TW202302148A - 使用ｉｌ－２接合物和抗ｐｄ－１抗體或其抗原結合片段的肺癌組合療法 - Google Patents

使用ｉｌ－２接合物和抗ｐｄ－１抗體或其抗原結合片段的肺癌組合療法 Download PDF

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卡羅來納 卡法羅
布麗吉特 德默斯
約瑟夫 萊韋克
孟琬如
杰羅德 普塔辛
馬科斯 米拉
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Abstract

本發明涉及一種本文公開了用於在有需要的受試者中治療肺癌的方法，其包括組合投予IL-2接合物與抗PD-1抗體或其抗原結合片段（例如，派姆單抗）。

Description

使用IL-2接合物和抗PD-1抗體或其抗原結合片段的肺癌組合療法
相關申請的交叉引用
本申請要求2021年2月12日提交的美國臨時申請號63/149,078、2021年10月8日提交的美國臨時申請號63/253,903和2021年11月8日提交的美國臨時申請號63/276,954的優先權，其每一個的公開內容通過引用以其整體特此併入。
本發明涉及一種本文公開了用於在有需要的受試者中治療肺癌的方法，其包括組合投予IL-2接合物與抗PD-1抗體或其抗原結合片段（例如，派姆單抗）。
不同的T細胞群調節免疫系統以維持免疫穩態和耐受性。例如，調節性T（Treg）細胞通過防止病理性自身反應性來防止免疫系統的不適當反應，而細胞毒性T細胞靶向並破壞感染的細胞和/或癌細胞。在一些情況下，不同T細胞群的調節為疾病或適應證的治療提供選擇。
細胞激素包括細胞信號傳導蛋白的家族，如趨化介素、干擾素、介白素、淋巴介素、腫瘤壞死因子以及在先天性和適應性免疫細胞穩態中發揮作用的其他生長因子。細胞激素是由免疫細胞（如巨噬細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞和肥大細胞、內皮細胞、成纖維細胞和不同的基質細胞）產生的。在一些情況下，細胞激素調節體液免疫反應與基於細胞的免疫反應之間的平衡。
介白素是調節以下細胞的發育和分化的信號傳導蛋白：T淋巴細胞和B淋巴細胞、單核細胞譜系的細胞、嗜中性白血球、嗜鹼性白血球、嗜酸性白血球、巨核細胞和造血細胞。介白素是由輔助CD4+ T和B淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、內皮細胞和其他組織駐留細胞產生的。
在一些情況下，介白素2（IL-2）信號傳導用於調節T細胞反應，且隨後用於治療癌症。
PD-1被認為是免疫調節和維持外周耐受性中的重要角色。PD-1在幼稚T、B和NKT細胞上適度表現，並通過淋巴細胞、單核細胞和骨髓細胞上的T/B細胞受體信號傳導上調（Sharpe等人, The function of programmed cell death 1 and its ligands in regulating autoimmunity and infection. Nature Immunology(2007); 8:239-245）。
PD-1的兩種已知配體PD-L1（B7-H1）和PD-L2（B7-DC）在各種組織中產生的人類癌症中表現。在例如卵巢癌、腎癌、結直腸癌、胰腺癌、肝癌和黑色素瘤的大樣品組中，顯示出PD-L1表現與不良預後和降低的總存活期相關，而與隨後的治療無關（Dong等人, Nat Med.8(8):793-800 (2002)；Yang等人 Invest Ophthalmol Vis Sci. 49: 2518- 2525 (2008)；Ghebeh等人 Neoplasia8:190-198 (2006)；Hamanishi等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104: 3360-3365 (2007)；Thompson等人, Cancer5: 206-211 (2006)；Nomi等人, Clin. Cancer Research13:2151-2157 (2007)；Ohigashi等人, Clin. Cancer Research11: 2947-2953 (2005)；Inman等人, Cancer109: 1499-1505 (2007)；Shimauchi等人 Int. J. Cancer121:2585-2590 (2007)；Gao等人 Clin. Cancer Research15: 971-979 (2009)；Nakanishi J. Cancer Immunol Immunother. 56: 1173- 1182 (2007)；和Hino等人, Cancer00: 1-9 (2010)）。
類似地，發現腫瘤浸潤淋巴細胞上的PD-1表現標記乳腺癌和黑色素瘤中的功能失調性T細胞（Ghebeh等人, BMC Cancer. 2008 8:5714-15 (2008)；Ahmadzadeh等人, Blood114: 1537-1544 (2009)），並發現所述PD-1表現與腎癌中的不良預後相關（Thompson等人, Clinical Cancer Research15: 1757-1761(2007)）。因此，已提出表現PD-L1的腫瘤細胞與表現PD-1的T細胞相互作用以減弱T細胞啟動和逃避免疫監視，從而導致對腫瘤的免疫反應受損。
靶向PD-1軸的免疫檢查點療法已導致多種人類癌症的臨床反應的突破性改善（Brahmer等人, N Engl J Med2012, 366: 2455-65；Garon等人 N Engl J Med2015, 372: 2018-28；Hamid等人, N Engl J Med2013, 369: 134-44；Robert等人, Lancet2014, 384: 1109-17；Robert等人, N Engl J Med2015, 372: 2521-32；Robert等人, N Engl J Med2015, 372: 320-30；Topalian等人, N Engl J Med2012, 366: 2443-54；Topalian等人, J Clin Oncol2014, 32: 1020-30；Wolchok等人, N Engl J Med2013, 369: 122-33）。靶向PD-1軸的免疫療法包括針對PD-1受體的單株抗體（KEYTRUDA（派姆單抗）, Merck and Co., Inc., 凱尼爾沃思（Kenilworth）, 新澤西州, 美國，和OPDIVO（納武單抗）, Bristol-Myers Squibb Company, 普林斯頓（Princeton）, 新澤西州, 美國）以及與PD-L1配體結合的那些（MPDL3280A；TECENTRIQ™（阿特利珠單抗）, Genentech, 三藩市, 加利福尼亞州, 美國；IMFINZI（度伐魯單抗）, AstraZeneca Pharmaceuticals LP, 威爾明頓, 德拉瓦州；BAVENCIO（阿維魯單抗）, Merck KGaA, 達姆施塔特, 德國）。兩種治療方法均已證明在許多癌症類型中具有抗腫瘤作用。
因此，在一個方面，本文提供了治療受試者中的肺癌的方法，其包括組合投予IL-2接合物與抗PD-1抗體或其抗原結合片段，例如抗PD-1抗體派姆單抗。
本文描述了在有需要的受試者中治療癌症的方法，其包括向受試者投予 (a) 約8 μg/kg、16 μg/kg、24 μg/kg或32 μg/kg的IL-2接合物，和 (b) 抗PD-1抗體或其抗原結合片段，其中所述IL-2接合物包含在位置64處具有本文所述的非天然胺基酸殘基的SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，例如SEQ ID NO: 2的胺基酸序列，其中所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO: 11、12和13中所示的胺基酸序列之輕鏈互補決定區（CDR）和包含SEQ ID NO: 16、17和18中所示的胺基酸序列之重鏈CDR。
在一些實施例中，相對於現有療法，投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段在肺癌或其亞型的治療中提供改善的結果。例如，改善的結果可以是在有利結局的頻率方面，如完全反應、目標病變的消除、目標病變尺寸的減小、部分反應、疾病穩定、目標目標病變生長減慢。在一些實施例中，相對於現有的肺癌或IL-2療法，或相對於單獨使用所述IL-2接合物或所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段的單一療法，投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段提供了改善的安全性。例如，改善的安全性可以是在避免或減少不良事件的頻率方面，所述不良事件如4級不良事件；血管滲漏症候群（例如2級、3級和/或4級血管滲漏症候群）；毛細血管滲漏症候群；血漿蛋白和流體外滲到受試者的血管外空間中；受試者的低血壓和/或器官灌注減少；受試者嗜中性白血球功能受損；投予後受試者的平均動脈血壓下降；收縮壓低於90 mm Hg或從基線收縮壓下降20 mm Hg；嗜酸性白血球增多症；水腫或腎功能或肝功能受損；或受試者降低的趨化性。在一些實施例中，改善的安全性可以是在以下方面：受試者沒有增加的播散性感染風險；受試者自身免疫病或發炎病症的預先存在的或初始的表現沒有惡化。在一些實施例中，投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段提供了在以下方面的改善的結果：以上討論的或本文別處公開的一種或多種有利結局或其頻率與以上討論的或本文別處公開的一種或多種安全性改善的組合。
例示性實施例包括以下內容。實施例1是一種在有需要的受試者中治療肺癌的方法，其包括向所述受試者投予 (a) IL-2接合物，和 (b) 抗PD-1抗體或其抗原結合片段，其中： 所述IL-2接合物包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，其中位置P64處的胺基酸被式 (I) 的結構替代：
Figure 02_image001
式 (I) 其中： Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image003
； Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image005
； Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image006
；或者 Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image008
； W是具有約25 kDa-35 kDa的平均分子量的PEG基團； q是1、2或3； X是具有以下結構的L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1表示與前一個胺基酸殘基的附接點；以及 X+1表示與後一個胺基酸殘基的附接點， 其中所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO: 11、12和13中所示的胺基酸序列之輕鏈互補決定區（CDR）以及包含SEQ ID NO: 16、17和18中所示的胺基酸序列之重鏈CDR。
實施例2是一種在有需要的受試者中治療肺癌的方法，其包括向所述受試者投予 (a) IL-2接合物，和 (b) 抗PD-1抗體或其抗原結合片段，其中： 所述肺癌是非鱗狀非小細胞肺癌（NSCLC）、胸膜間皮瘤、不可切除的肺癌、IV期肺癌、PD-L1腫瘤比例得分大於或等於50%的NSCLC、或PD-L1腫瘤進展得分小於50%或為1%-49%的NSCLC；以及 所述IL-2接合物包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，其中位置P64處的胺基酸被式 (I) 的結構替代：
Figure 02_image001
式 (I) 其中： Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image003
； Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image005
； Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image006
；或者 Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image008
； W是具有約25 kDa-35 kDa的平均分子量的PEG基團； q是1、2或3； X是具有以下結構的L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1表示與前一個胺基酸殘基的附接點；以及 X+1表示與後一個胺基酸殘基的附接點， 其中所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO: 11、12和13中所示的胺基酸序列之輕鏈互補決定區（CDR）以及包含SEQ ID NO: 16、17和18中所示的胺基酸序列之重鏈CDR。
實施例3是一種在有需要的受試者中治療肺癌的方法，其包括： 選擇患有肺癌的受試者，其中基於一種或多種屬性選擇所述受試者，所述屬性包括 (i) 肺癌是非鱗狀非小細胞肺癌（NSCLC）；(ii) 肺癌是胸膜間皮瘤；(iii) 肺癌是不可切除的肺癌；(iv) 肺癌是IV期肺癌；(v) 肺癌是PD-L1腫瘤比例得分大於或等於50%的NSCLC；(vi) 肺癌是PD-L1腫瘤進展得分小於50%或為1%-49%的NSCLC；以及 向所述受試者投予 (a) IL-2接合物，和 (b) 抗PD-1抗體或其抗原結合片段，其中： 所述IL-2接合物包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，其中位置P64處的胺基酸被式 (I) 的結構替代：
Figure 02_image001
式 (I) 其中： Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image003
； Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image005
； Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image006
；或者 Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image008
； W是具有約25 kDa-35 kDa的平均分子量的PEG基團； q是1、2或3； X是具有以下結構的L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1表示與前一個胺基酸殘基的附接點；以及 X+1表示與後一個胺基酸殘基的附接點， 其中所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO: 11、12和13中所示的胺基酸序列之輕鏈互補決定區（CDR）以及包含SEQ ID NO: 16、17和18中所示的胺基酸序列之重鏈CDR。
實施例4是根據實施例1-3中任一項所述的方法，其還包括向所述受試者投予順鉑。
實施例5是一種在有需要的受試者中治療肺癌的方法，其包括向所述受試者投予 (a) IL-2接合物，(b) 抗PD-1抗體或其抗原結合片段，和 (c) 順鉑，其中： 所述IL-2接合物包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，其中位置P64處的胺基酸被式 (I) 的結構替代：
Figure 02_image001
式 (I) 其中： Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image003
； Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image005
； Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image006
；或者 Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image008
； W是具有約25 kDa-35 kDa的平均分子量的PEG基團； q是1、2或3； X是具有以下結構的L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1表示與前一個胺基酸殘基的附接點；以及 X+1表示與後一個胺基酸殘基的附接點， 其中所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO: 11、12和13中所示的胺基酸序列之輕鏈互補決定區（CDR）以及包含SEQ ID NO: 16、17和18中所示的胺基酸序列之重鏈CDR。
實施例6是根據實施例1-5中任一項所述的方法，其中所述肺癌是NSCLC。
實施例7是根據實施例1-6中任一項所述的方法，其中所述肺癌是不可切除的。
實施例8是根據實施例1-7中任一項所述的方法，其中所述肺癌是IV期。
實施例9是根據實施例1-8中任一項所述的方法，其中所述肺癌是非鱗狀NSCLC。
實施例10是實施例1-9中任一項所述的方法，其中所述肺癌是胸膜間皮瘤。
實施例11是根據實施例1-10中任一項所述的方法，其包括向所述受試者投予約8 μg/kg的所述IL-2接合物。
實施例12是根據實施例1-10中任一項所述的方法，其包括向所述受試者投予約16 μg/kg的所述IL-2接合物。
實施例13是根據實施例1-10中任一項所述的方法，其包括向所述受試者投予約24 μg/kg的所述IL-2接合物。
實施例14是根據實施例1-10中任一項所述的方法，其包括向所述受試者投予約32 μg/kg的所述IL-2接合物。
實施例15是根據實施例1-14中任一項所述的方法，其還包括向所述受試者投予培美曲塞。
實施例16是根據實施例1-15中任一項所述的方法，其還包括向所述受試者投予卡鉑。
實施例17是根據實施例1-16中任一項所述的方法，其還包括向所述受試者投予奈米顆粒白蛋白結合型紫杉醇（nab-paclitaxel）。
實施例18是根據實施例1-17中任一項所述的方法，其中在所述IL-2接合物中，所述PEG基團具有約30 kDa的平均分子量。
實施例19是根據實施例1-18中任一項所述的方法，其中在所述IL-2接合物中，Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image012
。
實施例20是根據實施例1-18中任一項所述的方法，其中在所述IL-2接合物中，Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image012
。
實施例21是根據實施例1-18中任一項所述的方法，其中在所述IL-2接合物中，Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image014
。
實施例22是根據實施例1-18中任一項所述的方法，其中在所述IL-2接合物中，Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image014
。
實施例23是根據實施例1-18中任一項所述的方法，其中式(I)的結構具有式(IV)或式(V)的結構，或者是式(IV)和式(V)的混合物：
Figure 02_image016
式 (IV)；
Figure 02_image018
式 (V)； 其中： q是1、2或3； X是具有以下結構的L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1表示與前一個胺基酸殘基的附接點；以及 X+1表示與後一個胺基酸殘基的附接點。
實施例24是根據實施例1-18中任一項所述的方法，其中式(I)的結構具有式(XII)或式(XIII)的結構，或者是式(XII)和式(XIII)的混合物：
Figure 02_image020
式 (XII)；
Figure 02_image022
式 (XIII)； 其中： n是整數，使得-(OCH 2CH 2) n-OCH 3具有約30 kDa的分子量； q是1、2或3；以及 波浪線表示與SEQ ID NO: 1中未被替代的胺基酸殘基的共價鍵。
實施例25是根據實施例1-24中任一項所述的方法，其中q是1。
實施例26是根據實施例1-24中任一項所述的方法，其中q是2。
實施例27是根據實施例1-24中任一項所述的方法，其中q是3。
實施例28是根據實施例1-27中任一項所述的方法，其中約每兩週一次、約每三週一次或約每4週一次向所述受試者投予所述IL-2接合物。
實施例29是根據實施例1-28中任一項所述的方法，其中約每兩週一次、約每三週一次或約每4週一次向所述受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段。
實施例30是根據實施例1-29中任一項所述的方法，其中所述IL-2接合物是醫藥上可接受的鹽、溶劑合物或水合物。
實施例31是根據實施例1-30中任一項所述的方法，其中以約200 mg的劑量每3週投予所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段。
實施例32是根據實施例1-31中任一項所述的方法，其中將所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段分開投予。
實施例33是根據實施例32所述的方法，其中將所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段依序投予。
實施例34是根據實施例32或33所述的方法，其中將所述IL-2接合物在所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段之前投予。
實施例35是根據實施例32或33所述的方法，其中將所述IL-2接合物在所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段之後投予。
實施例36是根據實施例1-35中任一項所述的方法，其中通過皮下投予向所述受試者投予所述IL-2接合物。
實施例37是根據實施例1-36中任一項所述的方法，其中通過皮下投予向所述受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段。
實施例38是根據實施例1-35中任一項所述的方法，其中通過靜脈內投予向所述受試者投予所述IL-2接合物。
實施例39是根據實施例1-35中任一項所述的方法，其中通過靜脈內投予向所述受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段。
實施例40是根據實施例1-39中任一項所述的方法，其還包括向所述受試者投予對乙醯胺基酚。
實施例41是根據實施例1-40中任一項所述的方法，其還包括向所述受試者投予苯海拉明。
實施例42是根據實施例40或41所述的方法，其中在投予所述IL-2接合物之前將對乙醯胺基酚和/或苯海拉明投予於所述受試者。
實施例43是根據實施例1-42中任一項所述的方法，其還包括至少部分地基於所述肺癌為非鱗狀NSCLC選擇被投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段的受試者。
實施例44是根據實施例1-43中任一項所述的方法，其還包括至少部分地基於所述肺癌為胸膜間皮瘤選擇被投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段的受試者。
實施例45是根據實施例1-44中任一項所述的方法，其還包括至少部分地基於所述肺癌為不可切除的肺癌選擇被投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段的受試者。
實施例46是根據實施例1-45中任一項所述的方法，其還包括至少部分地基於所述肺癌為IV期肺癌選擇被投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段的受試者。
實施例47是根據實施例1-46中任一項所述的方法，其還包括至少部分地基於所述肺癌為PD-L1腫瘤比例得分大於或等於50%的NSCLC選擇被投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段的受試者。
實施例48是根據實施例1-47中任一項所述的方法，其還包括至少部分地基於所述肺癌為PD-L1腫瘤進展得分小於50%或為1%-49%的NSCLC選擇被投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段的受試者。
實施例49是一種用於根據實施例1-48中任一項所述的方法中的IL-2接合物。
實施例50是IL-2接合物用於製備用於根據實施例1-49中任一項所述的方法的藥物的用途。
實施例51是根據前述實施例中任一項所述的方法、用於所述用途的IL-2接合物或用途，其中所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段為派姆單抗。
在本文所述的任何方法、組合物、套組和用途的一些實施例中，所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含：(a) 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 19所示的胺基酸序列或SEQ ID NO: 19的變異體，和 (b) 輕鏈可變區，其包含：(i) SEQ ID NO: 14所示的胺基酸序列或SEQ ID NO: 14的變異體。在本文所述的任何方法、組合物、套組和用途的一些實施例中，所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO: 19所示的胺基酸序列之重鏈可變區和包含SEQ ID NO: 14所示的胺基酸序列之輕鏈可變區。在本文所述的任何方法、組合物、套組和用途的一些實施例中，所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段是單株抗體，其包含：(a) 重鏈，其包含SEQ ID NO: 20所示的胺基酸序列或SEQ ID NO: 20的變異體，和 (b) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 15所示的胺基酸序列或SEQ ID NO: 15的變異體。在本文所述的任何方法、組合物、套組和用途的一些實施例中，所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段是包含包含SEQ ID NO: 20所示的胺基酸序列之重鏈和包含SEQ ID NO: 15所示的胺基酸序列之輕鏈的單株抗體。
在本文所述的任何方法、組合物、套組和用途的一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段是派姆單抗。在本文所述的任何方法和用途的一些實施例中，所述方法或用途包括 (i) 每約三週向患者投予約200 mg的抗PD-1抗體（例如派姆單抗）或其抗原結合片段，或 (ii) 每約六週向患者投予約400 mg的抗PD-1抗體（例如派姆單抗）或其抗原結合片段。
在本文所述的所有方法、組合物、套組和用途中，所述抗PD-1抗體或抗原結合片段抑制PD-L1與PD-1的結合，並且優選還抑制PD-L2與PD-1的結合。在本文所述的任何方法、組合物、套組和用途的一些實施例中，所述抗PD-1抗體或抗原結合片段是特異性結合PD-1並阻斷PD-L1與PD-1的結合的單株抗體。在本文所述的任何方法和用途的特定實施例中，所述抗PD-1抗體包含重鏈和輕鏈，並且其中所述重鏈和所述輕鏈包含圖1所示的胺基酸序列（SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 20）。
除非另外定義，否則本文中使用的所有技術術語和科學術語具有與要求保護的主題所屬領域的技術人員通常所理解的相同的含義。應理解，前述一般說明和以下詳細說明只是例示性和解釋性的，並且不限制要求保護的任何主題。在通過引用併入本文的任何材料與本公開文本的明確內容不一致的情況下，以明確內容為准。在本申請中，除非另外明確陳述，否則單數的使用包括複數含義。必須指出，如在說明書和所附申請專利範圍中所用，除非上下文另外清楚地規定，否則單數形式“一個/一種（a、an）”和“所述（the）”包括複數指示物。在本申請中，除非上下文另有要求，否則“或”的使用意指“和/或”。此外，術語“包括（including）”以及其他形式如“包括（include）”、“包括（includes）”和“包括（included）”的使用是非限制性的。
在說明書中對“一些實施例”、“實施例”、“一個實施例”或“其他實施例”的提及意指結合實施例描述的特定特徵、結構或特性包括在本公開文本的至少一些實施例中，但不必包括在本發明的所有實施例中。
如本文所用，範圍和數量可以表示為“約”特定值或範圍。約也包括確切的量。因此，“約5 μL”意指“約5 μL”並且也意指“5 μL”。通常，術語“約”包括預期在實驗誤差內的量，如例如，在15%、10%或5%內。
本文使用的章節標題僅用於組織目的，而不應解釋為限制所描述的主題。
如本文所用，術語“受試者”和“患者”是指任何哺乳動物。在一些實施例中，所述哺乳動物是人。在一些實施例中，所述哺乳動物是非人。所述術語均不要求或不限於以衛生保健工作者（例如醫生、註冊護士、執業護士、醫師助理、護理員或臨終關懷工作者）進行監督（例如持續或間斷）為特徵的情況。
如本文所用，術語“非天然胺基酸”是指除20種天然存在的胺基酸之一之外的胺基酸。例示性非天然胺基酸描述於Young等人, “Beyond the canonical 20 amino acids: expanding the genetic lexicon,” J. of Biological Chemistry 285(15): 11039-11044 (2010)中，其披露內容通過引用併入本文。
本文的術語“抗體”以最廣義使用，並且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體（例如雙特異性抗體）和抗體片段，只要它們展現出所需的抗原結合活性即可。“抗體片段”是指不同於完整抗體的分子，其包含完整抗體的結合完整抗體所結合的抗原的一部分。抗體片段的例子包括但不限於Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab') 2；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子（例如scFv）；和從抗體片段形成的多特異性抗體。“親本抗體”是通過在修飾抗體用於預期用途（如將抗體人源化以用作人類治療劑）之前將免疫系統暴露於抗原而獲得的抗體。
一般而言，基本抗體結構單元包含四聚體。每個四聚體5包括兩個相同的多肽鏈對，每對具有一條“輕”鏈（約25 kDa）和一條“重”鏈（約50-70 kDa）。每條鏈的胺基末端部分包括主要負責抗原識別的約100個至110個或更多個胺基酸的可變區。重鏈的羧基末端部分可以限定主要負責效應子功能的恒定區。典型地，將人輕鏈分類為κ和λ輕鏈。此外，人類重鏈通常被分類為μ、δ、γ、α或ε，並且將抗體的同種型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈內，可變區和恒定區通過約12個或更多個胺基酸的“J”區連接，其中重鏈還包括約10個或更多個胺基酸的“D”區。通常參見， Fundamental ImmunologyCh. 7 (Paul, W.編, 2 nd15 ed. Raven Press, N.Y. (1989)。
每個輕鏈/重鏈對的可變區形成抗體結合位點。因此，一般而言，完整抗體具有兩個結合位點。除了雙功能或雙特異性抗體之外，兩個結合位點一般而言是相同的。
