TW202313117A - 包含il-2接合物及西妥昔單抗(cetuximab)之頭頸癌組合療法 - Google Patents

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卡羅來納 卡法羅
布麗吉特 德默斯
約瑟夫 李維克
孟琬如
杰羅德 普塔辛
馬科斯 米拉
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Abstract

本文揭示用於治療有需要的個體的頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）的方法，所述方法包括投予IL-2接合物與西妥昔單抗的組合。

Description

包含IL-2接合物及西妥昔單抗(CETUXIMAB)之頭頸癌組合療法
本文揭示用於治療有需要的個體的頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）的方法，所述方法包括投予IL-2接合物與西妥昔單抗(cetuximab)的組合。
不同的T細胞群體調節免疫系統，以維持免疫穩態和耐受性。例如，調節T（Treg）細胞藉由防止病理性自身反應性來防止免疫系統的不適當反應，而細胞毒性T細胞靶向並且破壞感染的細胞和/或癌細胞。在一些情況下，不同T細胞群體的調節為疾病或適應症的治療提供選擇。
細胞激素包括細胞信號傳導蛋白的家族，諸如趨化介素、干擾素、介白素、淋巴介素、腫瘤壞死因子以及在先天性和適應性免疫細胞穩態中發揮作用的其他生長因子。細胞激素是由免疫細胞（諸如巨噬細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞和肥大細胞、內皮細胞、成纖維細胞和不同的基質細胞）產生的。在一些情況下，細胞激素調節體液免疫反應與基於細胞的免疫反應之間的平衡。
介白素是調節以下細胞的發育和分化的信號傳導蛋白：T淋巴細胞和B淋巴細胞、單核細胞譜系的細胞、嗜中性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨核細胞和造血細胞。介白素是由輔助CD4+ T和B淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、內皮細胞和其他組織駐留細胞產生的。
在一些情況下，介白素2（IL-2）信號傳導用於調節T細胞反應，且隨後用於治療癌症。因此，在一態樣，本文提供了治療個體的頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）的方法，所述方法包括投予IL-2接合物與一種或多種另外的藥劑的組合。
本文描述了治療有需要的個體的頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）的方法，所述方法包括向所述個體投予IL-2接合物與一種或多種另外的藥劑的組合，其中所述IL-2接合物包含在位置64處具有本文所述非天然胺基酸殘基的SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，例如SEQ ID NO: 2的胺基酸序列。
示例性實施例包括以下內容。
實施例1.一種治療有需要的個體的頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）的方法，所述方法包括向所述個體投予 (a) IL-2接合物和 (b) 西妥昔單抗，其中： 所述HNSCC是復發性和/或轉移性HNSCC；並且 所述IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO: 1，其中位置P64處的胺基酸被式 (I) 的結構替代：
Figure 02_image001
式 (I) 其中： Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image003
； Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image005
； Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image006
；或 Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image008
； W是具有約25 kDa-35 kDa的平均分子量的PEG基團； q是1、2或3； X是具有以下結構的L-胺基酸：
Figure 02_image010
； X-1指示與前一個胺基酸殘基的附接點；並且 X+1指示與後一個胺基酸殘基的附接點。
實施例2.一種治療有需要的個體的頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）的方法，所述方法包括： 選擇患有HNSCC的個體，其中所述個體是至少部分地基於所述個體患有復發性和/或轉移性HNSCC而選擇的；以及 向所述個體投予 (a) IL-2接合物和 (b) 西妥昔單抗，其中： 所述IL-2接合物包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，其中位置P64處的胺基酸被式 (I) 的結構替代：
Figure 02_image001
式 (I) 其中： Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image003
； Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image005
； Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image006
；或 Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image008
； W是具有約25 kDa-35 kDa的平均分子量的PEG基團； q是1、2或3； X是具有以下結構的L-胺基酸：
Figure 02_image010
； X-1指示與前一個胺基酸殘基的附接點；並且 X+1指示與後一個胺基酸殘基的附接點。
實施例3.一種治療有需要的個體的頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）的方法，所述方法包括向所述個體投予 (a) 從8 μg/kg至32 μg/kg的作為IL-2接合物的IL-2和 (b) 西妥昔單抗，其中： 所述IL-2接合物包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，其中位置P64處的胺基酸被式 (I) 的結構替代：
Figure 02_image001
式 (I) 其中： Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image003
； Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image005
； Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image006
；或 Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image008
； W是具有約25 kDa-35 kDa的平均分子量的PEG基團； q是1、2或3； X是具有以下結構的L-胺基酸：
Figure 02_image010
； X-1指示與前一個胺基酸殘基的附接點；並且 X+1指示與後一個胺基酸殘基的附接點。
實施例4.根據實施例1-3中任一項所述的方法，其中所述個體先前未用西妥昔單抗治療過。
實施例5.根據實施例1-4中任一項所述的方法，其中所述個體患有鉑難治性HNSCC。
實施例6.根據實施例1-5中任一項所述的方法，其中所述個體先前治療過HNSCC，並且先前對HNSCC的治療包括不超過兩種方案的失敗。
實施例7.根據實施例1-6中任一項所述的方法，其中所述個體患有鉑難治性HNSCC，並且所述個體先前對HNSCC的治療包括一種方案的失敗。
實施例8.根據實施例1-6中任一項所述的方法，其中所述個體患有鉑難治性HNSCC，並且所述個體先前對HNSCC的治療包括兩種方案的失敗。
實施例9.根據實施例1-8中任一項所述的方法，所述方法包括向所述個體投予約8 μg/kg至32 μg/kg的所述IL-2接合物。
實施例10.根據實施例1-9中任一項所述的方法，所述方法包括向所述個體投予約8 μg/kg的所述IL-2接合物。
實施例11.根據實施例1-9中任一項所述的方法，所述方法包括向所述個體投予約16 μg/kg的所述IL-2接合物。
實施例12.根據實施例1-9中任一項所述的方法，所述方法包括向所述個體投予約24 μg/kg的所述IL-2接合物。
實施例13.根據實施例1-9中任一項所述的方法，所述方法包括向所述個體投予約32 μg/kg的所述IL-2接合物。
實施例14.根據實施例1-13中任一項所述的方法，其中在所述IL-2接合物中，所述PEG基團具有約30 kDa的平均分子量。
實施例15.根據實施例1-14中任一項所述的方法，其中在所述IL-2接合物中，Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image003
。
實施例16.根據實施例1-14中任一項所述的方法，其中在所述IL-2接合物中，Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image003
。
實施例17.根據實施例1-14中任一項所述的方法，其中在所述IL-2接合物中，Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image008
。
實施例18.根據實施例1-14中任一項所述的方法，其中在所述IL-2接合物中，Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image008
。
實施例19.根據實施例1-14中任一項所述的方法，其中所述式 (I) 的結構具有式 (IV) 或式 (V) 的結構或是式 (IV) 和式 (V) 的混合物：
Figure 02_image021
式 (IV)；
Figure 02_image023
式 (V)； 其中： W是具有約25 kDa-35 kDa的平均分子量的PEG基團； q是1、2或3； X是具有以下結構的L-胺基酸：
Figure 02_image010
； X-1指示與前一個胺基酸殘基的附接點；並且 X+1指示與後一個胺基酸殘基的附接點。
實施例20.根據實施例1-14中任一項所述的方法，其中所述式 (I) 的結構具有式 (XII) 或式 (XIII) 的結構或是式 (XII) 和式 (XIII) 的混合物：
Figure 02_image026
式 (XII)；
Figure 02_image028
式 (XIII)； 其中： n是整數，使得-(OCH 2CH 2) n-OCH 3具有約30 kDa的分子量； q是1、2或3；並且 波浪線指示與SEQ ID NO: 1中未被替代的胺基酸殘基的共價鍵。
實施例21.根據實施例1-20中任一項所述的方法，其中q是1。
實施例22.根據實施例1-20中任一項所述的方法，其中q是2。
實施例23.根據實施例1-20中任一項所述的方法，其中q是3。
實施例24.根據實施例1-23中任一項所述的方法，其中所述平均分子量是數均分子量。
實施例25.根據實施例1-23中任一項所述的方法，其中所述平均分子量是重均分子量。
實施例26.根據實施例1-25中任一項所述的方法，其中約每兩週一次、約每三週一次或約每4週一次向所述個體投予所述IL-2接合物。
實施例27.根據實施例1-26中任一項所述的方法，其中約每兩週一次、約每三週一次或約每4週一次向所述個體投予所述IL-2接合物和西妥昔單抗。
實施例28.根據實施例1-27中任一項所述的方法，其中所述IL-2接合物是醫藥上可接受的鹽、溶劑合物或水合物。
實施例29.根據實施例1-28中任一項所述的方法，其中西妥昔單抗的初始劑量以約400 mg/m 2的劑量投予，並且西妥昔單抗的後續劑量以約250 mg/m 2的劑量投予。
實施例30.根據實施例1-29中任一項所述的方法，其中在所述IL-2接合物之前投予西妥昔單抗。
實施例31.根據實施例1-30中任一項所述的方法，其中所述IL-2接合物和西妥昔單抗單獨地投予。
實施例32.根據實施例31所述的方法，其中所述IL-2接合物和西妥昔單抗依序地投予。
實施例33.根據實施例32所述的方法，其中在西妥昔單抗之後投予所述IL-2接合物。
實施例34.根據實施例1-33中任一項所述的方法，其中藉由皮下投予向所述個體投予所述IL-2接合物。
實施例35.根據實施例1-34中任一項所述的方法，其中其中藉由皮下投予向所述個體投予所述IL-2接合物和西妥昔單抗。
實施例36.根據實施例1-33中任一項所述的方法，其中藉由靜脈內投予向所述個體投予所述IL-2接合物。
實施例37.根據實施例1-33和36中任一項所述的方法，其中其中藉由靜脈內投予向所述個體投予所述IL-2接合物和西妥昔單抗。
實施例38.根據實施例1-37中任一項所述的方法，所述方法進一步包括向所述個體投予對乙醯胺基酚。
實施例39.根據實施例1-38中任一項所述的方法，所述方法進一步包括向所述個體投予苯海拉明(diphenhydramine)。
實施例40.根據實施例1-39中任一項所述的方法，所述方法進一步包括向所述個體投予昂丹司瓊(ondansetron)。
實施例41.根據實施例38-40中任一項所述的方法，其中在投予所述IL-2接合物之前向所述個體投予所述對乙醯胺基酚、苯海拉明和/或昂丹司瓊。
實施例42.根據實施例38-40中任一項所述的方法，其中在投予西妥昔單抗之前向所述個體投予所述對乙醯胺基酚、苯海拉明和/或昂丹司瓊。
實施例43.一種用於根據實施例1-42中任一項所述的方法中的IL-2接合物。
實施例44.一種IL-2接合物用於製造用於根據實施例1-42中任一項所述的方法的藥劑的用途。
相關申請的交叉引用
本申請案係請求2021年6月3日提交的美國臨時申請號63/196,448、2021年6月24日提交的美國臨時申請號63/214,634、2021年10月8日提交的美國臨時申請號63/253,892和2021年10月20日提交的美國臨時申請號63/257,921的優先權。 定義
除非另外定義，否則本文中使用的所有技術術語和科學術語具有與要求保護的主題所屬領域技術者通常所理解的相同的含義。應理解，前述一般說明和以下詳細說明只是示例性和解釋性的，並且不限制要求保護的任何主題。在藉由引用併入本文的任何材料與本揭示文本的明確內容不一致的情況下，以明確內容為准。在本申請中，除非另外明確陳述，否則單數的使用包括複數含義。必須指出，如在說明書和所附申請專利範圍中所用，除非上下文另外清楚地規定，否則單數形式「一個/一種（a、an）」和「所述（the）」包括複數指示物。在本申請中，除非上下文另有要求，否則「或」的使用意指「和/或」。此外，術語「包括（including）」以及其他形式如「包括（include）」、「包括（includes）」和「包括（included）」的使用是非限制性的。
在說明書中對「一些實施例」、「實施例」、「一個實施例」或「其他實施例」的提及意指結合實施例描述的特定特徵、結構或特性包括在本揭示文本的至少一些實施例中，但不必包括在本發明的所有實施例中。
如本文所用，範圍和數量可以表示為「約」特定值或範圍。約也包括確切的量。因此，「約5 μL」意指「約5 μL」並且還意指「5 μL」。通常，術語「約」包括預期在實驗誤差範圍內的量，例如像在15%、10%或5%內。
本文使用的章節標題僅用於組織目的，而不應解釋為限制所描述的主題。
如本文所用，術語「個體」和「患者」是指任何哺乳動物。在一些實施例中，所述哺乳動物是人。在一些實施例中，哺乳動物是非人。所述術語均不要求或不限於以衛生保健工作者（例如醫生、註冊護士、執業護士、醫師助理、護理員或臨終關懷工作者）進行監督（例如持續或間斷）為特徵的情況。
如本文所用，術語「非天然胺基酸」是指除20種天然存在的胺基酸之一之外的胺基酸。示例性非天然胺基酸描述於Young等人, 「Beyond the canonical 20 amino acids: expanding the genetic lexicon,」 J. of Biological Chemistry 285(15): 11039-11044 (2010)中，將其揭露內容藉由引用併入本文。
本文的術語「抗體」以最廣義使用，並且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體（例如雙特異性抗體）和抗體片段，只要它們展現出所需的抗原結合活性即可。「抗體片段」是指除了完整抗體以外的分子，其包含完整抗體的結合完整抗體所結合的抗原的一部分。抗體片段的例子包括但不限於Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab') 2；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子（例如，scFv）；和從抗體片段形成的多特異性抗體。
如本文所用，「核苷酸」是指包含核苷部分和磷酸酯部分的化合物。示例性天然核苷酸包括而不限於腺苷三磷酸（ATP）、尿苷三磷酸（UTP）、胞苷三磷酸（CTP）、鳥苷三磷酸（GTP）、腺苷二磷酸（ADP）、尿苷二磷酸（UDP）、胞苷二磷酸（CDP）、鳥苷二磷酸（GDP）、腺苷一磷酸（AMP）、尿苷一磷酸（UMP）、胞苷一磷酸（CMP）和鳥苷一磷酸（GMP）、去氧腺苷三磷酸（dATP）、去氧胸苷三磷酸（dTTP）、去氧胞苷三磷酸（dCTP）、去氧鳥苷三磷酸（dGTP）、去氧腺苷二磷酸（dADP）、胸苷二磷酸（dTDP）、去氧胞苷二磷酸（dCDP）、去氧鳥苷二磷酸（dGDP）、去氧腺苷一磷酸（dAMP）、去氧胸苷一磷酸（dTMP）、去氧胞苷一磷酸（dCMP）和去氧鳥苷一磷酸（dGMP）。包含去氧核糖作為糖部分的示例性天然去氧核糖核苷酸包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dADP、dTDP、dCDP、dGDP、dAMP、dTMP、dCMP和dGMP。包含核糖作為糖部分的示例性天然核糖核苷酸包括ATP、UTP、CTP、GTP、ADP、UDP、CDP、GDP、AMP、UMP、CMP和GMP。
如本文所用，「鹼基」或「核鹼基」是指核苷或核苷酸（核苷和核苷酸涵蓋核糖或去氧核糖變異體）的至少核鹼基部分，所述核苷或核苷酸在一些情況下可以含有對核苷或核苷酸的糖部分的進一步修飾。在一些情況下，「鹼基」也用於代表整個核苷或核苷酸（例如，「鹼基」可以藉由DNA聚合酶摻入DNA中，或藉由RNA聚合酶摻入RNA中）。然而，除非上下文要求，否則術語「鹼基」不應解釋為必然代表整個核苷或核苷酸。在本文提供的鹼基或核鹼基化學結構中，僅示出核苷或核苷酸的鹼基，為清楚起見省略了糖部分和任選的任何磷酸酯殘基。如本文提供的鹼基或核鹼基化學結構中使用的，波浪線代表與核苷或核苷酸的連接，其中核苷或核苷酸的糖部分可以被進一步修飾。在一些實施例中，波浪線代表鹼基或核鹼基與核苷或核苷酸的糖部分（諸如戊糖）的附接。在一些實施例中，戊糖是核糖或去氧核糖。
在一些實施例中，核鹼基通常是核苷的雜環鹼基部分。核鹼基可以是天然存在的，可以是經修飾的，可以與天然鹼基沒有相似性，和/或可以是合成的，例如藉由有機合成而合成。在某些實施例中，核鹼基包含核苷或核苷酸中的任何原子或原子組，其中所述原子或原子組能夠在使用或不使用氫鍵的情況下與另一核酸的鹼基相互作用。在某些實施例中，非天然核鹼基不是源自天然核鹼基。應注意，非天然核鹼基不一定具有鹼基特性，但是為了簡單起見，它們稱為核鹼基。在一些實施例中，當提及核鹼基時，「(d)」指示核鹼基可以附接至去氧核糖或核糖，而沒有括弧的「d」指示核鹼基附接至去氧核糖。
如本文所用，「核苷」是包含核鹼基部分和糖部分的化合物。核苷包括但不限於天然存在的核苷（如在DNA和RNA中發現的）、脫鹼基核苷、經修飾的核苷和具有模擬鹼基和/或糖基團的核苷。核苷包括包含任何種類的取代基的核苷。核苷可以是藉由核酸鹼基與糖的還原基團之間的糖苷連接形成的糖苷化合物。
如本文所用的術語化學結構的「類似物」是指與母體結構保持基本相似性但它可能不容易從母體結構合成得到的化學結構。在一些實施例中，核苷酸類似物是非天然核苷酸。在一些實施例中，核苷類似物是非天然核苷。容易從母體化學結構合成得到的相關化學結構稱為「衍生物」。
如本文所用，「劑量限制性毒性」（DLT）被定義為在治療週期的第1天至第29天（含）±1天內發生的不良事件，其不明確地或無可爭議地僅與外來原因相關並且滿足實例2中針對DLT所述的標準。
如本文所用，「鉑難治性」癌症被定義這樣的癌症，其中在基於鉑的療法期間疾病進展（即，患者未達到至少穩定的疾病或對鉑療法的部分反應），或疾病在基於鉑的治療結束後6個月內復發。
如本文所用，「初治的(treatment-naïve)」是指從未接受過特定療法的治療的個體。例如，如果個體從未接受過西妥昔單抗治療，則個體對於西妥昔單抗是初治的。
如本文所用，「西妥昔單抗」是指由Eli Lilly and Co.以商品名「Erbitux」銷售的嵌合（小鼠/人）抗EGFR抗體。
儘管本發明的各種特徵可以在單一實施例的上下文中描述，但所述特徵也可以單獨提供或以任何合適的組合提供。相反，儘管為了清楚起見，本文可以在分開的實施例的背景下描述本發明，但是本發明也可以在單一實施例中實現。 IL-2 組合療法
介白素2（IL-2）是一種多效性1型細胞激素，其結構包含15.5 kDa的四α-螺旋束。IL-2的前體形式的長度為153個胺基酸殘基，其中前20個胺基酸形成信號肽，並且殘基21-153形成成熟形式。IL-2主要由CD4+ T細胞在抗原刺激後產生，以及由CD8+細胞、自然殺傷（NK）細胞、和自然殺傷T（NKT）細胞、活化的樹突細胞（DC）和肥大細胞以較低程度產生。IL-2信號傳導藉由與IL-2受體（IL-2R）亞基、IL-2Rα（也稱為CD25）、IL-2Rβ（也稱為CD122）和IL-2Rγ（也稱為CD132）的特定組合的相互作用來進行。IL-2與IL-2Rα的相互作用以約10 -8M的K d形成「低親和力」IL-2受體複合物。IL-2與IL-2Rβ和IL-2Rγ的相互作用以約10 -9M的K d形成「中親和力」IL-2受體複合物。IL-2與所有三種亞基IL-2Rα、IL-2Rβ和IL-2Rγ的相互作用以約＞10 -11M的K d形成「高親和力」IL-2受體複合物。
在一些情況下，經由「高親和力」IL-2Rαβγ複合物的IL-2信號傳導會調節調節T細胞的啟動和增殖。調節T細胞或CD4 +CD25 +Foxp3 +調節T（Treg）細胞藉由抑制效應細胞（諸如CD4 +T細胞、CD8 +T細胞、B細胞、NK細胞和NKT細胞）來介導免疫穩態的維持。在一些情況下，Treg細胞是從胸腺生成（tTreg細胞），或者是從外周的幼稚T細胞誘導（pTreg細胞）。在一些情況下，將Treg細胞視為外周耐受的介體。實際上，在一項研究中，CD25耗盡的外周CD4 +T細胞的轉移在裸鼠中產生多種自體免疫疾病，而CD4 +CD25 +T細胞的共轉移抑制自身免疫的發展（Sakaguchi等人, 「Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25),」 J. Immunol.155(3): 1151--1164 (1995)，其揭露內容藉由引用併入本文）。Treg細胞群體的增大下調效應T細胞增殖並且抑制自身免疫和T細胞抗腫瘤反應。
經由「中親和力」IL-2Rβγ複合物的IL-2信號傳導調節CD8 +效應T（Teff）細胞、NK細胞和NKT細胞的啟動和增殖。CD8 +Teff細胞（也稱為細胞毒性T細胞、Tc細胞、細胞毒性T淋巴細胞、CTL、T殺傷細胞、細胞裂解性T細胞、Tcon或殺傷T細胞）是識別並且殺傷受損細胞、癌細胞和病原體感染的細胞的T淋巴細胞。NK和NKT細胞是與CD8 +Teff細胞類似的淋巴細胞類型，其靶向癌細胞和病原體感染的細胞。
在一些情況下，IL-2信號傳導用於調節T細胞反應，並且隨後用於治療癌症。例如，以高劑量形式投予IL-2以誘導用於治療癌症的Teff細胞群體的擴增。然而，高劑量IL-2進一步導致對Treg細胞的伴隨刺激，從而減弱抗腫瘤免疫反應。高劑量IL-2還誘導由脈管系統中的IL-2Rα鏈表現細胞（包括2型先天免疫細胞（ILC-2）、嗜酸性粒細胞和內皮細胞）的接合介導的毒性不良事件。這導致嗜酸性粒細胞增多症、毛細血管滲漏和血管滲漏症候群（VLS）。
過繼細胞療法使得醫師能夠有效利用患者自身的免疫細胞對抗疾病，諸如增殖性疾病（例如，癌症）以及感染性疾病。IL-2信號傳導的作用可以藉由組合療法中存在另外的藥劑或方法而進一步增強。
一種有吸引力的療法是IL-2衍生物與西妥昔單抗的組合。西妥昔單抗是一種與表皮生長因子受體（EGFR）結合的單株抗體。EGFR是一種在多種類型癌症中過表現的細胞表面受體。EGFR的活化促進細胞增殖和存活，以及血管生成，導致腫瘤生長和轉移。細胞生長和血管生成可以藉由阻斷EGFR與表皮生長因子（EGF）的結合來調節。藉由阻止EGF與EGFR結合，下游信號轉導級聯被抑制，導致細胞生長減少。藉由抑制轉化生長因子α（TGF-α）與EGFR的結合可以達到相同的作用。除了EGFR阻斷之外，西妥昔單抗的作用機制似乎還包括抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（Iannello, A.等人, Cancer Metastasis Rev.2005, 24(4):487-99，將其揭露內容藉由引用併入本文），這可以有助於其功效並且可以被進一步開發。西妥昔單抗適用於與放射療法組合治療局部或區域晚期頭頸部鱗狀細胞癌；與基於鉑的療法和氟尿嘧啶組合治療頭頸部的復發性局部區域疾病或轉移性鱗狀細胞癌；以及頭頸部的復發性或轉移性鱗狀細胞癌。
頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）是按全球發病率計第九位主要的癌症並且占所有頭頸癌的90%（Gupta等人 Oncology, 2016, 91(1):13-23，將其揭露內容藉由引用併入本文）。HNSCC是一種生物多樣性和基因組異質性疾病，其起源於上呼吸消化道（包括唇和口腔、鼻腔、鼻旁竇、鼻咽、口咽、喉和下咽）的鱗狀粘膜內層。大量頭頸癌患者最初呈現有局部晚期的III/IV期疾病，其最初用化療、放射和/或手術的組合進行治療。這種初始治療可以導致患者的疾病控制率範圍在33%與86%之間。初始療法後進展的患者需要對復發性（R）或轉移性（M）疾病進行後續治療。 IL-2 接合物
本文提供了治療有需要的個體的HNSCC的方法，所述方法包括向所述個體投予IL-2接合物與一種或多種另外的藥劑的組合。
在一些實施例中，所述IL-2序列包含SEQ ID NO: 1的序列： PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT (SEQ ID NO: 1)。 其中位置P64處的胺基酸被式 (I) 的結構替代：
Figure 02_image001
(I) 其中： Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image003
； Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image003
； Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image006
；或 Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image006
； W是具有約25 kDa-35 kDa的平均分子量的PEG基團； q是1、2或3； X是具有以下結構的L-胺基酸：
Figure 02_image010
； X-1指示與前一個胺基酸殘基的附接點；並且 X+1指示與後一個胺基酸殘基的附接點。
在本文所述的式 (I) 的任何實施例或變型中，所述IL-2接合物是醫藥上可接受的鹽、溶劑合物或水合物。在一些實施例中，所述IL-2接合物是醫藥上可接受的鹽。在一些實施例中，所述IL-2接合物是溶劑合物。在一些實施例中，所述IL-2接合物是水合物。
在本文所述的式 (I) 和包含其的醫藥組合物的任何實施例或變型中，平均分子量涵蓋重均分子量和數均分子量二者；換句話說，例如，30 kDa數均分子量和30 kDa重均分子量二者均符合30 kDa分子量。在一些實施例中，平均分子量是重均分子量。在其他實施例中，平均分子量是數均分子量。應理解，在本文提供的方法中，向個體投予如本文所述的IL-2接合物包括投予多於單分子的IL-2接合物；因此，使用術語「平均」來描述PEG基團的分子量是指投予於個體的劑量中IL-2接合物分子的PEG基團的平均分子量。
在式 (I) 的一些實施例中，Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image036
。在式 (I) 的一些實施例中，Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image038
。在式 (I) 的一些實施例中，Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image039
。在式 (I) 的一些實施例中，Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image041
。
在式 (I) 的一些實施例中，q是1。在式 (I) 的一些實施例中，q是2。在式 (I) 的一些實施例中，q是3。
在式 (I) 的一些實施例中，W是具有約25 kDa的平均分子量的PEG基團。在式 (I) 的一些實施例中，W是具有約30 kDa的平均分子量的PEG基團。在式 (I) 的一些實施例中，W是具有約35 kDa的平均分子量的PEG基團。
在式 (I) 的一些實施例中，q是1並且式 (I) 的結構為式 (Ia) 的結構：
Figure 02_image001
(Ia) 其中： Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image044
； Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image044
； Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image046
；或 Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image048
； W是具有約25 kDa-35 kDa的平均分子量的PEG基團； X是具有以下結構的L-胺基酸：
Figure 02_image010
； X-1指示與前一個胺基酸殘基的附接點；並且 X+1指示與後一個胺基酸殘基的附接點。
在式 (Ia) 的一些實施例中，Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image044
。在式 (Ia) 的一些實施例中，Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image044
。在式 (Ia) 的其他實施例中，Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image046
。在式 (Ia) 的一些實施例中，Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image046
。
在式 (Ia) 的一些實施例中，PEG基團具有約30 kDa的平均分子量。
在一些實施例中，IL-2接合物包含SEQ ID NO: 2的序列： PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELK [AzK_L1_PEG30kD] LEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT (SEQ ID NO: 2)。 其中[AzK_L1_PEG30kD]是經由DBCO介導的點擊化學與PEG穩定接合的N6-((2-疊氮基乙氧基)-羰基)-L-離胺酸，所述點擊化學形成包含式 (IV) 或式 (V) 的結構的化合物，其中q是1（諸如式 (IVa) 或式 (Va)），並且其中所述PEG基團具有約25-35千道爾頓（例如，約30 kDa）的平均分子量，被甲氧基封端。術語「DBCO」意指包含二苯並環辛炔基團的化學部分，諸如包括實例1方案1和2中顯示的mPEG-DBCO化合物。
從點擊反應生成的位置異構體的比率為約1:1或大於1:1。
PEG典型地將包含許多（OCH 2CH 2）單體（或（CH 2CH 2O）單體，取決於如何定義PEG）。在一些實施例中，（OCH 2CH 2）單體（或（CH 2CH 2O）單體）的數量使得PEG基團的平均分子量為約30 kDa。
在一些情況下，PEG是封端聚合物，即至少一個末端用相對惰性的基團（諸如低級C 1-6烷氧基或羥基）封端的聚合物。在一些實施例中，PEG基團是甲氧基-PEG（通常稱為mPEG），其是PEG的線性形式，其中聚合物的一個末端是甲氧基（-OCH 3）基團，而另一個末端是羥基或可以任選地經化學修飾的其他官能團。
在一些實施例中，PEG基團是線性或分支PEG基團。在一些實施例中，PEG基團是線性PEG基團。在一些實施例中，PEG基團是分支PEG基團。在一些實施例中，PEG基團是甲氧基PEG基團。在一些實施例中，PEG基團是線性或分支甲氧基PEG基團。在一些實施例中，PEG基團是線性甲氧基PEG基團。在一些實施例中，PEG基團是分支甲氧基PEG基團。例如，本揭示文本的範圍內包括包含分子量為30,000 Da ± 3,000 Da、或30,000 Da ± 4,500 Da、或30,000 Da ± 5,000 Da的PEG基團的IL-2接合物。
在一些實施例中，所述IL-2接合物包含胺基酸序列SEQ ID NO: 1，其中胺基酸殘基P64被式 (IV) 或式 (V) 的結構或式 (IV) 和式 (V) 的混合物替代：
Figure 02_image021
式 (IV)；
Figure 02_image023
式 (V)； 其中： W是具有約25 kDa-35 kDa的平均分子量的PEG基團； q是1、2或3；並且 X具有以下結構：
Figure 02_image010
； X-1指示與前一個胺基酸殘基的附接點；並且 X+1指示與後一個胺基酸殘基的附接點。
在式 (IV) 或式 (V)、或式 (IV) 或式 (V) 的混合物的一些實施例中，q是1。在式 (IV) 或式 (V)、或式 (IV) 或式 (V) 的混合物的一些實施例中，q是2。在式 (IV) 或式 (V)、或式 (IV) 或式 (V) 的混合物的一些實施例中，q是3。
在式 (IV) 或式 (V)、或式 (IV) 或式 (V) 的混合物的一些實施例中，W是具有約25 kDa的平均分子量的PEG基團。在式 (IV) 或式 (V)、或式 (IV) 或式 (V) 的混合物的一些實施例中，W是具有約30 kDa的平均分子量的PEG基團。在式 (IV) 或式 (V)、或式 (IV) 或式 (V) 的混合物的一些實施例中，W是具有約35 kDa的平均分子量的PEG基團。
在本文所述的任何實施例中，式 (I) 的結構具有式 (IV) 或式 (V) 的結構或是式 (IV) 和式 (V) 的混合物。在一些實施例中，式 (I) 的結構具有式 (IV) 的結構。在一些實施例中，式 (I) 的結構具有式 (V) 的結構。在一些實施例中，式 (I) 的結構是式 (IV) 和式 (V) 的混合物。
在式 (IV) 或式 (V)、或式 (IV) 和式 (V) 的混合物的一些實施例中，q是1，式 (IV) 的結構是式 (IVa) 的結構，並且式 (V) 的結構是式 (Va) 的結構：
Figure 02_image053
式 (IVa)；
Figure 02_image055
式 (Va)； 其中： W是具有約25 kDa-35 kDa的平均分子量的PEG基團；並且 X具有以下結構：
Figure 02_image010
； X-1指示與前一個胺基酸殘基的附接點；並且 X+1指示與後一個胺基酸殘基的附接點。
在式 (IVa) 或式 (Va)、或式 (IVa) 和式 (Va) 的混合物的一些實施例中，PEG基團具有約30 kDa的平均分子量。
在本文所述的任何實施例中，式 (I) 的結構具有式 (IVa) 或式 (Va) 的結構或是式 (IVa) 和式 (Va) 的混合物。在一些實施例中，式 (I) 的結構具有式 (IVa) 的結構。在一些實施例中，式 (I) 的結構具有式 (Va) 的結構。在一些實施例中，式 (I) 的結構是式 (IVa) 和式 (Va) 的混合物。
在一些實施例中，IL-2接合物包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，其中胺基酸殘基P64被式(XII)或式(XIII)的結構、或式(XII)和式(XIII)的混合物替代：
Figure 02_image026
式 (XII)；
Figure 02_image028
式 (XIII)； 其中： n是整數，使得-(OCH 2CH 2) n-OCH 3具有約25 kDa-35 kDa的分子量； q是1、2或3；並且 波浪線表示與SEQ ID NO: 1中未被替代的胺基酸殘基的共價鍵。
在式 (XII) 或式 (XIII)、或式 (XII) 和式 (XIII) 的混合物的一些實施例中，q是1。在式 (XII) 或式 (XIII)、或式 (XII) 和式 (XIII) 的混合物的一些實施例中，q是2。在式 (XII) 或式 (XIII)、或式 (XII) 和式 (XIII) 的混合物的一些實施例中，q是3。
在式 (XII) 或式 (XIII)、或式 (XII) 和式 (XIII) 的混合物的一些實施例中，n是整數，使得-(OCH 2CH 2) n-OCH 3具有約30 kDa的分子量。
在本文所述的任何實施例中，式 (I) 的結構具有式 (XII) 或式 (XIII) 的結構或是式 (XII) 和式 (XIII) 的混合物。在一些實施例中，式 (I) 的結構具有式 (XII) 的結構。在一些實施例中，式 (I) 的結構具有式 (XIII) 的結構。在一些實施例中，式 (I) 的結構是式 (XII) 和式 (XIII) 的混合物。
在式(XII)或式(XIII)、或式(XII)和式(XIII)的混合物的一些實施例中，q是1，式(XII)的結構是式(XIIa)的結構，並且式(XIII)的結構是式(XIIIa)的結構：
Figure 02_image060
式 (XIIa)；
Figure 02_image062
式 (XIIIa)； 其中： n是整數，使得-(OCH 2CH 2) n-OCH 3具有約25 kDa-35 kDa的分子量；並且 波浪線表示與SEQ ID NO: 1中未被替代的胺基酸殘基的共價鍵。
在式 (XIIa) 或式 (XIIIa)、或式 (XIIa) 和式 (XIIIa) 的混合物的一些實施例中，n是整數，使得-(OCH 2CH 2) n-OCH 3具有約30 kDa的分子量。
在本文所述的任何實施例中，式 (I) 的結構具有式 (XIIa) 或式 (XIIIa) 的結構或是式 (XIIa) 和式 (XIIIa) 的混合物。在一些實施例中，式 (I) 的結構具有式 (XIIa) 的結構。在一些實施例中，式 (I) 的結構具有式 (XIIIa) 的結構。在一些實施例中，式 (I) 的結構是式 (XIIa) 和式 (XIIIa) 的混合物。
在一些實施例中，IL-2接合物包含SEQ ID NO: 的胺基酸序列，其中胺基酸殘基P64被式(XIV)或式(XV)的結構、或式(XIV)和式(XV)的混合物替代：
Figure 02_image064
式 (XIV)；
Figure 02_image066
式 (XV)； 其中： m是從0至20的整數； p是從0至20的整數； n是整數，使得PEG基團具有約25 kDa-35 kDa的平均分子量；並且 波浪線指示與SEQ ID NO: 1中未被替代的胺基酸殘基的共價鍵。
在式 (XIV) 或式 (XV)、或式 (XIV) 和式 (XV) 的混合物的一些實施例中，n是整數，使得PEG基團具有約30 kDa的平均分子量。
在一些實施例中，m是從0至15的整數。在一些實施例中，m是從0至10的整數。在一些實施例中，m是從0至5的整數。在一些實施例中，m是從1至5的整數。在一些實施例中，m是1。在一些實施例中，m是2。在一些實施例中，m是3。在一些實施例中，m是4。在一些實施例中，m是5。
在一些實施例中，p是從0至15的整數。在一些實施例中，p是從0至10的整數。在一些實施例中，p是從0至5的整數。在一些實施例中，p是從1至5的整數。在一些實施例中，p是1。在一些實施例中，p是2。在一些實施例中，p是3。在一些實施例中，p是4。在一些實施例中，p是5。
在一些實施例中，m和p各自是2。
在本文所述的任何實施例中，式 (I) 的結構具有式 (XIV) 或式 (XV) 的結構或是式 (XIV) 和式 (XV) 的混合物。在一些實施例中，式 (I) 的結構具有式 (XIV) 的結構。在一些實施例中，式 (I) 的結構具有式 (XV) 的結構。在一些實施例中，式 (I) 的結構是式 (XIV) 和式 (XV) 的混合物。
在一些實施例中，IL-2接合物包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，其中胺基酸殘基P64被式 (XVI) 或式 (XVII) 的結構、或式 (XVI) 和式 (XVII) 的混合物替代：
Figure 02_image068
式 (XVI)；
Figure 02_image070
式 (XVII)； 其中： m是從0至20的整數； n是整數，使得PEG基團具有約25 kDa-35 kDa的平均分子量；並且 波浪線指示與SEQ ID NO: 1中未被替代的胺基酸殘基的共價鍵。
在式 (XVI) 或式 (XVII)、或式 (XVI) 和式 (XVII) 的混合物的一些實施例中，n是整數，使得PEG基團具有約30 kDa的平均分子量。
在一些實施例中，m是從0至15的整數。在一些實施例中，m是從0至10的整數。在一些實施例中，m是從0至5的整數。在一些實施例中，m是從1至5的整數。在一些實施例中，m是1。在一些實施例中，m是2。在一些實施例中，m是3。在一些實施例中，m是4。在一些實施例中，m是5。
在本文所述的任何實施例中，式 (I) 的結構具有式 (XVI) 或式 (XVII) 的結構或是式 (XVI) 和式 (XVII) 的混合物。在一些實施例中，式 (I) 的結構具有式 (XVI) 的結構。在一些實施例中，式 (I) 的結構具有式 (XVII) 的結構。在一些實施例中，式 (I) 的結構是式 (XVI) 和式 (XVII) 的混合物。 接合化學
在一些實施例中，本文所述的IL-2接合物可以藉由包括1,3-偶極環加成反應的接合反應來製備。在一些實施例中，1,3-偶極環加成反應包括疊氮化物與炔烴的反應（「點擊」反應）。在一些實施例中，本文所述的接合反應包括方案I中概述的反應，其中X是SEQ ID NO: 1的位置P64處的非天然胺基酸。 方案 I.
Figure 02_image072
在一些實施例中，接合部分包含如本文所述的PEG基團。在一些實施例中，反應基團包含炔烴或疊氮化物。
在一些實施例中，本文所述的接合反應包括方案II中概述的反應，其中X是SEQ ID NO: 1的位置P64處的非天然胺基酸。 方案 II.
Figure 02_image074
在一些實施例中，本文所述的接合反應包括方案III中概述的反應，其中X是SEQ ID NO: 1的位置P64處的非天然胺基酸。 方案 III.
Figure 02_image076
在一些實施例中，本文所述的接合反應包括方案IV中概述的反應，其中X是SEQ ID NO: 1的位置P64處的非天然胺基酸。 方案 IV.
Figure 02_image078
在一些實施例中，本文所述的接合反應包括疊氮化物部分（諸如含於含有衍生自 N6-((2-疊氮基乙氧基)-羰基)-L-離胺酸（AzK）的胺基酸殘基的蛋白質中的疊氮化物部分）與應變環炔（諸如衍生自DBCO的應變環炔，所述DBCO是包含二苯並環辛炔基團的化學部分）之間的環加成反應。包含DBCO部分的PEG基團可商購獲得或者可以藉由一般熟習此項技術者已知的方法來製備。示例性反應顯示在方案V和VI中。 方案 V.
Figure 02_image080
方案 VI.
Figure 02_image082
本文所述的接合反應（諸如點擊反應）可以生成單一位置異構體或位置異構體的混合物。在一些情況下，位置異構體的比率是約1:1。在一些情況下，位置異構體的比率是約2:1。在一些情況下，位置異構體的比率是約1.5:1。在一些情況下，位置異構體的比率是約1.2:1。在一些情況下，位置異構體的比率是約1.1:1。在一些情況下，位置異構體的比率大於1:1。 IL-2 多肽產生
在一些情況下，重組產生或化學合成本文所述的IL-2接合物，其含有天然胺基酸突變或非天然胺基酸突變。在一些情況下，例如藉由宿主細胞系統或在無細胞系統中重組產生本文所述的IL-2接合物。
在一些情況下，藉由宿主細胞系統重組產生IL-2接合物。在一些情況下，宿主細胞是真核細胞（例如，哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞或植物細胞）或原核細胞（例如，革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌）。在一些情況下，真核宿主細胞是哺乳動物宿主細胞。在一些情況下，哺乳動物宿主細胞是穩定的細胞株，或者是將目的遺傳物質摻入其自身基因組中並且具有在多代細胞分裂後表現所述遺傳物質的產物的能力的細胞株。在其他情況下，哺乳動物宿主細胞是暫態細胞株，或者是未將目的遺傳物質摻入其自身基因組中並且不具有在多代細胞分裂後表現所述遺傳物質的產物的能力的細胞株。
示例性哺乳動物宿主細胞包括293T細胞株、293A細胞株、293FT細胞株、293F細胞、293 H細胞、A549細胞、MDCK細胞、CHO DG44細胞、CHO-S細胞、CHO-K1細胞、Expi293F™細胞、Flp-In™ T-REx™ 293細胞株、Flp-In™-293細胞株、Flp-In™-3T3細胞株、Flp-In™-BHK細胞株、Flp-In™-CHO細胞株、Flp-In™-CV-1細胞株、Flp-In™-Jurkat細胞株、FreeStyle™ 293-F細胞、FreeStyle™ CHO-S細胞、GripTite™ 293 MSR細胞株、GS-CHO細胞株、HepaRG™細胞、T-REx™ Jurkat細胞株、Per.C6細胞、T-REx™-293細胞株、T-REx™-CHO細胞株和T-REx™-HeLa細胞株。
在一些實施例中，真核宿主細胞是昆蟲宿主細胞。示例性昆蟲宿主細胞包括果蠅（ Drosophila）S2細胞、Sf9細胞、Sf21細胞、High Five™細胞和expresSF+®細胞。
在一些實施例中，真核宿主細胞是酵母宿主細胞。示例性酵母宿主細胞包括巴斯德畢赤酵母（法夫駒形氏酵母（ K. phaffii））酵母菌株，諸如GS115、KM71H、SMD1168、SMD1168H和X-33，以及釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）酵母菌株，諸如INVSc1。
在一些實施例中，真核宿主細胞是植物宿主細胞。在一些情況下，植物細胞包括來自藻類的細胞。示例性植物細胞株包括來自萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）137c或細長聚球藻（Synechococcus elongatus）PPC 7942的菌株。
在一些實施例中，宿主細胞是原核宿主細胞。示例性原核宿主細胞包括BL21、Mach1™、DH10B™、TOP10、DH5α、DH10Bac™、OmniMax™、MegaX™、DH12S™、INV110、TOP10F'、INVαF、TOP10/P3、ccdB Survival、PIR1、PIR2、Stbl2™、Stbl3™或Stbl4™。
在一些情況下，用於產生本文所述的IL-2多肽的合適的多核酸分子或載體包括源自真核或原核來源的任何合適的載體。示例性多核酸分子或載體包括來自細菌（例如，大腸桿菌）、昆蟲、酵母（例如，巴斯德畢赤酵母、法夫駒形氏酵母）、藻類或哺乳動物來源的載體。細菌載體包括例如pACYC177、pASK75、pBAD載體系列、pBADM載體系列、pET載體系列、pETM載體系列、pGEX載體系列、pHAT、pHAT2、pMal-c2、pMal-p2、pQE載體系列、pRSET A、pRSET B、pRSET C、pTrcHis2系列、pZA31-Luc、pZE21-MCS-1、pFLAG ATS、pFLAG CTS、pFLAG MAC、pFLAG Shift-12c、pTAC-MAT-1、pFLAG CTC或pTAC-MAT-2。
昆蟲載體包括例如pFastBac1、pFastBac DUAL、pFastBac ET、pFastBac HTa、pFastBac HTb、pFastBac HTc、pFastBac M30a、pFastBact M30b、pFastBac、M30c、pVL1392、pVL1393、pVL1393 M10、pVL1393 M11、pVL1393 M12、FLAG載體（諸如pPolh-FLAG1或pPolh-MAT 2）或MAT載體（諸如pPolh-MAT1或pPolh-MAT2）。
酵母載體包括例如Gateway ®pDEST ™14載體、Gateway ®pDEST ™15載體、Gateway ®pDEST ™17載體、Gateway ®pDEST ™24載體、Gateway ®pYES-DEST52載體、pBAD-DEST49 Gateway ®目的載體、pAO815畢赤酵母屬載體、pFLD1巴斯德畢赤酵母（法夫駒形氏酵母）載體、pGAPZA、B和C巴斯德畢赤酵母（法夫駒形氏酵母）載體、pPIC3.5K畢赤酵母屬載體、pPIC6 A、B和C畢赤酵母屬載體、pPIC9K畢赤酵母屬載體、pTEF1/Zeo、pYES2酵母載體、pYES2/CT酵母載體、pYES2/NT A、B和C酵母載體或pYES3/CT酵母載體。
藻類載體包括例如pChlamy-4載體或MCS載體。
哺乳動物載體包括例如暫態表現載體或穩定表現載體。示例性哺乳動物暫態表現載體包括p3xFLAG-CMV 8、pFLAG-Myc-CMV 19、pFLAG-Myc-CMV 23、pFLAG-CMV 2、pFLAG-CMV 6a,b,c、pFLAG-CMV 5.1、pFLAG-CMV 5a,b,c、p3xFLAG-CMV 7.1、pFLAG-CMV 20、p3xFLAG-Myc-CMV 24、pCMV-FLAG-MAT1、pCMV-FLAG-MAT2、pBICEP-CMV 3或pBICEP-CMV 4。示例性哺乳動物穩定表現載體包括pFLAG-CMV 3、p3xFLAG-CMV 9、p3xFLAG-CMV 13、pFLAG-Myc-CMV 21、p3xFLAG-Myc-CMV 25、pFLAG-CMV 4、p3xFLAG-CMV 10、p3xFLAG-CMV 14、pFLAG-Myc-CMV 22、p3xFLAG-Myc-CMV 26、pBICEP-CMV 1或pBICEP-CMV 2。
在一些情況下，將無細胞系統用於產生本文所述的IL-2多肽。在一些情況下，無細胞系統包含來自細胞的胞質和/或核組分的混合物，並且適合於體外核酸合成。在一些情況下，無細胞系統利用原核細胞組分。在其他情況下，無細胞系統利用真核細胞組分。核酸合成是在基於例如果蠅細胞、非洲爪蟾卵、古細菌或HeLa細胞的無細胞系統中獲得的。示例性無細胞系統包括大腸桿菌S30提取系統、大腸桿菌T7 S30系統或PURExpress®、XpressCF和XpressCF+。
無細胞轉譯系統不同地包含組分，諸如質體、mRNA、DNA、tRNA、合成酶、釋放因數、核糖體、伴侶蛋白、轉譯起始和延伸因數、天然和/或非天然胺基酸和/或用於蛋白質表現的其他組分。任選地修飾此類組分以提高產量、增加合成速率、增加蛋白質產物保真度或摻入非天然胺基酸。在一些實施例中，本文所述的細胞激素是使用US 8,778,631；US 2017/0283469；US 2018/0051065；US 2014/0315245；或US 8,778,631中描述的無細胞轉譯系統合成的，其每一個的揭露內容藉由引用併入本文。在一些實施例中，無細胞轉譯系統包含經修飾的釋放因數，或者甚至從所述系統去除一種或多種釋放因數。在一些實施例中，無細胞轉譯系統包含降低的蛋白酶濃度。在一些實施例中，無細胞轉譯系統包含具有重新分配的密碼子的經修飾的tRNA，所述密碼子用於編碼非天然胺基酸。在一些實施例中，在無細胞轉譯系統中使用本文所述的合成酶用於摻入非天然胺基酸。在一些實施例中，在將tRNA添加到無細胞轉譯系統之前，使用酶促或化學方法用非天然胺基酸對所述tRNA進行預載入。在一些實施例中，用於無細胞轉譯系統的組分是從經修飾的生物體（諸如經修飾的細菌、酵母或其他生物體）獲得。
在一些實施例中，經由表現宿主系統或藉由無細胞系統以環狀變換的形式產生IL-2多肽。 包含非天然胺基酸的細胞激素多肽的產生
可以在本揭示中使用正交或擴增的遺傳密碼，其中將存在於IL-2多肽的核酸序列中的一個或多個特定密碼子分配以編碼非天然胺基酸，使得可以藉由使用正交tRNA合成酶/tRNA對將其遺傳摻入IL-2中。正交tRNA合成酶/tRNA對能夠將非天然胺基酸裝載在tRNA，並且能夠響應於所述密碼子將所述非天然胺基酸摻入多肽鏈中。
在一些情況下，密碼子是密碼子琥珀、赭石、蛋白石或四聯體密碼子。在一些情況下，密碼子對應於將用於攜帶非天然胺基酸的正交tRNA。在一些情況下，密碼子是琥珀。在其他情況下，密碼子是正交密碼子。
在一些情況下，密碼子是四聯體密碼子，其可以由正交核糖體ribo-Q1解碼。在一些情況下，四聯體密碼子如以下中所述：Neumann等人, 「Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome,」 Nature, 464(7287): 441-444 (2010)，將其揭露內容藉由引用併入本文。
