RU2429244C2 - Улучшенные селективные в отношении протофибрилл антитела и их применение - Google Patents

Улучшенные селективные в отношении протофибрилл антитела и их применение Download PDF

Info

Publication number
RU2429244C2
RU2429244C2 RU2008141905/10A RU2008141905A RU2429244C2 RU 2429244 C2 RU2429244 C2 RU 2429244C2 RU 2008141905/10 A RU2008141905/10 A RU 2008141905/10A RU 2008141905 A RU2008141905 A RU 2008141905A RU 2429244 C2 RU2429244 C2 RU 2429244C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
antibody
seq
protofibrils
composition
specified
Prior art date
Application number
RU2008141905/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2008141905A (ru
Inventor
Пер ЕЛЛЕРФОРС (SE)
Пер ЕЛЛЕРФОРС
Ларс ЛАННФЕЛЬТ (SE)
Ларс ЛАННФЕЛЬТ
Даг СЕЛИН (SE)
Даг СЕЛИН
ПЕТТЕРССОН Фрида ЭКХОЛЬМ (SE)
ПЕТТЕРССОН Фрида ЭКХОЛЬМ
Хиллеви ЭНГЛУНД (SE)
Хиллеви ЭНГЛУНД
Original Assignee
Байоарктик Ньюросайенс Аб
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=38522718&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RU2429244(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Байоарктик Ньюросайенс Аб filed Critical Байоарктик Ньюросайенс Аб
Publication of RU2008141905A publication Critical patent/RU2008141905A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2429244C2 publication Critical patent/RU2429244C2/ru

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/464—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another
    • C07K16/465—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another with additional modified FR-residues
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/38—Pediatrics
    • G01N2800/385—Congenital anomalies
    • G01N2800/387—Down syndrome; Trisomy 18; Trisomy 13

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой антитело или его фрагмент, имеющие высокую аффинность в отношении протофибрилл Аβ. Также представлены композиции, содержащие антитело, способ детектирования протофибрилл Аβ in vitro, а также применения антитела. Изобретение может эффективно использоваться для лечения болезни Альцгеймера, синдрома Дауна, деменции с тельцами Леви и сосудистой деменции. 6 н. и 22 з.п. ф-лы, 14 ил., 44 табл.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Данное изобретение относится к предупреждению, лечению и диагностике нейродегенеративных заболеваний, в частности болезни Альцгеймера, и другого сходного заболевания. Более точно, данное изобретение относится к антителам с высокой аффинностью 10-7 М, предпочтительно 10-8 М, даже менее чем 10-9 М или менее чем 10-10 М или 10-11 М, селективным в отношении амилоидного бета-белка (Аβ) в его протофибриллярной конформации и относящимся к классу IgG и подклассам IgG1 или IgG4 или их комбинациям, сохраняющим высокое связывание Fc-рецептора и низкое связывание С1 (С1q), эффективным в клиренсе профибрилл Аβ и уменьшающим риск воспаления.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Болезнь Альцгеймера (AD) является прогрессирующим и необратимым нейродегенеративным нарушением, вызывающим когнитивные, связанные с памятью и поведенческие нарушения. Она является наиболее обычной причиной деменции в популяции пожилого возраста, поражающей приблизительно 5% популяции с возрастом 65 лет и 20% с возрастом 80 лет. AD характеризуется незаметно подкрадывающимся появлением и прогрессирующей деградацией множественных когнитивных функций. Невропатология включает в себя как внеклеточные, так и внутриклеточные аргирофильные белковые отложения. Внеклеточные отложения, называемые невритными бляшками, в основном состоят из амилоидного бета-белка (Aβ), окруженного дистрофическими невритами (набухшими, искаженными выступами нейронов). Aβ в этих внеклеточных отложениях могут окрашиваться определенными красителями, например, Конго Красным, и обнаруживают фибриллярную ультраструктуру. Эти характеристики, приобретаемые Aβ в его фибриллярной структуре в невритных бляшках, являются определением общего термина «амилоид». Это классическое патологическое изменение AD является нейрофибриллярным клубком (NFT), который состоит из волокнистых структур, называемых спаренными спиральными филаментами (PHFs), составленными из скрученных тяжей гиперфосфорилированного связанного с микротрубочками белка тау. Часто встречающиеся невритные бляшки и отложения нейрофибриллярных клубков в головном мозге являются диагностическими критериями для AD при проведении аутопсии. Головной мозг при AD также проявляет макроскопическую атрофию головного мозга, потерю нервных клеток, местное воспаление (микроглиоз и астроцитоз) и часто церебральную амилоидную ангиопатию (CAA) в стенках сосудов головного мозга.
Две формы Aβ-пептидов, Aβ40 и Aβ42, являются доминантными разновидностями в невритных бляшках AD, тогда как Aβ40 является важной разновидностью в цереброваскулярном амилоиде, связанным с AD. Ферментативные активности позволяют Aβ непрерывно образовываться из большего белка, называемого амилоидным белком-предшественником (APP) как в здоровых, так и в пораженных AD субъектах во всех клетках тела. Два основных события процессинга APP посредством активностей β- и γ-секретаз делает возможным образование Aβ, тогда как третий фермент, называемый α-секретазой, предотвращает генерирование Aβ расщеплением внутри последовательности Aβ (Selkoe, 1994; Ester 2001; US5604102). Aβ42 является пептидом из сорока двух аминокислот, т.е. на две аминокислоты более длинным на С-конце в сравнении с Aβ40. Aβ42 является более гидрофобным и действительно более легко агрегируется в более крупные структуры Aβ-пептидов (Jarret 1993), такие как Aβ-димеры, Aβ-тримеры, Aβ-тетрамеры, Aβ-олигомеры, Aβ-протофибриллы или Aβ-фибриллы. Aβ-фибриллы являются гидрофобными и нерастворимыми, тогда как другие структуры являются менее гидрофобными и растворимыми. Все эти более высокомолекулярные пептиды Aβ индивидуально определяются на основе из биофизического и структурного вида, например, в электронной микроскопии, и их биохимических характеристик, например, анализом при помощи вытеснительной хроматографии/вестерн-блоттинга. Эти пептиды Aβ, в частности, Aβ42, будут постепенно собираться в различные более высокомолеклярные структуры Aβ на протяжении продолжительности жизни. AD, которая является в сильной степени зависимым от возраста нарушением, будет встречаться раньше в жизни, если этот процесс сборки происходит более быстро. Это является центральной частью «гипотезы амилоидного каскада» AD, которая заявляет, что процессинг APP, уровни Aβ42 и их сборка в более высокомолекулярные структуры являются центральной причиной AD. Вся другая невропатология головного мозга больных AD и симптомы AD, такие как деменция, каким-то образом вызываются Aβ или его собранными формами.
Aβ может существовать в различных длинах, т.е. 1-39, 1-40, 1-42 и 1-43, и размерах фрагментов, т.е. 1-28 и 25-35. Укорочения могут иметь место на N-конце этого пептида. Все эти пептиды могут агрегироваться и образовывать растворимые промежуточные продукты и нерастворимые фибриллы, причем каждая молекулярная форма имеет уникальную структурную конформацию и биофизические свойства. Например, мономерный Aβl-42 является растворимым и нетоксичным пептидом с длиной 42 аминокислоты, который, как предполагается, участвует в нормальной функции синапса. При определенных условиях, Aβ1-42 может агрегироваться в димеры, тримеры, тетрамеры, пентамеры до 12-мерных и более высокоолигомерных форм, все из которых имеют различные физико-химические свойства, такие как молекулярный размер, ЭМ-структура и молекулярная форма в AFM (микроскопии на основе атомных сил). Примером более высокомолекулярной растворимой олигомерной формы Aβ является протофибрилла (Walsh 1997), которая имеет среднюю молекулярную массу >100 кДа и криволинейную структуру 4-11 нм в диаметре и <200 нм в длину. Недавно было продемонстрировано, что растворимые олигомерные Aβ-пептиды, такие как протофибриллы Aβ, нарушают долгосрочное потенциирование (LTP), показатель синаптической пластичности, который, как предполагается, отражает формирование памяти в гиппокампе (Walsh 2002). Кроме того, олигомерные Аβ-пептиды Arctic проявляют гораздо большее ингибирующее действие, чем wtAβ, на LTP в головном мозгу, по-видимому, вследствие их сильной склонности к образованию протофибрилл Aβ (Klyubin 2003).