通常，重鏈和輕鏈二者的可變結構域包含三個高變區，也稱為互補決定區（CDR），其位於相對保守的框架區（FR）內。CDR通常由框架區對齊，使得能夠與特異性表位結合。一般而言，從N末端至C末端，輕鏈和重鏈可變結構域都包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每個結構域的胺基酸分配通常是根據以下定義： Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat等人; National Institutes of Health, 貝塞斯達, 馬里蘭州; 第5版; NIH Publ. No. 91-3242 (1991)；Kabat (1978) Adv. Prot. Chem.32:1-75；Kabat等人, (1977) J. Biol. Chem.252:6609-6616；Chothia等人, (1987) J Mol. Biol.196:901-917或Chothia等人, (1989) Nature342:878-883。
術語“高變區”是指抗體中負責抗原結合的胺基酸殘基。高變區包含來自“互補決定區”或“CDR”（即，輕鏈可變結構域中的CDRL1、CDRL2和CDRL3以及重鏈可變結構域中的CDRH1、CDRH2和CDRH3）的胺基酸殘基。參見Kabat等人 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, 貝塞斯達, 馬里蘭州（按序列定義抗體的CDR 35區）；還參見Chothia和Lesk (1987) J. Mol. Biol.196: 901-917（按結構定義抗體的CDR區）。術語“框架”或“FR”殘基是指除了本文定義為CDR殘基的高變區殘基之外的那些可變結構域殘基。
除非另有說明，“抗體片段”或“抗原結合片段”是指抗體的抗原結合片段，即保留與被全長抗體結合的抗原特異性地結合的能力的抗體片段，例如保留一個或多個CDR區的片段。抗體結合片段的例子包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段。
“特異性地結合”特定靶蛋白的抗體是與其他蛋白質相比，展現出優先與該靶標結合的抗體，但這種特異性不需要絕對結合特異性。如果抗體的結合決定了樣品中靶蛋白的存在，例如，沒有產生不希望的結果，如假陽性，則抗體被認為對其預期靶標是“特異性的”。可用於本發明的抗體或其結合片段將以比與非靶蛋白的親和力大至少兩倍、優選地大至少十倍、更優選地大至少20倍、以及最優選地大至少100倍的親和力與靶蛋白結合。如本文所用，抗體被稱為與包含給定胺基酸序列（例如成熟人類PD-1或人類PD-L1分子的胺基酸序列）的多肽特異性地結合，條件是其與包含該序列的多肽結合但不與缺少該序列的蛋白結合。
“CDR”或“CDRs”意指免疫球蛋白可變區中的互補決定區，通常使用Kabat編號系統定義。
“Chothia”意指在Al-Lazikani等人, JMB273:927-948 (1997)中描述的抗體編號系統。
“保守修飾的變異體”或“保守取代”是指蛋白質中的胺基酸用具有類似特徵（例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構型和剛性等）的其他胺基酸取代，使得可頻繁地進行改變而不改變蛋白質的生物活性或其他所需特性，如抗原親和力和/或特異性。習知技術者認識到，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸取代基本上不改變生物活性（參見，例如，Watson等人 (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (第4版)）。此外，結構或功能上相似的胺基酸的取代不太可能破壞生物活性。例示性保守取代列於表1中。
表1例示性保守胺基酸取代
原始殘基 保守取代
Ala (A) Gly; Ser
Arg (R) Lys; His
Asn (N) Gln; His
Asp (D) Glu; Asn
Cys (C) Ser; Ala
Gln (Q) Asn
Glu (E) Asp; Gln
Gly (G) Ala
His (H) Asn; Gln
Ile (I) Leu; Val
Leu (L) Ile; Val
Lys (K) Arg; His
Met (M) Leu; Ile; Tyr
Phe (F) Tyr; Met; Leu
Pro (P) Ala
Ser (S) Thr
Thr (T) Ser
Trp (W) Tyr; Phe
Tyr (Y) Trp; Phe
Val (V) Ile; Leu
如本文所用，“Kabat”意指Elvin A. Kabat首創的免疫球蛋白比對和編號系統（(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, 貝塞斯達, 馬里蘭州）。
可用於本發明的任何治療方法、組合物和用途的“抗PD-1抗體”包括特異性結合人PD-1的單株抗體（mAb）或其抗原結合片段。PD-1及其配體的替代名稱或同義詞包括：PD-1：PDCD1、PD1、CD279和SLEB2；PD-L1：PDCD1L1、PDL1、B7H1、B7-4、CD274和B7-H；以及PD-L2：PDCD1L2、PDL2、B7-DC、Btdc和CD273。在治療人個體的本發明的任何治療方法、組合物和用途中，PD-1抗體或其抗原結合片段是阻斷人PD-L1與人PD-1結合或阻斷人PD-L1和PD-L2二者與人PD-1結合的PD-1拮抗劑。人PD-1胺基酸序列可以在NCBI基因座號：NP_005009中找到。人PD-L1和PD-L2胺基酸序列可以分別在NCBI基因座號：NP_054862和NP_079515中找到。抗PD-1抗體可以是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體，並且可以包括人恒定區。在一些實施例中，人恒定區選自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定區，並且在優選的實施例中，人恒定區是IgG1或IgG4恒定區。在一些實施例中，抗原結合片段選自Fab、Fab'-SH、F(ab')2、scFv和Fv片段。
除非另外定義，否則“PD-L1”或“PD-L2”表述意指指定PD-L蛋白在細胞表面上或指定PD-L mRNA在細胞或組織內的任何可檢測的表現水平。PD-L蛋白表現可以用診斷性PD-L抗體在腫瘤組織切片的IHC測定中或通過流式細胞術檢測。可替代地，腫瘤細胞的PD-L蛋白表現可通過PET成像，使用特異性結合期望的PD-L靶標（例如，PD-L1或PD-L2）的結合劑（例如，抗體片段、親和體等）來檢測。用於檢測和測量PD-L mRNA表現的技術包括RT-PCR和即時定量RT-PCR。
如本文所用，“核苷酸”是指包含核苷部分和磷酸酯部分的化合物。例示性天然核苷酸包括而不限於腺苷三磷酸（ATP）、尿苷三磷酸（UTP）、胞苷三磷酸（CTP）、鳥苷三磷酸（GTP）、腺苷二磷酸（ADP）、尿苷二磷酸（UDP）、胞苷二磷酸（CDP）、鳥苷二磷酸（GDP）、腺苷一磷酸（AMP）、尿苷一磷酸（UMP）、胞苷一磷酸（CMP）和鳥苷一磷酸（GMP）、去氧腺苷三磷酸（dATP）、去氧胸苷三磷酸（dTTP）、去氧胞苷三磷酸（dCTP）、去氧鳥苷三磷酸（dGTP）、去氧腺苷二磷酸（dADP）、胸苷二磷酸（dTDP）、去氧胞苷二磷酸（dCDP）、去氧鳥苷二磷酸（dGDP）、去氧腺苷一磷酸（dAMP）、去氧胸苷一磷酸（dTMP）、去氧胞苷一磷酸（dCMP）和去氧鳥苷一磷酸（dGMP）。包含去氧核糖作為糖部分的例示性天然去氧核糖核苷酸包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dADP、dTDP、dCDP、dGDP、dAMP、dTMP、dCMP和dGMP。包含核糖作為糖部分的例示性天然核糖核苷酸包括ATP、UTP、CTP、GTP、ADP、UDP、CDP、GDP、AMP、UMP、CMP和GMP。
如本文所用，“鹼基”或“核鹼基”是指核苷或核苷酸（核苷和核苷酸涵蓋核糖或去氧核糖變異體）的至少核鹼基部分，所述核苷或核苷酸在一些情形中可以含有對核苷或核苷酸的糖部分的進一步修飾。在一些情形中，“鹼基”也用於代表整個核苷或核苷酸（例如，“鹼基”可以通過DNA聚合酶摻入DNA中，或通過RNA聚合酶摻入RNA中）。然而，除非上下文要求，否則術語“鹼基”不應解釋為必然代表整個核苷或核苷酸。在本文提供的鹼基或核鹼基化學結構中，僅示出核苷或核苷酸的鹼基，為清楚起見省略了糖部分和任選的任何磷酸酯殘基。如本文提供的鹼基或核鹼基化學結構中使用的，波浪線代表與核苷或核苷酸的連接，其中核苷或核苷酸的糖部分可以被進一步修飾。在一些實施例中，波浪線代表鹼基或核鹼基與核苷或核苷酸的糖部分（如戊糖）的附接。在一些實施例中，戊糖是核糖或去氧核糖。
在一些實施例中，核鹼基通常是核苷的雜環鹼基部分。核鹼基可以是天然存在的，可以是修飾的，可以與天然鹼基沒有相似性，和/或可以是合成的，例如通過有機合成而合成。在某些實施例中，核鹼基包含核苷或核苷酸中的任何原子或原子組，其中所述原子或原子組能夠在使用或不使用氫鍵的情況下與另一核酸的鹼基相互作用。在某些實施例中，非天然核鹼基不是源自天然核鹼基。應注意的是，非天然核鹼基不一定具有鹼基特性，但是為了簡單起見，它們稱為核鹼基。在一些實施例中，當提及核鹼基時，“(d)”指示核鹼基可以附接至去氧核糖或核糖，而沒有括弧的“d”指示核鹼基附接至去氧核糖。
如本文所用，“核苷”是包含核鹼基部分和糖部分的化合物。核苷包括但不限於天然存在的核苷（如在DNA和RNA中發現的）、脫鹼基核苷、修飾的核苷和具有模擬鹼基和/或糖基團的核苷。核苷包括包含任何種類的取代基的核苷。核苷可以是通過核酸鹼基與糖的還原基團之間的糖苷連接形成的糖苷化合物。
如本文所用的術語化學結構的“類似物”是指與母體結構保持基本相似性但它可能不容易從母體結構合成得到的化學結構。在一些實施例中，核苷酸類似物是非天然核苷酸。在一些實施例中，核苷類似物是非天然核苷。容易從母體化學結構合成得到的相關化學結構稱為“衍生物”。
如本文所用，“劑量限制性毒性”（DLT）被定義為在治療週期的第1天至第29天（含）± 1天內發生的不良事件，其不明確地或無可爭議地僅與外來原因相關並且滿足實例2中針對DLT所述的標準。
如本文所用，“嚴重細胞激素釋放症候群”是指Teachey等人, Cancer Discov.2016; 6(6); 664-79中所述的4級或5級細胞激素釋放症候群，其披露內容通過引用併入本文。
如本文所用，“派姆單抗”是指Merck & Co以商品名“Keytruda”銷售的人源化抗PD-1抗體。
如本文所用，“卡鉑”是指也以商品名“Novaplus”銷售的化療藥物。
如本文所用，“順鉑”是指也以商品名“Platinol-AQ”銷售的化療藥物。
如本文所用，“奈米顆粒白蛋白結合型紫杉醇”是指也以商品名“Abraxane”銷售的化療藥物。
如本文所用，“培美曲塞”是指也以商品名“Alimta”銷售的化療藥物。
儘管本發明的各種特徵可以在單一實施例的上下文中描述，但所述特徵也可以單獨提供或以任何合適的組合提供。相反，儘管為了清楚起見，本文可以在分開的實施例的背景下描述本發明，但是本發明也可以在單一實施例中實現。 IL-2 接合物
介白素2（IL-2）是一種多效性1型細胞激素，其結構包含15.5 kDa的四α-螺旋束。IL-2的前體形式的長度為153個胺基酸殘基，其中前20個胺基酸形成信號肽，並且殘基21-153形成成熟形式。IL-2主要由CD4+ T細胞在抗原刺激後產生，以及由CD8+細胞、自然殺傷（NK）細胞、和自然殺傷T（NKT）細胞、活化的樹突細胞（DC）和肥大細胞以較低程度產生。IL-2信號傳導通過與IL-2受體（IL-2R）亞基、IL-2Rα（也稱為CD25）、IL-2Rβ（也稱為CD122）和IL-2Rγ（也稱為CD132）的特定組合的相互作用來進行。IL-2與IL-2Rα的相互作用以約10 -8M的K d形成“低親和力”IL-2受體複合物。IL-2與IL-2Rβ和IL-2Rγ的相互作用以約10 -9M的K d形成“中親和力”IL-2受體複合物。IL-2與所有三種亞基IL-2Rα、IL-2Rβ和IL-2Rγ的相互作用以約＞10 -11M的K d形成“高親和力”IL-2受體複合物。
在一些情況下，經由“高親和力”IL-2Rαβγ複合物的IL-2信號傳導調節調節性T細胞的啟動和增殖。調節性T細胞或CD4 +CD25 +Foxp3 +調節性T（Treg）細胞通過抑制效應細胞（如CD4 +T細胞、CD8 +T細胞、B細胞、NK細胞和NKT細胞）來介導免疫穩態的維持。在一些情況下，Treg細胞是從胸腺生成（tTreg細胞），或者是從外周的幼稚T細胞誘導（pTreg細胞）。在一些情形中，將Treg細胞視為外周耐受的介體。實際上，在一項研究中，CD25耗盡的外周CD4 +T細胞的轉移在裸鼠中產生多種自身免疫病，而CD4 +CD25 +T細胞的共轉移抑制自身免疫的發展（Sakaguchi,等人, “Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25),” J. Immunol.155(3): 1151-1164 (1995)，其披露內容通過引用併入本文）。Treg細胞群的增多下調效應T細胞增殖並抑制自身免疫和T細胞抗腫瘤反應。
經由“中親和力”IL-2Rβγ複合物的IL-2信號傳導調節CD8 +效應T（Teff）細胞、NK細胞和NKT細胞的啟動和增殖。CD8 +Teff細胞（也稱為細胞毒性T細胞、Tc細胞、細胞毒性T淋巴細胞、CTL、T殺傷細胞、細胞裂解性T細胞、Tcon或殺傷T細胞）是識別並殺傷受損細胞、癌細胞和病原體感染的細胞的T淋巴細胞。NK和NKT細胞是與CD8 +Teff細胞類似的淋巴細胞類型，其靶向癌細胞和病原體感染的細胞。
在一些情況下，IL-2信號傳導用於調節T細胞反應，且隨後用於治療癌症。例如，以高劑量形式投予IL-2以誘導用於治療癌症的Teff細胞群的擴增。然而，高劑量IL-2進一步導致對Treg細胞的伴隨刺激，從而減弱抗腫瘤免疫反應。高劑量IL-2還誘導由脈管系統中的IL-2Rα鏈表現細胞（包括2型先天免疫細胞（ILC-2）、嗜酸性白血球和內皮細胞）的接合介導的毒性不良事件。這導致嗜酸性白血球增多症、毛細血管滲漏和血管滲漏症候群（VLS）。
過繼細胞療法使得醫師能夠有效利用患者自身的免疫細胞對抗疾病，如增殖性疾病（例如，癌症）以及感染性疾病。IL-2信號傳導的作用可以通過組合療法中存在另外的藥劑或方法而進一步增強。例如，程式性細胞死亡蛋白1，也稱為PD-1或CD279，是在T細胞和祖B細胞上表現的細胞表面受體，其在調節免疫系統對人體細胞的反應中起作用。PD-1通過抑制T細胞發炎活性下調免疫系統並促進自身耐受性。這預防自身免疫病，但也可預防免疫系統殺傷癌細胞。PD-1通過兩種機制防止自身免疫。第一，PD-1促進淋巴結中抗原特異性T細胞的凋亡（程式性細胞死亡）。第二，PD-1減少調節性T細胞（抗炎抑制性T細胞）中的凋亡。派姆單抗是一種人源化抗PD-1抗體，其可阻斷PD-1，活化免疫系統攻擊腫瘤，並被批准用於治療某些癌症。
本文提供了在有需要的受試者中治療癌症的方法，其包括向所述受試者投予 (a) 約8 μg/kg、16 μg/kg、24 μg/kg或32 μg/kg的IL-2接合物，和 (b) 抗PD-1抗體或其抗原結合片段，其中所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO: 11、12和13中所示的胺基酸序列之輕鏈互補決定區（CDR）和包含SEQ ID NO: 16、17和18中所示的胺基酸序列之重鏈CDR（例如派姆單抗）。
在一些實施例中，所述IL-2序列包含SEQ ID NO: 1的序列： PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT (SEQ ID NO: 1) 其中位置P64處的胺基酸被式 (I) 的結構替代：
Figure 02_image001
(I) 其中： Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image003
； Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image003
； Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image006
；或者 Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image006
； W是具有約25 kDa-35 kDa的平均分子量的PEG基團； q是1、2或3； X是具有以下結構的L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1表示與前一個胺基酸殘基的附接點；以及 X+1表示與後一個胺基酸殘基的附接點。
在本文所述的式 (I) 的任何實施例或變型中，所述IL-2接合物是醫藥上可接受的鹽、溶劑合物或水合物。在一些實施例中，所述IL-2接合物是醫藥上可接受的鹽。在一些實施例中，所述IL-2接合物是溶劑合物。在一些實施例中，所述IL-2接合物是水合物。
在本文所述的式 (I) 和包含其的醫藥組合物的任何實施例或變型中，平均分子量涵蓋重均分子量和數均分子量二者；換句話說，例如，30 kDa數均分子量和30 kDa重均分子量二者均符合30 kDa分子量。在一些實施例中，平均分子量是重均分子量。在其他實施例中，平均分子量是數均分子量。應理解，在本文提供的方法中，向受試者投予如本文所述的IL-2接合物包括投予多於單分子的IL-2接合物；因此，使用術語“平均”來描述PEG基團的分子量是指投予於受試者的劑量中IL-2接合物分子的PEG基團的平均分子量。
在式 (I) 的一些實施例中，Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image024
。在式 (I) 的一些實施例中，Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image026
。在式 (I) 的一些實施例中，Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image027
。在式 (I) 的一些實施例中，Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image029
。
在式 (I) 的一些實施例中，q是1。在式 (I) 的一些實施例中，q是2。在式 (I) 的一些實施例中，q是3。
在式 (I) 的一些實施例中，W是具有約25 kDa的平均分子量的PEG基團。在式 (I) 的一些實施例中，W是具有約30 kDa的平均分子量的PEG基團。在式 (I) 的一些實施例中，W是具有約35 kDa的平均分子量的PEG基團。
在式 (I) 的一些實施例中，q是1並且式 (I) 的結構為式 (Ia) 的結構：
Figure 02_image001
(Ia) 其中： Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image012
； Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image012
； Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image014
；或者 Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image031
； W是具有約25 kDa-35 kDa的平均分子量的PEG基團； X是具有以下結構的L-胺基酸：
Figure 02_image009
； X-1表示與前一個胺基酸殘基的附接點；以及 X+1表示與後一個胺基酸殘基的附接點。
在式 (Ia) 的一些實施例中，Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image012
。在式 (Ia) 的一些實施例中，Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image012
。在式 (Ia) 的其他實施例中，Z是CH 2並且Y是
Figure 02_image014
。在式 (Ia) 的一些實施例中，Y是CH 2並且Z是
Figure 02_image014
。
在式 (Ia) 的一些實施例中，PEG基團具有約30 kDa的平均分子量。
在一些實施例中，IL-2接合物包含SEQ ID NO: 2的序列： PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELK [AzK_L1_PEG30kD] LEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT (SEQ ID NO: 2) 其中[AzK_L1_PEG30kD]是經由DBCO介導的點擊化學與PEG穩定接合的N6-((2-疊氮基乙氧基)-羰基)-L-離胺酸，其包含式(IV)或式(V)的結構的化合物，其中q是1（如式(IVa)或式(Va)），並且其中所述PEG基團具有約25-35千道爾頓（例如約30 kDa）的平均分子量，被甲氧基封端。術語“DBCO”意指包含二苯並環辛炔基團的化學部分，如包括實例1方案1和2中顯示的mPEG-DBCO化合物。
從點擊反應生成的位置異構體的比率為約1:1或大於1:1。
PEG通常將包含許多（OCH 2CH 2）單體（或（CH 2CH 2O）單體，取決於如何定義PEG）。在一些實施例中，（OCH 2CH 2）單體（或（CH 2CH 2O）單體）的數量使得PEG基團的平均分子量為約30 kDa。
在一些情況下，PEG是封端聚合物，即至少一個末端用相對惰性的基團（如低級C 1-6烷氧基或羥基）封端的聚合物。在一些實施例中，PEG基團是甲氧基-PEG（通常稱為mPEG），其是PEG的線性形式，其中聚合物的一個末端是甲氧基（-OCH 3）基團，而另一個末端是羥基或可以任選地經化學修飾的其他官能團。
在一些實施例中，PEG基團是線性或分支PEG基團。在一些實施例中，PEG基團是線性PEG基團。在一些實施例中，PEG基團是分支PEG基團。在一些實施例中，PEG基團是甲氧基PEG基團。在一些實施例中，PEG基團是線性或分支甲氧基PEG基團。在一些實施例中，PEG基團是線性甲氧基PEG基團。在一些實施例中，PEG基團是分支甲氧基PEG基團。例如，本公開文本的範圍內包括包含分子量為30,000 Da ± 3,000 Da、或30,000 Da ± 4,500 Da、或30,000 Da ± 5,000 Da的PEG基團的IL-2接合物。
在一些實施例中，所述IL-2接合物包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，其中胺基酸殘基P64被式(IV)或式(V)或式(IV)和式(V)的混合物的結構替代：
Figure 02_image016
式 (IV)；
Figure 02_image018
式 (V)； 其中： W是具有約25 kDa-35 kDa的平均分子量的PEG基團； q是1、2或3；以及 X具有以下結構：
Figure 02_image009
； X-1表示與前一個胺基酸殘基的附接點；以及 X+1表示與後一個胺基酸殘基的附接點。
在式(IV)或式(V)、或式(IV)或式(V)的混合物的一些實施例中，q是1。在式(IV)或式(V)、或式(IV)或式(V)的混合物的一些實施例中，q是2。在式(IV)或式(V)、或式(IV)或式(V)的混合物的一些實施例中，q是3。
在式(IV)或式(V)、或式(IV)或式(V)的混合物的一些實施例中，W是具有約25kDa的平均分子量的PEG基團。在式(IV)或式(V)、或式(IV)或式(V)的混合物的一些實施例中，W是具有約30kDa的平均分子量的PEG基團。在式(IV)或式(V)、或式(IV)或式(V)的混合物的一些實施例中，W是具有約35kDa的平均分子量的PEG基團。
在本文所述的任何實施例中，式(I)的結構具有式(IV)或式(V)的結構，或者是式(IV)和式(V)的混合物。在一些實施例中，式(I)的結構具有式(IV)的結構。在一些實施例中，式(I)的結構具有式(V)的結構。在一些實施例中，式(I)的結構是式(IV)和式(V)的混合物。
在式(IV)或式(V)、或式(IV)和式(V)的混合物的一些實施例中，q是1，式(IV)的結構是式(IVa)的結構，並且式(V)的結構是式(Va)的結構：
Figure 02_image033
式 (IVa)；
Figure 02_image035
式 (Va)； 其中： W是具有約25 kDa-35 kDa的平均分子量的PEG基團；以及 X具有以下結構：
Figure 02_image009
； X-1表示與前一個胺基酸殘基的附接點；以及 X+1表示與後一個胺基酸殘基的附接點。
在式(IVa)或式(Va)、或式(IVa)和式(Va)的混合物的一些實施例中，PEG基團具有約30kDa的平均分子量。
在本文所述的任何實施例中，式(I)的結構具有式(IVa)或式(Va)的結構，或者是式(IVa)和式(Va)的混合物。在一些實施例中，式(I)的結構具有式(IVa)的結構。在一些實施例中，式(I)的結構具有式(Va)的結構。在一些實施例中，式(I)的結構是式(IVa)和式(Va)的混合物。
在一些實施例中，IL-2接合物包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，其中胺基酸殘基P64被式(XII)或式(XIII)、或式(XII)和式(XIII)的混合物的結構替代：
Figure 02_image020
式 (XII)；
Figure 02_image022
式 (XIII)； 其中： n是整數，使得-(OCH 2CH 2) n-OCH 3具有約25 kDa-35 kDa的分子量； q是1、2或3；以及 波浪線表示與SEQ ID NO: 1中未被替代的胺基酸殘基的共價鍵。
在式(XII)或式(XIII)、或式(XII)和式(XIII)的混合物的一些實施例中，q是1。在式(XII)或式(XIII)、或式(XII)和式(XIII)的混合物的一些實施例中，q是2。在式(XII)或式(XIII)、或式(XII)和式(XIII)的混合物的一些實施例中，q是3。
在式(XII)或式(XIII)、或式(XII)和式(XIII)的混合物的一些實施例中，n是整數，使得-(OCH 2CH 2) n-OCH 3具有約30kDa的分子量。
在本文所述的任何實施例中，式(I)的結構具有式(XII)或式(XIII)的結構，或者是式(XII)和式(XIII)的混合物。在一些實施例中，式(I)的結構具有式(XII)的結構。在一些實施例中，式(I)的結構具有式(XIII)的結構。在一些實施例中，式(I)的結構是式(XII)和式(XIII)的混合物。
在式(XII)或式(XIII)、或式(XII)和式(XIII)的混合物的一些實施例中，q是1，式(XII)的結構是式(XIIa)的結構，並且式(XIII)的結構是式(XIIIa)的結構：
Figure 02_image037
式 (XIIa)；
Figure 02_image039
式 (XIIIa)； 其中： n是整數，使得-(OCH 2CH 2) n-OCH 3具有約25 kDa-35 kDa的分子量；以及 波浪線表示與SEQ ID NO: 1中未被替代的胺基酸殘基的共價鍵。
在式(XIIa)或式(XIIIa)、或式(XIIa)和式(XIIIa)的混合物的一些實施例中，n是整數，使得-(OCH 2CH 2) n-OCH 3具有約30kDa的分子量。
在本文所述的任何實施例中，式(I)的結構具有式(XIIa)或式(XIIIa)的結構，或者是式(XIIa)和式(XIIIa)的混合物。在一些實施例中，式(I)的結構具有式(XIIa)的結構。在一些實施例中，式(I)的結構具有式(XIIIa)的結構。在一些實施例中，式(I)的結構是式(XIIa)和式(XIIIa)的混合物。
在一些實施例中，IL-2接合物包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，其中胺基酸殘基P64被式(XIV)或式(XV)、或式(XIV)和式(XV)的混合物的結構替代：
Figure 02_image041
式 (XIV)；
Figure 02_image043
式 (XV)； 其中： m是0至20的整數； p是0至20的整數； n是整數，使得PEG基團具有約25 kDa-35 kDa的平均分子量；以及 波浪線表示與SEQ ID NO: 1中未被替代的胺基酸殘基的共價鍵。
在式(XIV)或式(XV)、或式(XIV)和式(XV)的混合物的一些實施例中，n是整數，使得PEG基團具有約30kDa的平均分子量。
在一些實施例中，m是從0至15的整數。在一些實施例中，m是從0至10的整數。在一些實施例中，m是從0至5的整數。在一些實施例中，m是從1至5的整數。在一些實施例中，m是1。在一些實施例中，m是2。在一些實施例中，m是3。在一些實施例中，m是4。在一些實施例中，m是5。
在一些實施例中，p是從0至15的整數。在一些實施例中，p是從0至10的整數。在一些實施例中，p是從0至5的整數。在一些實施例中，p是從1至5的整數。在一些實施例中，p是1。在一些實施例中，p是2。在一些實施例中，p是3。在一些實施例中，p是4。在一些實施例中，p是5。
在一些實施例中，m和p各自是2。
在本文所述的任何實施例中，式(I)的結構具有式(XIV)或式(XV)的結構，或者是式(XIV)和式(XV)的混合物。在一些實施例中，式(I)的結構具有式(XIV)的結構。在一些實施例中，式(I)的結構具有式(XV)的結構。在一些實施例中，式(I)的結構是式(XIV)和式(XV)的混合物。
在一些實施例中，IL-2接合物包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，其中胺基酸殘基P64被式(XVI)或式(XVII)、或式(XVI)和式(XVII)的混合物的結構替代：
Figure 02_image045
式 (XVI)；
Figure 02_image047
式 (XVII)； 其中： m是0至20的整數； n是整數，使得PEG基團具有約25 kDa-35 kDa的平均分子量；以及 波浪線表示與SEQ ID NO: 1中未被替代的胺基酸殘基的共價鍵。
在式(XVI)或式(XVII)、或式(XVI)和式(XVII)的混合物的一些實施例中，n是整數，使得PEG基團具有約30 kDa的平均分子量。
在一些實施例中，m是從0至15的整數。在一些實施例中，m是從0至10的整數。在一些實施例中，m是從0至5的整數。在一些實施例中，m是從1至5的整數。在一些實施例中，m是1。在一些實施例中，m是2。在一些實施例中，m是3。在一些實施例中，m是4。在一些實施例中，m是5。
在本文所述的任何實施例中，式(I)的結構具有式(XVI)或式(XVII)的結構，或者是式(XVI)和式(XVII)的混合物。在一些實施例中，式(I)的結構具有式(XVI)的結構。在一些實施例中，式(I)的結構具有式(XVII)的結構。在一些實施例中，式(I)的結構是式(XVI)和式(XVII)的混合物。 接合化學
在一些實施例中，本文所述的IL-2接合物可通過包括1,3-偶極環加成反應的接合反應來製備。在一些實施例中，1,3-偶極環加成反應包括疊氮化物與炔烴的反應（“點擊”反應）。在一些實施例中，本文所述的接合反應包括方案I中概述的反應，其中X是SEQ ID NO: 1的位置P64處的非天然胺基酸。 方案 I.
Figure 02_image049
在一些實施例中，接合部分包含如本文所述的PEG基團。在一些實施例中，反應基團包括炔烴或疊氮化物。
在一些實施例中，本文所述的接合反應包括方案II中概述的反應，其中X是SEQ ID NO: 1的位置P64處的非天然胺基酸。 方案 II.
Figure 02_image051
在一些實施例中，本文所述的接合反應包括方案III中概述的反應，其中X是SEQ ID NO: 1的位置P64處的非天然胺基酸。 方案 III.
Figure 02_image053
在一些實施例中，本文所述的接合反應包括方案IV中概述的反應，其中X是SEQ ID NO: 1的位置P64處的非天然胺基酸。 方案 IV.
Figure 02_image055
在一些實施例中，本文所述的接合反應包括疊氮化物部分（如含於含有衍生自 N6-((2-疊氮基乙氧基)-羰基)-L-離胺酸（AzK）的胺基酸殘基的蛋白質中的疊氮化物部分）與應變環炔（如衍生自DBCO的應變環炔，其為包含二苯並環辛炔基團的化學部分）之間的環加成反應。包含DBCO部分的PEG基團可市售獲得或者可以通過業內一般技術者已知的方法來製備。例示性反應顯示在方案V和VI中。 方案 V.
Figure 02_image057
方案 VI.
