CN116635061A - 用il-2缀合物的免疫肿瘤学疗法 - Google Patents

用il-2缀合物的免疫肿瘤学疗法 Download PDF

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CN116635061A
CN116635061A CN202180077790.1A CN202180077790A CN116635061A CN 116635061 A CN116635061 A CN 116635061A CN 202180077790 A CN202180077790 A CN 202180077790A CN 116635061 A CN116635061 A CN 116635061A
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C·E·卡法罗
J·莱韦克
M·米拉
J·帕特钦
L·肖弗
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New Sox Co ltd
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Abstract

本文公开了涉及施用IL‑2缀合物的方法和用途或者用于治疗一种或多种适应证如治疗增殖性疾病的方法。本文还描述了包含一种或多种所述IL‑2缀合物的药物组合物和试剂盒。

Description

用IL-2缀合物的免疫肿瘤学疗法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年10月9日提交的美国临时申请号63/090,005、2021年3月9日提交的美国临时申请号63/158,672、2021年4月9日提交的美国临时申请号63/173,130的优先权，将其中每一项的公开内容通过引用以其整体特此并入。
背景技术
不同的T细胞群体调节免疫系统，以维持免疫稳态和耐受性。例如，调节性T(Treg)细胞通过防止病理性自身反应性来防止免疫系统的不适当反应，而细胞毒性T细胞靶向并破坏感染的细胞和/或癌细胞。在一些情况下，不同T细胞群体的调节为疾病或适应证的治疗提供选择。
细胞因子包括细胞信号传导蛋白的家族，如趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子、肿瘤坏死因子以及在先天性和适应性免疫细胞稳态中发挥作用的其他生长因子。细胞因子是由免疫细胞(如巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和肥大细胞、内皮细胞、成纤维细胞和不同的基质细胞)产生的。在一些情况下，细胞因子调节体液免疫应答与基于细胞的免疫应答之间的平衡。
白介素是调节以下细胞的发育和分化的信号传导蛋白：T淋巴细胞和B淋巴细胞、单核细胞谱系的细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞和造血细胞。白介素是由辅助CD4+T和B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞和其他组织驻留细胞产生的。
在一些情况下，白介素2(IL-2)信号传导用于调节T细胞应答，并且随后用于治疗癌症。因此，在一个方面，本文提供了治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括施用IL-2缀合物。
发明内容
本文描述了治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg、32μg/kg或40μg/kg，或者约24μg/kg至40μg/kg的作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含在位置64处具有本文所述的非天然氨基酸残基的SEQ ID NO:1的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
示例性实施方案包括以下内容。实施方案1是一种在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg至40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
实施方案2是一种在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用约40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
实施方案3是一种在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用约32μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
实施方案4是一种在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
实施方案5是一种用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法中使用的IL-2缀合物，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg至40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
实施方案6是一种用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法中使用的IL-2缀合物，所述方法包括向有需要的受试者施用约40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
实施方案7是一种用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法中使用的IL-2缀合物，所述方法包括向有需要的受试者施用约32μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
实施方案8是一种用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法中使用的IL-2缀合物，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
实施方案9是IL-2缀合物用于制造用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法的药剂的用途，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg至40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
实施方案10是IL-2缀合物用于制造用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法的药剂的用途，所述方法包括向有需要的受试者施用约40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
实施方案11是IL-2缀合物用于制造用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法的药剂的用途，所述方法包括向有需要的受试者施用约32μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
实施方案12是IL-2缀合物用于制造用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法的药剂的用途，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
实施方案13是根据实施方案1-12中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述PEG具有约30kDa的分子量。
实施方案14是根据实施方案1-13中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述IL-2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，其中[AzK_L1_PEG30kD]是具有式(XVI)或式(XVII)的结构的L-氨基酸：
其中：
m是2；
n是整数，使得-(OCH2CH2)n-OCH3具有约30kDa的分子量；并且
波浪线指示与SEQ ID NO:2中未被替代的氨基酸残基的共价键。
实施方案15是根据实施方案1-14中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中施用包含所述IL-2缀合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
实施方案16是根据实施方案15所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述药物组合物包含所述IL-2缀合物的混合物，其中所述混合物包含其中所述式(IA)的结构是具有式(XVI)的结构的L-氨基酸的IL-2缀合物和其中所述式(IA)的结构是具有式(XVII)的结构的L-氨基酸的IL-2缀合物。
实施方案17是根据实施方案1-13中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述式(IA)的结构具有式(IVA)或式(VA)的结构：
其中：
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；并且
q是1、2或3。
实施方案18是根据实施方案17所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中施用包含所述IL-2缀合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，并且所述药物组合物包含所述IL-2缀合物的混合物，其中所述混合物包含其中所述式(IA)的结构是具有式(IVA)的结构的L-氨基酸的IL-2缀合物和其中所述式(IA)的结构是具有式(VA)的结构的L-氨基酸的IL-2缀合物。
实施方案19是根据实施方案1-13中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述位置64处的氨基酸具有式(XIIA)或(XIIIA)的结构：
其中：
n是整数，使得-(OCH2CH2)n-OCH3具有约25kDa-35kDa的分子量；
q是1、2或3；并且
波浪线指示与SEQ ID NO:1中未被替代的氨基酸残基的共价键。
实施方案20是根据实施方案19所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中施用包含所述IL-2缀合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，并且所述药物组合物包含所述IL-2缀合物的混合物，其中所述混合物包含其中SEQ ID NO:1的氨基酸P64被式(XIIA)的结构替代的IL-2缀合物和其中SEQ ID NO:1的氨基酸P64被式(XIIIA)的结构替代的IL-2缀合物。
实施方案21是一种在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg至40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30 kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
实施方案22是一种在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用约40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
实施方案23是一种在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用约32μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
实施方案24是一种在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
实施方案25是一种用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法中使用的IL-2缀合物，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg至40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
实施方案26是一种用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法中使用的IL-2缀合物，所述方法包括向有需要的受试者施用约40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
实施方案27是一种用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法中使用的IL-2缀合物，所述方法包括向有需要的受试者施用约32μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
实施方案28是一种用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法中使用的IL-2缀合物，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
实施方案29是一种用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法中使用的IL-2缀合物，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg至40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
实施方案30是一种用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法中使用的IL-2缀合物，所述方法包括向有需要的受试者施用约40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
实施方案31是一种用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法中使用的IL-2缀合物，所述方法包括向有需要的受试者施用约32μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
实施方案32是一种用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法中使用的IL-2缀合物，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
实施方案33是IL-2缀合物用于制造用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法的药剂的用途，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg至40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30 kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
实施方案34是IL-2缀合物用于制造用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法的药剂的用途，所述方法包括向有需要的受试者施用约40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30 kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
实施方案35是IL-2缀合物用于制造用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法的药剂的用途，所述方法包括向有需要的受试者施用约32μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
实施方案36是IL-2缀合物用于制造用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法的药剂的用途，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
实施方案37是根据实施方案1-13和15-36中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中q是1。
实施方案38是根据实施方案1-13和15-36中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中q是2。
实施方案39是根据实施方案1-13和15-36中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中q是3。
实施方案40是根据实施方案1-39中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中将所述IL-2缀合物施用至少两次。
实施方案41是根据实施方案1-40中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中将所述IL-2缀合物施用至少三次。
实施方案42是根据实施方案1-41中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中将所述IL-2缀合物施用至少四次。
实施方案43是根据实施方案1-42中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中将所述IL-2缀合物施用至少五次。
实施方案44是根据实施方案1-43中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中将所述IL-2缀合物约每两周施用一次。
实施方案45是根据实施方案1-43中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中将所述IL-2缀合物约每三周施用一次。
实施方案46是根据实施方案1-45中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中将所述IL-2缀合物约每14、15、16、17、18、19、20或21天施用一次。
实施方案47是根据实施方案1-46中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述受试者患有实体瘤癌症。
实施方案48是根据实施方案1-47中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述受试者患有转移性实体瘤。
实施方案49是根据实施方案1-48中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述受试者患有晚期实体瘤。
实施方案50是根据实施方案1-46中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述受试者患有液体瘤。
实施方案51是根据实施方案1-50中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述受试者患有难治性癌症。
实施方案52是根据实施方案1-51中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述受试者患有复发性癌症。
实施例53是根据实施方案1-52中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述癌症选自肾细胞癌(RCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、经典型霍奇金淋巴瘤(cHL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、尿路上皮癌、微卫星不稳定癌、微卫星稳定癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌(CRC)、宫颈癌、肝细胞癌(HCC)、梅克尔细胞癌(MCC)、黑色素瘤、小细胞肺癌(SCLC)、食管癌、食管鳞状细胞癌(ESCC)、胶质母细胞瘤、间皮瘤、乳腺癌、三阴性乳腺癌、前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌、转移性去势抵抗性前列腺癌、或具有DNA损伤应答(DDR)缺陷的转移性去势抵抗性前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、中度至低度突变负荷的肿瘤、皮肤鳞状细胞癌(CSCC)、鳞状细胞皮肤癌(SCSC)、低表达至不表达PD-L1的肿瘤、超出其原发解剖学起源部位全身性播散至肝脏和CNS的肿瘤以及弥漫性大B细胞淋巴瘤。
实施方案54是根据实施方案1-53中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中CD8+细胞扩增至少约2倍。
实施方案55是根据实施方案1-54中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中NK细胞扩增至少约2倍。
实施方案56是根据实施方案1-55中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中嗜酸性粒细胞扩增不多于约3.2倍。
实施方案57是根据实施方案1-55中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中CD4+细胞扩增不多于约3.2倍。
实施方案58是根据实施方案1-57中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中CD8+细胞和/或NK细胞的扩增多于CD4+细胞和/或嗜酸性粒细胞的扩增。
实施方案59是根据实施方案1-58中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述IL-2缀合物不引起剂量限制性毒性。
实施方案60是根据实施方案1-59中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述IL-2缀合物不引起重度细胞因子释放综合征。
实施方案61是根据实施方案1-60中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述IL-2缀合物不引起血管渗漏综合征。
实施方案62是根据实施方案1-61中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中通过皮下施用向所述受试者施用所述IL-2缀合物。
实施方案63是根据实施方案1-61中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中通过静脉内施用向所述受试者施用所述IL-2缀合物。
实施方案64是根据实施方案1-63中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述IL-2缀合物是药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。
实施方案65是根据实施方案1-64中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中没有向所述受试者施用另外的治疗剂。
实施方案66是根据实施方案1-65中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述IL-2缀合物不诱导抗药物抗体。
实施方案67是根据实施方案1-66中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述受试者患有鳞状细胞癌。
实施方案68是根据实施方案1-66中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述受试者患有结直肠癌。
实施方案69是根据实施方案1-66中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述受试者患有黑色素瘤。
实施方案70是根据前述实施方案中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述方法包括向所述受试者施用约24μg/kg至32μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2。
实施方案71是根据前述实施方案中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述方法向所述受试者施用约32μg/kg至40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2。
实施方案72是根据前述实施方案中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述IL-2缀合物具有约10小时的体内半衰期。
附图说明
本发明的新颖特征在随附权利要求中具体阐述。将通过参考阐述了利用本发明原理的说明性实施方案的以下具体实施方式和附图获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在所述附图中：
图1A示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用24μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中外周CD8+Teff计数的变化。在此处和其他地方，诸如“C1D1”的名称指示治疗周期和天(例如，治疗周期1，第1天)。“前(PRE)”指示施用前的基线测量值；24HR指示施用后24小时；等等。
图1B示出了在施用第一剂量的24μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物后的外周CD8+Teff细胞扩增峰值。将数据相对治疗前(C1D1)CD8+T细胞计数归一化。
图1C示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用24μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中的外周CD8+Teff细胞计数。
图2示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用24μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中表达Ki67的CD8+Teff细胞的百分比。
图3A示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用24μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中外周自然杀伤(NK)细胞计数的变化。
图3B示出了在施用第一剂量的24μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物后的外周NK细胞扩增峰值。将数据相对治疗前(C1D1)NK细胞计数归一化。
图3C示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用24μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中外周自然杀伤(NK)细胞计数的变化。
图3D示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用24μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中外周自然杀伤(NK)细胞计数。
图4示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用24μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中表达Ki67的NK细胞的百分比。
图5A示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用24μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中外周CD4+Treg计数的变化。
图5B示出了在施用第一剂量的24μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物后的外周CD4+Treg细胞扩增峰值。将数据相对治疗前(C1D1)CD4+T细胞计数归一化。
图5C示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用24μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中的外周CD4+Treg细胞计数。
图6示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用24μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中表达Ki67的CD4+Treg细胞的百分比。
图7A示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用24μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中嗜酸性粒细胞计数的变化。
图7B示出了在施用第一剂量的24μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物后的外周嗜酸性粒细胞扩增峰值。将数据相对治疗前(C1D1)嗜酸性粒细胞计数归一化。
图7C示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用24μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中的嗜酸性粒细胞计数。
图8A示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用24μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中IFN-γ、IL-5和IL-6的血清水平。
图8B示出了在施用24μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物后IL-5的血清水平。BLQ＝定量下限。将数据绘制为平均值(范围为BLQ至最大值)。
图8C示出了在施用24μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物后IL-6的血清水平。BLQ＝定量下限。将数据绘制为平均值(范围为BLQ至最大值)。
图9A示出了在食蟹猴中施用30μg/kg、100μg/kg、300μg/kg和1000μg/kg的IL-2缀合物后的CD8+Teff细胞扩增。
图9B示出了在施用30μg/kg、100μg/kg、300μg/kg和1000μg/kg的IL-2缀合物后的外周CD4+Treg细胞的最小扩增。
图9C示出了在施用300μg/kg的IL-2缀合物后嗜酸性粒细胞、白细胞和淋巴细胞的细胞计数。
图10A示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用32μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中外周CD8+Teff计数的变化。
图10B示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用32μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中的外周CD8+Teff细胞计数。
图11A示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用32μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中外周自然杀伤(NK)细胞计数的变化。
图11B示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用32μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中的外周自然杀伤(NK)细胞计数。
图12A示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用32μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中外周CD4+Treg计数的变化。
图12B示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用32μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中的外周CD4+Treg细胞计数。
图13A示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用32μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中嗜酸性粒细胞计数的变化。
图13B示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用32μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中的嗜酸性粒细胞计数。
图14A示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用32μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中CD8+记忆细胞计数的变化。
图14B示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用32μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中的CD8+记忆细胞计数。
