3 dias antes do teste. Análise FACS (Exemplo 1) mostrou que a expressão PD-1 nas PBMCs ativadas (principalmente células T) foi aumentada a grau variável dependente de doadores individuais (tabela 6). Para determinar a resposta de células T pré- ativadas a células tumorais ligante PD-1-positivas após engajamento TCR/CD3 complexo, PBMCs (1x104) foram co-cultivados com células HEK293/OS8/PD-L1 ou HEK293/OS8/PD--L2 (3x104) em placas de fundo plano de 96 cavidades por 15-18 horas. Sobrenadantes livres de célula foram testados para nível IFN-Y por ELISA utilizando kits Ready-Set-Go! ELISA (Cat. No. 88-7316, eBiosciences), que é o indicador mais predominante de ativação de célula T assim como de outra ativação imunocelular (Thakur A. et al. 2012 Vaccine, 30:4907-4920).

[0194]

[0195] Figura 6 demonstrou que a presença de mAbs mu317 e mu326 na co-cultura de PBMCs pré-ativados e células HEK293/OS8/PD-L1 resultaram no aumento de acumulação IFN- de um modo dose-dependente. Embora o nivel base de IFN- com tratamento IgG murino de controle varie entre diferentes doadores o aumento de secreção IFN- em PBMCs tratados por mu317 ou mu326 é estatisticamente significativo na faixa de 0.1 a 10 Dg/ml de tratamento de anticorpo. Em comparação ao nível correspondente de PBMCs mIgG-tratados, secreção IFN- I induzida por mu317 e mu326 entre os níveis de concentração 0.1 a 10g/ml aumentou 2.5 para 3.2 vezes em PBMCs de doador -19, e aumentou 1.4 a 2.3 vezes em PBMCs de doador-20, respectivamente.

[0196] Exemplo 5. Ativação de células NK humanas por anti-PD1 mAbs

[0197] Linhagens celulares estáveis para teste funcional em células NK

[0198] Células NK humanas primárias foram relatadas anteriormente como expressando a proteina PD-1 em resposta a tratamento IL- 2 e inibindo citotoxicidade aumentada de sinalização mediada por PD-1de células NK (2010 Blood, 116: 2286). Para teste quantitativo de efeito funcional exercido por mAbs Anti-PD-1 em células NK, linhagem cellular NK humana NK92MI (ATCC) e linhagem celular de câncer de pulmão SK-Mes-1 (ATCC) foram projetadas para expressar estavelmente PD-1 humano e PD-L1, respectivamente, por transdução retroviral de acordo com os protocolos anteriormente descritos (Zhang et al. 2005, Blood 106: 1544-1551, Zhang et al. 2006, Cancer Res, 66: 5927). As duas linhagens celulares estáveis foram chamadas de NK92MI/PD-1 e SK-Mes-1/PD-L1.

[0199] Anti-PD-1 Abs promovem produção de IFN- e secreção em células NK92MI/PD-1

[0200] Atividade funcional dos mAbs Anti-PD-1 em células NK foi analisada por medição quantitativa de produção de IFN- e secreção em células NK92MI/PD-1 que foram co-cultivadas com linhagem celular de câncer de pulmão SK-MES-1/PD-L1 na razão de 1 a 2 em placa de fundo plano de 96 cavidades com total de 6 x 104 células por cavidade. Os mAbs Anti-PD-1 foram adicionados às células NK92MI/PD-1 15 minutos da co-cultura ser iniciada, depois as células foram co-cultivadas durante a noite no incubador CO2. Sobrenadantes livres de células foram analisados para nível IFN-Y por ELISA conforme descrito no Exemplo 4.

[0201] Todos mAbs Anti-PD-1 dispararam aumento significativo de produção de IFN- l da linha de base com baixa concentração de tratamento de anticorpo para linha de topo com alta concentração de tratamento de anticorpo. Os dois anticorpos de topo, mu317 e mu326, apresentaram EC50 inferior em comparação com o anticorpo 5C, indicando que eles apresentam efeito de ativação mais potente para as células NK (tabela 7).

[0202] Tabela 7. IFN- I secretou no meio (pg/ml) por células NK92MI/PD-1 na presença de mAb PD-1 e células SK-MES-1/PD-L1

[0203] Anticorpo Anti-PD-1 aumenta o extermínio de células cancerígenas mediadas por células NK92MI/PD-1

[0204] Citotoxicidade de células NK92MI/PD-1 contra células SK- MES-1/PD-L1 foi determinada por ensaio de liberação de lactato dehidrogenase (LDH) utilizando kit de ensaio de citotoxicidade não-radioativo CytoTox 96 (Promega, Madison, WI). Resumidamente, células NK92MI/PD-1 (105) foram pré-incubadas com mAbs Anti-PD-1 em concentrações finais dentro da faixa de 0.004-10 μg/ml por 15 minutos, e células SK-MES-1/PD-L1 (2x104) foram adicionadas à cultura de imunocélulas em uma placa de fundo V de 96 cavidades em uma razão de célula efetora para célula tumoral (E:T) de 5:1, em seguida co-cultivadas por 5 horas. A lise de célula completa foi estabelecida como extermínio máximo de células, a leitura de ensaio de liberação LDH de cada amostra foi calculada como porcentagem de extermínio máximo de célula. Os extermínios de células (%) de todas as amostras forma normalizados através das placas utilizando 10% de linha de base como padrão comum.

[0205] No ensaio de citotoxicidade específica estabelecido conforme acima, os mAbs Anti-PD-1 selecionados causaram um extermínio de células tumorais líquido (= linha de topo - linha de base) variando de 19% a 20.2% em elevada concentração de entrada de mAb. Mu317 e mu326 apresentaram EC50 inferior a mu336, indicando melhor potência para disparar o extermínio de célula tumorais mediadas por célula NK92MI/PD-1 (tabela 8).