Figure 02_image059
本文所述的接合反應（如點擊反應）可以生成單一位置異構體或位置異構體的混合物。在一些情況下，位置異構體的比率為約1:1。在一些情況下，位置異構體的比率為約2:1。在一些情況下，位置異構體的比率為約1.5:1。在一些情況下，位置異構體的比率為約1.2:1。在一些情況下，位置異構體的比率為約1.1:1。在一些情況下，位置異構體的比率大於1:1。 IL-2 多肽產生
在一些情況下，重組產生或化學合成本文所述的IL-2接合物，其含有天然胺基酸突變或非天然胺基酸突變。在一些情況下，例如通過宿主細胞系統或在無細胞系統中重組產生本文所述的IL-2接合物。
在一些情況下，通過宿主細胞系統重組產生IL-2接合物。在一些情形中，宿主細胞是真核細胞（例如，哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞或植物細胞）或原核細胞（例如，革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌）。在一些情形中，真核宿主細胞是哺乳動物宿主細胞。在一些情形中，哺乳動物宿主細胞是穩定的細胞株，或者是將目的遺傳物質摻入其自身基因組中並且具有在多代細胞分裂後表現所述遺傳物質的產物的能力的細胞株。在其他情形中，哺乳動物宿主細胞是暫態細胞株，或者是未將目的遺傳物質摻入其自身基因組中並且不具有在多代細胞分裂後表現所述遺傳物質的產物的能力的細胞株。
例示性哺乳動物宿主細胞包括293T細胞株、293A細胞株、293FT細胞株、293F細胞、293 H細胞、A549細胞、MDCK細胞、CHO DG44細胞、CHO-S細胞、CHO-K1細胞、Expi293F™細胞、Flp-In™ T-REx™ 293細胞株、Flp-In™-293細胞株、Flp-In™-3T3細胞株、Flp-In™-BHK細胞株、Flp-In™-CHO細胞株、Flp-In™-CV-1細胞株、Flp-In™-Jurkat細胞株、FreeStyle™ 293-F細胞、FreeStyle™ CHO-S細胞、GripTite™ 293 MSR細胞株、GS-CHO細胞株、HepaRG™細胞、T-REx™ Jurkat細胞株、Per.C6細胞、T-REx™-293細胞株、T-REx™-CHO細胞株和T-REx™-HeLa細胞株。
在一些實施例中，真核宿主細胞是昆蟲宿主細胞。例示性昆蟲宿主細胞包括果蠅（ Drosophila）S2細胞、Sf9細胞、Sf21細胞、High Five™細胞和expresSF+®細胞。
在一些實施例中，真核宿主細胞是酵母宿主細胞。例示性酵母宿主細胞包括巴斯德畢赤酵母（法夫駒形氏酵母（ K. phaffii））酵母菌株，如GS115、KM71H、SMD1168、SMD1168H和X-33，以及釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）酵母菌株，如INVSc1。
在一些實施例中，真核宿主細胞是植物宿主細胞。在一些情況下，植物細胞包括來自藻類的細胞。例示性植物細胞株包括來自萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）137c或細長聚球藻（Synechococcus elongatus）PPC 7942的株系。
在一些實施例中，宿主細胞是原核宿主細胞。例示性原核宿主細胞包括BL21、Mach1™、DH10B™、TOP10、DH5α、DH10Bac™、OmniMax™、MegaX™、DH12S™、INV110、TOP10F'、INVαF、TOP10/P3、ccdB Survival、PIR1、PIR2、Stbl2™、Stbl3™或Stbl4™。
在一些情況下，用於產生本文所述的IL-2多肽的合適的多核酸分子或載體包括衍生自真核或原核來源的任何合適的載體。例示性多核酸分子或載體包括來自細菌（例如大腸桿菌）、昆蟲、酵母（例如巴斯德畢赤酵母、法夫駒形氏酵母）、藻類或哺乳動物來源的載體。細菌載體包括例如pACYC177、pASK75、pBAD載體系列、pBADM載體系列、pET載體系列、pETM載體系列、pGEX載體系列、pHAT、pHAT2、pMal-c2、pMal-p2、pQE載體系列、pRSET A、pRSET B、pRSET C、pTrcHis2系列、pZA31-Luc、pZE21-MCS-1、pFLAG ATS、pFLAG CTS、pFLAG MAC、pFLAG Shift-12c、pTAC-MAT-1、pFLAG CTC或pTAC-MAT-2。
昆蟲載體包括例如pFastBac1、pFastBac DUAL、pFastBac ET、pFastBac HTa、pFastBac HTb、pFastBac HTc、pFastBac M30a、pFastBact M30b、pFastBac、M30c、pVL1392、pVL1393、pVL1393 M10、pVL1393 M11、pVL1393 M12、FLAG載體（如pPolh-FLAG1或pPolh-MAT 2）或MAT載體（如pPolh-MAT1或pPolh-MAT2）。
酵母載體包括例如Gateway ®pDEST ™14載體、Gateway ®pDEST ™15載體、Gateway ®pDEST ™17載體、Gateway ®pDEST ™24載體、Gateway ®pYES-DEST52載體、pBAD-DEST49 Gateway ®目的載體、pAO815畢赤酵母屬載體、pFLD1巴斯德畢赤酵母（法夫駒形氏酵母）載體、pGAPZA、B和C巴斯德畢赤酵母（法夫駒形氏酵母）載體、pPIC3.5K畢赤酵母屬載體、pPIC6 A、B和C畢赤酵母屬載體、pPIC9K畢赤酵母屬載體、pTEF1/Zeo、pYES2酵母載體、pYES2/CT酵母載體、pYES2/NT A、B和C酵母載體或pYES3/CT酵母載體。
藻類載體包括例如pChlamy-4載體或MCS載體。
哺乳動物載體包括例如暫態表現載體或穩定表現載體。例示性哺乳動物暫態表現載體包括p3xFLAG-CMV 8、pFLAG-Myc-CMV 19、pFLAG-Myc-CMV 23、pFLAG-CMV 2、pFLAG-CMV 6a,b,c、pFLAG-CMV 5.1、pFLAG-CMV 5a,b,c、p3xFLAG-CMV 7.1、pFLAG-CMV 20、p3xFLAG-Myc-CMV 24、pCMV-FLAG-MAT1、pCMV-FLAG-MAT2、pBICEP-CMV 3或pBICEP-CMV 4。例示性哺乳動物穩定表現載體包括pFLAG-CMV 3、p3xFLAG-CMV 9、p3xFLAG-CMV 13、pFLAG-Myc-CMV 21、p3xFLAG-Myc-CMV 25、pFLAG-CMV 4、p3xFLAG-CMV 10、p3xFLAG-CMV 14、pFLAG-Myc-CMV 22、p3xFLAG-Myc-CMV 26、pBICEP-CMV 1或pBICEP-CMV 2。
在一些情況下，將無細胞系統用於產生本文所述的IL-2多肽。在一些情形中，無細胞系統包含來自細胞的胞質和/或核組分的混合物，並且適合於體外核酸合成。在一些情況下，無細胞系統利用原核細胞組分。在其他情況下，無細胞系統利用真核細胞組分。核酸合成是在基於例如果蠅細胞、爪蟾屬卵、古細菌或HeLa細胞的無細胞系統中獲得的。例示性無細胞系統包括大腸桿菌S30提取系統、大腸桿菌T7 S30系統或PURExpress®、XpressCF和XpressCF+。
無細胞轉譯系統不同地包含組分，如質體、mRNA、DNA、tRNA、合成酶、釋放因子、核糖體、伴侶蛋白、轉譯起始和延伸因子、天然和/或非天然胺基酸和/或用於蛋白質表現的其他組分。任選地修飾此類組分以提高產量、增加合成速率、增加蛋白質產物保真度或摻入非天然胺基酸。在一些實施例中，本文所述的細胞激素是使用US 8,778,631；US 2017/0283469；US 2018/0051065；US 2014/0315245；或US 8,778,631中描述的無細胞轉譯系統合成的，其每一個的披露內容通過引用併入本文。在一些實施例中，無細胞轉譯系統包含修飾的釋放因子，或者甚至從所述系統去除一種或多種釋放因子。在一些實施例中，無細胞轉譯系統包含降低的蛋白酶濃度。在一些實施例中，無細胞轉譯系統包含具有重新分配的密碼子的修飾的tRNA，所述密碼子用於編碼非天然胺基酸。在一些實施例中，在無細胞轉譯系統中使用本文所述的合成酶用於摻入非天然胺基酸。在一些實施例中，在將tRNA添加到無細胞轉譯系統之前，使用酶促或化學方法用非天然胺基酸對所述tRNA進行預載入。在一些實施例中，用於無細胞轉譯系統的組分是從修飾的生物體（如修飾的細菌、酵母或其他生物體）獲得。
在一些實施例中，經由表現宿主系統或通過無細胞系統以環狀變換的形式產生IL-2多肽。 包含非天然胺基酸的細胞激素多肽的產生
可以在本公開中使用正交或擴增的遺傳密碼，其中將存在於IL-2多肽的核酸序列中的一個或多個特定密碼子分配以編碼非天然胺基酸，使得可以通過使用正交tRNA合成酶/tRNA對將其遺傳摻入IL-2中。正交tRNA合成酶/tRNA對能夠將非天然胺基酸裝載在tRNA，並且能夠響應於所述密碼子將所述非天然胺基酸摻入多肽鏈中。
在一些情況下，密碼子是密碼子琥珀、赭石、蛋白石或四聯體密碼子。在一些情形中，密碼子對應於將用於攜帶非天然胺基酸的正交tRNA。在一些情形中，密碼子是琥珀密碼子。在其他情形中，密碼子是正交密碼子。
在一些情況下，密碼子是四聯體密碼子，其可以由正交核糖體ribo-Q1解碼。在一些情形中，四聯體密碼子如以下中所述：Neumann等人, “Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome,” Nature, 464(7287): 441-444 (2010)，其披露內容通過引用併入本文。
在一些情況下，本公開文本中使用的密碼子是重編碼的密碼子，例如，被可替代密碼子替代的同義密碼子或稀有密碼子。在一些情形中，重新編碼的密碼子如Napolitano等人 ,“Emergent rules for codon choice elucidated by editing rare arginine codons in Escherichia coli,” PNAS, 113(38): E5588-5597 (2016)中所述，其披露內容通過引用併入本文。在一些情形中，重編碼的密碼子如以下中所述：Ostrov等人, “Design, synthesis, and testing toward a 57-codon genome,” Science 353(6301): 819-822 (2016)，其披露內容通過引用併入本文。
在一些情況下，利用非天然核酸，導致一種或多種非天然胺基酸摻入IL-2中。例示性非天然核酸包括但不限於尿嘧啶-5-基，次黃嘌呤-9-基（I），2-胺基腺嘌呤-9-基，5-甲基胞嘧啶（5-me-C），5-羥甲基胞嘧啶，黃嘌呤，次黃嘌呤，2-胺基腺嘌呤，腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基衍生物和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基衍生物和其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮基尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶（假尿嘧啶），4-硫尿嘧啶，8-鹵代、8-胺基、8-巰基、8-硫烷基、8-羥基和其他8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤，5-鹵代（特別是5-溴）、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤，7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤，以及3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。某些非天然核酸，如5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶和N-2取代的嘌呤、N-6取代的嘌呤、O-6取代的嘌呤、2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、增加雙鏈體形成穩定性的那些分子、通用核酸、疏水性核酸、混雜核酸、尺寸擴大的核酸、氟化核酸、5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶以及N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶（5-me-C），5-羥甲基胞嘧啶，黃嘌呤，次黃嘌呤，2-胺基腺嘌呤，腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基衍生物和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基衍生物和其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-鹵代尿嘧啶，5-鹵代胞嘧啶，5-丙炔基（-C≡C-CH 3）尿嘧啶，5-丙炔基胞嘧啶，嘧啶核酸的其他炔基衍生物，6-偶氮基尿嘧啶，6-偶氮基胞嘧啶，6-偶氮基胸腺嘧啶，5-尿嘧啶（假尿嘧啶），4-硫尿嘧啶，8-鹵代、8-胺基、8-巰基、8-硫烷基、8-羥基和其他8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤，5-鹵代（特別是5-溴）、5-三氟甲基、其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鳥嘌呤，7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-胺基-腺嘌呤，8-氮雜鳥嘌呤，8-氮雜腺嘌呤，7-脫氮鳥嘌呤，7-脫氮腺嘌呤，3-脫氮鳥嘌呤，3-脫氮腺嘌呤，三環嘧啶，吩噁嗪胞苷（[5,4-b][l,4]苯並噁嗪-2(3H)-酮），吩噻嗪胞苷（1H-嘧啶並[5,4-b][l,4]苯並噻嗪-2(3H)-酮），G-夾，吩噁嗪胞苷（例如9- (2-胺基乙氧基)-H-嘧啶並[5,4-b][l,4]苯並噁嗪-2(3H)-酮），哢唑胞苷（2H-嘧啶並[4,5-b]吲哚-2-酮），吡啶並吲哚胞苷（H-吡啶並[3’,2’:4,5]吡咯並[2,3-d]嘧啶-2-酮），其中嘌呤或嘧啶鹼基被其他雜環替代的那些，7-脫氮-腺嘌呤，7-脫氮鳥嘌呤，2-胺基吡啶，2-吡啶酮，氮雜胞嘧啶，5-溴胞嘧啶，溴尿嘧啶，5-氯胞嘧啶，氯代胞嘧啶，環胞嘧啶，胞嘧啶阿拉伯糖苷，5-氟胞嘧啶，氟嘧啶，氟尿嘧啶，5,6-二氫胞嘧啶，5-碘胞嘧啶，羥基脲，碘尿嘧啶，5-硝基胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-氟尿嘧啶和5-碘尿嘧啶，2-胺基-腺嘌呤，6-硫代-鳥嘌呤，2-硫代-胸腺嘧啶，4-硫代-胸腺嘧啶，5-丙炔基-尿嘧啶，4-硫代-尿嘧啶，N4-乙基胞嘧啶，7-脫氮鳥嘌呤，7-脫氮-8-氮雜鳥嘌呤，5-羥基胞嘧啶，2'-去氧尿苷，2-胺基-2'-去氧腺苷，以及描述於美國專利號3,687,808；4,845,205；4,910,300；4,948,882；5,093,232；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,681,941；5,750,692；5,763,588；5,830,653和6,005,096；WO 99/62923；Kandimalla等人, (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813；The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, Kroschwitz, J.I.,編, John Wiley & Sons, 1990, 858- 859；Englisch等人, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613；和Sanghvi, 第15章, Antisense Research and Applications, Crooke和Lebleu編, CRC Press, 1993, 273-288中的那些。另外的鹼基修飾可在以下中找到：例如美國專利號3,687,808；Englisch等人, Angewandte Chemie, 國際版, 1991, 30, 613；和Sanghvi, 第15章, Antisense Research and Applications, 第289-302頁, Crooke和Lebleu編, CRC Press, 1993；其每一個的披露內容通過引用併入本文。
包含各種雜環鹼基和各種糖部分（和糖類似物）的非天然核酸是本領域可獲得的，並且在一些情形中，核酸包括除了天然存在的核酸的五種主要鹼基組分以外的一種或幾種雜環鹼基。例如，在一些情形中，雜環鹼基包括尿嘧啶-5-基、胞嘧啶-5-基、腺嘌呤-7-基、腺嘌呤-8-基、鳥嘌呤-7-基、鳥嘌呤-8-基、4-胺基吡咯並[2.3-d]嘧啶-5-基、2-胺基-4-氧代吡咯並[2, 3-d]嘧啶5-基、2-胺基-4-氧代吡咯並[2.3-d]嘧啶-3-基，其中嘌呤經由9-位置、嘧啶經由1-位置、吡咯並嘧啶經由7-位置且吡唑並嘧啶經由1-位置附接至核酸的糖部分。
在一些實施例中，核苷酸類似物還在磷酸酯部分被修飾。經修飾的磷酸酯部分包括但不限於在兩個核苷酸之間的連接處被修飾的那些，並且含有例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯（包括3’-亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯）、次膦酸酯、胺基磷酸酯（包括3’-胺基胺基磷酸酯和胺基烷基胺基磷酸酯）、硫羰胺基磷酸酯、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯和硼烷磷酸酯。應理解，兩個核苷酸之間的這些磷酸酯或經修飾的磷酸酯連接是通過3’-5’連接或2’-5’連接，並且所述連接含有反向極性，如3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’。還包括各種鹽、混合鹽和游離酸形式。許多美國專利傳授了如何製備和使用含有修飾的磷酸酯的核苷酸，並且所述美國專利包括但不限於3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050；其每一個的披露內容通過引用併入本文。
在一些實施例中，非天然核酸包括2’,3’-二去氧-2’,3’-二脫氫-核苷（PCT/US2002/006460）、5’-取代的DNA和RNA衍生物（PCT/US2011/033961；Saha等人, J. Org Chem., 1995, 60, 788-789；Wang等人, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 1999, 9, 885-890；和Mikhailov等人, Nucleosides & Nucleotides, 1991, 10(1-3), 339-343；Leonid等人, 1995, 14(3-5), 901-905；和Eppacher等人, Helvetica Chimica Acta, 2004, 87, 3004-3020；PCT/JP2000/004720；PCT/JP2003/002342；PCT/JP2004/013216；PCT/JP2005/020435；PCT/JP2006/315479；PCT/JP2006/324484；PCT/JP2009/056718；PCT/JP2010/067560）、或製備為具有修飾的鹼基的單磷酸酯的5’-取代的單體（Wang等人, Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids, 2004, 23 (1 & 2), 317-337）；其每一個的披露內容通過引用併入本文。
在一些實施例中，非天然核酸包括在糖環的5’-位置和2’-位置處的修飾（PCT/US94/02993），如5’-CH 2-取代的2’-O-保護的核苷（Wu等人, Helvetica Chimica Acta, 2000, 83, 1127-1143和Wu等人, Bioconjugate Chem. 1999, 10, 921-924）。在一些情形中，非天然核酸包括醯胺連接的核苷二聚體，其已經被製備用於摻入寡核苷酸中，其中二聚體中3'連接的核苷（5’至3’）包含2’-OCH 3和5’-(S)-CH 3（Mesmaeker等人, Synlett, 1997, 1287-1290）。非天然核酸可以包括2’-取代的5’-CH 2（或O）修飾的核苷（PCT/US92/01020）。非天然核酸可以包括5’-亞甲基膦酸酯DNA和RNA單體、和二聚體（Bohringer等人, Tet. Lett., 1993, 34, 2723-2726；Collingwood等人, Synlett, 1995, 7, 703-705；和Hutter等人, Helvetica Chimica Acta, 2002, 85, 2777-2806）。非天然核酸可以包括具有2’-取代基的5’-膦酸酯單體（US 2006/0074035）和其他經修飾的5’-膦酸酯單體（WO 1997/35869）。非天然核酸可以包括5’-修飾的亞甲基膦酸酯單體（EP614907和EP629633）。非天然核酸可以包括在5’和/或6’位置包含羥基的5’或6’-膦酸酯核糖核苷的類似物（Chen等人, Phosphorus, Sulfur and Silicon, 2002, 777, 1783-1786；Jung等人, Bioorg. Med. Chem., 2000, 8, 2501-2509；Gallier等人, Eur. J. Org. Chem., 2007, 925-933；和Hampton等人, J. Med. Chem., 1976, 19(8), 1029-1033）。非天然核酸可以包括具有5’-磷酸基團的5’-膦酸酯去氧核糖核苷單體和二聚體（Nawrot等人, Oligonucleotides, 2006, 16(1), 68-82）。非天然核酸可以包括具有6’-膦酸酯基團的核苷（其中5’或/和6’位置是未經取代的或用硫代叔丁基（SC(CH 3) 3）（及其類似物）；亞甲基胺基（CH 2NH 2）（及其類似物）或氰基（CN）（及其類似物）取代（Fairhurst等人, Synlett, 2001, 4, 467-472；Kappler等人, J. Med. Chem., 1986, 29, 1030-1038；Kappler等人, J. Med. Chem., 1982, 25, 1179-1184；Vrudhula等人, J. Med. Chem., 1987, 30, 888-894；Hampton等人, J. Med. Chem., 1976, 19, 1371-1377；Geze等人, J. Am. Chem. Soc, 1983, 105(26), 7638-7640；和Hampton等人, J. Am. Chem. Soc, 1973, 95(13), 4404-4414）。本段中列出的每個參考文獻的披露內容通過引用併入本文。
在一些實施例中，非天然核酸還包括糖部分的修飾。在一些情形中，核酸含有其中糖基團已被修飾的一種或多種核苷。此類糖修飾的核苷可以賦予增強的核酸酶穩定性、增加的結合親和力或一些其他有益的生物學特性。在某些實施例中，核酸包含經化學修飾的呋喃核糖環部分。經化學修飾的呋喃核糖環的例子包括而不限於添加取代基（包括5’和/或2’取代基；兩個環原子橋接形成二環核酸（BNA）；用S、N(R)或C(R 1)(R 2)替代核糖基環氧原子（R = H、C 1-C 12烷基或保護基團）；及其組合。經化學修飾的糖的例子可發現於WO 2008/101157、US 2005/0130923和WO 2007/134181中，其每一個的披露內容通過引用併入本文。
在一些情況下，修飾的核酸包含修飾的糖或糖類似物。因此，除核糖和去氧核糖之外，所述糖部分可以是戊糖、去氧戊糖、己糖、去氧己糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、來蘇糖或糖“類似物”環戊基。所述糖可以呈吡喃糖基或呋喃糖基形式。所述糖部分可以是核糖、去氧核糖、阿拉伯糖或2’-O-烷基核糖的呋喃糖苷，並且所述糖可以以[α]或[β]異頭構型附接至相應的雜環鹼基。糖修飾包括但不限於2’-烷氧基-RNA類似物、2’-胺基-RNA類似物、2’-氟-DNA和2’-烷氧基-或胺基-RNA/DNA嵌合體。例如，糖修飾可以包括2’-O-甲基-尿苷或2’-O-甲基-胞苷。糖修飾包括2’-O-烷基-取代的去氧核糖核苷和2’-O-乙二醇樣核糖核苷。這些糖或糖類似物以及其中此類糖或類似物附接至雜環鹼基（核酸鹼基）的相應“核苷”的製備是已知的。還可以進行糖修飾並且將其與其他修飾組合。
糖部分的修飾包括核糖和去氧核糖的天然修飾以及非天然修飾。糖修飾包括但不限於在2’位置處的以下修飾：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C 1至C 10烷基或C 2至C 10烯基和炔基。2’糖修飾還包括但不限於-O[(CH 2) nO] mCH 3、-O(CH 2) nOCH 3、-O(CH 2) nNH 2、-O(CH 2) nCH 3、-O(CH 2) nONH 2和-O(CH 2) nON[(CH 2)n CH 3)] 2，其中n和m是1至約10。
2’位置處的其他修飾包括但不限於：C 1至C 10低級烷基、取代的低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、SH、SCH 3、OCN、Cl、Br、CN、CF 3、OCF 3、SOCH 3、SO 2CH 3、ONO 2、NO 2、N 3、NH 2、雜環烷基、雜環烷芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、取代的甲矽烷基、RNA切割基團、報導基團、嵌入劑、用於改善寡核苷酸藥代動力學特性的基團、或用於改善寡核苷酸的藥效學特性的基團，以及具有類似特性的其他取代基。還可以在所述糖的其他位置（特別是在3’末端核苷酸或2’-5’連接的寡核苷酸中糖的3’位置和5’末端核苷酸的5’位置）處進行類似的修飾。經修飾的糖還包括在橋環氧處含有修飾（如CH 2和S）的那些糖。核苷酸糖類似物也可以具有糖模擬物，如環丁基部分代替戊呋喃糖基糖。許多美國專利傳授了此類經修飾的糖結構的製備，並且詳述並描述了一系列的鹼基修飾，所述美國專利是例如美國專利號4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121、5,596,091；5,614,617；5,681,941；和5,700,920，其每一個的披露內容通過引用併入本文。
具有經修飾的糖部分的核酸的例子包括而不限於包含5’-乙烯基、5’-甲基（R或S）、4’-S、2’-F、2’-OCH 3和2’-O(CH 2) 2OCH 3取代基的核酸。2’位置處的取代基還可以選自烯丙基、胺基、疊氮基、硫代、O-烯丙基、O-(C 1-C 1O烷基)、OCF 3、O(CH 2) 2SCH 3、O(CH 2) 2-O-N(R m)(R n)和O-CH 2-C(=O)-N(R m)(R n)，其中R m和R n各自獨立地是H或者取代或未取代的C 1-C 10烷基。
在某些實施例中，本文所述的核酸包括一種或多種二環核酸。在某些此類實施例中，雙環核酸包含4’與2’核糖基環原子之間的橋。在某些實施例中，本文提供的核酸包括一種或多種雙環核酸，其中所述橋包含4’至2’雙環核酸。此類4’至2’雙環核酸的例子包括但不限於下式之一：4’-(CH 2)-O-2’（LNA）；4’-(CH 2)-S-2’；4’-(CH 2) 2-O-2’（ENA）；4’-CH(CH 3)-O-2’和4’-CH(CH 2OCH 3)-O-2’及其類似物（參見美國專利號7,399,845）；4’-C(CH 3)(CH 3)-O-2’及其類似物（參見WO 2009/006478、WO 2008/150729、US 2004/0171570、美國專利號7,427,672，Chattopadhyaya等人, J. Org. Chem., 209, 74, 118-134，以及WO 2008/154401）。還參見例如：Singh等人, Chem. Commun., 1998, 4, 455-456；Koshkin等人, Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630；Wahlestedt等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638；Kumar等人, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222；Singh等人, J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039；Srivastava等人, J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379；Elayadi等人, Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561；Braasch等人, Chem. Biol, 2001, 8, 1-7；Oram等人, Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243；美國專利號4,849,513；5,015,733；5,118,800；5,118,802；7,053,207；6,268,490；6,770,748；6,794,499；7,034,133；6,525,191；6,670,461；和7,399,845；國際公開號WO 2004/106356、WO 1994/14226、WO 2005/021570、WO 2007/090071和WO 2007/134181；美國專利公開號US 2004/0171570、US 2007/0287831和US 2008/0039618；美國臨時申請號60/989,574、61/026,995、61/026,998、61/056,564、61/086,231、61/097,787和61/099,844；和國際申請號PCT/US2008/064591、PCT US2008/066154、PCT US2008/068922和PCT/DK98/00393。本段中列出的每個參考文獻的披露內容通過引用併入本文。
在某些實施例中，核酸包含連接的核酸。核酸可以使用任何核酸間連接而連接在一起。核酸間連接基團的兩個主要類別是通過磷原子的存在或不存在來定義的。代表性的含磷的核酸間連接包括但不限於磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、胺基磷酸酯和硫代磷酸酯（P=S）。代表性的不含磷的核酸間連接基團包括但不限於亞甲基甲基亞胺基（-CH 2-N(CH 3)-O-CH 2-）、硫代二酯（-O-C(O)-S-）、硫代胺基甲酸酯（-O-C(O)(NH)-S-）；矽氧烷（-O-Si(H) 2-O-）；和N,N*-二甲基肼（-CH 2-N(CH 3)-N(CH 3)）。在某些實施例中，可以將具有手性原子的核酸間連接製備為外消旋混合物，作為分開的對映體，例如烷基膦酸酯和硫代磷酸酯。非天然核酸可以含有單個修飾。非天然核酸可以在所述部分之一內或不同部分之間含有多個修飾。
對核酸的骨架磷酸修飾包括但不限於甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、胺基磷酸酯（橋接或非橋接）、磷酸三酯、二硫代磷酸酯（phosphorodithioate）、二硫代磷酸酯（phosphodithioate）和硼烷磷酸酯，並且可以以任何組合來使用。還可以使用其他非磷酸酯連接。
在一些實施例中，骨架修飾（例如，甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、胺基磷酸酯和二硫代磷酸酯核苷酸間連接）可以賦予經修飾的核酸免疫調節活性和/或增強其體內穩定性。
在一些情況下，磷衍生物（或修飾的磷酸酯基團）附接至糖或糖類似物部分，並且可以是單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、胺基磷酸酯等。含有經修飾的磷酸酯連接或非磷酸酯連接的例示性多核苷酸可發現於：Peyrottes等人, 1996, Nucleic Acids Res. 24: 1841-1848；Chaturvedi等人, 1996, Nucleic Acids Res. 24:2318-2323；Schultz等人, (1996) Nucleic Acids Res. 24:2966-2973；Matteucci, 1997, “Oligonucleotide Analogs: an Overview” in Oligonucleotides as Therapeutic Agents, (Chadwick和Cardew, 編輯) John Wiley and Sons, 紐約, 紐約州；Zon, 1993, “Oligonucleoside Phosphorothioates” in Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties, Humana Press, 第165-190頁；Miller等人, 1971, JACS 93:6657-6665；Jager等人, 1988, Biochem. 27:7247-7246；Nelson等人, 1997, JOC 62:7278-7287；美國專利號5,453,496；和Micklefield, 2001, Curr. Med. Chem. 8: 1157-1179；其每一個的披露內容通過引用併入本文。