图15示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用24μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中IFN-γ、IL-5和IL-6的血清水平。
图16A示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用24μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中CD8+记忆细胞计数的变化。
图16B示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用24μg/kg[Q3W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中的CD8+记忆细胞计数。
图17示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用8μg/kg[Q2W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中外周CD8+Teff细胞计数的变化。
图18示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用8μg/kg[Q2W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中外周NK细胞计数的变化。
图19示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用8μg/kg[Q2W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中外周CD4+Treg细胞计数的变化。
图20示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用8μg/kg[Q2W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中外周淋巴细胞计数的变化。
图21示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用8μg/kg[Q2W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中外周嗜酸性粒细胞计数的变化。
图22A和图22B示出了在施用后指定时间，分别在1和2个周期后，以8μg/kg[Q2W]向所指示的受试者施用的IL-2缀合物的平均浓度。
图23示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用8μg/kg[Q2W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中的IFN-γ、IL-6和IL-5的水平。
图24示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用16μg/kg[Q2W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中外周CD8+Teff细胞计数的变化。
图25示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用16μg/kg[Q2W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中外周NK细胞计数的变化。
图26示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用16μg/kg[Q2W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中外周CD4+Treg细胞计数的变化。
图27示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用16μg/kg[Q2W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中外周嗜酸性粒细胞计数的变化。
图28示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用16μg/kg[Q2W]的IL-2缀合物治疗的所指示受试者中的IFN-γ、IL-6和IL-5的水平。
图29A和图29B示出了在施用后指定时间，分别在1和2个周期后，以16μg/kg[Q2W]向所指示的受试者施用的IL-2缀合物的平均浓度。
图30示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用8μg/kg[Q3W]治疗的所指示受试者中所指示细胞因子的血清水平。
图31示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用16μg/kg[Q3W]治疗的所指示受试者中所指示细胞因子的血清水平。
图32A-图32D示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用8μg/kg[Q3W]或16μg/kg[Q3W]治疗的所指示受试者中的嗜酸性粒细胞计数，如通过细胞计量术或CBC(全血细胞计数)测量的。
图33A-图33D示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用8μg/kg[Q3W]或16μg/kg[Q3W]治疗的所指示受试者中的淋巴细胞计数，如通过细胞计量术或CBC测量的。
图34A-图34D示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用8μg/kg[Q3W]或16μg/kg[Q3W]治疗的所指示受试者中的外周CD8+Teff计数。
图35A-图35B示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用8μg/kg[Q3W]或16μg/kg[Q3W]治疗的所指示受试者中表达Ki67的CD8+Teff细胞的百分比。
图36A-图36B示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用8μg/kg[Q3W]或16μg/kg[Q3W]治疗的所指示受试者中的外周记忆CD8+计数。
图37A-图37D示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用8μg/kg[Q3W]或16μg/kg[Q3W]治疗的所指示受试者中的外周自然杀伤(NK)细胞计数。
图38A-图38B示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用8μg/kg[Q3W]或16μg/kg[Q3W]治疗的所指示受试者中表达Ki67的NK细胞的百分比。
图39A-图39B示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用8μg/kg[Q3W]或16μg/kg[Q3W]治疗的所指示受试者中的外周CD4+Treg计数。
图40A-图40B示出了在施用IL-2缀合物后指定时间用8μg/kg[Q3W]或16μg/kg[Q3W]治疗的所指示受试者中表达Ki67的CD4+Treg细胞的百分比。
图41A示出了用8-40μg/kg[Q3W]IL-2缀合物治疗的受试者中外周CD8+Teff细胞计数的变化。
图41B示出了用8-40μg/kg[Q3W]IL-2缀合物治疗的受试者中外周CD4+Treg细胞计数的变化。
图41C示出了用8-40μg/kg[Q3W]IL-2缀合物治疗的受试者中外周自然杀伤(NK)细胞计数的变化。
具体实施方式
定义
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与要求保护的主题所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。应理解，前述一般说明和以下详细说明只是示例性和解释性的，并且不限制要求保护的任何主题。在通过引用并入本文的任何材料与本公开文本的明确内容不一致的情况下，以明确内容为准。在本申请中，除非另外明确陈述，否则单数的使用包括复数含义。必须指出，如在说明书和所附权利要求中所用，除非上下文另外清楚地规定，否则单数形式“一个/一种(a、an)”和“所述(the)”包括复数指示物。在本申请中，除非上下文另有要求，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其他形式如“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(included)”的使用是非限制性的。
在说明书中对“一些实施方案”、“实施方案”、“一个实施方案”或“其他实施方案”的提及意指结合实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一些实施方案中，但不必包括在本发明的所有实施方案中。
如本文所用，范围和量可以表示为“约”特定值或范围。约也包括确切的量。因此，“约5μL”意指“约5μL”并且还意指“5μL”。通常，术语“约”包括预期在实验误差内的量，例如像，在15％、10％或5％内。
本文所用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。
如本文所用，术语“一个或多个受试者”和“一个或多个患者”是指任何哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，哺乳动物是非人。所述术语均不要求或不限于以卫生保健工作者(例如医生、注册护士、执业护士、医师助理、护理员或临终关怀工作者)进行监督(例如持续或间断)为特征的情况。
如本文所用，术语“非天然氨基酸”是指除20种天然存在的氨基酸之一之外的氨基酸。示例性非天然氨基酸描述于Young等人,“Beyond the canonical 20amino acids:expanding the genetic lexicon,”J.of Biological Chemistry 285(15):11039-11044(2010)中，将其披露内容通过引用并入本文。
本文的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展现出所需的抗原结合活性即可。“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；和从抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用，“核苷酸”是指包含核苷部分和磷酸酯部分的化合物。示例性天然核苷酸包括但不限于腺苷三磷酸(ATP)、尿苷三磷酸(UTP)、胞苷三磷酸(CTP)、鸟苷三磷酸(GTP)、腺苷二磷酸(ADP)、尿苷二磷酸(UDP)、胞苷二磷酸(CDP)、鸟苷二磷酸(GDP)、腺苷一磷酸(AMP)、尿苷一磷酸(UMP)、胞苷一磷酸(CMP)和鸟苷一磷酸(GMP)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧腺苷二磷酸(dADP)、胸苷二磷酸(dTDP)、脱氧胞苷二磷酸(dCDP)、脱氧鸟苷二磷酸(dGDP)、脱氧腺苷一磷酸(dAMP)、脱氧胸苷一磷酸(dTMP)、脱氧胞苷一磷酸(dCMP)和脱氧鸟苷一磷酸(dGMP)。包含脱氧核糖作为糖部分的示例性天然脱氧核糖核苷酸包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dADP、dTDP、dCDP、dGDP、dAMP、dTMP、dCMP和dGMP。包含核糖作为糖部分的示例性天然核糖核苷酸包括ATP、UTP、CTP、GTP、ADP、UDP、CDP、GDP、AMP、UMP、CMP和GMP。
如本文所用，“碱基”或“核碱基”是指核苷或核苷酸(核苷和核苷酸涵盖核糖或脱氧核糖变体)的至少核碱基部分，所述核苷或核苷酸在一些情形中可以含有对核苷或核苷酸的糖部分的进一步修饰。在一些情形中，“碱基”也用于代表整个核苷或核苷酸(例如，“碱基”可以通过DNA聚合酶掺入DNA中，或通过RNA聚合酶掺入RNA中)。然而，除非上下文要求，否则术语“碱基”不应解释为必然代表整个核苷或核苷酸。在本文提供的碱基或核碱基化学结构中，仅示出核苷或核苷酸的碱基，为清楚起见省略了糖部分和任选的任何磷酸酯残基。如本文提供的碱基或核碱基化学结构中使用的，波浪线代表与核苷或核苷酸的连接，其中核苷或核苷酸的糖部分可以被进一步修饰。在一些实施方案中，波浪线代表碱基或核碱基与核苷或核苷酸的糖部分(如戊糖)的附接。在一些实施方案中，戊糖是核糖或脱氧核糖。
在一些实施方案中，核碱基通常是核苷的杂环碱基部分。核碱基可以是天然存在的，可以是经修饰的，可以与天然碱基没有相似性，和/或可以是合成的，例如通过有机合成而合成。在某些实施方案中，核碱基包含核苷或核苷酸中的任何原子或原子组，其中所述原子或原子组能够在使用或不使用氢键的情况下与另一核酸的碱基相互作用。在某些实施方案中，非天然核碱基不是衍生自天然核碱基。应注意，非天然核碱基不一定具有碱基特性，但是为了简单起见，它们称为核碱基。在一些实施方案中，当提及核碱基时，“(d)”指示核碱基可以附接至脱氧核糖或核糖，而没有括号的“d”指示核碱基附接至脱氧核糖。
如本文所用，“核苷”是包含核碱基部分和糖部分的化合物。核苷包括但不限于天然存在的核苷(如在DNA和RNA中发现的)、脱碱基核苷、经修饰的核苷和具有模拟碱基和/或糖基团的核苷。核苷包括包含任何种类的取代基的核苷。核苷可以是通过核酸碱基与糖的还原基团之间的糖苷连接形成的糖苷化合物。
如本文所用的术语化学结构的“类似物”是指与母体结构保持基本相似性但它可能不容易从母体结构合成得到的化学结构。在一些实施方案中，核苷酸类似物是非天然核苷酸。在一些实施方案中，核苷类似物是非天然核苷。容易从母体化学结构合成得到的相关化学结构称为“衍生物”。
如本文所用，“剂量限制性毒性”(DLT)被定义为在治疗周期的第1天至第29天(含)±1天内发生的不良事件，其不明确地或无可争议地仅与外来原因相关并且满足实施例2中针对DLT所述的标准。
如本文所用，“重度细胞因子释放综合征”是指Teachey等人,CancerDiscov.2016；6(6)；664-79中所述的4级或5级细胞因子释放综合征，将其披露内容通过引用并入本文。
尽管本发明的各种特征可以在单一实施方案的上下文中描述，但所述特征也可以分开地提供或以任何合适的组合提供。相反，尽管为了清楚起见，本文可以在分开的实施方案的背景下描述本发明，但是本发明也可以在单一实施方案中实现。
IL-2缀合物
白介素2(IL-2)是一种多效性1型细胞因子，其结构包含15.5kDa的四α-螺旋束。IL-2的前体形式的长度为153个氨基酸残基，其中前20个氨基酸形成信号肽，并且残基21-153形成成熟形式。IL-2主要由CD4+T细胞在抗原刺激后产生，以及由CD8+细胞、自然杀伤(NK)细胞、和自然杀伤T(NKT)细胞、激活的树突细胞(DC)和肥大细胞以较低程度产生。IL-2信号传导通过与IL-2受体(IL-2R)亚基、IL-2Rα(也称为CD25)、IL-2Rβ(也称为CD122)和IL-2Rγ(也称为CD132)的特定组合的相互作用来进行。IL-2与IL-2Rα的相互作用以约10-8M的Kd形成“低亲和力”IL-2受体复合物。IL-2与IL-2Rβ和IL-2Rγ的相互作用以约10-9M的Kd形成“中亲和力”IL-2受体复合物。IL-2与所有三种亚基IL-2Rα、IL-2Rβ和IL-2Rγ的相互作用以约>10-11M的Kd形成“高亲和力”IL-2受体复合物。
在一些情况下，经由“高亲和力”IL-2Rαβγ复合物的IL-2信号传导会调节调节性T细胞的激活和增殖。调节性T细胞或CD4+CD25+Foxp3+调节性T(Treg)细胞通过抑制效应细胞(如CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞和NKT细胞)来介导免疫稳态的维持。在一些情况下，Treg细胞是从胸腺生成(tTreg细胞)，或者是从外周的幼稚T细胞诱导(pTreg细胞)。在一些情形中，将Treg细胞视为外周耐受的介体。实际上，在一项研究中，CD25耗尽的外周CD4+T细胞的转移在裸鼠中产生多种自身免疫性疾病，而CD4+CD25+T细胞的共转移抑制自身免疫的发展(Sakaguchi等人,“Immunologic self-tolerance maintained by activated Tcells expressing IL-2receptor alpha-chains(CD25),”J.Immunol.155(3):1151-1164(1995)，将其披露内容通过引用并入本文)。Treg细胞群的增大下调效应T细胞增殖并抑制自身免疫和T细胞抗肿瘤应答。
经由“中亲和力”IL-2Rβγ复合物的IL-2信号传导调节CD8+效应T(Teff)细胞、NK细胞和NKT细胞的激活和增殖。CD8+Teff细胞(也称为细胞毒性T细胞、Tc细胞、细胞毒性T淋巴细胞、CTL、T杀伤细胞、细胞裂解性T细胞、Tcon或杀伤T细胞)是识别并且杀伤受损细胞、癌细胞和病原体感染的细胞的T淋巴细胞。NK和NKT细胞是与CD8+Teff细胞类似的淋巴细胞类型，其靶向癌细胞和病原体感染的细胞。
在一些情况下，IL-2信号传导用于调节T细胞反应，并且随后用于治疗癌症。例如，以高剂量形式施用IL-2以诱导用于治疗癌症的Teff细胞群体的扩增。然而，高剂量IL-2进一步导致对Treg细胞的伴随刺激，从而减弱抗肿瘤免疫反应。高剂量IL-2还诱导由脉管系统中的IL-2Rα链表达细胞(包括2型先天免疫细胞(ILC-2)、嗜酸性粒细胞和内皮细胞)的接合介导的毒性不良事件。这导致嗜酸性粒细胞增多症、毛细血管渗漏和血管渗漏综合征(VLS)。
本文描述了总体上涉及施用白介素2(IL-2)缀合物的施用的方法和用途。可以将IL-2缀合物按以下量施用：24μg/kg、32μg/kg或40μg/kg，或24μg/kg至32μg/kg、或24μg/kg至40μg/kg IL-2。此类量的IL-2的质量不包括与IL-2缀合的材料(包括接头)的质量。
可以将IL-2缀合物施用超过一次，例如两次、三次、四次、五次或更多次。在一些实施方案中，将IL-2缀合物约每两周施用一次。在一些实施方案中，将IL-2缀合物约每三周施用一次。在一些实施方案中，将IL-2缀合物约每14、15、16、17、18、19、20或21天施用一次。
在一些实施方案中，所述方法用于治疗癌症。在一些实施方案中，癌症是实体瘤癌症。在一些实施方案中，受试者患有转移性实体瘤。在一些实施方案中，受试者患有晚期实体瘤。
在一些实施方案中，所述方法用于刺激受试者中的CD8+细胞。在一些实施方案中，所述方法用于刺激受试者中的NK细胞。刺激可以包括例如施用后约4、5、6或7天，或施用后约1、2、3或4周，受试者中CD8+细胞数量的增加。在一些实施方案中，CD8+细胞包括记忆CD8+细胞。在一些实施方案中，CD8+细胞包括效应CD8+细胞。刺激可以包括例如施用后约4、5、6或7天，或施用后约1、2、3或4周，受试者中Ki67阳性的CD8+细胞比例的增加。刺激可以包括例如施用后约4、5、6或7天，或施用后约1、2、3或4周，受试者中NK细胞数量的增加。
在一些实施方案中，在施用后，CD8+细胞在受试者中扩增至少2倍(如至少5倍)。在一些实施方案中，在施用后，CD8+细胞在受试者中扩增至少5倍。在一些实施方案中，在施用后，NK细胞在受试者中扩增至少2倍(如至少7倍)。在一些实施方案中，在施用后，NK细胞在受试者中扩增至少7倍(如至少7.7倍)。在一些实施方案中，嗜酸性粒细胞扩增不多于约3.2倍(如不多于约2.7倍)。在一些实施方案中，CD4+细胞扩增不多于约3.2倍(如不多于约2倍或2.7倍)。在一些实施方案中，CD8+细胞和/或NK细胞的扩增多于CD4+细胞和/或嗜酸性粒细胞的扩增。在一些实施方案中，CD8+细胞的扩增多于CD4+细胞的扩增。在一些实施方案中，NK细胞的扩增多于CD4+细胞的扩增。在一些实施方案中，CD8+细胞的扩增多于嗜酸性粒细胞的扩增。在一些实施方案中，NK细胞的扩增多于嗜酸性粒细胞的扩增。相对于施用IL-2缀合物之前测量的基线值，确定扩增倍数。在一些实施方案中，确定在前述段落中阐述的施用后任意时间的扩增倍数。
在一些实施方案中，IL-2缀合物不引起剂量限制性毒性。在一些实施方案中，IL-2缀合物不引起重度细胞因子释放综合征。在一些实施方案中，IL-2缀合物不诱导抗药物抗体(ADA)，即抗IL-2缀合物的抗体。在一些实施方案中，ADA诱导的缺乏是通过抗PEG的抗体的直接免疫测定和/或抗IL-2缀合物的抗体的ELISA来测定。如果测得的ADA水平在统计学上与基线(治疗前)水平或与未治疗对照的水平无法区分，则认为IL-2缀合物不会诱导ADA。
IL-2缀合物
在一些实施方案中，所述IL-2序列包含SEQ ID NO:1的序列：PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCL EEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLN RWITFSQSIISTLT(SEQ ID NO:1)
其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
在本文所述的式(IA)的任何实施方案或变型中，IL-2缀合物是药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物是药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物是溶剂化物。在一些实施方案中，所述IL-2缀合物是水合物。
在式(IA)的一些实施方案中，Z是CH2并且Y是
在式(IA)的一些实施方案中，Y是CH2并且Z是在式(IA)的一些实施方案中，Z是CH2并且Y是在式(IA)的一些实施方案中，Y是CH2并且Z是
在式(IA)的一些实施方案中，q是1。在式(IA)的一些实施方案中，q是2。在式(IA)的一些实施方案中，q是3。
在式(IA)的一些实施方案中，W是具有约25kDa的平均分子量的PEG基团。在式(IA)的一些实施方案中，W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团。在式(IA)的一些实施方案中，W是具有约35kDa的平均分子量的PEG基团。
在一些实施方案中，所述IL-2序列包含SEQ ID NO:1的序列：PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCL EEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLN RWITFSQSIISTLT(SEQ ID NO:1)
其中位置P64处的氨基酸被式(I)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。在一些实施方案中，PEG基团具有约30kDa的平均分子量。
在一些实施方案中，IL-2缀合物包含序列SEQ ID NO:2：
PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELK[AzK_ L1_PEG30kD]LEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT(SEQ ID NO:2)
其中[AzK_L1_PEG30kD]是经由DBCO介导的点击化学与PEG稳定缀合的N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸，所述点击化学形成包含式(IVA)或式(VA)的结构的化合物，其中q是1(如式(IV)或式(V))，并且所述PEG具有约25-35千道尔顿(例如约30kDa)的平均分子量，被甲氧基封端。从点击反应生成的区域异构体的比率为约1:1或大于1:1。术语“DBCO”意指包含二苯并环辛炔基团的化学部分，如包括实施例1的方案1中说明的mPEG-DBCO化合物。
PEG典型地将包含许多(OCH2CH2)单体或(CH2CH2O)单体，取决于如何定义PEG。
在一些情况下，PEG是封端聚合物，即至少一个末端用相对惰性的基团(如低级C1-6烷氧基或羟基)封端的聚合物。在聚合物是PEG时，例如，可以使用甲氧基-PEG(通常称为mPEG)，其是PEG的线性形式，其中聚合物的一个末端是甲氧基(—OCH3)基团，而另一个末端是羟基或可以被任选地化学修饰的其他官能团。
在一些实施方案中，构成本文公开的IL-2缀合物的PEG基团是线性或分支PEG基团。在一些实施方案中，PEG基团是线性PEG基团。在一些实施方案中，PEG基团是分支PEG基团。在一些实施方案中，PEG基团是甲氧基PEG基团。在一些实施方案中，PEG基团是线性或分支甲氧基PEG基团。在一些实施方案中，PEG基团是线性甲氧基PEG基团。在一些实施方案中，PEG基团是分支甲氧基PEG基团。例如，本公开文本的范围内包括包含分子量为30,000Da±3000Da、或30,000Da±4,500Da、或30,000Da±5,000Da的PEG基团的IL-2缀合物。
在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中氨基酸残基P64被式(IVA)或式(VA)的结构、或式(IVA)和式(VA)的混合物替代：
其中：
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；并且
X具有以下结构：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
在式(IVA)或式(VA)、或式(IVA)或式(VA)的混合物的一些实施方案中，q是1。在式(IVA)或式(VA)、或式(IVA)或式(VA)的混合物的一些实施方案中，q是2。在式(IVA)或式(VA)、或式(IVA)或式(VA)的混合物的一些实施方案中，q是3。
在式(IVA)或式(VA)、或式(IVA)或式(VA)的混合物的一些实施方案中，W是具有约25kDa的平均分子量的PEG基团。在式(IVA)或式(VA)、或式(IVA)或式(VA)的混合物的一些实施方案中，W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团。在式(IVA)或式(VA)、或式(IVA)或式(VA)的混合物的一些实施方案中，W是具有约35kDa的平均分子量的PEG基团。
在本文所述的任何实施方案中，式(IA)的结构具有式(IVA)或式(VA)的结构或是式(IVA)和式(VA)的混合物。在一些实施方案中，式(IA)的结构具有式(IVA)的结构。在一些实施方案中，式(IA)的结构具有式(VA)的结构。在一些实施方案中，式(IA)的结构是式(IVA)和式(VA)的混合物。
在一些实施方案中，IL-2缀合物包含氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:1的氨基酸序列)，其中氨基酸残基P64被式(IV)或式(V)的结构、或式(IV)和式(V)的混合物替代：
其中：
W是具有约25kDa-35kDa(如约30kDa)的平均分子量的PEG基团；并且X具有以下结构：
其中X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。在本文所述的任何实施方案中，其中IL-2缀合物包含式(IA)的结构，式(IA)可以是式(IV)或(V)、或(IV)和(V)的混合物。
在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中氨基酸残基P64被式(XIIA)或式(XIIIA)的结构、或式(XIIA)和式(XIIIA)的混合物替代：
其中：
n是整数，使得-(OCH2CH2)n-OCH3具有约25kDa-35kDa的分子量；
q是1、2或3；并且
波浪线指示与SEQ ID NO:1中未被替代的氨基酸残基的共价键。
在式(XIIA)或式(XIIIA)、或式(XIIA)和式(XIIIA)的混合物的一些实施方案中，q是1。在式(XIIA)或式(XIIIA)、或式(XIIA)和式(XIIIA)的混合物的一些实施方案中，q是2。在式(XIIA)或式(XIIIA)、或式(XIIA)和式(XIIIA)的混合物的一些实施方案中，q是3。
在式(XIIA)或式(XIIIA)、或式(XIIA)和式(XIIIA)的混合物的一些实施方案中，n是整数，使得-(OCH2CH2)n-OCH3具有约30kDa的分子量。
在本文所述的任何实施方案中，式(IA)的结构具有式(XIIA)或式(XIIIA)的结构或是式(XIIA)和式(XIIIA)的混合物。在一些实施方案中，式(IA)的结构具有式(XIIA)的结构。在一些实施方案中，式(IA)的结构具有式(XIIIA)的结构。在一些实施方案中，式(IA)的结构是式(XIIA)和式(XIIIA)的混合物。
在一些实施方案中，IL-2缀合物中SEQ ID NO:1的氨基酸残基P64被式(XII)或(XIII)的结构、或(XII)和(XIII)的混合物替代：
其中：
n是整数，使得-(OCH2CH2)n-OCH3具有约25kDa-35kDa(例如，约30kDa)的分子量；并且
波浪线指示与SEQ ID NO:1中未被替代的氨基酸残基的共价键。
在式(XII)或式(XIII)、或式(XII)和式(XIII)的混合物的一些实施方案中，n是整数，使得-(OCH2CH2)n-OCH3具有约30kDa的分子量。
在本文所述的任何实施方案中，式(IA)的结构具有式(XII)或式(XIII)的结构或是式(XII)和式(XIII)的混合物。在一些实施方案中，式(IA)的结构具有式(XII)的结构。在一些实施方案中，式(IA)的结构具有式(XIII)的结构。在一些实施方案中，式(IA)的结构是式(XII)和式(XIII)的混合物。
在一些实施方案中，IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中所述IL-2缀合物中的氨基酸残基P64被式(XIV)或(XV)的结构、或(XIV)和(XV)的混合物替代：
其中：
m是0至20的整数(例如，1至3，或2)；
p是0至20的整数(例如，1至3，或2)；
n是整数，使得PEG基团具有约25kDa-35kDa(例如，约30kDa)的平均分子量；并且
波浪线指示与SEQ ID NO:1中未被替代的氨基酸残基的共价键。在本文所述的任何实施方案中，其中IL-2缀合物包含式(I)的结构，式(I)可以是式(XIV)或(XV)、或(XIV)和(XV)的混合物。
在式(XIV)或(XV)、或(XIV)和(XV)的混合物的一些实施方案中，m是1至10的整数。在一些实施方案中，m是1。在一些实施方案中，m是2。在一些实施方案中，m是3。在一些实施方案中，m是4。在一些实施方案中，m是5。在一些实施方案中，m是6。在一些实施方案中，m是7。在一些实施方案中，m是8。在一些实施方案中，m是9。在一些实施方案中，m是10。在式(XIV)或(XV)、或(XIV)和(XV)的混合物的一些实施方案中，m是1至5的整数。在式(XIV)或(XV)、或(XIV)和(XV)的混合物的一些实施方案中，m是11至20的整数。在一些实施方案中，m是从11至15的整数。在一些实施方案中，m是从16至20的整数。在一些实施方案中，m是0。
在式(XIV)或(XV)、或(XIV)和(XV)的混合物的一些实施方案中，n是整数，使得PEG基团具有约25kDa的平均分子量。在式(XIV)或(XV)、或(XIV)和(XV)的混合物的一些实施方案中，n是整数，使得PEG基团具有约30kDa的平均分子量。在式(XIV)或(XV)、或(XIV)和(XV)的混合物的一些实施方案中，n是整数，使得PEG基团具有约35kDa的平均分子量。
在式(XIV)或(XV)、或(XIV)和(XV)的混合物的一些实施方案中，p是1至10的整数。在一些实施方案中，p是1。在一些实施方案中，p是2。在一些实施方案中，p是3。在一些实施方案中，p是4。在一些实施方案中，p是5。在一些实施方案中，p是6。在一些实施方案中，p是7。在一些实施方案中，p是8。在一些实施方案中，p是9。在一些实施方案中，p是10。在式(XIV)或(XV)、或(XIV)和(XV)的混合物的一些实施方案中，p是1至5的整数。在式(XIV)或(XV)、或(XIV)和(XV)的混合物的一些实施方案中，p是11至20的整数。在一些实施方案中，p是从11至15的整数。在一些实施方案中，p是从16至20的整数。在一些实施方案中，p是0。
在一些实施方案中，IL-2缀合物包含氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:1)，其中所述IL-2缀合物中的至少一个氨基酸残基被式(XVI)或(XVII)的结构、或(XVI)和(XVII)的混合物替代：
其中：
m是0至20的整数(例如，1至3，或2)；
n是整数，使得PEG基团具有约25kDa-35kDa(例如，约30kDa)的平均分子量；并且
波浪线指示与SEQ ID NO:1中未被替代的氨基酸残基的共价键。
在式(XVI)或式(XVII)、或式(XVI)和式(XVII)的混合物的一些实施方案中，n是整数，使得PEG基团具有约25kDa的平均分子量。在式(XVI)或式(XVII)、或式(XVI)和式(XVII)的混合物的一些实施方案中，n是整数，使得PEG基团具有约30kDa的平均分子量。在式(XVI)或式(XVII)、或式(XVI)和式(XVII)的混合物的一些实施方案中，n是整数，使得PEG基团具有约35kDa的平均分子量。
在式(XVI)或(XVII)、或(XVI)和(XVII)的混合物的一些实施方案中，m是1至10的整数。在一些实施方案中，m是1。在一些实施方案中，m是2。在一些实施方案中，m是3。在一些实施方案中，m是4。在一些实施方案中，m是5。在一些实施方案中，m是6。在一些实施方案中，m是7。在一些实施方案中，m是8。在一些实施方案中，m是9。在一些实施方案中，m是10。在式(XVI)或(XVII)、或(XVI)和(XVII)的混合物的一些实施方案中，m是1至5的整数。在式(XVI)或(XVII)、或(XVI)和(XVII)的混合物的一些实施方案中，m是11至20的整数。在一些实施方案中，m是从11至15的整数。在一些实施方案中，m是从16至20的整数。在一些实施方案中，m是0。
在本文所述的任何实施方案中，式(IA)的结构具有式(XVI)或式(XVII)的结构或是式(XVI)和式(XVII)的混合物。在一些实施方案中，式(IA)的结构具有式(XVI)的结构。在一些实施方案中，式(IA)的结构具有式(XVII)的结构。在一些实施方案中，式(IA)的结构是式(XVI)和式(XVII)的混合物。
在式(IA)或其任何变体的一些实施方案中，IL-2缀合物具有约10小时的体内半衰期。
缀合化学
在本文所述的一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括方案I中示出的反应。
方案I.