Имеются также другие растворимые олигомерные формы, описанные в литературе, которые заметно отличаются от протофибрилл. Одной такой олигомерной формой является ADDL (полученный из амилоида диффундируемый лиганд) (Lambert 1998). AFM-анализ ADDL выявил преимущественно малые глобулярные виды 4,7-6,2 нм вдоль z-оси с молекулярными массами 17-42 кДа (Stine 1996). Другая форма названа ASPD (Амилоидсфероиды) (Hoshi 2003). ASPD являются сферическими олигомерами Aβ1-40. Исследования токсичности показали, что сферические ASPD >10 нм были более токсичными, чем более низкомолекулярные формы (Hoshi 2003). Эта идея получила поддержку из недавнего открытия мутации АРР Arctic (E693), которая вызывает раннее появление AD (US 2002/0162129 Al; Nilsberth et al., 2001). Эта мутация локализована внутри последовательности пептида Aβ. Носители мутации будут посредством этого генерировать варианты пептидов Aβ, например, Arctic Aβ40 и Arctic Aβ42. Как Arctic Aβ40, так и Arctic Aβ42 будут гораздо более легко собираемыми в более высокомолекулярные структуры, т.е. протофибриллы. Таким образом, патогенный механизм мутации Arctic предполагает, что эти растворимые, высокомолекулярные протофибриллы вызывают AD и содержит специфический уникальный эпитоп, т.е. “эпитоп болезни AD”.
В головном мозге в случае болезни Альцгеймера (AD) внеклеточные амилоидные бляшки обычно обнаруживают в паренхиме и стенках сосудов. Эти бляшки состоят из амилоида (гидрофобных и самоагрегирующихся пептидов Aβ38-43 с длиной 38-43 аминокислот, которые постепенно полимеризуются перед отложением бляшек). Было сделано предположение, что растворимые олигомерные разновидности Aβ являются лучшими коррелятами заболевания, чем сами амилоидные бляшки (McLean et al., 1999; Nаslund et al., 2000). Было показано, что среди этих префибриллярных промежуточных разновидностей Aβ олигомерные формы вызывают вредные биологические эффекты как in vitro, так и in vivo (Walsh et al., 2002) и, следовательно, могут играть центральную роль в патогенезе заболевания. Известно несколько разновидностей олигомерных Aβ с различными молекулярными размерами. Важно, что конформации мономерных, олигомерных и фибриллярных форм Aβ являются различными и могут быть мишенями конформационно селективных антител. Идентичность основного патогена Aβ не выяснена, хотя некоторые данные предполагают, что высокомолекулярные олигомеры Aβ являются особенно нейротоксичными (Hoshi et al., 2003).
Были описаны патогенные мутации гена амилоидного белка-предшественника (АРР), вызывающие раннее появление AD. Одна из них, мутация АРР Swedish (Mullan et al., 1992), вызывает увеличенные уровни Aβ. Было обнаружено, что другая мутация АРР Arctic (E693G), расположенная в домене Aβ, усиливает образование протофибрилл, больших олигомеров Aβ, что предполагает, что эти промежуточные продукты Aβ являются особенно патогенными (US 2002/0162129 Al; Nilsberth et al., 2001). Идентификация мутации АРР и выяснение токсических действий в отношении протофибрилл Aβ заставили сосредоточить внимание на олигомерах Aβ в патогенезе AD.
Активная иммунизация в качестве терапевтической стратегии для болезни Альцгеймера была впервые сообщена Schenk et al. 1999. Мишенью этой стратегии иммунизации была фибриллярная форма Aβ, обнаруженная в бляшках болезни Альцгеймера. Недавнее исследование клинической фазы I/II активной вакцинации Aβ, использующей фибриллизированный Aβ в качестве вакцины (AN-1792), должно было быть приостановлено вследствие менингоэнцефалита в небольшом количестве пациентов (Bayer et al., 2005). Побочные действия, наблюдаемые в этом исследовании, были, по-видимому, вызваны анти-Aβ-антителами, реагирующими против фибриллярного амилоида в стенках сосудов. Этот фибриллярный амилоид в САА находится в тесной близости с гематоэнцефалическим барьером (ВВВ), и, следовательно, реакция антиген-антитело могла генерировать повреждение ВВВ, приводя к инфильтрации Т-лимфоцитов в ЦНС (Pfeifer et al., 2002; Racke et al., 2005). Кроме того, только небольшая часть участвующих пациентов обнаруживала иммунную реакцию на эту вакцину Aβ. Хотя это исследование было закончено преждевременно, оно позволяет предполагать, что активная иммунизация Aβ может быть полезной только для субпопуляции пациентов с AD.
Были описаны моноклональные антитела, селективные в отношении протофибрилл Aβ человека (US 2002/0162129 Al). Способ генерирования высокоочищенных и стабильных протофибрилл Aβ человека включает в себя использование синтетических пептидов Aβ с мутацией Arctic (Glu22Gly). Эта мутация облегчает иммунизацию и скрининг гибридом на селективные в отношении протофибрилл Aβ антитела. Важно, что эти антитела связывают как протофибриллы Aβ дикого типа, так и протофибриллы Aβ-Arc (PCT/SE 2005/000993).
Были описаны антитела, которые являются селективными в отношении других конформаций Aβ, таких как фибриллы Aβ (O'Nuallain 2002), мицеллярный Aβ (Kayed 2003), ADDL (Lambert 2001). Однако ни одни из них не являются селективными в отношении протофибрилл Aβ.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к улучшенным антителам, т.е. имеющим высокую аффинность (менее 10-7 М), селективным в отношении протофибрилл Aβ антителам класса IgG и подкласса IgG1 или IgG2 или их комбинации, или их мутациям, с уменьшенным риском воспаления, для улучшенной профилактики, лечения и диагностики болезни Альцгеймера, синдрома Дауна или других нейродегенеративных нарушений. Указанные антитела были разработаны классическими гибридомными способами и генной инженерией антител.
Это изобретение раскрывает консенсусную аминокислотную последовательность районов CDR1-3 на цепях VL и VH из антител, которые селективно связывают олигомерные формы Aβ, т.е. профибриллы Aβ, составляющие “эпитоп болезни Альцгеймера”, объединенную с модификациями Fc-района для уменьшения риска активации комплемента и воспаления.
Константная область антитела имеет многие важные функции, в особенности связывание рецепторов Fc и фактора комплемента С1q. Последнюю функцию инактивировали во избежание воспалительных реакций.
Таким образом, этот тип высокоаффинных селективных в отношении протофибрилл антител имеет явные преимущества в сравнении с другими известными иммунотерапевтическими способами лечения:
1) действует на заболевание, объединяясь с протофибриллами Aβ с высокой аффинностью,
2) уменьшает риск воспалительных побочных эффектов, т.е. менингоэнцефалита, вследствие низкого связывания или отсутствия связывания с фактором комплемента С1q,
3) высокоаффинное антитело уменьшает клиническую дозу, необходимую для эффективного лечения,
4) обеспечивает способ с точным дозированием,
5) меньшее связывание антитела с фибриллами Aβ в стенке кровеносных сосудов, т.е. САА, уменьшающее риск в отношении воспалительных побочных эффектов,
6) меньшее количество антител связываются в периферии, следовательно, большее количество антител будут пересекать гематоэнцефалический барьер и будут доступными для связывания и элиминации олигомерных форм Aβ в головном мозге.
Одним аспектом этого изобретения является раскрытие консенсусной аминокислотной последовательности антитела районов CDR, которые связывают протофибриллы Aβ дикого типа человека (пример 1). Это раскрытие определяет сайты связывания (районы CDR), которые придают высокую аффинность и высокую селективность в отношении протофибрилл Aβ человека дикого типа, для использования в качестве терапевтических средств или диагностических средств. Основная структура молекулы иммуноглобулина (IgG) содержит две идентичные легкие цепи и две идентичные тяжелые цепи, связанные вместе дисульфидными мостиками (фигура 1). Легкая цепь, которая является либо лямбда, либо каппа, имеет вариабельную область (VL) и константную область (CL) из приблизительно 110 аминокислотных остатков, каждая. Тяжелая цепь имеет вариабельную область (VH) из приблизительно 110 аминокислотных остатков, но гораздо большую константную область (CH) из 300-400 аминокислотных остатков, содержащую районы или домены CHγl, CHγ2 и CHγ3.