[0206] Tabela 8. Citotoxicidade de células NK92MI/PD-1 na direção de células tumorais induzidas por mAb PD-1

[0207] Exemplo 6. Clonagem de análise de sequência de mAbs PD-1

[0208] Os clones de hibridoma murino secretando um mAb específico foram cultivados a uma densidade de 3 a 10 X 106 células em um disco de cultura 100mm-tecido e as células foram colhidas através da centrifugação a 1500 rpm em um rotor swing bucket. O RNA celular total foi isolado utilizando kit Ultrapure RNA (Cat. No. CW0581, CWBIOTECH, Beijing, China) seguindo o protocolo do fabricante. O RNA foi resuspenso em água duplamente-deionizada, concentração medida por NanoDrop (ThermoFisher, Shanghai, China).

[0209] Primers PCR usados para clonagem de mAb cDNA foram sintetizados por Invitrogen (Beijing, China) com base nas sequências anteriormente indicadas (Brocks et al. 2001 Mol Med 7:461-469). A 1a fita de cDNA foi sintetizada utilizando transcriptase reversa (Cat. No. AH301-02, Transgen Biotech, Beijing, China). Amplificação de PCR de mAb cDNA específico foi executada utilizando kit de reagente PCR (Cat. No. Ap221-12, TransGen Biotech, Beijing, China) e seguindo protocolo do fabricante. O produto PCR foi diretamente sequenciado pelo provedor de serviço (GeneWiz, Beijing, China) ou subclonado em um vetor pCR (Invitrogen), subsequentemente sequenciado (GeneWiz).

[0210] As sequências de proteína de mAbs murino foram analisadas pelo alinhamento por homologia de sequência. MAbs foram agrupados com base na homologia de sequência e resultados de mapeamento epítopo (Exemplo 13). Regiões determinantes de complementariedade (CDRs) foram identificadas com base em Kabat (Wu, T.T. and Kabat, E.A., 1970 J. Exp. Med. 132: 211-250) e sistema IMGT (Lefranc M.-P. et al., 1999 Nucleic Acids Research, 27, 209-212) por anotação de sequência e por análise de sequência com base na internet (Erro! A referência de hiperlink não é válida. e Erro! A referência de hiperlink não é válida.). Conforme mostrado na tabela 9, os CDRs de mu317 e mu326 são muito diferentes em comprimento de sequência e identidade. Tabela 9. CDRs de mu317 e mu326

[0211] Exemplo 7. Humanização do mAbs murino

[0212] Simulação de estrutura 3D de anticorpo

[0213] As três estruturas dimensionais foram simuladas por domínios variáveis de mu317 e mu326 a fim de identificar resíduos estruturais que possam ser importantes para suportar estruturas de loop DR. Resíduos estruturais potencialmente importantes foram mantidos como resíduos murino originais na primeira rodada de humanização de anticorpo. O método de modelagem estabelecido anteriormente para anticorpos (Morea et al. Methods 2000 20:267-279) foi adotado para simular estrutura 3D de mAbs Anti-PD-1 baseado nas estruturas conhecidas canônicas de anticorpos (Al-Lazikani et al. 1997 Journal of Molecular Biology 273:927-948). Resumidamente, a sequência de cada domínio variável (Vk e Vh) de anticorpo murino foi jateada na base de dados PDB (Protein Data Bank, Erro! A referência de hiperlink não é válida.) para identificar a sequência de anticorpo o mais homóloga com estrutura de alta resolução conhecida (resolução inferior a 2.5 angstrom). Modelos de estrutura selecionados para modelagem de mu317 e mu326 (listados na tabela 10) apresentavam as mesmas classes de estruturas de loop canônico em L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, e H-CDR2 para os anticorpos alvo a serem modelados. Se os modelos para o Vk e o Vh vierem de diferentes imunoglobulinas eles serão empacotados juntos por um mínimos quadrados dos átomos de cadeia principal para formar uma estrutura híbrida de resíduos de interface Vk-Vh que foi usada como os modelos para modelagem por homologia estrutural pelo programa de modelo Swiss (Kiefer et al. 2009 Nucleic Acids Research 37, D387-D392). Certa conformação de cadeia lateral foi ajustada enquanto as conformações de cadeia principal foram retidas. Nos sítios onde a estrutura parente e a estrutura modelada tinham o mesmo resíduo a conformação de cadeia lateral foi retida. Nos sítios onde os resíduos eram diferentes, conformações de cadeia lateral foram modeladas com base na estrutura de modelo, banco de dados rotamer e considerações de empacotamento. Após modelagem por homologia, programa PLOP (Jacobson et al. 2002 Journal of Physical Chemistry 106:11673-11680) foi usado para refinar os modelos de homologia para minimizar energia de todo átomo e otimizar interface Vk e Vh. Esta etapa foi executada para melhorar a estereoquímica especialmente naquelas regiões onde segmentos de estruturas vindo de diferentes anticorpos tinham sido unidos.

[0214] Tabela 10. Modelos de estrutura usados nas simulações de estrutura de anticorpo

[0215]

[0216] As estruturas também foram simuladas para 317-1 e 326-1 CDR-enxertados a fim de guiar outras rodadas de engenharia de anticorpo a fim de aumentar as extensões de humanização e/ou estabilidades de anticorpo. Os modelos de estrutura selecionados também estão listados na tabela 10. As simulações de estrutura foram feitas de modo similar ao procedimento acima exceto que as possíveis confirmações de H-CDR3 foram tiradas de modelos PDB 1AY1 para 317-1 e 3CXD para 326-1, respectivamente, que continham H- CDR3s de tamanho similar e região torso. Minimização de energia para resíduos H-CDR3 enxertados foi feita utilizando PLOP.

[0217] Humanização

[0218] Para humanização dos mAbs Anti-PD-1, buscamos genes IgG de linha germinal humana homólogo a uma sequência de regiões variáveis cDNAs de mu317 e mu326 por jateamento da base de dados de gene imunoglobulina humano em websites IMGT (Erro! A referência de hiperlink não é válida.) e NCBI (Erro! A referência de hiperlink não é válida.). Os IGVH e IGV humanos com elevada homologia em relação aos mAbs PD-1 foram selecionados como modelo para humanização.