其中X是SEQ ID NO:1的位置P64处的非天然氨基酸。在此处和其他地方，“位置X-1”和“位置X+1”是指紧邻这样的氨基酸残基的N末端和C末端的氨基酸残基：(i)材料将要与其缀合或已经缀合和/或(ii)其是非天然氨基酸。缀合部分包含如本文所述的PEG。
在一些实施方案中，反应基团包括炔烃或叠氮化物。在本文所述的一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括方案II中示出的反应。
方案II.
其中X是如上所述的。
在本文所述的一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括方案III中示出的反应。
方案III.
其中X是如上所述的。
在本文所述的一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括方案IV中示出的反应。
方案IV.
其中X是如上所述的。
在本文所述的一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括叠氮化物部分(如含于含有衍生自N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸(AzK)的氨基酸残基的蛋白质中的叠氮化物部分)与应变环炔(如衍生自DBCO的应变环炔，DBCO是包含二苯并环辛炔基团的化学部分)之间的环加成反应。包含DBCO部分的PEG基团可商购获得或者可以通过本领域普通技术人员已知的方法来制备。在一些实施方案中，本文所述的缀合反应包括方案V和VI中示出的反应。
方案V.
方案VI.
本文所述的缀合反应(如点击反应)可以生成单一区域异构体或区域异构体的混合物。在一些情况下，区域异构体的比率为约1:1。在一些情况下，区域异构体的比率为约2:1。在一些情况下，区域异构体的比率为约1.5:1。在一些情况下，区域异构体的比率为约1.2:1。在一些情况下，区域异构体的比率为约1.1:1。在一些情况下，区域异构体的比率大于1:1。
细胞因子多肽产生
在一些情况下，重组产生或化学合成本文所述的IL-2缀合物，其含有天然氨基酸突变或非天然氨基酸突变。在一些情况下，例如通过宿主细胞系统或在无细胞系统中重组产生本文所述的IL-2缀合物。
在一些情况下，通过宿主细胞系统重组产生IL-2缀合物。在一些情形中，宿主细胞是真核细胞(例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或植物细胞)或原核细胞(例如，革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌)。在一些情形中，真核宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。在一些情形中，哺乳动物宿主细胞是稳定的细胞系，或者是将目的遗传物质掺入其自身基因组中并且具有在多代细胞分裂后表达所述遗传物质的产物的能力的细胞系。在其他情况下，哺乳动物宿主细胞是瞬时细胞系，或者是未将目的遗传物质掺入其自身基因组中并且不具有在多代细胞分裂后表达所述遗传物质的产物的能力的细胞系。
示例性哺乳动物宿主细胞包括293T细胞系、293A细胞系、293FT细胞系、293F细胞、293H细胞、A549细胞、MDCK细胞、CHO DG44细胞、CHO-S细胞、CHO-K1细胞、Expi293FTM细胞、Flp-InTMT-RExTM293细胞系、Flp-InTM-293细胞系、Flp-InTM-3T3细胞系、Flp-InTM-BHK细胞系、Flp-InTM-CHO细胞系、Flp-InTM-CV-1细胞系、Flp-InTM-Jurkat细胞系、FreeStyleTM293-F细胞、FreeStyleTMCHO-S细胞、GripTiteTM293MSR细胞系、GS-CHO细胞系、HepaRGTM细胞、T-RExTMJurkat细胞系、Per.C6细胞、T-RExTM-293细胞系、T-RExTM-CHO细胞系和T-RExTM-HeLa细胞系。
在一些实施方案中，真核宿主细胞是昆虫宿主细胞。示例性昆虫宿主细胞包括果蝇(Drosophila)S2细胞、Sf9细胞、Sf21细胞、High FiveTM细胞和细胞。
在一些实施方案中，真核宿主细胞是酵母宿主细胞。示例性酵母宿主细胞包括巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)酵母菌株(如GS115、KM71H、SMD1168、SMD1168H和X-33)，以及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)酵母菌株(如INVSc1)。
在一些实施方案中，真核宿主细胞是植物宿主细胞。在一些情况下，植物细胞包括来自藻类的细胞。示例性植物细胞系包括来自莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)137c或细长聚球藻(Synechococcus elongatus)PPC 7942的株系。
在一些实施方案中，宿主细胞是原核宿主细胞。示例性原核宿主细胞包括BL21、Mach1TM、DH10BTM、TOP10、DH5α、DH10BacTM、OmniMaxTM、MegaXTM、DH12STM、INV110、TOP10F’、INVαF、TOP10/P3、ccdB Survival、PIR1、PIR2、Stbl2TM、Stbl3TM或Stbl4TM。
在一些情况下，用于产生本文所述的IL-2多肽的合适的多核酸分子或载体包括衍生自真核或原核来源的任何合适的载体。示例性多核酸分子或载体包括来自细菌(例如大肠杆菌(E.coli))、昆虫、酵母(例如巴斯德毕赤酵母)、藻类或哺乳动物来源的载体。细菌载体包括例如pACYC177、pASK75、pBAD载体系列、pBADM载体系列、pET载体系列、pETM载体系列、pGEX载体系列、pHAT、pHAT2、pMal-c2、pMal-p2、pQE载体系列、pRSET A、pRSET B、pRSETC、pTrcHis2系列、pZA31-Luc、pZE21-MCS-1、pFLAG ATS、pFLAG CTS、pFLAG MAC、pFLAGShift-12c、pTAC-MAT-1、pFLAG CTC或pTAC-MAT-2。
昆虫载体包括例如pFastBac1、pFastBac DUAL、pFastBac ET、pFastBac HTa、pFastBac HTb、pFastBac HTc、pFastBac M30a、pFastBact M30b、pFastBac、M30c、pVL1392、pVL1393、pVL1393 M10、pVL1393 M11、pVL1393 M12、FLAG载体(如pPolh-FLAG1或pPolh-MAT2)或MAT载体(如pPolh-MAT1或pPolh-MAT2)。
酵母载体包括例如pDESTTM14载体，pDESTTM15载体，pDESTTM17载体，pDESTTM24载体，pYES-DEST52载体，pBAD-DEST49目的载体，pAO815毕赤酵母属载体，pFLD1巴斯德毕赤酵母载体，pGAPZA、B和C巴斯德毕赤酵母载体，pPIC3.5K毕赤酵母属载体，pPIC6 A、B和C毕赤酵母属载体，pPIC9K毕赤酵母属载体，pTEF1/Zeo，pYES2酵母载体，pYES2/CT酵母载体，pYES2/NT A、B和C酵母载体或pYES3/CT酵母载体。
藻类载体包括例如pChlamy-4载体或MCS载体。
哺乳动物载体包括例如瞬时表达载体或稳定表达载体。示例性哺乳动物瞬时表达载体包括p3xFLAG-CMV 8、pFLAG-Myc-CMV 19、pFLAG-Myc-CMV 23、pFLAG-CMV 2、pFLAG-CMV6a,b,c、pFLAG-CMV 5.1、pFLAG-CMV 5a,b,c、p3xFLAG-CMV 7.1、pFLAG-CMV 20、p3xFLAG-Myc-CMV 24、pCMV-FLAG-MAT1、pCMV-FLAG-MAT2、pBICEP-CMV 3或pBICEP-CMV 4。示例性哺乳动物稳定表达载体包括pFLAG-CMV 3、p3xFLAG-CMV 9、p3xFLAG-CMV 13、pFLAG-Myc-CMV21、p3xFLAG-Myc-CMV 25、pFLAG-CMV 4、p3xFLAG-CMV 10、p3xFLAG-CMV 14、pFLAG-Myc-CMV22、p3xFLAG-Myc-CMV 26、pBICEP-CMV 1或pBICEP-CMV 2。
在一些情况下，使用无细胞系统产生本文所述的细胞因子(例如，IL-2)多肽。在一些情形中，无细胞系统包含来自细胞的胞质和/或核组分的混合物，并且适合于体外核酸合成。在一些情况下，无细胞系统利用原核细胞组分。在其他情况下，无细胞系统利用真核细胞组分。核酸合成是在基于例如果蝇细胞、爪蟾属(Xenopus)卵、古细菌或HeLa细胞的无细胞系统中获得的。示例性无细胞系统包括大肠杆菌S30提取系统、大肠杆菌T7 S30系统或XpressCF和XpressCF+。
无细胞翻译系统不同地包含组分，如质粒、mRNA、DNA、tRNA、合成酶、释放因子、核糖体、伴侣蛋白、翻译起始和延伸因子、天然和/或非天然氨基酸和/或用于蛋白质表达的其他组分。任选地修饰此类组分以提高产量、增加合成速率、增加蛋白质产物保真度或掺入非天然氨基酸。在一些实施方案中，本文所述的细胞因子是使用US 8,778,631；US 2017/0283469；US 2018/0051065；US 2014/0315245；或US 8,778,631中描述的无细胞翻译系统合成的，将其中每一项的披露内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，无细胞翻译系统包含经修饰的释放因子，或者甚至从所述系统去除一种或多种释放因子。在一些实施方案中，无细胞翻译系统包含降低的蛋白酶浓度。在一些实施方案中，无细胞翻译系统包含具有重新分配的密码子的经修饰的tRNA，所述密码子用于编码非天然氨基酸。在一些实施方案中，在无细胞翻译系统中使用本文所述的合成酶用于掺入非天然氨基酸。在一些实施方案中，在将tRNA添加到无细胞翻译系统之前，使用酶促或化学方法用非天然氨基酸对所述tRNA进行预加载。在一些实施方案中，用于无细胞翻译系统的组分是从经修饰的生物体(如经修饰的细菌、酵母或其他生物体)获得。
在一些实施方案中，经由表达宿主系统或通过无细胞系统以环状变换的形式产生细胞因子(例如，IL-2)多肽。
包含非天然氨基酸的细胞因子多肽的产生
可以在本公开文本中使用正交或扩增的遗传密码，其中将存在于细胞因子(例如，IL-2)多肽的核酸序列中的一个或多个特定密码子分配以编码非天然氨基酸，使得可以通过使用正交tRNA合成酶/tRNA对将其遗传掺入细胞因子(例如，IL-2)中。正交tRNA合成酶/tRNA对能够将非天然氨基酸装载在tRNA，并且能够响应于所述密码子将所述非天然氨基酸掺入多肽链中。
在一些情况下，密码子是密码子琥珀、赭石、蛋白石或四联体密码子。在一些情形中，密码子对应于将用于携带非天然氨基酸的正交tRNA。在一些情形中，密码子是琥珀。在其他情形中，密码子是正交密码子。
在一些情况下，密码子是四联体密码子，其可以由正交核糖体ribo-Q1解码。在一些情形中，四联体密码子如以下中所述：Neumann等人,“Encoding multiple unnaturalamino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome,”Nature,464(7287):441-444(2010)，将其披露内容通过引用并入本文。
在一些情况下，本公开文本中使用的密码子是重编码的密码子，例如，被可替代密码子替代的同义密码子或稀有密码子。在一些情形中，重编码的密码子如Napolitano等人,“Emergent rules for codon choice elucidated by editing rare arginine codonsin Escherichia coli,”PNAS,113(38):E5588-5597(2016)中所述。在一些情形中，重编码的密码子如Ostrov等人,“Design,synthesis,and testing toward a 57-codon genome,”Science353(6301):819-822(2016)中所述。将本段中列出的每个参考文献的披露内容通过引用并入本文。
在一些情况下，利用非天然核酸，导致一种或多种非天然氨基酸掺入细胞因子(例如，IL-2)中。示例性非天然核酸包括但不限于尿嘧啶-5-基，次黄嘌呤-9-基(I)，2-氨基腺嘌呤-9-基，5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基衍生物和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基衍生物和其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮基尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代(特别是5-溴)、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤，以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。某些非天然核酸，如5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2取代的嘌呤，N-6取代的嘌呤，O-6取代的嘌呤，2-氨基丙基腺嘌呤，5-丙炔基尿嘧啶，5-丙炔基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，增加双链体形成稳定性的那些分子，通用核酸，疏水性核酸，混杂核酸，尺寸扩大的核酸，氟化核酸，5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和0-6取代的嘌呤包括2-氨基丙基腺嘌呤，5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基、其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶，5-卤代胞嘧啶，5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶，5-丙炔基胞嘧啶，嘧啶核酸的其他炔基衍生物，6-偶氮基尿嘧啶，6-偶氮基胞嘧啶，6-偶氮基胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代(特别是5-溴)、5-三氟甲基、其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤，7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基-腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤，8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤，7-脱氮腺嘌呤，3-脱氮鸟嘌呤，3-脱氮腺嘌呤，三环嘧啶，吩噁嗪胞苷([5,4-b][l,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)，吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][l,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G-夹，吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][l,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)，咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)，吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3’,2’:4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)，其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环替代的那些，7-脱氮-腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤，2-氨基吡啶，2-吡啶酮，氮杂胞嘧啶，5-溴胞嘧啶，溴尿嘧啶，5-氯胞嘧啶，氯代胞嘧啶，环胞嘧啶，阿糖胞苷，5-氟胞嘧啶，氟嘧啶，氟尿嘧啶，5,6-二氢胞嘧啶，5-碘胞嘧啶，羟基脲，碘尿嘧啶，5-硝基胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-氟尿嘧啶和5-碘尿嘧啶，2-氨基-腺嘌呤，6-硫代-鸟嘌呤，2-硫代-胸腺嘧啶，4-硫代-胸腺嘧啶，5-丙炔基-尿嘧啶，4-硫代-尿嘧啶，N4-乙基胞嘧啶，7-脱氮鸟嘌呤，7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤，5-羟基胞嘧啶，2’-脱氧尿苷，2-氨基-2’-脱氧腺苷，以及描述于以下文献中的那些：美国专利号3,687,808；4,845,205；4,910,300；4,948,882；5,093,232；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,681,941；5,750,692；5,763,588；5,830,653和6,005,096；WO 99/62923；Kandimalla等人,(2001)Bioorg.Med.Chem.9:807-813；The Concise Encyclopediaof Polymer Science and Engineering,Kroschwitz,J.I.编辑,John Wiley&Sons,1990,858-859；Englisch等人,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613；和Sanghvi,第15章,Antisense Research and Applications,Crooke和Lebleu编辑,CRCPress,1993,273-288。另外的碱基修饰可以在例如以下文献中找到：美国专利号3,687,808；Englisch等人,Angewandte Chemie,国际版,1991,30,613；和Sanghvi,第15章,Antisense Research and Applications,第289-302页,Crooke和Lebleu编辑,CRC Press,1993。将本段中列出的每个参考文献的披露内容通过引用并入本文。
包含各种杂环碱基和各种糖部分(和糖类似物)的非天然核酸是本领域可获得的，并且在一些情形中，核酸包括除了天然存在的核酸的五种主要碱基组分以外的一种或几种杂环碱基。例如，在一些情形中，杂环碱基包括尿嘧啶-5-基、胞嘧啶-5-基、腺嘌呤-7-基、腺嘌呤-8-基、鸟嘌呤-7-基、鸟嘌呤-8-基、4-氨基吡咯并[2.3-d]嘧啶-5-基、2-氨基-4-氧代吡咯并[2,3-d]嘧啶5-基、2-氨基-4-氧代吡咯并[2.3-d]嘧啶-3-基，其中嘌呤经由9-位置、嘧啶经由1-位置、吡咯并嘧啶经由7-位置且吡唑并嘧啶经由1-位置附接至核酸的糖部分。
在一些实施方案中，核苷酸类似物还在磷酸酯部分被修饰。经修饰的磷酸酯部分包括但不限于在两个核苷酸之间的连接处被修饰的那些，并且含有例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3’-亚烷基膦酸酯)和手性膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯)、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯和硼烷磷酸酯。应理解，两个核苷酸之间的这些磷酸酯或经修饰的磷酸酯连接是通过3’-5’连接或2’-5’连接，并且所述连接含有相反的极性，如3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。许多美国专利传授了如何制备和使用含有经修饰的磷酸酯的核苷酸，并且所述美国专利包括但不限于3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050；将其中每一项的披露内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，非天然核酸包括2’,3’-二脱氧-2’,3’-二脱氢-核苷(PCT/US2002/006460)、5’-取代的DNA和RNA衍生物(PCT/US2011/033961；Saha等人,J.OrgChem.,1995,60,788-789；Wang等人,Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,1999,9,885-890；和Mikhailov等人,Nucleosides&Nucleotides,1991,10(1-3),339-343；Leonid等人,1995,14(3-5),901-905；和Eppacher等人,Helvetica Chimica Acta,2004,87,3004-3020；PCT/JP2000/004720；PCT/JP2003/002342；PCT/JP2004/013216；PCT/JP2005/020435；PCT/JP2006/315479；PCT/JP2006/324484；PCT/JP2009/056718；PCT/JP2010/067560)、或制备为具有经修饰的碱基的单磷酸酯的5’-取代的单体(Wang等人,NucleosidesNucleotides&Nucleic Acids,2004,23(1&2),317-337)；将其中每一项的披露内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，非天然核酸包括在糖环的5’-位置和2’-位置处的修饰(PCT/US94/02993)，如5’-CH2-取代的2’-O-保护的核苷(Wu等人,Helvetica Chimica Acta,2000,83,1127-1143和Wu等人,Bioconjugate Chem.1999,10,921-924)。在一些情形中，非天然核酸包括酰胺连接的核苷二聚体,其已经被制备用于掺入寡核苷酸中，其中二聚体中3’连接的核苷(5’至3’)包含2’-OCH3和5’-(S)-CH3(Mesmaeker等人,Synlett,1997,1287-1290)。非天然核酸可以包括2’-取代的5’-CH2(或O)修饰的核苷(PCT/US92/01020)。非天然核酸可以包括5’-亚甲基膦酸酯DNA和RNA单体以及二聚体(Bohringer等人,Tet.Lett.,1993,34,2723-2726；Collingwood等人,Synlett,1995,7,703-705；以及Hutter等人,Helvetica Chimica Acta,2002,85,2777-2806)。非天然核酸可以包括具有2’-取代基的5’-膦酸酯单体(US2006/0074035)和其他经修饰的5’-膦酸酯单体(WO1997/35869)。非天然核酸可以包括5’-修饰的亚甲基膦酸酯单体(EP614907和EP629633)。非天然核酸可以包括在5’和/或6’-位置处包含羟基的5’或6’-膦酸核糖核苷的类似物(Chen等人,Phosphorus,Sulfur and Silicon,2002,777,1783-1786；Jung等人,Bioorg.Med.Chem.,2000,8,2501-2509；Gallier等人,Eur.J.Org.Chem.,2007,925-933；和Hampton等人,J.Med.Chem.,1976,19(8),1029-1033)。非天然核酸可以包括5’-膦酸酯脱氧核糖核苷单体和具有5’-磷酸酯基团的二聚体(Nawrot等人,Oligonucleotides,2006,16(1),68-82)。非天然核酸可以包括具有6’-膦酸基团的核苷，其中所述5’或/和6’-位置是未经取代的或者被硫代-叔丁基(SC(CH3)3)(及其类似物)；亚甲基氨基(CH2NH2)(及其类似物)或氰基(CN)(及其类似物)取代(Fairhurst等人,Synlett,2001,4,467-472；Kappler等人,J.Med.Chem.,1986,29,1030-1038；Kappler等人,J.Med.Chem.,1982,25,1179-1184；Vrudhula等人,J.Med.Chem.,1987,30,888-894；Hampton等人,J.Med.Chem.,1976,19,1371-1377；Geze等人,J.Am.Chem.Soc,1983,105(26),7638-7640；和Hampton等人,J.Am.Chem.Soc,1973,95(13),4404-4414)。将本段中列出的每个参考文献的披露内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，非天然核酸还包括糖部分的修饰。在一些情形中，核酸含有其中糖基团已经被修饰的一种或多种核苷。此类糖修饰的核苷可以赋予增强的核酸酶稳定性、增加的结合亲和力或一些其他有益的生物学特性。在某些实施方案中，核酸包含经化学修饰的呋喃核糖环部分。经化学修饰的呋喃核糖环的例子包括但不限于添加取代基(包括5’和/或2’取代基；两个环原子桥接形成二环核酸(BNA)；用S、N(R)或C(R1)(R2)替代核糖基环氧原子(R＝H、C1-C12烷基或保护基团)；及其组合。经化学修饰的糖的例子可以发现于WO2008/101157、US 2005/0130923和WO 2007/134181中，将其中每一项的披露内容通过引用并入本文。