在一些情形中，骨架修飾包括用可替代部分如陰離子基團、中性基團或陽離子基團替代磷酸二酯連接。此類修飾的例子包括：陰離子核苷間連接；N3’至P5’胺基磷酸酯修飾；硼烷磷酸酯DNA；原寡核苷酸；中性核苷間連接，如甲基膦酸酯；醯胺連接的DNA；亞甲基(甲基亞胺基)連接；甲縮醛（formacetal）和硫代甲縮醛連接；含有磺醯基的骨架；N-嗎啉基寡聚物；肽核酸（PNA）；以及帶正電荷的去氧核糖核酸胍（DNG）寡聚物（Micklefield, 2001, Current Medicinal Chemistry 8: 1157-1179，其披露內容通過引用併入本文）。經修飾的核酸可以包含嵌合或混合的骨架，所述嵌合的或混合的骨架包含一種或多種修飾（例如，磷酸酯連接的組合，如磷酸二酯和硫代磷酸酯連接的組合）。
磷酸酯的取代基包括，例如，短鏈烷基或環烷基核苷間連接、混合的雜原子和烷基或環烷基核苷間連接，或一個或多個短鏈雜原子或雜環核苷間連接。這些包括具有以下的那些：嗎啉基連接（部分地由核苷的糖部分形成）；矽氧烷骨架；硫化物、亞碸和碸骨架；甲醯乙醯基和硫代甲醯乙醯基骨架；亞甲基甲醯乙醯基和硫代甲醯乙醯基骨架；含烯烴的骨架；胺基磺酸酯骨架；亞甲基亞胺基和亞甲基肼基骨架；磺酸酯和磺醯胺骨架；醯胺骨架；以及具有混合N、O、S和CH 2組成部分的其他骨架。許多美國專利披露了如何製備和使用這些類型的磷酸酯替代物，並且所述美國專利包括但不限於美國專利號5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439。還應理解，在核苷酸取代物中，核苷酸的糖和磷酸部分二者都可以被替代，例如被醯胺型連接（胺乙基甘胺酸）（PNA）替代。美國專利號5,539,082；5,714,331；和5,719,262傳授了如何製備和使用PNA分子，其每一個通過引用併入本文。還參見Nielsen等人, Science, 1991, 254, 1497-1500。還可能將其他類型的分子（接合物）連接至核苷酸或核苷酸類似物，以增強例如細胞攝取。接合物可以與所述核苷酸或核苷酸類似物化學連接。此類接合物包括但不限於脂質部分，如膽固醇部分（Letsinger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556）、膽酸（Manoharan等人, Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060）、硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醇（Manoharan等人, Ann. KY. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309；Manoharan等人, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770）、硫代膽固醇（Oberhauser等人, Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538）、脂肪族鏈，例如，十二烷二醇或十一烷基殘基（Saison-Behmoaras等人, EM5OJ, 1991, 10, 1111-1118；Kabanov等人, FEBS Lett., 1990, 259, 327-330；Svinarchuk等人, Biochimie, 1993, 75, 49-54）、磷脂，例如，二-十六烷基-rac-甘油或l-二-O-十六烷基-rac-甘油-S-H-膦酸三乙銨（Manoharan等人, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654；Shea等人, Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783）、多胺或聚乙二醇鏈（Manoharan等人, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973）、或金剛烷乙酸（Manoharan等人, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654）、棕櫚基部分（Mishra等人, Biochem. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237）、或十八烷胺或己基胺基-羰基-氧基膽固醇部分（Crooke等人, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937）。許多美國專利傳授了此類接合物的製備，並且所述美國專利包括但不限於美國專利號4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717, 5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241, 5,391,723；5,416,203, 5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941。本段中列出的每個參考文獻的披露內容通過引用併入本文。
在一些情形中，非天然核酸進一步形成非天然鹼基對。能夠在體內條件下形成非天然DNA或RNA鹼基對（UBP）的例示性非天然核苷酸包括但不限於TAT1、dTAT1、5FM、d5FM、TPT3、dTPT3、5SICS、d5SICS、NaM、dNaM、CNMO、dCNMO及其組合。在一些實施例中，非天然核苷酸包括：
Figure 02_image061
。 例示性非天然鹼基對包括：(d)TPT3-(d)NaM；(d)5SICS-(d)NaM；(d)CNMO-(d)TAT1；(d)NaM-(d)TAT1；(d)CNMO-(d)TPT3；和(d)5FM-(d)TAT1。
能夠形成可用於製備本文所公開的IL-2接合物的非天然UBP的非天然核苷酸的其他例子可在Dien等人, J Am Chem Soc., 2018, 140:16115-16123；Feldman等人, J Am Chem Soc, 2017, 139:11427-11433；Ledbetter等人, J Am Chem Soc., 2018, 140:758-765；Dhami等人, Nucleic Acids Res. 2014, 42:10235-10244；Malyshev等人, Nature, 2014, 509:385-388；Betz等人, J Am Chem Soc., 2013, 135:18637-18643；Lavergne等人, J Am Chem Soc. 2013, 135:5408-5419；和Malyshev等人 Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109:12005-12010中找到；其每一個的披露內容通過引用併入本文。在一些實施例中，非天然核苷酸包括：
Figure 02_image063
Figure 02_image065
。
在一些實施例中，可以用於製備本文公開的IL-2接合物的非天然核苷酸可衍生自下式的化合物：
Figure 02_image067
其中R 2選自氫、烷基、烯基、炔基、甲氧基、甲硫醇、甲烷硒基、鹵素、氰基和疊氮基；並且 波浪線指示與核糖基或2'-去氧核糖基的鍵，其中核糖基或2'-去氧核糖基部分的5'-羥基為游離形式，連接至單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、α-硫代三磷酸酯、β-硫代三磷酸酯或γ-硫代三磷酸酯基團，或包含在RNA或DNA中或者RNA類似物或DNA類似物中。
在一些實施例中，可以用於製備本文公開的IL-2接合物的非天然核苷酸可衍生自下式的化合物：
Figure 02_image069
其中：
每個X獨立地是碳或氮；
當X是氮時R 2不存在，而當X是碳時，R 2是存在的且獨立地是氫、烷基、烯基、炔基、甲氧基、甲硫醇、甲烷硒基、鹵素、氰基或疊氮基；
Y是硫、氧、硒或二級胺；
E是氧、硫或硒；並且
波浪線指示與核糖基、去氧核糖基或二去氧核糖基部分或其類似物的鍵合點，其中所述核糖基、去氧核糖基或二去氧核糖基部分或其類似物是游離形式，連接至單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、α-硫代三磷酸酯、β-硫代三磷酸酯或γ-硫代三磷酸酯基團，或包含在RNA或DNA中或者RNA類似物或DNA類似物中。
在一些實施例中，每個X是碳。在一些實施例中，至少一個X是碳。在一些實施例中，一個X是碳。在一些實施例中，至少兩個X是碳。在一些實施例中，兩個X是碳。在一些實施例中，至少一個X是氮。在一些實施例中，一個X是氮。在一些實施例中，至少兩個X是氮。在一些實施例中，兩個X是氮。
在一些實施例中，Y是硫。在一些實施例中，Y是氧。在一些實施例中，Y是硒。在一些實施例中，Y是二級胺。
在一些實施例中，E是硫。在一些實施例中，E是氧。在一些實施例中，E是硒。
在一些實施例中，當X是碳時R 2是存在的。在一些實施例中，當X是氮時R 2不存在。在一些實施例中，每個R 2在存在的情況下是氫。在一些實施例中，R 2是烷基，如甲基、乙基或丙基。在一些實施例中，R 2是烯基，如-CH 2=CH 2。在一些實施例中，R 2是炔基，如乙炔基。在一些實施例中，R 2是甲氧基。在一些實施例中，R 2是甲硫醇。在一些實施例中，R 2是甲烷硒基。在一些實施例中，R 2是鹵素，如氯、溴或氟。在一些實施例中，R 2是氰基。在一些實施例中，R 2是疊氮基。
在一些實施例中，E是硫，Y是硫，並且每個X獨立地是碳或氮。在一些實施例中，E是硫，Y是硫，並且每個X是碳。
在一些實施例中，可以用於製備本文公開的IL-2接合物的非天然核苷酸可衍生自
Figure 02_image071
、
Figure 02_image073
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image079
、
Figure 02_image081
、
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
、
Figure 02_image091
和
Figure 02_image093
。在一些實施例中，可以用於製備本文公開的IL-2接合物的非天然核苷酸包括
Figure 02_image095
、
Figure 02_image097
、
Figure 02_image099
、
Figure 02_image101
、
Figure 02_image103
、
Figure 02_image105
、
Figure 02_image107
、
Figure 02_image109
、
Figure 02_image111
、
Figure 02_image113
、
Figure 02_image115
和
Figure 02_image117
或其鹽。
在一些實施例中，非天然鹼基對生成非天然胺基酸，如以下中所述：Dumas等人 ,“Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology,” Chemical Science, 6: 50-69 (2015)，其披露內容通過引用併入本文。
在一些實施例中，通過包含非天然核酸的合成密碼子將非天然胺基酸摻入細胞激素（例如，IL多肽）中。在一些情況下，通過正交的修飾的合成酶/tRNA對將非天然胺基酸摻入細胞激素中。此類正交對包含天然合成酶，所述天然合成酶能夠用非天然胺基酸裝載非天然tRNA，同時最小化a) 其他內源胺基酸在非天然tRNA上以及b) 非天然胺基酸在其他內源tRNA上的裝載。此類正交對包含能夠通過非天然合成酶進行裝載，同時避免通過內源合成酶裝載a) 其他內源胺基酸的tRNA。在一些實施例中，從各種生物體（如細菌、酵母、古細菌或人來源）鑒定出此類對。在一些實施例中，正交合成酶/tRNA對包含來自單一生物體的組分。在一些實施例中，正交合成酶/tRNA對包含來自兩種不同的生物體的組分。在一些實施例中，正交合成酶/tRNA對包含在修飾之前促進兩個不同胺基酸轉譯的組分。在一些實施例中，正交合成酶是經修飾的丙胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是修飾的精胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是修飾的天門冬醯胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是修飾的天門冬胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是修飾的半胱胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是修飾的麩醯胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是修飾的麩胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是修飾的丙胺酸甘胺酸。在一些實施例中，正交合成酶是修飾的組胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是修飾的白胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是修飾的異白胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是修飾的離胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是修飾的甲硫胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是修飾的苯丙胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是修飾的脯胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是修飾的絲胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是修飾的蘇胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是修飾的色胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是修飾的酪胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是修飾的擷胺酸合成酶。在一些實施例中，正交合成酶是修飾的磷酸絲胺酸合成酶。在一些實施例中，正交tRNA是修飾的丙胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是修飾的精胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是修飾的天門冬醯胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是修飾的天門冬胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是修飾的半胱胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是修飾的麩醯胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是修飾的麩胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是修飾的丙胺酸甘胺酸。在一些實施例中，正交tRNA是修飾的組胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是修飾的白胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是修飾的異白胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是修飾的離胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是修飾的甲硫胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是修飾的苯丙胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是修飾的脯胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是修飾的絲胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是修飾的蘇胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是修飾的色胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是修飾的酪胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是修飾的擷胺酸tRNA。在一些實施例中，正交tRNA是修飾的磷酸絲胺酸tRNA。
在一些實施例中，通過胺醯（aaRS或RS）-tRNA合成酶-tRNA對將非天然胺基酸摻入細胞激素（例如，IL多肽）中。例示性aaRS-tRNA對包括但不限於詹氏甲烷球菌（ Methanococcus jannaschii）（ Mj-Tyr）aaRS/tRNA對、大腸桿菌TyrRS（ Ec-Tyr）/嗜熱脂肪芽孢桿菌（ B. stearothermophilus）tRNA CUA對、大腸桿菌LeuRS（ Ec-Leu）/嗜熱脂肪芽孢桿菌tRNA CUA對和吡咯離胺醯-tRNA對。在一些情況下，通過 Mj-TyrRS/tRNA對將非天然胺基酸摻入細胞激素（例如，IL多肽）中。可以通過 Mj-TyrRS/tRNA對摻入的例示性UAA包括但不限於對位取代的苯丙胺酸衍生物，如對-胺基苯丙胺酸和對-甲氧基苯丙胺酸；間位取代的酪胺酸衍生物，如3-胺基酪胺酸、3-硝基酪胺酸、3,4-二羥基苯丙胺酸和3-碘酪胺酸；苯基硒代半胱胺酸；對-硼苯丙胺酸；以及鄰-硝基苄基酪胺酸。
在一些情況下，通過 Ec-Tyr/tRNA CUA或 Ec-Leu/tRNA CUA對將非天然胺基酸摻入細胞激素（例如，IL多肽）中。可以通過 Ec-Tyr/tRNA CUA或 Ec-Leu/tRNA CUA對摻入的例示性UAA包括但不限於含有苯甲酮、酮、碘化物或疊氮化物取代基的苯丙胺酸衍生物； O-炔丙基酪胺酸；α-胺基辛酸、O-甲基酪胺酸、O-硝基苄基半胱胺酸；和3-(萘-2-基胺基)-2-胺基-丙酸。
在一些情況下，通過吡咯離胺醯-tRNA對將非天然胺基酸摻入細胞激素（例如，IL多肽）中。在一些情形中，PylRS獲自古細菌，例如獲自產甲烷的古細菌。在一些情形中，PylRS獲自巴氏甲烷八疊球菌（ Methanosarcina barkeri）、馬氏甲烷八疊球菌（ Methanosarcina mazei）或乙酸甲烷八疊球菌（ Methanosarcina acetivorans）。可以通過吡咯離胺醯-tRNA對摻入的例示性UAA包括但不限於醯胺和胺基甲酸酯取代的離胺酸，如2-胺基-6-((R)-四氫呋喃-2-甲醯胺基)己酸、 N-ε- D-脯胺醯基- L-離胺酸和 N-ε-環戊基氧基羰基- L-離胺酸； N-ε-丙烯醯基- L-離胺酸； N-ε-[(1-(6-硝基苯並[d][1,3]二氧雜環戊烯-5-基)乙氧基)羰基]- L-離胺酸；和 N-ε-(1-甲基環丙-2-烯甲醯胺基)離胺酸。在一些實施例中，本文公開的IL-2接合物可以通過使用馬氏甲烷八疊球菌（ M. mazei）tRNA來製備，所述tRNA通過巴氏甲烷八疊球菌（ M. barkeri）吡咯離胺醯-tRNA合成酶（ MbPylRS）選擇性裝載非天然胺基酸，如 N6-((2-疊氮基乙氧基)-羰基)-L-離胺酸（AzK）。其他方法是業內一般技術者已知的，如Zhang等人, Nature 2017, 551(7682): 644-647中披露的那些，其披露內容通過引用併入本文。
在一些情況下，通過US 9,988,619和US 9,938,516中披露的合成酶將非天然胺基酸摻入本文所述的細胞激素（例如，IL多肽）中，其每一個的披露內容通過引用併入本文。
在合適的培養基中培養或維持引入了本文公開的構築體或載體的宿主細胞，使得產生tRNA、tRNA合成酶和目的蛋白質。培養基還包含一種或多種非天然胺基酸，使得目的蛋白質摻入所述一種或多種非天然胺基酸。在一些實施例中，來自細菌、植物或藻類的核苷三磷酸轉運蛋白（NTT）也存在於宿主細胞中。在一些實施例中，本文公開的IL-2接合物是通過使用表現NTT的宿主細胞來製備。在一些實施例中，用於宿主細胞中的核苷酸三磷酸核苷轉運蛋白可以選自TpNTT1、TpNTT2、TpNTT3、TpNTT4、TpNTT5、TpNTT6、TpNTT7、TpNTT8（假微型海鏈藻（T. pseudonana））、PtNTT1、PtNTT2、PtNTT3、PtNTT4、PtNTT5、PtNTT6（三角褐指藻（P. tricornutum））、GsNTT（嗜硫原始紅藻（Galdieria sulphuraria））、AtNTT1、AtNTT2（阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana））、CtNTT1、CtNTT2（沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis））、PamNTT1、PamNTT2（嗜阿米巴原衣原體（Protochlamydia amoebophila））、CcNTT（石竹殺手桿菌（Caedibacter caryophilus））、RpNTT1（普氏立克次體（Rickettsia prowazekii））。在一些實施例中，NTT選自PtNTT1、PtNTT2、PtNTT3、PtNTT4、PtNTT5和PtNTT6。在一些實施例中，所述NTT是PtNTT1。在一些實施例中，所述NTT是PtNTT2。在一些實施例中，所述NTT是PtNTT3。在一些實施例中，所述NTT是PtNTT4。在一些實施例中，所述NTT是PtNTT5。在一些實施例中，所述NTT是PtNTT6。可以使用的其他NTT披露於Zhang等人, Nature2017, 551(7682): 644-647；Malyshev等人 Nature2014 (509(7500), 385-388；和Zhang等人Proc Natl Acad Sci USA, 2017, 114:1317-1322中。
正交tRNA合成酶/tRNA對用非天然胺基酸裝載tRNA，並回應於所述密碼子將所述非天然胺基酸摻入多肽鏈中。例示性aaRS-tRNA對包括但不限於詹氏甲烷球菌（ Methanococcus jannaschii）（ Mj-Tyr）aaRS/tRNA對、大腸桿菌TyrRS（ Ec-Tyr）/嗜熱脂肪芽孢桿菌（ B. stearothermophilus）tRNA CUA對、大腸桿菌LeuRS（ Ec-Leu）/嗜熱脂肪芽孢桿菌tRNA CUA對和吡咯離胺醯-tRNA對。可以根據本公開文本使用的其他aaRS-tRNA對包括衍生自馬氏甲烷八疊球菌的那些，描述於以下中的那些：Feldman等人, J Am Chem Soc., 2018 140:1447-1454；和Zhang等人 Proc Natl Acad Sci USA, 2017, 114:1317-1322；其每一個的披露內容通過引用併入本文。
在一些實施例中提供在表現NTT和tRNA合成酶的細胞系統中製備本文公開的IL-2接合物的方法。在本文所述的一些實施例中，NTT選自PtNTT1、PtNTT2、PtNTT3、PtNTT4、PtNTT5和PtNTT6，並且tRNA合成酶選自詹氏甲烷球菌、大腸桿菌TyrRS（ Ec-Tyr）/嗜熱脂肪芽孢桿菌和馬氏甲烷八疊球菌。在一些實施例中，NTT是PtNTT1，並且tRNA合成酶衍生自詹氏甲烷球菌、大腸桿菌TyrRS（ Ec-Tyr）/嗜熱脂肪芽孢桿菌或馬氏甲烷八疊球菌。在一些實施例中，NTT是PtNTT2，並且tRNA合成酶衍生自詹氏甲烷球菌、大腸桿菌TyrRS（ Ec-Tyr）/嗜熱脂肪芽孢桿菌或馬氏甲烷八疊球菌。在一些實施例中，NTT是PtNTT3，並且tRNA合成酶衍生自詹氏甲烷球菌、大腸桿菌TyrRS（ Ec-Tyr）/嗜熱脂肪芽孢桿菌或馬氏甲烷八疊球菌。在一些實施例中，NTT是PtNTT3，並且tRNA合成酶衍生自詹氏甲烷球菌、大腸桿菌TyrRS（ Ec-Tyr）/嗜熱脂肪芽孢桿菌或馬氏甲烷八疊球菌。在一些實施例中，NTT是PtNTT4，並且tRNA合成酶衍生自詹氏甲烷球菌、大腸桿菌TyrRS（ Ec-Tyr）/嗜熱脂肪芽孢桿菌或馬氏甲烷八疊球菌。在一些實施例中，NTT是PtNTT5，並且tRNA合成酶衍生自詹氏甲烷球菌、大腸桿菌TyrRS（ Ec-Tyr）/嗜熱脂肪芽孢桿菌或馬氏甲烷八疊球菌。在一些實施例中，NTT是PtNTT6，並且tRNA合成酶衍生自詹氏甲烷球菌、大腸桿菌TyrRS（ Ec-Tyr）/嗜熱脂肪芽孢桿菌或馬氏甲烷八疊球菌。
在一些實施例中，本文公開的IL-2接合物可以在細胞（如大腸桿菌）中製備，其包含 (a) 核苷酸三磷酸轉運蛋白 PtNTT2（包括截短的變異體，其中全長蛋白質的前65個胺基酸殘基缺失），(b) 包含雙鏈寡核苷酸的質體，所述雙鏈寡核苷酸編碼具有所需胺基酸序列的IL-2變異體並且含有包含第一非天然核苷酸和第二非天然核苷酸的非天然鹼基對，以在所需位置提供密碼子，將在所述位置摻入非天然胺基酸，如 N6-((2-疊氮基乙氧基)-羰基)-L-離胺酸（AzK），(c) 編碼衍生自馬氏甲烷八疊球菌的tRNA的質體，並且其包含非天然核苷酸以提供公認的反密碼子（針對IL-2變異體的密碼子）來代替其天然序列，以及 (d) 編碼巴氏甲烷八疊球菌來源的吡咯離胺醯-tRNA合成酶（ MbPylRS）的質體，其可以是編碼所述tRNA的相同質體或不同質體。在一些實施例中，細胞進一步補充有包含一種或多種非天然鹼基的去氧核糖三磷酸酯。在一些實施例中，細胞進一步補充有包含一種或多種非天然鹼基的核糖三磷酸酯。在一些實施例中，細胞進一步補充有一種或多種非天然胺基酸，如 N6-((2-疊氮基乙氧基)-羰基)-L-離胺酸（AzK）。在一些實施例中，編碼所希望的IL-2變異體的胺基酸序列的雙鏈寡核苷酸在編碼具有SEQ ID NO: 1的蛋白質的序列的位置64處含有密碼子AXC，其中X是非天然核苷酸。在一些實施例中，細胞還包含質體，所述質體可以是蛋白質表現質體或另一種質體，其編碼來自馬氏甲烷八疊球菌的正交tRNA基因，所述正交tRNA基因包含AXC匹配的反密碼子GYT代替其天然序列，其中Y是互補的並且可以與所述密碼子中的非天然核苷酸相同或不同的非天然核苷酸。在一些實施例中，密碼子中的非天然核苷酸與反密碼子中的非天然核苷酸不同且互補。在一些實施例中，密碼子中的非天然核苷酸與反密碼子中的非天然核苷酸相同。在一些實施例中，在雙鏈寡核苷酸中包含非天然鹼基對的第一和第二非天然核苷酸可以衍生自
Figure 02_image073
、
Figure 02_image077
、
Figure 02_image119
、
Figure 02_image121
、
Figure 02_image123
和
Figure 02_image093
。在一些實施例中，在雙鏈寡核苷酸中的包含非天然鹼基對的第一和第二非天然核苷酸可以衍生自
Figure 02_image073
和
Figure 02_image093
。在一些實施例中，第一和第二非天然核苷酸的三磷酸酯包括
Figure 02_image097
、
Figure 02_image099
和
Figure 02_image117
、或其鹽。在一些實施例中，第一和第二非天然核苷酸的三磷酸酯包括
Figure 02_image097
、和
Figure 02_image117
、或其鹽。在一些實施例中，源自包含第一非天然核苷酸和第二非天然核苷酸的雙鏈寡核苷酸的mRNA可以包含含有衍生自
Figure 02_image071
、
Figure 02_image075
和
Figure 02_image091
的非天然核苷酸的密碼子。在一些實施例中，馬氏甲烷八疊球菌tRNA可以包含含有非天然核苷酸的反密碼子，其識別包含mRNA的非天然核苷酸的密碼子。馬氏甲烷八疊球菌tRNA中的反密碼子可以包含衍生自
Figure 02_image071
、
Figure 02_image075
、
Figure 02_image125
、
Figure 02_image127
、
Figure 02_image129
和
Figure 02_image091
的非天然核苷酸。在一些實施例中，mRNA包含衍生自
Figure 02_image071
的非天然核苷酸。在一些實施例中，mRNA包含衍生自
Figure 02_image075
的非天然核苷酸。在一些實施例中，mRNA包含衍生自
Figure 02_image131
的非天然核苷酸。在一些實施例中，mRNA包含衍生自
Figure 02_image133
的非天然核苷酸。在一些實施例中，mRNA包含衍生自
Figure 02_image134
的非天然核苷酸。在一些實施例中，mRNA包含衍生自
Figure 02_image091
的非天然核苷酸。在一些實施例中，tRNA包含衍生自
Figure 02_image071
的非天然核苷酸。在一些實施例中，tRNA包含衍生自
Figure 02_image075
的非天然核苷酸。在一些實施例中，tRNA包含衍生自
Figure 02_image135
的非天然核苷酸。在一些實施例中，tRNA包含衍生自
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的非天然核苷酸。在一些實施例中，tRNA包含衍生自
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的非天然核苷酸。在一些實施例中，tRNA包含衍生自
Figure 02_image091
的非天然核苷酸。在一些實施例中，mRNA包含衍生自
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的非天然核苷酸，並且tRNA包含衍生自
Figure 02_image091
的非天然核苷酸。在一些實施例中，mRNA包含衍生自
Figure 02_image091
的非天然核苷酸，並且tRNA包含衍生自
Figure 02_image071
的非天然核苷酸。在一些實施例中，mRNA包含衍生自
Figure 02_image071
的非天然核苷酸，並且tRNA包含衍生自
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的非天然核苷酸。在一些實施例中，mRNA包含衍生自
Figure 02_image139
的非天然核苷酸，並且tRNA包含衍生自
Figure 02_image071
的非天然核苷酸。將宿主細胞在含有適當營養素的培養基中培養，並補充以下物質：(a) 包含一種或多種非天然鹼基的去氧核糖核苷的三磷酸酯，其是編碼具有密碼子的細胞激素基因的一種或多種質體的複製所需的，(b) 包含一種或多種非天然鹼基的核糖核苷的三磷酸酯，其是以下的轉錄所需的：(i) 對應於細胞激素的編碼序列並且含有包含一種或多種非天然鹼基的密碼子的mRNA，和 (ii) 含有包含一種或多種非天然鹼基的反密碼子的tRNA，以及 (c) 要摻入目的細胞激素的多肽序列中的一種或多種非天然胺基酸。然後將宿主細胞維持在允許目的蛋白質表現的條件下。
所表現的所得含AzK蛋白質可以通過業內一般技術者已知的方法來純化，然後可以允許其與炔烴（如包含如本文所公開的具有所需平均分子量的PEG鏈的DBCO）在業內一般技術者已知的條件下反應，以提供本文公開的IL-2接合物。其他方法是業內一般技術者已知的，如以下中披露的那些：Zhang等人, Nature 2017, 551(7682): 644-647；WO 2015157555；WO 2015021432；WO 2016115168；WO 2017106767；WO 2017223528；WO 2019014262；WO 2019014267；WO 2019028419；和WO 2019/028425，其每一個的披露內容通過引用併入本文。
所表現的包含一種或多種非天然胺基酸（例如Azk）的所得蛋白質可以通過業內一般技術者已知的方法來純化，然後可以允許其與炔烴（如包含如本文所公開的具有所需平均分子量的PEG鏈的DBCO）在業內一般技術者已知的條件下反應，以提供本文公開的IL-2接合物。其他方法是業內一般技術者已知的，如以下中披露的那些：Zhang等人, Nature 2017, 551(7682): 644-647；WO 2015157555；WO 2015021432；WO 2016115168；WO 2017106767；WO 2017223528；WO 2019014262；WO 2019014267；WO 2019028419；和WO 2019/028425，其每一個的披露內容通過引用併入本文。
可替代地，通過將本文所述的包含tRNA和胺醯tRNA合成酶並包含具有一個或多個框內正交（終止）密碼子的目的核酸序列的核酸構築體引入宿主細胞中，來製備包含一種或多種非天然胺基酸的IL-2多肽。將宿主細胞在含有適當的營養素的培養基中培養，補充有 (a) 包含一個或多個非天然鹼基的去氧核糖核苷的三磷酸酯，對於編碼包含新密碼子和反密碼子的細胞激素基因之一種或多種質體的複製是必需的；(b) 核糖核苷的三磷酸酯，其對於對應於以下的mRNA的轉錄是必需的：(i) 含有密碼子的細胞激素序列，和 (ii) 含有反密碼子的正交tRNA；以及 (c) 一種或多種非天然胺基酸。然後將宿主細胞維持在允許目的蛋白質表現的條件下。回應於非天然密碼子，將所述一種或多種非天然胺基酸摻入多肽鏈中。例如，將一種或多種非天然胺基酸摻入IL-2多肽中。可替代地，可以在蛋白質的兩個或更多個位點處將兩個或更多個非天然胺基酸摻入IL-2多肽中。
一旦在宿主細胞中產生了摻入非天然胺基酸的IL-2多肽，就可以通過本領域已知的多種技術（包括酶促、化學和/或滲透裂解和物理破壞）從其提取。IL-2多肽可以通過習知的標準技術來純化，例如製備型離子交換層析、疏水層析、親和層析或者業內一般技術者已知的任何其他合適的技術。
合適的宿主細胞可以包括細菌細胞（例如，大腸桿菌，BL21(DE3)），但最合適的宿主細胞是真核細胞，例如昆蟲細胞（例如果蠅，如黑腹果蠅）、酵母細胞、線蟲（例如秀麗隱杆線蟲（ C. elegans））、小鼠（例如小家鼠）或哺乳動物細胞（如中國倉鼠卵巢細胞（CHO）或COS細胞、人293T細胞、HeLa細胞、NIH 3T3細胞和小鼠紅白血病（MEL）細胞）或人類細胞或其他真核細胞。其他合適的宿主細胞是習知技術者已知的。合適地，宿主細胞是哺乳動物細胞，如人類細胞或昆蟲細胞。在一些實施例中，合適的宿主細胞包括大腸桿菌。