在一些情況下，本揭示文本中使用的密碼子是重編碼的密碼子，例如，被可替代密碼子替代的同義密碼子或稀有密碼子。在一些情況下，重新編碼的密碼子如Napolitano等人 ,「Emergent rules for codon choice elucidated by editing rare arginine codons in Escherichia coli,」 PNAS, 113(38): E5588-5597 (2016)中所述，其揭露內容藉由引用併入本文。在一些情況下，重編碼的密碼子如以下中所述：Ostrov等人, 「Design, synthesis, and testing toward a 57-codon genome,」 Science 353(6301): 819-822 (2016)，將其揭露內容藉由引用併入本文。
在一些情況下，利用非天然核酸，導致一種或多種非天然胺基酸摻入IL-2中。示例性非天然核酸包括但不限於尿嘧啶-5-基、次黃嘌呤-9-基（I）、2-胺基腺嘌呤-9-基、5-甲基胞嘧啶（5-me-C）、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基衍生物和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基衍生物和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮基尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶（假尿嘧啶）、4-硫尿嘧啶、8-鹵代、8-胺基、8-巰基、8-硫烷基、8-羥基和其他8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵代（具體地5-溴）、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤以及3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。某些非天然核酸，諸如5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶和N-2取代的嘌呤、N-6取代的嘌呤、O-6取代的嘌呤、2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、增加雙鏈體形成穩定性的那些分子、通用核酸、疏水性核酸、混雜核酸、尺寸擴大的核酸、氟化核酸、5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶以及N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶（5-me-C），5-羥甲基胞嘧啶，黃嘌呤，次黃嘌呤，2-胺基腺嘌呤，腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基衍生物和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基衍生物和其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-鹵代尿嘧啶，5-鹵代胞嘧啶，5-丙炔基（-C≡C-CH 3）尿嘧啶，5-丙炔基胞嘧啶，嘧啶核酸的其他炔基衍生物，6-偶氮基尿嘧啶，6-偶氮基胞嘧啶，6-偶氮基胸腺嘧啶，5-尿嘧啶（假尿嘧啶），4-硫尿嘧啶，8-鹵代、8-胺基、8-巰基、8-硫烷基、8-羥基和其他8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤，5-鹵代（特別是5-溴）、5-三氟甲基、其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鳥嘌呤，7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-胺基-腺嘌呤，8-氮雜鳥嘌呤，8-氮雜腺嘌呤，7-脫氮鳥嘌呤，7-脫氮腺嘌呤，3-脫氮鳥嘌呤，3-脫氮腺嘌呤，三環嘧啶，吩噁嗪胞苷（[5,4-b][l,4]苯並噁嗪-2(3H)-酮），吩噻嗪胞苷（1H-嘧啶並[5,4-b][l,4]苯並噻嗪-2(3H)-酮），G-夾，吩噁嗪胞苷（例如9- (2-胺基乙氧基)-H-嘧啶並[5,4-b][l,4]苯並噁嗪-2(3H)-酮），哢唑胞苷（2H-嘧啶並[4,5-b]吲哚-2-酮），吡啶並吲哚胞苷（H-吡啶並[3’,2’:4,5]吡咯並[2,3-d]嘧啶-2-酮），其中嘌呤或嘧啶鹼基被其他雜環替代的那些，7-脫氮-腺嘌呤，7-脫氮鳥嘌呤，2-胺基吡啶，2-吡啶酮，氮雜胞嘧啶，5-溴胞嘧啶，溴尿嘧啶，5-氯胞嘧啶，氯代胞嘧啶，環胞嘧啶，胞嘧啶阿拉伯糖苷，5-氟胞嘧啶，氟嘧啶，氟尿嘧啶，5,6-二氫胞嘧啶，5-碘胞嘧啶，羥基脲，碘尿嘧啶，5-硝基胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-氟尿嘧啶和5-碘尿嘧啶，2-胺基-腺嘌呤，6-硫代-鳥嘌呤，2-硫代-胸腺嘧啶，4-硫代-胸腺嘧啶，5-丙炔基-尿嘧啶，4-硫代-尿嘧啶，N4-乙基胞嘧啶，7-脫氮鳥嘌呤，7-脫氮-8-氮雜鳥嘌呤，5-羥基胞嘧啶，2'-去氧尿苷，2-胺基-2'-去氧腺苷，以及描述於美國專利號3,687,808；4,845,205；4,910,300；4,948,882；5,093,232；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,681,941；5,750,692；5,763,588；5,830,653和6,005,096；WO 99/62923；Kandimalla等人, (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813；The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, Kroschwitz, J.I.,編輯, John Wiley & Sons, 1990, 858- 859；Englisch等人, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613；和Sanghvi, 第15章, Antisense Research and Applications, Crooke和Lebleu編, CRC Press, 1993, 273-288中的那些。另外的鹼基修飾可以在以下中找到：例如美國專利號3,687,808；Englisch等人, Angewandte Chemie, 國際版, 1991, 30, 613；和Sanghvi, 第15章, Antisense Research and Applications, 第289-302頁, Crooke和Lebleu編, CRC Press, 1993；將其每一個的揭露內容藉由引用併入本文。
包含各種雜環鹼基和各種糖部分（和糖類似物）的非天然核酸是本領域可獲得的，並且在一些情況下，核酸包括除了天然存在的核酸的五種主要鹼基組分以外的一種或幾種雜環鹼基。例如，在一些情況下，雜環鹼基包括尿嘧啶-5-基、胞嘧啶-5-基、腺嘌呤-7-基、腺嘌呤-8-基、鳥嘌呤-7-基、鳥嘌呤-8-基、4-胺基吡咯並[2.3-d]嘧啶-5-基、2-胺基-4-氧代吡咯並[2,3-d]嘧啶5-基、2-胺基-4-氧代吡咯並[2.3-d]嘧啶-3-基，其中嘌呤經由9-位置、嘧啶經由1-位置、吡咯並嘧啶經由7-位置且吡唑並嘧啶經由1-位置附接至核酸的糖部分。
在一些實施例中，核苷酸類似物還在磷酸酯部分被修飾。經修飾的磷酸酯部分包括但不限於在兩個核苷酸之間的連接處被修飾的那些，並且含有例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯（包括3'-亞烷基膦酸酯）和手性膦酸酯、次膦酸酯、胺基磷酸酯（包括3'-胺基胺基磷酸酯和胺基烷基胺基磷酸酯、硫羰胺基磷酸酯）、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯和硼烷磷酸酯。應理解，兩個核苷酸之間的這些磷酸酯或經修飾的磷酸酯連接是藉由3'-5'連接或2'-5'連接實現的，並且所述連接含有反向極性，諸如3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'。還包括各種鹽、混合鹽和游離酸形式。許多美國專利教示如何製備和使用含有經修飾的磷酸酯的核苷酸，並且所述美國專利包括但不限於3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050；其每一個的揭露內容藉由引用併入本文。
在一些實施例中，非天然核酸包括2',3'-二去氧-2',3'-二脫氫-核苷（PCT/US2002/006460）、5'-取代的DNA和RNA衍生物（PCT/US2011/033961；Saha等人, J. Org Chem., 1995, 60, 788-789；Wang等人, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 1999, 9, 885-890；和Mikhailov等人, Nucleosides & Nucleotides, 1991, 10(1-3), 339-343；Leonid等人, 1995, 14(3-5), 901-905；和Eppacher等人, Helvetica Chimica Acta, 2004, 87, 3004-3020；PCT/JP2000/004720；PCT/JP2003/002342；PCT/JP2004/013216；PCT/JP2005/020435；PCT/JP2006/315479；PCT/JP2006/324484；PCT/JP2009/056718；PCT/JP2010/067560）、或製備為具有修飾的鹼基的單磷酸酯的5'-取代的單體（Wang等人, Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids, 2004, 23 (1 & 2), 317-337）；將其每一個的揭露內容藉由引用併入本文。
在一些實施例中，非天然核酸包括在糖環的5'-位置和2'-位置處的修飾（PCT/US94/02993），諸如5’-CH 2-取代的2'-O-保護的核苷（Wu等人, Helvetica Chimica Acta, 2000, 83, 1127-1143和Wu等人, Bioconjugate Chem. 1999, 10, 921-924）。在一些情況下，非天然核酸包括醯胺連接的核苷二聚體,其已經被製備用於摻入寡核苷酸中，其中二聚體中3'連接的核苷（5'至3'）包含2'-OCH 3和5'-(S)-CH 3（Mesmaeker等人, Synlett, 1997, 1287-1290）。非天然核酸可以包括2'-取代的5’-CH 2（或O）修飾的核苷（PCT/US92/01020）。非天然核酸可以包括5'-亞甲基膦酸酯DNA和RNA單體以及二聚體（Bohringer等人, Tet. Lett., 1993, 34, 2723-2726；Collingwood等人, Synlett, 1995, 7, 703-705；和Hutter等人, Helvetica Chimica Acta, 2002, 85, 2777-2806）。非天然核酸可以包括具有2'-取代基的5'-膦酸酯單體（US 2006/0074035）和其他經修飾的5'-膦酸酯單體（WO 1997/35869）。非天然核酸可以包括5'-修飾的亞甲基膦酸酯單體（EP614907和EP629633）。非天然核酸可以包括在5'和/或6'-位包含羥基的5'或6'-膦酸酯核糖核苷的類似物（Chen等人, Phosphorus, Sulfur and Silicon, 2002, 777, 1783-1786；Jung等人, Bioorg. Med. Chem., 2000, 8, 2501-2509；Gallier等人, Eur. J. Org. Chem., 2007, 925-933；和Hampton等人, J. Med. Chem., 1976, 19(8), 1029-1033）。非天然核酸可以包括5'-膦酸酯去氧核糖核苷單體和具有5'-磷酸酯基團的二聚體（Nawrot等人, Oligonucleotides, 2006, 16(1), 68-82）。非天然核酸可以包括具有6'-膦酸酯基團的核苷，其中5'或/和6'-位未被取代或被硫代叔丁基（SC(CH 3) 3）（及其類似物）；亞甲基胺基（CH 2NH 2）（及其類似物）或氰基（CN）（及其類似物）取代（Fairhurst等人, Synlett, 2001, 4, 467-472；Kappler等人, J. Med. Chem., 1986, 29, 1030-1038；Kappler等人, J. Med. Chem., 1982, 25, 1179-1184；Vrudhula等人, J. Med. Chem., 1987, 30, 888-894；Hampton等人, J. Med. Chem., 1976, 19, 1371-1377；Geze等人, J. Am. Chem. Soc, 1983, 105(26), 7638-7640；和Hampton等人, J. Am. Chem. Soc, 1973, 95(13), 4404-4414）。將本段中列出的每個參考文獻的揭露內容藉由引用併入本文。
在一些實施例中，非天然核酸還包括糖部分的修飾。在一些情況下，核酸含有其中糖基團已被修飾的一種或多種核苷。此類糖修飾的核苷可以賦予增強的核酸酶穩定性、增加的結合親和力或一些其他有益的生物學特性。在某些實施例中，核酸包含經化學修飾的呋喃核糖環部分。經化學修飾的呋喃核糖環的例子包括而不限於添加取代基（包括5'和/或2'取代基；兩個環原子橋接形成二環核酸（BNA）；用S、N(R)或C(R 1)(R 2)替代核糖基環氧原子（R = H、C 1-C 12烷基或保護基團）；及其組合。經化學修飾的糖的例子可以發現於WO2008/101157、US2005/0130923和WO2007/134181中，將其每一個的揭露內容藉由引用併入本文。
在一些情況下，經修飾的核酸包含經修飾的糖或糖類似物。因此，除核糖和去氧核糖之外，所述糖部分可以是戊糖、去氧戊糖、己糖、去氧己糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、來蘇糖或糖「類似物」環戊基。所述糖可以呈吡喃糖基或呋喃糖基形式。所述糖部分可以是核糖、去氧核糖、阿拉伯糖或2'-O-烷基核糖的呋喃糖苷，並且所述糖可以以[α]或[β]異頭構型附接至相應的雜環鹼基。糖修飾包括但不限於2'-烷氧基-RNA類似物、2'-胺基-RNA類似物、2'-氟-DNA和2'-烷氧基-或胺基-RNA/DNA嵌合體。例如，糖修飾可以包括2'-O-甲基-尿苷或2'-O-甲基-胞苷。糖修飾包括2'-O-烷基-取代的去氧核糖核苷和2'-O-乙二醇樣核糖核苷。這些糖或糖類似物以及其中此類糖或類似物附接至雜環鹼基（核酸鹼基）的相應「核苷」的製備是已知的。還可以進行糖修飾並且將其與其他修飾組合。
糖部分的修飾包括核糖和去氧核糖的天然修飾以及非天然修飾。糖修飾包括但不限於在2'位置處的以下修飾：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C 1至C 10烷基或C 2至C 10烯基和炔基。2'糖修飾還包括但不限於-O[(CH 2) nO] mCH 3、-O(CH 2) nOCH 3、-O(CH 2) nNH 2、-O(CH 2) nCH 3、-O(CH 2) nONH 2和-O(CH 2) nON[(CH 2)n CH 3)] 2，其中n和m是1至約10。
2'位置處的其他修飾包括但不限於：C 1至C 10低級烷基、經取代的低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、SH、SCH 3、OCN、Cl、Br、CN、CF 3、OCF 3、SOCH 3、SO 2CH 3、ONO 2、NO 2、N 3、NH 2、雜環烷基、雜環烷芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、經取代的甲矽烷基、RNA切割基團、報告基團、嵌入劑、用於改善寡核苷酸藥動學特性的基團或用於改善寡核苷酸的藥效學特性的基團，以及具有類似特性的其他取代基。還可以在所述糖的其他位置（特別是在3'末端核苷酸或2'-5'連接的寡核苷酸中糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置）處進行類似的修飾。經修飾的糖還包括在橋環氧處含有修飾（諸如CH 2和S）的那些糖。核苷酸糖類似物也可以具有糖模擬物，諸如環丁基部分代替戊呋喃糖基糖。許多美國專利教示此類經修飾的糖結構的製備，並且詳述並描述了一系列的鹼基修飾，所述美國專利是例如美國專利號4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121、5,596,091；5,614,617；5,681,941；和5,700,920，將其每一個的揭露內容藉由引用併入本文。
具有經修飾的糖部分的核酸的例子包括而不限於包含5'-乙烯基、5'-甲基（R或S）、4'-S、2'-F、2’-OCH 3和2’-O(CH 2) 2OCH 3取代基的核酸。2'位置處的取代基還可以選自烯丙基、胺基、疊氮基、硫基、O-烯丙基、O-(C 1-C 1O烷基)、OCF 3、O(CH 2) 2SCH 3、O(CH 2) 2-O-N(R m)(R n)和O-CH 2-C(=O)-N(R m)(R n)，其中R m和R n各自獨立地是H或者取代或未取代的C 1-C 10烷基。
在某些實施例中，本文所述的核酸包括一種或多種二環核酸。在某些此類實施例中，雙環核酸包含4'與2'核糖基環原子之間的橋。在某些實施例中，本文提供的核酸包括一種或多種雙環核酸，其中所述橋包含4'至2'雙環核酸。此類4'至2'二環核酸的例子包括但不限於以下式中的一種：4'-(CH 2)-O-2'（LNA）；4'-(CH 2)-S-2'；4'-(CH 2) 2-O-2'（ENA）；4'-CH(CH 3)-O-2'和4'-CH(CH 2OCH 3)-O-2'及其類似物（參見美國專利號7,399,845）；4'-C(CH 3)(CH 3)-O-2'及其類似物（參見WO2009/006478、WO2008/150729、US2004/0171570、美國專利號7,427,672；Chattopadhyaya等人, J. Org. Chem., 209, 74, 118-134；和WO2008/154401）。還參見例如：Singh等人, Chem. Commun., 1998, 4, 455-456；Koshkin等人, Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630；Wahlestedt等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638；Kumar等人, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222；Singh等人, J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039；Srivastava等人, J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379；Elayadi等人, Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561；Braasch等人, Chem. Biol, 2001, 8, 1-7；Oram等人, Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243；美國專利號4,849,513；5,015,733；5,118,800；5,118,802；7,053,207；6,268,490；6,770,748；6,794,499；7,034,133；6,525,191；6,670,461；和7,399,845；國際公開號WO2004/106356、WO1994/14226、WO2005/021570、WO2007/090071和WO2007/134181；美國專利公開號US2004/0171570、US2007/0287831和US2008/0039618；美國臨時申請號60/989,574、61/026,995、61/026,998、61/056,564、61/086,231、61/097,787和61/099,844；和國際申請號PCT/US2008/064591、PCT US2008/066154、PCT US2008/068922和PCT/DK98/00393。將本段中列出的每個參考文獻的揭露內容藉由引用併入本文。
在某些實施例中，核酸包含連接的核酸。核酸可以使用任何核酸間連接而連接在一起。核酸間連接基團的兩個主要類別是藉由磷原子的存在或不存在來定義的。代表性的含磷的核酸間連接包括但不限於磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、胺基磷酸酯和硫代磷酸酯（P=S）。代表性的不含磷的核酸間連接基團包括但不限於亞甲基甲基亞胺基（-CH 2-N(CH 3)-O-CH 2-）、硫代二酯（-O-C(O)-S-）、硫代胺基甲酸酯（-O-C(O)(NH)-S-）；矽氧烷（-O-Si(H) 2-O-）；和N,N*-二甲基肼（-CH 2-N(CH 3)-N(CH 3)）。在某些實施例中，可以將具有手性原子的核酸間連接製備為外消旋混合物，製備為單獨的對映體，例如，烷基膦酸酯和硫代磷酸酯。非天然核酸可以含有單個修飾。非天然核酸可以在所述部分之一內或不同部分之間含有多個修飾。
對核酸的骨架磷酸酯修飾包括但不限於甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、胺基磷酸酯（橋連或非橋連）、磷酸三酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯，並且可以以任何組合使用。還可以使用其他非磷酸酯連接。
在一些實施例中，骨架修飾（例如，甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、胺基磷酸酯和二硫代磷酸酯核苷酸間連接）可以賦予經修飾的核酸免疫調節活性和/或增強其體內穩定性。
在一些情況下，磷衍生物（或經修飾的磷酸酯基團）附接至糖或糖類似物部分，並且可以是單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、胺基磷酸酯等。含有經修飾的磷酸酯鍵或非磷酸酯鍵的示例性多核苷酸可以見於Peyrottes等人, 1996, Nucleic Acids Res.24: 1841-1848；Chaturvedi等人, 1996, Nucleic Acids Res.24:2318-2323；Schultz等人, (1996) Nucleic Acids Res.24:2966-2973；Matteucci, 1997, 「Oligonucleotide Analogs: an Overview」 in Oligonucleotides as Therapeutic Agents, (Chadwick和Cardew編輯) John Wiley and Sons, 紐約州紐約；Zon, 1993, 「Oligonucleoside Phosphorothioates」 in Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties, Humana Press, 第165-190頁；Miller等人, 1971, JACS 93:6657-6665; Jager等人, 1988, Biochem.27:7247-7246；Nelson等人, 1997, JOC 62:7278-7287；美國專利號5,453,496；和Micklefield, 2001, Curr. Med. Chem. 8: 1157-1179；將其每一個的揭露內容藉由引用併入本文。
在一些情況下，骨架修飾包括用可替代部分諸如陰離子基團、中性基團或陽離子基團替代磷酸二酯連接。此類修飾的例子包括：陰離子核苷間連接；N3'至P5'胺基磷酸酯修飾；硼烷磷酸酯DNA；原寡核苷酸；中性核苷間連接，如甲基膦酸酯；醯胺連接的DNA；亞甲基(甲基亞胺基)連接；甲縮醛（formacetal）和硫代甲縮醛連接；含有磺醯基的骨架；N-吗啉基寡聚物；肽核酸（PNA）；以及帶正電荷的去氧核糖核酸胍（DNG）寡聚物（Micklefield, 2001, Current Medicinal Chemistry 8: 1157-1179，將其揭露內容藉由引用併入本文）。經修飾的核酸可以包含嵌合或混合的骨架，所述嵌合的或混合的骨架包含一種或多種修飾（例如，磷酸酯連接的組合，諸如磷酸二酯和硫代磷酸酯連接的組合）。
磷酸酯的取代基包括，例如，短鏈烷基或環烷基核苷間連接、混合的雜原子和烷基或環烷基核苷間連接，或一個或多個短鏈雜原子或雜環核苷間連接。這些包括具有以下的那些：N-吗啉基連接（部分地由核苷的糖部分形成）；矽氧烷骨架；硫化物、亞碸和碸骨架；甲醯乙醯基和硫代甲醯乙醯基骨架；亞甲基甲醯乙醯基和硫代甲醯乙醯基骨架；含烯烴的骨架；胺基磺酸酯骨架；亞甲基亞胺基和亞甲基肼基骨架；磺酸酯和磺醯胺骨架；醯胺骨架；以及具有混合N、O、S和CH 2組成部分的其他骨架。多個美國專利揭露了如何製備和使用這些類型的磷酸酯替代，並且包括但不限於美國專利號5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439。還應理解，在核苷酸取代物中，核苷酸的糖和磷酸部分二者都可以被替代，例如被醯胺型連接（胺乙基甘胺酸）（PNA）替代。美國專利號5,539,082；5,714,331；和5,719,262傳授了如何製備和使用PNA分子，將其每一個藉由引用併入本文。還參見Nielsen等人, Science, 1991, 254, 1497-1500。還可能將其他類型的分子（接合物）連接至核苷酸或核苷酸類似物，以增強例如細胞攝取。接合物可以與所述核苷酸或核苷酸類似物化學連接。此類接合物包括但不限於脂質部分，諸如膽固醇部分（Letsinger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556）；膽酸（Manoharan等人, Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060）；硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇（Manoharan等人, Ann. KY. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309；Manoharan等人, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770）；硫代膽固醇（Oberhauser等人, Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538）；脂族鏈，例如十二烷二醇或十一烷基殘基（Saison-Behmoaras等人, EM5OJ, 1991, 10, 1111-1118；Kabanov等人, FEBS Lett., 1990, 259, 327-330；Svinarchuk等人, Biochimie, 1993, 75, 49-54）；磷脂，例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基銨l-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-S-H-膦酸鹽（Manoharan等人, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654；Shea等人, Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783）；多胺或聚乙二醇鏈（Manoharan等人, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973）；或金剛烷乙酸（Manoharan等人, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654）；棕櫚基部分（Mishra等人, Biochem. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237）；或十八胺或己胺基-羰基-氧膽固醇部分（Crooke等人, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937）。多個美國專利傳授此類接合物的製備，並且包括但不限於美國專利號4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717、5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241、5,391,723；5,416,203、5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941。將本段中列出的每個參考文獻的揭露內容藉由引用併入本文。