在一些情况下，经修饰的核酸包含经修饰的糖或糖类似物。因此，除核糖和脱氧核糖之外，糖部分还可以是戊糖、脱氧戊糖、己糖、脱氧己糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖或糖“类似物”环戊基。糖可以呈吡喃糖基或呋喃糖基形式。糖部分可以是核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖或2’-O-烷基核糖的呋喃糖苷，并且所述糖可以以[α]或[β]异头构型附接至相应的杂环碱基。糖修饰包括但不限于2’-烷氧基-RNA类似物、2’-氨基-RNA类似物、2’-氟-DNA和2’-烷氧基-或氨基-RNA/DNA嵌合体。例如，糖修饰可以包括2’-O-甲基-尿苷或2’-O-甲基-胞苷。糖修饰包括2’-O-烷基-取代的脱氧核糖核苷和2’-O-乙二醇样核糖核苷。这些糖或糖类似物以及其中此类糖或类似物附接至杂环碱基(核酸碱基)的相应“核苷”的制备是已知的。还可以进行糖修饰并且将其与其他修饰组合。
糖部分的修饰包括核糖和脱氧核糖的天然修饰以及非天然修饰。糖修饰包括但不限于在2’位置处的以下修饰：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。2’糖修饰还包括但不限于-O[(CH2)nO]m CH3、-O(CH2)nOCH3、-O(CH2)nNH2、-O(CH2)nCH3、-O(CH2)nONH2和-O(CH2)nON[(CH2)n CH3)]2，其中n和m是1至约10。
2’位置处的其他修饰包括但不限于：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2 CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、嵌入剂、用于改善寡核苷酸药代动力学特性的基团或用于改善寡核苷酸的药效学特性的基团，以及具有类似特性的其他取代基。还可以在所述糖的其他位置(特别是在3’末端核苷酸或2’-5’连接的寡核苷酸中糖的3’位置和5’末端核苷酸的5’位置)处进行类似的修饰。经修饰的糖还包括在桥环氧处含有修饰(如CH2和S)的那些糖。核苷酸糖类似物也可以具有糖模拟物，如环丁基部分代替戊呋喃糖基糖。许多美国专利传授了此类经修饰的糖结构的制备，并且详述并描述了一系列的碱基修饰，所述美国专利是如美国专利号4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121、5,596,091；5,614,617；5,681,941；和5,700,920，将其中每一项的披露内容通过引用以其整体并入本文。
具有经修饰的糖部分的核酸的例子包括但不限于包含5’-乙烯基、5’-甲基(R或S)、4’-S、2’-F、2’-OCH3和2’-O(CH2)2OCH3取代基的核酸。2’位置处的取代基还可以选自烯丙基、氨基、叠氮基、硫代、O-烯丙基、O-(C1-C1O烷基)、OCF3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)和O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中Rm和Rn各自独立地是H或者经取代或未经取代的C1-C10烷基。
在某些实施方案中，本文所述的核酸包括一种或多种二环核酸。在某些此类实施方案中，二环核酸包含4’与2’核糖基环原子之间的桥。在某些实施方案中，本文提供的核酸包括一种或多种双环核酸，其中所述桥包含4’至2’二环核酸。此类4’至2’二环核酸的例子包括但不限于以下式中的一种：4’-(CH2)-O-2’(LNA)；4’-(CH2)-S-2’；4’-(CH2)2-O-2’(ENA)；4’-CH(CH3)-O-2’和4’-CH(CH2OCH3)-O-2’及其类似物(参见，美国专利号7,399,845)；4’-C(CH3)(CH3)-O-2’及其类似物(参见WO2009/006478、WO2008/150729、US2004/0171570、美国专利号7,427,672；Chattopadhyaya等人,J.Org.Chem.,209,74,118-134；和WO2008/154401)。还参见例如：Singh等人,Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等人,Tetrahedron,1998,54,3607-3630；Wahlestedt等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Kumar等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；Singh等人,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；Srivastava等人,J.Am.Chem.Soc.,2007,129(26)8362-8379；Elayadi等人,Curr.Opinion Invens.Drugs,2001,2,558-561；Braasch等人,Chem.Biol,2001,8,1-7；Oram等人,Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243；美国专利号4,849,513；5,015,733；5,118,800；5,118,802；7,053,207；6,268,490；6,770,748；6,794,499；7,034,133；6,525,191；6,670,461；和7,399,845；国际公开号WO 2004/106356、WO1994/14226、WO 2005/021570、WO 2007/090071和WO 2007/134181；美国专利公开号US2004/0171570、US 2007/0287831和US 2008/0039618；美国临时申请号60/989,574、61/026,995、61/026,998、61/056,564、61/086,231、61/097,787和61/099,844；以及国际申请号PCT/US2008/064591、PCT US2008/066154、PCT US2008/068922和PCT/DK98/00393。将本段中列出的每个参考文献的披露内容通过引用并入本文。
在某些实施方案中，核酸包含连接的核酸。核酸可以使用任何核酸间连接而连接在一起。核酸间连接基团的两个主要类别是通过磷原子的存在或不存在来定义的。代表性的含磷的核酸间连接包括但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯和硫代磷酸酯(P＝S)。代表性的不含磷的核酸间连接基团包括但不限于亚甲基甲基亚氨基(-CH2-N(CH3)-O-CH2-)、硫代二酯(-O-C(O)-S-)、硫羰氨基甲酸酯(-O-C(O)(NH)-S-)；硅氧烷(-O-Si(H)2-O-)；和N,N*-二甲基肼(-CH2-N(CH3)-N(CH3))。在某些实施方案中，可以将具有手性原子的核酸间连接制备为外消旋混合物，制备为单独的对映异构体，例如，烷基膦酸酯和硫代磷酸酯。非天然核酸可以含有单个修饰。非天然核酸可以在所述部分之一内或不同部分之间含有多个修饰。
对核酸的骨架磷酸酯修饰包括但不限于甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯(桥连或非桥连)、磷酸三酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯，并且可以以任何组合使用。还可以使用其他非磷酸酯连接。
在一些实施方案中，骨架修饰(例如，甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和二硫代磷酸酯核苷酸间连接)可以赋予经修饰的核酸免疫调节活性和/或增强其体内稳定性。
在一些情况下，磷衍生物(或经修饰的磷酸酯基团)附接至糖或糖类似物部分，并且可以是单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等。含有经修饰的磷酸酯连接或非磷酸酯连接的示例性多核苷酸可以发现于Peyrottes等人,1996,Nucleic Acids Res.24:1841-1848；Chaturvedi等人,1996,NucleicAcids Res.24:2318-2323；和Schultz等人,(1996)Nucleic Acids Res.24:2966-2973；Matteucci,1997,“Oligonucleotide Analogs:an Overview”in Oligonucleotides asTherapeutic Agents,(Chadwick和Cardew,编辑)John Wiley and Sons,New York,NY；Zon,1993,“Oligonucleoside Phosphorothioates”in Protocols for Oligonucleotidesand Analogs,Synthesis and Properties,Humana Press,第165-190页；Miller等人,1971,JACS 93:6657-6665；Jager等人,1988,Biochem.27:7247-7246；Nelson等人,1997,JOC 62:7278-7287；美国专利号5,453,496；和Micklefield,2001,Curr.Med.Chem.8:1157-1179中；将其中每一项的披露内容通过引用并入本文。
在一些情形中，骨架修饰包括用可替代部分如阴离子基团、中性基团或阳离子基团替代磷酸二酯连接。此类修饰的例子包括：阴离子核苷间连接；N3’至P5’氨基磷酸酯修饰；硼烷磷酸酯DNA；原寡核苷酸；中性核苷间连接，如甲基膦酸酯；酰胺连接的DNA；亚甲基(甲基亚氨基)连接；甲缩醛(formacetal)和硫代甲缩醛连接；含有磺酰基的骨架；吗啉代寡聚物；肽核酸(PNA)；以及带正电荷的脱氧核糖核酸胍(DNG)寡聚物(Micklefield,2001,Current Medicinal Chemistry 8:1157-1179，将其披露内容通过引用并入本文)。经修饰的核酸可以包含嵌合或混合的骨架，所述嵌合的或混合的骨架包含一种或多种修饰(例如，磷酸酯连接的组合，如磷酸二酯和硫代磷酸酯连接的组合)。
磷酸酯的取代基包括，例如，短链烷基或环烷基核苷间连接、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间连接，或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间连接。这些包括具有以下的那些：吗啉代连接(部分地由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；含烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚胺基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及具有混合N、O、S和CH2组成部分的其他骨架。多个美国专利披露如何制备和使用这些类型的磷酸酯替代，并且包括但不限于美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439。还应理解，在核苷酸取代物中，核苷酸的糖和磷酸部分二者都可以被例如酰胺型连接(氨乙基甘氨酸)(PNA)替代。美国专利号5,539,082；5,714,331；和5,719,262传授了如何制备和使用PNA分子，将其中每一项通过引用并入本文。还参见Nielsen等人,Science,1991,254,1497-1500。还可能将其他类型的分子(缀合物)连接至核苷酸或核苷酸类似物，以增强例如细胞摄取。缀合物可以与所述核苷酸或核苷酸类似物化学连接。此类缀合物包括但不限于脂质部分如胆固醇部分(Letsinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553-6556)、胆酸(Manoharan等人,Bioorg.Med.Chem.Let.,1994,4,1053-1060)、硫醚(例如，己基-S-三苯甲硫醇)(Manoharan等人,Ann.KY.Acad.Sci.,1992,660,306-309；Manoharan等人,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3,2765-2770)、巯基胆固醇(Oberhauser等人,Nucl.Acids Res.,1992,20,533-538)、脂肪链(例如，十二烷二醇或十一烷基残基)(Saison-Behmoaras等人,EM5OJ,1991,10,1111-1118；Kabanov等人,FEBS Lett.,1990,259,327-330；Svinarchuk等人,Biochimie,1993,75,49-54)、磷脂(例如，二-十六烷基-rac-甘油或者三乙基铵l-二-O-十六烷基-rac-甘油-S-H-膦酸盐)(Manoharan等人,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651-3654；Shea等人,Nucl.Acids Res.,1990,18,3777-3783)，聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等人,Nucleosides&Nucleotides,1995,14,969-973)、或金刚烷乙酸(Manoharan等人,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651-3654)、棕榈基部分(Mishra等人,Biochem.Biophys.Acta,1995,1264,229-237)、或十八胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分(Crooke等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,923-937)。许多美国专利传授了此类缀合物的制备，并且所述美国专利包括但不限于美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717，5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241，5,391,723；5,416,203，5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941。将本段中列出的每个参考文献的披露内容通过引用并入本文。
在一些情形中，非天然核酸进一步形成非天然碱基对。能够在体内条件下形成非天然DNA或RNA碱基对(UBP)的示例性非天然核苷酸包括但不限于TPT3、dTPT3、5SICS、d5SICS、NaM、dNaM、CNMO、dCNMO及其组合。能够形成可以用于制备本文公开的IL-2缀合物的非天然UBP的非天然核苷酸的其他例子可以发现于Dien等人,JAm Chem Soc.,2018,140:16115-16123；Feldman等人,J Am Chem Soc,2017,139:11427-11433；Ledbetter等人,J AmChem Soc.,2018,140:758-765；Dhami等人,Nucleic Acids Res.2014,42:10235-10244；Malyshev等人,Nature,2014,509:385-388；Betz等人,JAm Chem Soc.,2013,135:18637-18643；Lavergne等人,J Am Chem Soc.2013,135:5408-5419；和Malyshev等人Proc NatlAcad Sci USA,2012,109:12005-12010中；将其中每一项的披露内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，非天然核苷酸包括：
在一些实施方案中，可以用于制备本文公开的IL-2缀合物的非天然核苷酸可能衍生自下式的化合物：
其中R2选自氢、烷基、烯基、炔基、甲氧基、甲硫醇、甲烷硒基、卤素、氰基和叠氮基；并且
波浪线指示与核糖基或2’-脱氧核糖基的键，其中核糖基或2’-脱氧核糖基部分的5’-羟基呈游离形式，或者任选地键合至单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯基团。
在一些实施方案中，可以用于制备本文公开的IL-2缀合物的非天然核苷酸可以衍生自 在一些实施方案中，可以用于制备本文公开的IL-2缀合物的非天然核苷酸包括
或其盐。
在一些实施方案中，非天然碱基对生成非天然氨基酸，如以下中所述：Dumas等人,“Designing logical codon reassignment-Expanding the chemistry in biology,”Chemical Science,6:50-69(2015)，将其披露内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，通过包含非天然核酸的合成密码子将非天然氨基酸掺入细胞因子(例如，IL多肽)中。在一些情况下，通过正交的经修饰的合成酶/tRNA对将非天然氨基酸掺入细胞因子中。此类正交对包含非天然合成酶，所述非天然合成酶能够用非天然氨基酸装载非天然tRNA，同时最小化a)其他内源氨基酸在非天然tRNA上以及b)非天然氨基酸在其他内源tRNA上的装载。此类正交对包含能够通过非天然合成酶进行装载，同时避免通过内源合成酶装载a)其他内源氨基酸的tRNA。在一些实施方案中，从各种生物体(如细菌、酵母、古细菌或人来源)鉴定出此类对。在一些实施方案中，正交合成酶/tRNA对包含来自单一生物体的组分。在一些实施方案中，正交合成酶/tRNA对包含来自两种不同的生物体的组分。在一些实施方案中，正交合成酶/tRNA对包含在修饰之前促进两种不同氨基酸的翻译的组分。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的丙氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的精氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的天冬酰胺合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的天冬氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的半胱氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的谷氨酰胺合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的谷氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的丙氨酸甘氨酸。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的组氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的亮氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的异亮氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的赖氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的甲硫氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的苯丙氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的脯氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的丝氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的苏氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的色氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的酪氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的缬氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交合成酶是经修饰的磷酸丝氨酸合成酶。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的丙氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的精氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的天冬酰胺tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的天冬氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的半胱氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的谷氨酰胺tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的谷氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的丙氨酸甘氨酸。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的组氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的亮氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的异亮氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的赖氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的甲硫氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的苯丙氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的脯氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的丝氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的苏氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的色氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的酪氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的缬氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是经修饰的磷酸丝氨酸tRNA。
在一些实施方案中，通过氨酰(aaRS或RS)-tRNA合成酶-tRNA对将非天然氨基酸掺入细胞因子(例如，IL多肽)中。示例性aaRS-tRNA对包括但不限于詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)(Mj-Tyr)aaRS/tRNA对、大肠杆菌TyrRS(Ec-Tyr)/嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)tRNACUA对、大肠杆菌LeuRS(Ec-Leu)/嗜热脂肪芽孢杆菌tRNACUA对和吡咯赖氨酰-tRNA对。在一些情况下，通过Mj-TyrRS/tRNA对将非天然氨基酸掺入细胞因子(例如，IL多肽)中。可以通过Mj-TyrRS/tRNA对掺入的示例性UAA包括但不限于对位取代的苯丙氨酸衍生物，如对-氨基苯丙氨酸和对-甲氧基苯丙氨酸；间位取代的酪氨酸衍生物，如3-氨基酪氨酸、3-硝基酪氨酸、3,4-二羟基苯丙氨酸和3-碘酪氨酸；苯基硒代半胱氨酸；对-硼苯丙氨酸；以及邻-硝基苄基酪氨酸。