通常可以在本發明的實施例中使用的其他合適的宿主細胞是在實例部分中提到的那些。可以經由常規轉化或轉染技術將載體DNA引入宿主細胞中。如本文所用，術語“轉化”和“轉染”旨在指用於將外來核酸分子（例如，DNA）引入宿主細胞中的多種公認的技術，包括磷酸鈣或氯化鈣共沈澱、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂質體轉染或電穿孔。用於轉化或轉染宿主細胞的合適方法是本領域習知的。
當創建細胞株時，通常優選製備穩定的細胞株。例如，對於哺乳動物細胞的穩定轉染，已知根據所使用的表現載體和轉染技術，只有一小部分細胞可以將外來DNA整合到其基因組中。為了鑒定和選擇這些整合體，通常將編碼選擇性標記物（例如，對抗生素的抗性）的基因與目的基因一起引入宿主細胞中。優選的選擇性標記物包括賦予對藥物（如G418、潮黴素或甲胺蝶呤）的抗性的那些選擇性標記物。可以將編碼選擇性標記物的核酸分子在相同載體上引入宿主細胞中，或者可以在單獨的載體上引入。可以通過藥物選擇來鑒定被引入的核酸分子穩定轉染的細胞（例如，已摻入選擇性標記基因的細胞將存活，而其他細胞死亡）。
在一個實施例中，將本文所述的構築體整合到宿主細胞的基因組中。穩定整合的優點是實現了各個細胞或選殖株之間的均勻性。另一個優點是可以進行最佳生產者的選擇。因此，希望創建穩定的細胞株。在另一個實施例中，將本文所述的構築體轉染到宿主細胞中。將構築體轉染到宿主細胞中的優點是可以使蛋白質產量最大化。在一個方面，描述了包含本文所述的核酸構築體或載體的細胞。 可用於本發明的 PD-1 抗體和抗原結合片段
可用於本發明的治療方法和用途的結合人PD-1的mAb的例子描述於US 7,521,051、US 8,008,449和US 8,354,509中。在本發明的治療方法、組合物和用途中可用作PD-1拮抗劑的特定抗人類PD-1 mAb包括：派姆單抗（以前稱為MK-3475、SCH 900475和蘭姆利珠單抗（lambrolizumab））；人源化IgG4 mAb，其具有 WHO Drug Information, 第27卷, 第2期, 第161-162頁 (2013)中所述的結構並且包含圖1中所示的重鏈和輕鏈胺基酸序列；以及人源化抗體h409A11、h409A16和h409A17，其描述於WO 2008/156712和表2中。
在本發明的治療方法、組合物、套組和用途的一些實施例中，所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含：(a) 包含SEQ ID NO: 11、12和13中所示的胺基酸序列的輕鏈CDR和包含SEQ ID NO: 16、17和18中所示的胺基酸序列的重鏈CDR。
在一些實施例中，所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段是人類抗體。在其他實施例中，所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段是人源化抗體。在其他實施例中，所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段是嵌合抗體。在具體實施例中，所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段是單株抗體。
在本發明的治療方法、組合物、套組和用途的其他實施例中，所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段特異性結合人類PD-1，並且包含 (a) 包含SEQ ID NO: 19所示胺基酸序列或其變異體的重鏈可變區，和 (b) 包含選自SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的輕鏈可變區。
重鏈可變區序列或全長重鏈序列的變異體與參考序列相同，除了在框架區（即，CDR之外）中具有多達17個保守胺基酸取代，並且優選在框架區中具有少於10、9、8、7、6或5個保守胺基酸取代。輕鏈可變區序列或全長輕鏈序列的變異體與參考序列相同，除了在框架區（即，CDR之外）中具有多達5個保守胺基酸取代，並且優選在框架區中具有少於4、3或2個保守胺基酸取代。
在本發明的治療方法、組合物、套組和用途的另一個實施例中，所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段是特異性結合人類PD-1的單株抗體，並且包含 (a) 包含SEQ ID NO: 20所示的胺基酸序列或其變異體或由所述胺基酸序列或其變異體組成的重鏈；和 (b) 包含SEQ ID NO: 15所示的胺基酸序列或其變異體或由所述胺基酸序列或其變異體組成的輕鏈。
在本發明的治療方法、組合物和用途的又另一個實施例中，所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段是特異性結合人類PD-1的單株抗體，並且包含 (a) 包含SEQ ID NO: 20所示的胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成的重鏈；和 (b) 包含SEQ ID NO: 15所示的胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成的輕鏈。
下表2提供了用於本發明的治療方法、組合物、套組和用途的例示性抗PD-1 mAb的胺基酸序列的列表。
表2.例示性抗人PD-1抗體
A.包含WO2008/156712中hPD-1.09A的輕鏈和重鏈CDR(派姆單抗的輕鏈和重鏈CDR)
CDRL1 RASKGVSTSGYSYLH SEQ ID NO:11
CDRL2 LASYLES SEQ ID NO:12
CDRL3 QHSRDLPLT SEQ ID NO:13
CDRH1 NYYMY SEQ ID NO:16
CDRH2 GINPSNGGTNFNEKFKN SEQ ID NO:17
CDRH3 RDYRFDMGFDY SEQ ID NO:18
C.包含WO 2008/156712中的成熟h109A重鏈可變(VH)區和成熟K09A輕鏈可變(VL)區之一
重鏈VH QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQA PGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYME LKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 19(派姆單抗的VH)
輕鏈VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQK PGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFA VYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 14(派姆單抗的VL)或
重鏈 QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQA PGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYME LKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSAST KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKP SNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID NO: 20(派姆單抗的重鏈)
輕鏈 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQK PGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFA VYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG EC SEQ ID NO: 15(派姆單抗的輕鏈)或
在本文所述的任何方法和用途的一些實施例中，所述方法包括 (i) 每約三週向患者投予約200 mg的抗PD-1抗體或其抗原結合片段或 (ii) 每約六週向患者投予約400 mg的抗PD-1抗體或其抗原結合片段。
在本文所述的任何方法、組合物、套組和用途的一些實施例中，所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO: 19所示的胺基酸序列之重鏈可變區和包含SEQ ID NO: 14所示的胺基酸序列之輕鏈可變區。
在本文所述的任何方法、組合物、套組和用途的一些實施例中，所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段是單株抗體，其包含 (a) 重鏈，其包含SEQ ID NO: 20所示的胺基酸序列或SEQ ID NO: 20的變異體，和 (b) 輕鏈，其包含SEQ ID NO: 15所示的胺基酸序列或SEQ ID NO: 15的變異體。 治療方法
在一個方面，本文提供了一種在有需要的受試者中治療肺癌的方法，其包括向所述受試者投予 (a) 如本文所述的IL-2接合物，和 (b) 抗PD-1抗體或其抗原結合片段，其中所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO: 11、12和13中所示的胺基酸序列之輕鏈互補決定區（CDR）和包含SEQ ID NO: 16、17和18中所示的胺基酸序列之重鏈CDR（例如派姆單抗）。在一些實施例中，在有需要的受試者中治療癌症的方法包括向所述受試者投予 (a) 約8 μg/kg的如本文所述的IL-2接合物，和 (b) 抗PD-1抗體或其抗原結合片段，其中所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO: 11、12和13中所示的胺基酸序列之輕鏈互補決定區（CDR）和包含SEQ ID NO: 16、17和18中所示的胺基酸序列之重鏈CDR（例如派姆單抗）。在一些實施例中，在有需要的受試者中治療癌症的方法包括向所述受試者投予 (a) 約16 μg/kg的如本文所述的IL-2接合物，和 (b) 抗PD-1抗體或其抗原結合片段，其中所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO: 11、12和13中所示的胺基酸序列之輕鏈互補決定區（CDR）和包含SEQ ID NO: 16、17和18中所示的胺基酸序列之重鏈CDR（例如派姆單抗）。在一些實施例中，在有需要的受試者中治療癌症的方法包括向所述受試者投予 (a) 約24 μg/kg的如本文所述的IL-2接合物，和 (b) 抗PD-1抗體或其抗原結合片段，其中所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO: 11、12和13中所示的胺基酸序列之輕鏈互補決定區（CDR）和包含SEQ ID NO: 16、17和18中所示的胺基酸序列之重鏈CDR（例如派姆單抗）。在一些實施例中，在有需要的受試者中治療癌症的方法包括向所述受試者投予 (a) 約32 μg/kg的如本文所述的IL-2接合物，和 (b) 抗PD-1抗體或其抗原結合片段，其中所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO: 11、12和13中所示的胺基酸序列之輕鏈互補決定區（CDR）和包含SEQ ID NO: 16、17和18中所示的胺基酸序列之重鏈CDR（例如派姆單抗）。
在另一方面，本文提供了用於在有需要的受試者中治療肺癌的方法中的IL-2接合物，所述方法包括向所述受試者投予 (a) 如本文所述的IL-2接合物，和 (b) 抗PD-1抗體或其抗原結合片段，其中所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO: 11、12和13中所示的胺基酸序列之輕鏈互補決定區（CDR）和包含SEQ ID NO: 16、17和18中所示的胺基酸序列之重鏈CDR（例如派姆單抗），其中：所述肺癌是非鱗狀非小細胞肺癌（NSCLC）、胸膜間皮瘤、不可切除的肺癌、IV期肺癌、PD-L1腫瘤比例得分大於或等於50%的NSCLC、或PD-L1腫瘤進展得分小於50%或為1%-49%的NSCLC。
在另外的方面，本文提供了在有需要的受試者中治療肺癌的方法，其包括：選擇患有肺癌的受試者，其中基於一種或多種屬性選擇所述受試者，所述屬性包括 (i) 所述肺癌是非鱗狀非小細胞肺癌（NSCLC）；(ii) 所述肺癌是胸膜間皮瘤；(iii) 所述肺癌是不可切除的肺癌；(iv) 所述肺癌是IV期肺癌；(v) 所述肺癌是PD-L1腫瘤比例得分大於或等於50%的NSCLC；(vi) 所述肺癌是PD-L1腫瘤進展得分小於50%或為1%-49%的NSCLC；以及向所述受試者投予 (a) 如本文所述的IL-2接合物，和 (b) 抗PD-1抗體或其抗原結合片段，其中所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO: 11、12和13中所示的胺基酸序列之輕鏈互補決定區（CDR）和包含SEQ ID NO: 16、17和18中所示的胺基酸序列之重鏈CDR（例如派姆單抗）。
在另外的方面，本文提供了一種在有需要的受試者中治療肺癌的方法，其包括向所述受試者投予 (a) 本文所述的IL-2接合物，(b) 抗PD-1抗體或其抗原結合片段，其中所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO: 11、12和13中所示的胺基酸序列之輕鏈互補決定區（CDR）和包含SEQ ID NO: 16、17和18中所示的胺基酸序列之重鏈CDR（例如派姆單抗），和 (c) 順鉑。
在另外的方面，本文提供了IL-2接合物用於製備用於本文揭露的治療有需要的受試者中的癌症的方法的藥物中的用途。
以下實施例適用於任何前述方面。在一些實施例中，所述方法包括向所述受試者投予 (a) 約8 μg/kg的如本文所述的IL-2接合物，和 (b) 抗PD-1抗體或其抗原結合片段，其中所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO: 11、12和13中所示的胺基酸序列之輕鏈互補決定區（CDR）和包含SEQ ID NO: 16、17和18中所示的胺基酸序列之重鏈CDR（例如派姆單抗）。在一些實施例中，所述方法包括向所述受試者投予 (a) 約16 μg/kg的如本文所述的IL-2接合物，和 (b) 抗PD-1抗體或其抗原結合片段，其中所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO: 11、12和13中所示的胺基酸序列之輕鏈互補決定區（CDR）和包含SEQ ID NO: 16、17和18中所示的胺基酸序列之重鏈CDR（例如派姆單抗）。在一些實施例中，所述方法包括向所述受試者投予 (a) 約24 μg/kg的如本文所述的IL-2接合物，和 (b) 抗PD-1抗體或其抗原結合片段（例如派姆單抗）。在一些實施例中，所述方法包括向所述受試者投予 (a) 約32 μg/kg的如本文所述的IL-2接合物，和 (b) 抗PD-1抗體或其抗原結合片段，其中所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO: 11、12和13中所示的胺基酸序列之輕鏈互補決定區（CDR）和包含SEQ ID NO: 16、17和18中所示的胺基酸序列之重鏈CDR（例如派姆單抗）。
在以下部分中描述的實施例適用於任何前述方面。 癌症類型
在一些實施例中，所述肺癌是非小細胞肺癌（NSCLC）。在一些實施例中，所述肺癌是不可切除的。在一些實施例中，所述肺癌是IV期，如IV期NSCLC。在一些實施例中，所述肺癌是非鱗狀NSCLC，如IV期非鱗狀NSCLC。在一些實施例中，所述肺癌是胸膜間皮瘤，如不可切除的胸膜間皮瘤。在一些實施例中，所述肺癌是NSCLC腺癌。
在一些實施例中，所述肺癌（例如NSCLC）具有大於或等於50%的PD-L1腫瘤比例得分。在一些實施例中，所述肺癌（例如NSCLC）具有小於50%的PD-L1腫瘤比例得分。在一些實施例中，所述肺癌（例如NSCLC）具有1%-49%的PD-L1腫瘤比例得分。PD-L1腫瘤比例得分是顯示膜PD-L1染色的活腫瘤細胞相對於所有活腫瘤細胞的百分比。參見例如，Sim等人, Korean J Intern Med. 2018年7月; 33(4): 737-744。 投予
在一些實施例中，通過靜脈內、皮下、肌內、腦內、鼻內、動脈內、關節內、皮內、玻璃體內、骨內輸注、腹膜內或鞘內投予向所述受試者投予所述IL-2接合物。在一些實施例中，通過靜脈內、皮下或肌內投予向所述受試者投予所述IL-2接合物。在一些實施例中，通過靜脈內投予向所述受試者投予所述IL-2接合物。在一些實施例中，通過皮下投予向所述受試者投予所述IL-2接合物。在一些實施例中，通過肌內投予向所述受試者投予所述IL-2接合物。在一些實施例中，通過靜脈內投予向所述受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，通過皮下投予向所述受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段。
可將所述IL-2接合物投予超過一次，例如兩次、三次、四次、五次或更多次。在一些實施例中，治療的持續時間長達24個月，例如1個月、2個月、3個月、6個月、9個月、12個月、15個月、18個月、21個月或24個月。在一些實施例中，治療的持續時間進一步延長至多另外24個月。在一些實施例中，治療的持續時間最多35個週期。在一些實施例中，治療的持續時間直到疾病進展。
在一些實施例中，與所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段的投予分開，將所述IL-2接合物投予於受試者。在一些實施例中，將所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段依序投予於所述受試者。在一些實施例中，在向所述受試者投予所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段之前向所述受試者投予所述IL-2接合物。在一些實施例中，在向所述受試者投予所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段之後向所述受試者投予所述IL-2接合物。在一些實施例中，將所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段同時投予於所述受試者。
在一些實施例中，約每兩週一次、約每三週一次或約每4週一次向有需要的受試者投予所述IL-2接合物。在一些實施例中，每兩週一次向有需要的受試者投予所述IL-2接合物。在一些實施例中，每三週一次向有需要的受試者投予所述IL-2接合物。在一些實施例中，每4週一次向有需要的受試者投予所述IL-2接合物。在一些實施例中，將所述IL-2接合物約每14、15、16、17、18、19、20或21天投予一次。
在一些實施例中，約每兩週一次、約每三週一次或約每4週一次向有需要的受試者投予所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，每兩週一次向有需要的受試者投予所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，每三週一次向有需要的受試者投予所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，每4週一次向有需要的受試者投予所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，將所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段約每14、15、16、17、18、19、20或21天投予一次。
在一些實施例中，約每兩週一次、約每三週一次或約每4週一次向有需要的受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，每兩週一次向有需要的受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，每三週一次向有需要的受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，每4週一次向有需要的受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，將所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段約每14、15、16、17、18、19、20或21天投予一次。
在一些情況下，所需劑量方便地以單一劑量或作為分開的劑量存在，所述分開的劑量是同時（或在短時間段內）或以適當的間隔（例如每天兩個、三個、四個或更多個子劑量）投予。
在一些實施例中，以約200 mg的劑量每3週投予所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，本文所述的方法還包括投予一種或多種另外的治療劑。在一些實施例中，所述另外的治療劑包括化療劑。在一些實施例中，所述化療劑包括培美曲塞。在一些實施例中，所述化療劑包括鉑劑（如卡鉑）。在一些實施例中，所述化療劑包括順鉑。在一些實施例中，所述化療劑包括奈米顆粒白蛋白結合型紫杉醇。在一些實施例中，所述化療劑包括培美曲塞和鉑劑（如卡鉑）。在一些實施例中，所述化療劑包括培美曲塞和順鉑。
在一些實施例中，所述另外的治療劑包括抗組胺藥（如苯海拉明）。在一些實施例中，所述另外的治療劑包括化療劑和抗組胺藥（如苯海拉明）。在一些實施例中，所述另外的治療劑包括上述化療劑中的任一種和抗組胺藥（如苯海拉明）。
在一些實施例中，所述另外的治療劑包括鎮痛藥（如對乙醯胺基酚）。在一些實施例中，所述另外的治療劑包括化療劑和鎮痛藥（如對乙醯胺基酚）。在一些實施例中，所述另外的治療劑包括上述化療劑中的任一種和鎮痛藥（如對乙醯胺基酚）。
在一些實施例中，所述另外的治療劑包括一種或多種維生素（如葉酸和/或維生素B12）。在一些實施例中，所述另外的治療劑包括化療劑和一種或多種維生素（如葉酸和/或維生素B12）。在一些實施例中，所述另外的治療劑包括上述化療劑中的任一種和一種或多種維生素（如葉酸和/或維生素B12）。
在一些實施例中，所述另外的治療劑包括抗組胺藥和鎮痛藥，如苯海拉明和對乙醯胺基酚。在一些實施例中，所述另外的治療劑包括抗組胺藥和一種或多種維生素，如苯海拉明以及葉酸和維生素B12中的一種或兩種。在一些實施例中，所述另外的治療劑包括鎮痛藥和一種或多種維生素，如對乙醯胺基酚以及葉酸和維生素B12中的一種或兩種。在一些實施例中，所述另外的治療劑包括抗組胺藥、鎮痛藥和一種或多種維生素，如苯海拉明、對乙醯胺基酚、以及葉酸和維生素B12中的一種或兩種。在任何上述實施例中，所述另外的治療劑可以還包括化療劑，如上述化療劑中的任一種。 受試者
在一些實施例中，將所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段投予於成人。在一些實施例中，所述成人是男性。在其他實施例中，所述成人是女性。在一些實施例中，所述受試者為18歲或更大。在一些實施例中，所述成人年齡為至少18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95歲。
在一些實施例中，所述受試者患有PD-L1腫瘤比例得分（TPS）大於或等於50%的NSCLC並且未接受過先前治療。也就是說，所述受試者將接受所述IL-2接合物治療作為1L或一線療法。在一些實施例中，所述受試者是1L NSCLC受試者。在一些實施例中，所述受試者是初治NSCLC受試者。在一些實施例中，所述受試者是TPS大於或等於50%的1L NSCLC受試者。在一些實施例中，所述受試者是TPS大於或等於50%的初治NSCLC受試者。在任何上述實施例中，所述NSCLC可以是IV期。
在一些實施例中，所述受試者患有PD-L1腫瘤比例得分（TPS）為1%-49%的NSCLC並且未接受過先前治療。也就是說，所述受試者將接受所述IL-2接合物治療作為1L或一線療法。在一些實施例中，所述受試者是1L NSCLC受試者。在一些實施例中，所述受試者是初治NSCLC受試者。在一些實施例中，所述受試者是TPS為1%-49%的1L NSCLC受試者。在一些實施例中，所述受試者是TPS為1%-49%的初治NSCLC受試者。在任何上述實施例中，所述NSCLC可以是IV期。
在一些實施例中，所述受試者患有非鱗狀NSCLC並且未接受過先前治療，並且治療包括投予 (1) 培美曲塞和 (2) 卡鉑和/或順鉑。也就是說，所述受試者將接受所述IL-2接合物治療作為1L或一線療法。在一些實施例中，所述受試者是1L非鱗狀NSCLC受試者。在一些實施例中，所述受試者是初治非鱗狀NSCLC受試者。在一些實施例中，所述受試者是1L NSCLC受試者。在一些實施例中，所述受試者是初治NSCLC受試者。在任何上述實施例中，所述NSCLC可以是IV期。
在一些實施例中，所述受試者患有NSCLC，已經接受了1或2種先前療法線，並且已經在基於檢查點抑制劑（CPI）的療法（如PD-1/PD-L1）中進展。即，所述受試者將接受IL-2接合物治療作為2/3L或二線或三線療法。在一些實施例中，所述受試者是2L或3L NSCLC受試者。在一些實施例中，所述受試者是2L NSCLC受試者。在一些實施例中，所述受試者是3L NSCLC受試者。在任何上述實施例中，所述NSCLC可以是IV期。在一些實施例中，所述受試者接受一種含抗PD-1/PD-L1的方案，其包括化療劑作為治療IV期NSCLC的方案的一部分，所述IV期NSCLC在根據RECIST 1.1對含抗PD-1/PD-L1的方案證明受益後進展。在一些實施例中，從含抗PD-1/PD-L1的方案中受益的證明定義為≥ 1次放射成像掃描的SD、CR或部分反應（PR）。在一些實施例中，所述含抗PD-1/PD-L1的方案是抗PD-1/PD-L1單一療法。在一些實施例中，所述含抗PD-1/PD-L1的方案是在與另一全身抗癌療法相同的週期中投予的抗PD-1/PD-L1劑。在一些實施例中，在初始放射學進展之後使用PD-1/PD-L1治療，同時繼續用在PD之前使用的相同PD-1/PD-L1藥劑進行治療。在一些實施例中，所述受試者接受基於鉑的化療作為含抗PD-1/PD-L1的方案的一部分。在一些實施例中，所述受試者接受基於鉑的化療作為單獨的方案。在一些實施例中，所述受試者接受不超過一種先前化療方案。在一些實施例中，所述受試者接受一種或兩種先前化療方案，並且先前的含抗PD-1/PD-L1的方案不包括基於鉑的化療。在一些實施例中，所述受試者接受不超過2種先前化療治療。在一些實施例中，所述受試者拒絕基於鉑的化療。在一些實施例中，所述受試者不可耐受基於鉑的化療。
在一些實施例中，所述受試者患有NSCLC，已經接受了1或2種先前療法線，並且已經在基於檢查點抑制劑（CPI）的療法（如PD-1/PD-L1）中進展，並且治療包括投予奈米顆粒白蛋白結合型紫杉醇。即，所述受試者將接受IL-2接合物治療作為2/3L或二線或三線療法。在一些實施例中，所述受試者是2L或3L NSCLC受試者。在一些實施例中，所述受試者是2L NSCLC受試者。在一些實施例中，所述受試者是3L NSCLC受試者。在一些實施例中，所述受試者是2L或3L非鱗狀NSCLC受試者。在任何上述實施例中，所述NSCLC可以是IV期。在一些實施例中，所述受試者接受一種含抗PD-1/PD-L1的方案，其包括化療劑作為治療IV期NSCLC的方案的一部分，所述IV期NSCLC在根據RECIST 1.1對含抗PD-1/PD-L1的方案證明受益後進展。在一些實施例中，從含抗PD-1/PD-L1的方案中受益的證明定義為≥1次放射成像掃描的SD、CR或部分反應（PR）。在一些實施例中，所述含抗PD-1/PD-L1的方案是抗PD-1/PD-L1單一療法。在一些實施例中，所述含抗PD-1/PD-L1的方案是在與另一全身抗癌療法相同的週期中投予的抗PD-1/PD-L1劑。在一些實施例中，在初始放射學進展之後使用PD-1/PD-L1治療，同時繼續用在PD之前使用的相同PD-1/PD-L1藥劑進行治療。在一些實施例中，所述受試者接受基於鉑的化療作為含抗PD-1/PD-L1的方案的一部分。在一些實施例中，所述受試者接受基於鉑的化療作為單獨的方案。在一些實施例中，所述受試者接受不超過一種先前化療方案。在一些實施例中，所述受試者接受一種或兩種先前化療方案，並且先前的含抗PD-1/PD-L1的方案不包括基於鉑的化療。在一些實施例中，所述受試者接受不超過2種先前化療治療。在一些實施例中，所述受試者拒絕基於鉑的化療。在一些實施例中，所述受試者不可耐受基於鉑的化療。
在一些實施例中，所述受試者患有不可切除的惡性胸膜間皮瘤，已經接受1或2種先前療法線，並且是檢查點抑制劑（CPI）初治的。即，所述受試者將接受IL-2接合物治療作為2/3L或二線或三線療法。在一些實施例中，所述受試者是2L或3L不可切除的惡性胸膜間皮瘤受試者。在一些實施例中，所述受試者是2L不可切除的惡性胸膜間皮瘤受試者。在一些實施例中，所述受試者是3L不可切除的惡性胸膜間皮瘤受試者。在一些實施例中，所述受試者是2L或3L間皮瘤受試者。
在一些實施例中，所述受試者患有可測量的疾病（即，癌症）。可測量的疾病可通過RECIST v1.1確定。在一些實施例中，所述受試者已被確定具有＜ 2（例如0或1）的東部腫瘤協作組（ECOG）體能狀態。在一些實施例中，所述受試者具有足夠的心血管、血液、肝、腎功能和實驗室參數，如醫師所確定的。在一些實施例中，所述受試者已被確定（例如，通過醫師）具有大於或等於12週的期望壽命。在一些實施例中，所述受試者在投予第一治療劑量之前已經進行先前抗癌療法。
在一些實施例中，所述受試者沒有同種異體組織/實體器官移植史。在一些實施例中，所述受試者不具有來自先前4級免疫腫瘤學療法或導致中斷的免疫介導的/相關的毒性。在一些實施例中，所述受試者不具有由任何先前抗癌療法引起的大於或等於2的正在發生的AE。在一些實施例中，所述受試者不具有小於或等於92%的基線氧飽和度（SpO2）（沒有氧療法的情況下）。在一些實施例中，所述受試者未接受過先前的基於IL-2的抗癌治療。在一些實施例中，所述受試者可在每次IL-2接合物投藥前暫時（至少36小時）不服用抗高血壓藥物。在一些實施例中，所述受試者不具有任何醫學或臨床病症、實驗室異常、或將妨礙根據本文公開的方法進行治療的任何具體情況，如監督醫師所確定的。在一些實施例中，所述受試者未患有需要皮質類固醇療法的共病。在一些實施例中，所述受試者未患有活動性腦轉移或軟腦膜疾病。在一些實施例中，所述受試者在IL-2接合物治療的28天內沒有接受大手術或局部干預。在一些實施例中，所述受試者在IL-2接合物治療的28天內或在半衰期的5倍內（以較短者為准）未接受先前抗腫瘤療法或研究治療的最後一次投予。在一些實施例中，所述受試者在第一次投予IL-2接合物的14天內未接受抗生素（不包括局部抗生素）。在一些實施例中，所述受試者在開始用IL-2接合物治療的6個月內未患有嚴重或不穩定的心臟病症。在一些實施例中，所述受試者在開始用IL-2接合物治療的2年內未患有需要全身治療的活動性、已知或疑似自身免疫病。在一些實施例中，所述受試者在開始用IL-2接合物治療的3年內未患有發生進展或需要積極治療的已知的第二惡性腫瘤。在一些實施例中，所述受試者在開始用IL-2接合物治療的28天內未接受過活病毒或活減毒疫苗接種。
在其中所述受試者患有PD-L1腫瘤比例得分（TPS）大於或等於50%的NSCLC並且未接受過先前治療的一些實施例中，所述受試者具有根據RECIST v1.1的至少一個可測量的病變。在其中所述受試者患有PD-L1腫瘤比例得分（TPS）大於或等於50%的NSCLC並且未接受過先前治療的一些實施例中，所述受試者具有組織學或細胞學證實的IV期NSCLC診斷。在其中所述受試者患有PD-L1腫瘤比例得分（TPS）大於或等於50%的NSCLC並且未接受過先前治療的一些實施例中，所述受試者不具有已知的驅動改變，如表皮生長因子受體（EGFR）、間變性淋巴瘤激酶（ALK）、原癌基因酪胺酸-蛋白激酶（ROS）1或BRAF突變。在任何上述實施例中，所述NSCLC可以是IV期。
在其中所述受試者患有PD-L1腫瘤比例得分（TPS）為1%-49%的NSCLC並且未接受過先前治療的一些實施例中，所述受試者患有根據RECIST v1.1的至少一個可測量的病變。在其中所述受試者患有PD-L1腫瘤比例得分（TPS）為1%-49%的NSCLC並且未接受過先前治療的一些實施例中，所述受試者具有組織學或細胞學證實的IV期NSCLC診斷。在其中所述受試者患有PD-L1腫瘤比例得分（TPS）為1%-49%的NSCLC並且未接受過先前治療的一些實施例中，所述受試者不具有已知的驅動改變，如表皮生長因子受體（EGFR）、間變性淋巴瘤激酶（ALK）、原癌基因酪胺酸-蛋白激酶（ROS）1或BRAF突變。在任何上述實施例中，所述NSCLC可以是IV期。
在其中所述受試者患有非鱗狀NSCLC並且未接受過先前治療並且其中治療包括投予培美曲塞和卡鉑/順鉑的一些實施例中，所述受試者患有根據RECIST v1.1的至少一個可測量的病變。在其中所述受試者患有非鱗狀NSCLC並且未接受過先前治療的一些實施例中，所述受試者具有組織學或細胞學證實的IV期非鱗狀NSCLC診斷。在其中所述受試者患有非鱗狀NSCLC並且未接受過先前治療的一些實施例中，所述受試者不具有已知的驅動改變，如表皮生長因子受體（EGFR）、間變性淋巴瘤激酶（ALK）、原癌基因酪胺酸-蛋白激酶（ROS）1或BRAF突變。在其中所述受試者患有非鱗狀NSCLC並且未接受過先前治療的一些實施例中，所述受試者沒有以下情況：不受控制的胸膜/腹膜積液、心包積液或需要反復引流程序的腹水；主要為鱗狀細胞組織學NSCLC；或不能中斷阿司匹林或其他非甾體抗炎藥（NSAID）（除了阿司匹林劑量小於或等於1.3 g/天），持續5天時間段。