在一些情況下，非天然核酸進一步形成非天然鹼基對。能夠在體內條件下形成非天然DNA或RNA鹼基對（UBP）的示例性非天然核苷酸包括但不限於TAT1、dTAT1、5FM、d5FM、TPT3、dTPT3、5SICS、d5SICS、NaM、dNaM、CNMO、dCNMO及其組合。在一些實施例中，非天然核苷酸包括：
Figure 02_image084
示例性非天然鹼基對包括：(d)TPT3-(d)NaM；(d)5SICS-(d)NaM；(d)CNMO-(d)TAT1；(d)NaM-(d)TAT1；(d)CNMO-(d)TPT3；和(d)5FM-(d)TAT1。
能夠形成可用於製備本文揭示的IL-2接合物的非天然UBP的非天然核苷酸的其他例子可以在以下中找到：Dien等人, J Am Chem Soc., 2018, 140:16115–16123；Feldman等人, J Am Chem Soc, 2017, 139:11427–11433；Ledbetter等人, J Am Chem Soc., 2018, 140:758-765；Dhami等人, Nucleic Acids Res. 2014, 42:10235-10244；Malyshev等人, Nature, 2014, 509:385-388；Betz等人, J Am Chem Soc., 2013, 135:18637-18643；Lavergne等人, J Am Chem Soc. 2013, 135:5408-5419；和Malyshev等人 Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109:12005-12010，將其每一個的揭露內容藉由引用併入本文。在一些實施例中，非天然核苷酸包括：
Figure 02_image086
Figure 02_image088
。
在一些實施例中，可以用於製備本文揭示的IL-2接合物的非天然核苷酸可以衍生自下式的化合物：
Figure 02_image090
其中R 2選自氫、烷基、烯基、炔基、甲氧基、甲硫醇、甲烷硒基、鹵素、氰基和疊氮基；並且 波浪線指示與核糖基或2'-去氧核糖基的鍵，其中核糖基或2'-去氧核糖基部分的5'-羥基為游離形式，連接至單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、α-硫代三磷酸酯、β-硫代三磷酸酯或γ-硫代三磷酸酯基團，或包含在RNA或DNA中或者RNA類似物或DNA類似物中。
在一些實施例中，可以用於製備本文揭示的IL-2接合物的非天然核苷酸可以衍生自下式的化合物：
Figure 02_image092
其中： 每個X獨立地是碳或氮； 當X是氮時R 2不存在，而當X是碳時，R 2是存在的且獨立地是氫、烷基、烯基、炔基、甲氧基、甲硫醇、甲烷硒基、鹵素、氰基或疊氮化物； Y是硫、氧、硒或二級胺； E是氧、硫或硒；並且 波浪線指示與核糖基、去氧核糖基或二去氧核糖基部分或其類似物的鍵合點，其中所述核糖基、去氧核糖基或二去氧核糖基部分或其類似物是游離形式，連接至單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、α-硫代三磷酸酯、β-硫代三磷酸酯或γ-硫代三磷酸酯基團，或包含在RNA或DNA中或者RNA類似物或DNA類似物中。
在一些實施例中，每個X是碳。在一些實施例中，至少一個X是碳。在一些實施例中，一個X是碳。在一些實施例中，至少兩個X是碳。在一些實施例中，兩個X是碳。在一些實施例中，至少一個X是氮。在一些實施例中，一個X是氮。在一些實施例中，至少兩個X是氮。在一些實施例中，兩個X是氮。
在一些實施例中，Y是硫。在一些實施例中，Y是氧。在一些實施例中，Y是硒。在一些實施例中，Y是二級胺。
在一些實施例中，E是硫。在一些實施例中，E是氧。在一些實施例中，E是硒。
在一些實施例中，當X是碳時R 2是存在的。在一些實施例中，當X是氮時R 2不存在。在一些實施例中，每個R 2在存在的情況下是氫。在一些實施例中，R 2是烷基，諸如甲基、乙基或丙基。在一些實施例中，R 2是烯基，諸如-CH 2=CH 2。在一些實施例中，R 2是炔基，諸如乙炔基。在一些實施例中，R 2是甲氧基。在一些實施例中，R 2是甲硫醇。在一些實施例中，R 2是甲烷硒基。在一些實施例中，R 2是鹵素，諸如氯、溴或氟。在一些實施例中，R 2是氰基。在一些實施例中，R 2是疊氮化物。
在一些實施例中，E是硫，Y是硫，並且每個X獨立地是碳或氮。在一些實施例中，E是硫，Y是硫，並且每個X是碳。
在一些實施例中，可以用於製備本文揭示的IL-2接合物的非天然核苷酸可衍生自
Figure 02_image094
、
Figure 02_image096
、
Figure 02_image098
、
Figure 02_image100
、
Figure 02_image102
、
Figure 02_image104
、
Figure 02_image106
、
Figure 02_image108
、
Figure 02_image110
、
Figure 02_image112
、
Figure 02_image114
和
Figure 02_image116
。在一些實施例中，可以用於製備本文揭示的IL-2接合物的非天然核苷酸包括
Figure 02_image118
、
Figure 02_image120
、
Figure 02_image122
、
Figure 02_image124
、
Figure 02_image126
、
Figure 02_image128
、
Figure 02_image130
、
Figure 02_image132
、
Figure 02_image134
、
Figure 02_image136
、
Figure 02_image138
和
Figure 02_image140
或其鹽。
在一些實施例中，非天然鹼基對生成非天然胺基酸，如以下中所述：Dumas等人 ,「Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology,」 Chemical Science, 6: 50-69 (2015)，將其揭露內容藉由引用併入本文。
在一些實施例中，藉由包含非天然核酸的合成密碼子將非天然胺基酸摻入細胞激素（例如，IL多肽）中。在一些情況下，藉由正交的經修飾的合成酶/tRNA對將非天然胺基酸摻入細胞激素中。此類正交對包含天然合成酶，所述天然合成酶能夠用非天然胺基酸裝載非天然tRNA，同時將以下最小化：a) 將其他內源胺基酸裝載至非天然tRNA上，以及b) 將非天然胺基酸裝載至其他內源tRNA上。此類正交對包含能夠藉由非天然合成酶進行裝載，同時避免藉由內源合成酶裝載a) 其他內源胺基酸的tRNA。在一些實施例中，從各種生物體（諸如細菌、酵母、古細菌或人來源）鑒定出此類對。在一些實施例中，正交合成酶/tRNA對包含來自單一生物體的組分。在一些實施例中，正交合成酶/tRNA對包含來自兩種不同的生物體的組分。在一些實施例中，正交合成酶/tRNA對包含在修飾之前促進兩種不同胺基酸的轉譯的組分。在一些實施例中，正交合成酶是經修飾的丙胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是經修飾的精胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是經修飾的天門冬醯胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是經修飾的天門冬胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是經修飾的半胱胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是經修飾的麩醯胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是經修飾的麩胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是經修飾的丙胺酸甘胺酸。在一些實施例中，正交合成酶是經修飾的組胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是經修飾的白胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是經修飾的異白胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是經修飾的離胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是經修飾的甲硫胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是經修飾的苯丙胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是經修飾的脯胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是經修飾的絲胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是經修飾的蘇胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是經修飾的色胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是經修飾的酪胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是經修飾的擷胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是經修飾的磷酸絲胺酸合成酶。在一些實施例中，正交tRNA是經修飾的丙胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是經修飾的精胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是經修飾的天門冬醯胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是經修飾的天門冬胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是經修飾的半胱胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是經修飾的麩醯胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是經修飾的麩胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是經修飾的丙胺酸甘胺酸。在一些實施例中，正交tRNA是經修飾的組胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是經修飾的白胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是經修飾的異白胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是經修飾的離胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是經修飾的甲硫胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是經修飾的苯丙胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是經修飾的脯胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是經修飾的絲胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是經修飾的蘇胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是經修飾的色胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是經修飾的酪胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是經修飾的擷胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是經修飾的磷酸絲胺酸tRNA。
在一些實施例中，藉由胺醯基（aaRS或RS）-tRNA合成酶-tRNA對將非天然胺基酸摻入細胞激素（例如，IL多肽）中。示例性aaRS-tRNA對包括但不限於詹氏甲烷球菌（ Methanococcus jannaschii）（ Mj-Tyr）aaRS/tRNA對、大腸桿菌TyrRS（ Ec-Tyr）/嗜熱脂肪芽孢桿菌（ B. stearothermophilus）tRNA CUA對、大腸桿菌LeuRS（ Ec-Leu）/嗜熱脂肪芽孢桿菌tRNA CUA對和吡咯離胺醯-tRNA對。在一些情況下，藉由 Mj-TyrRS/tRNA對將非天然胺基酸摻入細胞激素（例如，IL多肽）中。可以藉由 Mj-TyrRS/tRNA對摻入的示例性UAA包括但不限於對位取代的苯丙胺酸衍生物，諸如對-胺基苯丙胺酸和對-甲氧基苯丙胺酸；間位取代的酪胺酸衍生物，諸如3-胺基酪胺酸、3-硝基酪胺酸、3,4-二羥基苯丙胺酸和3-碘酪胺酸；苯基硒代半胱胺酸；對-硼苯丙胺酸；以及鄰-硝基苄基酪胺酸。
在一些情況下，藉由 Ec-Tyr/tRNA CUA或 Ec-Leu/tRNA CUA對將非天然胺基酸摻入細胞激素（例如，IL多肽）中。可以藉由 Ec-Tyr/tRNA CUA或 Ec-Leu/tRNA CUA對摻入的示例性UAA包括但不限於含有二苯甲酮、酮、碘化物或疊氮化物取代基的苯丙胺酸衍生物； O-炔丙基酪胺酸；α-胺基辛酸、O-甲基酪胺酸、O-硝基苄基半胱胺酸；和3-(萘-2-基胺基)-2-胺基-丙酸。
在一些情況下，藉由吡咯離胺醯基-tRNA對將非天然胺基酸摻入細胞激素（例如，IL多肽）中。在一些情況下，PylRS獲自古細菌，例如獲自產甲烷的古細菌。在一些情況下，PylRS獲自巴氏甲烷八疊球菌（ Methanosarcina barkeri）、馬氏甲烷八疊球菌（ Methanosarcina mazei）或乙酸甲烷八疊球菌（ Methanosarcina acetivorans）。可以藉由吡咯離胺醯-tRNA對摻入的示例性UAA包括但不限於醯胺和胺基甲酸酯取代的離胺酸，諸如2-胺基-6-((R)-四氫呋喃-2-甲醯胺基)己酸、 N-ε- D-脯胺醯基- L-離胺酸和 N-ε-環戊基氧基羰基- L-離胺酸； N-ε-丙烯醯基- L-離胺酸； N-ε-[(1-(6-硝基苯並[d][1,3]二氧雜環戊烯-5-基)乙氧基)羰基]- L-離胺酸；和 N-ε-(1-甲基環丙-2-烯甲醯胺基)離胺酸。在一些實施例中，本文揭示的IL-2接合物可以藉由使用馬氏甲烷八疊球菌（ M. mazei）tRNA來製備，所述tRNA藉由巴氏甲烷八疊球菌（ M. barkeri）吡咯離胺醯-tRNA合成酶（ MbPylRS）選擇性裝載非天然胺基酸，諸如 N6-((2-疊氮基乙氧基)-羰基)-L-離胺酸（AzK）。其他方法是一般熟習此項技術者已知的，諸如Zhang等人, Nature 2017, 551(7682): 644-647中揭露的那些，將其揭露內容藉由引用併入本文。
在一些情況下，藉由US 9,988,619和US 9,938,516中揭露的合成酶將非天然胺基酸摻入本文所述的細胞激素（例如，IL多肽）中，將其每一個的揭露內容藉由引用併入本文。
在合適的培養基中培養或維持引入了本文揭示的構築體或載體的宿主細胞，使得產生tRNA、tRNA合成酶和目的蛋白質。培養基還包含一種或多種非天然胺基酸，使得目的蛋白質摻入所述一種或多種非天然胺基酸。在一些實施例中，來自細菌、植物或藻類的三磷酸核苷轉運蛋白（NTT）也存在於宿主細胞中。在一些實施例中，本文揭示的IL-2接合物是藉由使用表現NTT的宿主細胞來製備。在一些實施例中，用於宿主細胞中的核苷酸三磷酸核苷轉運蛋白可以選自TpNTT1、TpNTT2、TpNTT3、TpNTT4、TpNTT5、TpNTT6、TpNTT7、TpNTT8（假微型海鏈藻（T. pseudonana））、PtNTT1、PtNTT2、PtNTT3、PtNTT4、PtNTT5、PtNTT6（三角褐指藻（P. tricornutum））、GsNTT（嗜硫原始紅藻（Galdieria sulphuraria））、AtNTT1、AtNTT2（擬南芥（Arabidopsis thaliana））、CtNTT1、CtNTT2（沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis））、PamNTT1、PamNTT2（嗜阿米巴原衣原體（Protochlamydia amoebophila））、CcNTT（石竹殺手桿菌（Caedibacter caryophilus））、RpNTT1（普氏立克次體（Rickettsia prowazekii））。在一些實施例中，NTT選自PtNTT1、PtNTT2、PtNTT3、PtNTT4、PtNTT5和PtNTT6。在一些實施例中，所述NTT是PtNTT1。在一些實施例中，所述NTT是PtNTT2。在一些實施例中，所述NTT是PtNTT3。在一些實施例中，所述NTT是PtNTT4。在一些實施例中，所述NTT是PtNTT5。在一些實施例中，所述NTT是PtNTT6。可以使用的其他NTT揭示於Zhang等人, Nature2017, 551(7682): 644-647；Malyshev等人 Nature2014 (509(7500), 385-388；和Zhang等人Proc Natl Acad Sci USA, 2017, 114:1317-1322，將其每一個的揭露內容藉由引用併入本文。
正交tRNA合成酶/tRNA對用非天然胺基酸裝載tRNA，並且回應於所述密碼子將所述非天然胺基酸摻入多肽鏈中。示例性aaRS-tRNA對包括但不限於詹氏甲烷球菌（ Methanococcus jannaschii）（ Mj-Tyr）aaRS/tRNA對、大腸桿菌TyrRS（ Ec-Tyr）/嗜熱脂肪芽孢桿菌（ B. stearothermophilus）tRNA CUA對、大腸桿菌LeuRS（ Ec-Leu）/嗜熱脂肪芽孢桿菌tRNA CUA對和吡咯離胺醯-tRNA對。可以根據本揭示文本使用的其他aaRS-tRNA對包括衍生自馬氏甲烷八疊球菌的那些，描述於以下中的那些：Feldman等人, J Am Chem Soc., 2018 140:1447-1454；和Zhang等人 Proc Natl Acad Sci USA, 2017, 114:1317-1322；將其每一個的揭露內容藉由引用併入本文。
在一些實施例中提供在表現NTT和tRNA合成酶的細胞系統中製備本文揭示的IL-2接合物的方法。在本文所述的一些實施例中，NTT選自PtNTT1、PtNTT2、PtNTT3、PtNTT4、PtNTT5和PtNTT6，並且tRNA合成酶選自詹氏甲烷球菌、大腸桿菌TyrRS（ Ec-Tyr）/嗜熱脂肪芽孢桿菌和馬氏甲烷八疊球菌。在一些實施例中，NTT是PtNTT1，並且tRNA合成酶源自詹氏甲烷球菌、大腸桿菌TyrRS（ Ec-Tyr）/嗜熱脂肪芽孢桿菌或馬氏甲烷八疊球菌。在一些實施例中，NTT是PtNTT2並且tRNA合成酶衍生自詹氏甲烷球菌、大腸桿菌TyrRS（Ec-Tyr）/嗜熱脂肪芽孢桿菌、或馬氏甲烷八疊球菌。在一些實施例中，NTT是PtNTT3並且tRNA合成酶衍生自詹氏甲烷球菌、大腸桿菌TyrRS（Ec-Tyr）/嗜熱脂肪芽孢桿菌、或馬氏甲烷八疊球菌。在一些實施例中，NTT是PtNTT3並且tRNA合成酶衍生自詹氏甲烷球菌、大腸桿菌TyrRS（Ec-Tyr）/嗜熱脂肪芽孢桿菌、或馬氏甲烷八疊球菌。在一些實施例中，NTT是PtNTT4並且tRNA合成酶衍生自詹氏甲烷球菌、大腸桿菌TyrRS（Ec-Tyr）/嗜熱脂肪芽孢桿菌、或馬氏甲烷八疊球菌。在一些實施例中，NTT是PtNTT5並且tRNA合成酶衍生自詹氏甲烷球菌、大腸桿菌TyrRS（Ec-Tyr）/嗜熱脂肪芽孢桿菌、或馬氏甲烷八疊球菌。在一些實施例中，NTT是PtNTT6並且tRNA合成酶衍生自詹氏甲烷球菌、大腸桿菌TyrRS（Ec-Tyr）/嗜熱脂肪芽孢桿菌、或馬氏甲烷八疊球菌。
在一些實施例中，本文揭示的IL-2接合物可以在細胞（諸如大腸桿菌）中製備，其包含 (a) 核苷酸三磷酸轉運蛋白 PtNTT2（包括截短的變異體，其中全長蛋白質的前65個胺基酸殘基缺失），(b) 包含雙鏈寡核苷酸的質體，所述雙鏈寡核苷酸編碼具有所需胺基酸序列的IL-2變異體並且含有包含第一非天然核苷酸和第二非天然核苷酸的非天然鹼基對，以在所需位置提供密碼子，將在所述位置摻入非天然胺基酸，諸如 N6-((2-疊氮基乙氧基)-羰基)-L-離胺酸（AzK），(c) 編碼衍生自馬氏甲烷八疊球菌的tRNA的質體，並且其包含非天然核苷酸以提供公認的反密碼子（針對IL-2變異體的密碼子）來代替其天然序列，以及 (d) 編碼巴氏甲烷八疊球菌來源的吡咯離胺醯-tRNA合成酶（ MbPylRS）的質體，其可以是編碼所述tRNA的相同質體或不同質體。在一些實施例中，所述細胞進一步補充有包含一個或多個非天然鹼基的去氧核糖三磷酸酯。在一些實施例中，細胞進一步補充有包含一種或多種非天然鹼基的核糖三磷酸酯。在一些實施例中，細胞進一步補充有一種或多種非天然胺基酸，諸如 N6-((2-疊氮基乙氧基)-羰基)-L-離胺酸（AzK）。在一些實施例中，編碼所希望的IL-2變異體的胺基酸序列的雙鏈寡核苷酸在編碼具有SEQ ID NO: 1的蛋白質的序列的位置64處含有密碼子AXC，其中X是非天然核苷酸。在一些實施例中，細胞還包含質體，所述質體可以是蛋白質表現質體或另一種質體，其編碼來自馬氏甲烷八疊球菌的正交tRNA基因，所述正交tRNA基因包含AXC匹配的反密碼子GYT代替其天然序列，其中Y是互補的並且可以與所述密碼子中的非天然核苷酸相同或不同的非天然核苷酸。在一些實施例中，密碼子中的非天然核苷酸與反密碼子中的非天然核苷酸不同且互補。在一些實施例中，密碼子中的非天然核苷酸與反密碼子中的非天然核苷酸相同。在一些實施例中，在雙鏈寡核苷酸中包含非天然鹼基對的第一和第二非天然核苷酸可以衍生自
Figure 02_image096
、
Figure 02_image100
、
Figure 02_image143
、
Figure 02_image145
、
Figure 02_image147
和
Figure 02_image116
。在一些實施例中，在雙鏈寡核苷酸中的構成非天然鹼基對的第一和第二非天然核苷酸可以衍生自
Figure 02_image096
和
Figure 02_image116
。在一些實施例中，第一和第二非天然核苷酸的三磷酸酯包括
Figure 02_image120
、
Figure 02_image122
和
Figure 02_image140
、或其鹽。在一些實施例中，第一和第二非天然核苷酸的三磷酸酯包括
Figure 02_image120
、和
Figure 02_image140
、或其鹽。在一些實施例中，包含第一非天然核苷酸和第二非天然核苷酸的mRNA衍生的雙鏈寡核苷酸可以包含含有衍生自
Figure 02_image094
、
Figure 02_image098
、和
Figure 02_image114
的非天然核苷酸的密碼子。在一些實施例中，馬氏甲烷八疊球菌tRNA可以包含含有非天然核苷酸的反密碼子，其識別包含所述mRNA的非天然核苷酸的密碼子。馬氏甲烷八疊球菌tRNA中的反密碼子可以包含衍生自
Figure 02_image094
、
Figure 02_image098
、
Figure 02_image158
、
Figure 02_image160
、
Figure 02_image162
和
Figure 02_image114
的非天然核苷酸。在一些實施例中，mRNA包含衍生自
Figure 02_image094
的非天然核苷酸。在一些實施例中，mRNA包含衍生自
Figure 02_image098
的非天然核苷酸。在一些實施例中，mRNA包含衍生自
Figure 02_image165
的非天然核苷酸。在一些實施例中，mRNA包含衍生自
Figure 02_image167
的非天然核苷酸。在一些實施例中，mRNA包含衍生自
Figure 02_image169
的非天然核苷酸。在一些實施例中，mRNA包含衍生自
Figure 02_image114
的非天然核苷酸。在一些實施例中，tRNA包含衍生自
Figure 02_image094
的非天然核苷酸。在一些實施例中，tRNA包含衍生自
Figure 02_image098
的非天然核苷酸。在一些實施例中，tRNA包含衍生自
Figure 02_image172
的非天然核苷酸。在一些實施例中，tRNA包含衍生自
Figure 02_image174
的非天然核苷酸。在一些實施例中，tRNA包含衍生自
Figure 02_image176
的非天然核苷酸。在一些實施例中，tRNA包含衍生自
Figure 02_image114
的非天然核苷酸。在一些實施例中，mRNA包含衍生自
Figure 02_image094
的非天然核苷酸並且tRNA包含衍生自
Figure 02_image114
的非天然核苷酸。在一些實施例中，mRNA包含衍生自
Figure 02_image114
的非天然核苷酸並且tRNA包含衍生自
Figure 02_image094