[0219] Humanização foi realizada a princípio por enxerto CDR. Na 1a rodada de humanização, mutações de resíduos de aminoácido murino a humano nas sequências estruturais de regiões variáveis foi guiada pelas estruturas 3D simuladas e apenas os resíduos de aminoácido murino cujas alterações retém todo o anticorpo e estrutura de loop CDR foram mutados para sequência humana conforme acima descrito. As versões iniciais de mAbs humanizadas eram hu317-1 (SEQ NO 47-50) e hu326-1 (SEQ NO 55-58), que compreendem uma cadeia pesada com cadeia pesada variável humanizada (Vh) fusionada para região constante IgG2 humano (NCBI Acesso No. P01859) e uma kappa de cadeia leve variável humanizada (Va) fusionada para região-C de kappa Ig humano (NCBI Acesso No. P01834). Do mesmo modo, geramos anticorpos quiméricos de mu317 e mu326, que são compostos de um VH murino fusionado a região constante IgG2 humano e um VD murinho fusionado para região-C kappa Ig humano. Os anticorpos quiméricos foram denominados ch317 e ch326, respectivamente. Todos mAbs recombinantes foram expressos e purificados conforme descrito no Exemplo 1.

[0220] FACS e ensaios funcionais demonstraram que mAb hu317- 1 praticamente reteve a mesma ligação e atividade funcional como o mu317 e ch317. A diferença EC50 na análise FACS entre mu317 versus ch317 e hu317- 1 pode ser interpretada pelo fato de que dois anticorpos de detecção diferentes, um IgG anti-rato goat e um IgG anti-humano goat foram usados na FACS. Nos dois ensaios funcionais todas as três versões de 317 foram tratadas mais igualmente e os resultados também se aproximam (Tabela 11).

[0221] Como resultado da rodada inicial de humanização para mu326, mAb hu326-1 reteve característica funcional similar ao ch326 parental e mu326 embora atividade funcional em ensaio de ligação FACS e em ensaio de liberação IL-2 baseado em célula HuT78/PD-1 possa ser ligeiramente mais fraca do que ch326 (tabela 12). Tabela 11. Comparação de mu317, ch317 e hu317-1 por FACS e ensaios funcionais

Tabela 12. Comparação de mu317, ch317 e hu317-1 por ensaio FACS e nsaio funcional

[0222] Com base na primeira rodada de humanização, mutamos os outros resíduos aminoácido murino (AA) na estrutura (FR) de hu317-1_Vh e _VDD individualmente para acessar o impacto sobre a função anticorpo. Conforme mostrado na tabela 13, as sete mutações individuais em Vh e uma mutação em V de hu317-1 todos apresentam atividades funcionais similares. Somente alterações menores foram observadas em alguma mutação Vh tal como hu317-2_K71V com função inibitória ligeiramente mais fraca entre as mutações. Porém, quando todos os resíduos aminoacido murino mutaram juntos para humano (hu317-3A), a função é claramente mais fraca do que as mutações residuais em FACS e ensaios de liberação IL-2.

[0223] No experimento inicial acima descrito, hu326-1 alcançou nível de humanização significativo na FR exceto por uns poucos resíduos AA murino deixados. Ainda, ele apresenta função mais fraca do que mu326. Portanto, fizemos mais mutações individuais seja de volta a resíduos murino ou adiante para resíduos humanos a fim de explorar a contribuição de cada AA individual para função mAb326. Tabela 14 apresenta todas as mutações AA simples feitas com base no modelo hu326-1_Vh (SEQ NO 56, SEQ NO 57) e seus resultados de ensaio funcionais. Grande parte das mutações mostraram melhor atividade funcional do que aquela de hu326-1, combinando o mu326 mAb original. Um par de mutações (E46K e F95Y) mostrou potência ligeiramente menor na EC50 ou IC50, indicando o papel daqueles resíduos na estrutura e função de anticorpo. Tabela 13. Comparação de atividade funcional de Fabs com mutações de humanização na estrutura hu317-1

[0224] Tabela 14. Comparação de atividade funcional de mAbs com mutações na estrutura hu326-1

[0225] Para explorar a composição melhor possível de sequência Vh e V para mAbs 317 e 326 que poderiam ser usadas como terapêutica em humano, fizemos uma variedade de mutações de combinação (incluindo algumas mutações nas sequências CDR) em considerações das características de anticorpo tais como nível de humanização em FR, atividades funcionais, propriedades fisico-químicas, citotoxicidade célula-mediada anticorpo dependente (ADCC) e citotoxicidade complementariedade-dependente (CDC). A maioria das mutações foram consideradas como não passando nos padrões de qualificação. Através do processo de construção, seis dos mAbs humanizados recombinantes foram selecionados para sua utilidade terapêutica potencial: hu317-4B2 (SEQ ID NO 43-44 ), hu317-4B5 (SEQ ID NO 45-46), hu317-4B6 (SEQ ID NO 23-26), hu326-3B1 (SEQ ID NO 51-52), hu326-3G1 (SEQ ID NO 53-54) e hu326-4A3 (SEQ ID NO 27-30). Os CDRs do mAb foram comparados áqueles de anticorpos murino originais mostrados na tabela 15 e tabela 16.

[0226] Entre os seis mAbs, hu317-4B2, hu317-4B5 e hu317-4B6 estão intimamente relacionados entre si em sequências e são muito similares em suas atividades funcionais e resistência. Por outro lado, hu326-3B1, hu326- 3G1 e hu326-4A3 são muito próximos entre si em sequências e funcionalidades (tabela 17-18). Dentro de cada um dos dois grupos de mAbs, eles também compartilharam muitas outras características além das sequências e funcionam tal como propriedades fisico-químicas e epítopos de ligação (descrito nos Exemplos 10 e 11) embora algumas pequenas diferenças existam. Tabela 15. Comparação de CDRs entre diferentes versões de mAbs 317