在一些情况下，通过Ec-Tyr/tRNACUA或Ec-Leu/tRNACUA对将非天然氨基酸掺入细胞因子(例如，IL多肽)中。可以通过Ec-Tyr/tRNACUA或Ec-Leu/tRNACUA对掺入的示例性UAA包括但不限于含有二苯甲酮、酮、碘化物或叠氮化物取代基的苯丙氨酸衍生物；O-炔丙基酪氨酸；α-氨基辛酸、O-甲基酪氨酸、O-硝基苄基半胱氨酸；和3-(萘-2-基氨基)-2-氨基-丙酸。
在一些情况下，通过吡咯赖氨酰-tRNA对将非天然氨基酸掺入细胞因子(例如，IL多肽)中。在一些情形中，PylRS获自古细菌，例如获自产甲烷的古细菌。在一些情形中，PylRS获自巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)或乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)。可以通过吡咯赖氨酰-tRNA对掺入的示例性UAA包括但不限于酰胺和氨基甲酸酯取代的赖氨酸，如2-氨基-6-((R)-四氢呋喃-2-甲酰胺基)己酸、N-ε-D-脯氨酰基-L-赖氨酸和N-ε-环戊基氧基羰基-L-赖氨酸；N-ε-丙烯酰基-L-赖氨酸；N-ε-[(1-(6-硝基苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)乙氧基)羰基]-L-赖氨酸；和N-ε-(1-甲基环丙-2-烯甲酰氨基)赖氨酸。在一些实施方案中，本文公开的IL-2缀合物可以通过使用马氏甲烷八叠球菌(M.mazei)tRNA来制备，所述tRNA通过巴氏甲烷八叠球菌(M.barkeri)吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(Mb PylRS)选择性装载非天然氨基酸，如N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸(AzK)。其他方法是本领域普通技术人员已知的，如Zhang等人,Nature 2017,551(7682):644-647中披露的那些，将其披露内容通过引用并入本文。
在一些情况下，通过US 9,988,619和US 9,938,516中披露的合成酶将非天然氨基酸掺入本文所述的细胞因子(例如，IL多肽)中，将其中每一项的披露内容通过引用并入本文。
在合适的培养基中培养或维持引入了本文公开的构建体或载体的宿主细胞，使得产生tRNA、tRNA合成酶和目的蛋白质。培养基还包含一种或多种非天然氨基酸，使得目的蛋白质掺入所述一种或多种非天然氨基酸。在一些实施方案中，来自细菌、植物或藻类的核苷三磷酸转运蛋白(NTT)也存在于宿主细胞中。在一些实施方案中，本文公开的IL-2缀合物是通过使用表达NTT的宿主细胞来制备。在一些实施方案中，用于宿主细胞中的核苷酸三磷酸核苷转运蛋白可以选自TpNTT1、TpNTT2、TpNTT3、TpNTT4、TpNTT5、TpNTT6、TpNTT7、TpNTT8(假微型海链藻(T.pseudonana))、PtNTT1、PtNTT2、PtNTT3、PtNTT4、PtNTT5、PtNTT6(三角褐指藻(P.tricornutum))、GsNTT(嗜硫原始红藻(Galdieria sulphuraria))、AtNTT1、AtNTT2(拟南芥(Arabidopsis thaliana))、CtNTT1、CtNTT2(沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis))、PamNTT1、PamNTT2(嗜阿米巴原衣原体(Protochlamydia amoebophila))、CcNTT(石竹杀手杆菌(Caedibacter caryophilus))、RpNTT1(普氏立克次体(Rickettsiaprowazekii))。在一些实施方案中，NTT选自PtNTT1、PtNTT2、PtNTT3、PtNTT4、PtNTT5和PtNTT6。在一些实施方案中，NTT是PtNTT1。在一些实施方案中，NTT是PtNTT2。在一些实施方案中，NTT是PtNTT3。在一些实施方案中，NTT是PtNTT4。在一些实施方案中，NTT是PtNTT5。在一些实施方案中，NTT是PtNTT6。可以使用的其他NTT披露于Zhang等人,Nature 2017,551(7682):644-647；Malyshev等人Nature 2014(509(7500),385-388；和Zhang等人Proc NatlAcad Sci USA,2017,114:1317-1322；将其中每一项的披露内容通过引用并入本文。
正交tRNA合成酶/tRNA对用非天然氨基酸装载tRNA，并响应于所述密码子将所述非天然氨基酸掺入多肽链中。示例性aaRS-tRNA对包括但不限于詹氏甲烷球菌(Mj-Tyr)aaRS/tRNA对、大肠杆菌TyrRS(Ec-Tyr)/嗜热脂肪芽孢杆菌tRNACUA对、大肠杆菌LeuRS(Ec-Leu)/嗜热脂肪芽孢杆菌tRNACUA对和吡咯赖氨酰-tRNA对。可以根据本公开文本使用的其他aaRS-tRNA对包括衍生自马氏甲烷八叠球菌的那些，描述于以下文献中的那些：Feldman等人,J Am Chem Soc.,2018 140:1447-1454；以及Zhang等人Proc Natl Acad Sci USA,2017,114:1317-1322；将其中每一项的披露内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中提供在表达NTT和tRNA合成酶的细胞系统中制备本文公开的IL-2缀合物的方法。在本文所述的一些实施方案中，NTT选自PtNTT1、PtNTT2、PtNTT3、PtNTT4、PtNTT5和PtNTT6，并且tRNA合成酶选自詹氏甲烷球菌、大肠杆菌TyrRS(Ec-Tyr)/嗜热脂肪芽孢杆菌和马氏甲烷八叠球菌。在一些实施方案中，NTT是PtNTT1，并且tRNA合成酶衍生自詹氏甲烷球菌、大肠杆菌TyrRS(Ec-Tyr)/嗜热脂肪芽孢杆菌或马氏甲烷八叠球菌。在一些实施方案中，NTT是PtNTT2并且tRNA合成酶衍生自詹氏甲烷球菌、大肠杆菌TyrRS(Ec-Tyr)/嗜热脂肪芽孢杆菌、或马氏甲烷八叠球菌。在一些实施方案中，NTT是PtNTT3并且tRNA合成酶衍生自詹氏甲烷球菌、大肠杆菌TyrRS(Ec-Tyr)/嗜热脂肪芽孢杆菌、或马氏甲烷八叠球菌。在一些实施方案中，NTT是PtNTT3并且tRNA合成酶衍生自詹氏甲烷球菌、大肠杆菌TyrRS(Ec-Tyr)/嗜热脂肪芽孢杆菌、或马氏甲烷八叠球菌。在一些实施方案中，NTT是PtNTT4并且tRNA合成酶衍生自詹氏甲烷球菌、大肠杆菌TyrRS(Ec-Tyr)/嗜热脂肪芽孢杆菌、或马氏甲烷八叠球菌。在一些实施方案中，NTT是PtNTT5并且tRNA合成酶衍生自詹氏甲烷球菌、大肠杆菌TyrRS(Ec-Tyr)/嗜热脂肪芽孢杆菌、或马氏甲烷八叠球菌。在一些实施方案中，NTT是PtNTT6并且tRNA合成酶衍生自詹氏甲烷球菌、大肠杆菌TyrRS(Ec-Tyr)/嗜热脂肪芽孢杆菌、或马氏甲烷八叠球菌。
在一些实施方案中，本文公开的IL-2缀合物可以在细胞(如大肠杆菌)中制备，其包含(a)核苷酸三磷酸转运蛋白PtNTT2(包括截短的变体，其中全长蛋白质的前65个氨基酸残基缺失)，(b)含有双链寡核苷酸的质粒，所述双链寡核苷酸编码具有所需氨基酸序列的IL-2变体并且含有包含第一非天然核苷酸和第二非天然核苷酸的非天然碱基对，以在所需位置提供密码子，将在所述位置掺入非天然氨基酸，如N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸(AzK)，(c)编码衍生自马氏甲烷八叠球菌的tRNA的质粒，并且其包含非天然核苷酸以提供公认的反密码子(针对IL-2变体的密码子)来代替其天然序列，以及(d)编码巴氏甲烷八叠球菌来源的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(Mb PylRS)的质粒，其可以是编码所述tRNA的相同质粒或不同质粒。在一些实施方案中，细胞进一步补充有包含一种或多种非天然碱基的脱氧核糖三磷酸酯。在一些实施方案中，细胞进一步补充有包含一种或多种非天然碱基的核糖三磷酸酯。在一些实施方案中，细胞进一步补充有一种或多种非天然氨基酸，如N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸(AzK)。在一些实施方案中，编码所希望的IL-2变体的氨基酸序列的双链寡核苷酸在编码具有SEQ ID NO:1的蛋白质的序列的例如位置34、37、40、41、42、43、44、61、64、68、或71处含有密码子AXC。在一些实施方案中，细胞进一步包含质粒，所述质粒可以是蛋白质表达质粒或另一种质粒，其编码来自马氏甲烷八叠球菌的正交tRNA基因，所述正交tRNA基因包含AXC匹配的反密码子GYT代替其天然序列，其中Y是互补的并且可以与所述密码子中的非天然核苷酸相同或不同的非天然核苷酸。在一些实施方案中，密码子中的非天然核苷酸与反密码子中的非天然核苷酸不同且互补。在一些实施方案中，密码子中的非天然核苷酸与反密码子中的非天然核苷酸相同。在一些实施方案中，在双链寡核苷酸中的构成非天然碱基对的第一和第二非天然核苷酸可以衍生自 在一些实施方案中，在双链寡核苷酸中的构成非天然碱基对的第一和第二非天然核苷酸可以衍生自 在一些实施方案中，第一和第二非天然核苷酸的三磷酸酯包括 或其盐。在一些实施方案中，第一和第二非天然核苷酸的三磷酸酯包括 或其盐。在一些实施方案中，包含第一非天然核苷酸和第二非天然核苷酸的mRNA衍生的双链寡核苷酸可以包含含有衍生自的非天然核苷酸的密码子。在一些实施方案中，马氏甲烷八叠球菌tRNA可以包含含有非天然核苷酸的反密码子，其识别包含所述mRNA的非天然核苷酸的密码子。马氏甲烷八叠球菌tRNA中的反密码子可以包含衍生自的非天然核苷酸。在一些实施方案中，mRNA包含衍生自的非天然核苷酸。在一些实施方案中，mRNA包含衍生自的非天然核苷酸。在一些实施方案中，mRNA包含衍生自的非天然核苷酸。在一些实施方案中，tRNA包含衍生自的非天然核苷酸。在一些实施方案中，tRNA包含衍生自的非天然核苷酸。在一些实施方案中，tRNA包含衍生自的非天然核苷酸。在一些实施方案中，mRNA包含衍生自的非天然核苷酸并且tRNA包含衍生自的非天然核苷酸。在一些实施方案中，mRNA包含衍生自的非天然核苷酸并且tRNA包含衍生自的非天然核苷酸。将宿主细胞在含有适当营养素的培养基中培养，并补充以以下物质：(a)包含一种或多种非天然碱基的脱氧核糖核苷的三磷酸酯，所述非天然碱基是编码具有密码子的细胞因子基因的一种或多种质粒的复制所需的，(b)包含一种或多种非天然碱基的核糖核苷的三磷酸酯，所述非天然碱基是以下的转录所需的：(i)对应于细胞因子的编码序列并且含有包含一种或多种非天然碱基的密码子的mRNA，和(ii)含有包含一种或多种非天然碱基的反密码子的tRNA，以及(c)要掺入目的细胞因子的多肽序列中的一种或多种非天然氨基酸。然后将宿主细胞维持在允许目的蛋白质表达的条件下。
所表达的含AzK的所得蛋白质可以通过本领域普通技术人员已知的方法来纯化，然后可以允许其与炔烃(如包含如本文所公开的具有所需平均分子量的PEG链的DBCO)在本领域普通技术人员已知的条件下反应，以得到本文公开的IL-2缀合物。其他方法是本领域普通技术人员已知的，如以下文献中披露的那些：Zhang等人,Nature 2017,551(7682):644-647；WO 2015157555；WO 2015021432；WO 2016115168；WO 2017106767；WO2017223528；WO 2019014262；WO 2019014267；WO 2019028419；和WO2019/028425；将其中每一项的披露内容通过引用并入本文。
所表达的包含一种或多种非天然氨基酸(例如Azk)的所得蛋白质可以通过本领域普通技术人员已知的方法来纯化，然后可以允许其与炔烃(如包含如本文所公开的具有所需平均分子量的PEG链的DBCO)在本领域普通技术人员已知的条件下反应，以提供本文公开的IL-2缀合物。其他方法是本领域普通技术人员已知的，如以下文献中披露的那些：Zhang等人,Nature 2017,551(7682):644-647；WO 2015157555；WO 2015021432；WO 2016115168；WO 2017106767；WO 2017223528；WO 2019014262；WO 2019014267；WO 2019028419；和WO2019/028425；将其中每一项的披露内容通过引用并入本文。
可替代地，通过将本文所述的包含tRNA和氨酰tRNA合成酶并包含具有一个或多个框内正交(终止)密码子的目的核酸序列的核酸构建体引入宿主细胞中，来制备包含一种或多种非天然氨基酸的细胞因子(例如，IL-2)多肽。将宿主细胞在含有适当的营养素的培养基中培养，补充有(a)包含一个或多个非天然碱基的脱氧核糖核苷的三磷酸酯，所述一个或多个非天然碱基对于一种或多种质粒的复制是必需的，所述一种或多种质粒编码包含新密码子和反密码子的细胞因子基因；(b)核糖核苷的三磷酸酯，其对于对应于以下的mRNA的转录是必需的：(i)含有密码子的细胞因子序列，和(ii)含有反密码子的正交tRNA；以及(c)一种或多种非天然氨基酸。然后将宿主细胞维持在允许目的蛋白质表达的条件下。响应于非天然密码子，将所述一种或多种非天然氨基酸掺入多肽链中。例如，将一种或多种非天然氨基酸掺入细胞因子(例如，IL-2)多肽中。可替代地，可以在蛋白质中的两个或更多个位点处将两种或更多种非天然氨基酸掺入细胞因子(例如，IL-2)多肽中。
一旦在宿主细胞中产生了掺入一种或多种非天然氨基酸的细胞因子(例如，IL-2)多肽，就可以通过本领域已知的多种技术(包括酶促、化学和/或渗透裂解和物理破坏)从其提取。可以通过本领域已知的标准技术(如制备型离子交换色谱、疏水色谱、亲和色谱或本领域普通技术人员已知的任何其他合适的技术)纯化细胞因子(例如，IL-2)多肽。
合适的宿主细胞可以包括细菌细胞(例如，大肠杆菌，BL21(DE3))，但最合适的宿主细胞是真核细胞，例如昆虫细胞(例如果蝇，如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))、酵母细胞、线虫(例如秀丽隐杆线虫(C.elegans))、小鼠(例如小家鼠(Mus musculus))或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞、人293T细胞、HeLa细胞、NIH 3T3细胞和小鼠红白血病(MEL)细胞)或人细胞或其他真核细胞。其他合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。合适地，宿主细胞是哺乳动物细胞，如人细胞或昆虫细胞。在一些实施方案中，合适的宿主细胞包括大肠杆菌。
通常可以在本发明的实施方案中使用的其他合适的宿主细胞是在实施例部分中提到的那些。可以经由常规转化或转染技术将载体DNA引入宿主细胞中。如本文所用，术语“转化”和“转染”旨在指代用于将外来核酸分子(例如，DNA)引入宿主细胞中的多种公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适方法是本领域熟知的。
当创建细胞系时，通常优选地制备稳定细胞系。例如，对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知根据所使用的表达载体和转染技术，只有一小部分细胞可以将外来DNA整合到其基因组中。为了鉴定和选择这些整合体，通常将编码选择性标记物(例如，对抗生素的抗性)的基因与目的基因一起引入宿主细胞中。优选的选择性标记物包括赋予对药物(如G418、潮霉素或甲氨蝶呤)的抗性的那些选择性标记物。可以将编码选择性标记物的核酸分子在相同载体上引入宿主细胞中，或者可以引入单独的载体上。可以通过药物选择来鉴定被引入的核酸分子稳定转染的细胞(例如，已掺入选择性标记基因的细胞将存活，而其他细胞死亡)。
在一个实施方案中，将本文所述的构建体整合到宿主细胞的基因组中。稳定整合的优点是实现了各个细胞或克隆之间的均匀性。另一个优点是可以进行最佳生产者的选择。因此，希望创建稳定的细胞系。在另一个实施方案中，将本文所述的构建体转染到宿主细胞中。将构建体转染到宿主细胞中的优点是可以使蛋白质产量最大化。在一个方面，描述了包含本文所述的核酸构建体或载体的细胞。
药物组合物和配制品
在一些实施方案中，通过多种施用途径向受试者施用本文所述的包含细胞因子缀合物(例如，IL-2缀合物)的药物组合物和配制品，所述施用途径包括但不限于肠胃外、口服、经颊、直肠、舌下或透皮施用途径。在一些情形中，肠胃外施用包括静脉内、皮下、肌内、脑内、鼻内、动脉内、关节内、皮内、玻璃体内、骨内输注、腹膜内或鞘内施用。在一些情况下，将药物组合物配制用于局部施用。在其他情形下，将药物组合物配制用于全身施用。在一些实施方案中，通过静脉内、皮下和肌内施用向受试者施用本文所述的药物组合物和配制品。在一些实施方案中，通过静脉内施用向受试者施用本文所述的药物组合物和配制品。在一些实施方案中，通过施用向受试者施用本文所述的药物组合物和配制品。在一些实施方案中，通过肌内施用向受试者施用本文所述的药物组合物和配制品。
在一些实施方案中，药物配制品包括但不限于水性液体分散体、自乳化分散体、固体溶液、脂质体分散体、气溶胶、固体剂型、散剂、常释配制品、控释配制品、速融配制品、片剂、胶囊、丸剂、延迟释放配制品、延长释放配制品、脉冲式释放配制品、多颗粒配制品(例如，纳米颗粒配制品)和混合式常释与控释配制品。
在一些实施方案中，药物配制品包括基于与本文公开的组合物的相容性和所需剂型的释放曲线特性而选择的载体或载体材料。示例性载体材料包括例如粘合剂、助悬剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、润湿剂、稀释剂等。药学上相容的载体材料包括但不限于阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、麦芽糊精、甘油、硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、胆固醇、胆固醇酯、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、牛磺胆酸、磷脂酰胆碱、氯化钠、磷酸三钙、磷酸氢二钾、纤维素和纤维素缀合物、糖硬脂酰乳酸钠、角叉菜胶、甘油单酯、甘油二酯、预胶化淀粉等。参见例如，Remington:The Science and Practiceof Pharmacy,第十九版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)，Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania1975，Liberman,H.A.和Lachman,L.,编辑,Pharmaceutical Dosage Forms,MarcelDecker,New York,N.Y.,1980，以及Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems,第七版(Lippincott Williams&Wilkins1999)，将其中每一项的披露内容通过引用并入本文。
在一些情形中，将药物组合物配制为免疫脂质体，其包含与脂质体的脂质双层直接或间接结合的多种IL-2缀合物。示例性脂质包括但不限于脂肪酸；磷脂；固醇，如胆固醇；鞘脂，如鞘磷脂；糖鞘脂，如神经节苷脂、红细胞糖苷脂和脑苷脂；表面活性剂胺，如硬脂酰胺、油胺和亚油胺。
在一些情况下，药物配制品进一步包括pH调节剂或缓冲剂，所述pH调节剂或缓冲剂包括药学上可接受的盐、碱基或缓冲液。
在一些情况下，药物配制品包括一种或多种例如以使组合物的重量摩尔渗透压浓度在可接受范围内的量的药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，药物配制品包括但不限于糖(像海藻糖、蔗糖、甘露醇、麦芽糖、葡萄糖)或盐(像磷酸钾、柠檬酸钠、硫酸铵)和/或其他药剂(如肝素)，以增加多肽的溶解度和体内稳定性。
在一些情况下，药物配制品进一步包括用于稳定化合物的稀释剂，因为它们可以提供更稳定的环境。溶解于缓冲溶液中的盐(其也可以提供pH控制或维持)在本领域中用作稀释剂，包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液。在某些情况下，稀释剂增加组合物的体积以有助于压缩或产生足够的均匀共混物体积用于胶囊填充。
在一些情形中，药物配制品包括崩解剂(disintegration agent)或崩解剂(disintegrant)以促进物质的分解或崩解。术语“崩解”包括剂型在与胃肠液接触时的溶解和分散二者。崩解剂的例子包括淀粉，例如天然淀粉(如玉米淀粉或马铃薯淀粉)、预胶化淀粉(如National 1551或)或羟基乙酸淀粉钠(如或)；纤维素，如木制品、甲基结晶纤维素(例如，PH101、PH102、PH105、P100、Ming和)、甲基纤维素、交联羧甲纤维素或交联纤维素(如交联羧甲纤维素钠交联羧甲基纤维素或交联交联羧甲纤维素)；交联淀粉，如羟基乙酸淀粉钠；交联聚合物，如交聚维酮、交联聚乙烯吡咯烷酮；海藻酸盐，如海藻酸或海藻酸的盐(如海藻酸钠)；黏土，如HV(硅酸镁铝)；胶质，如琼脂、瓜尔胶、槐豆胶、卡拉牙胶、果胶或黄蓍胶；羟基乙酸淀粉钠；膨润土；天然海绵；表面活性剂；树脂，如阳离子交换树脂；柑橘渣；十二烷基硫酸钠；十二烷基硫酸钠与淀粉的组合等。
在一些情况下，药物配制品包括填充剂，如乳糖、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、微晶纤维素、纤维素粉、右旋糖、葡萄糖结合剂(dextrates)、右旋糖酐、淀粉、预胶化淀粉、蔗糖、木糖醇、乳糖醇、甘露醇、山梨醇、氯化钠、聚乙二醇等。
润滑剂和助流剂也任选地包括在本文所述的药物配制品中，用于防止、减少或抑制材料的粘附或摩擦。示例性润滑剂包括例如硬脂酸、氢氧化钙、滑石粉、硬脂酰富马酸钠、烃(如矿物油，或氢化植物油，如氢化大豆油)、高级脂肪酸及其碱金属和碱土金属盐(如铝、钙、镁、锌、硬脂酸、硬脂酸钠)、甘油、滑石粉、蜡、硼酸、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、聚乙二醇(例如，PEG-4000)或甲氧基聚乙二醇(如CarbowaxTM)、油酸钠、苯甲酸钠、山嵛酸甘油酯、聚乙二醇、十二烷基硫酸镁或十二烷基硫酸钠、胶体二氧化硅(如SyloidTM、)、淀粉(如玉米淀粉)、硅油、表面活性剂等。
增塑剂包括用于软化微囊化材料或薄膜包衣以使其脆性降低的化合物。合适的增塑剂包括例如聚乙二醇(如PEG 300、PEG 400、PEG 600、PEG 1450、PEG 3350和PEG 800)、硬脂酸、丙二醇、油酸、三乙基纤维素和三醋汀。增塑剂也可以起分散剂或润湿剂的作用。
增溶剂包括诸如以下的化合物：三醋汀、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、维生素E TPGS、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N-羟乙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基环糊精、乙醇、正丁醇、异丙醇、胆固醇、胆汁盐、聚乙二醇200-600、四氢呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)、二乙二醇单乙基醚(transcutol)、丙二醇和二甲基异山梨醇酯。
稳定剂包括诸如任何抗氧化剂、缓冲剂、酸、防腐剂的化合物。示例性稳定剂包括L-精氨酸盐酸盐、氨基丁三醇、白蛋白(人)、柠檬酸、苯甲醇、苯酚、磷酸二氢二钠脱水合物、丙二醇、间甲酚(metacresol)或间甲酚(m-cresol)、乙酸锌、聚山梨醇酯-20或20或氨丁三醇。
助悬剂包括诸如以下的化合物：聚乙烯吡咯烷酮，例如聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30；乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)；聚乙二醇，例如聚乙二醇可以具有约300至约6000、或约3350至约4000、或约7000至约5400的分子量；羧甲纤维素钠；甲基纤维素；羟丙基甲基纤维素；醋酸硬脂酸羟甲基纤维素；聚山梨醇酯-80；羟乙基纤维素；海藻酸钠；胶质，例如像黄蓍胶和阿拉伯胶、瓜尔胶、黄原胶类(包括黄原胶)；糖；纤维质，例如像羧甲纤维素钠、甲基纤维素、羧甲纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素；聚山梨醇酯-80；海藻酸钠；聚乙氧基化脱水山梨醇单月桂酸酯、聚乙氧基化脱水山梨醇单月桂酸酯；聚维酮等。
表面活性剂包括诸如以下的化合物：十二烷基硫酸钠、多库酯钠、Tween 60或80、三醋汀、维生素E TPGS、脱水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、聚山梨酸酯、泊洛沙姆(polaxomer)、胆汁盐、单硬脂酸甘油酯、环氧乙烷与环氧丙烷的共聚物(例如，(BASF))等。另外的表面活性剂包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和植物油(例如，聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油)以及聚氧乙烯烷基醚和烷基苯基醚(例如，辛苯聚醇10、辛苯聚醇40)。有时，包括表面活性剂以增强物理稳定性或用于其他目的。