的非天然核苷酸。在一些實施例中，mRNA包含衍生自
Figure 02_image094
的非天然核苷酸並且tRNA包含衍生自
Figure 02_image181
的非天然核苷酸。在一些實施例中，mRNA包含衍生自
Figure 02_image183
的非天然核苷酸並且tRNA包含衍生自
Figure 02_image094
的非天然核苷酸。將宿主細胞在含有適當營養素的培養基中培養，並且補充以下物質：(a) 包含一種或多種非天然鹼基的去氧核糖核苷三磷酸酯，所述非天然鹼基是編碼具有密碼子的細胞激素基因的一種或多種質體的複製所需的，(b) 包含一種或多種非天然鹼基的核糖核苷三磷酸酯，所述非天然鹼基是以下的轉錄所需的：(i) 對應於細胞激素的編碼序列並且含有包含一種或多種非天然鹼基的密碼子的mRNA，和 (ii) 含有包含一種或多種非天然鹼基的反密碼子的tRNA，以及 (c) 要摻入目的細胞激素的多肽序列中的一種或多種非天然胺基酸。然後將宿主細胞維持在允許目的蛋白質表現的條件下。
所表現的所得含AzK蛋白質可以藉由一般熟習此項技術者已知的方法來純化，然後可以允許其與炔烴（諸如包含如本文所揭示的具有所需平均分子量的PEG鏈的DBCO）在一般熟習此項技術者已知的條件下反應，以提供本文揭示的IL-2接合物。其他方法是一般熟習此項技術者已知的，諸如以下中揭示的那些：Zhang等人, Nature 2017, 551(7682): 644-647；WO 2015157555；WO 2015021432；WO 2016115168；WO 2017106767；WO 2017223528；WO 2019014262；WO 2019014267；WO 2019028419；和WO2019/028425，將其每一個的揭露內容藉由引用併入本文。
所表現的包含一種或多種非天然胺基酸（例如Azk）的所得蛋白質可以藉由一般熟習此項技術者已知的方法來純化，然後可以允許其與炔烴（諸如包含如本文所揭示的具有所需平均分子量的PEG鏈的DBCO）在一般熟習此項技術者已知的條件下反應，以提供本文揭示的IL-2接合物。其他方法是一般熟習此項技術者已知的，諸如以下中揭示的那些：Zhang等人, Nature 2017, 551(7682): 644-647；WO 2015157555；WO 2015021432；WO 2016115168；WO 2017106767；WO 2017223528；WO 2019014262；WO 2019014267；WO 2019028419；和WO2019/028425，將其每一個的揭露內容藉由引用併入本文。
或者，藉由將本文所述的包含tRNA和胺醯tRNA合成酶並包含具有一個或多個框內正交（終止）密碼子的目的核酸序列的核酸構築體引入宿主細胞中，來製備包含一種或多種非天然胺基酸的IL-2多肽。將宿主細胞在含有適當的營養素的培養基中培養，補充有 (a) 包含一個或多個非天然鹼基的去氧核糖核苷的三磷酸酯，所述一個或多個非天然鹼基對於一種或多種質體的複製是必需的，所述一種或多種質體編碼包含新密碼子和反密碼子的細胞激素基因；(b) 核糖核苷的三磷酸酯，其對於對應於以下的mRNA的轉錄是必需的：(i) 含有密碼子的細胞激素序列，和 (ii) 含有反密碼子的正交tRNA；以及 (c) 一種或多種非天然胺基酸。然後將宿主細胞維持在允許目的蛋白質表現的條件下。響應於非天然密碼子，將一個或多個非天然胺基酸摻入多肽鏈中。例如，將一種或多種非天然胺基酸摻入IL-2多肽中。可替代地，可以在蛋白質的兩個或更多個位點處將兩個或更多個非天然胺基酸摻入IL-2多肽中。
一旦在宿主細胞中產生了摻入非天然胺基酸的IL-2多肽，就可以藉由本領域已知的多種技術（包括酶促、化學和/或滲透裂解和物理破壞）從其提取。IL-2多肽可以藉由本領域中已知的標準技術來純化，所述標準技術例如製備型離子交換層析法、疏水層析法、親和層析法或者一般熟習此項技術者已知的任何其他合適的技術。
合適的宿主細胞可以包括細菌細胞（例如，大腸桿菌，BL21(DE3)），但最合適的宿主細胞是真核細胞，例如昆蟲細胞（例如，果蠅，諸如黑腹果蠅）、酵母細胞、線蟲（例如，秀麗隱杆線蟲（ C. elegans））、小鼠（例如，小家鼠）或哺乳動物細胞（諸如中國倉鼠卵巢細胞（CHO）或COS細胞、人293T細胞、HeLa細胞、NIH 3T3細胞和小鼠紅白血病（MEL）細胞）或人細胞或其他真核細胞。其他合適的宿主細胞是熟習此項技術者已知的。合適地，宿主細胞是哺乳動物細胞，諸如人細胞或昆蟲細胞。在一些實施例中，合適的宿主細胞包括大腸桿菌。
通常可以在本發明的實施例中使用的其他合適的宿主細胞是在實例部分中提到的那些。可以經由常規轉化或轉染技術將載體DNA引入宿主細胞中。如本文所用，術語「轉化」和「轉染」旨在指用於將外來核酸分子（例如，DNA）引入宿主細胞中的多種公認的技術，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉澱、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂質體轉染或電穿孔。用於轉化或轉染宿主細胞的合適方法是本領域熟知的。
當創建細胞株時，通常優選地製備穩定細胞株。例如，對於哺乳動物細胞的穩定轉染，已知根據所使用的表現載體和轉染技術，只有一小部分細胞可以將外來DNA整合到其基因組中。為了鑒定和選擇這些組成部分，通常將編碼可選擇標記物（例如，對抗生素的抗性）的基因與目的基因一起引入宿主細胞中。優選的可選擇標記物包括賦予對藥物（諸如G418、潮黴素或甲胺蝶呤）的抗性的那些可選擇標記物。可以將編碼可選擇標記物的核酸分子在相同載體上引入宿主細胞中，或者可以在單獨的載體上引入。可以藉由藥物選擇來鑒定被引入的核酸分子穩定轉染的細胞（例如，已摻入可選擇標記基因的細胞將存活，而其他細胞死亡）。
在一個實施例中，將本文所述的構築體整合到宿主細胞的基因組中。穩定整合的優點是實現了各個細胞或殖株之間的均勻性。另一個優點是可以進行最佳生產者的選擇。因此，希望創建穩定的細胞株。在另一個實施例中，將本文所述的構築體轉染到宿主細胞中。將構築體轉染到宿主細胞中的優點是可以使蛋白質產量最大化。在一個態樣，描述了包含本文所述的核酸構築體或載體的細胞。 治療方法
在一態樣，本文提供了一種治療有需要的個體的HNSCC的方法，所述方法包括向個體投予：(a) 如本文所述的IL-2接合物和 (b) 西妥昔單抗。
在又一態樣，本文提供了一種治療有需要的個體的HNSCC的方法，所述方法包括向個體投予 (a) 如本文所述的IL-2接合物，和 (b) 西妥昔單抗，其中所述HNSCC是復發性和/或轉移性HNSCC。
在又一態樣，本文提供了一種治療有需要的個體的HNSCC的方法，所述方法包括：選擇患有HNSCC的個體，其中所述個體是至少部分地基於所述個體患有復發性和/或轉移性HNSCC而選擇的；以及向所述個體投予 (a) 如本文所述的IL-2接合物和 (b) 西妥昔單抗。
在又一態樣，本文提供了一種治療有需要的個體的HNSCC的方法，所述方法包括向個體投予 (a) 如本文所述的IL-2接合物，和 (b) 西妥昔單抗，其中所述HNSCC是鉑難治性HNSCC。
在又一態樣，本文提供了一種治療有需要的個體的HNSCC的方法，所述方法包括：選擇患有HNSCC的個體，其中所述個體是至少部分地基於所述個體患有鉑難治性HNSCC而選擇的；以及向所述個體投予 (a) 如本文所述的IL-2接合物和 (b) 西妥昔單抗。
在再又一態樣，本文提供了一種治療有需要的個體的HNSCC的方法，所述方法包括向個體投予：(a) 從8 μg/kg至32 μg/kg的作為如本文所述IL-2接合物的IL-2和 (b) 西妥昔單抗。
本文還提供了如本文所述的IL-2接合物，其用於本文揭示的治療有需要的個體的HNSCC的方法。
在又一態樣，本文提供了如本文所述的IL-2接合物在製造用於本文揭示的治療有需要的個體的HNSCC的方法的藥劑中的用途。
在以下部分中描述的實施例適用於任何前述態樣。 癌症類型
在一些實施例中，所述HNSCC是復發性和/或轉移性（R/M）的。在一些實施例中，所述HNSCC是復發性的。在一些實施例中，所述HNSCC是轉移性的。在一些實施例中，所述HNSCC是復發性和轉移性（R/M）的。在一些實施例中，所述HNSCC是III期的。在一些實施例中，所述HNSCC是IV期的。在一些實施例中，所述HNSCC是鉑難治性HNSCC。在一些實施例中，HNSCC的原發腫瘤位置是口咽、口腔、下咽或喉。 用於組合療法的藥劑
本文揭示的用於治療HNSCC的方法包括投予本文所述IL-2接合物與一種或多種另外的藥劑的組合。在一些實施例中，所述一種或多種另外的藥劑是西妥昔單抗。 投予 1. 途徑
在一些實施例中，藉由靜脈內、皮下、肌內、腦內、鼻內、動脈內、關節內、皮內、玻璃體內、骨內輸注、腹膜內或鞘內投予向個體投予IL-2接合物。在一些實施例中，藉由靜脈內、皮下或肌內投予向個體投予IL-2接合物。在一些實施例中，藉由靜脈內投予向個體投予IL-2接合物。在一些實施例中，藉由皮下投予向個體投予IL-2接合物。在一些實施例中，藉由肌內投予向個體投予IL-2接合物。
在一些實施例中，藉由靜脈內投予來投予西妥昔單抗。在一些實施例中，均藉由靜脈內投予向個體投予IL-2接合物和西妥昔單抗。 2. 時間表
可以將IL-2接合物投予超過一次，例如兩次、三次、四次、五次或更多次。在一些實施例中，治療的持續時間長達24個月，例如1個月、2個月、3個月、6個月、9個月、12個月、15個月、18個月、21個月或24個月。在一些實施例中，治療的持續時間進一步延長多達另外24個月。
可以將西妥昔單抗投予超過一次，例如兩次、三次、四次、五次或更多次。在一些實施例中，治療的持續時間長達24個月，例如1個月、2個月、3個月、6個月、9個月、12個月、15個月、18個月、21個月或24個月。在一些實施例中，治療的持續時間進一步延長多達另外24個月。
在一些實施例中，可以將IL-2接合物和西妥昔單抗投予超過一次，例如兩次、三次、四次、五次或更多次。在這些實施例中的任一個中，治療的持續時間長達24個月，例如1個月、2個月、3個月、6個月、9個月、12個月、15個月、18個月、21個月或24個月。在一些實施例中，治療的持續時間進一步延長多達另外24個月。
在一些實施例中，約每週一次、約每兩週一次、約每三週一次或約每4週一次向有需要的個體投予IL-2接合物。在一些實施例中，每週一次向有需要的個體投予IL-2接合物。在一些實施例中，每兩週一次向有需要的個體投予IL-2接合物。在一些實施例中，每三週一次向有需要的個體投予IL-2接合物。在一些實施例中，每4週一次向有需要的個體投予IL-2接合物。在一些實施例中，約每7、14、15、16、17、18、19、20或21天一次投予IL-2接合物。
在一些實施例中，約每週一次、約每兩週一次、約每三週一次或約每4週一次向有需要的個體投予西妥昔單抗。在一些實施例中，每週一次向有需要的個體投予西妥昔單抗。在一些實施例中，每兩週一次向有需要的個體投予西妥昔單抗。在一些實施例中，每三週一次向有需要的個體投予西妥昔單抗。在一些實施例中，每4週一次向有需要的個體投予西妥昔單抗。在一些實施例中，約每7、14、15、16、17、18、19、20或21天一次投予西妥昔單抗。
在一些實施例中，約每週一次、約每兩週一次、約每三週一次或約每4週一次向有需要的個體投予IL-2接合物和西妥昔單抗。在一些實施例中，每週一次向有需要的個體投予IL-2接合物和西妥昔單抗。在一些實施例中，每兩週一次向有需要的個體投予IL-2接合物和西妥昔單抗。在一些實施例中，每三週一次向有需要的個體投予IL-2接合物和西妥昔單抗。在一些實施例中，每4週一次向有需要的個體投予IL-2接合物和西妥昔單抗。在一些實施例中，約每7、14、15、16、17、18、19、20或21天一次投予IL-2接合物和西妥昔單抗。在一些實施例中，約每3週一次向有需要的個體投予IL-2接合物，並且約每週一次向有需要的個體施西妥昔單抗。
在一些實施例中，與西妥昔單抗的投予分開地將IL-2接合物投予於個體。在一些實施例中，IL-2接合物和西妥昔單抗依序地投予於個體。在一些實施例中，在向個體投予西妥昔單抗之前，將IL-2接合物投予於個體。在一些實施例中，在向個體投予西妥昔單抗之後，將IL-2接合物投予於個體。在一些實施例中，IL-2接合物和西妥昔單抗同時投予於個體。在一些實施例中，IL-2接合物和西妥昔單抗在同一天投予於個體。在一些實施例中，IL-2接合物和西妥昔單抗在不同的日期天投予於個體。
3. 用劑
在一些情況下，所需劑量方便地以單一劑量或作為分開的劑量存在，所述分開的劑量是同時（或在短時間段內）或以適當的間隔（例如每天兩個、三個、四個或更多個子劑量）投予。
在一些實施例中，IL-2接合物以從約8 μg/kg至32 μg/kg的劑量投予。在一些實施例中，IL-2接合物以從約8 μg/kg至24 μg/kg的劑量投予。在一些實施例中，IL-2接合物以約8 μg/kg的劑量投予。在一些實施例中，IL-2接合物以約16 μg/kg的劑量投予。在一些實施例中，IL-2接合物以約24 μg/kg的劑量投予。在一些實施例中，IL-2接合物以約32 μg/kg的劑量投予。在這些實施例中的任一個中，可以每3週以如本文所述的劑量投予IL-2接合物。
在一些實施例中，與西妥昔單抗組合投予從約8 μg/kg至32 μg/kg的劑量的IL-2接合物。在一些實施例中，與西妥昔單抗組合投予從約8 μg/kg至24 μg/kg的劑量的IL-2接合物。在一些實施例中，與西妥昔單抗組合投予約8 μg/kg的劑量的IL-2接合物。在一些實施例中，與西妥昔單抗組合投予約16 μg/kg的劑量的IL-2接合物。在一些實施例中，與西妥昔單抗組合投予約24 μg/kg的劑量的IL-2接合物。在一些實施例中，與西妥昔單抗組合投予約32 μg/kg的劑量的IL-2接合物。在這些實施例中的任一個中，可以每3週以如本文所述的劑量投予IL-2接合物。
在一些實施例中，藉由靜脈內輸注以從約100 mg/m 2至約500mg/m 2的負載劑量投予西妥昔單抗。在本文所述的任何實施例中，西妥昔單抗的負載劑量是mg/m 2個體體表面積。在一些實施例中，藉由靜脈內輸注以約100 mg/m 2的負載劑量投予西妥昔單抗。在一些實施例中，藉由靜脈內輸注以約150 mg/m 2的負載劑量投予西妥昔單抗。在一些實施例中，藉由靜脈內輸注以約200 mg/m 2的負載劑量投予西妥昔單抗。在一些實施例中，藉由靜脈內輸注以約250 mg/m 2的負載劑量投予西妥昔單抗。在一些實施例中，藉由靜脈內輸注以約300 mg/m 2的負載劑量投予西妥昔單抗。在一些實施例中，藉由靜脈內輸注以約350 mg/m 2的負載劑量投予西妥昔單抗。在一些實施例中，藉由靜脈內輸注以約400 mg/m 2的負載劑量投予西妥昔單抗。在一些實施例中，藉由靜脈內輸注以約450 mg/m 2的負載劑量投予西妥昔單抗。在一些實施例中，藉由靜脈內輸注以約500 mg/m 2的負載劑量投予西妥昔單抗。在一些實施例中，西妥昔單抗的初始劑量以約400 mg/m 2的負載劑量藉由靜脈內輸注投予，並且西妥昔單抗的所有後續劑量以約250 mg/m 2的負載劑量藉由靜脈內輸注投予。在這些實施例中的任一個中，經約30-240分鐘輸注西妥昔單抗。在一些實施例中，經約30分鐘輸注西妥昔單抗。在一些實施例中，經約60分鐘輸注西妥昔單抗。在一些實施例中，經約90分鐘輸注西妥昔單抗。在一些實施例中，經約120分鐘輸注西妥昔單抗。在一些實施例中，經約150分鐘輸注西妥昔單抗。在一些實施例中，經約180分鐘輸注西妥昔單抗。在一些實施例中，經約210分鐘輸注西妥昔單抗。在一些實施例中，經約240分鐘輸注西妥昔單抗。在這些實施例中的任一個中，以約1 mg/min至約10 mg/min，諸如1 mg/min、2 mg/min、3 mg/min、4 mg/min、5 mg/min、6 mg/min、7 mg/min、8 mg/min、9 mg/min或10 mg/min的輸注速率投予西妥昔單抗。在一些實施例中，以比後續劑量的西妥昔單抗的劑量更高的負載劑量投予第一劑量的西妥昔單抗。在一些實施例中，第一劑量的西妥昔單抗的輸注時間長於後續劑量的西妥昔單抗的輸注時間。在一些實施例中，每3週以如本文所述的劑量投予西妥昔單抗。在一些實施例中，每2週以如本文所述的劑量投予西妥昔單抗。在一些實施例中，每週以如本文所述的劑量投予西妥昔單抗。 4. 另外的藥劑 / 預前藥劑
在一些實施例中，本文所述的任何方法進一步包括投予抗組胺劑。在一些實施例中，所述抗組胺劑是西替利嗪(cetirizine)。在一些實施例中，所述抗組胺劑是異丙嗪(promethazine)。在一些實施例中，所述抗組胺劑是右旋氯苯吡胺(dexchlorpheniramine)。在一些實施例中，所述抗組胺劑是苯海拉明。在一些實施例中，以從約25至50 mg的劑量靜脈內投予苯海拉明。
在一些實施例中，本文所述的任何方法進一步包括投予鎮痛劑，諸如對乙醯胺基酚。在一些實施例中，以從約650至1000 mg的劑量口服投予對乙醯胺基酚。
在一些實施例中，本文所述的任何方法進一步包括投予5-羥色胺5-HT 3受體拮抗劑。在一些實施例中，5-羥色胺5-HT 3受體拮抗劑是格拉司瓊(granisetron)。在一些實施例中，5-羥色胺5-HT 3受體拮抗劑是朵拉司瓊(dolasetron)。在一些實施例中，5-羥色胺5-HT 3受體拮抗劑是托烷司瓊(tropisetron)。在一些實施例中，5-羥色胺5-HT 3受體拮抗劑是帕洛諾司瓊(palonosetron)。在一些實施例中，5-羥色胺5-HT 3受體拮抗劑是昂丹司瓊(ondansetron)。在一些實施例中，以從約8 mg至0.15 mg/kg的劑量靜脈內投予昂丹司瓊。
在一些實施例中，本文所述的任何方法進一步包括投予抗組胺劑（諸如西替利嗪、異丙嗪、右旋氯苯吡胺或苯海拉明）、鎮痛劑（諸如對乙醯胺基酚）和/或5-羥色胺5-HT 3受體拮抗劑（諸如格拉司瓊、朵拉司瓊、托烷司瓊、帕洛諾司瓊或昂丹司瓊）。在一些實施例中，所述方法進一步包括投予抗組胺劑（諸如西替利嗪、異丙嗪、右旋氯苯吡胺或苯海拉明）和鎮痛劑（諸如對乙醯胺基酚）。在一些實施例中，所述方法進一步包括投予抗組胺劑（諸如西替利嗪、異丙嗪、右旋氯苯吡胺或苯海拉明）和5-羥色胺5-HT 3受體拮抗劑（諸如格拉司瓊、朵拉司瓊、托烷司瓊、帕洛諾司瓊或昂丹司瓊）。在一些實施例中，所述方法進一步包括投予鎮痛劑（諸如對乙醯胺基酚）和5-羥色胺5-HT 3受體拮抗劑（諸如格拉司瓊、朵拉司瓊、托烷司瓊、帕洛諾司瓊或昂丹司瓊）。在一些實施例中，本文所述的任何方法進一步包括投予抗組胺劑（諸如西替利嗪、異丙嗪、右旋氯苯吡胺或苯海拉明）、鎮痛劑（諸如對乙醯胺基酚）和5-羥色胺5-HT 3受體拮抗劑（諸如格拉司瓊、朵拉司瓊、托烷司瓊、帕洛諾司瓊或昂丹司瓊）。
在一些實施例中，本文所述的任何方法進一步包括投予預前藥劑，例如以預防或減少輸注相關反應（IAR）或流感樣症狀的急性效應。在一些實施例中，在投予IL-2接合物和/或西妥昔單抗之前投予預前藥劑。在一些實施例中，在投予IL-2接合物之後投予預前藥劑。在一些實施例中，在投予西妥昔單抗之前投予預前藥劑。在一些實施例中，在投予IL-2接合物和西妥昔單抗之前投予預前藥劑。
在一些實施例中，用於IL-2接合物的預前藥劑不同於用於西妥昔單抗的預前藥劑。在一些實施例中，用於IL-2接合物的預前藥劑與用於西妥昔單抗的預前藥劑相同。在用於IL-2接合物和西妥昔單抗的預前藥劑相同的一些情況下，僅投予單劑量的預前藥劑。在用於IL-2接合物和西妥昔單抗的預前藥劑相同的其他情況下，投予多個劑量的預前藥劑。在一些實施例中，對所有投予劑量的IL-2接合物投予預前藥劑。在一些實施例中，對前1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個劑量的IL-2接合物而不對任何後續劑量的IL-2接合物投予預前藥劑。在一些實施例中，對前4個劑量的IL-2接合物而不對任何後續劑量的IL-2接合物投予預前藥劑。在一些實施例中，對所有投予劑量的西妥昔單抗投予預前藥劑。在一些實施例中，對前1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個劑量的西妥昔單抗而不對任何後續劑量的西妥昔單抗投予預前藥劑。在一些實施例中，對第一劑量的西妥昔單抗而不對任何後續劑量的西妥昔單抗投予預前藥劑。
在一些實施例中，本文所述的任何方法進一步包括在投予IL-2接合物之前投予預前藥劑。在一些實施例中，IL-2接合物預前藥劑是抗組胺劑，諸如西替利嗪、異丙嗪、右旋氯苯吡胺或苯海拉明。在一些實施例中，所述抗組胺劑是苯海拉明。在一些實施例中，以從約25至50 mg的劑量靜脈內投予苯海拉明。在一些實施例中，IL-2接合物預前藥劑是5-羥色胺5-HT 3受體拮抗劑（諸如格拉司瓊、朵拉司瓊、托烷司瓊、帕洛諾司瓊或昂丹司瓊）。在一些實施例中，5-羥色胺5-HT 3受體拮抗劑是昂丹司瓊。在一些實施例中，以從約8 mg至0.15 mg/kg的劑量靜脈內投予昂丹司瓊。在一些實施例中，IL-2接合物預前藥劑是鎮痛劑（諸如對乙醯胺基酚）。在一些實施例中，以從約650至1000 mg的劑量口服投予對乙醯胺基酚。
在一些實施例中，本文所述的任何方法進一步包括在投予西妥昔單抗之前投予預前藥劑。在一些實施例中，西妥昔單抗預前藥劑是抗組胺劑，諸如西替利嗪、異丙嗪、右旋氯苯吡胺或苯海拉明。在一些實施例中，所述抗組胺劑是苯海拉明。在一些實施例中，以從約25至50 mg的劑量靜脈內投予苯海拉明。在一些實施例中，西妥昔單抗預前藥劑是5-羥色胺5-HT 3受體拮抗劑（諸如格拉司瓊、朵拉司瓊、托烷司瓊、帕洛諾司瓊或昂丹司瓊）。在一些實施例中，5-羥色胺5-HT 3受體拮抗劑是昂丹司瓊。在一些實施例中，以從約8 mg至0.15 mg/kg的劑量靜脈內投予昂丹司瓊。在一些實施例中，西妥昔單抗預前藥劑是鎮痛劑（諸如對乙醯胺基酚）。在一些實施例中，以從約650至1000 mg的劑量口服投予對乙醯胺基酚。
在一些實施例中，本文所述的任何方法進一步包括在投予IL-2接合物之前投予第一劑量的預前藥劑並且在投予西妥昔單抗之前投予第二劑量的預前藥劑。在一些實施例中，用於IL-2接合物的預前藥劑與用於西妥昔單抗的預前藥劑相同。在一些實施例中，用於IL-2接合物的預前藥劑不同於用於西妥昔單抗的預前藥劑。在一些實施例中，預前藥劑是抗組胺劑，諸如西替利嗪、異丙嗪、右旋氯苯吡胺或苯海拉明。在一些實施例中，所述抗組胺劑是苯海拉明。在一些實施例中，以從約25至50 mg的劑量靜脈內投予苯海拉明。在一些實施例中，預前藥劑是5-羥色胺5-HT 3受體拮抗劑（諸如格拉司瓊、朵拉司瓊、托烷司瓊、帕洛諾司瓊或昂丹司瓊）。在一些實施例中，5-羥色胺5-HT 3受體拮抗劑是昂丹司瓊。在一些實施例中，以從約8 mg至0.15 mg/kg的劑量靜脈內投予昂丹司瓊。在一些實施例中，預前藥劑是鎮痛劑（諸如對乙醯胺基酚）。在一些實施例中，以從約650至1000 mg的劑量口服投予對乙醯胺基酚。在一些實施例中，預前藥劑包含抗組胺劑和5-羥色胺5-HT 3受體拮抗劑。在一些實施例中，預前藥劑包含抗組胺劑和鎮痛劑。在一些實施例中，預前藥劑包含5-羥色胺5-HT 3受體拮抗劑和鎮痛劑。在一些實施例中，預前藥劑包含抗組胺劑、5-羥色胺5-HT 3受體拮抗劑和鎮痛劑。在用於IL-2接合物和西妥昔單抗的預前藥劑相同（諸如苯海拉明）的一些情況下，僅投予單劑量的預前藥劑。在用於IL-2接合物和西妥昔單抗的預前藥劑相同的其他情況下，投予多個劑量的預前藥劑。 5. 劑量順序
在一些實施例中，用於IL-2接合物和/或西妥昔單抗的預前藥劑如上所述並且作為劑量順序的一部分投予，所述劑量順序包括投予IL-2接合物。
在本文所述方法的一些實施例中，劑量順序如下：(i) 用於西妥昔單抗的預前藥劑；(ii) 西妥昔單抗；(iii) 用於IL-2接合物的派姆單抗；和 (iv) IL-2接合物。在用於西妥昔單抗的預前藥劑與用於IL-2接合物的預前藥劑相同（諸如苯海拉明）的一些變型下，可以省略用於IL-2接合物的預前藥劑的投予。
在一些實施例中，在IL-2接合物的投予之前約30-60分鐘，例如在IL-2接合物輸注開始之前30-60分鐘投予用於IL-2接合物的預前藥劑。在一些實施例中，在西妥昔單抗的投予之前約30-60分鐘，例如在西妥昔單抗輸注開始之前30-60分鐘投予用於西妥昔單抗的預前藥劑。 個體
在一些實施例中，IL-2接合物和一種或多種另外的藥劑的投予是針對成人的。在一些實施例中，所述成人是男性。在其他實施例中，所述成人是女性。在一些實施例中，所述成人年齡為至少18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95歲。
在一些實施例中，所述個體患有可測量的疾病（即，HNSCC）。可測量的疾病可以藉由RECIST v1.1確定。例如，根據RECIST v1.1，個體可能具有至少一種可測量的病灶。在一些實施例中，個體在組織學或細胞學上已證實診斷為復發性和/或轉移性（R/M）HNSCC，其不適合出於治癒目的的進一步療法。在一些實施例中，個體的HNSCC的原發腫瘤位置是口咽、口腔、下咽或喉。在一些實施例中，原發腫瘤位置不是鼻咽。在一些實施例中，口咽癌的個體HPV p16狀態是已知的。在一些實施例中，個體已被確定具有 ＜ 2（例如，0或1）的東部腫瘤協作組（ECOG）體能狀態。在一些實施例中，個體具有足夠的心血管、血液、肝臟和腎臟功能，如由醫師所確定的。在一些實施例中，個體已被確定（例如，藉由醫師）具有大於或等於12週的期望壽命。在一些實施例中，個體在投予第一治療劑量之前已經進行先前抗癌療法。在一些實施例中，個體在組織學或細胞學上已證實診斷為R/M HNSCC，其不適合出於治癒目的的進一步療法。在一些實施例中，如果個體患有口咽癌，則個體具有已知的人乳頭瘤病毒p16狀態。在一些實施例中，個體沒有同種異體組織/實體器官移植史。在一些實施例中，個體未經歷來自先前4級免疫腫瘤學療法或導致中斷的免疫介導的/相關的毒性。在一些實施例中，個體沒有由任何先前抗癌療法引起的≥ 2級的正在發生的AE。在一些實施例中，個體沒有≤92%的基線氧飽和度（SpO2）（沒有氧療法的情況下）。在一些實施例中，個體未接受過先前的基於IL-2的抗癌治療。在一些實施例中，個體可以在每個劑量的IL-2接合物之前暫時（至少36小時）不服用任何抗高血壓藥物。在一些實施例中，對於其中療法包括投予西妥昔單抗的方法，個體未接受過用西妥昔單抗的先前治療。在一些實施例中，個體沒有在正常範圍之外的電解質（鎂、鈣和鉀）水準。在一些實施例中，個體滿足上述每個標準。
在一些實施例中，個體對於R/M HNSCC是初治的。在一些實施例中，個體先前未用西妥昔單抗治療過（即，患者對於西妥昔單抗是初治的）。
在一些實施例中，個體先前用基於鉑的方案治療過。在一些實施例中，個體患有鉑難治性HNSCC。在一些實施例中，個體先前對HNSCC的治療包括不超過兩種方案的失敗。在一些實施例中，個體先前對HNSCC的治療包括一種方案的失敗。在一些實施例中，個體先前對HNSCC的治療包括兩種方案的失敗。在一些實施例中，個體先前對HNSCC的治療包括不超過兩種方案的失敗，其中至少有一種失敗的方案是基於鉑的方案。在一些實施例中，個體先前對HNSCC的治療包括基於檢查點的方案的失敗。在一些實施例中，個體先前對HNSCC的治療包括基於檢查點的方案的失敗和基於鉑的方案。在一些實施例中，個體患有鉑難治性HNSCC，並且個體先前對HNSCC的治療包括不超過兩種方案的失敗。在一些實施例中，個體患有鉑難治性HNSCC，並且個體先前對HNSCC的治療包括一種方案的失敗。在一些實施例中，個體患有鉑難治性HNSCC，並且個體先前對HNSCC的治療包括兩種方案的失敗。在一些實施例中，個體是1L R/M HNSCC個體。在一些實施例中，個體是2/3L R/M HNSCC個體。