Константная область (Fc) активирует систему комплемента и связывается с рецептором Fc на макрофагах, микроглии и нейтрофилах, которые поглощают и разрушают инфицирующие микроорганизмы или чужеродные/неаутологичные антигены. Эта функция имеет особенно важное значение, так как она является частью терапевтического принципа этого антитела, т.е. опосредованного рецептором Fc микроглиального фагоцитоза и клиренса протофибрилл Aβ. Другими опосредуемыми антителом механизмами клиренса являются также оперативные, т.е. противоагрегирующие свойства Aβ-антител и клиренс протофибрилл Aβ в периферии, в соответствии с гипотезой стока. Вариабельная область тяжелой и легкой цепей содержит 3 гипервариабельных района, называемых определяющими комплементарность районами или CDR. Эти районы CDR являются короткими участками с длиной приблизительно 13-23 аминокислот, расположенными в областях VL и VH. Шесть районов CDR на одном «плече» антитела образуют «карман», который связывает антиген. Фигура 1 показывает эту основную структуру иммуноглобулина IgG и его субдоменов.
Другой аспект этого изобретения относится к селективным в отношении протофибрилл антителам высокой аффинности. Описаны аффинности в диапазоне 10-7 М, предпочтительно 10-8 М, даже менее чем 10-9 М, менее чем 10-10 М, или менее чем 10-11 М в отношении протофибрилл (пример 2). Эти антитела имеют то преимущество, что они могут вводиться при более низких дозах в сравнении с антителами с аффинностями в диапазоне 10-6 М. Это имеет существенное клиническое преимущество, заключающееся в том, что эти высокоаффинные антитела, которые вводят инъекцией, могут предоставляться подкожно, так как только низкое количество этого антитела требуется для достижения эффективности. Способы введения не ограничиваются подкожными инъекциями. Кроме того, более низкие дозы, необходимые для эффективности, будут уменьшать расходы на покупку материалов для получения этого антитела.
Другой аспект этого изобретения заключается в том, что эти антитела являются антителами класса IgG, подходящего для терапевтического использования, так как IgG может проходить через гематоэнцефалический барьер. Клиренс протофибрилл Aβ в паренхиме головного мозга достигается опосредованным Fc-рецептором фагоцитозом клетками микроглии. По-видимому, действуют также и другие механизмы клиренса анти-Aβ-антител. Этот клиренс растворимых протофибрилл Aβ является центральным механизмом этого лечения. Протофибриллы Aβ считаются высоко нейротоксичными, запускающими процесс заболевания и управляющими процессом заболевания. Клиренс протофибрилл Aβ в головном мозге имеет существенное клиническое значение. Кроме клиренса протофибрилл Aβ, другие олигомерные формы Aβ, в том числе фибриллы Aβ, будут снижаться непосредственно посредством удаления протофибрилл Aβ, так как различные агрегированные формы Aβ, т.е. димеры, тримеры, тетрамеры и более высокие олигомерные формы, в том числе протофибриллы и фибриллы, находятся в равновесии. Пример уменьшения бляшек, которые содержат фибриллы Aβ, показан в модели болезни Альцгеймера трансгенной мыши (APPswe) после 72-часовой обработки высокоаффинным селективным в отношении протофибрилл антителом (mAb 158) (пример 3). Таким образом, клиренс протофибрилл Aβ указанным антителом будет также выгодным для опосредованного уменьшения других агрегированных или олигомерных форм Aβ.
Еще одним аспектом этого изобретения является высокоаффинное селективное в отношении протофибрилл человека антитело подкласса IgG1, которое имеет высокую аффинность в отношении рецепторов FcγRI человека, присутствующих на микроглиальных клетках в головном мозге. Высокоаффинное антитело будет приводить к эффективному клиренсу протофибрилл Aβ, что будет иметь существенную терапевтическую пользу. Таким образом, эти антитела будут обнаруживать клиренс протофибрилл Aβ как в ЦНС, так и в периферии в сравнении с другими иммунотерапевтическими стратегиями, такими как вакцинация или лечение моноклональными антителами с использованием других моноклональных антител подкласса IgG1, мишенями которых являются другие формы Aβ. Важно, что это лечение будет эффективным рано в процессе этого заболевания, когда токсичные растворимые разновидности Aβ, такие как протофибриллы Aβ, присутствуют при повышенных уровнях, но также и позднее в процессе этого заболевания. Повышенные уровни олигомерных форм Aβ были описаны в трансгенной мышиной модели, обнаруживающей мутации Swedish и Arctic APP swearc (Lord A. et al. 2006).
Еще одним аспектом этого изобретения является то, что высокоаффинные селективные в отношении протофибрилл Aβ антитела могут снижать или ингибировать агрегацию Aβ, уменьшая посредством этого уровни растворимых олигомерных форм Aβ в головном мозге.
Кроме того, другим аспектом этого изобретения является то, что высокоаффинные селективные в отношении протофибрилл Aβ антитела могут связывать олигомерные формы Aβ, т.е. протофибриллы Aβ, также вне ЦНС, смещая посредством этого равновесие указанных форм Aβ через гематоэнцефалический барьер таким образом, что уровни в ЦНС указанных форм Aβ снижаются (дренаж).
Как обсуждалось выше, клиническое исследование Elan с использованием вакцины Aβ (AN-1792), селективной в отношении фибрилл Aβ, для лечения пациентов с болезнью Альцгеймера приводило к побочному действию, т.е. менингоэнцефалиту, в 6% этих случаев. Стратегия нацеливания на фибриллы Aβ, которые являются сердцевиной амилоидных бляшек, присутствующих в паренхиме головного мозга, но, что является важным, также в стенках кровеносных сосудов, приводила к тяжелым побочным эффектам. Эти побочные эффекты были, наиболее вероятно, вызваны связыванием этих антител с САА (церебральной амилоидной ангиопатией) в стенках сосудов головного мозга, начинающим воспалительный процесс. Эта существенная клиническая проблема устраняется улучшенными высокоаффинными селективными в отношении протофибрилл антителами с уменьшенной активностью активации комплемента. Эти антитела будут сохранять высокую эффективность клиренса протофибрилл Aβ, уменьшая риск побочных эффектов, т.е. менингоэнцефалита.
Другой аспект этого изобретения заключается в том, что высокоаффинные селективные в отношении протофибрилл Aβ антитела имеют низкое связывание фибрилл Aβ (см. пример 2), уменьшая риск побочных действий, но меньшее связывание с фибриллами Aβ, присутствующими в САА.
Еще один аспект этого изобретения заключается в том, что конструируют высокоаффинные селективные в отношении протофибрилл Aβ IgG-антитела для уменьшения связывания фактора комплемента С1q с доменом CH2 IgG1 и уменьшения активации комплемента и риска воспаления. Эта модификация может выполняться несколькими различными путями. Одним путем является получение химерного антитела, где домен CHγ2 константной области IgG1 был удален и заменен соответствующим доменом из IgG4 или частью домена, которая придает способность связывания С1q. Хорошо установлено, что IgG4 не связывает С1q и, следовательно, не активирует каскад комплемента. Для достижения этого константную область тяжелой цепи (СН) конструируют таким образом, чтобы объединить высокоаффинный домен Fc-рецептора (CHγ3) на IgG1 с доменом (CHγ2) IgG4, который не может связываться с фактором комплемента С1q. Это новое антитело, содержащее химерную константную область тяжелой цепи (IgG1:CHγ1, CHγ2:IgG4, CHγ3:IgGl), будет иметь важные свойства как эффективного клиренса протофибрилл Aβ через опосредованный Fc-рецептором фагоцитоз, так и уменшенный риск побочных действий, т.е. воспаления, такого как менингоэнцефалит.
Еще одним путем уменьшения риска воспаления является изменение структуры олигосахаридов этого антитела, которая будет уменьшать связывание фактора С1q и активацию комплемента. Были описаны 30 различных структур комплексных биантенных олигосахаридов при Asn-297 в IgG1 человека. Считается, что СН2-ассоциированные углеводы вызывают конформационное изменение в «шарнирной» области антитела, уменьшая эффективности взаимодействия с эффекторными молекулами и потерю функции активации комплемента и связывания С1q.