Tabela 16. Comparação de CDRs entre diferentes versões de mAbs 326

Tabela 17. Atividades de ligação de mAbs humanizados testados por ELISA e FACS

Tabela 18. Afinidade de ligação de Fabs testados por SPR

[0227] Determinação de afinidade de Fabs Anti-PD-1 humanizados por SPR

[0228] mAbs Anti-PD-1 foram convertidos na versão Fab por PCR para fusionar as regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve para o N- terminal de IgG2-CH1 humano e região constante de cadeia kappa respectivamente, e subclonados no vetor pcDNA3.1 (Invitrogen). Mbos vetores de expressão foram co-expressados em células 293-F utilizando um protocolo de transfecção transiente similar à expressão transiente de anticorpos inteiros. Resumidamente, a cadeia kappa Fab era PCR amplificado e subclonado no vetor de expressão a base de pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Em um plasmídeo separado, a região variável de cadeia pesada (VH) junto com a sequência codificadora CH1 de IgG2 humano foi fusionada com uma marca c- Myc-His8 C-terminal por sobreposição de PCR, e em seguida subclonada no vetor de expressão. As mutações C232S e C233S (Kabat residue numbering, Kabat et al. Sequence of proteins of immunologic interest, 5a ed Bethesda, MD, NIH 1991) foram introduzidas na cadeia pesada IgG2 para impedir troca de ligação dissulfeto e para estabilizar IgG2 humano na conformação IgG2-A (Lightle et al. 2010 Protein Sci 19(4): 753-762). Ambos construtos continham um peptídeo de sinal a montante das sequências maduras Fab. Expressão secretada de Fab foi obtida por co-transfecção de 2 plasmídeos acima em células 293-F e sobrenadantes de cultura celular foram colhidos 6-7 dias após transfecção. His8-tagged Fabs foram purificados de sobrenadantes de cutura celular utilizando uma coluna de fluxo rápido Ni-sepharose (Cat. No. 17531801, GE Life Sciences) seguida pela cromatografia de exclusão por tamanho utilizando uma coluna HiLoad 16/60 Superdex200 (Cat. No. 17106901, GE Life Sciences). Os Fabs purificados foram concentrados a 0.5-5 mg/mL in PBS e armazenados em alíquotas no congelador -80oC.

[0229] Para determinações de afinidade de Fabs Anti-PD-1, SPR ensaios foram usados com o instrumento BIAcoreTM T-200 (GE Life Sciences). Resumidamente, PD-1 humano/His ou PD-1/His de macaco cinomolgus foi acoplado a chips biosensor CM5 ativado (Cat. No. BR100530, GE Life Sciences) para obter aproximadamente 100-200 unidades de resposta (RU), seguida por bloqueio de grupos não-reagidos com 1M etanolamina. Amostras Fab de crescent concentração de 0.12nM para 90nM foram injetados no tampão de corrida SPR (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20, pH7.4) a 30 L/minuto, e respostas de ligação em PD-1 humano/His ou PD-1/His de macaco foram calculadas por subtração de RU de uma célula de fluxo a branco. Taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (koff) foram calculadas utilizando um modelo de ligação Langmuir um-para-um (BIA Evaluation Software, GE Life Sciences). A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) foi calculada como a razão koff/kon.

[0230] As afinidades de ligação SPR-determinadas de Fabs Anti- PD-1 foram listadas na tabela 18. Cada ligação Fab anti-PD-1 com elevada afinidade (Kd = 0.15-1 nM) a PD-1 humano. Todas Fabs, exceto 326-3G1, ligadas a afinidades ligeiramente inferiores mas comparáveis (dentro de 5 vezes em Kd) a PD-1 de macaco cinomolgus.

[0231] Exemplo 8. Geração e expressão de mAbs Anti-PD-1 recombinantes com região constante IgG4 humano modificada

[0232] Uma vez que PD-1 é principalmente aexpressado em células T ativadas, anticorpos de bloqueio PD-1 ligados a tipo de ocorrência natural de porções IgG-Fc são esperados para induzir funções DFc - mediadas tais como ADCC e CDC, a um grau variável de dependência nas subclasses IgG que resulta na eliminação de células T ativadas (Natsume A, et al, 2009 Drug Des Devel Ther. 3: 7-16). Subclasse de anticorpo humano IgG4 mostrou em muitos relatórios anteriores que ele apresenta ADCC modesto e quase nenhuma função efetora CDC (Moore GL, et al. 2010 MAbs, 2:181-189). Por outro lado IgG4 natural foi encontrado menos estável em condições de estresse tal como em tampão acídico ou sob temperatura crescente (Angal, S. 1993 Mol Immunol, 30:105-108; Dall'Acqua, W. et al, 1998 Biochemistry, 37:9266-9273; Aalberse et al. 2002 Immunol, 105:9-19). Para evitar que células PD-1+ T seja exterminadas e para melhorar as propriedades fisico-químicas dos anticorpos anti-PD-1 os mAbs humanizados foram ligados a IgG4 construidos por combinações de mutações para apresentarem atividades de ligação FCYR ou atividades de ligação C1q reduzidas ou nulas portanto, atenuando ou eliminando funções efetoras ADCC e CDC. Considerando propriedades fisico- químicas de anticorpo como uma fármaco biológico uma das propriedades menos desejadas, intrínsecas de IgG4 é separação dinâmica de suas duas cadeias pesadas para formar semi anticorpo, que leva a anticorpos bi- específicos gerados in vivo via um processo chamado “Fab arm exchange” (Van der Neut Kolfschoten M, et al. 2007 Science, 317:1554-157). A mutação da série para prolina na posição 228 (EU numbering system) apareceu inibitória para a separação de cadeia pesada IgG4 (Angal, S. 1993 Mol Immunol, 30:105-108; Aalberse et al. 2002 Immunol, 105:9-19). Alguns dos resíduos aminoácido na articulação e região DFc foram relatados como tendo impacto sobre interação de anticorpo com receptores FCY (Chappel SM, et al. 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9036-9040; Mukherjee, J. et al., 1995 FASEB J, 9:115-119; Armour, K.L. et al., 1999 Eur J Immunol, 29:2613-2624; Clynes, R.A. et al., 2000 Nature Medicine, 6:443-446; Arnold J.N., 2007 Annu Rev Immunol, 25:21-50). Além disso, alguns isoformos IgG4 de rara ocorrência na população humana também podem elicidir diferentes propriedades fisicoquímicas (Brusco, A. et al. 1998 Eur J Immunogenet, 25:349-55; Aalberse et al. 2002 Immunol, 105:9-19). Porém, juntando todas as mutações e isoformas anteriormente descobertas em um anticorpo específico não garantem uma molécula de anticorpo ideal para compartilhar todas as características para terapêutica tais como acima descrito que podem ser decorrentes de efeito contraditório das mutações combinadas e do impacto de região variável para a função efetora e propriedades físico- químicas de um anticorpo (Igawa T. et al., 2010 Prot Eng Design Select, 23:385392; Perchiacca J.M. and Tessier P.M., 2012 Ann Rev Biomol Eng 3:263-286).