在一些實施例中，對於本文揭示的IL-2接合物、PEG、聚乙二醇化藥物或西妥昔單抗中任一種，個體沒有已知的超敏反應或禁忌症。在一些實施例中，個體未接受過包含IL-2的先前抗癌治療。在一些實施例中，個體未接受過包含西妥昔單抗的先前抗癌治療。
在一些實施例中，個體沒有大於或等於2的東部腫瘤協作組（ECOG）體能狀態。在一些實施例中，個體沒有不小於或等於3個月的預期的期望壽命。
在一些實施例中，個體未患有活動性腦轉移或軟腦膜轉移。在一些實施例中，個體先前治療過腦轉移，在IL-2接合物組合療法的投予之前在臨床上已穩定至少4週，沒有新的或擴大的腦轉移的證據，並且在IL-2接合物組合療法的投予之前的至少2週內未接受過類固醇。在一些實施例中，個體具有無症狀的腦轉移（即，沒有神經系統症狀，沒有皮質類固醇要求，並且沒有大於1.5 cm的病灶）並且接受作為疾病部位的腦部定期成像。
在一些實施例中，個體沒有同種異體或實體器官移植史。
在一些實施例中，個體沒有來自免疫調節劑（包括但不限於抗細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4單株抗體）的治療相關免疫介導（或免疫相關）不良事件（AE），其引起藥劑的永久中斷或嚴重程度為4級。
在一些實施例中，個體最後一次投予先前抗腫瘤療法（化療、靶向藥劑和免疫療法）或任何研究性治療不是在IL-2接合物組合療法的投予之前的28天或半衰期的少於5倍（以較短者為准）內。在一些實施例中，個體在接受IL-2組合療法的28天內沒有大型手術或局部干預。
在一些實施例中，個體在接受第一劑量IL-2接合物組合療法的2週內不具有需要皮質類固醇療法（＞10 mg強的松(prednisone)/天或等效物）的合併症。在一些實施例中，個體接受吸入或局部類固醇，前提是它們不用於治療自身免疫性障礙。在一些實施例中，個體接受簡短的類固醇療程（例如，由於對造影劑過敏而作為對成像研究的預防）。
在一些實施例中，個體在接受第一劑量IL-2接合物組合療法的14天內未接受過抗生素（不包括局部抗生素）。在一些實施例中，個體沒有任何嚴重的全身性真菌、細菌、病毒或其他無法控制或需要靜脈內注射或口服抗生素的感染。
在一些實施例中，個體在投予IL-2接合物組合療法的6個月內沒有嚴重或不穩定的心臟病症，諸如充血性心力衰竭（紐約心臟協會（New York Heart Association）III或IV級）、心臟搭橋手術或冠狀動脈支架置入、血管成形術、左心室射血分數（LVEF）低於50%、不穩定型心絞痛醫學上無法控制的高血壓（例如，收縮壓≥160 mmHg或舒張壓≥100 mmHg）、需要藥療的不受控制的心律失常（≥ 2級，根據NCI-CTCAE v5.0）、或心肌梗塞。在一些實施例中，個體沒有顯著的瓣膜性心臟病（包括瓣膜置換術）、血管畸形和動脈瘤。
在一些實施例中，個體沒有由先前的抗癌療法引起的≥ 2級的正在發生的AE（NCI-CTCAE 5.0版）。在一些實施例中，個體具有2級周圍神經病變或2級脫髮。
在一些實施例中，個體在投予IL-2接合物組合療法的2年內未患有需要全身治療（即，使用疾病調節劑、皮質類固醇或免疫抑制藥物）的活性、已知或疑似自身免疫性疾病。在一些實施例中，個體已接受針對自身免疫性疾病的替代療法（例如，甲狀腺素、胰島素或針對腎上腺或垂體功能不全的生理性皮質類固醇替代療法等）。在一些實施例中，個體患有白斑症、已經消退的兒童期哮喘或不需要全身治療的銀屑病。
在一些實施例中，個體沒有肺炎或間質性肺病，或需要口服或靜脈內注射糖皮質激素來協助管理的間質性肺病或肺炎的病史。
在一些實施例中，個體在接受第一劑量IL-2接合物組合療法的2週內未接受過放射療法。在一些實施例中，個體已從所有放射相關毒性中恢復，不需要皮質類固醇，並且沒有放射性肺炎。在一些實施例中，個體已經過針對與非CNS疾病相關的姑息性放射（≤2週的放射療法）而言一週的洗脫（washout）。
在一些實施例中，個體在接受第一劑量IL-2接合物組合療法的28天內未接受活病毒疫苗接種。
在一些實施例中，個體沒有感染HIV，具有卡波西肉瘤和/或多中心卡斯特曼病（Multicentric Castleman Disease）或已知不受控制的HIV感染的病史。在一些實施例中，個體感染HIV並且接受抗逆轉錄病毒療法（ART）並且具有良好控制的HIV感染/疾病，其定義為：接受ART的個體具有CD4+ T細胞計數＞350個細胞/mm 3；接受ART的個體已達到並且維持病毒學抑制，定義為使用當地可用的測定確認的HIV RNA水準低於50拷貝/mL或定性下限（低於檢測限）並且持續至少12週；接受ART的個體在接受第一劑量的IL-2接合物組合療法之前的至少4週內接受沒有改變藥物或劑量的穩定方案；組合ART方案不含除阿巴卡韋(abcavir)、度魯特韋(dolutegravir)、恩曲他濱(emtricitabine)、拉米夫定(lamivudine)、雷特格韋(raltegravir)、利匹韋林(rilpivirine)或替諾福韋(tenoforvir)以外的任何抗逆轉錄病毒藥療。
在一些實施例中，個體沒有已知的不受控制的B型肝炎感染、已知的未經治療的C型肝炎感染、活動性肺結核或需要腸胃外抗生素治療的嚴重感染。在一些實施例中，個體具有陽性HBsAg並且在接受第一劑量的IL-2接合物組合療法之前已開始抗HBV療法以控制HBV感染。在一些實施例中，個體已接受針對HBV的抗病毒療法持續至少4週，並且在接受第一劑量的IL-2接合物組合療法之前具有小於100 IU/mL的HBV病毒載量。在一些實施例中，個體具有低於100 IU/mL的病毒載量，並且在整個IL-2接合物組合療法期間接受主動HBV療法。
在一些實施例中，個體抗B型肝炎核心抗體HBc呈陽性，B型肝炎表面抗原（HBsAg）呈陰性，抗B型肝炎表面抗體（HBs）呈陰性或陽性，HBV病毒載量低於100 IU/mL，並且不需要HBV抗病毒預防。
在一些實施例中，個體過去或正在進行HCV感染，並且在接受第一劑量的IL-2接合物組合療法之前的至少1個月完成治療。在一些實施例中，個體HCV抗體呈陽性並且HCV RNA檢測不到，並且未接受抗HCV療法。
在一些實施例中，個體在投予IL-2接合物組合療法之前的3年內未患有發生進展或需要主動治療的已知的第二惡性腫瘤。在一些實施例中，個體患有皮膚基底細胞癌、皮膚鱗狀細胞癌、或原位癌（例如，乳腺癌、原位宮頸癌）並且已經受潛在治癒性的療法。
在一些實施例中，個體沒有潛在的癌症易感性症候群，包括但不限於遺傳性乳腺癌和卵巢癌症候群、Ferguson-Smith症候群、多發性自愈性上皮瘤、家族性腺瘤性息肉病、多發性內分泌瘤或Li-Fraumeni症候群的病史。
在一些實施例中，個體沒有在正常範圍之外的電解質（鎂、鈣、鉀）。在一些實施例中，個體沒有基線SpO 2≤92%（沒有氧療法的情況下）。
在一些實施例中，個體未接受過先前的基於IL-2的抗癌治療。在一些實施例中，個體能夠並且願意服用預前藥劑。在一些實施例中，在沒有密切監測的情況下，個體不接受肝臟代謝的窄治療指數藥物（例如，地高辛(digoxin)、華法林(warfarin)）。在一些實施例中，個體正在接受抗高血壓治療，並且在接受每一劑量的IL-2接合物組合療法之前（至少36小時）暫時停止抗高血壓藥療。
在一些實施例中，個體在接受第一劑量的抗TGFβ抗體之前的7天內未用治療劑量的抗凝劑或抗血小板劑（例如，1 mg/kg bid的依諾肝素(enoxaparin)、每天300 mg阿司匹林、每天300 mg氯吡格雷(clopidogrel)或等效物）治療。在一些實施例中，個體接受抗凝劑的預防性治療。
在一些實施例中，個體未接受過用西妥昔單抗的先前治療，除非在局部用於治療局部晚期疾病，並且在從先前西妥昔單抗療法完成起至少4個月內沒有疾病進展。
在一些實施例中，個體未在接受IL-2接合物組合療法的同時參與臨床研究。
在一些實施例中，個體沒有以下任一項或多項：絕對嗜中性粒細胞計數 ＜ 1500/uL（1.5 × 10 9/L）（停用G-CSF至少一週後）；血小板 ＜ 100 × 10 3u/L（不血小板輸注至少3天後）；血紅蛋白 ＜ 9 g/dL（在前2週內沒有包裝紅細胞 [pRBC] 輸注；個體可以接受穩定劑量的促紅細胞生成素（≥ 大約3個月）；總膽紅素＞1.5 x正常上限（ULN），除非直接膽紅素 ≤ ULN（不排除血清膽紅素水準 ≤ 3 × ULN的已知吉伯特病個體）；天門冬胺酸轉胺酶和/或丙胺酸轉胺酶 ＞ 2.5 × ULN（或對於肝轉移個體，＞ 5 × ULN）；估計腎小球濾過率速率（eGFR）＜ 50 mL/min/1.73 m 2（腎病飲食調整 [MDRD] 配方）；國際標準化比率（INR）或凝血酶原時間（PT）或活化部分凝血活酶時間（aPTT）＞ 1.5 × ULN，除非個體正在接受抗凝劑治療，只要PT或aPTT在抗凝劑預期用途的治療範圍內。 投予效果
在一些實施例中，如本文所述的IL-2接合物組合療法的投予提供了完全反應、部分反應、或穩定的疾病。
在一些實施例中，在投予IL-2接合物組合療法之後，個體經歷了如藉由實體瘤免疫相關療效評價標準（Immune-related Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，iRECIST）測量的反應。在一些實施例中，在投予IL-2接合物組合療法之後，個體經歷根據RECIST 1.1版的客觀反應率（ORR）。在一些實施例中，在投予IL-2接合物組合療法之後，個體經歷根據RECIST 1.1版的反應持續時間（DOR）。在一些實施例中，在投予IL-2接合物組合療法之後，個體經歷根據RECIST 1.1版的無進展存活期（PFS）。在一些實施例中，在投予IL-2接合物組合療法之後，個體經歷根據RECIST 1.1版的總體存活期。在一些實施例中，在投予IL-2接合物組合療法之後，個體經歷根據RECIST 1.1版的反應時間（TTR）。在一些實施例中，在投予IL-2接合物組合療法之後，個體經歷根據RECIST 1.1版的疾病控制率（DCR）。在這些實施例中的任一個中，個體的經歷是基於醫師對拍攝的個體的放射照相圖像的審查。
在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會引起個體的血管滲漏症候群。在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會引起個體的2級、3級或4級血管滲漏症候群。在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會引起個體的2級血管滲漏症候群。在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會引起個體的3級血管滲漏症候群。在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會引起個體的4級血管滲漏症候群。在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會引起個體的血管緊張度損失。
在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會引起個體的血漿蛋白和流體外滲到血管外空間中。
在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會引起個體的低血壓和器官灌注減少。
在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會引起個體的嗜中性粒細胞功能受損。在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會引起個體的趨化性降低。
在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法與個體的增加的播散性感染風險無關。在一些實施例中，所述播散性感染是敗血症或細菌性心內膜炎。在一些實施例中，所述播散性感染是敗血症。在一些實施例中，所述播散性感染是細菌性心內膜炎。在一些實施例中，在投予所述IL-2接合物組合療法之前，針對任何預先存在的細菌感染治療個體。在一些實施例中，在投予IL-2接合物組合療法之前，用選自苯唑西林(oxacillin)、萘夫西林(nafcillin)、環丙沙星(ciprofloxacin)和萬古黴素的抗細菌劑治療個體。
在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會加劇個體的自體免疫疾病或炎性病症的預先存在的表現或初始表現。在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會加劇個體的自體免疫疾病的預先存在的表現或初始表現。在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會加劇個體的炎性病症的預先存在的表現或初始表現。在一些實施例中，個體的自體免疫疾病或炎性病症選自克羅恩病、硬皮病、甲狀腺炎、炎性關節炎、糖尿病、眼球型重症肌無力、新月體性IgA腎小球腎炎、膽囊炎、腦血管炎、史-約症候群（Stevens-Johnson syndrome）和大皰性類天皰瘡。在一些實施例中，個體的自體免疫疾病或炎性病症是克羅恩病。在一些實施例中，個體的自體免疫疾病或炎性病症是硬皮病。在一些實施例中，個體的自體免疫疾病或炎性病症是甲狀腺炎。在一些實施例中，個體的自體免疫疾病或炎性病症是炎性關節炎。在一些實施例中，個體的自體免疫疾病或炎性病症是糖尿病。在一些實施例中，個體的自體免疫疾病或炎性病症是眼球型重症肌無力。在一些實施例中，個體的自體免疫疾病或炎性病症是新月體性IgA腎小球腎炎。在一些實施例中，個體的自體免疫疾病或炎性病症是膽囊炎。在一些實施例中，個體的自體免疫疾病或炎性病症是腦血管炎。在一些實施例中，個體的自體免疫疾病或炎性病症是史-約症候群。在一些實施例中，個體的自體免疫疾病或炎性病症是大皰性類天皰瘡。
在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會引起所述個體的精神狀態變化、言語困難、皮質盲、肢體或步態共濟失調、幻覺、神經激動、遲鈍或昏迷。在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會引起個體的癲癇發作。在一些實施例中，在患有已知癲癇發作障礙的個體中，向個體投予IL-2接合物組合療法不是禁忌的。
在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會引起個體的毛細血管滲漏症候群。在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會引起個體的2級、3級或4級毛細血管滲漏症候群。在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會引起個體的2級毛細血管滲漏症候群。在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會引起個體的3級毛細血管滲漏症候群。在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會引起個體的4級毛細血管滲漏症候群。
在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會引起個體在投予後平均動脈血壓的下降。在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法確實引起個體的低血壓。在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會使個體經歷低於90 mm Hg的收縮壓或從基線收縮壓下降20 mm Hg。
在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會引起個體的水腫或腎功能或肝功能受損。
在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會引起個體的嗜酸性粒細胞增多症。在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會引起個體的外周血中的嗜酸性粒細胞計數超過500/μL。在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會引起個體的外周血中的嗜酸性粒細胞計數超過500/μL至1500/μL。在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會引起個體的外周血中的嗜酸性粒細胞計數超過1500/μL至5000/μL。在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會引起個體的外周血中的嗜酸性粒細胞計數超過5000/μL。在一些實施例中，在接受現有精神藥物方案的個體中，向個體投予IL-2接合物組合療法不是禁忌的。
在一些實施例中，在接受腎毒性、骨髓毒性、心臟毒性或肝毒性藥物的現有方案的個體中，向個體投予IL-2接合物組合療法不是禁忌的。在一些實施例中，在接受胺基糖苷類、細胞毒性化療、多柔比星、甲胺蝶呤或天門冬醯胺酸酶的現有方案的個體中，向個體投予IL-2接合物組合療法不是禁忌的。在一些實施例中，在接受含有抗腫瘤劑的組合方案的個體中，向個體投予IL-2接合物組合療法不是禁忌的。在一些實施例中，所述抗腫瘤劑選自達卡巴嗪、順鉑、他莫昔芬和干擾素-α。
在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不會引起個體在投予後的一種或多種4級不良事件。在一些實施例中，4級不良事件選自體溫過低；休克；心動過緩；室性期前收縮；心肌缺血；暈厥；出血；房性心律失常；靜脈炎；二度房室傳導阻滯；心內膜炎；心包積液；外周壞疽；血栓形成；冠狀動脈障礙；口炎；噁心和嘔吐；肝功能測試異常；胃腸出血；嘔血；血性腹瀉；胃腸道障礙；腸穿孔；胰腺炎；貧血；白細胞減少；白細胞增多；低鈣血症；鹼性磷酸酶升高；血尿素氮（BUN）升高；高尿酸血症；非蛋白氮（NPN）升高；呼吸性酸中毒；嗜睡；神經激動；神經病變；偏執性反應；抽搐；癲癇大發作性抽搐；譫妄；哮喘、肺水腫；通氣過度；低氧症；咯血；通氣不足；氣胸；瞳孔散大；瞳孔障礙；腎功能異常；腎衰；和急性腎小管壞死。在一些實施例中，向一組個體投予IL-2接合物組合療法不會引起大於1%的個體在投予後的一種或多種4級不良事件。在一些實施例中，4級不良事件選自體溫過低；休克；心動過緩；室性期前收縮；心肌缺血；暈厥；出血；房性心律失常；靜脈炎；二度房室傳導阻滯；心內膜炎；心包積液；外周壞疽；血栓形成；冠狀動脈障礙；口炎；噁心和嘔吐；肝功能測試異常；胃腸出血；嘔血；血性腹瀉；胃腸道障礙；腸穿孔；胰腺炎；貧血；白細胞減少；白細胞增多；低鈣血症；鹼性磷酸酶升高；血尿素氮（BUN）升高；高尿酸血症；非蛋白氮（NPN）升高；呼吸性酸中毒；嗜睡；神經激動；神經病變；偏執性反應；抽搐；癲癇大發作性抽搐；譫妄；哮喘、肺水腫；通氣過度；低氧症；咯血；通氣不足；氣胸；瞳孔散大；瞳孔障礙；腎功能異常；腎衰；和急性腎小管壞死。
在一些實施例中，向一組個體投予IL-2接合物組合療法不會引起大於1%的個體在投予後的一種或多種不良事件，其中所述一種或多種不良事件選自十二指腸潰瘍形成；腸壞死；心肌炎；室上性心動過速；繼發於視神經炎的永久性或暫時性失明；短暫腦缺血發作；腦膜炎；腦水腫；心包炎；過敏性間質性腎炎；和氣管食管瘺。
在一些實施例中，向一組個體投予IL-2接合物組合療法不會引起大於1%的個體在投予後的一種或多種不良事件，其中所述一種或多種不良事件選自惡性高熱；心臟停搏；心肌梗死；肺栓塞；中風；腸穿孔；肝或腎衰竭；導致自殺的嚴重抑鬱症；肺水腫；呼吸停止；呼吸衰竭。
在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法會刺激個體的CD8+細胞。在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法會刺激個體的NK細胞。刺激可以包括個體中CD8+細胞數量的增加，例如投予後約4、5、6或7天，或投予後約1、2、3或4週。在一些實施例中，CD8+細胞包括記憶CD8+細胞。在一些實施例中，CD8+細胞包括效應CD8+細胞。刺激可以包括例如投予後約4、5、6或7天，或投予後約1、2、3或4週，個體中Ki67陽性的CD8+細胞比例的增加。刺激可以包括例如投予後約4、5、6或7天，或投予後約1、2、3或4週，個體中NK細胞數量的增加。
在一些實施例中，在投予IL-2接合物組合療法之後，CD8+細胞在個體中擴增至少1.5倍，諸如至少1.6倍、1.7倍、1.8倍或1.9倍。在一些實施例中，在投予IL-2接合物組合療法之後，NK細胞在個體中擴增至少5倍，諸如至少5.5倍、6倍或6.5倍。在一些實施例中，在投予IL-2接合物組合療法之後，嗜酸性粒細胞在個體中擴增不超過約2倍，諸如不超過約1.5倍、1.4倍或1.3倍。在一些實施例中，在投予IL-2接合物組合療法之後，CD4+細胞在個體中擴增不超過約2倍，諸如不超過約1.8倍、1.7倍或1.6倍。在一些實施例中，在投予IL-2接合物組合療法之後，在個體中CD8+細胞和/或NK細胞的擴增多於CD4+細胞和/或嗜酸性粒細胞的擴增。在一些實施例中，CD8+細胞的擴增多於CD4+細胞的擴增。在一些實施例中，NK細胞的擴增多於CD4+細胞的擴增。在一些實施例中，CD8+細胞的擴增多於嗜酸性粒細胞的擴增。在一些實施例中，NK細胞的擴增多於嗜酸性粒細胞的擴增。相對於投予所述IL-2接合物之前測量的基線值，確定擴增倍數。在一些實施例中，在投予後的任何時間，諸如投予後約4、5、6或7天，或投予後約1、2、3或4週，確定擴增倍數。
在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法會增加個體中外周CD8+ T和NK細胞的數量，而不增加個體中外周CD4+調節T細胞的數量。在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法會增加個體中外周CD8+ T和NK細胞的數量，而不增加個體中外周嗜酸性粒細胞的數量。在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法會增加個體中外周CD8+ T和NK細胞的數量，而不增加個體中腫瘤內CD8+ T細胞和NK細胞的數量並且不增加個體中腫瘤內CD4+調節T細胞的數量。
在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不需要使用重症監護設施或熟練的心肺或重症監護醫學專家。在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不需要使用重症監護設施或熟練的心肺或重症監護醫學專家。在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不需要使用重症監護設施。在一些實施例中，向個體投予IL-2接合物組合療法不需要使用熟練的心肺或重症監護醫學專家。
在一些實施例中，投予IL-2接合物組合療法不會引起劑量限制性毒性。在一些實施例中，投予IL-2接合物組合療法不會引起嚴重的細胞激素釋放症候群。在一些實施例中，IL-2接合物不誘導抗藥物抗體（ADA），即抗IL-2接合物的抗體。在一些實施例中，西妥昔單抗的投予不誘導抗藥物抗體（ADA），即針對西妥昔單抗的抗體。在一些實施例中，ADA誘導的缺乏是藉由抗PEG的抗體的直接免疫測定和/或針對IL-2接合物或西妥昔單抗的抗體的ELISA來測定。如果測得的ADA水準在統計學上與基線（治療前）水準或與未治療對照的水準無法區分，則認為IL-2接合物或西妥昔單抗不會誘導ADA。
在一些實施例中，IL-2接合物組合療法的投予會改善對HNSCC的ADCC反應。在一些實施例中，IL-2接合物組合療法的投予會促進腫瘤微環境內的免疫活化。在一些實施例中，IL-2接合物組合療法的投予會克服或減少免疫逃避機制並且增強抗癌T細胞免疫。在一些實施例中，IL-2接合物組合療法的投予會抑制導致腫瘤抵抗的機制，例如EGFR活性。 套組 / 製品
在某些實施例中，本文揭示了與本文所述的一種或多種方法和組合物一起使用的套組和製品。此類套組包括載體、包裝或容器，其被分隔以容納一個或多個容器諸如小瓶、管等，所述一個或多個容器中的每一個包含有待在本文所述的方法中使用的單獨要素之一。合適的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和試管。在一個實施例中，容器由各種材料（諸如玻璃或塑膠）形成。
套組典型地包含列出內容物和/或使用說明的標籤、以及包含使用說明的包裝插頁。典型地還將包括一組說明書。
在一個實施例中，標籤在容器上或與容器相關。在一個實施例中，當形成標籤的字母、數位或其他字元被貼附、模制或蝕刻到容器本身中時，標籤在容器上；當標籤存在於容納容器的器皿或載體內時，標籤與容器相關，例如作為包裝插頁。在一個實施例中，標籤用於指示內容物將用於特定治療應用。標籤還指示使用內容物的指示，諸如在本文所述的方法中。
在某些實施例中，醫藥組合物存在於包裝或分配器裝置中，所述裝置含有一個或多個含有本文所提供化合物的單位劑型。包裝例如含有金屬或塑膠箔，諸如泡罩包裝。在一個實施例中，包裝或分配器裝置附有投予說明書。在一個實施例中，包裝或分配器還附有與容器相關的通知，所述通知的形式由規範藥物製造、使用或銷售的政府機構規定，所述通知反映了所述機構對用於人或獸醫投予的藥物形式的核准。例如，此類通知是由美國食品和藥物管理局核准的藥物標籤，或核准的產品插頁。在一個實施例中，還製備了在相容的藥物載劑中配製的含有本文提供的化合物的組合物，將其放置在適當的容器中，並且標記用於治療指定病症。 實例
這些實例僅僅出於說明性目的提供，並且不限制本文提供的申請專利範圍的範圍。 實例 1. 聚乙二醇化 IL-2 接合物的製備。
在本實例中詳細提供了用於製備本文所述的IL-2接合物的示例性方法。
使用本文揭示的方法使用以下將用於生物接合的IL-2在大腸桿菌中表現為包涵體：(a) 表現質體，其編碼 (i) 具有所需胺基酸序列的蛋白質，其基因含有第一非天然鹼基對以在摻入非天然胺基酸 N6-((2-疊氮基乙氧基)-羰基)-L-離胺酸（AzK）的所需位置處提供密碼子，和 (ii) 衍生自馬氏甲烷八疊球菌Pyl的tRNA，其基因包含第二非天然核苷酸以提供匹配的反密碼子代替其天然序列；(b) 編碼巴氏甲烷八疊球菌衍生的吡咯離胺醯-tRNA合成酶（ MbPylRS）的質體，(c) N6-((2-疊氮基乙氧基)-羰基)-L-離胺酸（AzK）；和 (d) 核苷酸三磷酸轉運蛋白PtNTT2的截短變異體，其中缺失全長蛋白質的前65個胺基酸殘基。編碼所希望的IL-2變異體的胺基酸序列的雙鏈寡核苷酸含有密碼子AXC作為編碼具有SEQ ID NO: 1的蛋白質的序列的密碼子64，其中P64被本文所述的非天然胺基酸替代。編碼來自馬氏甲烷八疊球菌的正交tRNA基因的質體包含AXC匹配的反密碼子GYT代替其天然序列，其中Y是本文揭示的非天然核苷酸。X和Y選自本文揭示的非天然核苷酸dTPT3和dNaM。從包涵體中提取表現的蛋白質，並且使用標準程序重新折疊，然後使用DBCO介導的無銅點擊化學將含AzK的IL-2產物進行位點特異性聚乙二醇化，以將穩定的共價mPEG部分附接到AzK上。示例性反應示於方案1和2中（其中n表示重複PEG單元的數量）。AzK部分與DBCO炔基部分的反應可提供一種區域異構產物或區域異構產物的混合物。 方案 1.
Figure 02_image184
方案 2.