Эта модификация высокоаффинного селективного в отношении протофибрилл Aβ человека антитела сайт-направленным мутагенезом Asn-297 в любую другую аминокислоту будет генерировать антитело с сохраненным связыванием Fc-рецептора с меньшим связыванием С1q и, следовательно, уменьшенным риском воспаления, в частности, в гематоэнцефалическом барьере. Альтернативой модификации гликозилирования на этом антителе является экспрессия этого антитела в клеточном типе, в котором был инактивирован фермент N-aцетилглюкозаминилтрансфераза I. Это даст антитело с измененной углеводной структурой при Asn-297. Образуется структура Man5GlcNAc2, но не только эта структура. Эта углеводная модификация будет уменьшать связывание фактора С1q и ингибировать воспаление (Wright at al. 1998). Альтернативно, гликозилированные селективные в отношении протофибрилл антитела могут быть получены культивированием клеток, экспрессирующих антитела, в присутствии туникамицина, который ингибирует гликозилирование. Эти антитела будут иметь измененную активность активации комплемента, а также измененную функцию Fc-рецептора (Leatherbarrow el al. 1985). Скрининг клонов, экспрессирующих антитела с низкой активацией комплемента и высоким связыванием Fc-рецептора, будет генерировать селективные в отношении протофибрилл антитела, которые обнаруживают высокий Fc-опосредованный клиренс профибрилл Aβ и низкое связывание С1q.
Еще одним аспектом этого изобретения является высокоаффинное селективное в отношении протофибрилл антитело человека, подкласса IgG1, где был модифицирован сайт связывания фактора С1q, т.е. Pro33l>Ser331 (Xu et al. 1994) таким образом, чтобы уменьшить или ингибировать связывание фактора комплемента С1q, для лечения или предупреждения AD. Остаток пролина в положении 331 IgG1 человека может быть изменен на треонин или глицин или любую другую полярную аминокислоту. Эта модификация может быть получена стандартными способами молекулярной биологии, такими как сайт-направленный мутагенез или делеции ДНК.
Другим аспектом этого изобретения является применение высокоаффинных селективных в отношении протофибрилл Aβ человека антител для специфического определения уровней протофибрилл в тканях человека, в частности в цереброспинальной жидкости, крови, моче или слюне, в качестве диагностического инструмента или биомаркера в отношении болезни Альцгеймера. Уровни протофибрилл Aβ человека в CSF или крови являются, по-видимому, отличающимися в сравнении с соответствующей пожилой контрольной группой, не имеющей болезни Альцгеймера. Человек с развивающейся болезнью Альцгеймера, по-видимому, имеет увеличенные уровни протофибрилл в CSF или в крови. Таким образом, посредством определения уровней протофибрилл Aβ в CSF или крови может быть выполнена ранняя диагностика этого заболевания. Это может быть достигнуто с новыми высокоаффинными селективными в отношении протофибрилл Aβ антителами в комбинации со способом сэндвич-ELISA (пример 2А), где протофибриллы Aβ определяли до уровня 10 пМ. Интерференция других форм Aβ, таких как фибриллы Aβ, мономеры Aβ и фрагменты Aβ (1-16; 17-40) в этом анализе, составляет 10% или менее.
Это изобретение дополнительно относится к применению высокоаффинных специфических в отношении протофибрилл антител для определений протофибрилл Aβ в тканях человека и животных, таких как, например, цереброспинальная жидкость, кровь, сыворотка, моча и ткань головного мозга, но не только в этих тканях, обеспечивающему возможный диагностический способ для болезни Альцгеймера. Подходящими способами для анализа протофибрилл в этих тканях, а также в культурах клеток, использующими антитело против протофибрилл Aβ, являются иммуноанализы, такие как ELISA, RIA, вестерн-блоттинг или дот-блоттинг. Этот способ мог бы применяться для прослеживания эффективности лечения (уменьшения протофибрилл) в клинических исследованиях и быть пригодным в качестве диагностического теста на болезнь Альцгеймера или синдрома Дауна.
Поскольку уровни протофибрилл Aβ являются очень низкими в CSF и крови, в диагностическом тесте на основе способа ELISA необходимо высокоаффинное селективное в отношении протофибрилл антитело для возможности измерения очень низких уровней протофибрилл Aβ. Другие сверхчувствительные способы, такие как лигирование на основе близости (пример 4) (Gullberg 2004) или аналогичные системы амплификации или Biacore или сходные способы, могут быть использованы для увеличения чувствительности. Способ лигирования на основе близости основан на обнаружении того, что различные антитела, индуцированные против различных эпитопов на аналите (в этом случае на белке), могут связываться вблизи каждого из них на указанном аналите. Если указанные различные антитела конъюгируют с олигонуклеотидами, расстояние между указанными олигонуклеотидами будет достаточно коротким для того, чтобы олигонуклеотид-коннектор, при помощи компонентов лигирования, образовал мостик между этими олигонуклеотидами. Добавляют также компоненты амплификации, после чего может выполняться ОТ-ПЦР. По этому принципу генерируют амплифицируемую ДНК-последовательность, отражающую идентичность и количество белка-мишени. Этот способ позволяет получать усиленную реакцию сигнала и, следовательно, детектировать более низкие концентрации аналита.
Авторы данного изобретения неожиданно обнаружили, что модифицированный способ лигирования на основе близости может быть также использован с их специфическими в отношении протофибрилл Aβ антителами для детектирования низких концентраций более крупных структур Aβ-пептида, т.е. протофибрилл Aβ, но не мономеров Aβ. Они обнаружили, что Aβ-пептиды, в конформации протофибрилл, обнаруживают структуру (повторяющиеся звенья), которая делает возможным для двух антител, в соответствии с данным изобретением, достаточное связывание поблизости друг от друга на этой протофибрилле. Если указанные антитела конъюгируют с олигонуклеотидами, указанные олигонуклеотиды могут быть связаны мостиками с использованием олигонуклеотида-коннектора. Выполняют ПЦР с использованием компонентов амплификации. По этому принципу генерируют амплифицируемую ДНК-последовательность, отражающую идентичность и количество протофибриллы-мишени (см. фиг. 4А).
Лигирование на основе близости или версия этого способа, называемая «катящимся кольцом», является высокочувствительным способом и особенно хорошо подходящим для детектирования полимерных структур с повторяющимися последовательностями, таких как протофибриллы Aβ, при использовании для диагностики болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных нарушений.
Это изобретение относится дополнительно к применению высокоаффинных специфических в отношении протофибрилл антител в томографии для детектирования, определения местоположения и количественного определения протофибрилл Aβ в тканях человека и животных. Это антитело может быть помечено радиоактивным лигандом, таким как I131, C14, H3 или галлий68, но без ограничения этими радиоактивными изотопами, для целей детектирования. Этот способ будет пригоден в качестве диагностического инструмента для болезни Альцгеймера или синдрома Дауна.
Еще одним аспектом этого изобретения является получение разновидностей антител, специфических для применения в ветеринарии. Эти диагностические способы описаны также для применения в ветеринарии.
Другим аспектом этого изобретения является гуманизация указанных антител во избежание побочного действия, т.е. во избежание иммунной реакции против указанных антител в людях при использовании в качестве терапевтического или диагностического агента.
Другим аспектом является приготовление этого антитела в физиологическом буфере, например, ЗФР, подходящем для введения людям и животным. Этот содержащий антитело продукт может быть лиофилизирован для лучшей стабильности. Лиофилизированная готовая форма может содержать эксципиент, например, маннит, но не ограничивающийся маннитом, для стабилизации этого продукта после лиофилизации.
Этот продукт антитела может содержать антибактериальный агент.
Антитела или фрагменты в соответствии с этим изобретением могут иметь делеции, замены и инсерции аминокислот в указанных CDR-районах и/или их каркасе. Встроенными или замененными аминокислотами могут быть также производные аминокислот при условии, что аффинность и специфичность этого антитела все еще является интактной.
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры приведены для иллюстрации и не предназначены для ограничения этого изобретения этими конкретными примерами.
Пример 1
Селективные в отношении протофибрилл Aβ моноклональные антитела дикого типа человека клонировали и секвенировали. Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL) показаны в таблице 1. Положения CDR-районов 1-3 подчеркнуты и показаны также в таблицах 2 и 3. Аминокислотные последовательности этих CDR-районов образуют структурную основу для связывания протофибрилл Aβ дикого типа, составляющую «эпитоп болезни Альцгеймера».
Аминокислотная последовательность CDR-районов 1-3 цепей VL и VH для высокоаффинного специфического в отношении профибрилл антитела BA9/158 показана в таблицах 1, 2 и 3. Данные секвенирования других селективных в отношении протофибрилл антител (BA2, BA3, BA4 и BA7) обеспечивают альтернативные аминокислотные последовательности CDR-районов, но не ограничиваются ими. Объединенные аминокислотные последовательности районов CDR1-3 цепей VH и VL создают молекулярный «карман», который связывает протофибриллы Aβ дикого типа человека с высокой аффинностью и специфичностью. Этот «карман» образует структурную основу для «эпитопа болезни Альцгеймера». Вариации в длине аминокислотных последовательностей CDR, наблюдаемые как в цепи VH, так и в цепи VL, являются совместимыми с протофибриллами Aβ человека (таблицы 2 и 3). Более короткий CDR-район обеспечивает более ограниченную трехмерную структуру кармана связывания этого антитела, в то время как более длинный является более гибким.