[0233] Para gerar mAbs Anti-PD-1 com pelo menos ADCC, CDC e instabilidade modificamos a articulação e região CFc de IgG4 humano ela introdução de um numero de combinações de mutações, que criou IgG4mt1 para IgG4mt12. Algumas das variantes IgG4 modificadas eram claramente menos desejadas conforme indicado pelos nossos resultados de teste diversas variantes IgG4 relevantes e sequências modificadas foram listadas na tabela 19. A análise desses anticorpos é aqui descrita. Tabela 19. Modificações de sequência de variantes IgG4

[0234] Exemplo 9. IgG4mt10 não apresenta ligação FCYR, menor função efetora ADCC e CDC

[0235] ADCC é iniciada quando um anticorpo se liga a proteína alvo de superfície celular seguida por ligação a receptores FCY (FCYRS) expressos sobre células efetoras. Foi bem documentado que IgG1 humano apresenta afinidade de ligação bem maior em relação a FCYRS do que IgG2 e IgG4, especialmente, ligação a FCYR-I e FCYR-IIIA, que se correlaciona à resistência de IgG1 para ativar ADCC. Reminescente de ADCC, CDC é ativado quando um anticorpo reticula uma proteina C1q e alvo de superfície celular que é seguida por uma reação em cascata de formação de complexo de complementariedade e lise de célula-alvo. Como proxi de ADCC e CDC, ensaios para ligação de anticorpo a FcyRs e C1q podem servir como o indicador fundamental de ADCC e CDC. Nós portanto analisamos sistematicamente a ligação de mAbsa todos os FcyRs principais.

[0236] Ligação FCYR

[0237] Ligação de vários mutantes IgG4 a FcyRs foi determinada por citometria de fluxo. Resumidamente, uma série de transfectantes HEK293 que expressam FcyRs humanos foram estabelecidos. Esses transfectantes expressaram FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB ou FcyRIIIA. Multi-subunit FcyRs (i.e., FcyRI and FcyRIIIA) foram co-expressados com FcRy. Variantes polimórficas (i.e., FcyRIIA H131 e R131, FcyRIIIA F158 e V158) também foram induzidos. Um anticorpo secundário (goat anti-human IgG F(ab)'2-Alexa Fluor 488, Jackson ImmunoResearch , West Grove, PA, USA) foi usado para detectar a ligação de mAbs Anti-PD-1 com variantes IgG4 modificadas (Tabela 19) a células FcyR+ HEK293. Conforme esperado, mAbs Anti-PD-1 no formato IgG1 (hu317-1/IgG1 e hu317-4B6/IgG1) se ligam fortemente a todos FcyRs incluindo FcyRI, FcyRIIA (aletos H131 e R131), FcyRIIB, e FcyRIIIA (aletos V158 e F158) (tabela 20). Surpreendentemente quando as duas diferentes versões de mAbs humanizados, hu317-1 e hu317-4B6 (com diferenças tanto em Vh como Vd), foram geradas no mesmo formato de variante IgG4 tal como no formato IgG4mt1 ou no formato IgG4mt6, sua força de ligação (MFI) varia em uma faixa de algumas vezes para praticamente 100 vezes (por exemplo 455.2/115.7 = 3.9 vezes; 13.6/1.0 = 13.6 vezes; 434.6/4.9 = 88.7 vezes; e etc., vide tabela 20). É consistente aos resultados anteriores por outro que as regiões variáveis de anticorpos apresentam grande impacto sobre a ligação a FcRs, exercendo portanto o impacto sobre a função efetora tal como ADCC (Igawa T. et al., 2010 Prot Eng Design Select, 23:385-392; Perchiacca J.M. and Tessier P.M., 2012 Ann Rev Biomol Eng 3:263-286).

[0238] Conforme demonstrado na tabela 20, quando hu317-4B6 e hu326-4A3 foram feitos no formato IgG4mt10 eles apresentavam a menor atividade de ligação para FcRs entre os formatos de variante mAbs PD-1 e IgG listados na tabela, assim como outros mAbs humanizados e formatos IgG que testamos no estudo. A unicidade de hu317-4B6 e hu326-4A3 no formato IgG4mt10 neste aspecto pode não ser estendida à mesma família de mAbs humanizados com alguma homologia de sequência distante tal como hu317-1, conforme acima descrito.

[0239] tabela 20. Força de ligação (MFI*) de mAbs Anti-PD-1 para Fc Rs determinados por FACS

[0240] ADCC

[0241] Ativação de ADCC clássica de células NK por anticorpos que engatam a FCYRIIIA ou CD16. Para verificar se mAbs Anti-PD-1 humanizados induzem ADCC, células NK92MI/CD16V que foram geradas de células NK92MI (ATCC) por plasmídeos de expressão de co-transdução contendo CD16 (alelo V158) e genes FCRY , foram usados como células efetoras e linhagem de célula T que expressam PD-1, HuT78/PD-1, foi usado como células-alvo. Células NK92MI/CD16V (4x104) foram co-cultivadas com igual numero de células HuT78/PD-1 em placas de fundo em V de 96 cavidades por 5hs. Citotoxicidade foi determinada por ensaio de liberação LDH descrito na seção anterior. Os resultados confirmaram que hu317-4B2/IgG4mt6, hu317-4B6/IgG4mt6, hu317- 4B6/IgG4mt10 e hu326-4A3/IgG4mt10 todos apresentam nível de base de ADCC em comparação com os controles positivos (Fig. 7). A menor diferença em ADCC entre aqueles 4 mAbs pode ser atribuível a erro de teste (vide erro na Fig. 7).