Figure 02_image186
實例 2. 在患有鉑難治性 HNSCC 的個體（世代 B2 ）中使用 IL-2 接合物和西妥昔單抗的組合療法的臨床研究。
進行一項2期非隨機、開放標籤、多世代、多中心研究，以評估IL-2接合物與西妥昔單抗組合用於治療患有HNSCC的參與者的臨床益處。所述IL-2接合物包含SEQ ID NO: 2，其中位置64是AzK_L1_PEG30kD，其中AzK_L1_PEG30kD被定義為具有如下的結構：式 (IV) 或式 (V) 或式 (IV) 和式 (V) 的混合物，以及30 kDa線性mPEG鏈。所述IL-2接合物也可描述為包含SEQ ID NO: 1的IL-2接合物，其中位置64被替代為具有以下的結構：式 (IV) 或式 (V) 或式 (IV) 和式 (V) 的混合物，以及30 kDa線性mPEG鏈。所述IL-2接合物也可描述為包含SEQ ID NO: 1的IL-2接合物，其中位置64被替代為具有以下的結構：式 (XII) 或式 (XIII) 或式 (XII) 和式 (XIII) 的混合物，以及30 kDa線性mPEG鏈。如實例1中所述製備化合物，即，使用其中首先製備具有SEQ ID NO: 1的蛋白質，其中位置64的脯胺酸被 N6-((2-疊氮基乙氧基)-羰基)-L-離胺酸AzK替代。然後允許含有AzK的蛋白質在點擊化學條件下與包含平均分子量為30 kDa的甲氧基線性PEG基團的DBCO反應，隨後使用標準程序純化和配製。
世代B2參與者是患有鉑難治性2L/3L復發性和/或轉移性HNSCC並且未接受用西妥昔單抗的先前治療的患者。所有世代B2參與者先前都用基於鉑的方案治療過，並且在對於復發性和/或轉移性（R/M）疾病的不超過2種方案失敗後是西妥昔單抗幼稚的。
參與者為男性或女性並且年齡 ≥ 18歲。參與者必須具有根據RECIST v1.1至少有一個可測量的病灶，並且在組織學或細胞學上證實診斷出R/M HNSCC，其被認為不適合出於治癒目的的進一步療法（合格的原發性腫瘤位置：口咽、口腔、下咽、和喉）。口咽癌參與者必須具有已知的人乳頭瘤病毒p16狀態。參與者必須具有足夠的心血管、肝、腎功能和實驗室參數。
參與者受以下排除標準的約束： • ECOG體能狀態 ≥ 2 • 同種異體組織/實體器官移植史 • 來自先前4級免疫腫瘤學療法或導致中斷的免疫介導的/相關的毒性 • 由任何先前抗癌療法引起的 ≥ 2級的正在發生的AE • 基線氧飽和度（SpO2）≤ 92%（沒有氧療法的情況下） • 先前的基於IL-2的抗癌治療 • 無法在每個劑量的IL-2接合物之前暫時（至少36小時）不服用抗高血壓藥物 • 如由研究者判斷的將排除方案療法或將使個體不適合研究的任何醫學或臨床狀況、實驗室異常或任何特定情況 • 用西妥昔單抗的先前治療 • 在正常範圍之外的電解質（鎂、鈣和鉀）水準。
世代B2的參與者每3週一次接受IL-2接合物（24 μg/kg的劑量），並且根據如下劑量方案藉由靜脈內輸注接受西妥昔單抗。在第1週期第1天以400 mg/m 2的初始負載劑量經120分鐘輸注（最大輸注速率10 mg/min）西妥昔單抗，然後對於從第1週期第8天投予開始的所有後續劑量，經60分鐘輸注250 mg/m 2（最大輸注速率10 mg/min），直到疾病進展（PD）。在每個21天週期的第1、8和15天給予西妥昔單抗。IL-2接合物的輸注時間約30分鐘。對於前4個治療週期，在投予IL-2接合物之前，所有參與者都接受了IL-2接合物預前藥劑，以預防或減少輸注相關反應（IAR）或流感樣症狀的急性效應，在輸注IL-2接合物之前30至60分鐘。IL-2接合物預前藥劑如下：對乙醯胺基酚（約650-1000 mg，口服）、苯海拉明（約25-50 mg，靜脈內）和/或昂丹司瓊（約8 mg或0.15 mg/kg，靜脈內）。在前4個週期後，IL-2接合物預前藥劑的投予是任選的，基於監督醫生的評估。在投予第一劑量的西妥昔單抗之前，所有參與者預先服用苯海拉明（約25至50 mg，靜脈內）。基於監督醫師的評估，用於後續劑量西妥昔單抗的預前藥劑是任選的。當在同一天給予IL-2接合物和西妥昔單抗時，接受作為西妥昔單抗預前藥劑的苯海拉明的參與者可以跳過作為IL-2接合物預前藥劑的苯海拉明。劑量順序如下：(i) 用於西妥昔單抗的預前藥劑（在開始西妥昔單抗輸注之前30-60 min）；(ii) 西妥昔單抗；(iii) 用於IL-2接合物的預前藥劑（在開始IL-2接合物輸注之前30-60 min投予）；和 (iv) IL-2接合物。重複治療直到PD。
根據各種標準監測患者的疾病進展。根據RECIST 1.1，在投予IL-2接合物和西妥昔單抗組合治療後評價患者的評估客觀反應率（ORR）。根據美國國家癌症研究不良事件通用術語標準（National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events）（NCI CTCAE）v 5.0和美國移植與細胞療法學會（American Society for Transplantation and Cellular Therapy）（ASTCT）共識分級，在投予IL-2接合物和西妥昔單抗組合治療之後評價治療緊急不良事件（TEAE）、劑量限制性毒性（DLT）、嚴重不良事件（SAE）和實驗室異常的發生率。在投予IL-2接合物和西妥昔單抗組合治療後，根據RECIST 1.1評價患者的完全反應（CR）或部分反應（PR）的時間。
可以在投予IL-2接合物和西妥昔單抗組合治療後還評價患者的以下參數：(1) 反應持續時間（DoR），定義為從第一個記錄的CR或PR證據直到根據RECIST 1.1確定的進展性疾病（PD）或由任何原因導致的死亡（以先發生者為准）的時間；(2) 臨床受益率（CBR），包括在任何時間確認的CR或PR或根據RECIST 1.1至少6個月的穩定疾病（SD）；和 (3) 無進展生存期（PFS），定義為從首次投予IL-2接合物和西妥昔單抗組合治療的日期至根據RECIST 1.1的首次記錄的腫瘤進展的日期或由於任何原因導致的死亡（以先發生者為准）的時間。也在整個研究的不同時間點評價患者的藥動學參數，諸如IL-2接合物和西妥昔單抗的濃度和針對IL-2接合物的抗藥物抗體（ADA）的發生率。在投予IL-2接合物和西妥昔單抗組合治療後還評價患者的以下額外的抗腫瘤活性指標：(1) 基於免疫療法的實體瘤的免疫反應評價標準（iRECIST）的客觀反應率；(2) 疾病控制率（DCR），定義為根據RECIST 1.1達到CR、PR或SD的參與者的比例；(3) 完全反應率（CRR），定義為具有確認的CR（根據RECIST 1.1確定）的參與者的比例；和 (4) OS，定義為從第一劑量的IL-2接合物和西妥昔單抗組合治療至因任何原因死亡的日期的時間。在投予IL-2接合物和西妥昔單抗組合治療後，還可以評價患者的以下對免疫系統的額外影響：(1) 血液中的免疫細胞擴增和動力學（血液中的CD8+ T細胞和NK細胞增殖（Ki67）和擴增）；(2) 腫瘤微環境（TME）中免疫反應的調節（在基線和治療腫瘤組織樣品上程式性死亡配體1（PD-L1）、CD8+/Ki67、CD4+、FoxP3、和T/NK/Treg的表現）；(3) 細胞激素產生的動力學（血液中的細胞激素組）；和 (4) 反應的預測標記物（PD-L1、錯配修復狀態、腫瘤突變負荷（TMB）、免疫基因特徵、基線樣品上的循環腫瘤DNA（ctDNA））。
結果。7名患有R/M HNSCC並且已接受1-2線先前治療的個體（世代B2）接受劑量為24 μg/kg Q3W的IL-2接合物與西妥昔單抗（第1天400 mg/m 2，隨後250 mg/m 2QW）的組合。兩名個體具有至少一次可評價的基線後腫瘤評估掃描（即，評價功效）。一名個體具有經證實的部分反應（即，靶病灶大小明顯減小）。一名個體具有穩定疾病的最佳總體反應（BOR）。一名個體無法評價並且中斷治療。對其他個體的評價尚不可用。
治療緊急不良事件（TEAE）總結在表1中。 表 1.治療緊急不良事件：n = 7。
系統器官分類 所有等級 等級 ≥ 3
感染和侵染 0/7 (0%) 0/7 (0%)
血液及淋巴系統障礙 1/7 (14.3%) 0/7 (0%)
免疫系統障礙 0/7 (0%) 0/7 (0%)
代謝及營養障礙 2/7 (28.6%) 0/7 (0%)
精神障礙 1/7 (14.3%) 0/7 (0%)
神經系統障礙 2/7 (28.6%) 0/7 (0%)
心臟障礙 3/7 (42.9%) 2/7 (28.6%)
血管障礙 1/7 (14.3%) 0/7 (0%)
呼吸系統、胸及縱膈障礙 0/7 (0%) 0/7 (0%)
胃腸道障礙 7/7 (100%) 1/7 (14.3%)
皮膚及皮下組織障礙 3/7 (42.9%) 0/7 (0%)
肌肉骨骼及結締組織障礙 2/7 (28.6%) 0/7 (0%)
腎臟及泌尿系統 0/7 (0%) 0/7 (0%)
全身性障礙及 投予部位狀況 4/7 (57.1%) 0/7 (0%)
研究 2/7 (28.6%) 1/7 (14.3%)
損傷、中毒及手術併發症 4/7 (57.1%) 0/7 (0%)
在一些實施例中，在一個治療週期後個體顯示一個或多個病灶的大小減小。在一些實施例中，在第一次腫瘤評估後，個體顯示一個或多個靶病灶的大小減小。在一些實施例中，在第二次、第三次或第四次腫瘤評估後，個體顯示出反應（即，靶病灶的大小減小）。在一些實施例中，在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個治療週期後，個體顯示出反應（即，靶病灶的大小減小）。在一些實施例中，在第一次治療後的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20週後，個體顯示出反應（即，靶病灶的大小減小）。 實例 3. IL-2 接合物和西妥昔單抗的體外研究（ PBMC ADCC 測定）。
使用人PBMC與鈣黃綠素標記的癌細胞株（CAL27和A431）的共培養物進行研究，以研究實例2的IL-2接合物與西妥昔單抗的組合對抗體依賴性細胞毒性（ADCC）的影響。
CAL27 細胞。
試劑。
生物測定緩衝液：添加到不含酚紅的RPMI中的1%超低IgG FBS。完全測定緩衝液：添加到45 mL生物測定緩衝液中的450 μL丙磺舒(probenecid)，其中最終丙磺舒濃度為77 μg/mL。鈣黃綠素-乙醯氧基甲酯（鈣黃綠素-AM）：在25 μL DMSO中的50 μg。鈣黃綠素-AM染色緩衝液：添加到4 mL完全測定緩衝液中的10 μL鈣黃綠素-AM（最終鈣黃綠素-AM濃度為5 μg/mL）。Triton-X-100裂解緩衝液：添加到4 mL完全測定緩衝液中的20 μL Triton-X-100（最終濃度為0.5%）。
程序。
在第1天，製備IL-2接合物的6點的1比5稀釋系列（在PBS中）。IL-2接合物濃度為2、0.4、0.08、0.016、0.0032和0 μg/mL。藉由以200 x g離心5分鐘收集PBMC，並且以2000萬個細胞/mL重懸於無酚紅RPMI + 10%超低IgG中。將適當體積的這些PBMC轉移到多孔儲器的6個部分，向其中添加一系列IL-2接合物稀釋液。藉由上下移液將PBMC與IL-2接合物充分混合，並且使用多通道移液器將50 mL轉移到圓底96孔板中（每孔的最終PBMC數量為100萬）。保留六個空孔以供在第二天添加對照。在5%二氧化碳的存在下，將板在37ºC的加濕培養箱中培育過夜。
在第2天，使用TrypLE express解離緩衝液收穫CAL27細胞（表現EGFR的口腔上皮鱗狀細胞癌細胞株），並且藉由以200 x g離心5分鐘收集。對細胞進行計數，並且將500萬個細胞重懸在4 mL鈣黃綠素-AM染色緩衝液中，並且在37ºC下在5%二氧化碳的存在下培育30分鐘。然後收集細胞並且藉由以200 x g離心5分鐘在完全測定緩衝液中洗滌兩次。對細胞進行計數並且以40萬個細胞/mL重懸，最終靶細胞數為20,000個/孔。
將西妥昔單抗抗體（Eli Lilly & Co.）稀釋至工作濃度3X（3、0.3、0.03、0.003 μg/mL），最終測定濃度為1、0.1、0.001、0.0001 μg/mL。將同種型對照（hIgG1，Biolegend）在完全測定緩衝液中稀釋至3 μg/mL，最終濃度為1 μg/mL。將等體積的40萬個細胞/mL的染色CAL27細胞與抗體稀釋液或同種型對照混合，並且在4ºC下培育30分鐘以允許抗體結合。培育後，從第1天起將100 μL的抗體-CAL27細胞混合物添加到含有50 μL的IL-2接合物處理的PBMC的96孔板中。
一式三份地製備對照孔，其沒有PBMC但具有50 μL用完全測定緩衝液處理的鈣黃綠素-AM染色的CAL27細胞（背景信號）或用50 μL Triton-X-100處理的染色CAL27（用於細胞裂解後的最大信號），兩者都用完全測定緩衝液達到150 μL最終體積。將板以200 x g離心1分鐘，並且然後在37ºC下在5%二氧化碳的存在下培育60分鐘。培育後，將板再次短暫離心，然後將90 μL上清液轉移到新鮮的黑色透明底板中，並且在Envision 2104讀板器上讀取螢光信號（激發：492 nm；發射：515 nm）。
使用以下公式計算細胞毒性： 細胞毒性 (%) = (A - B)/(C - B)×100 其中A是處理細胞的螢光值；B是僅來自靶細胞的背景；並且C是從Triton-X-100處理獲得的最大釋放值。
資料代表在西妥昔單抗的存在下IL-2接合物處理的人PBMC對靶癌細胞的細胞毒性%。技術重複的平均百分比轉換為比例。使用雙向廣義線性混合模型（GLMM）進行分析，具有針對IL-2接合物、西妥昔單抗及其相互作用的因素，具有隨機供體效應，將比例視為偽二項式變數。此後進行事後檢驗（使用Dunnett-Hsu調整）以將IL-2接合物處理組與對照組進行比較。使用SAS (1) 9.4版本軟體進行統計學分析。小於5%（p ＜ 0.05）的概率被認為是顯著的。
結果。
在1、0.1和0.01 mg/mL的西妥昔單抗劑量水準下，IL-2接合物在0.08、0.4和2 mg/mL的濃度下增強了西妥昔單抗對表現EGFR的CAL27細胞的ADCC功能（p ＜ 0.05）（ 圖 1A-C）。在0.001 mg/mL的西妥昔單抗劑量水準下，IL-2接合物在0.4和2 mg/mL的濃度下增強了西妥昔單抗對表現EGFR的CAL27細胞的ADCC功能（p ＜ 0.05）。 圖 2A進一步示出了西妥昔單抗對表現EGFR的CAL27細胞的增強的ADCC功能（PBMC與CAL27的比率為50:1）。
GLMM模型的固定效應的測試表明，IL-2接合物、西妥昔單抗及其相互作用的因素對細胞毒性具有顯著影響，即IL-2接合物組之間的差異對於不同的西妥昔單抗濃度有顯著差異。成對比較表明在0.001 mg/mL的西妥昔單抗濃度下IL-2接合物2 mg/mL組與對照組之間（p=0.0001）以及IL-2接合物0.4 mg/mL組與對照組之間（p=0.0001）的顯著差異。成對比較還表明在0.01 mg/mL的西妥昔單抗濃度下IL-2接合物2 mg/mL組與對照組之間（p＜0.0001）、IL-2接合物0.4 mg/mL組與對照組之間（p＜0.0001）以及IL-2接合物0.08 mg/mL組與對照組之間（p=0.0003）的顯著差異。另外，成對比較表明在0.1 mg/mL的西妥昔單抗濃度下IL-2接合物2 mg/mL組與對照組之間（p＜0.0001）、IL-2接合物0.4 mg/mL組與對照組之間（p＜0.0001）以及IL-2接合物0.08 mg/mL組與對照組之間（p＜0.0001）的顯著差異。最後，成對比較表明在1 mg/mL的西妥昔單抗濃度下IL-2接合物2 mg/mL組與對照組之間（p＜0.0001）、IL-2接合物0.4 mg/mL組與對照組之間（p＜0.0001）以及IL-2接合物0.08 mg/mL組與對照組之間（p＜0.0001）的顯著差異。
資料證明IL-2接合物增強了西妥昔單抗對表現EGFR的CAL27癌細胞的ADCC功能。使用IL-2接合物與同種型對照的組合時未觀察到顯著差異。
A431 細胞。
按照以上針對CAL27細胞概述的程序，使用表現EGFR的A431細胞（表皮樣癌）進行研究。 圖 2B示出了西妥昔單抗對表現EGFR的A431細胞的增強的ADCC功能（PBMC與A431的比率為50:1）。資料證明IL-2接合物增強了西妥昔單抗對表現EGFR的A431癌細胞的ADCC功能。 實例 4. 使用工程化細胞株 NK-92.CD16 V 作為效應細胞的 ADCC 測定。
使用鈣黃綠素-乙醯氧基甲基（鈣黃綠素-AM；Invitrogen）釋放測定檢查實例1的IL-2接合物對西妥昔單抗的ADCC功能的影響。
材料。
將NK-92.CD16 V（高親和力變異體）（Conkwest Inc.，加利福尼亞州聖地牙哥）用作效應細胞株。將以下細胞株用作靶細胞：CAL27、A431、DLD-1和FaDu。
使用以下試劑：西妥昔單抗抗體（Eli Lilly & Co.）；人同種型IgG1抗體（Biolegend）；鈣黃綠素-乙醯氧基甲基（Calcein-AM；Invitrogen C3100MP）和丙磺舒（Invitrogen；P36400）。生物測定培養基是補充有1%丙磺舒的含1%超低IgG胎牛血清的無酚紅RPMI，用於完全測定培養基。對於NK-92.CD16 V細胞培養物，使用補充有IL-2（100 U/mL）和氫化可的松（Sigma H6909；10 mL，50 μM）的MyeloCult H5100（Stemcell目錄號05150）。
程序。
從NK-92.CD16 V細胞培養物中取出IL-2補充物，然後在開始測定之前將所述細胞培養物培育過夜。第二天，在不同濃度（0.1 μg /mL、0.01 μg/mL、0.001 μg/mL和0 μg/mL）的IL-2_P65_[AzK_L1_PEG30kD]-1的存在下在補充有1%低IgG FBS的無酚紅RPMI 1640培養基中，在37ºC下在5% CO 2的加濕培養箱中，將細胞鋪板在96孔圓底板中（對於效應細胞與靶細胞的比率為3:1，鋪板60,000個細胞）持續18小時。將這些細胞用作效應細胞。第二天，將人EGFR陽性癌細胞株（A431、DLD-1、FaDu或CAL27）用鈣黃綠素-AM標記30 min（50 μg稀釋在25 μL DMSO中以製備儲備溶液，然後將10 μL鈣黃綠素儲備溶液添加到含有1%低IgG FBS和1%丙磺舒的4 mL RPMI 1640中，用於染色5 × 10 6個細胞），並且然後洗滌。將細胞分成幾個標記的管，用於與不同濃度的西妥昔單抗或同種型對照一起培育。以3X濃度添加西妥昔單抗和同種型人IgG1抗體（最終測定濃度為10 μg/mL至1 pg/mL），並且將標記的靶細胞和抗體混合並且允許靜置30 min以允許調理作用。此培育後，將靶細胞（20,000）和抗體添加到100 μL中的NK-92.CD16 V細胞上。將板以1100 rpm短暫離心1分鐘，然後在37ºC和5% CO 2下培育1小時。
培育後，像以前一樣再次將板短暫離心，並且在不干擾細胞的情況下將90 μL上清液從每個孔轉移到底部透明的黑色板。使用Envision 2104讀取螢光信號（激發：492 nm；發射：515 nm）。
為了最大化釋放，將細胞用2% Triton X-100裂解。從實驗釋放 (A)、靶細胞自發釋放 (B) 和靶細胞最大釋放 (C) 的螢光值中減去培養基背景的螢光值。
使用以下公式計算每個板（一式兩份）的細胞毒性和ADCC百分比： 細胞毒性 (%) = (A - B)/(C - B)×100 ADCC (%) = 細胞毒性 (%，有抗體) - 細胞毒性 (%，無抗體)
對於每個實驗，使用三個重複孔一式三份地進行測量。每個實驗至少重複3次。藉由使用GraphPad Prism 5（GraphPad Software, Inc.，加利福尼亞州聖地牙哥）將資料點擬合到4參數方程來計算半數最大有效濃度（EC50）值。
結果。
圖 3A-D中分別針對表現EGFR的A431（表皮樣癌）（NK92與A431的比率3:1）、DLD-1（腺癌、結直腸癌）（NK92與DLD-1的比率3:1）、FaDu（上皮鱗狀細胞癌）（NK92與FaDu的比率3:1）和CAL27（上皮鱗狀細胞癌）（NK92與CAL27的比率3:1）細胞，示出了使用NK92細胞株ADCC測定的細胞毒性資料。資料證明IL-2接合物增強了西妥昔單抗對表現EGFR的癌細胞的ADCC功能。 實例 5. 使用 IL-2 接合物和西妥昔單抗的組合療法的臨床研究。
概述。已經證明使用實例2的IL-2接合物的單一療法促進NK細胞數量的外周增加，NK細胞是介導IgG1抗體諸如西妥昔單抗的抗體依賴性細胞毒性（ADCC）的重要效應細胞。參見例如，2022年4月14日公開的Caffaro等人的WO 2022/076859 A1，將其出於所有目的藉由引用併入本文。
進行一項½期、開放標籤、多中心研究，以評估實例2中描述的IL-2接合物與西妥昔單抗組合用於治療患有晚期或轉移性實體瘤的參與者的臨床益處。
總共23名參與者每3週一次藉由靜脈內輸注接受IL-2接合物（16、24或32 μg/kg劑量）。在此處以及在此實例及所有其他實例的整個討論中，藥物質量/kg個體（例如，16 μg/kg）是指 除 PEG 和連接子質量外的IL-2質量。在第1週期第1天以400 mg/m 2的初始負載劑量經120分鐘輸注（最大輸注速率10 mg/min）西妥昔單抗，然後對於從第1週期第8天投予開始的所有後續劑量，經60分鐘輸注250 mg/m 2（最大輸注速率10 mg/min）。在每個21天週期的第1、8和15天給予西妥昔單抗。IL-2接合物的輸注時間各約30分鐘。對於每個治療週期，在投予IL-2接合物之前，至少一名參與者接受了IL-2接合物預前藥劑，以預防或減少輸注相關反應（IAR）或流感樣症狀的急性效應，在輸注IL-2接合物之前30至60分鐘。IL-2接合物預前藥劑如下：口服解熱藥和抗組胺藥（H1阻滯劑）。止吐藥由監督醫師酌情提供。在投予第一劑量的西妥昔單抗之前，至少一名參與者預先服用苯海拉明（約25至50 mg，靜脈內）。基於監督醫師的評估，用於後續劑量西妥昔單抗的預前藥劑是任選的。當在同一天給予IL-2接合物和西妥昔單抗時，接受作為西妥昔單抗預前藥劑的苯海拉明的參與者可以跳過作為IL-2接合物預前藥劑的苯海拉明。劑量順序如下：(i) 用於西妥昔單抗的預前藥劑（在開始西妥昔單抗輸注之前30-60 min）；(ii) 西妥昔單抗；(iii) 用於IL-2接合物的預前藥劑（在開始IL-2接合物輸注之前30-60 min投予）；和 (iv) IL-2接合物。重複治療最多總共35個週期或持續時間最多735天。
個體年齡範圍為從43至75，其中平均年齡60.7並且中位年齡65.0。所有個體均患有轉移性疾病。14名個體為男性，並且8名為女性。1名個體是西班牙裔或拉丁裔，20名不是西班牙裔或拉丁裔，並且2名未報告。11名個體是白人，1名是黑人或非裔美國人，7名是亞洲人，4名是其他人，並且1名未報告。5名個體的ECOG得分為0，並且18名個體的ECOG得分為1。先前線的全身療法如下：1名個體具有1線；4名個體具有2線；4名個體具有3線；7名個體具有4線；並且6名個體具有5+線。原發腫瘤類型包括11種結直腸癌（CRC）、1種非小細胞肺癌（NSCLC）、1種HNSCC和12種其他。
以下生物標記物用作安全性和/或功效的替代預測因數： 嗜酸性粒細胞增多症（外周嗜酸性粒細胞計數升高）：與血管滲漏症候群（VLS）相關的IL-2誘導的細胞（嗜酸性粒細胞）增殖的細胞替代標記物； 介白素 5 （ IL-5 ）：IL-2誘導的2型先天淋巴細胞活化和導致嗜酸性粒細胞增多症和潛在VLS的這種趨化介素釋放的細胞激素替代標記物； 介白素 6 （ IL-6 ）：IL-2誘導的細胞激素釋放症候群（CRS）的細胞激素替代標記物；以及 干擾素 γ （ IFN-γ ）：IL-2誘導的CD8+細胞毒性T淋巴細胞活化的細胞激素替代標記物。
以下生物標記物用作抗腫瘤免疫活性的替代預測因數： 外周 CD8+ 效應細胞：IL-2誘導的外周中這些靶細胞的增殖的標記物，在浸潤後成為誘導可能潛在治療反應的替代標記物； 外周 CD8+ 記憶細胞：IL-2誘導的外周中這些靶細胞的增殖的標記物，在浸潤後成為誘導可能持久的潛在治療和維持記憶群體的替代標記物； 外周 NK 細胞：IL-2誘導的外周中這些靶細胞的增殖的標記物，在浸潤後成為誘導可能快速治療反應的替代標記物；以及 外周 CD4+ 調節細胞：IL-2誘導的外周中這些靶細胞的增殖的標記物，在浸潤後成為誘導免疫抑制性TME和抵消基於效應物的治療作用的替代標記物。 使用 16 μg/kg 劑量的 IL-2 接合物的第一世代
結果。5名個體包括兩名人類男性和3名女性，其中中位年齡為69歲（範圍為65-72歲）。所有個體的東部腫瘤協作組（ECOG）體能狀態為0或1，並且已接受1至4線全身性療法。癌症是肛門癌（1名個體）、結腸腺癌（1名個體）、腎上腺皮質癌（1名個體）、肺鱗狀細胞癌（1名個體）和小腸癌（1名個體）。所有五名個體均患有轉移性疾病。
個體接受IL-2接合物（16 μg/kg）和西妥昔單抗組合治療，持續2-7個週期（2-7個劑量的IL-2接合物）。兩名個體（一名患有肛門癌並且一名患有轉移性腎上腺皮質癌）在2個週期的組合治療後顯示出進展性疾病（PD），導致中斷IL-2接合物和西妥昔單抗組合治療。一名患有結腸癌的個體在5個週期後顯示出疾病進展。兩名個體正在進行：一名在3個週期時具有肺鱗狀細胞癌，並且一名在7個週期時具有小腸癌。
測量外周CD8+ T eff細胞計數（ 圖 4）。在先前劑量後3週，在一些個體中觀察到超過基線的延長的CD8+擴增（例如，大於或等於2倍變化）。
圖 5示出了外周NK細胞計數。在每個個體中觀察到NK細胞計數的增加。在前一次劑量後8天和3週，個體總體上顯示出高於基線的NK細胞計數。
圖 6示出了外周CD4+ T reg計數。
測量嗜酸性粒細胞計數（ 圖 7）。如Pisani等人, Blood1991年9月15日;78(6):1538-44中報導的，在患有IL-2誘導的嗜酸性粒細胞增多症的患者中，測量值不超過四倍的增加並且始終低於2328-15958個嗜酸性粒細胞/μL的範圍。還測量淋巴細胞計數（ 圖 8A-B）。
結果總結和討論。所有測試個體在劑量後具有CD8+ T效應（Teff）細胞、NK細胞和CD4+ T reg細胞的外周擴增。
不良事件（AE）是投予藥物產品的臨床研究個體中的任何不良醫學事件，無論其原因如何。劑量限制性毒性定義為在治療週期的第1天至第29天（含）±1天內發生的AE，其不明確或不可爭議地僅與外來原因相關，並且滿足至少一個以下標準： • 3級嗜中性粒細胞減少症（絕對嗜中性粒細胞計數 ＜ 1000/mm 3＞ 500/mm 3）持續 ≥ 7天，或任何持續時間的4級嗜中性粒細胞減少症 • 3級+發熱性嗜中性粒細胞減少症 • 4級+血小板減少症（血小板計數 ＜ 25,000/mm 3） • 3級+血小板減少症（血小板計數 ＜ 50,000-25,000/mm 3），持續 ≥ 5天，或與臨床顯著出血或需要血小板輸注相關 • 未能在10天內滿足絕對嗜中性粒細胞計數為至少1,000個細胞/mm 3和血小板計數為至少75,000個細胞/mm 3的恢復標準 • 任何其他等級4+血液學毒性，持續 ≥ 5天 • 3級+ALT或AST以及膽紅素 ＞ 2倍ULN，無膽汁淤積或其他原因如病毒感染或其他藥物的證據（即Hy定律） • 預前藥劑發生3級輸注相關反應；4級輸注相關反應 • 3級血管滲漏症候群，定義為與體液瀦留和肺水腫相關的低血壓 • 3級+過敏反應 • 3級+低血壓 • 3級+AE，在開始接受標準護理醫療管理7天內未消退至 ＜ 2級 • 3級+細胞激素釋放症候群
以下例外情況適用於非血液學AE： • 3級疲勞、噁心、嘔吐或腹瀉，在 ≤ 3天內藉由最佳醫療管理消退至 ≤ 2級 • 3級發熱（定義為＞40ºC，持續≤24小時） • 3級輸注相關反應，在沒有預前藥劑的情況下發生；後續劑量應使用預前藥劑，並且如果反應復發，則為DLT • 3級關節痛或皮疹，在開始接受標準護理醫療管理（例如，全身皮質類固醇療法）7天內消退至 ≤ 2級
如果個體在基線時為1級或2級ALT或AST升高（被認為是間接致肝轉移），則3級升高也必須是 ≥ 3倍基線且持續 ＞ 7天。
嚴重AE定義為導致以下任何結局的任何AE：死亡；危及生命的AE；住院治療或延長現住院時間；進行正常生活功能的能力持續或嚴重喪失或進行正常生活功能的能力嚴重破壞；或先天性異常/出生缺陷。可能不會導致死亡、危及生命或需要住院治療的重要醫學事件在基於適當的醫學判斷可能危及個體並可能需要醫療或手術干預以防止以上所列結局中的一種時，可被視為嚴重事件。此類醫學事件的例子包括需要在急診室或家中進行強化治療的過敏性支氣管痙攣、不導致住院治療的血液惡液質或抽搐，或發生藥物依賴或藥物濫用。
IL-5沒有有意義的升高。沒有累積毒性。沒有終末器官毒性。沒有QTc延長或其他心臟毒性。總的來說，IL-2接合物被認為耐受性良好。
5名個體中有四名具有至少一種治療緊急AE（TEAE）。大多數TEAE是1-2級，一名個體具有至少一次3級，並且一名個體具有至少一次4級TEAE。四名個體具有治療相關AE。其中包括：一次1級輸注反應；一次1級噁心；一次1級疲勞；一次2級腹瀉；和一次4級淋巴細胞計數減少。兩名個體具有3次無關SAE：一次吞咽困難和脊髓受壓；和一次胸腔積液。TEAE沒有導致任何藥物中斷，沒有減少劑量，沒有DLT，並且沒有過敏反應或CRS。治療相關AE在公認的護理標準的情況下消退。表2詳述了TEAE，並且表3總結了治療相關不良事件。 表 2.治療緊急不良事件：n = 5。
系統器官分類 1 級 2 級 3 級 4 級 5 級
全身性障礙及投予部位狀況 2/5 (40%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%)
胃腸道障礙 2/5 (40%) 0/5 (0%) 1/5 (20%) 0/5 (0%) 0/5 (0%)
研究 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 1/5(20%) 0/5 (0%)
感染和侵染 0/5 (0%) 1/5 (20%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%)
損傷、手術併發症 2/5 (40%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%)
神經系統障礙 0/5 (0%) 0/5 (0%) 2/5(40%) 0/5 (0%) 0/5 (0%)
皮膚及皮下組織障礙 3/5 (60%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%)
血液及淋巴系統障礙 1/5 (20%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%)
眼部障礙 1/5 (20%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%)
代謝及營養障礙 1/5 (20%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%)
呼吸系統、胸及縱膈障礙 0/5 (0%) 1/5 (20%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%)
內分泌障礙 0/5 (0%) 1/5 (20%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%)
肌肉骨骼及結締組織障礙 1/5 (20%) 1/5 (20%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%)
精神障礙 1/5 (20%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%)
生殖和乳腺障礙 1/5 (20%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%)