Авторы изобретения заявляют как последовательности CDR, показанные в таблицах 1, 2 и 3, так и аминокислотные последовательности в областях «мышиного каркаса» цепей VH и VL, т.е. вне CDR-районов, а также каркасных областях VL и VH человека для специфических в отношении протофибрилл антител, показанных в таблице 4 и 5, но не ограничивающиеся ими.
Аминокислотная последовательность каркасного района областей VL и VH 1-3 VL- и VH-цепей из высокоаффинного специфического в отношении протофибрилл антитела BA9/158 показана в таблице 4 и 5.
Другие аминокислотные замены в CDR-районах, чем те, которые показаны в таблицах 1, 2 и 3, являются совместимыми с высокой аффинностью и высокой специфичностью связывания с протофибриллами Aβ дикого типа человека. Если полярная аминокислота присутствует в конкретном положении в CDR-районе, эта конкретная аминокислота может быть заменена другой полярной аминокислотой с сохраненной или улучшенной высокой аффинностью и специфичностью связывания с протофибриллами Aβ. Подобным образом, если неполярная или отрицательно или положительно заряженная аминокислота присутствует в определенном положении, эта аминокислота может быть заменена сходной аминокислотой из той же самой группы. Конкретную аминокислоту или конкретные аминокислоты заменяют также в любом положении в CDR-районах функциональными эквивалентами, которые придают аналогичную функцию и структуру этому антителу.
Пример 2. Характеристика высокоаффинного селективного в отношении протофибрилл Aβ дикого типа человека моноклонального антитела при помощи ELISA
Пример 2 показывает высокоаффинное селективное в отношении протофибрилл антитело, которое перекрестно реагирует в 200-100 раз менее с мономерами Aβ и менее, чем в 40 раз, с фибриллами Aβ, как измерено сэндвич-ELISA (фиг. 2,А). На основании экспериментов с конкурентным ELISA это антитело имеет высокую аффинность в отношении протофибрилл дикого типа AB42 человека, но только очень слабую аффинность в отношении N-концевой части пептида Aβ и мономеров Aβ. Связывания не наблюдали с С-концевым фрагментом Aβ (фиг. 2,B). Кроме того, это антитело не реагирует перекрестно с другими типами амилоидов, такими как медин или транстиретин. Кроме того, это антитело не узнает АРР человека, обильный предшественник Aβ.
На фигуре 2,А показан сэндвич-ELISA. Антитело 158 было нанесено в виде покрытия в лунки и затем различные формы Aβ добавляли в лунки в увеличивающихся концентрациях. Измерение связанных форм A,β выполняли добавлением биотинилированного mAb 158 и HRP-меченого стрептавидина. Развитие окраски измеряли в соответствии с процедурой, рекомендованной изготовителем.
На фигуре 2,В показан конкурентный ELISA. Планшет ELISA покрывали протофибриллами Aβ человека. Затем антитело 158 инкубировали с увеличивающимися количествами различных форм Aβ (конкуренция). Инкубационную смесь добавляли в лунки этого микротитрационного планшета и свободному антителу давали связываться с иммобилизованными протофибриллами в этих лунках. Связанное антитело 158 измеряли вторым антителом с использованием стандартных процедур.
Пример 3
Эффективность высокоаффинного селективного в отношении протофибрилл Aβ антитела определяли в трансгенной мышиной модели болезни Альцгеймера (APPswe) посредством острой внутричерепной инъекции. Трансгенные мыши, используемые для оценки эффективности, экспрессировали АРР человека с мутацией Swedish (APPSwe). В этом примере антитела инъецировали непосредственно в богатые бляшками участки паренхимы головного мозга и действия на неврологию оценивали спустя 72 часа (Wilcock et al., 2003). Другие исследования показали, что прямое применение анти-Aβ-антител приводит к быстрому клиренсу амилоидных отложений in vivo (Bacskai et al., 2001; Brendza et al., 2005). Инъекция высокоаффинного селективного в отношении протофибрилл Aβ антитела приводит к значимому уменьшению бляшек в модели мыши APPswe (фигура 3).
На фигуре 3 испытывали терапевтическую эффективность высокоаффинного селективного в отношении протофибрилл антитела в модели трансгенной мыши (APPswe). A: 14-месячной трансгенной мыши APPSwe интракраниально инъецировали ЗФР, и В: высокоаффинное селективное в отношении протофибрилл антитело (158) при 1 мкг/мкл и испытывали спустя 72 часа после инъекции. Заметный клиренс нагрузки Aβ был обнаружен в подлежащей ткани вблизи места инъекции (B; стрелка) в сравнении с контрольной стороной (A; стрелка).
Пример 4
Лигирование на основе близости в комбинации с высокоаффинным селективным в отношении протофибрилл Aβ антителом для измерения протофибрилл Aβ
Протофибриллы Aβ дикого типа человека детектировали до диапазона 10 пМ, тогда как препарат мономеров Aβ вообще не детектировался. Комбинирование сверхчувствительного способа лигирования на основе близости и высокоаффинного антитела является особенно выгодным, так как оно обеспечивает систему для определения только олигомерных форм аналита, которая особенно пригодна при диагностике болезни Альцгеймера и других заболеваний с «агрегацией белка», например, вызываемых прионами заболеваний, болезни Крейтцфельда-Якоба, амилоидоза и болезни Паркинсона.
На фигуре 4 протофибриллы Aβ человека измеряют при пМ-уровнях способом лигирования на основе близости. Анализ лигирования на основе близости: Описание способа: (из Gullberg et al., 2004): стадия 1 - инкубирование пробы с парой зондов близости (~1 ч); стадия 2 - добавление всех компонентов, необходимых для лигирования и детектирования количественной ПЦР (время лигирования ~5 мин). В этом анализе использовали высокоаффинное селективное в отношении протофибрилл моноклональное антитело; стадия 3 - количественная ПЦР (~2 ч). Препараты синтетического мономера Aβ и протофибрилл Aβ разбавляли и испытывали на их реактивность в анализе лигирования на основе близости, описанного выше.
Пример 5
mAb 158 не узнает общий амилоидный эпитоп
Было показано, что сообщенные ранее зависимые от конформации Aβ антитела связывают олигомеры и фибриллы других амилоидогенных белков, что предполагает наличие общего эпитопа, присутствующего на всех амилоидных агрегатах. Вследствие технических трудностей в генерировании протофибрилл из других амилоидогенных белков, чем Aβ, mAb158 тестировали вместо этого против различных амилоидных фибрилл. Для этих экспериментов использовали дот-блот-анализ, так как ELISA на основе ингибирования, где реакции антитело-антиген происходят в растворе, не пригоден для нерастворимых антигенов, таких как фибриллы. Однако дот-блот-анализ не пригоден для оценки специфичности антител в отношении разных форм Aβ, т.е. для измерения различий в селективности в отношении протофибрилл и фибрилл. Фибриллы медина, островкового амилоидного полипептида (IAPP) и α-синуклеина иммобилизовали на нитроцеллюлозной мембране для поддержания их нативных конформаций. mAbl58 не обнаруживал реактивности ни с одним амилоидом, другим, чем фибрилла Aβ (фиг. 5,A). Связывание mAb158 с фибриллами Aβ предполагает, что часть эпитопа протофибриллы Aβ присутствует также в структуре фибрилл Aβ. В качестве положительных контролей использовали антитела 6E10 (Aβ), pAbl79 (медин), pAbAl10 (IAPP) и mAb211 (α-синуклеин) (фиг. 5,B). Репрезентативные блоты из повторяемых экспериментов (n=3).
mAbl58 не связывает APP
Уровни APP и растворимых фрагментов APP обычно превышали уровни Aβ в биологических пробах, таких как CSF и гомогенат головного мозга, и, следовательно, перекрестная реактивность Aβ-антитела с APP могла ингибировать лечение связыванием с APP, приводя к меньшему количеству свободного антитела для связывания и элиминации протофибрилл Aβ и/или олигомеров Aβ. Она могла также нарушать измерения протофибрилл Aβ в биологических пробах при анализе Aβ сэндвич-ELISA. Для выяснения, связывается ли mAb158 с нативным APP, выполняли эксперименты с использованием иммунопреципитации. Культуральную среду HEK-клеток (контроль, APPSwe и APPArc-Swe) и гомогенаты головного мозга мыши (нетрансгенной, APPSwe и APPArc-Swe) иммунопреципитировали mAb158 или 6E10, с последующим денатурирующим вестерн-блоттингом с 6E10 в качестве детектирующего антитела (фиг. 5,C). Как видно на фигуре 5,C, mAbl58 не иммунопреципитировал αAPP из культуральной среды клеток или полноразмерный APP из гомогенатов головного мозга мыши, тогда как 6E10 иммунопреципитировал, как и ожидалось. Синтетические протофибриллы Aβ, используемые в качестве контроля, иммунопреципитировались равным образом хорошо обоими антителами (фиг. 5,С). Репрезентативные блоты из повторяемых экспериментов (n=3).