[0242] CDC

[0243] Anticorpos IgG4 humanos em geral não induzem a qualquer CDC via trajetória clássica. Se mAbs Anti-PD-1 no formato IgG4mt10 irão desencadear, CDC foi analisado com uso de linhagem de célula T que expressa PD-1, Hut78/PD-1, e doadores saudáveis de soro humano recente. Lise celular por CDC foi determinado por kits de ensaio Celltiter glo (Promega, Beijing, China). Resumidamente, células HuT78/PD-1 (2x104) foram incubadas em RPMI1640 livre de soro (Invitrogen) com anti-PD-1 Abs (10 μg/ml) a 37°C por 15 minutos antes da adição de soro humano normal (NHS) na concentração final de 15% ou 50% em placas de fundo plano de 96 cavidades em um volume total de 120μl. Após incubação durante a noite a 37°C, células foram lisadas em testadas quanto à concentração de ATP. Para testar se mAbs Anti-PD-1 humanizados em IgG4mt10 podem exterminar células T primárias PD-1+ via CDC, PBMCs isolados de doadores saudáveis foram pré-ativados com anti- CD3 Ab OKT3 (40 ng/ml) por 3 dias antes da co-cultura com anti-PD-1 Abs plus NHS. A quantidade de ATP é diretamente proporcional ao número de células presentes na cultura. Fluorescência foi lida utilizando um fluorômetro de 96 cavidades 96 (PHERA Star FS, BMG LABTECH). Os resultados são expressados em unidades de fluorescência relativas (RFU) que são proporcionais ao numero de células viáveis. A atividade CDC porcento foi calculada como segue: % de atividade CDC =[(teste RFU - RFU plano de fundo) / (RFU em lise celular total - RFU plano de fundo)] x 100. Em geral, não podemos detectar qualquer ADCC mediado por mAbs Anti-PD-1 no formato IgG4mt10 que se liga a PBMCs ativados. Em condições de teste hipersensíveis tal como utilizar linhagem celular de alta expressão de PD-1 elevada concentração de anticorpo e soro, detectamos nível muito baixo de CDC em alguns casos e não há muitas diferenças entre versões e mAbs Anti-PD-1, indicando os mAbs Anti-PD-1 em formatos de variantes IgG4 retiveram característica de baia ou nenhuma atividade de CDC como a forma comum de IgG4.

[0244] Exemplo 10. mAbs Anti-PD-1 humanizados em formato IgG4mt10 apresentam estabilidade aumentada sob condições de estresse

[0245] Estabilidade de anticorpos anti-PD-1 em elevada temperatura e condições acídicas

[0246] Anticorpos Anti-PD-1 usados em estudos de estabilidade foram todos purificados da coluna A de proteína seguida por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) conforme descrito em seções anteriores. Após purificação, os conteúdos de agregado de amostras de anticorpo purificadas foram monitorados em cromatografia de exclusão por tamanho analítico- cromatografia de alto desempenho (SEC-HPLC), que se situou dentro da faixa de 0%-0.5%.

[0247] Para análise SEC-HPLC as amostras de anticorpo foram analisadas utilizando-se uma coluna TSKgel G3000 SWXL (7.8x300 mm, Cat. No. 08541, Tosoh Bioscience, Shanghai, China) sob condição de eluição isocrática (tampão de eluição 0.2 M fosfato de sódio, pH7.2), e subsequente detecção a UV-215 nm. Em cada curso, 10 microlitros de amostra de anticorpo foram colocados na coluna e eluídos em uma taxa de fluxo de 1mL/minuto. O dímero ou espécies de agregado maiores de anticorpo foram separados de espécies monoméricas e as porcentagens de dímeros e agregados foram determinados nas áreas de pico integrados de traços UV.

[0248] Para estudo de estabilidade de estocagem de velocidade aumentada, anticorpos anti-PD-1 (10-40mg/mL in PBS) foram mantidos em incubadores em 40-50oC para 4-7 dias a fim de testar a estabilidade de anticorpos em condição de elevada temperatura. As amostras de anticorpo foram em seguida analisadas para formação calor-induzida de dímero e agregados em SEC-HPLC. Para cada um dos anticorpos anti-PD-1 analisado, menos de 2% se tornaram espécies de elevado peso molecular (dímeros e agregados), indicando os anticorpos anti-PD-1 apresentavam boa estabilidade em condições de elevada temperatura.

[0249] Estabilidade de Anticorpo em condição acídica foi um desafio -chave no processo de fabricação a jusante (Liu et al. 2010 mAbs 2:480499). Eluição de Anticorpo de proteína A e inativação de virus usualmente exigem incubação de anticorpo em condições de baixo pH (2.5-4). Porém, tais condições acídicas poderiam potencialmente causar desnaturação de anticorpo e agregação. IgG4 humano é sabido ser menos estável do que IgG1 e IgG2 (2002 Immunology 105:9). Portanto, testamos os mAbs humanizados feitos com várias formas de mutante IgG4. Resumidamente, estabilidades de Anticorpo em condições de baixo pH foram estudadas por 1:1 volume de cada amostra de anticorpo (10 mg/mL em PBS) misturadas com tampões de baixo pH contendo 50 mM de citrato de sódio , 100mM NaCl em pH3.6, 3.3, 3.0 ou 2.7, respectivamente. Após 1 hora de incubação sob temperatura ambiente, as amostras anticorpo em condições de baixo pH foram neutralizadas por razão de diluição 1:5 no tampão de eluição SEC-HPLC contendo 0.2M fosfato de sódio, pH7.2. Análises SEC-HPLC foram feitas como descritas acima e porcentagens de dímeros e agregados induzidos por condições de baixo pH foram quantificadas. O mAb PD-1 317-4B6 em formato IgG1 foi o mais estável em condições acídicas bioprocessamento-relevantes mesmo quando valor pH chega a ser baixo como 2.7. Entre os mAbs Anti-PD-1 feitos em diversas variantes IgG4, hu317-4B6/IgG4mt10 e hu326-4A3/IgG4mt10 eram os mais estáveis sob condição de tampão acídico (tabela 21) como os agregados ácido- induzidos foram significativamente reduzidas um nível que era comparável àquele do formato IgG1 de mAbs Anti-PD-1, 317-4B6 e 326-4A3, i.e. o agregado solúvel é inferior a 2% (tabela 21).