在其中所述受試者患有NSCLC、已經接受了1或2種先前療法線並且已經在基於檢查點抑制劑（CPI）的療法（如PD-1/PD-L1）中進展的一些實施例中，所述受試者患有根據RECIST v1.1的至少一個可測量的病變。在其中所述受試者患有NSCLC、已經接受了1或2種先前療法線並且已經在基於檢查點抑制劑（CPI）的療法（如PD-1/PD-L1）中進展的一些實施例中，所述受試者具有組織學或細胞學證實的IV期NSCLC診斷。在其中所述受試者患有NSCLC、已經接受了1或2種先前療法線並且已經在基於檢查點抑制劑（CPI）的療法（如PD-1/PD-L1）中進展的一些實施例中，所述受試者不具有已知的驅動改變，如表皮生長因子受體（EGFR）、間變性淋巴瘤激酶（ALK）、原癌基因酪胺酸-蛋白激酶（ROS）1或BRAF突變。在一些實施例中，所述受試者先前接受了一種PD-1/PD-L1治療方案（其與基於鉑的化療並行或依序投予），以及一種另外的化療方案。
在其中所述受試者患有NSCLC、已經接受了1或2種先前療法線並且已經在基於檢查點抑制劑（CPI）的療法（如PD-1/PD-L1）中進展，並且其中治療包括投予奈米顆粒白蛋白結合型紫杉醇的一些實施例中，所述受試者患有根據RECIST v1.1的至少一個可測量的病變。在其中所述受試者患有NSCLC、已經接受了1或2種先前療法線並且已經在基於檢查點抑制劑（CPI）的療法（如PD-1/PD-L1）中進展，並且其中治療包括投予奈米顆粒白蛋白結合型紫杉醇的一些實施例中，所述受試者具有組織學或細胞學證實的IV期NSCLC診斷。在其中所述受試者患有NSCLC、已經接受了1或2種先前療法線並且已經在基於檢查點抑制劑（CPI）的療法（如PD-1/PD-L1）中進展，並且其中治療包括投予奈米顆粒白蛋白結合型紫杉醇的一些實施例中，所述受試者不具有已知的驅動改變，如表皮生長因子受體（EGFR）、間變性淋巴瘤激酶（ALK）、原癌基因酪胺酸-蛋白激酶（ROS）1或BRAF突變。在一些實施例中，所述受試者先前接受了一種PD-1/PD-L1治療方案（其與基於鉑的化療並行或依序投予），以及一種另外的化療方案。
在其中所述受試者患有不可切除的惡性胸膜間皮瘤、已經接受1或2種先前療法線並且為檢查點抑制劑（CPI）初治的一些實施例中，所述受試者患有根據修改的RECIST的至少一個可測量的病變。在其中所述受試者患有間皮瘤、已經接受1或2種先前療法線並且為檢查點抑制劑（CPI）初治的一些實施例中，所述受試者具有組織學證實的不可切除的惡性胸膜間皮瘤。
在一些實施例中，所述受試者是未懷孕或未哺乳的女性。在一些實施例中，所述受試者是不準備生育（WOCBP）的女性。在一些實施例中，所述受試者是有生育可能（WOCBP）並且在中斷IL-2接合物治療後至少150天使用批准的避孕方法的女性。在一些實施例中，所述受試者是有生育可能（WOCBP）並且在中斷IL-2接合物治療後至少420天使用批准的避孕方法的女性。在一些實施例中，所述受試者是有生育可能（WOCBP）並且在中斷IL-2接合物治療後至少150天不捐贈或冷凍保存卵子的女性。在一些實施例中，所述受試者是不捐贈或冷凍保存精子的男性。在一些實施例中，所述受試者是在中斷IL-2接合物治療後至少330天戒斷異性性交的男性。在一些實施例中，所述受試者是在中斷IL-2接合物治療後至少210天戒斷異性性交的男性。在一些實施例中，所述受試者是在中斷IL-2接合物治療後使用批准的避孕至少330天的男性。在一些實施例中，所述受試者是在中斷IL-2接合物治療後使用批准的避孕至少210天的男性。
在一些實施例中，所述受試者對本文公開的任何IL-2接合物、PEG、聚乙二醇化藥物或抗PD-1抗體或其抗原結合片段沒有已知的過敏反應或禁忌症。在一些實施例中，所述受試者先前未接受過包含IL-2的抗癌治療。
在一些實施例中，基於一種或多種屬性選擇受試者以接受所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段，所述屬性包括 (i) 所述肺癌是非鱗狀非小細胞肺癌（NSCLC）；(ii) 所述肺癌是胸膜間皮瘤；(iii) 所述肺癌是不可切除的肺癌；(iv) 所述肺癌是IV期肺癌；(v) 所述肺癌是PD-L1腫瘤比例得分大於或等於50%的NSCLC；或 (vi) 所述肺癌是PD-L1腫瘤進展得分小於50%或為1%-49%的NSCLC。
在一些實施例中，至少部分地基於所述肺癌是非鱗狀NSCLC（例如，IV期非鱗狀NSCLC）選擇受試者以接受所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，至少部分地基於所述肺癌是IV期NSCLC選擇受試者以接受所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，至少部分地基於所述肺癌是胸膜間皮瘤選擇受試者以接受所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，至少部分地基於所述肺癌不可切除（例如，不可切除的胸膜間皮瘤）選擇受試者以接受所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，至少部分地基於所述肺癌是IV期肺癌選擇受試者以接受所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，至少部分地基於所述肺癌具有大於或等於50%的PD-L1腫瘤比例得分選擇受試者以接受所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，至少部分地基於所述肺癌具有小於50%的PD-L1腫瘤比例得分選擇受試者以接受所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，至少部分地基於所述肺癌具有1%-49%的PD-L1腫瘤比例得分選擇受試者以接受所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段。 投予效果
在一些實施例中，所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段的投予提供了完全反應、部分反應或疾病穩定。在一些實施例中，所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段的投予提供了完全反應。在一些實施例中，所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段的投予提供了部分反應。在一些實施例中，所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段的投予提供了疾病穩定。
在一些實施例中，所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段的投予提供了目標病變大小的減小。在一些實施例中，所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段的投予使得目標病變大小穩定。在一些變型中，所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段的投予減緩目標病變的生長速率。在一些變型中，所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段的投予使得目標病變的生長停止。在一些實施例中，所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段的投予消除目標病變。
在一些實施例中，在投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段後，受試者經歷通過實體瘤免疫相關反應評價標準（iRECIST）測量的反應。在一些實施例中，在投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段後，受試者經歷根據RECIST 1.1版的客觀反應率（ORR）。在一些實施例中，在投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段後，受試者經歷根據RECIST 1.1版的反應持續時間（DOR）。在一些實施例中，在投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段後，受試者經歷根據RECIST 1.1版的無進展存活期（PFS）。在一些實施例中，在投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段後，受試者經歷根據RECIST 1.1版的總體存活期。在一些實施例中，在投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段後，受試者經歷根據RECIST 1.1版的反應時間（TTR）。在一些實施例中，在投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段後，受試者經歷根據RECIST 1.1版的疾病控制率（DCR）。在任何這些實施例中，受試者的經歷是基於醫師對拍攝的受試者的放射照相圖像的審查。
在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起受試者的血管滲漏症候群。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起受試者的2級、3級或4級血管滲漏症候群。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起受試者的2級血管滲漏症候群。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起受試者的3級血管滲漏症候群。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起受試者的4級血管滲漏症候群。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起受試者的血管緊張度損失。
在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起受試者的血漿蛋白和流體外滲到血管外空間中。
在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起受試者的低血壓和器官灌注減少。
在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起受試者的嗜中性白血球功能受損。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起受試者的趨化性降低。
在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段與受試者的增加的播散性感染風險無關。在一些實施例中，所述播散性感染是膿毒症或細菌性心內膜炎。在一些實施例中，所述播散性感染是膿毒症。在一些實施例中，所述播散性感染是細菌性心內膜炎。在一些實施例中，在投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段之前治療受試者的任何預先存在的細菌感染。在一些實施例中，在投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段之前，用選自苯唑西林、萘夫西林、環丙沙星和萬古黴素的抗細菌劑治療受試者。
在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不加劇受試者的自身免疫病或發炎病症的預先存在的表現或初始表現。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不加劇受試者的自身免疫病的預先存在的表現或初始表現。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不加劇受試者的發炎病症的預先存在的表現或初始表現。在一些實施例中，受試者的自身免疫病或發炎病症選自克羅恩病、硬皮病、甲狀腺炎、發炎關節炎、糖尿病、眼球型重症肌無力、新月體性IgA腎小球腎炎、膽囊炎、腦血管炎、史-約症候群和大皰性類天皰瘡。在一些實施例中，受試者的自身免疫病或發炎病症是克羅恩病。在一些實施例中，受試者的自身免疫病或發炎病症是硬皮病。在一些實施例中，受試者的自身免疫病或發炎病症是甲狀腺炎。在一些實施例中，受試者的自身免疫病或發炎病症是發炎關節炎。在一些實施例中，受試者的自身免疫病或發炎病症是糖尿病。在一些實施例中，受試者的自身免疫病或發炎病症是眼球型重症肌無力。在一些實施例中，受試者的自身免疫病或發炎病症是新月體性IgA腎小球腎炎。在一些實施例中，受試者的自身免疫病或發炎病症是膽囊炎。在一些實施例中，受試者的自身免疫病或發炎病症是腦血管炎。在一些實施例中，受試者的自身免疫病或發炎病症是史-約症候群。在一些實施例中，受試者的自身免疫病或發炎病症是大皰性類天皰瘡。
在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起受試者的精神狀態變化、言語困難、皮質盲、肢體或步態共濟失調、幻覺、激越、遲鈍或昏迷。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起受試者的癲癇發作。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段在患有已知癲癇發作病症的受試者中不是禁忌的。
在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起受試者的毛細血管滲漏症候群。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起受試者的2級、3級或4級毛細血管滲漏症候群。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起受試者的2級毛細血管滲漏症候群。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起受試者的3級毛細血管滲漏症候群。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起受試者的4級毛細血管滲漏症候群。
在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起受試者在投予後平均動脈血壓的下降。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段引起受試者的低血壓。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會使受試者經歷低於90 mm Hg的收縮壓或從基線收縮壓下降20 mm Hg。
在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起受試者的水腫或腎功能或肝功能受損。
在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起受試者的嗜酸性白血球增多症。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會導致受試者的外周血中的嗜酸性白血球計數超過500/μL。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會導致受試者的外周血中的嗜酸性白血球計數超過500/µL至1500/μL。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會導致受試者的外周血中的嗜酸性白血球計數超過1500/μL至5000/μL。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會導致受試者的外周血中的嗜酸性白血球計數超過5000/μL。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段在接受現有精神藥物方案的受試者中不是禁忌的。
在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起IL-5水平的顯著升高。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段導致IL-5水平處於或低於最低檢測水平。
在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起累積毒性、終末器官毒性、QTc延長或其他心臟毒性。
在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起與IL-5/IL-6細胞激素升高相關的發熱、低血壓或缺氧的不良事件（AE）。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段引起主要由流感樣症狀、噁心或嘔吐組成的相關TEAE，這些是短暫的並且用公認的護理標準而消退。
在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段在接受腎毒性、骨髓毒性、心臟毒性或肝毒性藥物的現有方案的受試者中不是禁忌的。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段在接受胺基糖苷類、細胞毒性化療、多柔比星、甲胺蝶呤或天門冬醯胺酸酶的現有方案的受試者中不是禁忌的。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段在接受含有抗腫瘤劑的組合方案的受試者中不是禁忌的。在一些實施例中，所述抗腫瘤劑選自達卡巴嗪、順鉑、他莫昔芬和干擾素-α。
在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起受試者在投予後的一種或多種4級不良事件。在一些實施例中，4級不良事件選自體溫過低；休克；心動過緩；室性期前收縮；心肌缺血；暈厥；出血；房性心律失常；靜脈炎；二度房室傳導阻滯；心內膜炎；心包積液；外周壞疽；血栓形成；冠狀動脈病症；口炎；噁心和嘔吐；肝功能測試異常；胃腸出血；嘔血；血性腹瀉；胃腸道病症；腸穿孔；胰腺炎；貧血；白細胞減少；白細胞增多；低鈣血症；鹼性磷酸酶升高；血尿素氮（BUN）升高；高尿酸血症；非蛋白氮（NPN）升高；呼吸性酸中毒；嗜睡；激越；神經病；偏執性反應；抽搐；癲癇大發作性抽搐；譫妄；哮喘、肺水腫；通氣過度；低氧症；咯血；通氣不足；氣胸；瞳孔散大；瞳孔病症；腎功能異常；腎衰；和急性腎小管壞死。在一些實施例中，向一組受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起大於1%的受試者在投予後的一種或多種4級不良事件。在一些實施例中，4級不良事件選自體溫過低；休克；心動過緩；室性期前收縮；心肌缺血；暈厥；出血；房性心律失常；靜脈炎；二度房室傳導阻滯；心內膜炎；心包積液；外周壞疽；血栓形成；冠狀動脈病症；口炎；噁心和嘔吐；肝功能測試異常；胃腸出血；嘔血；血性腹瀉；胃腸道病症；腸穿孔；胰腺炎；貧血；白血球減少；白血球增多；低鈣血症；鹼性磷酸酶升高；血尿素氮（BUN）升高；高尿酸血症；非蛋白氮（NPN）升高；呼吸性酸中毒；嗜睡；激越；神經病；偏執性反應；抽搐；癲癇大發作性抽搐；譫妄；哮喘、肺水腫；通氣過度；低氧症；咯血；通氣不足；氣胸；瞳孔散大；瞳孔病症；腎功能異常；腎衰；和急性腎小管壞死。
在一些實施例中，向一組受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起大於1%的受試者在投予後的一種或多種不良事件，其中所述一種或多種不良事件選自十二指腸潰瘍形成；腸壞死；心肌炎；室上性心動過速；繼發於視神經炎的永久性或暫時性失明；短暫腦缺血發作；腦膜炎；腦水腫；心包炎；過敏性間質性腎炎；和氣管食管瘺。
在一些實施例中，向一組受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起大於1%的受試者在投予後的一種或多種不良事件，其中所述一種或多種不良事件選自惡性高熱；心臟停搏；心肌梗死；肺栓塞；中風；腸穿孔；肝或腎衰竭；導致自殺的嚴重抑鬱症；肺水腫；呼吸停止；呼吸衰竭。
在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段刺激受試者中的CD8+細胞。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段刺激受試者中的NK細胞。刺激可以包括受試者中CD8+細胞數量的增加，例如投予後約4、5、6或7天，或投予後約1、2、3或4週。在一些實施例中，所述CD8+細胞包括記憶CD8+細胞。在一些實施例中，CD8+細胞包括效應CD8+細胞。刺激可以包括例如投予後約4、5、6或7天，或投予後約1、2、3或4週，受試者中Ki67陽性的CD8+細胞比例的增加。刺激可以包括例如投予後約4、5、6或7天，或投予後約1、2、3或4週，受試者中NK細胞數量的增加。
在一些實施例中，在投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段後，CD8+細胞在受試者中擴增至少1.5倍，如至少1.6倍、1.7倍、1.8倍或1.9倍。在一些實施例中，在投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段後，NK細胞在受試者中擴增至少5倍，如至少5.5倍、6倍或6.5倍。在一些實施例中，在投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段後，嗜酸性白血球在受試者中擴增不超過約2倍，如不超過約1.5倍、1.4倍或1.3倍。在一些實施例中，在投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段後，CD4+細胞在受試者中擴增不超過約2倍，如不超過約1.8倍、1.7倍或1.6倍。在一些實施例中，投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段後，在受試者中CD8+細胞和/或NK細胞的擴增多於CD4+細胞和/或嗜酸性白血球的擴增。在一些實施例中，CD8+細胞的擴增多於CD4+細胞的擴增。在一些實施例中，NK細胞的擴增多於CD4+細胞的擴增。在一些實施例中，CD8+細胞的擴增多於嗜酸性白血球的擴增。在一些實施例中，NK細胞的擴增多於嗜酸性白血球的擴增。相對於投予所述IL-2接合物之前測量的基線值，確定擴增倍數。在一些實施例中，在投予後的任何時間，如投予後約4、5、6或7天，或投予後約1、2、3或4週，確定擴增倍數。
在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段增加所述受試者中外周CD8+ T和NK細胞的數量，而不增加所述受試者中外周CD4+調節性T細胞的數量。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段增加所述受試者中外周CD8+ T和NK細胞的數量，而不增加所述受試者中外周嗜酸性白血球的數量。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段增加所述受試者中外周CD8+ T和NK細胞的數量，而不增加所述受試者中腫瘤內CD8+ T細胞和NK細胞的數量且不增加所述受試者中腫瘤內CD4+調節性T細胞的數量。
在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不需要使用重症監護設施或熟練的心肺或重症監護醫學專家。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不需要使用重症監護設施或熟練的心肺或重症監護醫學專家。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不需要使用重症監護設施。在一些實施例中，向受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不需要使用熟練的心肺或重症監護醫學專家。
在一些實施例中，投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起劑量限制性毒性。在一些實施例中，投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段不會引起嚴重的細胞激素釋放症候群。在一些實施例中，IL-2接合物不誘導抗藥物抗體（ADA），即抗IL-2接合物的抗體。在一些實施例中，ADA誘導的缺乏是通過抗PEG的抗體的直接免疫測定和/或抗IL-2接合物的抗體的ELISA來測定。如果測得的ADA水平在統計學上與基線（治療前）水平或與未治療對照的水平無法區分，則認為IL-2接合物不會誘導ADA。 另外的藥劑
在一些實施例中，除了抗PD-1抗體或其抗原結合片段之外，所述方法還包括向受試者投予治療有效量的一種或多種化療劑。在一些實施例中，所述一種或多種化療劑包括一種或多種基於鉑的化療劑。在一些實施例中，所述一種或多種化療劑包括卡鉑和培美曲塞。在一些實施例中，所述一種或多種化療劑包括卡鉑和奈米顆粒白蛋白結合型紫杉醇。在一些實施例中，所述一種或多種化療劑包括卡鉑和多西他賽。在一些實施例中，受試者中的癌症是非小細胞肺癌（NSCLC）。 套組 / 製品
在某些實施例中，本文公開了與本文所述的一種或多種方法和組合物一起使用的套組和製品。此類套組包括載體、包裝或容器，其被分隔以容納一個或多個容器如小瓶、管等，所述一個或多個容器中的每一個包含有待在本文所述的方法中使用的單獨要素之一。合適的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和試管。在一個實施例中，容器由各種材料（如玻璃或塑膠）形成。
套組通常包含列出內容物和/或使用說明的標籤、以及包含使用說明的包裝說明書。通常還將包括一組指令。
在一個實施例中，標籤在容器上或與容器相關聯。在一個實施例中，當形成標籤的字母、數字或其他字元被貼附、模制或蝕刻到容器本身中時，標籤在容器上；當標籤存在於還容納容器的器皿或載體內時，標籤與容器相連，例如作為包裝說明書。在一個實施例中，標籤用於指示內容物將用於特定治療應用。標籤還指示如在本文所述的方法中使用內容物的指導。
在某些實施例中，醫藥組合物存在於包裝或分配器裝置中，所述裝置含有一個或多個含有本文所提供化合物的單位劑型。包裝例如含有金屬或塑膠箔，如泡罩包裝。在一個實施例中，包裝或分配器裝置附有投予說明書。在一個實施例中，包裝或分配器還附有與容器相連的通知，所述通知的形式由管理藥物製造、使用或銷售的政府機構規定，所述通知反映了所述機構對用於人或獸醫投予的藥物形式的批准。例如，此類通知是由美國食品和藥物管理局批准的藥物標籤，或批准的產品插頁。在一個實施例中，還製備了在相容的醫藥載劑中配製的含有本文所提供的化合物的組合物，將其放置在適當的容器中，並標記用於治療所指示病症。
在某些實施例中，套組提供的抗PD-1抗體或其抗原結合片段可以是配製成液體藥物的派姆單抗，其在10 mM組胺酸緩衝液pH 5.5中包含25 mg/ml派姆單抗、7%（w/v）蔗糖、0.02%（w/v）聚山梨醇酯80。 實例
這些實例僅僅出於說明性目的提供，並且不限制本文提供的申請專利範圍的範圍。 實例 1. 聚乙二醇化 IL-2 接合物的製備。
在本實例中詳細提供了用於製備本文所述的IL-2接合物的例示性方法。
使用本文公開的方法使用以下將用於生物接合的IL-2在大腸桿菌中表現為包涵體：(a) 表現質體，其編碼 (i) 具有所需胺基酸序列的蛋白質，其基因含有第一非天然鹼基對以在摻入非天然胺基酸 N6-((2-疊氮基乙氧基)-羰基)-L-離胺酸（AzK）的所需位置處提供密碼子，和 (ii) 衍生自馬氏甲烷八疊球菌Pyl的tRNA，其基因包含第二非天然核苷酸以提供匹配的反密碼子代替其天然序列；(b) 編碼巴氏甲烷八疊球菌衍生的吡咯離胺醯-tRNA合成酶（ MbPylRS）的質體，(c) N6-((2-疊氮基乙氧基)-羰基)-L-離胺酸（AzK）；和 (d) 核苷酸三磷酸轉運蛋白PtNTT2的截短變異體，其中缺失全長蛋白質的前65個胺基酸殘基。編碼所需IL-2變異體的胺基酸序列的雙鏈寡核苷酸含有密碼子AXC作為編碼具有SEQ ID NO: 1的蛋白質的序列的密碼子64，其中P64被本文所述的非天然胺基酸替代。編碼來自馬氏甲烷八疊球菌的正交tRNA基因的質體包含AXC匹配的反密碼子GYT代替其天然序列，其中Y是本文公開的非天然核苷酸。X和Y選自本文公開的非天然核苷酸dTPT3和dNaM。從包涵體中提取表現的蛋白質，並使用標準程序重新折疊，然後使用DBCO介導的無銅點擊化學將含AzK的IL-2產物進行位點特異性聚乙二醇化，以將穩定的共價mPEG部分附接到AzK上。例示性反應示於方案1和2中（其中n表示重複PEG單元的數量）。AzK部分與DBCO炔基部分的反應可提供一種區域異構產物或區域異構產物的混合物。 方案 1.
Figure 02_image140
方案 2.
Figure 02_image142
實例 2.IL-2 接合物和派姆單抗投予後生物標記物影響的臨床研究。
進行研究以表徵與派姆單抗組合的本文所述的IL-2接合物的體內投予的免疫學影響。所述IL-2接合物包含SEQ ID NO: 2，其中位置64是AzK_L1_PEG30kD，其中AzK_L1_PEG30kD被定義為具有如下的結構：式(IV)或式(V)或式(IV)和式(V)的混合物，以及30 kDa線性mPEG鏈。所述IL-2接合物也可描述為包含SEQ ID NO: 1的IL-2接合物，其中位置64被替代為具有如下的結構：式(IV)或式(V)或式(IV)和式(V)的混合物，以及30 kDa線性mPEG鏈。所述IL-2接合物也可描述為包含SEQ ID NO: 1的IL-2接合物，其中位置64被替代為具有如下的結構：式(XII)或式(XIII)或式(XII)和式(XIII)的混合物，以及30 kDa線性mPEG鏈。如實例1中所述製備化合物，即，使用其中首先製備具有SEQ ID NO: 1的蛋白質，其中位置64的脯胺酸被 N6-((2-疊氮基乙氧基)-羰基)-L-離胺酸AzK替代。然後允許含有AzK的蛋白質在點擊化學條件下與包含平均分子量為30 kDa的甲氧基線性PEG基團的DBCO反應，隨後使用標準程序純化和配製。
將IL-2接合物和派姆單抗通過IV輸注每3週[Q3W]投予30分鐘。分析對以下生物標記物的影響作為安全性和/或功效的替代預測因子： 嗜酸性白血球增多症（外周嗜酸性白血球計數升高）：與血管滲漏症候群（VLS）相關的IL-2誘導的細胞（嗜酸性白血球）增殖的細胞替代標記物； 介白素 5 （ IL-5 ）：IL-2誘導的2型先天淋巴細胞啟動和導致嗜酸性白血球增多症和潛在VLS的這種趨化介素釋放的細胞激素替代標記物； 介白素 6 （ IL-6 ）：IL-2誘導的細胞激素釋放症候群（CRS）的細胞激素替代標記物；以及 干擾素 γ （ IFN-γ ）：IL-2誘導的CD8+細胞毒性T淋巴細胞和NK細胞啟動的細胞激素替代標記物。
分析對以下生物標記物的細胞計數的影響作為抗腫瘤免疫活性的替代預測因子： 外周 CD8+ 效應細胞：IL-2誘導的外周中這些靶細胞的增殖的標記物，在浸潤後成為誘導可能潛在治療反應的替代標記物； 外周 CD8+ 記憶細胞：IL-2誘導的外周中這些靶細胞的增殖的標記物，在浸潤後成為誘導可能持久的潛在治療和維持記憶群體的替代標記物； 外周 NK 細胞：IL-2誘導的外周中這些靶細胞的增殖的標記物，在浸潤後成為誘導可能快速治療反應的替代標記物；以及 外周 CD4+ 調節細胞：IL-2誘導的外周中這些靶細胞的增殖的標記物，在浸潤後成為誘導免疫抑制性TME和抵消基於效應物的治療作用的替代標記物。
受試者在篩選時為年齡≥ 18歲的男性或女性。所有受試者先前已經用抗癌療法治療並且滿足以下至少一項：根據NCI CTCAE v5.0，治療相關毒性消退至0或1級（脫髮除外）；或根據NCI CTCAE v5.0，治療相關毒性至少消退至2級，事先獲得醫學監查員批准。最常見的腫瘤包括宮頸癌、頭頸部鱗狀細胞癌、基底細胞癌、黑色素瘤和非小細胞肺癌。
受試者還滿足以下標準：提供知情同意書。東部腫瘤協作組（ECOG）體能狀態為0或1。研究者確定的期望壽命大於或等於12週。組織學或細胞學證實的晚期和/或轉移性實體瘤的診斷。拒絕護理標準的晚期或轉移性實體瘤；或不存在會帶來臨床益處的合理護理標準；或標準治療無法忍受、無效或無法獲得的受試者。根據RECIST v1.1可測量的疾病。適當的實驗室參數包括：絕對淋巴細胞計數 ＞正常下限的0.5倍；血小板計數 ≥ 100 × 10 9/L；血紅蛋白 ≥ 9.0 g/dL（2週內無生長因子或輸血；ESA和CSF投予的1週清除是足夠的）；絕對嗜中性白血球計數 ≥ 1.5 × 10 9/L（2週內無生長因子）；凝血酶原時間（PT）和部分促凝血酶原激酶時間（PTT）≤ 正常上限（ULN）的1.5倍；天門冬胺酸轉胺酶（AST）和丙胺酸轉胺酶（ALT）≤ 2.5倍ULN，除非存在肝轉移的話可能是 ≤ 5倍ULN；總膽紅素 ≤ 1.5 × ULN。絕經前婦女和絕經後不到12個月的婦女在開始研究治療前7天內血清妊娠試驗呈陰性。 用 8 μg/kg 和 16 μg/kg 劑量治療的群組
Q3W 投藥。14名患有晚期或轉移性實體瘤並且年齡範圍為29-74歲的成人（9名[64.3%]男性，5名[35.7%]女性，9名[64.2%]白種人）依序接受a) 8 μg/kg劑量IV Q3W或16 μg/kg劑量IV Q3W的IL-2接合物和b) 200 mg劑量IV Q3W的派姆單抗，持續至少一個週期。在本文和整個實例2中，每kg受試者的藥物質量（例如，8 μg/kg）是指 除 PEG 和連接子質量外的IL-2質量。以下結果是關於接受8 μg/kg劑量IV Q3W和派姆單抗的受試者（4名受試者）或接受16 μg/kg劑量IV Q3W和派姆單抗的受試者（10名受試者），他們接受2-19個週期的治療。
接受8 μg/kg IL-2接合物和派姆單抗的兩名受試者已證實部分反應（PR；1例PD-1初治的基底細胞癌，1例頭頸部鱗狀細胞癌，接受過先前抗PD-1），持續22+個月。一名接受16 μg/kg IL-2接合物和派姆單抗的受試者（非小細胞肺癌）疾病穩定約6個月。六名受試者出現疾病進展（在6週評估時）；一名受試者初期疾病穩定（在6週評估時；隨後疾病進展）。接受8 μg/kg IL-2接合物和派姆單抗的四名受試者投藥後CD8+ Ki67表現水平增加（15%-70%）。
一名患有頭頸部鱗狀細胞癌的59歲男性接受8 μg/kg IL-2接合物和派姆單抗，接受30+個週期，並且經證實為部分反應（8個週期後下降39%；11個週期後下降47%）。該受試者先前已接受包括2次抗PD1治療的4線全身療法；對於抗PD1治療的最佳反應是疾病穩定。
一名患有基底細胞癌的50歲男性接受8 μg/kg IL-2接合物和派姆單抗，接受30個週期，經證實為部分反應（2個週期後下降50%，8個週期後下降80%）。該受試者先前接受過手術和放射療法。