Пример 6
Установление специфического в отношении протофибрилл Aβ сэндвич-ELISA
Для обеспечения возможности измерений протофибрилл Aβ в биологических пробах был разработан сэндвич-ELISA с использованием mAbl58 в качестве как захватывающего, так и детектирующего антитела. Этот анализ измеряет протофибриллы Aβ с пределом детектирования 1 пМ и с линейным диапазоном 250 пМ (фиг. 6,А, линии указывают линейную регрессию калибровочных кривых). Вследствие неопределенности в отношении размера протофибрилл Aβ, используемых в калибровочной кривой, концентрация 1 пМ основывалась на молекулярной массе одного мономера Aβ (4514 г/моль), хотя, поскольку молекулярная масса протофибриллы была оценена как равная по меньшей мере 100 кДа, предел детектирования, рассчитанный как молярные протофибриллы Aβ, мог быть таким низким, как 50 фМ. Калибровочная кривая протофибрилл AβArc давала более низкий сигнал, чем протофибриллы Aβ дикого типа, возможно, вследствие различий в размере протофибрилл Aβ. (фиг. 6,A, 6,B). Использовали синтетический LMW-Aβ (низкомолекулярный Aβ) с определенными концентрациями. Под термином «низкомолекулярный Aβ» имеют в виду мономеры, димеры и триммеры Aβ, имеющие молекулярную массу приблизительно 4-12 кДа. Протофибриллы Aβ и Aβl-16 использовали для валидизации конформационной специфичности этого ELISA (фиг. 6,B), где использовали этот гидрофильный пептид Aβl-16, так как не ожидали, что он агрегируется. Этот анализ ELISA, состоящий из двух идентичных антител, требует по меньшей мере димера белка для продуцирования сигнала, и, как предсказывалось, Aβl-16 не детектировался mAbl58-сэндвич-ELISA даже при мкМ концентрациях (фиг. 6,B). При предобработке LMW-Aβ и протофибрилл Aβ 70% муравьиной кислотой (FA), которая, как известно, диссоциирует агрегированный Aβ на мономеры, этот сигнал сэндвич-ELISA был потерян (данные не показаны). Таким образом, детектирование LMW-Aβ при высоких нМ концентрациях (Fig 6B) обусловлено, возможно, малым содержанием агрегатов этого пептидного препарата.
Большой избыток мономерного Aβ, holoAPP и APP-фрагментов, природно-встречающийся в биологических пробах, мог бы препятствовать анализу протофибрилл Aβ занятием сайтов связывания захватывающей оболочки антитела, ингибируя связывание протофибрилл. Эту проблему исследовали добавлением увеличивающегося избытка Aβ1-16 к фиксированной концентрации протофибрилл Aβ (50 пМ, в расчете на мономерные звенья) и анализом этой проблемы с использованием как mAb158-ELISA, так и 6E10-6E10-сэндвич-ELISA (фиг. 6,C). 500000-кратный молярный избыток Aβ1-16, в сравнении с протофибриллами Aβ, не нарушал измерений с использованием mAbl58-сэндвич-ELISA, как и ожидалось, так как Aβl-16 связывается слабо с этим захватывающим антителом. В противоположность этому, 500-кратный избыток Aβ1-16 был достаточным для уменьшения сигнала в 6E10-6E10-ELISA, где Aβl-16 связывается с высокой аффинностью с захватывающим антителом (фиг. 6,C). Кроме того, при добавлении синтетических протофибрилл Aβ к контрольной культуральной среде клеток НЕК или гомогенатам головного мозга нетрансгенной мыши получали 90% этого сигнала (данные не показаны).
Пример 7
Измерение протофибрилл Aβ в биологических пробах
Было предположено присутствие протофибрилл Aβ в клетках и мышиных моделях, несущих мутацию Arctic, хотя до настоящего времени не было способа для прямого анализа протофибрилл Aβ в биологических пробах. Таким образом, mAbl58-сэндвич-ELISA обеспечивает первую возможность измерения уровня протофибрилл Aβ в таких клетках и мышиных моделях и сравнения их с моделями без внутренней мутации Aβ. Пробы из клеток и мышей, несущих только мутацию Swedish, сравнивали с калибровочной кривой протофибрилл Aβ дикого типа, тогда как пробы из клеток и мышей, экспрессирующих Aβ с мутацией Arctic, сравнивали с калибровочной кривой протофибрилл AβArc (фиг. 6,A). Для гарантии, что весь Aβ, измеренный в этом анализе, находился в растворимым состоянии, и для исключения какого-либо вмешательства со стороны фибрилл Aβ, все пробы центрифугировали в течение 5 минут при 17900 x g перед анализом. Группы клеточных сред от транзиторно трансфицированных APPSwe- и APPArc-Swe-HEK-клеток анализировали и сравнивали с контрольными культуральными средами НЕК-клеток. Уровни протофибрилл Aβ рассчитывали из калибровочных кривых (фиг. 6,A) в виде средней величины из трех повторностей и затем нормализовали относительно уровней АРР для компенсации в отношении различий в уровнях транскрипции (в соответствии с Stenh et al.). Концентрация протофибрилл Aβ в культуральных средах APPArc-Swe-HEK-клеток была равна 28 пМ (±2), значимо более высокая (p<0,0001), чем 8,2 пМ (±0,3), наблюдаемая в APPSwe (фиг. 7,A). В контрольных средах протофибриллы Aβ не детектировались. Уровни протофибрилл Aβ измеряли также в головном мозге из 10-месячных APPSwe- и APPArc-Swe-трансгенных мышей как с бляшками, так и с патологией с внутринейронным Aβ (в соответствии с Lord et al.). Головной мозг в каждом случае гомогенизировали в TBS и центрифугировали перед анализом для получения растворимой фракции Aβ. Аналогично этому анализу с использованием культуральных сред клеток, уровни протофибрилл Aβ значимо (р=0,005) различались между этими группами, с 397 пМ (±59) в головном мозгу APPArc-Swe- и 108 пМ (±14) в головном мозгу APPswе-трансгенных мышей (фиг. 7,B).
В вышеупомянутых фигурах (фиг. 6 и 7) исследовали следующее количество проб: контрольные клетки (n=3) и транзиторно трансфицированные APPSwe (n=8) и APPArc-Swe (n=11). Уровни протофибрилл Aβ в APPArc-Swe-средах были приблизительно в 9 раз более высокими, чем в средах APPSwe-средах, в то время как контрольные среды не давали сигнала (A). Измерения уровней протофибрилл Aβ в TBS-растворимой фракции гомогенатом головного мозга нетрансгенных мышей (n=6) сравнивали с трансгенными мышами (APPSwe, n=3, и APPArc-Swe, n=6) (B). Аналогично культуральным средам клеток, уровни протофибрилл Aβ APPArc-Swe-мышей были в 7 раз более высокими, чем в APPSwe-мышах. Столбики ошибок показывают ± SEM.
Пример 8
mAbl58 значимо снижает протофибриллы Aβ и общий Aβ в трансгенных мышах АРРswearc после i.p. введения
mAbl58 (12 мг/кг) инъецировали i.p. один раз в неделю в течение 18 недель в 9-10-месячных мышей APPswearc. После этого исследования головной мозг каждой мыши выделяли и гомогенизировали в TBS и затем центрифугировали для осаждения нерастворимого материала. Этот нерастворимый материал солюбилизировали в муравьиной кислоте. Таким образом, получали две фракции из головного мозга мыши, т.е. фракцию TBS и фракцию муравьиной кислоты. Уровни протофибрилл Aβ во фракциях TBS определяли при помощи ELISA. Обнаруживали значимое уменьшение протофибрилл Aβ в группе обработки mAbl58 в сравнении с группой плацебо (фиг. 8). Фигура 8 показывает уровни протофибрилл в экстрактах TBS головного мозга трансгенных мышей АРРswearc после 4-месячной обработки либо mAb158, либо плацебо.