[0250] Tabela 21. Dímero de agregados solúveis formados em tampões acídicos e testados por SEC-HPLC

[0251] Exemplo 11. Mapeamento dos epitópos de ligação de mAbs Anti-PD-1

[0252] Relatórios anteriores sobre as estruturas de cristal de complexos PD-1/PD-L1 e PD-1/PD-L2 lançaram luz quanto ao entendimento de resíduos aminoácido (AA) críticos em PD-1 que são necessários para a ligação de ligante (Zhang et al. 2004 Immunity, 20:337-347; Lin D.Y. et al. 2008 PNAS 105:3011-3016; Lazar-Molnar E. et al. 2008 PNAS, 105:10483-10488). De fato, seis de tais resíduos AA foram identificados no receptor através de uma análise de mutação de ponto necessária para ligação PD-L1. Cinco dos seis resíduos AA foram também necessários para ligação PD-L2 (Lin D.Y. et al. 2008 PNAS 105:3011-3016). Com base na informação da análise de mutação estrutura-guiada nós deduzimos que a via mais eficaz para mAbs funcionais para bloquear sinalização PD-1 mediada e competir com ligantes PD-1 pela ligação aos seis resíduos AA críticos, portanto ocupando os epítopos de ligação necessários para a ligação de ligante. Para explorar a hipótese e para compreender o mecanismo de ação por anticorpos PD-1 funcionais fizemos seis mutantes de PD-1 por substituição dos seis AAs críticos para Ala, individualmente, i.e. K45A, I93A, L95A, P97A, I101A e E103A (AA residue numbering based on Lin D.Y. et al. 2008 PNAS 105:3011-3016). Os mutantes PD-1/Fc e PD-1/His (Fig. 1) foram usados como modelos para mutagênese PCR-guiada ou mutagênese de circulo rolante utilizando o sistema Fast Mutagenesis (Cat. No. FM111, Transgen Biotech, Beijing, China). Todos os mutantes foram subclonados em nossos vetores de expressão a base de pcDNA e verificados pelo sequenciamento. As proteínas PD-1 tipo selvagem e mutadas foram expressas por transfecção transiente (descrita no Exemplo 1), e preparadas após 4 a 6 dias de cultura. Os meios condicionados (CM) foram analisados por Western blot para verificar a expressão de proteína PD-1 em termos de qualidade e quantidade. Os sobrenadantes (CM), após eliminação de detritos celulares foram diretamente usados na análise ELISA ou Western blot para mapeamento de epítopo.

[0253] Para estudar os epítopos de ligação de mAbs Anti-PD-1 humanizados, ensaios de ELISA utilizando o PD-1 tipo selvagem (WT) e mutante (Mt) foram realizados para acessar as atividades de ligação de hu317- 4B5, hu317-4B6, hu326-3B1 e hu326-4A3. Para fins de comparação a fim de checar a unicidade da assinatura de ligação de anticorpo dois anticorpos de referência (referência Ab-1 e referência Ab-2 de US8008449B2 e US8168757B2, respectivamente) foram incluídos no estudo. Volume igual de CM contendo WT ou Mt PD-1 foi revestido em placa de 96 cavidades para todos mAbs no mesmo ensaio ELISA. Todos os resultados ELISA foram normalizados utilizando as leituras médias ELISA de sinais de ligação WT PD-1 como padrão. Sinais de ligação de ELISA a um Mt PD-1 específico foram também normalizados em relação à leitura de ligação de anticorpo mais elevada (ajustada como 100%) ao Mt PD-1 específico. Para conveniência de análise de dados quando sinal de ligação de ELISA de mAb para um mutante específico reduzido a 50% com relação a WT PD-1, é definido que o resíduo aminoácido é um epítopo de ligação importante cuja mutação anulou a ligação de anticorpo. Do mesmo modo, se o sinal de ligação de ELISA de mAb para um mutante específico reduziu para menos de 25%, ele é definido como muito importante. Conforme mostrado na figura 8, dois dos resíduos AA críticos em PD-1, K45 e I93, são epítopos importantes ou muito importantes para ligação mAbs hu317-4B5 e hu317-4B6 e três resíduos AA, I93, L95 e P97, são epítopos importantes ou muito importantes para hu326-3B1 e hu326-4A3. Por outro lado os dois anticorpos de referência apresentam epítopos de ligação distintos, P97 é importante para referência Ab-1, enquanto L95 e P97 são importantes para referência Ab-2.

[0254] Surpreendentemente, quando a proteina PD-1 é desnaturada no Western Blot, mAb hu317-4B5 e -4B6 foram ainda capazes de ligação a WT PD-1 através dos epítopos de ligação crítica (K45 e I93) não estando próximos entre si (não-lineares). Ele indicou que a proteína PD-1 se tornou renaturada a algum grau após desnaturação em SDS-PAGE do processo Western Blot que permite que os mAbs Anti-PD-1 reconheçam e se liguem a ele. Tomando a vantagem desta observação, realizamos análise Western Blot para todos os seis anticorpos usados no estudo acima ELISA. Os resultados gerais de Western Blot corroboraram muito bem os resultados ELISA i.e. os epítopos importantes ou muito importantes cujas mutações resultaram em sinais de ligação baixos em ELISA, também forneceram a faixa mais fraca Western Blot em comparação com a ligação a outro mutante PD-1 (Fig. 8). Algumas diferenças menores entre ELISA e Western Blot também foram observadas, por exemplo, os sinais de ligação ELISA em I93A e E103A por referência Ab-2 foram relativamente mais fortes do que aqueles em Western Blot. Isso pode ser indicativo daquele cujos resíduos AA também podem contribuir para a ligação pois suas mutações impactaram a ligação somente sob condições de estresse (i.e. desnaturação ou perda de conformação nativa). Conforme resumido na tabela 22, os mAbs Anti-PD-1 nesta invenção apresentam epítopos de ligação identificáveis de outro anti-PD-1 anticorpo. Tabela 22. Resumo* de epítopos-chave por mAbs Anti-PD-1

[0255]

[0256] Exemplo 12. mAbs Anti-PD-1 ativam PBMCs primários humanos e inibem crescimento tumoral em modelos de rato xenotransplante

[0257] mAbs Anti-PD-1 humanizados ativam PBMCs humanos

[0258] Através de todos os processos de humanização, os mAbs Anti-PD-1 humanizados em vários estágios retiveram atividades funcionais similares conforme analisado por ELISA, FACS e ensaios de liberação de citoquina célula-baseados. Para confirmar a função de versões finais de mAbs humanizados, testamos as funções de ativação de hu317-4B5, hu317-4B6, hu326-3B1 e hu326-4A3 utilizando PBMCs humanos primários. Os resultados demonstraram que aqueles mAbs por toda a humanização mantiveram as funções mAb murino para ativar PBMCs primários embora o grau de ativação seja diferente entre os quatro doadores devido à variação de pano de fundo genético do indivíduo (Fig. 9).