發現具有免疫敏感腫瘤的其他患者中的最大腫瘤反應是黑色素瘤（23%和11%生長）、基底細胞癌（4%生長）和非小細胞肺癌（29%減少）。
在接受8 μg/kg IL-2接合物和派姆單抗的受試者中，CD8+ T效應細胞的外周擴增峰值平均高於基線2.02倍。所有四名受試者的投藥後NK細胞Ki67表現水平接近100%。在第3天，受試者的NK細胞的投藥後外周擴增峰值平均高於基線6.73倍。在接受16 μg/kg IL-2接合物和派姆單抗的受試者中，CD8+ T效應細胞的外周擴增峰值平均高於基線3.71倍。
功效生物標記物。與功效生物標記物相關的資料基於10名受試者的可用資料（4名受試者接受8 μg/kg的IL-2接合物；6名受試者接受16 μg/kg的IL-2接合物）。測量外周CD8+ T eff細胞計數（ 圖 1A- 圖 1C）。在先前投藥後3週，在一些受試者中觀察到超過基線的延長的CD8+擴增（例如，大於或等於1.5倍變化）。還測量了表現Ki67的CD8+ T eff細胞的百分比（ 圖 2）。
外周NK細胞計數如 圖 3A- 圖 3C所示。在先前投藥後3週，在一些受試者中觀察到超過基線的延長的NK細胞擴增（例如，大於或等於2倍變化）。還測量了表現Ki67的NK細胞的百分比（ 圖 4）。
圖 5A- 圖 5C顯示外周CD4+ T reg計數。還測量了表現Ki67的CD4+ T reg細胞的百分比（ 圖 6）。
測量嗜酸性白血球計數（ 圖 7A- 圖 7C）。如Pisani等人, Blood1991年9月15日;78(6):1538-44中報導的，在患有IL-2誘導的嗜酸性白血球增多症的患者中，測量值始終低於2328-15958個嗜酸性白血球/μL的範圍。還測量了IFN-γ、IL-5和IL-6的水平（ 圖 8A- 圖 8D）。測量值顯示誘導了IFN-γ，但誘導了少量IL-5和IL-6（分別為與VLS和CRS相關的細胞激素）。
圖 9A和 圖 9B分別顯示在1和2個週期後以8 μg/kg的劑量投予的IL-2接合物的平均濃度。 圖 9C和 圖 9D分別顯示在1和2個週期後以16 μg/kg的劑量投予的IL-2接合物的平均濃度。
抗藥物抗體（ ADA ）。在每個劑量週期後測定來自治療受試者的樣品的抗藥物抗體（ADA）。通過直接免疫測定法檢測抗聚乙二醇自身抗體（檢測限：36 ng/mL）。用標記形式的IL-2接合物進行橋接MesoScale Discovery ELISA，其檢測限為4.66 ng/mL。另外，使用CTLL-2細胞株進行中和抗IL-2接合物的抗體的基於細胞的測定，其中STAT5磷酸化作為讀出（檢測限：6.3 μg/mL）。
在每個劑量週期後收集並分析來自四名受試者的樣品，其中2名患者接受2個週期，另外兩名患者接受10或11個週期。在測定量化期間確定測定特異性截止點，對於IL-2接合物ADA測定為1.09或更高的信負比（signal to negative ratio），以及對於PEG ADA測定為2.08的信負比。對在IL-2接合物測定中給出陽性或不確定結果的樣品進行確認性測試，其中在存在和不存在確認性緩衝液（封閉溶液中10 μg/mL IL-2接合物）的情況下測定樣品和對照。對在PEG測定中給出陽性或不確定結果的樣品進行確認性測試，其中在存在和不存在確認性緩衝液（6%馬血清中10 μg/mL IL-2接合物）的情況下測定樣品和對照。如果在檢測步驟中，樣品的吸光度信號被抑制等於或大於測定量化期間確定的測定特異性截止點（IL-2接合物為14.5%，或PEG為42.4%），則認為樣品是“確認的”。未檢測到針對IL-2接合物或PEG的確認的ADA（資料未顯示）。
結果總結；討論。所有受試者的投藥後CD8+ Ki67表現水平升高（ 圖 2），CD8+ T效應（Teff）細胞的外周擴增平均高於基線1.95倍。所有4名受試者的投藥後NK細胞Ki67表現水平也升高（ 圖 4），在第3天，NK細胞的外周擴增平均高於基線6.73倍。IL-5和IL-6水平沒有有意義的升高。
AE是投予藥物產品的臨床研究受試者中的任何不良醫學事件，無論其原因如何。劑量限制性毒性定義為在治療週期的第1天至第29天（含）± 1天內發生的AE，其不明確或不可爭議地僅與外來原因相關，並且滿足至少一個以下標準： •   3級嗜中性白血球減少症（絕對嗜中性白血球計數＜ 1000/mm 3＞ 500/mm 3）持續≥ 7天，或任何持續時間的4級嗜中性白血球減少症 •   3級+發熱性嗜中性白血球減少症 •   4級+血小板減少症（血小板計數＜ 25,000/mm 3） •   3級+血小板減少症（血小板計數＜ 50,000-25,000/mm 3），持續≥ 5天，或與臨床顯著出血或需要血小板輸注相關 •   未能在10天內滿足絕對嗜中性白血球計數為至少1,000個細胞/mm 3和血小板計數為至少75,000個細胞/mm 3的恢復標準 •   任何其他分級4+血液學毒性，持續≥ 5天 •   3級+ALT或AST以及膽紅素＞ 2倍ULN，無膽汁淤積或其他原因如病毒感染或其他藥物的證據（即Hy定律） •   術前用藥發生3級輸注相關反應；4級輸注相關反應 •   3級血管滲漏症候群，定義為與體液滯留和肺水腫相關的低血壓 •   3級+過敏反應 •   3級+低血壓 •   3級+AE，在開始接受標準護理醫療管理7天內未消退至＜ 2級 •   3級+細胞激素釋放症候群 以下例外情況適用於非血液學AE： •   3級疲勞、噁心、嘔吐或腹瀉，在≤ 3天內通過最佳醫療管理消退至≤ 2級 •   3級發熱（定義為＞ 40ºC，持續≤ 24小時） •   3級輸注相關反應，在沒有術前用藥的情況下發生；後續劑量應使用術前用藥，並且如果反應復發，則為DLT •   3級關節痛或皮疹，在開始接受標準護理醫療管理（例如，全身皮質類固醇療法）7天內消退至≤ 2級 如果受試者在基線時為1級或2級ALT或AST升高（被認為是間接致肝轉移），則3級升高也必須是≥ 3倍基線且持續＞ 7天。
嚴重AE定義為導致以下任何結局的任何AE：死亡；危及生命的AE；住院治療或延長現住院時間；進行正常生活功能的能力持續或嚴重喪失或進行正常生活功能的能力嚴重破壞；或先天性異常/出生缺陷。可能不會導致死亡、危及生命或需要住院治療的重要醫學事件在基於適當的醫學判斷可能危及受試者並可能需要醫療或手術干預以防止以上所列結局中的一種時，可被視為嚴重事件。此類醫學事件的例子包括需要在急診室或家中進行強化治療的過敏性支氣管痙攣、不導致住院治療的血液惡液質或抽搐，或發生藥物依賴或藥物濫用。
在任一劑量下均未報告劑量限制性毒性，且未發生導致中斷的治療相關不良事件（TRAE）。一次TRAE導致劑量減少。在以16 μg/kg劑量IV Q3W治療的患者中的三名中報告了5次與治療相關的嚴重AE。
根據SOC，所有分級的最常見TRAE（＞ 2名患者）包括一般病症和投予狀況，檢查，代謝及營養，神經系統病症，呼吸、胸部及縱隔病症，血管病症，皮膚及皮下病症，血液及淋巴系統病症，心臟病症，胃腸道病症，免疫系統病症，感染和侵染，以及肌肉骨骼病症。用優選術語表示的TEAE在表3中詳述。
表 3
8 µg/kg IL-2 接合物 Q3W+ 派姆單抗 (N=4) 16 µg/kg IL-2 接合物 Q3W+ 派姆單抗 (N=10)
主要系統器官分類 首選項， n (%) 所有分級 分級 ≥3 所有分級 分級 ≥3
患有TEAE的參與者的數量 3 (75.0) 0 10 (100) 6 (60.0)
感染及侵染類 1 (25.0) 0 1 (10.0) 0
血液及淋巴系統病症 0 0 2 (20.0) 1 (10.0)
免疫系統病症 0 0 2 (20.0) 1 (10.0)
內分泌病症 0 0 2 (20.0) 0
代謝及營養病症 1 (25.0) 0 4 (40.0) 1 (10.0)
精神病症 1 (25.0) 0 0 0
神經系統病症 2 (50.0) 0 3 (30.0) 0
眼部病症 1 (25.0) 0 0 0
心臟病症 0 0 2 (20.0) 0
血管病症 1 (25.0) 0 3 (30.0) 1 (10.0)
呼吸、胸部及縱膈病症 1 (25.0) 0 3 (30.0) 1 (10.0)
胃腸道病症 1 (25.0) 0 4 (40.0) 0
肝膽病症 0 0 1 (10.0) 0
皮膚及皮下組織病症 1 (25.0) 0 3 (30.0) 0
肌肉骨骼及結締組織病症 1 (25.0) 0 3 (30.0) 0
全身性病症及投予部位狀況 3 (75.0) 0 10 (100) 0
檢查 2 (50.0) 0 8 (80.0) 4 (40.0)
損傷、中毒及手術併發症 1 (25.0) 0 1 (10.0) 0
治療相關AE是短暫的並且用公認的護理標準而消退。發熱、低血壓和缺氧的AE與IL-5/IL-6細胞激素升高無關。未觀察到累積毒性、終末器官毒性、血管滲漏症候群或嗜酸性白血球增多症。IL-5水平保持在最低檢測水平或低於最低檢測水平。一名受試者患有G2低血壓，通過補水消退。一名受試者患有G3細胞激素釋放症候群（發熱+需要升壓藥的低血壓；受試者患有基線直立性低血壓）並因進展而退出療法。一名受試者出現復發性G2細胞激素釋放症候群伴發熱和缺氧（患者患有基礎COPD，採用包括1劑托西利單抗（tociluzimab）在內的支持性護理管理，實現消退）。受試者劑量降至8 μg/kg；然後受試者發生G2肺炎，並在改善至G1後被再激發。隨後，受試者出現復發性G3肺炎，而未接受進一步的療法。其他的話，對生命體征沒有顯著影響，沒有QTc延長或其他心臟毒性，並且沒有由於TRAE而中斷。因此，與派姆單抗組合的IL-2接合物展示出令人鼓舞的PD資料，並且總體上是良好耐受的。確定IL-2接合物的體內半衰期為約10小時。總之，這些結果被認為支持IL-2接合物的非α優先活性，與派姆單抗組合具有可耐受的安全性，以及在免疫敏感腫瘤患者中具有令人鼓舞的PD和活性的初步證據。 用 24 μg/kg 劑量治療的群組
患有晚期或轉移性實體瘤的中位年齡為61歲（範圍為46-68歲）的十名個體（男性[100%]，6名[60.0%]白種人）接受24 μg/kg劑量Q3W的IL-2接合物。腫瘤類型包括肺癌、基底細胞癌和結腸癌。
對每名受試者用以下依序治療：a) 以24 μg/kg的劑量通過IV輸注投予30分鐘的IL-2接合物，和b) 以200 mg劑量IV投予的派姆單抗。每3週[Q3W]給予治療。分析8 μg/kg和16 μg/kg劑量的IL-2接合物對上述相同生物標記物的影響作為安全性和/或功效的替代預測因子。這些研究中的受試者滿足與用8 μg/kg和16 μg/kg劑量治療的受試者相同的標準。
所有10名受試者均經歷了至少一次TEAE，10名受試者中有7名（70.0%）經歷了至少1次3-4級相關TEAE（1次3級和6次4級）。一次3級ALT/AST升高（還伴3級低磷血症），在G2 CRS的情況下出現G2高膽紅素血症，以及5次4級淋巴細胞計數下降（一次受試者有3級AST/ALT升高，2級高膽紅素血症-DLT以及2級CRS）和1次G4淋巴細胞減少症。淋巴細胞計數在48小時內恢復到至少3級。
六名受試者經歷了相關SAE：患有腎上腺功能不全的需要類固醇調節的受試者中一次1級發熱，以及一次與3級AST/ALT升高和G2高膽紅素血症相關的2級細胞激素釋放症候群（發熱和低血壓，需要液體和地塞米松）。此外，一名受試者發生G2低血壓，接受支持性護理，一名受試者在C1D1期間發生輸注相關反應，隨後在週期2後出現G2 CRS，伴隨發熱、發冷和低血壓，接受支持性護理，另一名受試者在C1期間發生G3輸注相關反應，隨後在週期2期間發生細胞激素釋放症候群G1，以及一名受試者在週期2期間發生G2 CRS，接受支持性護理。有一例DLT：受試者具有3級AST/ALT升高以及與2級CRS（發熱和低血壓，需要補水和地塞米松）相關的2級高膽紅素血症。對於該受試者，C2D1的劑量減少。沒有因TEAE導致停藥。TEAE詳述於表4中。
表 4 治療中出現的不良事件 (TEAE) （ n=10 ）
24 µg/kg Q3W+ 派姆單抗 (N=10)
主要系統器官分類 首選項， n (%) 所有分級 分級 ≥3
患有TEAE的參與者的數量 10 (100) 7 (70.0)
感染及侵染類 1 (10.0) 0
血液及淋巴系統病症 3 (30.0) 1 (10.0)
免疫系統病症 3 (30.0) 0
內分泌病症 0 0
代謝及營養病症 3 (30.0) 1 (10.0)
精神病症 1 (10.0) 0
神經系統病症 1 (10.0) 0
眼部病症 0 0
心臟病症 0 0
血管病症 2 (20.0) 0
呼吸、胸部及縱膈病症 0 0
胃腸道病症 5 (50.0) 0
肝膽病症 1 (10.0) 0
皮膚及皮下組織病症 3 (30.0) 0
肌肉骨骼及結締組織病症 2 (20.0) 0
全身性病症及投予部位狀況 8 (80.0) 1 (10.0)
檢查 6 (60.0) 6 (60.0)
損傷、中毒及手術併發症 4 (40.0) 1 (10.0)
報告了以下相關事件：一次在2級CRS（發熱、低血壓[BP97/56 mm Hg]和低氧血症[SpO2 92%]）的情況下，3級AST/ALT和2級膽紅素（DLT），接受液體推注、補充氧氣和地塞米松，需要減少C2D1的劑量得以消退；一名患者發熱、發冷、寒戰和低氧血症（92%），需要支援性護理和氧氣（C2D1）；一次在酒精中毒情況下3級AST/ALT（C2D8），推測與IL-2接合物和派姆單抗相關，無其他症狀；以及三次4級淋巴細胞計數下降。
功效生物標記物。與功效生物標記物相關的資料基於6名接受24 μg/kg IL-2接合物的受試者的可用資料。測量外周CD8+ T eff細胞計數（ 圖 10），並且外周NK細胞計數示於 圖 11中。 圖 12顯示外周CD4+ T reg細胞計數，並且 圖 13顯示外周嗜酸性白血球計數。
圖 14A和 圖 14B分別顯示在1和2個週期後IL-2接合物的平均濃度。
圖 15顯示細胞激素水平（IFN-γ、IL-6和IL-5）。
因此，與派姆單抗組合的IL-2接合物展示出令人鼓舞的PD資料，並且總體上是良好耐受的，沒有由於TRAE而中斷。總之，這些結果被認為支持IL-2接合物的非α優先活性，與派姆單抗組合具有可耐受的安全性，以及在免疫敏感腫瘤患者中具有令人鼓舞的PD和活性的初步證據。 用 32 μg/kg 劑量治療的群組
三名患有晚期或轉移性實體瘤的個體接受32 μg/kg劑量Q3W的IL-2接合物。腫瘤類型包括卵巢癌。
對每名受試者用以下依序治療：a) 以32 μg/kg的劑量通過IV輸注投予30分鐘的IL-2接合物，和b) 以200 mg劑量IV投予的派姆單抗。每3週[Q3W]給予治療。分析8 μg/kg和16 μg/kg劑量的IL-2接合物對上述相同生物標記物的影響作為安全性和/或功效的替代預測因子。這些研究中的受試者滿足與用8 μg/kg和16 μg/kg劑量治療的受試者相同的標準。
所有六名（100%）受試者均經歷了至少一次TEAE，並且6名受試者中有兩名（33.3%）經歷了至少1次3-4級相關TEAE（1次4級）。有一例4級淋巴細胞計數下降（受試者還有G3發熱）。有兩次1級發熱和1級心動過速的相關SAE，需要住院24小時（C2D2-C2D3），通過支持性護理消退。該患者有3次另外的發熱和心動過速SAE，以及C5時G4 CRS發作，需要住院治療。通過支持性護理消退。另一名患者在C1期間出現G2缺氧，需要延長住院治療時間，通過支持性護理消退。無DLT。一名受試者因TEAE中斷治療。TEAE詳述於表5中。
表 5 治療中出現的不良事件 (TEAE) （ n=6 ）
32 µg/kg IL-2 接合物 Q3W+ 派姆單抗 (N=6)
主要系統器官分類 首選項， n (%) 所有分級 分級 ≥3
患有TEAE的參與者的數量 6 (100) 2 (33.3)
感染及侵染類 0 0
血液及淋巴系統病症 0 0
免疫系統病症 2 (33.3) 1 (16.7)
內分泌病症 2 (33.3) 0
代謝及營養病症 2 (33.3) 0
精神病症 0 0
神經系統病症 2 (33.3) 0
眼部病症 1 (16.7) 0
心臟病症 1 (16.7) 0
血管病症 1 (16.7) 0
呼吸、胸部及縱膈病症 2 (33.3) 0
胃腸道病症 2 (33.3) 0
肝膽病症 1 (16.7) 0
皮膚及皮下組織病症 1 (16.7) 0
肌肉骨骼及結締組織病症 0 0
全身性病症及投予部位狀況 5 (83.3) 1 (16.7)
檢查 4 (66.7) 1 (16.7)
損傷、中毒及手術併發症 0 0
功效生物標記物。與功效生物標記物相關的資料基於3名接受32 μg/kg IL-2接合物的受試者的可用資料。測量外周CD8+ T eff細胞計數（ 圖 16）。 圖 17顯示外周CD4+ T reg細胞計數。
圖 18A和 圖 18B分別顯示在1和2個週期後IL-2接合物的平均濃度。
圖 19顯示細胞激素水平（IFN-γ、IL-6和IL-5）。
因此，與派姆單抗組合的IL-2接合物展示出令人鼓舞的PD資料，並且總體上是良好耐受的，沒有由於TEAE而中斷。總之，這些結果被認為支持IL-2接合物的非α優先活性，與派姆單抗組合具有可耐受的安全性，以及在免疫敏感腫瘤患者中具有令人鼓舞的PD和活性的初步證據。 向患有肺癌的受試者投予 IL-2 接合物 Q3W 投藥
一名患有NSCLC腺癌的個體接受IL-2接合物（16 μg/kg）和派姆單抗。在本文和整個實例2中，每kg受試者的藥物質量（例如，16 μg/kg）是指 除 PEG 和連接子質量外的IL-2質量。
如表6所示，在治療前後測量該受試者的外周CD8+ T eff細胞計數、外周NK細胞計數、外周CD4+ T reg細胞計數、淋巴細胞計數和嗜酸性白血球計數。兩個治療週期後，受試者目標病變處疾病穩定，並且五個週期後疾病持續穩定。非目標病變顯示完全反應。
表 6歸一化外周CD8+ T eff細胞計數、外周NK細胞計數、外周CD4+ T reg細胞計數、淋巴細胞計數和嗜酸性白血球計數。
治療週期1 治療週期2
治療後時間 a 治療後時間 a
細胞類型 0hr 4hr 24hr 48hr 168hr 0hr 4hr 24hr 168hr
外周CD8+ T eff細胞 1.00 0.02 0.02 0.12 3.29 0.57 0.03 0.02 1.70
外周NK細胞 1.00 0.01 0.01 0.16 26.85 2.23 0.03 0.06 13.99
外周CD4+ T reg細胞 1.00 0.06 0.03 0.22 3.19 0.54 0.03 0.04 1.88
淋巴細胞 1.00 0.05 0.03 0.22 6.36 0.78 0.04 0.04 3.45
嗜酸性白血球 1.00 0.17 0.42 1.62 0.98 0.44 0.07 0.18 1.66
a0hr是指就在週期治療之前的細胞計數測定。
如圖8D中所示，在治療前後測量該受試者（受試者1001-0026）中的IFN-γ、IL-6和IL-5水平。測量值表明誘導了IFN-γ，但誘導了少量IL-5和IL-6（分別為與VLS和CRS相關的細胞激素）。 實例 3.IL-2 接合物和檢查點抑制劑在治療帶有 CT-26 腫瘤的 Balb/c 小鼠中的用途。
在本研究中使用包含SEQ ID NO: 3的IL-2接合物“IL-2_P65[AzK_PEG30kD]”（在本文和附圖中也稱為“化合物A”）： APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELK [AzK_PEG30kD] LEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT (SEQ ID NO: 3) 其中[AzK_ PEG30kD]是經由DBCO介導的點擊化學與PEG穩定接合的N6-((2-疊氮基乙氧基)-羰基)-L-離胺酸，所述點擊化學形成包含上述式 (I) 的結構的化合物，其中Z是CH 2，Y是
Figure 02_image027
，q是3，並且W是具有30 kDa的平均分子量的甲氧基線性PEG基團，和/或包含式 (I) 的結構的化合物，其中Y是CH 2，並且Z是
Figure 02_image029
，q是3，並且W是具有30 kDa的平均分子量的甲氧基線性PEG基團。 使用其中首先製備具有SEQ ID NO: 4的蛋白質的方法製備化合物，其中位置65的脯胺酸被 N6-((2-疊氮基乙氧基)-羰基)-L-離胺酸AzK替代。
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT (SEQ ID NO: 4) 然後允許含有AzK的蛋白質在點擊化學條件下與包含平均分子量為30 kDa的甲氧基線性PEG基團的DBCO反應，隨後使用標準程序純化和配製。
在Balb/c雌性小鼠中進行化合物A作為單一療法和與抗PD-1抗體組合的研究。6-8週齡平均體重16 g - 21 g的Balb/c雌性小鼠購自Jackson Laboratories（Sacramento, CA），用於研究1和2。7-8週齡平均體重18-22 g的Balb/c雌性小鼠購自HD Biosciences的Taconic Biosciences，用於研究3。低溫保存的小瓶裝CT-26結腸癌細胞購自美國組織類型保藏中心（ATCC, Manassas, VA）。根據製造商的方案將細胞解凍並培養。在腫瘤細胞接種當天，將細胞在無血清培養基中洗滌，計數，並以250,000（研究1和2）或300,000（研究3）個活細胞/0.1 mL的濃度重懸浮於冷的無血清培養基中。將CT-26細胞（0.1 mL）皮下注射到個體小鼠的側腹中，並使腫瘤生長。
對於其中使用化合物A和抗PD-1抗體的組合的研究1和2，所使用的抗體是抗小鼠PD-1（BioXcell；RMP1-14），並且對照抗體是IgG1同種型抗體（BioXcell；目錄號BP0089，批號2A3）。對於其中使用抗PD-1抗體的研究3，使用的抗體是抗小鼠PD-1（BioXcell；目錄號BP0146，RMP1-14，批號695318A1），並且對照抗體為IgG1同種型抗體（BioXcell；目錄號BP0089，批號2A3）。
將凍乾的化合物A用0.1 M乙酸重構成10 mg/mL原液。然後用1x磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）進一步稀釋至工作濃度。在向動物投藥的1小時內重構並稀釋化合物，並保持在冰上直到投藥。將凍乾的化合物在使用前儲存在-80ºC。將媒劑儲存在4ºC下。
使用帶有CT-26腫瘤的Balb/c小鼠進行三個分別的功效研究。研究1的設計（其評價化合物A作為單一藥劑的劑量依賴性功效）概述於表7中。表8和表9分別概述研究2和3的設計（其評價與抗PD-1抗體組合的化合物A的功效）。化合物A的投予途徑是靜脈內（IV）。通過尾靜脈對小鼠進行IV投藥。通過腹膜內（IP）投予抗體。基於就在每次投藥前獲得的每隻動物的個體體重投予所有藥劑。投藥方案的細節描述如下。 表 7.研究#1：帶有CT-26腫瘤的小鼠中的對照和測試治療組。
藥劑 劑量 (mg/kg) 途徑，方案 小鼠數量
媒劑對照 0 IV, QWx3 10
化合物A 0.3 IV, QWx3 10
化合物A 0.3 IV, Q2Wx2 10
化合物A 1 IV, QWx3 10
化合物A 1 IV, Q2Wx2 10
化合物A 3 IV, QWx3 10
化合物A 3 IV, Q2Wx2 10
IV=靜脈內；QWx3=每週一次，共3劑；Q2Wx2=每2週一次，共2劑。 表 8.研究#2：帶有CT-26腫瘤的小鼠中的對照和測試治療組。
藥劑 劑量（ mg/kg ） 途徑，方案 小鼠數量
媒劑對照+ IgG同種型對照 0 + 10 IV, QWx3 + IP, BIWx3 14
化合物A 3 IV, QWx3 14
化合物A 6 IV, QWx3 14
抗PD-1抗體 10 IP, BIWx3 14
化合物A+抗PD-1抗體 6 + 10 IV, QWx3 + IP, BIWx3 14
BIWx3=每週兩次，共3週，共6劑；IP=腹膜內；IV=靜脈內；QWx3=每週一次，共3劑。 表 9.研究#3：帶有CT-26腫瘤的小鼠中的對照和測試治療組。
藥劑 劑量 (mg/kg) 途徑，方案 小鼠數量
媒劑對照+IgG同種型對照 0 + 10 IV, QWx3 + IP, BIWx3 14
化合物A 1 IV, QWx3 14
化合物A 3 IV, QWx3 14
化合物A 6 IV, QWx3 14
化合物A 9 IV, QWx3 14
抗PD-1抗體 10 IP, BIWx3 14
化合物A+抗PD-1抗體 1 + 10 IV, QWx3 + IP, BIWx3 14
化合物A+抗PD-1抗體 3 + 10 IV, QWx3 + IP, BIWx3 14
化合物A+抗PD-1抗體 6 + 10 IV, QWx3 + IP, BIWx3 14
BIWx3=每週兩次，共3週，共6劑；IP=腹膜內；IV=靜脈內；QWx3=每週一次，共3劑；Q2Wx2=每2週一次，共2劑。
在研究1中，在腫瘤細胞接種後第4天開始，此時平均腫瘤體積為約80 mm 3，用媒劑以IV，每週一次，共3劑（QWx3）或0.3、1或3 mg/kg IV的化合物A，每週一次，共三劑（QWx3）或每2週一次，共2劑（Q2Wx2）治療帶有CT-26腫瘤的小鼠。
在研究2中，在腫瘤細胞接種後第5天，此時平均腫瘤體積為約80 mm 3，帶有CT-26腫瘤的小鼠接受治療。用媒劑IV QWx3 + IgG同種型對照IP，或按照QWx3投藥方案3或6 mg/k IV的化合物A，或10 mg/kg IP的抗PD-1抗體，或6 mg/kg IV QWx3的化合物A+10 mg/kg IP的抗PD-1抗體的組合投藥。在所有情況下，抗體的IP投藥是每週兩次，共3週，共6劑（BIWx3）。
在研究3中，在腫瘤細胞接種後第7天，此時平均腫瘤體積為約70 mm3，對帶有CT-26腫瘤的小鼠進行治療。用媒劑IV QWx3 + IgG同種型對照IP BIWx3；或按照QWx3投藥方案1、3、6或9 mg/kg IV的化合物A，或10 mg/kg IP BIWx3的抗PD-1抗體；或1、3或6 mg/kg IV QWx3的化合物A+10 mg/kg IP BIWx3的抗PD-1抗體的組合投藥。
所有三項研究的總結示於表10中。每天觀察動物的臨床體征。根據IACUC指南，當腫瘤體積生長超過2000 mm 3或觀察到它們具有持續惡化的狀況或顯示出嚴重痛苦和/或疼痛的明顯跡象時，對動物進行人道安樂死。
監測每隻小鼠的存活超過100天，此時將研究2和3中存活的無腫瘤動物包括在研究的再激發延續中，進行兩個週期，相隔2個月。具體地，通過在相對的下側腹接種相同類型的腫瘤細胞（CT-26）再激發無腫瘤的動物。對照動物是年齡匹配的初試小鼠，對其在相對的下側腹並行接種相同數量的CT-26腫瘤細胞。
每3-4天使用數位卡尺測量監測腫瘤生長，直至研究結束。腫瘤體積計算為寬度 2x 長度/2，其中寬度是最小尺寸，而長度是最大尺寸。研究報告中提供了原始腫瘤體積資料。
將每組的平均腫瘤體積資料隨時間用平均值的標準誤差（SEM）條作圖。此外，將動物處死前最後一天的個體腫瘤體積資料與平均值和SEM條一起作圖，以檢查資料的分佈。
使用GraphPad Prism v.7.0進行動物處死前最後一天的腫瘤體積資料的統計分析。使用單向ANOVA分析資料的顯著性。使用Tukey檢定程序（雙側）進行成對比較。報告了每個單獨比較的p值。
每個治療組與對照組的腫瘤生長抑制百分比（TGI%）計算如下： [(對照-對照基線) - (治療-治療基線)] / (對照-對照基線) x 100%。
記錄每隻小鼠的存活，並產生卡普蘭-邁耶圖以顯示按治療組的存活，並通過對數秩（Mantel-Cox）檢驗評估顯著性。在研究#1、#2和#3中，在治療開始後監測存活超過100天，並且在研究#2和#3中，在存活的無腫瘤小鼠中監測超過兩個再激發週期。  使用GraphPad Prism 7.0版進行分析。 表 10.化合物A作為單一療法和與抗小鼠PD-1抗體組合在小鼠中的腫瘤生長抑制。
化合物A劑量 [抗體劑量 a] (mg/kg) TGI%(相對於媒劑對照)
[0001] 研究#1 研究#2 研究#3
[0001] QWx3 Q2Wx2 QWx3 QWx3
化合物 A 單一療法 0.3 19 20 - -
[0001] 1 31 27 - 30
[0001] 3 51* 45* 56 59***
[0001] 6 - - 36* 86***
[0001] 9 - - - 85***
[0001] 抗體[10] - - 44 # 44 #
組合療法 b 6 + [10] - - 75** 84**
aBIW投藥3週（共6劑）； b未示出1和3 mg/kg化合物A組合組的資料。 在第15天（研究1）和第17天（研究2和3）計算TGI%。 結果為平均值± SEM。 QWx3 = 每週一次，共3劑；Q2Wx2 = 每2週一次，共2劑；TGI = 腫瘤生長抑制。*與媒劑對照相比，p ＜ 0.05；**與單一療法（化合物A或抗體）相比，p ＜ 0.05；***與媒劑或抗體同種型對照相比，p ＜ 0.001； #與抗體同種型對照相比，p ＜ 0.01。
在研究1中，評價化合物A作為單一藥劑在帶有皮下建立的CT-26結腸腫瘤的雌性Balb/c小鼠中的劑量依賴性功效。當對照組中的幾個腫瘤體積超過2000 mm 3時，根據IACUC提出的人道終點，研究在治療開始後第15天正式結束。 圖 20示出用化合物A以QWx3投藥治療的組隨時間的平均腫瘤體積。 圖 21示出用化合物A以QWx3投藥治療的每隻動物在治療後第15天的腫瘤體積。 圖 22示出用化合物A以Q2Wx2投藥治療的組隨時間的平均腫瘤體積。 圖 23示出用化合物A以Q2Wx2投藥的每隻動物在治療後第15天的腫瘤體積。
根據QWx3投藥方案，化合物A展現出劑量依賴性單一藥劑抗腫瘤活性，得到0.3、1和3 mg/kg劑量組與媒劑對照相比的TGI%分別為31%、19%和52%。類似地，根據Q2Wx2投藥方案，化合物A展現出劑量依賴性單一藥劑抗腫瘤活性，得到0.3、1和3 mg/kg劑量組與媒劑對照相比的TGI%分別為20%、27%和45%。然而，根據兩種投藥方案，與媒劑對照相比，僅3 mg/kg劑量具有統計學顯著性（p ＜ 0.05）。兩種投藥方案展現出可比的抗腫瘤活性。因此，對於該小鼠模型中的後續研究，選擇QWx3投藥方案。
在 圖 20、 圖 22、 圖 24和 圖 27中，黑色箭頭表示化合物A投藥的天數。 圖 20和 圖 22中的資料是化合物A的QWx3投藥和Q2Wx2投藥的平均腫瘤生長曲線；黑色箭頭表示化合物A投藥的天數。 圖 21和 圖 23中的資料表示用化合物A以QWx3和Q2Wx2投藥治療後第15天的個體腫瘤體積和平均腫瘤體積±平均值的標準誤差（SEM）（10隻小鼠/組）。資料表示個體腫瘤體積；還顯示了平均值± SEM和與媒劑對照相比的TGI%。
圖 22中的資料表示用化合物A以Q2Wx2投藥的動物中的平均腫瘤體積±平均值的標準誤差（SEM）（10隻小鼠/組）。 圖 23中的資料表示用化合物A以Q2Wx2投藥治療後第15天的個體和平均腫瘤體積資料。*在第15天與媒劑對照相比，p ＜ 0.05。
在帶有CT-26結腸腫瘤的小鼠中進行兩項單獨的研究（研究2和3），以評估作為單一藥劑和與小鼠抗PD-1檢查點抑制劑抗體組合的化合物A。研究之間化合物A的劑量範圍重疊，研究3具有較寬的劑量範圍。在兩項研究中，將化合物A以QWx3投予，並且將相同劑量水平的抗體以BIWx3投予。
在研究2中，在帶有皮下建立的CT-26結腸腫瘤的雌性Balb/c小鼠中，評估化合物A以3和6 mg/kg（QWx3）作為單一藥劑的抗腫瘤活性。另外，用6 mg/kg的化合物A（QWx3）和10 mg/kg IP的抗PD-1抗體（BIWx3）IV投藥來評價組合抗腫瘤活性。在治療開始後第15天計算TGI%，因為媒劑對照組中的幾個腫瘤體積超過2000 mm 3。然而，以每週一次或兩次的頻率對展現出完全腫瘤消退的治療組中的動物追蹤測量腫瘤。
化合物A展現出單一藥劑抗腫瘤活性，得到3和6 mg/kg劑量組與媒劑對照相比的TGI%分別為56.3%和35.6%。在組合研究中，在腫瘤細胞接種後5天開始，此時平均腫瘤體積為約80 mm 3，用6 mg/kg QWx3的化合物A IV治療，或用抗PD-1抗體BIWx3 IP治療，或按照相同投藥方案用組合治療帶有CT-26腫瘤的小鼠。 圖 24顯示用媒劑，作為單一藥劑的6 mg/kg化合物A，作為單一藥劑的抗PD-1抗體，和6 mg/kg化合物A和抗PD-1抗體的組合治療小鼠的平均腫瘤生長曲線。 圖 24中的資料表示平均腫瘤體積±SEM（14隻小鼠/組）。上部箭頭表示化合物A投藥的天數，而下部箭頭表示抗PD-1抗體投藥的天數。與單獨的化合物A或抗PD-1抗體相比，組合抗腫瘤活性顯著增強（p ＜ 0.05）。TGI%資料在 圖 25中揭露，並且與用媒劑、單獨的化合物A或單獨的抗PD-1抗體治療的組相比，用化合物A和抗PD-1抗體的組合治療的組在治療後第15天顯示出顯著抗腫瘤作用（對於單獨的化合物A組為35.6%；單獨的抗PD-1抗體組為44.1%；並且投予化合物A和抗PD-1抗體的組合的組為74.6%）。資料表示個體腫瘤體積；還顯示了平均值±SEM和與媒劑對照相比的TGI%。與媒劑對照相比，*p ＜ 0.05，**p ＜ 0.01，和***p ＜ 0.01。 ┴與抗PD-1抗體相比，p ＜ 0.05。#與化合物A相比，p ＜ 0.05。各組的中值存活時間示出在 圖 26中，並且對照、化合物A、抗PD-1抗體、和化合物A+抗PD-1抗體組分別為17、27、27.5和38天。組合組的中值存活時間顯著長於化合物A（p ＜ 0.05）和抗PD-1抗體（p ＜ 0.05）單一藥劑治療組。在治療後98天，化合物A和抗PD-1抗體劑量組各14隻動物中僅有1隻（7%）無腫瘤存活，而組合組中14隻動物中有4隻（29%）無腫瘤存活。 圖 26中的資料表示治療組的卡普蘭-邁耶存活曲線。*與媒劑對照相比，p ＜ 0.05。 ┴與抗PD-1抗體相比，p ＜ 0.05。#與化合物A相比，p ＜ 0.05。
在研究3中，與研究2相比，根據相同的IV QWx3投藥方案，在帶有SC CT-26結腸腫瘤的雌性Balb/c小鼠中以更寬的劑量範圍（1、3、6和9 mg/kg）評價化合物A的單一藥劑抗腫瘤活性。 圖 27中的資料表示將化合物A以1 mg/kg、3 mg/kg、6 mg/kg和9 mg/kg單一藥劑投藥時的平均腫瘤生長曲線。資料表示平均腫瘤體積± SEM（14隻小鼠/組；除了9 mg/kg化合物A為12隻小鼠/組）。黑色箭頭表示化合物A投藥的天數。以1 mg/kg、3 mg/kg、6 mg/kg和9 mg/kg單獨投藥的化合物A也展現出劑量依賴性抗腫瘤活性，得出與媒劑對照相比，1、3、6和9 mg/kg劑量組的TGI%分別為29.8%、58.8%、86.2%和84.8%（ 圖 28）。在治療開始後第15天計算TGI%，因為媒劑對照組中的幾個腫瘤超過2000 mm 3。然而，以每週一次或兩次的頻率對展現出完全腫瘤消退的治療組中的動物追蹤測量腫瘤。 圖 28中的資料表示治療後第15天的個體腫瘤體積。資料表示個體腫瘤體積；還顯示了平均值±SEM和與媒劑對照相比的TGI%。***與媒劑對照相比，p ＜ 0.01。與媒劑治療組相比，最低劑量（1 mg/kg）沒有顯示統計學上顯著的抗腫瘤活性，而其他3個劑量組在統計學上是顯著的（p ＜ 0.001）。資料還顯示，兩個高劑量組（6 mg/kg和9 mg/kg）的TGI%相似，表明在6 mg/kg劑量下達到最大抗腫瘤活性。在9 mg/kg劑量組中，發現14隻動物中有2隻在由於治療而體重減輕＞ 15%後死亡。