粘度增强剂包括例如甲基纤维素、黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、醋酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、卡波姆、聚乙烯醇、海藻酸盐、阿拉伯胶、壳聚糖及其组合。
润湿剂包括诸如以下的化合物：油酸、单硬脂酸甘油酯、脱水山梨醇单油酸酯、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯、多库酯钠、油酸钠、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、三醋汀、Tween80、维生素ETPGS、铵盐等。
治疗方法
癌症类型
在一些实施方案中，癌症选自肾细胞癌(RCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、经典型霍奇金淋巴瘤(cHL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、尿路上皮癌、微卫星不稳定癌、微卫星稳定癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌(CRC)、宫颈癌、肝细胞癌(HCC)、梅克尔细胞癌(MCC)、黑色素瘤、小细胞肺癌(SCLC)、食管癌、食管鳞状细胞癌(ESCC)、胶质母细胞瘤、间皮瘤、乳腺癌、三阴性乳腺癌、前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌、转移性去势抵抗性前列腺癌、或具有DNA损伤应答(DDR)缺陷的转移性去势抵抗性前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、中度至低度突变负荷的肿瘤、皮肤鳞状细胞癌(CSCC)、鳞状细胞皮肤癌(SCSC)、低表达至不表达PD-L1的肿瘤、超出其原发解剖学起源部位全身性播散至肝脏和CNS的肿瘤以及弥漫性大B细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，反应是完全反应(CR)、部分反应(PR)或疾病稳定(SD)。
施用
在一些实施方案中，通过静脉内、皮下、肌内、脑内、鼻内、动脉内、关节内、皮内、玻璃体内、骨内输注、腹膜内或鞘内施用向受试者施用IL-2缀合物。在一些实施方案中，通过静脉内、皮下或肌内施用向受试者施用IL-2缀合物。在一些实施方案中，通过皮下或静脉内施用向受试者施用IL-2缀合物。在一些实施方案中，通过静脉内施用向受试者施用IL-2缀合物。在一些实施方案中，通过皮下施用向受试者施用IL-2缀合物。在一些实施方案中，通过肌内施用向受试者施用IL-2缀合物。在一些实施方案中，通过静脉内施用向受试者施用IL-2缀合物。
可以将IL-2缀合物施用超过一次，例如两次、三次、四次、五次或更多次。在一些实施方案中，治疗的持续时间长达24个月，如1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、21个月或24个月。在一些实施方案中，治疗的持续时间再进一步延长长达24个月。
在一些实施方案中，约每两周一次、约每三周一次或约每4周一次向有需要的受试者施用IL-2缀合物。在一些实施方案中，每两周一次向有需要的受试者施用IL-2缀合物。在一些实施方案中，每三周一次向有需要的受试者施用IL-2缀合物。在一些实施方案中，每4周一次向有需要的受试者施用IL-2缀合物。在一些实施方案中，将IL-2缀合物约每14、15、16、17、18、19、20或21天施用一次。
在一些情况下，所需剂量方便地以单一剂量或作为分开的剂量存在，所述分开的剂量是同时(或在短时间段内)或以适当的间隔(例如每天两个、三个、四个或更多个子剂量)施用。
在一些实施方案中，以约8μg/kg、16μg/kg、24μg/kg、32μg/kg或40μg/kg的剂量向有需要的受试者施用IL-2缀合物。在一些实施方案中，以约8μg/kg剂量向有需要的受试者施用IL-2缀合物。在一些实施方案中，以约16μg/kg剂量向有需要的受试者施用IL-2缀合物。在一些实施方案中，以约24μg/kg剂量向有需要的受试者施用IL-2缀合物。在一些实施方案中，以约32μg/kg剂量向有需要的受试者施用IL-2缀合物。在一些实施方案中，以约40μg/kg剂量向有需要的受试者施用IL-2缀合物。在一些实施方案中，以约8-40μg/kg剂量向有需要的受试者施用IL-2缀合物。在一些实施方案中，以约8-16μg/kg剂量向有需要的受试者施用IL-2缀合物。在一些实施方案中，以约24-32μg/kg剂量向有需要的受试者施用IL-2缀合物。在一些实施方案中，以约24-40μg/kg剂量向有需要的受试者施用IL-2缀合物。
受试者
在一些实施方案中，IL-2缀合物的施用是针对成人的。在一些实施方案中，成人是男性。在其他实施方案中，成人是女性。在一些实施方案中，成人年龄为至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95岁。在一些实施方案中，IL-2缀合物的施用是针对婴儿、儿童或青少年。在一些实施方案中，受试者为至少1月龄、2月龄、3月龄、6月龄、9月龄或12月龄。在一些实施方案中，受试者为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19岁。
在一些实施方案中，受试者患有可测量的疾病(即，癌症)，如通过RECIST v1.1确定。在一些实施方案中，受试者已经被确定具有0或1的东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态。在一些实施方案中，受试者具有足够的心血管、血液、肝脏和肾脏功能，如通过医生确定。在一些实施方案中，受试者已经被确定(例如，通过医生)具有大于或等于12周的期望寿命。在一些实施方案中，受试者在施用第一治疗剂量之前接受过先前的抗癌疗法。
在一些实施方案中，受试者患有实体瘤癌症。在一些实施方案中，受试者患有转移性实体瘤。在一些实施方案中，受试者患有晚期实体瘤。在一些实施方案中，受试者患有难治性癌症。在一些实施方案中，受试者患有复发性癌症。
在一些实施方案中，对于本文公开的IL-2缀合物、PEG或聚乙二醇化药物中的任一种，受试者没有已知的超敏反应或禁忌证。
施用效果
在一些实施方案中，IL-2缀合物的施用提供了完全反应、部分反应或疾病稳定。
在一些实施方案中，在施用IL-2缀合物之后，受试者经历如通过实体瘤免疫相关疗效评价标准(Immune-related Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，iRECIST)测量的反应。在一些实施方案中，在施用IL-2缀合物之后，受试者经历根据RECIST1.1版的客观反应率(ORR)。在一些实施方案中，在施用IL-2缀合物之后，受试者经历根据RECIST 1.1版的反应持续时间(DOR)。在一些实施方案中，在施用IL-2缀合物之后，受试者经历根据RECIST 1.1版的无进展存活期(PFS)。在一些实施方案中，在施用IL-2缀合物之后，受试者经历根据RECIST 1.1版的总存活期。在一些实施方案中，在施用IL-2缀合物之后，受试者经历根据RECIST 1.1版的反应时间(TTR)。在一些实施方案中，在施用IL-2缀合物之后，受试者经历根据RECIST 1.1版的疾病控制率(DCR)。在这些实施方案的任一个中，受试者的经历是基于医生对受试者拍摄的射线图像的审查。
在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不会引起受试者的血管渗漏综合征。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不会引起受试者的2级、3级或4级血管渗漏综合征。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不会引起受试者的2级血管渗漏综合征。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不会引起受试者的3级血管渗漏综合征。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不会引起受试者的4级血管渗漏综合征。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不会引起受试者的血管紧张度损失。
在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不会引起受试者的血浆蛋白和流体外渗到血管外空间中。
在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不会引起受试者的低血压和器官灌注减少。
在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不会引起受试者的嗜中性粒细胞功能受损。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不会引起受试者的趋化性降低。
在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物与受试者的增加的播散性感染风险无关。在一些实施方案中，播散性感染是脓毒症或细菌性心内膜炎。在一些实施方案中，播散性感染是脓毒症。在一些实施方案中，播散性感染是细菌性心内膜炎。在一些实施方案中，在施用IL-2缀合物之前，治疗受试者的任何先前存在的细菌感染。在一些实施方案中，在施用IL-2缀合物之前，用选自苯唑西林、萘夫西林、环丙沙星和万古霉素的抗细菌剂治疗受试者。
在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不加剧受试者的自身免疫性疾病或炎性障碍的预先存在的表现或初始表现。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不加剧受试者的自身免疫性疾病的预先存在的表现或初始表现。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不加剧受试者的炎性障碍的预先存在的表现或初始表现。在一些实施方案中，受试者的自身免疫性疾病或炎性障碍选自克罗恩病、硬皮病、甲状腺炎、炎性关节炎、糖尿病、眼球型重症肌无力、新月体性IgA肾小球肾炎、胆囊炎、脑血管炎、史-约综合征和大疱性类天疱疮。在一些实施方案中，受试者的自身免疫性疾病或炎性障碍是克罗恩病。在一些实施方案中，受试者的自身免疫性疾病或炎性障碍是硬皮病。在一些实施方案中，受试者的自身免疫性疾病或炎性障碍是甲状腺炎。在一些实施方案中，受试者的自身免疫性疾病或炎性障碍是炎性关节炎。在一些实施方案中，受试者的自身免疫性疾病或炎性障碍是糖尿病。在一些实施方案中，受试者的自身免疫性疾病或炎性障碍是眼球型重症肌无力。在一些实施方案中，受试者的自身免疫性疾病或炎性障碍是新月体性IgA肾小球肾炎。在一些实施方案中，受试者的自身免疫性疾病或炎性障碍是胆囊炎。在一些实施方案中，受试者的自身免疫性疾病或炎性障碍是脑血管炎。在一些实施方案中，受试者的自身免疫性疾病或炎性障碍是史-约综合征。在一些实施方案中，受试者的自身免疫性疾病或炎性障碍是大疱性类天疱疮。
在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不会引起受试者的精神状态变化、言语困难、皮质盲、肢体或步态共济失调、幻觉、激越、迟钝或昏迷。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不会引起受试者的癫痫。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物在患有已知癫痫发作障碍的受试者中不是禁忌的。
在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不会引起受试者的毛细血管渗漏综合征。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不会引起受试者的2级、3级或4级毛细血管渗漏综合征。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不会引起受试者的2级毛细血管渗漏综合征。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不会引起受试者的3级毛细血管渗漏综合征。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不会引起受试者的4级毛细血管渗漏综合征。
在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不会引起受试者在施用后平均动脉血压的下降。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不会引起受试者的低血压。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不会使受试者经历低于90mm Hg的收缩压或从基线收缩压下降20mm Hg。
在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不会引起受试者的水肿或肾功能或肝功能受损。
在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不会引起受试者的嗜酸性粒细胞增多症。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不会引起受试者的外周血中的嗜酸性粒细胞计数超过500/μL。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不会引起受试者的外周血中的嗜酸性粒细胞计数超过500/μL至1500/μL。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不会引起受试者的外周血中的嗜酸性粒细胞计数超过1500/μL至5000/μL。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不会引起受试者的外周血中的嗜酸性粒细胞计数超过5000/μL。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物在接受现有精神药物方案的受试者中不是禁忌的。
在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物在接受肾毒性、骨髓毒性、心脏毒性或肝毒性药物的现有方案的受试者中不是禁忌的。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物在接受氨基糖苷类、细胞毒性化学疗法、多柔比星、甲氨蝶呤或天冬酰胺酶的现有方案的受试者中不是禁忌的。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物在接受含有抗肿瘤剂的组合方案的受试者中不是禁忌的。在一些实施方案中，抗肿瘤剂选自达卡巴嗪、顺铂、他莫昔芬和干扰素-α。
在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不会引起受试者在施用后的一种或多种4级不良事件。在一些实施方案中，4级不良事件选自体温过低；休克；心动过缓；室性期前收缩；心肌缺血；晕厥；出血；房性心律失常；静脉炎；二度房室传导阻滞；心内膜炎；心包积液；外周坏疽；血栓形成；冠状动脉障碍；口炎；恶心和呕吐；肝功能测试异常；胃肠出血；呕血；血性腹泻；胃肠道障碍；肠穿孔；胰腺炎；贫血；白细胞减少症；白细胞增多症；低钙血症；碱性磷酸酶升高；血尿素氮(BUN)升高；高尿酸血症；非蛋白氮(NPN)升高；呼吸性酸中毒；嗜睡；激越；神经病；偏执性反应；抽搐；癫痫大发作性抽搐；谵妄；哮喘、肺水肿；通气过度；低氧症；咯血；通气不足；气胸；瞳孔散大；瞳孔障碍；肾功能异常；肾衰；和急性肾小管坏死。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不会引起大于1％的受试者在施用后的一种或多种4级不良事件。在一些实施方案中，4级不良事件选自体温过低；休克；心动过缓；室性期前收缩；心肌缺血；晕厥；出血；房性心律失常；静脉炎；二度房室传导阻滞；心内膜炎；心包积液；外周坏疽；血栓形成；冠状动脉障碍；口炎；恶心和呕吐；肝功能测试异常；胃肠出血；呕血；血性腹泻；胃肠道障碍；肠穿孔；胰腺炎；贫血；白细胞减少症；白细胞增多症；低钙血症；碱性磷酸酶升高；血尿素氮(BUN)升高；高尿酸血症；非蛋白氮(NPN)升高；呼吸性酸中毒；嗜睡；激越；神经病；偏执性反应；抽搐；癫痫大发作性抽搐；谵妄；哮喘、肺水肿；通气过度；低氧症；咯血；通气不足；气胸；瞳孔散大；瞳孔障碍；肾功能异常；肾衰；和急性肾小管坏死。
在一些实施方案中，向一组受试者施用IL-2缀合物不会引起大于1％的受试者在施用后的一种或多种不良事件，其中所述一种或多种不良事件选自十二指肠溃疡形成；肠坏死；心肌炎；室上性心动过速；继发于视神经炎的永久性或暂时性失明；短暂脑缺血发作；脑膜炎；脑水肿；心包炎；过敏性间质性肾炎；和气管食管瘘。
在一些实施方案中，向一组受试者施用IL-2缀合物不会引起大于1％的受试者在施用后的一种或多种不良事件，其中所述一种或多种不良事件选自恶性高热；心脏停搏；心肌梗塞；肺栓塞；中风；肠穿孔；肝或肾衰竭；导致自杀的重度抑郁症；肺水肿；呼吸停止；呼吸衰竭。
在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物刺激受试者中的CD8+细胞。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物刺激受试者中的NK细胞。刺激可以包括例如施用后约4、5、6或7天，或施用后约1、2、3或4周，受试者中CD8+细胞数量的增加。在一些实施方案中，CD8+细胞包括记忆CD8+细胞。在一些实施方案中，CD8+细胞包括效应CD8+细胞。刺激可以包括例如施用后约4、5、6或7天，或施用后约1、2、3或4周，受试者中Ki67阳性的CD8+细胞比例的增加。刺激可以包括例如施用后约4、5、6或7天，或施用后约1、2、3或4周，受试者中NK细胞数量的增加。
在一些实施方案中，在施用IL-2缀合物之后，CD8+细胞在受试者中扩增至少1.5倍(如至少1.6倍、1.7倍、1.8倍或1.9倍)。在一些实施方案中，在施用IL-2缀合物之后，NK细胞在受试者中扩增至少5倍(如至少5.5倍、6倍或6.5倍)。在一些实施方案中，在施用IL-2缀合物后，嗜酸性粒细胞在受试者中扩增不超过约2倍，如不超过约1.5倍、1.4倍或1.3倍。在一些实施方案中，在施用IL-2缀合物后，CD4+细胞在受试者中扩增不超过约2倍，如不超过约1.8倍、1.7倍或1.6倍。在一些实施方案中，在施用IL-2缀合物后，CD8+细胞和/或NK细胞在受试者中的扩增多于CD4+细胞和/或嗜酸性粒细胞的扩增。在一些实施方案中，CD8+细胞的扩增多于CD4+细胞的扩增。在一些实施方案中，NK细胞的扩增多于CD4+细胞的扩增。在一些实施方案中，CD8+细胞的扩增多于嗜酸性粒细胞的扩增。在一些实施方案中，NK细胞的扩增多于嗜酸性粒细胞的扩增。相对于施用IL-2缀合物之前测量的基线值，确定扩增倍数。在一些实施方案中，在施用后的任何时间(如施用后约4、5、6或7天，或施用后约1、2、3或4周)，确定扩增倍数。
在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物增加受试者中外周CD8+T和NK细胞的数量，而不增加受试者中外周CD4+调节性T细胞的数量。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物增加受试者中外周CD8+T和NK细胞的数量，而不增加受试者中外周嗜酸性粒细胞的数量。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物增加受试者中外周CD8+T和NK细胞的数量，而不增加受试者中肿瘤内CD8+T细胞和NK细胞的数量且不增加受试者中肿瘤内CD4+调节性T细胞的数量。
在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不需要使用重症监护设施或熟练的心肺或重症监护医学专家。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不需要使用重症监护设施或熟练的心肺或重症监护医学专家。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不需要使用重症监护设施。在一些实施方案中，向受试者施用IL-2缀合物不需要使用熟练的心肺或重症监护医学专家。
在一些实施方案中，施用IL-2缀合物不会引起剂量限制性毒性。在一些实施方案中，施用IL-2缀合物不会引起重度细胞因子释放综合征。在一些实施方案中，IL-2缀合物不诱导抗药物抗体(ADA)，即抗IL-2缀合物的抗体。在一些实施方案中，ADA诱导的缺乏是通过抗PEG的抗体的直接免疫测定和/或抗IL-2缀合物的抗体的ELISA来测定。如果测得的ADA水平在统计学上与基线(治疗前)水平或与未治疗对照的水平无法区分，则认为IL-2缀合物不会诱导ADA。
试剂盒/制品
在某些实施方案中，本文公开了与本文所述的一种或多种方法和组合物一起使用的试剂盒和制品。此类试剂盒包括载体、包装或容器，其被分隔以容纳一个或多个容器如小瓶、管等，所述一个或多个容器中的每一个包含有待在本文所述的方法中使用的单独要素之一。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。在一个实施方案中，容器由各种材料(如玻璃或塑料)形成。
试剂盒通常包括列出内容物和/或使用说明的标签、以及包含使用说明的药品说明书。典型地还将包括一组说明书。
在一个实施方案中，标签在容器上或与容器相关联。在一个实施方案中，当形成标签的字母、数字或其他字符被贴附、模制或蚀刻到容器本身中时，标签在容器上；当标签存在于容纳容器的器皿或载体内时，标签与容器相关，例如作为药品说明书。在一个实施方案中，标签用于指示，内容物要被用于特定治疗应用。标签还指示使用内容物的指示，如在本文所述的方法中。
在某些实施方案中，药物组合物存在于包装或分配器装置中，所述装置含有一个或多个含有本文所提供化合物的单位剂型。包装例如含有金属或塑料箔，如泡罩包装。在一个实施方案中，包装或分配器装置附有施用说明书。在一个实施方案中，包装或分配器还附有与容器相连的通知，所述通知的形式由管理药物制造、使用或销售的政府机构规定，所述通知反映了所述机构对用于人或兽医施用的药物形式的批准。例如，此类通知是由美国食品和药物监督管理局批准的药物标签，或批准的产品插页。在一个实施方案中，还制备了在相容的药物载体中配制的含有本文所提供的化合物的组合物，将其放置在适当的容器中，并标记用于治疗所指示病症。
实施例
这些实施例仅仅出于说明性目的提供，并且不限制本文提供的权利要求的范围。
如实施例1中详细提供了用于制备本文所述的IL-2缀合物的示例性方法。
实施例1.聚乙二醇化IL-2缀合物的制备。
在本实施例中详细提供了用于制备本文所述的IL-2缀合物的示例性方法。
使用本文公开的方法使用以下将用于生物缀合的IL-2在大肠杆菌中表达为包涵体：(a)表达质粒，其编码(i)具有所需氨基酸序列的蛋白质，其基因含有第一非天然碱基对以在掺入非天然氨基酸N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸(AzK)的所需位置处提供密码子，和(ii)衍生自马氏甲烷八叠球菌Pyl的tRNA，其基因包含第二非天然核苷酸以提供匹配的反密码子代替其天然序列；(b)编码巴氏甲烷八叠球菌衍生的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(Mb PylRS)的质粒，(c)N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸(AzK)；和(d)核苷酸三磷酸转运蛋白PtNTT2的截短变体，其中全长蛋白质的前65个氨基酸残基缺失。编码所需IL-2变体的氨基酸序列的双链寡核苷酸含有密码子AXC作为编码具有SEQ ID NO:1的蛋白质的序列的密码子64，其中P64被本文所述的非天然氨基酸替代。编码来自马氏甲烷八叠球菌的正交tRNA基因的质粒包含AXC匹配的反密码子GYT代替其天然序列，其中Y是本文公开的非天然核苷酸。X和Y选自本文公开的非天然核苷酸dTPT3和dNaM。从包涵体中提取表达的蛋白质，并且使用标准程序重新折叠，然后使用DBCO介导的无铜点击化学将含AzK的IL-2产物进行位点特异性聚乙二醇化，以将稳定的共价mPEG部分附接到AzK上。示例性反应示于方案1和2中(其中n指示重复PEG单元的数量)。AzK部分与DBCO炔基部分的反应可提供一种区域异构产物或区域异构产物的混合物。
方案1.
方案2.