Общий Aβ во фракции муравьиной кислоты определяли при помощи ELISA (муравьиную кислоту использовали для солюбилизации всех форм Aβ, чтобы сделать все формы Aβ детектируемыми). Значимое уменьшение общего Aβ наблюдали в группе обработки в сравнении с группой плацебо (фиг. 9). Фигура 9 показывает уровни общего Aβ в экстрактах TBS головного мозга трансгенных мышей АРРswearc после 4-месячной обработки либо mAb158, либо плацебо.
Примеры 9-11
Аббревиатуры
A аденин
Ab протокол биомедицинский протокол AERES
BHK почка детеныша хомячка
п.н. пары оснований
C стоградусная шкала
C цитозин
CHO яичник китайского хомячка
CMF не содержащая кальция и магния
COS 7 линия фибробластных клеток Африканской зеленой мартышки
dhfr дигидрофолатредуктаза
DMEM модифицированная по способу Дульбекко среда Игла
DMSO диметилсульфоксид
DNA дезоксирибонуклеиновая кислота
ELISA твердофазный иммуноферментный анализ
ФТС фетальная телячья сыворотка
г граммы
G гуанин
ч час
HRP пероксидаза хрена
IgG иммуноглобулин
K G или T (конвенция IUPAC)
LSAP большой растворимый амилоидный продукт
mAb моноклональное антитело
сек секунда
мин минута
M A или C (конвенция IUPAC)
MTX метотрексат
NIMR Национальный институт медицинских исследований (Великобритании (UK))
нм нанометр
OD оптическая плотность
ЗФР забуференный фосфатом солевой раствор
ПЦР полимеразная цепная реакция
R A или G (конвенция IUPAC)
RT комнатная температура
S C или G (конвенция IUPAC)
T тимин
УФ ультрафиолет
V вариабельный
V A или C или G (конвенция IUPAC)
VH вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина
VK вариабельная область легкой цепи каппа иммуноглобулина
W A или T (конвенция IUPAC)
Y C или T (конвенция IUPAC)
Материалы
Оборудование
Figure 00000001
Figure 00000002
Figure 00000003
Пример 9. ДНК-последовательность антитела 158
9.1 - Получение РНК
Быстро замороженные осадки клеток мышиной гибридомы 158 (флаконы, помеченные как 060824#158 5×106 клеток) получали посредством TAG 3 октября 2006 года. Эти клетки хранили в замороженном виде до обработки с использованием мидинабора Qiagen RNeasy для выделения РНК по протоколу изготовителей.
9.2 - Синтез 1-й цепи
Приблизительно 5 микрограммов РНК 158 подвергали обратной транскрипции с получением кДНК 158 с применением набора для синтеза 1-й цепи Amersham Biosciences в соответствии с протоколом изготовителей. Это повторяли для получения 3 независимых кДНК-продуктов (раунды 1, 2 и 3) во избежание мутаций ДНК вследствие реакции обратной транскриптазы (RT).
9.3 - Клонирование кДНК иммуноглобулина 158
кДНК гибридомы 158 амплифицировали при помощи ПЦР в 23 отдельных реакциях кДНК вариабельной области каппа-цепи (VK) иммуноглобулина амплифицировали с использованием 11 VK-праймеров (МКV1-11) в комбинации с праймером МКС константной области каппа (таблица 6). Аналогично, кДНК вариабельной области тяжелой цепи (VH) иммуноглобулина амплифицировали при помощи ПЦР с использованием 12 различных VH-праймеров (MHV1-12) в комбинации со смесью четырех праймеров константной области IgG (MHCG l/2a/2b/3: таблица 7).
Результатом начального набора ПЦР-реакций IgН был единственный продукт амплификации, полученный с использованием праймера MHV5. Ни одна из остальных 11 пар праймеров не давала продукта ПЦР. Продукт этой реакции ПЦР, праймированной олигонуклеотидными праймерами: MHV5 + (смесь MHCGl/2a/2b/3), лигировали в вектор pCR2.1®-TOPO® с использованием набора для клонирования TOPO-TA®. Результатом начального набора ПЦР-реакций IgK были два отдельных продукта амплификации с использованием праймеров MKV1 и MKV2 с MKC. Другие 9 пар праймеров не генерировали продукт. Продукты ПЦР-реакции, праймированной олигонуклеотидными праймерами: MKV1 или MKV2 + MKC, лигировали в вектор pCR2.1®-TOPO® с использованием набора для клонирования TOPO-TA®.
Бактерии E.coli TOP10, трансформированные этим лигированным вектором, клонировали на чашках с LB/ампициллин/Х-gal-агаром, выскребанием капилляром на агаровую сеточку и в смесь для ПЦР-скрининга. Эти клонированные плазмидные инсерты подвергали скринингу ПЦР-амплификацией. Продукты ПЦР подвергали гель-электрофорезу и идентифицировали клоны, продуцирующие продукт ПЦР-амплификации правильного размера (приблизительно 500 п.н.). Ночные культуры (5 мл) каждого клона обрабатывали с использованием протокола набора QIAprep Spin Miniprep, с получением мини-препаратов ДНК-плазмид.
9.4 - Определение последовательности кДНК
Полный цикл ОТ-ПЦР, клонирования и анализа последовательности ДНК повторяли для получения трех независимых наборов информации последовательности для каждой цепи иммуноглобулина. Плазмидные клоны из каждого независимого набора реакций ОТ-ПЦР секвенировали в обоих направлениях с использованием праймеров 1212 и 1233 (таблица 10). Плазмиды секвенировали с использованием набора BigDye® Terminator v. 3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (ABI), циклы повторяли на приборе GeneAmp9600 PCR и анализировали на капиллярном секвенаторе ABI 310.
9.5 - ДНК-последовательность VK 158
Последовательности клонов VK, генерированные с использованием праймеров ПЦР MKV2 и MKC в раундах 1 и 2 на кДНК 1-й цепи, были идентичны стерильному каппа-транскрипту из миеломного партнера слияния, такого как MOPC-21, SP2 и Ag8. Это стерильный транскрипт. Консенсусная последовательность (VK 158) клонов VK, генерированная с использованием праймеров ПЦР MKV1 и MKC в раундах 1-3 на кДНК 1-й цепи, показана в таблице 11. Это является функциональной реаранжировкой. Таблица 11 показывает некоторые отличия от последовательности, показанной в таблицах 1, 4 и 5. Эти отличия находятся в районе FW1, где расположен праймер ПЦР. Мышиной лидерной последовательностью VK, наиболее идентичной фрагменту лидера в VK 158, не кодируемой праймерами авторов изобретения, была K5.1# (таблица 12). Предсказание в отношении сигнального пептида для точного отщепления сигнальной последовательности #K5.1 выполняли с использованием программы предсказания. Наиболее вероятно предсказанный сайт расщепления находился точно между аминокислотными остатками 19 и 20 (таблица 13). Химерный белок 158VK и ДНК-последовательность показаны в таблице 14.
9.6 - ДНК-последовательность VH 158
Консенсусная последовательность (VН 158) клонов VН, генерированная с использованием праймеров ПЦР MKV5 и смеси MHCGl/2a/2b/3 в раундах 1-3 на кДНК 1-й цепи, показана в таблице 15. Как и в случае с VK 158, имелись некоторые отличия от последовательности FW1, показанные в таблицах 1, 4 и 5. Наиболее идентичной мышиной лидерной последовательностью VH относительно этого фрагмента лидера, не кодируемой праймерами авторов изобретения, была NL-1 (таблица 16).
Пример 10 - Конструирование химерных экспрессирующих векторов
Конструирование химерных экспрессирующих векторов влечет за собой добавление подходящей лидерной последовательности к VH и VK, перед которой находятся сайт рестрикции HindIII и последовательность Козака. Эта последовательность Козака (таблица 8) гарантирует эффективную трансляцию последовательности вариабельной области. Она определяет правильный кодон AUG, от которого рибосома может начинать трансляцию, и наиболее критическим основанием является аденин в положении -3, слева от стартового кодона AUG. Эта лидерная последовательность выбрана как наиболее сходная мышиная лидерная последовательность в базе данных Кабата. Эти добавления закодированы в прямых праймерах (таблица 9). Кроме того, конструирование химерных экспрессирующих векторов влечет за собой введение 5'-фрагмента константной области γ1 человека, до природного сайта рестрикции Apa I, смежного с 3'-концом J-области 158. Этот СН кодируется в экспрессирующем векторе справа от встроенной последовательности VH, но не содержит интрона V-C. Для легкой цепи справа от V-области добавляют природный донорный сайт сплайсинга (таблица 8) и сайт BamHI. Эта донорная последовательность сплайсинга облегчает сплайсинг интрона каппа V:C, который является необходимым для присоединения в рамке считывания VK к константной области.