在研究的組合階段，將1、3或6 mg/kg的化合物A（QWx3）與10 mg/kg IP的抗PD-1抗體（BIWx3）一起投藥。在腫瘤細胞接種後7天開始，此時平均腫瘤體積為約70 mm3，用1、3、6、或9 mg/kg QWx3的化合物A IV治療，或用抗PD-1抗體BIWx3 IP治療，或按照相同投藥方案用組合治療帶有CT-26腫瘤的小鼠。注意，對於9 mg/kg化合物A單一藥劑組，發現兩隻動物在＞ 15%體重減輕後死亡並且不包括在分析中。使用1 mg/kg化合物A+抗PD-1抗體的組合，基於存活資料沒有觀察到累加的抗腫瘤活性。在化合物A治療後的天數，抗PD-1抗體組中14隻動物中有1隻（7%）存活，而3 mg/kg單一藥劑組中的0隻動物存活。然而，在3 mg/kg化合物A+抗PD-1抗體組中，14隻動物中有2隻（14%）存活直至化合物A天數。如 圖 29所示，6 mg/kg化合物A+抗PD-1抗體的組合與單獨的各單一藥劑相比導致延長的存活。媒劑對照、化合物A（6 mg/kg）、抗PD-1抗體（10 mg/kg）、和化合物A+抗PD-1抗體組（6 mg/kg化合物A和10 mg/kg抗PD-1抗體）的中值存活時間分別為21、35、24.5和49天。組合組的中值存活時間顯著長於化合物A和抗PD-1抗體（p ＜ 0.05）單一藥劑治療組。具體地，在化合物A治療後的天數，6 mg/kg化合物A組中有0隻動物存活，而抗PD-1抗體組中的14隻動物中僅有1隻（7%）無腫瘤存活。然而，在組合組中，14隻動物中有5隻（36%）無腫瘤存活（p ＜ 0.05）。 圖 29中的資料代表治療組的卡普蘭-邁耶存活曲線。*與媒劑對照相比，p ＜ 0.05。┴與抗PD-1抗體相比，p ＜ 0.05。#與化合物A相比，p ＜ 0.05。 實例 4. 使用 IL-2 接合物和派姆單抗的組合療法的臨床研究。
進行一項2期非隨機、開放標籤、多群組、多中心研究，以評估實例2中描述的IL-2接合物與派姆單抗組合用於治療晚期肺癌或胸膜間皮瘤的參與者的臨床益處。A1群組參與者是PD-L1腫瘤比例得分（TPS）大於或等於50%的IV期NSCLC患者，其未接受過先前治療（即IL-2接合物治療是1L或一線療法；受試者為初治的）。A2群組參與者是PD-L1腫瘤比例得分（TPS）為1%-49%的IV期NSCLC患者，其未接受過先前治療（即IL-2接合物治療是1L或一線療法；受試者為初治的）。A3群組參與者是IV期非鱗狀NSCLC患者，其未接受過先前治療（即IL-2接合物治療是1L或一線療法；受試者為初治的）。B1群組參與者是患有IV期NSCLC的患者，其已經接受一種或兩種先前療法線（即，IL-2接合物治療是2/3L，或二線或三線療法）並且已經在基於檢查點抑制劑（CPI）的療法（如PD-1/PD-L1）中進展，並且基於研究者判斷，多西他賽或培美曲塞對於他們來說不是最佳治療。B2群組參與者是患有IV期NSCLC的患者，其已經接受一種或兩種先前療法線（即，IL-2接合物治療是2/3L，或二線或三線療法）並且已經在基於檢查點抑制劑（CPI）的療法（例如PD-1/PD-L1）中進展，並且基於研究者判斷，多西他賽或培美曲塞對於他們來說不是最佳治療。C1群組參與者是患有不可切除的惡性胸膜間皮瘤的患者，其已經接受包括與鉑劑組合的基於培美曲塞的方案在內的一種或兩種先前療法線（即IL-2接合物治療是2/3L，或二線或三線療法）並且是CPI初治的。
B1和B2群組參與者先前接受了一種含抗PD-1/PD-L1的方案，所述方案可包括化療劑作為所述方案的一部分，以治療IV期NSCLC，所述IV期NSCLC在根據RECIST 1.1對含抗PD-1/PD-L1的方案證明受益後進展。從含抗PD-1/PD-L1的方案中受益的證明定義為≥ 1次放射成像掃描的SD、CR或部分反應（PR）。含抗PD-1/PD-L1的方案被定義為抗PD-1/PD-L1單一療法或在與另一種全身抗癌療法相同的週期中投予的抗PD-1/PD-L1劑。如果在初始放射學進展之後使用PD-1/PD-L1，同時繼續使用在PD之前使用的相同PD-1/PD-L1藥劑進行治療，則認為是相同的方案。B1和B2群組參與者在作為含抗PD-1/PD-L1的方案的一部分給予或作為單獨的方案給予的一種基於鉑的化療中或之後進展，或拒絕或不能耐受基於鉑的化療。除非先前的治療IV期NSCLC的含抗PD-1/PD-L1方案不包括基於鉑的化療，否則參與者接受過不超過一種先前化療方案。在任何情況下，B1和B2群組的參與者接受過不超過2種先前化療治療。
A1、A2、B1和C1群組的參與者將通過每3週一次靜脈內輸注接受IL-2接合物（24 μg/kg劑量）和派姆單抗（200 mg）。A3群組的參與者將通過每3週一次靜脈內輸注接受IL-2接合物（24 μg/kg劑量）和派姆單抗（200 mg），並且還將接受培美曲塞（在每個21天週期的第1天以500 mg/m 2IV輸注投予）和卡鉑或順鉑中的一種。B2群組的參與者將通過每3週一次靜脈內輸注接受IL-2接合物（24 μg/kg劑量）、派姆單抗（200 mg），並且還將接受奈米顆粒白蛋白結合型紫杉醇（在每個週期的第1天和第8天以100 mg/m 2IV輸注投予，持續6個週期）。如果確定在醫學上是必要的或合適的，監督醫師可以決定投予對乙醯胺基酚、苯海拉明、葉酸、維生素B12和/或昂丹司瓊。所有群組的參與者將接受IL-2接合物治療，直至疾病進展、不可接受的毒性或完成35個週期（1個週期為21天）。
關鍵納入標準。所有參與者均為18歲以上的男性或女性。根據RECIST v 1.1，A1、A2、A3、B1和B2群組中的參與者具有至少一個可測量的病變。根據修改的RECIST，C1群組中的參與者具有至少一個可測量的病變。所有參與者具有足夠的心血管、血液、肝、腎功能和實驗室參數。A1、A2、B1和B2群組中的參與者具有組織學或細胞學證實的IV期NSCLC診斷。A3中的參與者具有組織學或細胞學證實的IV期NSCLC診斷。C1群組中的參與者具有組織學證實的不可切除的惡性胸膜間皮瘤（MPM）。A1群組中的參與者具有PD-L1表現TPS ≥ 50%。A2群組中的參與者具有PD-L1表現TPS 1%-49%。如果女性不懷孕或哺乳，不屬於有生育可能（WOCBP）的女性或是同意以下的WOCBP：使用批准的避孕方法並在治療前和中斷研究治療後至少420天（群組A3）或150天（群組A1、A2、B1、B2、C1）進行定期妊娠測試，在中斷研究治療後150天不捐獻或冷凍保存卵子，則她們有資格參加。如果男性同意在研究治療期間和至少330天（群組A3）或210天（群組A1、A2、B1、B2、C1）內和中斷研究治療後不捐獻或冷凍保存精子，並且戒斷異性性交或使用批准的避孕，則他們有資格參與。參與者能夠簽署知情同意書。
關鍵排除標準。所有參與者的ECOG體能狀態小於2。參與者沒有同種異體組織/實體器官移植史。參與者沒有來自先前免疫腫瘤學療法的4級免疫介導/相關毒性，或導致中斷的免疫介導/相關毒性。參與者沒有任何先前抗癌療法引起的≥ 2級持續AE。參與者沒有≤ 92%的基線氧飽和度（SpO2）（沒有氧療法）。參與者沒有接受過先前基於IL-2的抗癌治療。參與者能夠在每次IL-2接合物投藥前暫時（至少36小時）不服用抗高血壓藥物。參與者在開始用IL-2接合物治療的28天內未接受過活病毒或活減毒疫苗接種。參與者沒有任何醫學或臨床病症、實驗室異常、或監督醫師判斷可能妨礙方案療法或可能使受試者不適合研究的任何特定情況。A1、A2、A3、B1和B2群組的參與者不具有已知的驅動改變，如表皮生長因子受體（EGFR）、間變性淋巴瘤激酶（ALK）、原癌基因酪胺酸-蛋白激酶（ROS）1或BRAF突變。對於患有非鱗狀NSCLC的參與者。A3群組的參與者沒有不受控制的胸膜/腹膜積液、心包積液或需要反復引流程序的腹水；主要為鱗狀細胞組織學NSCLC；不能中斷阿司匹林或其他非甾體抗炎藥（NSAID）（除了阿司匹林劑量≤ 1.3 g/天），持續5天時間段。A1、A2、A3和C1群組的參與者未接受過阻斷PD-1/PD-L1途徑的先前藥劑治療。
可以根據各種標準監測患者的疾病進展。根據RECIST 1.1，A1-A3和B1-B2群組參與者在投予第一劑IL-2接合物和派姆單抗組合治療後多達約6個月，以及根據修改的RECIST，C1群組參與者在投予第一劑IL-2接合物和派姆單抗組合治療後多達約6個月，評價患者的客觀反應率（ORR）。
還可以從第一次投予IL-2接合物到最後一次投藥後30天評價任何不良事件（AE）或實驗室測試或其他研究的類型、頻率、嚴重程度、嚴重性和與研究療法的關係；由於AE的藥物中斷。
可以評價反應時間（TTR），其定義為從第一次投予IL-2接合物到第一次腫瘤評估的時間，在所述第一次腫瘤評估時將總反應記錄為隨後根據RECIST 1.1（對於NSCLC）或mRECIST（對於間皮瘤）確認和測定的部分反應（PR）或完全反應（CR）。
可以評價反應持續時間（DoR），其定義為從將總反應記錄為隨後確認的部分反應（PR）或完全反應（CR）的第一次腫瘤評估直到根據RECIST 1.1（對於NSCLC）或mRECIST（對於間皮瘤）確認的疾病進展（PD）或任何原因的死亡（以先發生者為准）的時間。
可以評價從第一次投予IL-2接合物直到PD（根據RECIST 1.1[對於NSCLC]或mRECIST[對於間皮瘤]）或任何原因的死亡（以先發生者為准）的至少6個月的臨床受益率（CBR），包括任何時間的CR或PR加上疾病穩定（SD）。
可以評價無進展存活期（PFS），其定義為從第一次投予IL-2接合物的日期到根據RECIST 1.1（對於NSCLC）或mRECIST（對於間皮瘤）首次記錄的疾病進展日期或任何原因的死亡（以先發生者為准）的時間。
也可以在整個研究的不同時間點在患者中評價藥代動力學參數，如IL-2接合物的濃度和針對IL-2接合物的抗藥物抗體（ADA）的發生率。
在一些實施例中，接受治療的個體（即A1、A2、A3、B1、B2或C1群組中的參與者）顯示回應於治療的目標病變的大小減小。在一些實施例中，個體在治療後顯示完全反應（CR）。在一些實施例中，個體在治療後顯示部分反應（PR）。在一些實施例中，個體在治療後顯示疾病穩定（SD）。在一些實施例中，個體在第一次腫瘤評估後（如在3個週期後）顯示PR、CR或SD。在一些實施例中，個體在第二次腫瘤評估後（如在4個或更多個週期後）顯示PR、CR或SD。在一些實施例中，個體在第三次、第四次或隨後的腫瘤評估後顯示PR、CR或SD。
雖然在本文中已經示出和描述了本發明的優選實施例，但是對於本領域的技術人員來說，顯然這些實施例僅作為舉例提供。在不背離本發明的情況下，業內熟習此項技術者現在將想到許多變型、改變和替換。應該理解的是，本文所述的本發明的實施例的各種替代方案可以用於實踐本發明。以下申請專利範圍旨在限定本發明的範圍，並且由此覆蓋這些申請專利範圍及其等同物範圍內的方法和結構。在此引用的所有專利和科學文獻的披露內容均以其全文通過引用明確併入本文。
本發明的新特徵具體陳述於所附的申請專利範圍中。將通過參考陳述利用本發明原理的說明性實施例的以下具體描述和附圖獲得對本發明的特徵和優點的更好的理解，在所述附圖中：
圖 1A顯示投予8 μg/kg IL-2接合物和派姆單抗後指定時間在所指示受試者中外周CD8+ T eff計數的變化。在此處和其他地方，名稱如“C1D1”表示治療週期和天（例如，治療週期1，第1天）。“前（PRE）”表示投予前的基線測量值；24HR表示投予後24小時；等等。
圖 1B顯示投予第一劑量的IL-2接合物和派姆單抗後外周CD8+ T eff細胞擴增峰值的變化。將資料相對治療前（C1D1）CD8+ T細胞計數歸一化。列出的值表示中值倍數變化。
圖 1C顯示投予16 μg/kg IL-2接合物和派姆單抗後指定時間在所指示受試者中外周CD8+ T eff計數的變化。
圖 2顯示投予8 μg/kg IL-2接合物和派姆單抗後指定時間在所指示受試者中表現Ki67的CD8+ T eff細胞的百分比。
圖 3A顯示投予8 μg/kg IL-2接合物和派姆單抗後指定時間在所指示受試者中外周自然殺傷（NK）細胞計數的變化。
圖 3B顯示投予第一劑量的IL-2接合物和派姆單抗後外周NK細胞擴增峰值的變化。將資料相對治療前（C1D1）NK細胞計數歸一化。列出的值表示中值倍數變化。
圖 3C顯示投予16 μg/kg IL-2接合物和派姆單抗後指定時間在所指示受試者中外周自然殺傷（NK）細胞計數的變化。
圖 4顯示投予8 μg/kg IL-2接合物和派姆單抗後指定時間在所指示受試者中表現Ki67的NK細胞的百分比。
圖 5A顯示投予8 μg/kg IL-2接合物和派姆單抗後指定時間在所指示受試者中外周CD4+ T reg計數的變化。
圖 5B顯示投予第一劑量的IL-2接合物和派姆單抗後外周CD4+ T reg細胞擴增峰值的變化。將資料相對治療前（C1D1）CD4+ T細胞計數歸一化。列出的值表示中值倍數變化。
圖 5C顯示投予16 μg/kg IL-2接合物和派姆單抗後指定時間在所指示受試者中外周CD4+ T reg計數的變化。
圖 6顯示投予8 μg/kg IL-2接合物和派姆單抗後指定時間在所指示受試者中表現Ki67的CD4+ T reg細胞的百分比。
圖 7A顯示投予8 μg/kg IL-2接合物和派姆單抗後指定時間在所指示受試者中嗜酸性白血球計數的變化。
圖 7B顯示投予第一劑量的IL-2接合物和派姆單抗後外周嗜酸性白血球擴增峰值的變化。將資料相對治療前（C1D1）嗜酸性白血球計數歸一化。列出的值表示中值倍數變化。
圖 7C顯示投予16 μg/kg IL-2接合物和派姆單抗後指定時間在所指示受試者中嗜酸性白血球計數的變化。
圖 8A顯示投予8 μg/kg IL-2接合物和派姆單抗後指定時間在所指示受試者中IFN-γ、IL-5和IL-6的血清水平。
圖 8B顯示投予8 μg/kg IL-2接合物和派姆單抗後IL-5的血清水平。BLQ = 定量下限。將資料繪製為平均值（範圍為BLQ至最大值）。
圖 8C顯示投予8 μg/kg IL-2接合物和派姆單抗後IL-6的血清水平。BLQ = 定量下限。將資料繪製為平均值（範圍為BLQ至最大值）。
圖 8D顯示投予16 µg/kg IL-2接合物和派姆單抗後指定時間在所指示受試者中IFN-γ、IL-5和IL-6的血清水平。
圖 9A和 圖 9B分別顯示在1和2個週期後，以8 μg/kg的劑量與派姆單抗一起投予的IL-2接合物的平均濃度。
圖 9C和 圖 9D分別顯示在1和2個週期後，以16 μg/kg的劑量與派姆單抗一起投予的IL-2接合物的平均濃度。
圖 10顯示投予24 μg/kg IL-2接合物和派姆單抗後指定時間在所指示受試者中外周CD8+ T eff細胞計數的變化。
圖 11顯示投予24 µg/kg IL-2接合物和派姆單抗後指定時間在所指示受試者中外周NK細胞計數的變化。
圖 12顯示投予24 µg/kg IL-2接合物和派姆單抗後指定時間在所指示受試者中外周CD4+ T reg細胞計數的變化。
圖 13顯示投予24 µg/kg IL-2接合物和派姆單抗後指定時間在所指示受試者中外周嗜酸性白血球計數的變化。
圖 14A和 圖 14B分別顯示在1和2個週期後，以24 μg/kg的劑量與派姆單抗一起投予的IL-2接合物的平均濃度。
圖 15顯示投予IL-2接合物後指定時間用24 μg/kg的IL-2接合物和派姆單抗治療的所指示受試者中IFN-γ、IL-6和IL-5的水平。
圖 16顯示投予32 μg/kg IL-2接合物和派姆單抗後指定時間在所指示受試者中外周CD8+ T eff細胞計數的變化。
圖 17顯示投予32 µg/kg IL-2接合物和派姆單抗後指定時間在所指示受試者中的外周CD4+ T reg細胞計數。
圖 18A和 圖 18B分別顯示在1和2個週期後，以32 μg/kg的劑量與派姆單抗一起投予的IL-2接合物的平均濃度。
圖 19顯示投予IL-2接合物後指定時間用32 μg/kg的IL-2接合物和派姆單抗治療的所指示受試者中IFN-γ、IL-6和IL-5的水平。
圖 20顯示實例3中研究1中根據QWx3方案IV投藥的化合物A的抗腫瘤活性圖。黑色箭頭表示用化合物A投藥的天數。
圖 21顯示實例3中研究1中採用根據QWx3方案IV投藥的化合物A的情況下的腫瘤體積圖。
圖 22顯示實例3中研究1中用化合物A以QWx3投藥治療的各動物在治療後第15天的腫瘤體積。黑色箭頭表示用化合物A投藥的天數。
圖 23顯示實例3中研究1中用化合物A以Q2Wx2投藥的各動物在治療後第15天的腫瘤體積。
圖 24顯示實例3的研究2中用媒劑，6 mg/kg化合物A作為單一藥劑，抗PD-1抗體作為單一藥劑，和6 mg/kg化合物A與抗PD-1抗體的組合治療小鼠的平均腫瘤生長曲線。黑色箭頭表示用化合物A投藥的天數。
圖 25顯示實例3的研究2中與用媒劑、單獨的化合物A或單獨的抗PD-1抗體治療的組相比，用化合物A和抗PD-1抗體的組合治療的組中治療後第15天的TGI%資料的圖。與媒劑對照相比，*p ＜ 0.05，**p ＜ 0.01，和***p ＜ 0.01。 ┴與抗PD-1抗體相比，p ＜ 0.05。#與化合物A相比，p ＜ 0.05。資料表示平均腫瘤體積± SEM（14隻小鼠/組）。
圖 26顯示實例3的研究2中治療組的卡普蘭-邁耶（Kaplan-Meier）存活曲線圖。*與媒劑對照相比，p ＜ 0.05。 ┴與抗PD-1抗體相比，p ＜ 0.05。#與化合物A相比，p ＜ 0.05。
圖 27表示實例3的研究3中化合物A以1 mg/kg、3 mg/kg、6 mg/kg和9 mg/kg單一藥劑投藥時的平均腫瘤生長曲線。資料表示平均腫瘤體積± SEM（14隻小鼠/組；除了9 mg/kg化合物A為12隻小鼠/組）。黑色箭頭表示化合物A投藥的天數。
圖 28表示實例3的研究3中治療後第15天的個體腫瘤體積。資料表示個體腫瘤體積；還顯示了平均值± SEM和與媒劑對照相比的TGI%。***與媒劑對照相比，p ＜ 0.01。
圖 29顯示用媒劑（對照）、單獨的抗PD-1抗體、單獨的化合物A、以及化合物A與抗PD-1抗體的組合治療的治療組的卡普蘭-邁耶存活曲線圖。*實例3的研究3中與媒劑對照相比，p ＜ 0.05。 ┴與抗PD-1抗體相比，p ＜ 0.05。#與化合物A相比，p ＜ 0.05。
圖 30顯示用於本發明的例示性抗PD-1單株抗體的輕鏈和重鏈的胺基酸序列（分別為SEQ ID NO: 15和20）。輕鏈和重鏈可變區加底線（SEQ ID NO: 14和19），並且CDR用粗體和加框表示。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 111105132-A0101-11-0001-1

Claims (52)

  1. 一種在有需要的受試者中治療肺癌的方法，其包括向所述受試者投予 (a) IL-2接合物，和 (b) 抗PD-1抗體或其抗原結合片段，其中： 所述IL-2接合物包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，其中位置P64處的胺基酸被式(I)的結構替代：
    Figure 03_image001
    式 (I) 其中： Z是CH 2並且Y是
    Figure 03_image003
    ； Y是CH 2並且Z是
    Figure 03_image005
    ； Z是CH 2並且Y是
    Figure 03_image006
    ；或者 Y是CH 2並且Z是
    Figure 03_image008
    ； W是具有約25 kDa-35 kDa的平均分子量的PEG基團； q是1、2或3； X是具有以下結構的L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1表示與前一個胺基酸殘基的附接點；以及 X+1表示與後一個胺基酸殘基的附接點；以及 其中所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO: 11、12和13中所示的胺基酸序列之輕鏈互補決定區（CDR）以及包含SEQ ID NO: 16、17和18中所示的胺基酸序列之重鏈CDR。
  2. 一種在有需要的受試者中治療肺癌的方法，其包括向所述受試者投予 (a) IL-2接合物，和 (b) 抗PD-1抗體或其抗原結合片段，其中： 所述肺癌是非鱗狀非小細胞肺癌（NSCLC）、胸膜間皮瘤、不可切除的肺癌、IV期肺癌、PD-L1腫瘤比例得分大於或等於50%的NSCLC、或PD-L1腫瘤進展得分小於50%或為1%-49%的NSCLC；以及 所述IL-2接合物包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，其中位置P64處的胺基酸被式(I)的結構替代：
    Figure 03_image001
    式 (I) 其中： Z是CH 2並且Y是
    Figure 03_image003
    ； Y是CH 2並且Z是
    Figure 03_image005
    ； Z是CH 2並且Y是
    Figure 03_image006
    ；或者 Y是CH 2並且Z是
    Figure 03_image008
    W是具有約25 kDa-35 kDa的平均分子量的PEG基團； q是1、2或3； X是具有以下結構的L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1表示與前一個胺基酸殘基的附接點；以及 X+1表示與後一個胺基酸殘基的附接點， 其中所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO: 11、12和13中所示的胺基酸序列之輕鏈互補決定區（CDR）以及包含SEQ ID NO: 16、17和18中所示的胺基酸序列之重鏈CDR。
  3. 一種在有需要的受試者中治療肺癌的方法，其包括： 選擇患有肺癌的受試者，其中基於一種或多種屬性選擇所述受試者，所述屬性包括 (i) 肺癌是非鱗狀非小細胞肺癌（NSCLC）；(ii) 肺癌是胸膜間皮瘤；(iii) 肺癌是不可切除的肺癌；(iv) 肺癌是IV期肺癌；(v) 肺癌是PD-L1腫瘤比例得分大於或等於50%的NSCLC；(vi) 肺癌是PD-L1腫瘤進展得分小於50%或為1%-49%的NSCLC；以及 向所述受試者投予 (a) IL-2接合物，和 (b) 抗PD-1抗體或其抗原結合片段，其中： 所述IL-2接合物包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，其中位置P64處的胺基酸被式 (I) 的結構替代：
    Figure 03_image001
    式 (I) 其中： Z是CH 2並且Y是
    Figure 03_image003
    ； Y是CH 2並且Z是
    Figure 03_image005
    ； Z是CH 2並且Y是
    Figure 03_image006
    ；或者 Y是CH 2並且Z是
    Figure 03_image008
    ； W是具有約25 kDa-35 kDa的平均分子量的PEG基團； q是1、2或3； X是具有以下結構的L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1表示與前一個胺基酸殘基的附接點；以及 X+1表示與後一個胺基酸殘基的附接點， 其中所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO: 11、12和13中所示的胺基酸序列之輕鏈互補決定區（CDR）以及包含SEQ ID NO: 16、17和18中所示的胺基酸序列之重鏈CDR。
  4. 如請求項1-3中任一項所述的方法，其還包括向所述受試者投予順鉑。
  5. 一種在有需要的受試者中治療肺癌的方法，其包括向所述受試者投予 (a) IL-2接合物，(b) 抗PD-1抗體或其抗原結合片段，和 (c) 順鉑，其中： 所述IL-2接合物包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，其中位置P64處的胺基酸被式 (I) 的結構替代：
    Figure 03_image001
    式 (I) 其中： Z是CH 2並且Y是
    Figure 03_image003
    ； Y是CH 2並且Z是
    Figure 03_image005
    ； Z是CH 2並且Y是
    Figure 03_image006
    ；或者 Y是CH 2並且Z是
    Figure 03_image008
    ； W是具有約25 kDa-35 kDa的平均分子量的PEG基團； q是1、2或3； X是具有以下結構的L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1表示與前一個胺基酸殘基的附接點；以及 X+1表示與後一個胺基酸殘基的附接點， 其中所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO: 11、12和13中所示的胺基酸序列之輕鏈互補決定區（CDR）以及包含SEQ ID NO: 16、17和18中所示的胺基酸序列之重鏈CDR。
  6. 如請求項1-5中任一項所述的方法，其中所述肺癌是NSCLC。
  7. 如請求項1-6中任一項所述的方法，其中所述肺癌是不可切除的。
  8. 如請求項1-7中任一項所述的方法，其中所述肺癌是IV期。
  9. 如請求項1-8中任一項所述的方法，其中所述肺癌是非鱗狀NSCLC。
  10. 如請求項1-9中任一項所述的方法，其中所述肺癌是胸膜間皮瘤。
  11. 如請求項1-10中任一項所述的方法，其包括向所述受試者投予約8 μg/kg的所述IL-2接合物。
  12. 如請求項1-10中任一項所述的方法，其包括向所述受試者投予約16 μg/kg的所述IL-2接合物。
  13. 如請求項1-10中任一項所述的方法，其包括向所述受試者投予約24 μg/kg的所述IL-2接合物。
  14. 如請求項1-10中任一項所述的方法，其包括向所述受試者投予約32 μg/kg的所述IL-2接合物。
  15. 如請求項1-14中任一項所述的方法，其還包括向所述受試者投予培美曲塞。
  16. 如請求項1-15中任一項所述的方法，其還包括向所述受試者投予卡鉑。
  17. 如請求項1-16中任一項所述的方法，其還包括向所述受試者投予奈米顆粒白蛋白結合型紫杉醇(nab-paclitaxel)。
  18. 如請求項1-17中任一項所述的方法，其中在所述IL-2接合物中，所述PEG基團具有約30 kDa的平均分子量。
  19. 如請求項1-18中任一項所述的方法，其中在所述IL-2接合物中，Z是CH 2並且Y是
    Figure 03_image012
    。
  20. 如請求項1-18中任一項所述的方法，其中在所述IL-2接合物中，Y是CH 2並且Z是
    Figure 03_image012
    。
  21. 如請求項1-18中任一項所述的方法，其中在所述IL-2接合物中，Z是CH 2並且Y是
    Figure 03_image014
    。
  22. 如請求項1-18中任一項所述的方法，其中在所述IL-2接合物中，Y是CH 2並且Z是
    Figure 03_image014
    。
  23. 如請求項1-18中任一項所述的方法，其中式(I)的結構具有式(IV)或式(V)的結構，或者是式(IV)和式(V)的混合物：
    Figure 03_image016
    式 (IV)；
    Figure 03_image018
    式 (V)； 其中： q是1、2或3； X是具有以下結構的L-胺基酸：
    Figure 03_image009
    ； X-1表示與前一個胺基酸殘基的附接點；以及 X+1表示與後一個胺基酸殘基的附接點。
  24. 如請求項1-18中任一項所述的方法，其中式(I)的結構具有式(XII)或式(XIII)的結構，或者是式(XII)和式(XIII)的混合物：
    Figure 03_image020
    式 (XII)；
    Figure 03_image022
    式 (XIII)； 其中： n是整數，使得-(OCH 2CH 2) n-OCH 3具有約30 kDa的分子量； q是1、2或3；以及 波浪線表示與SEQ ID NO: 1中未被替代的胺基酸殘基的共價鍵。
  25. 如請求項1-24中任一項所述的方法，其中q是1。
  26. 如請求項1-24中任一項所述的方法，其中q是2。
  27. 如請求項1-24中任一項所述的方法，其中q是3。
  28. 如請求項1-27中任一項所述的方法，其中約每兩週一次、約每三週一次、或約每4週一次向所述受試者投予所述IL-2接合物。
  29. 如請求項1-28中任一項所述的方法，其中約每兩週一次、約每三週一次、或約每4週一次向所述受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段。
  30. 如請求項1-29中任一項所述的方法，其中所述IL-2接合物是醫藥上可接受的鹽、溶劑合物、或水合物。
  31. 如請求項1-30中任一項所述的方法，其中所述方法包括： (i)    每約三週向所述患者投予約200 mg的抗PD-1抗體或其抗原結合片段；或 (ii)   每約六週向所述患者投予約400 mg的抗PD-1抗體或其抗原結合片段。
  32. 如請求項1-31中任一項所述的方法，其中將所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段分開投予。
  33. 如請求項32所述的方法，其中將所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段依序投予。
  34. 如請求項32或33所述的方法，其中將所述IL-2接合物在所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段之前投予。
  35. 如請求項32或33所述的方法，其中將所述IL-2接合物在所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段之後投予。
  36. 如請求項1-35中任一項所述的方法，其中通過皮下投予向所述受試者投予所述IL-2接合物。
  37. 如請求項1-36中任一項所述的方法，其中通過皮下投予向所述受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段。
  38. 如請求項1-35中任一項所述的方法，其中通過靜脈內投予向所述受試者投予所述IL-2接合物。
  39. 如請求項1-35中任一項所述的方法，其中通過靜脈內投予向所述受試者投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段。
  40. 如請求項1-39中任一項所述的方法，其還包括向所述受試者投予對乙醯胺基酚。
  41. 如請求項1-40中任一項所述的方法，其還包括向所述受試者投予苯海拉明。
  42. 如請求項40或41所述的方法，其中在投予所述IL-2接合物之前將對乙醯胺基酚和/或苯海拉明投予於所述受試者。
  43. 如請求項1-42中任一項所述的方法，其還包括至少部分地基於所述肺癌為非鱗狀NSCLC選擇被投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段的受試者。
  44. 如請求項1-43中任一項所述的方法，其還包括至少部分地基於所述肺癌為胸膜間皮瘤選擇被投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段的受試者。
  45. 如請求項1-44中任一項所述的方法，其還包括至少部分地基於所述肺癌為不可切除的肺癌選擇被投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段的受試者。
  46. 如請求項1-45中任一項所述的方法，其還包括至少部分地基於所述肺癌為IV期肺癌選擇被投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段的受試者。
  47. 如請求項1-46中任一項所述的方法，其還包括至少部分地基於所述肺癌為PD-L1腫瘤比例得分大於或等於50%的NSCLC選擇被投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段的受試者。
  48. 如請求項1-47中任一項所述的方法，其還包括至少部分地基於所述肺癌為PD-L1腫瘤進展得分小於50%或為1%-49%的NSCLC選擇被投予所述IL-2接合物和所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段的受試者。
  49. 一種用於如請求項1-48中任一項所述的方法中的IL-2接合物。
  50. 一種IL-2接合物用於製備用於如請求項1-49中任一項所述的方法的藥物的用途。
  51. 如前述請求項中任一項所述的方法、用於所述用途的IL-2接合物或用途，其中所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含： (a)   重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 19所示的胺基酸序列或SEQ ID NO: 19的變異體，和 (b)   輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 14所示的胺基酸序列或SEQ ID NO: 14的變異體。
  52. 如前述請求項中任一項所述的方法、用於所述用途的IL-2接合物或用途，其中所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段是包含重鏈和輕鏈的單株抗體，所述重鏈包含SEQ ID NO: 20所示的胺基酸序列，所述輕鏈包含SEQ ID NO: 15所示的胺基酸序列。
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