[0259] mAbs Anti-PD-1 aumentam citotoxicidade célula NK - baseada contra células cancerígenas

[0260] Reminiscente dos mAbs murino originais, os mAbs Anti-PD- 1, hu317-4B5, hu317-4B6, hu326-3B1 e hu326-3G1 humanizados, aumentam citotoxicidade mediada por célula NK92MI/PD-1 contra as células cancerígenas de pulmão, SK-MES-1/PD-L1, de modo dose-dependente (Fig. 10, tabela 23). Pareceu evidente que a princípio os mAbs Anti-PD-1 humanizados podem funcionar para romper a tolerância imunocelular media por sinalização PD-1, aumentando a atividade de eliminação de câncer por imunocelulas, por exemplo células NK e limfócitos T- citotóxicos.

[0261] mAb PD-1 humanizado ativa PBMCs humanos e inibe crescimento tumoral em um modelo de câncer de xenotransplante de rato in vivo

[0262] Todas as evidências de teste acima indicaram que os mAbs Anti-PD-1 podem trabalhar em modelos de câncer de rato utilizando camundongos imuno-comprometidos xentransplantados com células cancerígenas humanas em seguida implantação de PBMCs humanos e aplicação do tratamento mAb a fim de inibir crescimento de célula cancerígena in vivo. O teste foi projetado como segue. Camundongo SCID-macho com sete- oito semanas de vida (Vital River Laboratories, China) foram incubados por via subcutânea no flanco direito com células 3x106 Hep3B/OS8-PD-L1 em 50% Matrigel (BD Biosciences, New Jesey, USA). Quinze dias após a inoculação do tumor os camundongos portanto tamanhos de tumor entre 100-250 mm3 foram randomizados e divididos em três grupos de tratamento. Uma centena de microlitrosde PBMCs agrupados (5x105) de 2 doadores saudáveis foram injetados por via intratumoral. Três dias após implante de PBMC, anticorpos anti- PD-1 (Hu317-IgG4mt2) e IgG humano foram administrados via s.c. em uma dose de 10 mg/kg, respectivamente. Tratamento de Anticorpo foi repetido uma vez a cada 10 dias por um total de 3 vezes. PBS foi injetado em um grupo paralelo com controle negativo. Tumores foram medidos duas vezes por semana com uso de uma pinça partindo do dia 7. Volumes tumorais foram calculados com uso da seguinte formula: [D x (d2)]/2, na qual D representa o diâmetro grande do tumor, e d representa o diâmetro pequeno. Todos os estudos de animal foram realizados conforme procedimento Beigene Animal Care e de Uso.

[0263] No estudo in vivo embora 60% dos tumores nos grupos de controle foram auto-regressados, o restante de teste n vivo é praticamente ainda informativo os quais foram apresentados na figura 11. Nos grupos de controle seja grupo veículo-tratado ou IgG (hulgG)humano - tratado cada um apresenta 0% de tumor (2 de 5 camundongos) superando mais do que a linha de base no ponto de partida. Os dois tumores no grupo PBS-tratado cresceu muito mais (acima de 2,000 mm3, um rato portanto tumor foi terminado mais cedo devido à ultrapassagem do limite de tamanho do tumor pelo protocolo). Os dois tumores no grupo huIgG-tratado cresceram até o tamanho de 800 e 1,370 mm3, bem mais acima da linha de base média de 164 mm3 menor do que tumores PBS- tratados. Por outro lado, no grupo mAb PD-1 (hu317-1/IgG4mt2)-tratado tumores foram completamente regressados ou próximos ao tamanho de linha de base (um tumor = 200 mm3, que cresceu de volta lentamente após ter regressado para 50% da linha de base em duas semanas do implante PBMC). Os resultados que o mAb PD-1 descreveu acima podem ativar imuno-células humanas inibindo crescimento de células tumorais no modelo de câncer in vivo de rato que é consistente com os resultados de teste in vitro acima descritos

[0264] Tradicionalmente, compostos antimicrobianos são incluídos em composições de cuidados pessoais e de assistência domiciliar a fim de obter desinfecção de superfícies. Quando tais composições são do tipo com enxague o ativo antimicrobiano não possui tempo suficiente disponível durante

Claims (9)

1. Anticorpo compreendendo um domínio de ligação de antígeno de anticorpo que especificamente liga PD-1 humano e caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada (Vh) compreendendo as seguintes regiões determinantes de complementariedade (CDRs): CDR-H1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 31, CDR-H2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 32, e CDR-H3 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 33, e uma região variável de cadeia leve (Vk) compreendendo as seguintes três CDRs: CDR-L1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 34, CDR-L2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 35, e CDR- L3 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:36.

2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de compreender uma região variável de cadeia pesada (Vh) compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:24.

3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de compreender uma região variável de cadeia leve (Vk) compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:26.

4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de compreender uma região variável de cadeia pesada (Vh) compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID NO:24 e uma região variável de cadeia leve (Vk) compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID NO: 26.

5. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de ele se ligar especificamente a resíduos PD1: K45 e I93 equivalente a K58 e I106 na SEQ ID NO: 2.

6. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 caracterizado pelo fato de compreender um domínio constante IgG4 compreendendo a sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:83-88.

7. Anticorpo de acordo com a reivindicação 6 caracterizado pelo fato de compreender um domínio constante IgG4 compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 87 ou 88.

8. F(ab) ou F(ab)2 caracterizado por ser do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

9. Uso do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 caracterizado por ser para fabricação de um medicamento para tratamento de câncer ou infecção viral.

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