实施例2.施用IL-2缀合物(24μg/kg和32μg/kg[Q3W])后的生物标记物影响的临床研究。
使用24μg/kg剂量的第一队列
进行研究以表征本文所述的IL-2缀合物的体内施用的免疫学影响。IL-2缀合物包含SEQ ID NO:2，其中位置64是AzK_L1_PEG30kD，其中AzK_L1_PEG30kD被定义为式(IV)或式(V)的结构或式(IV)和式(V)的混合物以及30kDa线性mPEG链。该IL-2缀合物也可描述为包含SEQ ID NO:1的IL-2缀合物，其中位置64被替代为式(IV)或式(V)的结构或式(IV)和式(V)的混合物以及30kDa线性mPEG链。IL-2缀合物也可描述为包含SEQ ID NO:1的IL-2缀合物，其中位置64被替代为式(XII)或式(XIII)的结构或式(XII)和式(XIII)的混合物以及30kDa线性mPEG链。使用其中首先制备具有SEQ ID NO:1的蛋白质的方法制备化合物，其中位置64的脯氨酸被N6-((2-叠氮基乙氧基)-羰基)-L-赖氨酸AzK替代。然后允许含有AzK的蛋白质在点击化学条件下与包含平均分子量为30kDa的甲氧基线性PEG基团的DBCO反应，随后使用标准程序纯化和配制。
每3周[Q3W]以24μg/kg的剂量经由IV输注施用IL-2缀合物30分钟。分析对以下生物标记物的影响作为安全性和/或功效的替代预测因子：
嗜酸性粒细胞增多症(升高的外周嗜酸性粒细胞计数)：与血管渗漏综合征(VLS)相关的IL-2诱导的细胞(嗜酸性粒细胞)增殖的细胞替代标记物；
白介素5(IL-5)：IL-2诱导的2型先天淋巴细胞激活和导致嗜酸性粒细胞增多症和潜在VLS的这种趋化因子释放的细胞因子替代标记物；
白介素6(IL-6)：IL-2诱导的细胞因子释放综合征(CRS)的细胞因子替代标记物；以及
干扰素γ(IFN-γ)：IL-2诱导的CD8+细胞毒性T淋巴细胞激活的细胞因子替代标记物。
分析对以下生物标记物的影响作为抗肿瘤免疫活性的替代预测因子：
外周CD8+效应细胞：IL-2诱导的这些靶细胞在外周增殖的标记物，浸润后成为诱导可能潜在的治疗反应的替代标记物；
外周CD8+记忆细胞：IL-2诱导的这些靶细胞在外周增殖的标记物，浸润后成为诱导可能持久潜在的治疗和记忆群体的维持的替代标记物；
外周NK细胞：IL-2诱导的这些靶细胞在外周增殖的标记物，浸润后成为诱导可能快速的治疗反应的替代标记物；以及
外周CD4+调节细胞：IL-2诱导的这些靶细胞在外周增殖的标记物，浸润后成为诱导免疫抑制性TME和抵消基于效应物的治疗效果的替代标记物。
受试者在筛选时为年龄≥18岁的人类男性或女性。所有受试者先前已经用抗癌疗法治疗并且满足以下至少一项：根据NCI CTCAE v5.0，治疗相关毒性消退至0或1级(脱发除外)；或根据NCI CTCAE v5.0，治疗相关毒性至少消退至2级，事先获得医学监查员批准。最常见的肿瘤是结直肠癌或黑色素瘤。
受试者还满足以下标准：提供知情同意书。东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态为0或1。研究者确定的期望寿命大于或等于12周。组织学或细胞学证实的晚期和/或转移性实体瘤的诊断。拒绝护理标准的晚期或转移性实体瘤；或不存在会带来临床益处的合理护理标准；或标准治疗无法忍受、无效或无法获得的受试者。根据RECIST v1.1可测量的疾病。适当的实验室参数包括：绝对淋巴细胞计数>正常下限的0.5倍；血小板计数≥100×109/L；血红蛋白≥9.0g/dL(2周内无生长因子或输血；ESA和CSF施用的1周清除是足够的)；绝对嗜中性粒细胞计数≥1.5×109/L(2周内无生长因子)；凝血酶原时间(PT)和部分促凝血酶原激酶时间(PTT)≤正常上限(ULN)的1.5倍；天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)≤2.5倍ULN，除非存在肝转移的话可能是≤5倍ULN；总胆红素≤1.5×ULN。绝经前妇女和绝经后不到12个月的妇女在开始研究治疗前7天内血清妊娠试验呈阴性。
Q3W给药。10名患有晚期或转移性实体瘤且中位年龄为67.5岁(范围为37-78岁)的个体(4名[40％]男性，8名[80％]白种人)接受24μg/kg剂量Q3W的IL-2缀合物长达九个周期(每个周期1剂)。在本文和整个实施例2的第一队列的讨论中，每kg受试者的药物质量(例如，24μg/kg)是指除PEG和接头质量外的IL-2质量。
一名受试者在初次扫描时具有部分反应，在第二次和第三次扫描(先前PD-1暴露)时确认，持续6+个月；五名受试者最初疾病稳定(在6周评估时)，三名受试者在第一次评估时疾病进展，以及一名受试者因不良事件而退出治疗。所有受试者的给药后CD8+Ki67表达水平峰值超过50％(50％-85％)。
一名患有未知来源的鳞状细胞癌的73岁男性受试者，他接受了7个周期的治疗(24μg/kg Q3W)，还接受了包括抗PD-1在内的两种全身疗法线(对于抗PD-1的最佳反应：SD)，显示两个周期后肿瘤减少31％。发现其他免疫敏感肿瘤患者的最大肿瘤反应为肾细胞癌(RCC)(16％生长)和黑色素瘤(在两名受试者中观察到10％生长；2％减少；以及20％减少)。
CD8+T效应细胞的外周扩增平均高于基线4.47倍。所有受试者具有升高的给药后NK细胞Ki67表达水平。受试者的NK细胞的给药后外周扩增峰值平均高于基线7.67倍。
功效生物标记物。测量外周CD8+Teff细胞计数(图1A-图1B)。在先前给药后3周，在一些受试者中观察到超过基线的延长的CD8+扩增(例如，大于或等于2倍变化)。还测量了表达Ki67的CD8+Teff细胞的百分比(图2)。图16A-图16B示出了外周CD8+记忆细胞计数。
图3A-图3B示出了外周NK细胞计数。在每个受试者中观察到NK细胞计数的增加。还测量了表达Ki67的NK细胞的百分比(图4)。
图5A-图5B示出了外周CD4+Treg计数。还测量了表达Ki67的CD4+Treg细胞的百分比(图6)。
测量嗜酸性粒细胞计数(图7A-图7B)。如Pisani等人,Blood 1991年9月15日；78(6):1538-44中报道的，在患有IL-2诱导的嗜酸性粒细胞增多症的患者中，测量值不超过四倍的增加并且始终低于2328-15958个嗜酸性粒细胞/μL的范围。还测量了IFN-γ、IL-5和IL-6的水平(图8A-图8C)。测量值显示诱导了IFN-γ，但诱导了少量IL-5和IL-6(分别为与VLS和CRS相关的细胞因子)，除了一名受试者的IL-6水平在治疗后(接受托珠单抗后)24小时增加到约1100pg/mL，但此后下降。
抗药物抗体(ADA)。在每个剂量周期后测定来自治疗受试者的样品的抗药物抗体(ADA)。通过直接免疫测定法检测抗聚乙二醇自身抗体(检测限：36ng/mL)。用标记形式的IL-2缀合物进行桥接MesoScale Discovery ELISA，其检测限为4.66ng/mL。另外，使用CTLL-2细胞系进行中和抗IL-2缀合物的抗体的基于细胞的测定，其中STAT5磷酸化作为读出(检测限：6.3μg/mL)。
在每个剂量周期后从接受5个剂量周期的两名受试者和接受4个剂量周期的一名受试者收集和分析样品。在测定量化期间确定测定特异性截止点，对于IL-2缀合物ADA测定为1.09或更高的信负比(signal to negative ratio)，以及对于PEG ADA测定为2.08的信负比。对在IL-2缀合物测定中给出阳性或不确定结果的样品进行确认性测试，其中在存在和不存在确认性缓冲液(封闭溶液中10μg/mL IL-2缀合物)的情况下测定样品和对照。对在PEG测定中给出阳性或不确定结果的样品进行确认性测试，其中在存在和不存在确认性缓冲液(6％马血清中10μg/mL IL-2缀合物)的情况下测定样品和对照。如果在检测步骤中，样品的吸光度信号被抑制等于或大于测定量化期间确定的测定特异性截止点(IL-2缀合物为14.5％，或PEG为42.4％)，则认为样品是“确认的”。未检测到针对IL-2缀合物或PEG的确认的ADA(数据未示出)。
结果总结；讨论。所有测试的受试者具有在一个或多个时间点超过50％(50％-85％)的给药后CD8+Ki67表达水平，和CD8+T效应(Teff)细胞的外周扩增。所有测试的受试者也具有在一个或多个时间点超过50％(50％-100％)的给药后NK细胞Ki67表达水平，以及NK细胞的外周扩增。IL-5水平没有有意义的升高，并且IL-6水平在第3天升高的受试者在下一天显示出降低。在任何测试的受试者中都没有诱导ADA。
AE是施用药物产品的临床研究受试者中的任何不良医学事件，无论其原因如何。剂量限制性毒性定义为在治疗周期的第1天至第29天(含)±1天内发生的AE，其不明确或不可争议地仅与外来原因相关，并且满足至少一个以下标准：
·持续≥7天的3级嗜中性粒细胞减少症(绝对嗜中性粒细胞计数<1000/mm3>500/mm3)，或任何持续时间的4级嗜中性粒细胞减少症
·3+级发热性嗜中性粒细胞减少症
·4+级血小板减少症(血小板计数<25,000/mm3)
·持续≥5天或者与临床明显出血或需要血小板输注相关的3+级血小板减少症(血小板计数<50,000-25,000/mm3)
·未能在10天内满足绝对嗜中性粒细胞计数为至少1,000个细胞/mm3和血小板计数为至少75,000个细胞/mm3的恢复标准
·持续≥5天的任何其他4+级血液学毒性
·无胆汁郁积迹象或者诸如病毒性感染或其他药物的另外原因的3+级ALT或AST结合胆红素>2倍ULN(即Hy’s法则)
·用预先药物治疗发生的3级输注相关反应；4级输注相关反应
·3级血管渗漏综合征，定义为与体液潴留和肺水肿相关的低血压
·3+级过敏反应
·3+级低血压
·在开始接受的护理标准医疗管理的7天内未消退到<2级的3+级AE
·3+级细胞因子释放综合征
以下例外情况适用于非血液学AE：
·在≤3天内用优化的医疗管理消退到≤2级的3级疲劳、恶心、呕吐或腹泻
·3级发热(如通过>40℃持续≤24小时定义的)
·在没有预先药物治疗的情况下发生的3级输注相关反应；后续剂量应使用预先药物治疗并且如果反应再发生，则它将是DLT
·在开始接受的护理标准医疗管理(例如全身皮质类固醇疗法)的7天内消退到≤2级的3级关节痛或皮疹
如果受试者在基线时具有1级或2级ALT或AST升高，考虑间接的肝转移，3级升高也必须≥3倍基线并且持续7天。
严重AE定义为导致以下任何结局的任何AE：死亡；危及生命的AE；住院治疗或延长现住院时间；进行正常生活功能的能力持续或严重丧失或进行正常生活功能的能力严重破坏；或先天性异常/出生缺陷。可能不会导致死亡、危及生命或需要住院治疗的重要医学事件在基于适当的医学判断可能危及受试者并可能需要医疗或手术干预以防止以上所列结局中的一种时，可被视为严重事件。此类医学事件的例子包括需要在急诊室或家中进行强化治疗的过敏性支气管痉挛、不导致住院治疗的血液恶液质或抽搐，或发生药物依赖或药物滥用。
未报告有剂量限制性毒性。没有累积毒性。有两次治疗相关SAE(1次G3急性肾损伤和1次G4细胞因子释放综合征)，采用公认的护理标准消退。总之，IL-2缀合物被认为耐受性良好。
所有受试者具有至少一种治疗中出现的AE(TEAE)。TEAE详述于表1中。没有出现5级TEAE。两名受试者发生3级事件，以及三名受试者发生4级事件。3级事件包括：1次ALT/AST升高，1次嗜中性粒细胞计数下降和1次急性肾损伤。4级事件包括：1次CRS，1次淋巴细胞计数增加和2次淋巴细胞计数减少。
表1.治疗中出现的不良事件(TEAE)
TEAE主要由流感样症状、恶心或呕吐组成。TEAE用公认的护理标准消退。治疗相关AE是短暂的。发热、低血压和低氧症的AE与IL-5/IL-6细胞因子升高无关。一名受试者在24小时出现IL-6升高至1000pg/mL(托珠单抗治疗后)，到72小时下降至低于100pg/mL。对生命体征没有显著影响，没有QTc延长或其他心脏毒性。
因此，IL-2缀合物展示出令人鼓舞的PD数据，并且总体上是良好耐受的。确定IL-2缀合物的体内半衰期为约10小时。总之，这些结果被认为支持IL-2缀合物的非α优先活性，具有可耐受的安全性，在免疫敏感肿瘤患者中具有令人鼓舞的PD和活性的初步证据。
使用32μg/kg剂量的第二队列
对上述研究进行了扩展，以表征每3周[Q3W]以32μg/kg的剂量经由IV输注体内施用IL-2缀合物30分钟的免疫学影响。分析对实施例2中描述的相同生物标记物的影响作为安全性和/或功效的替代预测因子。
该第二队列中的受试者满足与实施例2中的受试者相同的标准。肿瘤类型包括宫颈肿瘤、结直肠肿瘤、胰腺肿瘤和肉瘤。
Q3W给药。六名患有晚期或转移性实体瘤的个体(5名[83.3％]男性，4名[66.7％]白种人)接受32μg/kg剂量Q3W的IL-2缀合物(每个周期1剂)。在本文和整个实施例2的第二队列中，每kg受试者的药物质量(例如，32μg/kg)是指除PEG和接头质量外的IL-2质量。
功效生物标记物。测量外周CD8+Teff细胞计数(图10A-图10B)。在3周时，在一些受试者中观察到超过基线的延长的CD8+扩增(例如，大于或等于4倍变化)。图14A-图14B示出了外周CD8+记忆细胞计数。
图11A-图11B示出了外周NK细胞计数。在每个受试者中观察到NK细胞计数的增加。
图12A-图12B示出了外周CD4+Treg计数。
测量嗜酸性粒细胞计数(图13A-图13B)。如Pisani等人,Blood 1991年9月15日；78(6):1538-44中报道的，在患有IL-2诱导的嗜酸性粒细胞增多症的患者中，测量值不超过四倍的增加并且始终低于2328-15958个嗜酸性粒细胞/μL的范围。
还测量了IFN-γ、IL-5和IL-6的水平(图15)。测量值显示诱导了IFN-γ，但诱导了少量IL-5和IL-6(分别为与VLS和CRS相关的细胞因子)，除了一名受试者的IL-6水平在治疗后(接受托珠单抗后)4小时增加到约700pg/mL，但此后下降。
结果总结；讨论。测试的所有受试者均具有CD8+T效应(Teff)细胞、CD8+记忆细胞、NK细胞和CD4+Treg细胞的给药后外周扩增。IL-5水平没有有意义的升高，并且IL-6水平在第3天升高的受试者在下一天显示出降低。
一名受试者在第一周期的第一天的第16小时和第二周期的第一天的第9小时经历了发热。第二名受试者在第一周期给药后16小时具有血压升高(162/9mm Hg)。第三名受试者经历了两次输注反应。第一次是在第一周期的第一天给药后2.5小时的1级反应。第二次是在第二周期的第一天给药后4小时的3级反应。在第一周期的第一天，第四名受试者经历了一级CRS，所述一级CRS包括发热、寒颤和血压降低(135/63至106/61mm Hg)。第五名患者经历了由发热和低血压组成的G2 CRS，用水合和地塞米松管理。随后发展为G3转氨酶升高，用地塞米松治疗。在C2D1，受试者经历了G2CRS的第二次发作，用类固醇和水合管理。
总之，所有6名受试者都具有至少一种治疗中出现的AE(TEAE)。TEAE详述于表2中。没有出现4或5级TEAE。两名患者具有2级TEAE。四名患者具有3级TEAE。
表2.治疗中出现的不良事件(TEAE)：n＝6
系统器官分类 1级 2级 3级 4级 5级
全身性障碍及施用部位状况 1/6(16.7％) 2/6(33.3％) 0/6(0％ 0/6(0％) 0/6(0％)
胃肠道障碍 2/6(33.3％) 1/6(16.7％) 0/6(0％) 0/6(0％) 0/6(0％)
检查 0/6(0％) 2/6(33.3％) 2/6(33.3％) 0/6(0％) 0/6(0％)
免疫系统障碍 1/6(16.7％) 1/6(16.7％) 0/6(0％) 0/6(0％) 0/6(0％)
感染及侵扰 0/6(0％) 0/6(0％) 1/6(16.7％) 0/6(0％) 0/6(0％)
损伤、手术并发症 0/6(0％) 0/6(0％) 1/6(16.7％) 0/6(0％) 0/6(0％)
神经系统障碍 2/6(33.3％) 0/6(0％) 0/6(0％) 0/6(0％) 0/6(0％)
皮肤及皮下组织障碍 1/6(16.7％) 0/6(0％) 0/6(0％) 0/6(0％) 0/6(0％)
代谢及营养障碍 1/6(16.7％) 1/6(16.7％) 2/6(33.3％) 0/6(0％) 0/6(0％)
呼吸系统、胸及纵膈障碍 0/6(0％) 1/6(16.7％) 0/6(0％) 0/6(0％) 0/6(0％)
肌肉骨骼及结缔组织障碍 4/6(66.7％) 0/6(0％) 0/6(0％) 0/6(0％) 0/6(0％)
精神障碍 1/6(16.7％) 0/6(0％) 0/6(0％) 0/6(0％) 0/6(0％)
血管障碍 1/6(16.7％) 0/6(0％) 0/6(0％) 0/6(0％) 0/6(0％)
两名患者具有2级治疗相关AE(二者均为发热)。四名患者具有3级治疗相关AE：1名输液反应，1名转氨酶升高(还有2级CRS发热和低血压，将其用地塞米松治疗)，1名低钾血症和1名低磷血症(以及在第2周期的第1天的1级CRS、发热、发冷和BP从135/62降低至106/61mm Hg)。TRAE详述于表3中。
表3.治疗相关不良事件：n＝6
两名患者发生SAE：一名患者发生1级CRS(发热、发冷和BP从135/62mm Hg降低至106/61mm Hg)，需要住院治疗但是用水合和电解质替代管理。另一名患者在第一周期时出现3级转氨酶升高，并且在第1和第2周期时均出现2级CRS(发热和低血压)，用地塞米松管理。
发生了一次DLT(需要减少剂量的输液相关反应)。尽管没有因TEAE导致的停药，但是由于TEAE(G3输液反应)导致一名患者的剂量减少。没有受试者经历过敏反应。
治疗相关AE用公认的护理标准消退。IL-5没有有意义的升高，没有累积毒性，没有终末器官毒性，并且没有QTc延长或其他与G3高血压和G4淋巴细胞减少症相关的心脏毒性。因此，IL-2缀合物展示出令人鼓舞的PD数据，并且总体上是良好耐受的。PK数据(表4)与IL-2缀合物的约10小时的体内半衰期一致。总之，这些结果被认为支持IL-2缀合物的非α优先活性，具有可耐受的安全性，在免疫敏感肿瘤患者中具有令人鼓舞的PD和活性的初步证据。
对于PK评估，从受试者中取样以确定血液中药物浓度随时间的变化。表4报告了在第1和第2周期中测量的血液浓度水平的平均值和标准差。
表4.浓度相对于时间的变化的总结
实施例3.向食蟹猴施用IL-2缀合物。
进行了使用食蟹猴的研究，以检查施用如本文所述的IL-2缀合物对多种细胞群体的影响。具体而言，使用实施例2中描述的IL-2缀合物研究对CD8+Teff细胞、CD4+Treg细胞、嗜酸性粒细胞、白细胞和淋巴细胞的群体的影响。使用未经处理的雄性食蟹猴进行研究。在第1、8和15天静脉内施用0.03、0.1、0.3或1mg/kg的三个每周剂量的IL-2缀合物。在第4天(给药前取样)和每次给药后的不同时间点收集用于流式细胞术的血液样品(参见图9A-图9C)。
在细胞亚群中分析血液样品的药效学(PD)读出。在其中测量PD读出的细胞亚群包括CD8+Teff细胞、CD4+Treg细胞、嗜酸性粒细胞、白细胞和淋巴细胞。
以30、100、300和1000μg/kg的剂量施用IL-2缀合物促进CD8+Teff细胞扩增(图9A)。以多达1000μg/kg的剂量施用IL-2缀合物对外周CD4+Treg细胞的扩增几乎没有影响(图9B)。
此外，测量施用300μg/kg的IL-2缀合物后的嗜酸性粒细胞、白细胞和淋巴细胞的细胞计数(图9C)。在施用IL-2缀合物后，在食蟹猴中未观察到血管渗漏综合征(VLS)的迹象。
实施例4.施用IL-2缀合物(8、16和24μg/kg[Q2W])后的生物标记物影响的临床研究。
进行研究以表征在实施例2中使用的IL-2缀合物的体内施用的免疫学影响。每2周[Q2W]以8、16或24μg/kg的剂量经由IV输注施用IL-2缀合物30分钟。分析对实施例2中描述的相同生物标记物的影响作为安全性和/或功效的替代预测因子。这些研究中的受试者满足与实施例2中的受试者相同的标准。
使用8μg/kg剂量([Q2W])的第一队列
四名患有晚期或转移性实体瘤的个体(4名[100％]男性，0名[0％]女性，白种人，中位年龄为64岁，范围为49-70岁)以8μg/kg剂量Q2W接受IL-2缀合物(每个周期1剂)。肿瘤类型包括结直肠肿瘤、胰腺肿瘤和肉瘤。在本文和整个实施例4的队列中，每kg受试者的药物质量(例如，8μg/kg)是指除PEG和接头质量外的IL-2质量。治疗持续时间范围为1.4-9.0个月(2.0个月，中值)，并且受试者接受4-20个总剂量(5.0个剂量，中值)。
受试者中有三名(75％)经历了至少一次TEAE，所有TEAE均为1级或2级。没有因TEAE导致的停药，并且没有剂量限制性毒性。一名受试者由于疾病进展死亡(5级AE)。未观察到累积毒性、终末器官毒性或QTc延长或者其他心脏毒性。此外，IL-5没有有意义的升高。TEAE详述于表5中。
表5.治疗中出现的不良事件(TEAE)，8μg/kg[Q2W](n＝4)
功效生物标记物。测量外周CD8+Teff细胞计数(图17)，并且外周NK细胞计数示于图18中。图19示出了外周CD4+Treg细胞计数。图20示出了外周淋巴细胞计数，并且图21示出了外周嗜酸性粒细胞计数。
图22A和图22B分别示出了在1和2个周期后IL-2缀合物的平均浓度。
图23示出了细胞因子水平(IFN-γ、IL-6和IL-5)。
因此，IL-2缀合物展示出令人鼓舞的PD数据，并且总体上是良好耐受的。总之，这些结果被认为支持IL-2缀合物的非α优先活性，具有可耐受的安全性，在免疫敏感肿瘤患者中具有令人鼓舞的PD和活性的初步证据。
使用16μg/kg剂量([Q2W])的第二队列
四名患有晚期或转移性实体瘤的个体接受16μg/kg剂量Q2W的IL-2缀合物(每个周期1剂)。肿瘤类型包括黑色素瘤、前列腺癌和结肠癌。
所有4名(100％)受试者经历了至少一次TEAE；4名患者中有3名(75％)经历了至少1次3-4级相关TEAE(1次3级和2次4级)。一名受试者经历了3级淋巴细胞计数减少，并且2名受试者经历了4级淋巴细胞计数减少(一名具有3级低磷血症)；淋巴细胞计数减少持续了2天。这些受试者没有相关的SAE(一次不相关的SAE肠梗阻)。没有因TEAE导致的停药。未观察到DLT。一名患者无法评价DLT，因为疾病进展阻止了C2D1的施用。一名受试者显示IL-6升高(1000pg/mL)，没有指示CRS的症状。TEAE详述于表6中。
表6.治疗中出现的不良事件(TEAE)，16μg/kg[Q2W](n＝4)
系统器官分类 1级 2级 3级 4级 5级
血液及淋巴障碍 0/4(0％) 1/4(25％) 0/4(0％) 0/4(0％) 0/4(0％)
胃肠道障碍 2/4(50％) 0/4(0％) 1/4(25％) 0/4(0％) 0/4(0％)
全身性障碍及施用状况 3/4(75％) 1/4(25％) 0/4(0％) 0/4(0％) 0/4(0％)
免疫系统障碍 1/4(25％) 0/4(0％) 0/4(0％) 0/4(0％) 0/4(0％)
检查 1/4(25％) 0/4(0％) 1/4(25％) 2/4(50％) 0/4(0％)
代谢及营养障碍 1/4(25％) 0/4(0％) 1/4(25％) 0/4(0％) 0/4(0％)
肌肉骨骼及结缔组织障碍 1/4(25％) 0/4(0％) 0/4(0％) 0/4(0％) 0/4(0％)
精神障碍 1/4(25％) 0/4(0％) 0/4(0％) 0/4(0％) 0/4(0％)
皮肤及皮下组织障碍 1/4(25％) 0/4(0％) 0/4(0％) 0/4(0％) 0/4(0％)
功效生物标记物。测量外周CD8+Teff细胞计数(图24)。CD8+扩增为约2倍，与第一[Q2W]队列(8μg/kg剂量)观察到的扩增相似。图25示出了外周NK细胞计数。NK细胞扩增比第一[Q2W]队列(8μg/kg剂量)高约1倍至20倍。图26示出了外周CD4+Treg细胞计数。图27示出了外周嗜酸性粒细胞计数。CD4+Treg和嗜酸性粒细胞扩增与第一[Q2W]队列(8μg/kg剂量)的扩增相似。
图28示出了细胞因子水平(IFN-γ、IL-6和IL-5)。
图29A和图29B分别示出了在1和2个周期后IL-2缀合物的平均浓度。
因此，IL-2缀合物展示出令人鼓舞的PD数据，并且总体上是良好耐受的。总之，这些结果被认为支持IL-2缀合物的非α优先活性，具有可耐受的安全性，在免疫敏感肿瘤患者中具有令人鼓舞的PD和活性的初步证据。
使用24μg/kg剂量([Q2W])的第三队列
三名患有晚期或转移性实体瘤的个体接受16μg/kg剂量Q2W的IL-2缀合物(每个周期1剂)。肿瘤类型包括黑色素瘤和肺肿瘤。
所有3名(100％)受试者均经历了至少一次TEAE；3名受试者中有2名(33.3％)经历了至少一次3-4级相关TEAE(2次4级)。有两例4级淋巴细胞计数减少(一名受试者具有1级转氨酶升高和1级TSH降低)。没有DLT。也没有相关的SAE。一名受试者需要保持剂量以接受对特殊目的不良事件(COVID-19感染)的治疗，并且随后的IL-2缀合物治疗由于PD而停药。没有因TEAE的停药。一名受试者因与IL-2缀合物治疗不相关的GI出血(胃溃疡)，而接受了C2D1的保持剂量。TEAE详述于表7中。
表7.治疗中出现的不良事件(TEAE)，24μg/kg[Q2W](n＝3)
系统器官分类 1级 2级 3级 4级 5级
胃肠道障碍 2/3(66％) 1/3(33％) 0/3(0％) 0/3(0％) 0/3(0％)
全身性障碍及施用状况 1/3(33％) 2/3(66％) 0/3(0％) 0/3(0％) 0/3(0％)
免疫系统障碍 1/3(33％) 0/3(0％) 0/3(0％) 0/3(0％) 0/3(0％)
感染及侵扰 1/3(33％) 1/3(33％) 0/3(0％) 0/3(0％) 0/3(0％)
损伤、中毒及手术并发症 1/3(33％) 0/3(0％) 0/3(0％) 0/3(0％) 0/3(0％)
检查 0/3(0％) 0/3(0％) 0/3(0％) 2/3(66％) 0/3(0％)
代谢及营养障碍 1/3(33％) 1/3(33％) 0/3(0％) 0/3(0％) 0/3(0％)
神经系统障碍 1/3(33％) 1/3(33％) 0/3(0％) 0/3(0％) 0/3(0％)
因此，IL-2缀合物展示出令人鼓舞的PD数据，并且总体上是良好耐受的。总之，这些结果被认为支持IL-2缀合物的非α优先活性，具有可耐受的安全性，在免疫敏感肿瘤患者中具有令人鼓舞的PD和活性的初步证据。
实施例5.施用IL-2缀合物(8μg/kg和16μg/kg[Q3W])后的生物标记物影响的临床研究。
进行研究以表征在实施例2中使用的IL-2缀合物的体内施用的免疫学影响。每3周[Q3W]以8μg/kg或16μg/kg的剂量经IV输注施用IL-2缀合物30分钟。分析对实施例2中描述的相同生物标记物的影响作为安全性和/或功效的替代预测因子。这些研究中的受试者满足与实施例2中的受试者相同的标准。在本文和整个实施例5的队列中，每kg受试者的药物质量(例如，8μg/kg)是指除PEG和接头质量外的IL-2质量。
队列1：8μg/kg[Q3W]给药。
队列1(患有恶性实体瘤的个体)接受8μg/kg剂量Q3W的IL-2缀合物，持续五个剂量周期。
对四名最初疾病稳定(在6周评估时；一名患者具有～12％肿瘤消退)的个体用IL-2缀合物治疗。这四名受试者的给药后CD8+Ki67表达水平超过60％(65％-80％)。
如下测定队列1中4名个体的生物标记物。CD8+T效应细胞的外周扩增平均高于基线1.53倍；一名受试者高于基线2.1倍。所有四名受试者的给药后NK细胞Ki67表达水平接近100％。所有四名受试者的NK细胞的给药后外周扩增在第3天平均高于基线3.9倍；一名受试者在第3天高于基线5.0倍。从周期1到周期2，PK参数没有变化。前三名受试者未检测到抗药物抗体；对两名受试者测量到周期5，对一名受试者测量到周期4。
在周期1和2期间，在给药后1、2和3天测量血清IFNγ、IL-6和IL-5水平。平均值和范围显示在表8中。所有受试者在给药后1天观察到所述范围的最高值。
表8.安全性/毒性生物标记物-细胞因子总结队列1：Q3W，8μg/kg
测量的细胞因子水平图示于图30中。
在Teachey等人,Cancer Discov.2016；6(6)；664-79中报道，在用CAR-T细胞治疗的急性成淋巴细胞白血病患者中，重度细胞因子释放综合征(CRS水平4或5)与非重度细胞因子释放综合征(CRS水平0-3)相比与本研究中测量的三种细胞因子中的每一种的较高值相关。Teachey等人对于IFNγ、IL-6和IL-5的数据(表示为中值(范围))再现于表9中。
表9.报道为与CRS水平0-3和4-5相关的IFNγ、IL-6和IL-5水平。
因此，表8和图30中的结果与没有重度CRS一致。
IL-2缀合物展示出令人鼓舞的PD数据，并且总体上是良好耐受的。总之，这些结果被认为支持IL-2缀合物的非α优先活性，具有可耐受的安全性，在免疫敏感肿瘤患者中具有令人鼓舞的PD和活性的初步证据。
队列2：16μg/kg[Q3W]给药。
本实施例报道了接受16μg/kg剂量Q3W的IL-2缀合物至少2个周期的3名患有恶性实体瘤的个体的结果。首次给药后，一名受试者的CD8+T效应细胞的给药后外周扩增4.1倍；三名患者平均扩增2.2倍。所有三名受试者的NK细胞的给药后外周扩增在第3天超过基线4倍；一名受试者高于基线11.4倍，平均值为7.2倍。
在周期1和2期间，在给药后1、2和3天测量血清IFNγ、IL-6和IL-5水平。平均值和范围显示在表10中。所指示的3名受试者在给药后1天观察到所述范围的最高值。