腎臟及泌尿系統障礙 1/5 (20%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%)
表 3.治療相關不良事件：n = 5。
系統器官分類 1 級 2 級 3 級 4 級 5 級
內分泌障礙 0/5 (0%) 1/5 (20%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%)
全身性障礙及投予部位狀況 2/5 (40%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%)
胃腸道障礙 1/5 (20%) 1/5(205%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%)
研究 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 1/5 (20%) 0/5 (0%)
損傷、手術併發症 1/5 (20%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%) 0/5 (0%)
神經系統障礙 0/5 (0%) 0/5 (0%) 1/5(20%) 0/5 (0%) 0/5 (0%)
使用 24 μg/kg 劑量的 IL-2 接合物的第二世代
結果。五名個體接受24 μg/kg劑量的IL-2接合物。所有個體的東部腫瘤協作組（ECOG）體能狀態為1。一名個體接受1種先前線的療法，並且第二名個體接受4種先前線的療法。癌症包括鱗狀細胞癌（2名個體，其中一名是頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC））和腺癌（3名個體，其中兩名是結腸腺癌）。所有個體都患有晚期和/或轉移性疾病。個體接受IL-2接合物（24 μg/kg）和西妥昔單抗組合治療，持續1、2或3個週期（每個週期具有1個劑量的IL-2接合物）。一名個體在第一個週期的組合治療後顯示出進展性疾病（PD），並且第二名個體在第二個週期的組合治療後顯示出進展性疾病（PD），從而阻止投予進一步治療劑量的IL-2接合物和西妥昔單抗組合治療。截至1、2和3個治療週期，在其他三名個體中未觀察到進展性疾病。
一名患有HNSCC的75歲個體藉由3個治療週期達到部分反應（腫瘤大小減小41%），這在5個治療週期時再次得到證實（腫瘤大小減小70%）。截至18個治療週期未觀察到進展性疾病。此個體先前接受過放射療法、手術和兩線全身性療法，包括順鉑（約六週的持續時間）以及放射療法和切除術。在HNSCC復發後，個體接受了西米普利單抗（約三個月的持續時間），並且進展性疾病的反應最佳。
所有五名最初個體均經歷至少一次TEAE。三名個體具有3級TEAE（寒戰、熱病和嘔吐各一次）。存在需要住院的噁心、嘔吐和心動過速的相關SAE，這藉由支持性護理消退。一名個體經歷IL-6升高至約1876 pg/mL而沒有任何症狀。
至少在最初的個體中，沒有觀察到DLT，並且沒有因TEAE導致的藥物中斷。表4中詳述了納入的前三名個體的TEAE，並且表5中總結了納入的前三名個體的治療相關不良事件。 表 4.治療緊急不良事件：n = 3。
系統器官分類 1 級 2 級 3 級 4 級 5 級
胃腸道障礙 0/3 (0%) 1/3 (33.3%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%)
全身性障礙及投予狀況 1/3 (33.3%) 0/3 (0%) 1/3 (33.3%) 0/3 (0%) 0/3 (0%)
感染和侵染 0/3 (0%) 2/3 (66.7%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%)
代謝及營養障礙 0/3 (0%) 2/3 (66.7%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%)
肌肉骨骼及結締組織障礙 1/3 (33.3%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%)
神經系統障礙 0/3 (0%) 1/3 (33.3%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%)
腎臟及泌尿系統障礙 1/3 (33.3%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%)
呼吸系統及縱膈障礙 0/3 (0%) 1/3 (33.3%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%)
皮膚及皮下組織障礙 1/3 (33.3%) 1/3 (33.3%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%)
表 5.治療相關不良事件：n = 3。
系統器官分類 1 級 2 級 3 級 4 級 5 級
胃腸道障礙 0/3 (0%) 1/3 (33.3%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%)
全身性障礙及投予狀況 1/3 (33.3%) 0/3 (0%) 1/3 (33.3%) 0/3 (0%) 0/3 (0%)
感染和侵染 0/3 (0%) 2/3 (66.7%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%)
代謝及營養障礙 0/3 (0%) 2/3 (66.7%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%)
神經系統障礙 0/3 (0%) 1/3 (33.3%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%)
呼吸系統及縱膈障礙 0/3 (0%) 1/3 (33.3%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%)
皮膚及皮下組織障礙 0/3 (0%) 1/3 (33.3%) 0/3 (0%) 0/3 (0%) 0/3 (0%)
測量外周CD8+ T eff細胞計數（ 圖 9）。在一些個體中觀察到超過基線的CD8+擴增（例如，約2倍的變化）。
圖 10示出了外周NK細胞計數。在每個個體中觀察到NK細胞計數的增加。在劑量後的一個或多個時間點，個體總體上顯示出高於基線的NK細胞計數。
圖 11示出了外周CD4+ T reg計數。
測量嗜酸性粒細胞計數（ 圖 12）。如Pisani等人, Blood1991年9月15日;78(6):1538-44中報導的，在患有IL-2誘導的嗜酸性粒細胞增多症的患者中，測量值不超過三倍的增加並且始終低於2328-15958個嗜酸性粒細胞/μL的範圍。還測量mCD8淋巴細胞計數（ 圖 13A-B）。
圖 14示出了四名個體的IFN-γ、IL-6和IL-5血清水準。如上所提及，經歷IL-6增加至約1876 pg/mL的個體沒有經歷IL-6相關AE。 使用 32 μg/kg 劑量的 IL-2 接合物的第三世代
六名患有晚期和/或轉移性癌症（包括結直腸癌（例如，結直腸腺癌）、結腸癌、壺腹癌、食管鱗狀細胞癌和胰腺癌）的個體接受32 μg/kg劑量的IL-2接合物。個體接受IL-2接合物（32 μg/kg）和西妥昔單抗組合治療，持續2-5個週期（2-5個劑量的IL-2接合物）。一名個體在第2週期後停止接受PD治療。另一名個體接受格拉司瓊和苯海拉明的預前藥劑，並且停止接受PD治療。對於另一位個體，掃描顯示出疾病進展，但個體在疾病進展後繼續治療到至少第3週期；隨後記錄到個體具有疾病進展。另一名個體（結直腸腺癌）在第5週期時仍在進行。一名個體實現了穩定疾病的最佳反應。其中一名個體（胰腺癌）繼續療法直到在第4週期第15天的PD。
圖 15示出了個體的外周CD8+ T eff細胞計數。 圖 16示出了個體的外周NK細胞計數。 圖 17示出了個體的外周CD4+ T reg計數。 圖 18示出了個體的嗜酸性粒細胞計數。在32 μg/kg Q3W的IL-2接合物 + 西妥昔單抗的情況下CD8+細胞和NK細胞的擴增似乎高於24 μg/kg Q3W的IL-2接合物 + 西妥昔單抗的情況。在32 μg/kg Q3W的IL-2接合物 + 西妥昔單抗的情況下T reg細胞的擴增似乎是與24 μg/kg Q3W的IL-2接合物 + 西妥昔單抗的情況可比較的。
圖 19示出了示出了在投予IL-2接合物後的指定時間用32 μg/kg的IL-2接合物和西妥昔單抗的組合治療的所指示個體中IFN-γ、IL-5和IL-6的血清水準。一名個體出現約250 pg/mL的IL-6水準，且沒有指示CRS的症狀。IL-5沒有升高。
不良事件包括1級發熱、寒戰、心動過速、噁心；2級疲勞、鞘膜積液和脫水；2級寒戰和低磷血症（被認為與西妥昔單抗有關）；被認為與西妥昔單抗相關的1級指甲變化（無其他相關TEAE）；1級噁心、嘔吐；1級幹性皮膚；1級CRS；2級疲勞和厭食以及口腔潰瘍（被認為與IL-2接合物無關）；2級CRS；3級室上性心動過速；和3級轉胺酶升高。六名個體中有五名（83.3%）經歷了至少一次TEAE。六名個體中有兩名（33.3%）經歷了至少一次G3-4相關TEAE。沒有DLT或由TEAE導致的藥物中斷。兩名個體在第2週期第1天減少劑量，並且都繼續治療。六名患者中有四名（66.7%）經歷了SAE，並且六名患者中有兩名（33.3%）具有三次治療相關SAE。
表6中詳述了六名個體的TEAE，並且表7中總結了六名個體的治療相關不良事件。 表 6.治療緊急不良事件：n = 6。
系統器官分類 1 級 2 級 3 級 4 級 5 級
血液及淋巴障礙 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
胃腸道障礙 5/6 (83.3%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
皮膚及皮下組織障礙 6/6 (100.0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
全身性障礙及投予狀況 3/6 (50%) 3/6 (50.0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
代謝及營養障礙 1/6 (16.7%) 3/6 (50.0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
呼吸系統及胸障礙 2/6 (33.3%) 0/6 (0%) 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 1/6 (16.7%)
眼部障礙 2/6 (33.3%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
心臟障礙 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
免疫系統障礙 1/6 (16.7%) 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
感染和侵染 0/6 (0%) 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
肌肉骨骼障礙 0/6 (0%) 0/6 (0%) 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
神經系統障礙 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
生殖障礙 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
表 7.治療相關不良事件：n = 6。
系統器官分類 1 級 2 級 3 級 4 級 5 級
胃腸道障礙 4/6 (66.7%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
全身性障礙及投予狀況 4/6 (66.7%) 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
代謝及營養障礙 1/6 (16.7%) 2/6 (33.3%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
皮膚及皮下組織障礙 1/6 16.7%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
心臟障礙 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
眼部障礙 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
免疫系統障礙 1/6 (16.7%) 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
呼吸系統障礙 1/6 (16.7%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%) 0/6 (0%)
總體而言，對於接受西妥昔單抗的16 μg/kg和24 μg/kg世代，觀察到CD8+ T細胞（比基線高1.3至7.57倍）和NK細胞（比基線高3.6至45.4倍）持續增加。未觀察到血管滲漏症候群、QTc延長、心臟或終末器官毒性或IL-5升高。沒有與IL-6增加相關的AE。對IL-6水準的影響本質上是短暫的。此外，CD4和嗜酸性粒細胞水準分別不超過150個細胞/μL和1,100個細胞/μL。最常見的AE包括熱病、噁心、流感樣症狀、嘔吐、寒戰、疲勞和AST升高。AE通常藉由支持性護理迅速消退。(G) 3/4級相關AE包括ALT/AST升高和淋巴細胞計數減少（在48-72小時內恢復，淋巴細胞遷移在機制上與免疫細胞著邊一致）。在兩名患者中觀察到G3/4 CRS。
對於接受西妥昔單抗的32 μg/kg世代，兩名個體具有用支援性療法管理的低級CRS。其中一名個體具有G3轉胺酶升高，在四天內恢復。一名個體具有G3室上性心動過速。一名個體具有G4降低的淋巴細胞計數。沒有DLT。未觀察到累積毒性、QTc延長、終末器官毒性或有意義的IL-5升高。基於安全性、NK細胞擴增、T細胞擴增和細胞激素，此劑量似乎是可以耐受的。
用16、24或32 μg/kg的IL-2接合物與西妥昔單抗的組合治療的個體的外周NK細胞計數示出在 圖 20A（第1和2週期）和 圖 20B（第4和5週期）中。用16、24或32 μg/kg的IL-2接合物與西妥昔單抗的組合治療的個體的外周CD8+ T eff細胞計數示出在 圖 21A（第1和2週期）和 圖 21B（第4和5週期）中。用16、24或32 μg/kg的IL-2接合物與西妥昔單抗的組合治療的個體的外周CD4+ T reg計數示出在 圖 22A（第1和2週期）和 圖 22B（第4和5週期）中。用16、24或32 μg/kg的IL-2接合物與西妥昔單抗的組合治療的個體的嗜酸性粒細胞計數示出在 圖 23A（第1和2週期）和 圖 23B（第4和5週期）中。
雖然在本文已經顯示和描述了本發明的優選實施例，但對於熟習此項技術者而言將明顯的是，此類實施例僅藉由舉例的方式來提供。在不背離本發明的情況下，熟習此項技術者現在將想到許多變型、改變和替換。應當理解的是，本文所述的本發明的實施例的各種替代方案可以用於實踐本發明。以下申請專利範圍旨在限定本發明的範圍，並且由此涵蓋這些申請專利範圍及其等同物範圍內的方法和結構。
無
本發明的新穎特徵在隨附申請專利範圍中具體闡述。將藉由參考陳述利用本發明原理的說明性實施例的以下具體描述和附圖獲得對本發明的特徵和優點的更好的理解，在所述附圖中：
圖 1A-C示出了與3個單獨的供體人PBMC和不同量的IL-2接合物和西妥昔單抗共培養的CAL27細胞中的細胞毒性%。
圖 2A示出了與人PBMC和不同量的IL-2接合物和西妥昔單抗共培養的CAL27細胞中的細胞毒性%。
圖 2B示出了與人PBMC和不同量的IL-2接合物和西妥昔單抗共培養的A431細胞中的細胞毒性%。
圖 3A示出了對與NK92細胞共培養並且用不同量的IL-2接合物和西妥昔單抗處理的A431細胞中的細胞毒性作用。
圖 3B示出了對與人NK92細胞共培養並且用不同量的IL-2接合物和西妥昔單抗處理的DLD-1細胞中的細胞毒性%。
圖 3C示出了對與NK92細胞共培養並且用不同量的IL-2接合物和西妥昔單抗處理的FaDu細胞的細胞毒性%。
圖 3D示出了對與人NK92細胞共培養並且用不同量的IL-2接合物和西妥昔單抗處理的CAL27細胞中的細胞毒性%。
圖 4示出了在投予IL-2接合物後的指定時間用16 μg/kg的IL-2接合物與西妥昔單抗的組合治療的所指示個體中的外周CD8+ T eff細胞計數。
圖 5示出了在投予IL-2接合物後的指定時間用16 μg/kg的IL-2接合物與西妥昔單抗的組合治療的所指示個體中的外周NK細胞計數。
圖 6示出了在投予IL-2接合物後的指定時間用16 μg/kg的IL-2接合物與西妥昔單抗的組合治療的所指示個體中外周CD4+ T reg細胞計數。
圖 7示出了在投予IL-2接合物後的指定時間用16 μg/kg的IL-2接合物與西妥昔單抗的組合治療的所指示個體中的嗜酸性粒細胞計數。
圖 8A示出了在投予IL-2接合物後的指定時間用16 μg/kg的IL-2接合物與西妥昔單抗的組合治療的所指示個體中的淋巴細胞計數。
圖 8B示出了在投予IL-2接合物後的指定時間用16 μg/kg的IL-2接合物與西妥昔單抗的組合治療的所指示個體中的淋巴細胞計數變化。將資料相對治療前（C1D1）淋巴細胞計數歸一化。
圖 9示出了在投予IL-2接合物後的指定時間用24 μg/kg的IL-2接合物與西妥昔單抗的組合治療的所指示個體中的外周CD8+ T eff細胞計數。
圖 10示出了在投予IL-2接合物後的指定時間用24 μg/kg的IL-2接合物和西妥昔單抗的組合治療的所指示個體中的外周NK細胞計數。
圖 11示出了在投予IL-2接合物後的指定時間用24 μg/kg的IL-2接合物與西妥昔單抗的組合治療的所指示個體中外周CD4+ T reg細胞計數。
圖 12示出了在投予IL-2接合物後的指定時間用24 μg/kg的IL-2接合物與西妥昔單抗的組合治療的所指示個體中的嗜酸性粒細胞計數。
圖 13A示出了在投予IL-2接合物後的指定時間用24 μg/kg的IL-2接合物與西妥昔單抗的組合治療的所指示個體中的淋巴細胞計數。
圖 13B示出了在投予IL-2接合物後的指定時間用24 μg/kg的IL-2接合物與西妥昔單抗的組合治療的所指示個體中的淋巴細胞計數變化。將資料相對治療前（C1D1）淋巴細胞計數歸一化。
圖 14示出了在投予IL-2接合物後的指定時間用24 μg/kg的IL-2接合物和西妥昔單抗的組合治療的所指示個體中IFN-γ、IL-5和IL-6的血清水準。
圖 15示出了在投予IL-2接合物後的指定時間用32 μg/kg的IL-2接合物與西妥昔單抗的組合治療的所指示個體中的外周CD8+ T eff細胞計數。
圖 16示出了在投予IL-2接合物後的指定時間用32 μg/kg的IL-2接合物和西妥昔單抗的組合治療的所指示個體中的外周NK細胞計數。
圖 17示出了在投予IL-2接合物後的指定時間用32 μg/kg的IL-2接合物與西妥昔單抗的組合治療的所指示個體中外周CD4+ T reg細胞計數。
圖 18示出了在投予IL-2接合物後的指定時間用32 μg/kg的IL-2接合物與西妥昔單抗的組合治療的所指示個體中的嗜酸性粒細胞計數。
圖 19示出了在投予IL-2接合物後的指定時間用32 μg/kg的IL-2接合物和西妥昔單抗的組合治療的所指示個體中IFN-γ、IL-5和IL-6的血清水準。#：在CsD1 POST時，個體4001-00116的1876 pg/mL的最大IFN-γ值高於測定的線性範圍。
圖 20A示出了在第1和2週期期間個體的外周NK細胞計數。將個體用16、24或32 μg/kg的IL-2接合物與西妥昔單抗的組合治療。
圖 20B示出了在第4和5週期期間個體的外周NK細胞計數。將個體用16、24或32 μg/kg的IL-2接合物與西妥昔單抗的組合治療。
圖 21A示出了在第1和2週期期間個體的外周CD8+ T eff細胞計數。將個體用16、24或32 μg/kg的IL-2接合物與西妥昔單抗的組合治療。
圖 21B示出了在第4和5週期期間個體的外周CD8+ T eff細胞計數。將個體用16、24或32 μg/kg的IL-2接合物與西妥昔單抗的組合治療。
圖 22A示出了在第1和2週期期間個體的外周CD4+ T reg細胞計數。將個體用16、24或32 μg/kg的IL-2接合物與西妥昔單抗的組合治療。
圖 22B示出了在第4和5週期期間個體的外周CD4+ T reg細胞計數。將個體用16、24或32 μg/kg的IL-2接合物與西妥昔單抗的組合治療。
圖 23A示出了在第1和2週期期間個體的嗜酸性粒細胞計數。將個體用16、24或32 μg/kg的IL-2接合物與西妥昔單抗的組合治療。
圖 23B示出了在第4和5週期期間個體的嗜酸性粒細胞計數。將個體用16、24或32 μg/kg的IL-2接合物與西妥昔單抗的組合治療。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002

Claims (44)

  1. 一種治療有需要的個體的頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）的方法，所述方法包括向所述個體投予 (a) IL-2接合物和 (b) 西妥昔單抗(cetuximab)，其中： 所述HNSCC是復發性和/或轉移性HNSCC；並且 所述IL-2接合物包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，其中位置P64處的胺基酸被式 (I) 的結構替代：
    Figure 03_image001
    式 (I) 其中： Z是CH 2並且Y是
    Figure 03_image003
    ； Y是CH 2並且Z是
    Figure 03_image005
    ； Z是CH 2並且Y是
    Figure 03_image006
    ；或 Y是CH 2並且Z是
    Figure 03_image008
    ； W是具有約25 kDa-35 kDa的平均分子量的PEG基團； q是1、2或3； X是具有以下結構的L-胺基酸：
    Figure 03_image010
    ； X-1指示與前一個胺基酸殘基的附接點；並且 X+1指示與後一個胺基酸殘基的附接點。
  2. 一種治療有需要的個體的頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）的方法，所述方法包括： 選擇患有HNSCC的個體，其中所述個體是至少部分地基於所述個體患有復發性和/或轉移性HNSCC而選擇的；以及 向所述個體投予 (a) IL-2接合物和 (b) 西妥昔單抗，其中： 所述IL-2接合物包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，其中位置P64處的胺基酸被式 (I) 的結構替代：
    Figure 03_image001
    式 (I) 其中： Z是CH 2並且Y是
    Figure 03_image003
    ； Y是CH 2並且Z是
    Figure 03_image005
    ； Z是CH 2並且Y是
    Figure 03_image006
    ；或 Y是CH 2並且Z是
    Figure 03_image008
    ； W是具有約25 kDa-35 kDa的平均分子量的PEG基團； q是1、2或3； X是具有以下結構的L-胺基酸：
    Figure 03_image010
    ； X-1指示與前一個胺基酸殘基的附接點；並且 X+1指示與後一個胺基酸殘基的附接點。
  3. 一種治療有需要的個體的頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）的方法，所述方法包括向所述個體投予 (a) 從8 μg/kg至32 μg/kg的作為IL-2接合物的IL-2和 (b) 西妥昔單抗，其中： 所述IL-2接合物包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，其中位置P64處的胺基酸被式 (I) 的結構替代：
    Figure 03_image001
    式 (I) 其中： Z是CH 2並且Y是
    Figure 03_image003
    ； Y是CH 2並且Z是
    Figure 03_image005
    ； Z是CH 2並且Y是
    Figure 03_image006
    ；或 Y是CH 2並且Z是
    Figure 03_image008
    ； W是具有約25 kDa-35 kDa的平均分子量的PEG基團； q是1、2或3； X是具有以下結構的L-胺基酸：
    Figure 03_image010
    ； X-1指示與前一個胺基酸殘基的附接點；並且 X+1指示與後一個胺基酸殘基的附接點。
  4. 如請求項1-3中任一項所述的方法，其中所述個體先前未用西妥昔單抗治療過。
  5. 如請求項1-4中任一項所述的方法，其中所述個體患有鉑難治性HNSCC。
  6. 如請求項1-5中任一項所述的方法，其中所述個體先前治療過HNSCC，並且先前對HNSCC的治療包括不超過兩種方案的失敗。
  7. 如請求項1-6中任一項所述的方法，其中所述個體患有鉑難治性HNSCC，並且所述個體先前對HNSCC的治療包括一種方案的失敗。
  8. 如請求項1-6中任一項所述的方法，其中所述個體患有鉑難治性HNSCC，並且所述個體先前對HNSCC的治療包括兩種方案的失敗。
  9. 如請求項1-8中任一項所述的方法，所述方法包括向所述個體投予約8 μg/kg至32 μg/kg的所述IL-2接合物。
  10. 如請求項1-9中任一項所述的方法，所述方法包括向所述個體投予約8 μg/kg的所述IL-2接合物。
  11. 如請求項1-9中任一項所述的方法，所述方法包括向所述個體投予約16 μg/kg的所述IL-2接合物。
  12. 如請求項1-9中任一項所述的方法，所述方法包括向所述個體投予約24 μg/kg的所述IL-2接合物。
  13. 如請求項1-9中任一項所述的方法，所述方法包括向所述個體投予約32 μg/kg的所述IL-2接合物。
  14. 如請求項1-13中任一項所述的方法，其中在所述IL-2接合物中，所述PEG基團具有約30 kDa的平均分子量。
  15. 如請求項1-14中任一項所述的方法，其中在所述IL-2接合物中，Z是CH 2並且Y是
    Figure 03_image003
    。
  16. 如請求項1-14中任一項所述的方法，其中在所述IL-2接合物中，Y是CH 2並且Z是
    Figure 03_image003
    。
  17. 如請求項1-14中任一項所述的方法，其中在所述IL-2接合物中，Z是CH 2並且Y是
    Figure 03_image008
    。
  18. 如請求項1-14中任一項所述的方法，其中在所述IL-2接合物中，Y是CH 2並且Z是
    Figure 03_image008
    。
  19. 如請求項1-14中任一項所述的方法，其中所述式 (I) 的結構具有式 (IV) 或式 (V) 的結構或是式 (IV) 和式 (V) 的混合物：
    Figure 03_image021
    式 (IV)；
    Figure 03_image023
    式 (V)； 其中： W是具有約25 kDa-35 kDa的平均分子量的PEG基團； q是1、2或3； X是具有以下結構的L-胺基酸：
    Figure 03_image010
    ； X-1指示與前一個胺基酸殘基的附接點；並且 X+1指示與後一個胺基酸殘基的附接點。
  20. 如請求項1-14中任一項所述的方法，其中所述式 (I) 的結構具有式 (XII) 或式 (XIII) 的結構或是式 (XII) 和式 (XIII) 的混合物：
    Figure 03_image026
    式 (XII)；
    Figure 03_image028
    式 (XIII)； 其中： n是整數，使得-(OCH 2CH 2) n-OCH 3具有約30 kDa的分子量； q是1、2或3；並且 波浪線指示與SEQ ID NO: 1中未被替代的胺基酸殘基的共價鍵。
  21. 如請求項1-20中任一項所述的方法，其中q是1。
  22. 如請求項1-20中任一項所述的方法，其中q是2。
  23. 如請求項1-20中任一項所述的方法，其中q是3。
  24. 如請求項1-23中任一項所述的方法，其中所述平均分子量是數均分子量。
  25. 如請求項1-23中任一項所述的方法，其中所述平均分子量是重均分子量。
  26. 如請求項1-25中任一項所述的方法，其中約每兩週一次、約每三週一次或約每4週一次向所述個體投予所述IL-2接合物。
  27. 如請求項1-26中任一項所述的方法，其中約每兩週一次、約每三週一次或約每4週一次向所述個體投予所述IL-2接合物和西妥昔單抗。
  28. 如請求項1-27中任一項所述的方法，其中所述IL-2接合物是醫藥上可接受的鹽、溶劑合物或水合物。
  29. 如請求項1-28中任一項所述的方法，其中西妥昔單抗的初始劑量以約400 mg/m 2的劑量投予，並且西妥昔單抗的後續劑量以約250 mg/m 2的劑量投予。
  30. 如請求項1-29中任一項所述的方法，其中在所述IL-2接合物之前投予西妥昔單抗。
  31. 如請求項1-30中任一項所述的方法，其中所述IL-2接合物和西妥昔單抗單獨地投予。
  32. 如請求項31所述的方法，其中所述IL-2接合物和西妥昔單抗依序地投予。
  33. 如請求項32所述的方法，其中在西妥昔單抗之後投予所述IL-2接合物。
  34. 如請求項1-33中任一項所述的方法，其中藉由皮下投予向所述個體投予所述IL-2接合物。
  35. 如請求項1-34中任一項所述的方法，其中其中藉由皮下投予向所述個體投予所述IL-2接合物和西妥昔單抗。
  36. 如請求項1-33中任一項所述的方法，其中藉由靜脈內投予向所述個體投予所述IL-2接合物。
  37. 如請求項1-33和36中任一項所述的方法，其中其中藉由靜脈內投予向所述個體投予所述IL-2接合物和西妥昔單抗。
  38. 如請求項1-37中任一項所述的方法，其進一步包括向所述個體投予對乙醯胺基酚。
  39. 如請求項1-38中任一項所述的方法，其進一步包括向所述個體投予苯海拉明(diphenhydramine)。
  40. 如請求項1-39中任一項所述的方法，其進一步包括向所述個體投予昂丹司瓊(ondansetron)。
  41. 如請求項38-40中任一項所述的方法，其中在投予所述IL-2接合物之前向所述個體投予所述對乙醯胺基酚、苯海拉明和/或昂丹司瓊。
  42. 如請求項38-40中任一項所述的方法，其中在投予西妥昔單抗之前向所述個體投予所述對乙醯胺基酚、苯海拉明和/或昂丹司瓊。
  43. 一種用於如請求項1-42中任一項所述的方法中的IL-2接合物。
  44. 一種IL-2接合物用於製造用於如請求項1-42中任一項所述的方法的藥劑之用途。
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