表10.安全性/毒性生物标记物-细胞因子总结队列2：Q3W，16μg/kg
测量的4名受试者的细胞因子水平图示于图31中。这些结果也与没有重度CRS一致。
通过FACS和CBC测量队列1-2的嗜酸性粒细胞计数(图32A-图32D)。如Pisani等人,Blood 1991年9月15日；78(6):1538-44中报道的，在患有IL-2诱导的嗜酸性粒细胞增多症的患者中，测量值始终低于2328-15958个嗜酸性粒细胞/μL的范围。还测量了队列1和2的外周淋巴细胞计数(图33A-图33D)。
队列1和2的功效生物标记物。测量队列1和2的外周CD8+Teff计数(图34A-图34D)。在先前给药后3周，在一些受试者中观察到超过基线的延长的CD8+扩增(例如，大于或等于2倍变化)。还测量了队列1和2中表达Ki67的CD8+Teff细胞的百分比(图35A-图35B)。
外周记忆CD8+计数示于图36A-图36B中。外周NK细胞计数示于图37A-图37D中。在先前给药后3周，在一些受试者中观察到超过基线的延长的NK细胞扩增(例如，大于或等于5倍变化)。还测量了队列1和2中表达Ki67的NK细胞的百分比(图38A-图38B)。
图39A-图39B示出了队列1和2的外周CD4+Treg计数。还测量了队列1和2的表达Ki67的CD4+Treg细胞的百分比(图40A-图40B)。
结果总结；讨论。上文讨论的接受8μg/kg剂量的受试者的给药后CD8+Ki67表达水平超过60％(65％-80％)，CD8+T效应(Teff)细胞的外周扩增平均高于基线1.53倍。所有4名受试者的给药后NK细胞Ki67表达水平也接近100％，在第3天，NK细胞的外周扩增平均高于基线3.9倍。在上文讨论的接受16μg/kg剂量的3名受试者中，1名在第7天的CD8+Teff细胞的给药后外周扩增高于基线4.1倍；3名受试者的平均扩增为2.2倍。没有观察到抗药物抗体(IL-2或PEG)，并且IL-5和IL-6水平没有有意义的升高。此外，PK数据没有表明从周期1到周期2的AUC的降低(数据未显示)。
在任一剂量下均未报告剂量限制性毒性，且未报告导致停药的治疗相关不良事件(TRAE)或治疗相关严重AE。
接受Q3W 8或16μg/kg剂量的10名受试者的TEAE详述于表11中。没有出现5级TEAE。两名受试者发生4级事件(一名为AST升高，以及一名为淋巴细胞计数下降)。一名受试者发生3级事件(AST升高)。
表11
TEAE主要由流感样症状、恶心或呕吐组成。TEAE用公认的护理标准消退。治疗相关AE是短暂的。发热、低血压和低氧症的AE与IL-5/IL-6细胞因子升高无关。对生命体征没有显著影响，没有QTc延长或其他心脏毒性。因此，IL-2缀合物展示出令人鼓舞的PD数据，并且总体上是良好耐受的。确定IL-2缀合物的体内半衰期为约10小时。总之，这些结果被认为支持IL-2缀合物的非α优先活性，具有可耐受的安全性，在免疫敏感肿瘤患者中具有令人鼓舞的PD和活性的初步证据。
选择的个体的结果。一名患有前列腺腺癌的受试者接受10个周期的Q3W 16μg/kg剂量，并且显示出疾病稳定(两个周期后降低24％)。该受试者在第10个周期后由于PSA升高而退出治疗。
一名患有非小细胞肺癌的受试者接受至少6个周期的Q3W 16μg/kg剂量，并且显示疾病稳定(5个周期后降低17.9％)。
抗药物抗体(ADA)。在每个剂量周期后测定来自治疗受试者的样品的抗药物抗体(ADA)。通过直接免疫测定法检测抗聚乙二醇自身抗体(检测限：36ng/mL)。用标记形式的IL-2缀合物进行桥接MesoScale Discovery ELISA，其检测限为4.66ng/mL。另外，使用CTLL-2细胞系进行中和抗IL-2缀合物的抗体的基于细胞的测定，其中STAT5磷酸化作为读出(检测限：6.3μg/mL)。
在每个剂量周期后从接受5个剂量周期的两名受试者和接受4个剂量周期的一名受试者收集和分析样品。在测定量化期间确定测定特异性截止点，对于IL-2缀合物ADA测定为1.09或更高的信负比，以及对于PEG ADA测定为2.08的信负比。对在IL-2缀合物测定中给出阳性或不确定结果的样品进行确认性测试，其中在存在和不存在确认性缓冲液(封闭溶液中10μg/mL IL-2缀合物)的情况下测定样品和对照。对在PEG测定中给出阳性或不确定结果的样品进行确认性测试，其中在存在和不存在确认性缓冲液(6％马血清中10μg/mL IL-2缀合物)的情况下测定样品和对照。如果在检测步骤中，样品的吸光度信号被抑制等于或大于测定量化期间确定的测定特异性截止点(IL-2缀合物为14.5％，或PEG为42.4％)，则认为样品是“确认的”。未检测到针对IL-2缀合物或PEG的确认的ADA(数据未示出)。
实施例6.施用IL-2缀合物(40μg/kg[Q3W])后的生物标记物影响的研究。
进行研究以表征在实施例2中使用的IL-2缀合物的体内施用的免疫学影响。每3周[Q3W]以40μg/kg的剂量经由IV输注施用IL-2缀合物30分钟。分析对实施例2中描述的相同生物标记物的影响作为安全性和/或功效的替代预测因子。这些研究中的受试者满足与实施例2中的受试者相同的标准。在本文和整个实施例6的队列中，每kg受试者的药物质量(例如，40μg/kg)是指除PEG和接头质量外的IL-2质量。
研究设计是向六名患有恶性晚期实体瘤或转移性实体瘤的个体施用40μg/kg剂量Q3W的IL-2缀合物。已获得4名受试者的结果并且数据如下所示。
关于受试者TEAE的数据汇总于表12中。
表12.治疗中出现的不良事件(TEAE)，40μg/kg[Q3W](n＝4)
没有剂量限制性毒性和由于AE的停药。
接受8-40μg/kg剂量范围的IL-2缀合物的受试者的外周血液样品中CD8+T效应细胞(而非CD4+T调节细胞)增加(图41A-图41B)。图41C示出了接受8-40μg/kg剂量范围的IL-2缀合物的受试者的外周血液样品中NK细胞增加。
总之，这些结果被认为支持IL-2缀合物的非α优先活性，具有可耐受的安全性，在患者中具有令人鼓舞的PD和活性的初步证据。
虽然在本文中已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域的技术人员来说，显然这些实施方案仅作为举例提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变型、改变和替换。应当理解，在实践本发明时，可以采用在本文中描述的本发明实施方案的各种替代方案。下面的权利要求旨在限定本发明的范围，从而覆盖在这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构。在此引用的所有专利和科学文献的披露内容均以其全文通过引用明确并入本文。在并入的任何材料与本公开文本的明确内容不一致的情况下，以明确内容为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 新索思股份有限公司
<120> 用IL-2缀合物的免疫肿瘤学疗法
<130> 01183-0098-00PCT
<150> US 63/090,005
<151> 2020-10-09
<150> US 63/090,005
<151> 2021-03-09
<150> US 63/173,130
<151> 2021-04-09
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 132
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-2 conjugate
<400> 1
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 2
<211> 132
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-2 conjugate
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (64)..(64)
<223> N6-((2-azidoethoxy)-carbonyl)-L-lysine stably-conjugated to PEG
via DBCO-mediated click chemistry
<400> 2
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Xaa
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130

Claims (71)

1.一种在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg至40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
2.一种在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用约40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
3.一种在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用约32μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
4.一种在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
5.一种用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法中使用的IL-2缀合物，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg至40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
6.一种用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法中使用的IL-2缀合物，所述方法包括向有需要的受试者施用约40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
7.一种用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法中使用的IL-2缀合物，所述方法包括向有需要的受试者施用约32μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
8.一种用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法中使用的IL-2缀合物，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
9.IL-2缀合物用于制造用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法的药剂的用途，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg至40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
10.IL-2缀合物用于制造用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法的药剂的用途，所述方法包括向有需要的受试者施用约40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
11.IL-2缀合物用于制造用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法的药剂的用途，所述方法包括向有需要的受试者施用约32μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
12.IL-2缀合物用于制造用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法的药剂的用途，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述PEG具有约30kDa的分子量。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述IL-2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，其中[AzK_L1_PEG30kD]是具有式(XVI)或式(XVII)的结构的L-氨基酸：
其中：
m是2；
n是整数，使得-(OCH2CH2)n-OCH3具有约30kDa的分子量；并且
波浪线指示与SEQ ID NO:2中未被替代的氨基酸残基的共价键。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中施用包含所述IL-2缀合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
16.根据权利要求15所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物、或用途，其中所述药物组合物包含所述IL-2缀合物的混合物，其中所述混合物包含其中所述式(IA)的结构是具有式(XVI)的结构的L-氨基酸的IL-2缀合物和其中所述式(IA)的结构是具有式(XVII)的结构的L-氨基酸的IL-2缀合物。
17.根据权利要求1-13中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述式(IA)的结构具有式(IVA)或式(VA)的结构：
其中：
W是具有约25kDa-35kDa的平均分子量的PEG基团；并且
q是1、2或3。
18.根据权利要求17所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中施用包含所述IL-2缀合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，并且所述药物组合物包含所述IL-2缀合物的混合物，其中所述混合物包含其中所述式(IA)的结构是具有式(IVA)的结构的L-氨基酸的IL-2缀合物和其中所述式(IA)的结构是具有式(VA)的结构的L-氨基酸的IL-2缀合物。
19.根据权利要求1-13中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述位置64处的氨基酸具有式(XIIA)或式(XIIIA)的结构：
其中：
n是整数，使得-(OCH2CH2)n-OCH3具有约25kDa-35kDa的分子量；
q是1、2或3；并且
波浪线指示与SEQ ID NO:1中未被替代的氨基酸残基的共价键。
20.根据权利要求19所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物、或用途，其中施用包含所述IL-2缀合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，并且所述药物组合物包含所述IL-2缀合物的混合物，其中所述混合物包含其中SEQ ID NO:1的氨基酸P64被式(XIIA)的结构替代的IL-2缀合物和其中SEQ ID NO:1的氨基酸P64被式(XIIIA)的结构替代的IL-2缀合物。
21.一种在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg至40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
22.一种在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用约40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
23.一种在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用约32μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
24.一种在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
25.一种用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法中使用的IL-2缀合物，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg至40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
26.一种用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法中使用的IL-2缀合物，所述方法包括向有需要的受试者施用约40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
27.一种用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法中使用的IL-2缀合物，所述方法包括向有需要的受试者施用约32μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
28.一种用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法中使用的IL-2缀合物，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
29.一种用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法中使用的IL-2缀合物，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg至40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
30.一种用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法中使用的IL-2缀合物，所述方法包括向有需要的受试者施用约40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
31.一种用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法中使用的IL-2缀合物，所述方法包括向有需要的受试者施用约32μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
32.一种用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法中使用的IL-2缀合物，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
33.IL-2缀合物用于制造用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法的药剂的用途，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg至40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
34.IL-2缀合物用于制造用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法的药剂的用途，所述方法包括向有需要的受试者施用约40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
35.IL-2缀合物用于制造用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法的药剂的用途，所述方法包括向有需要的受试者施用约32μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
36.IL-2缀合物用于制造用于在受试者中治疗癌症和/或刺激CD8+和/或NK细胞的方法的药剂的用途，所述方法包括向有需要的受试者施用约24μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2，其中所述IL-2缀合物包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中位置P64处的氨基酸被式(IA)的结构替代：
其中：
Z是CH2并且Y是
Y是CH2并且Z是
Z是CH2并且Y是或者
Y是CH2并且Z是
W是具有约30kDa的平均分子量的PEG基团；
q是1、2或3；
X是具有以下结构的L-氨基酸：
X-1指示与前一个氨基酸残基的附接点；并且
X+1指示与后一个氨基酸残基的附接点。
37.根据权利要求1-13和15-36中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中q是1。
38.根据权利要求1-13和15-36中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中q是2。
39.根据权利要求1-13和15-36中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中q是3。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中将所述IL-2缀合物施用至少两次。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中将所述IL-2缀合物施用至少三次。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中将所述IL-2缀合物施用至少四次。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中将所述IL-2缀合物施用至少五次。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中将所述IL-2缀合物约每两周施用一次。
45.根据权利要求1-43中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中将所述IL-2缀合物约每三周施用一次。
46.根据权利要求1-45中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中将所述IL-2缀合物约每14、15、16、17、18、19、20或21天施用一次。
47.根据权利要求1-46中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述受试者患有实体瘤癌症。
48.根据权利要求1-47中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述受试者患有转移性实体瘤。
49.根据权利要求1-48中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述受试者患有晚期实体瘤。
50.根据权利要求1-46中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述受试者患有液体瘤。
51.根据权利要求1-50中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述受试者患有难治性癌症。
52.根据权利要求1-51中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述受试者患有复发性癌症。
53.根据权利要求1-52中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述癌症选自肾细胞癌(RCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、经典型霍奇金淋巴瘤(cHL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、尿路上皮癌、微卫星不稳定癌、微卫星稳定癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌(CRC)、宫颈癌、肝细胞癌(HCC)、梅克尔细胞癌(MCC)、黑色素瘤、小细胞肺癌(SCLC)、食管癌、食管鳞状细胞癌(ESCC)、胶质母细胞瘤、间皮瘤、乳腺癌、三阴性乳腺癌、前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌、转移性去势抵抗性前列腺癌、或具有DNA损伤应答(DDR)缺陷的转移性去势抵抗性前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、中度至低度突变负荷的肿瘤、皮肤鳞状细胞癌(CSCC)、鳞状细胞皮肤癌(SCSC)、低表达至不表达PD-L1的肿瘤、超出其原发解剖学起源部位全身性播散至肝脏和CNS的肿瘤以及弥漫性大B细胞淋巴瘤。
54.根据权利要求1-53中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中CD8+细胞扩增至少约2倍。
55.根据权利要求1-54中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中NK细胞扩增至少约2倍。
56.根据权利要求1-55中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中嗜酸性粒细胞扩增不多于约3.2倍。
57.根据权利要求1-55中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中CD4+细胞扩增不多于约3.2倍。
58.根据权利要求1-57中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中CD8+细胞和/或NK细胞的扩增多于CD4+细胞和/或嗜酸性粒细胞的扩增。
59.根据权利要求1-58中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述IL-2缀合物不引起剂量限制性毒性。
60.根据权利要求1-59中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述IL-2缀合物不引起重度细胞因子释放综合征。
61.根据权利要求1-60中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述IL-2缀合物不引起血管渗漏综合征。
62.根据权利要求1-61中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中通过皮下施用向所述受试者施用所述IL-2缀合物。
63.根据权利要求1-61中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中通过静脉内施用向所述受试者施用所述IL-2缀合物。
64.根据权利要求1-63中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述IL-2缀合物是药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。
65.根据权利要求1-64中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中没有向所述受试者施用另外的治疗剂。
66.根据权利要求1-65中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述IL-2缀合物不诱导抗药物抗体。
67.根据权利要求1-66中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述受试者患有鳞状细胞癌。
68.根据权利要求1-66中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述受试者患有结直肠癌。
69.根据权利要求1-66中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述受试者患有黑色素瘤。
70.根据前述权利要求中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述方法包括向所述受试者施用约24μg/kg至32μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2。
71.根据前述权利要求中任一项所述的方法、用于所述用途的IL-2缀合物或用途，其中所述方法包括向所述受试者施用约32μg/kg至40μg/kg作为IL-2缀合物的IL-2。
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