Мышиные гены VH и VK анализировали для идентификации любых нежелательных донорных сайтов сплайсинга, последовательностей Козака и на присутствие каких-либо лишних субклонирующих сайтов рестрикции, которые могли бы в дальнейшем мешать субклонированию и/или экспрессии функционального полноразмерного антитела. В этом случае ни один из этих компонентов не был обнаружен.
10.1 - Экспрессирующие векторы
Препараты плазмидных ДНК экспрессирующих векторов pKN100 и pG1D200 очищали с использованием наборов Qiagen Maxi в соответствии с протоколом изготовителей. Плазмидную ДНК очищали с использованием наборов QIAGEN Plasmid Midi и Maxi из культур 500 мл бактерий TOP10, трансфицированных каждым вектором. Карты векторов показаны на фигурах 10 и 11.
10.2 - Праймеры химеризации легкой цепи
Мышиную лидерную последовательность K5.1# включали в конструкцию химерной VK 158. Праймеры конструировали таким образом, что они генерировали ПЦР-продукт, содержащий полный лидер и VK 158 с концевыми сайтами рестрикции HindIII и BamHI, для клонирования в экспрессирующий вектор pKN100 (таблица 9). Прямой праймер 158vl вводит сайт рестрикции HindIII, сайт Козака и лидерную последовательность K5.1#. Обратный праймер 158vlrev вводит донорный сайт сплайсинга и сайт рестрикции BamHI.
10.3 - Праймеры химеризации тяжелой цепи
Лидерную последовательность NL-1 включали в конструкцию химерной VH 158. Праймеры конструировали таким образом, что они генерировали ПЦР-продукт, содержащий этот лидер и VH-область с концевыми сайтами рестрикции HindIII и Apa I, для клонирования в экспрессирующий вектор pG1D200. Они показаны в таблице 9. Прямой праймер 158vh1 вводит сайт рестрикции HindIII, сайт инициации трансляции Козака и лидерную последовательность NL-1. Обратный праймер 158vhrev вводит 5'-конец С-области γ1 и природный сайт рестрикции ApaI. Предсказание сайта отщепления сигнального пептида для лидерной последовательности K5.1 VK показано в таблице 17.
10.4 - Генерирование химерной конструкции VH 158: pG1D200158VH
ДНК-фрагмент VH 158 амплифицировали с праймерами 158vh и 158vhrev (таблица 9). Продукт ПЦР 450 п.н. (приблизительно) лигировали T-A в вектор pCR2.1 и использовали для трансформации химически компетентных бактерий TOP10. Клоны отбирали по правильному размеру инсерта и секвенировали с использованием праймера 1212 (таблица 10). Правильно экспрессированный инсерт субклонировали в экспрессирующий вектор pG1D200 и правильный субклон отбирали с использованием секвенирования ДНК с использованием праймера BDSH61R (таблица 10). Этот клон выращивали в 200 мл культуры с получением плазмидной ДНК с использованием набора Qiagen Maxi Kit в соответствии с протоколом изготовителей. Этот химерный белок VH 158 и последовательность ДНК показаны в таблице 18.
10.5 - Генерирование химерной конструкции VK 158: pKN100158VK
ДНК-фрагмент VК 158 амплифицировали с праймерами 158vl и 158vlrev (таблица 9). Продукт ПЦР 450 п.н. (приблизительно) лигировали T-A в вектор pCR2.1 и использовали для трансформации химически компетентных бактерий TOP10. Клоны отбирали по правильному размеру инсерта и секвенировали с использованием праймера 1212 (таблица 10). Правильно экспрессированный инсерт субклонировали в экспрессирующий вектор pKN100. Правильный субклон отбирали скринингом на размер инсерта и секвенированием ДНК с использованием праймера Hu-K2 (таблица 10). Этот клон выращивали в 200 мл культуры с получением плазмидной ДНК с использованием набора Qiagen Maxi Kit в соответствии с протоколом изготовителей.
Пример 11 - Получение и свойства связывания химерного антитела 158
11.1 - Трансформация клеток COS 7 и культура клеток
Один флакон клеток COS 7 оттаивали и выращивали в DMEM, дополненной 10% фетальной сывороткой клона I и антибиотиками. Спустя одну неделю клетки (0,8 мл при 107/мл) электропорировали с использованием плазмид pGlD200158VH + pKN100158VK (10 мкг ДНК, каждой). Эти клетки выращивали в 8 мл среды для выращивания в чашках Петри в течение 3 дней.
11.2 - Получение химерного антитела
Сэндвич-ELISA использовали для измерения концентраций антител в супернатантах COS 7. Химерное антитело VH 158 x VK 158 экспрессировалось при 0,3 мкг/мл и затем при 3,7 мкг/мл (таблица 19) в кондиционированных транзиторно котрансфицированными COS-клетками средах.
11.3 - Активность химерного антитела
Два ELISA использовали для анализа связывания антигена химерного 158. С использованием кондиционированной 3,7 мкг/мл химерного антитела среды, связывание с мономером Aβ измеряли по протоколу прямого ELISA (фигура 12) и сравнивали с мышиным IgG 158. Кроме того, выполняли конкурентный ELISA с использованием либо мономера, либо протофибриллы, смешанных в водной фазе с антителом, которое затем связывали с мономером в твердой фазе (фигура 13). Эти ELISA показали, что химерное антитело 158 связывается с мономером амилоида Aβ и протофибриллой аналогично связыванию с первоначальным мышиным антителом 158
Примечание
Более позднее секвенирование показало, что данные относительно последовательности мышиного антитела, показанные в таблицах 1 и 4, содержат ошибки как в цепи VH, так и в цепи VK на 5'-конце. Авторы изобретения предполагают, что это вызвано использованием праймеров, расположенных в V-области. В более позднем секвенировании использовали праймеры, расположенные в лидерных последовательностях, которые не могут вводить мутации в этих V-областях. Это более позднее секвенирование показало различия последовательности (см. таблицы 15 и 11). Однако указанные различия не находятся в CDR-областях.
Это химерное антитело связывает мономер и протофибриллы амилоида Aβ, как показано прямым ELISA связывания и конкурентным ELISA соответственно. Этот результат подтверждает, что комбинация цепей VH 158 и VK 158 кодирует анти-LSAP-антитело 158, и показывает, что эти последовательности подходят для процедуры гуманизации для генерирования гуманизированного антитела 158.
Пример 12 - Конструирование и обсуждение гуманизированного антитела
Аббревиатуры и определения
158 Мышиное моноклональное анти-LSAP™-антитело 158
VH 158 VH мышиного антитела 158
VK 158 VK мышиного антитела 158
158RKASS Гуманизированная версия VK 158, сохраняющая скрытые сайты сплайсинга
158RKA Гуманизированная версия VK 158 с удаленными скрытыми сайтами сплайсинга
158RHAss Гуманизированная версия VH 158, сохраняющая скрытые сайты сплайсинга
158RHA Гуманизированная версия VH 158 с удаленными скрытыми сайтами сплайсинга
A Аденин
bp Пары оснований
C Цитозин
CDR Определяющий комплементарность район в вариабельных областях иммуноглобулина, определяемый с использованием системы нумерации Кабата
D-ген Ген разнообразия (ген, кодирующий гипервариабельный район VH-области иммуноглобулина)
ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота
FW Каркасная область: вариабельные области иммуноглобулина, за исключением CDR-областей
G Гуанин
IgG Иммуноглобулин G
J-ген Соединяющий ген (соединяющий вариабельную и константную области)
Кабат Система сопоставления и нумерации, впервые введенная Элвином А Кабатом
mAb Моноклональное антитело
MRCT Medical Research Council Technology
T Тимин
VCI Остаток каркасной области, классифицированный как Vernier или канонический или относящийся к VH-VL-границе раздела
V-ген Сегмент гена, который реаранжирован вместе с геном J (и D для VH) для генерирования полной VH- или VK-области
V-область Сегмент цепей IgG, который является вариабельным по последовательности между различными антителами. Он простирается до остатка 109 Кабата в легкой цепи и до остатка 113 в тяжелой цепи
VH Вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина
VK Вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина
Figure 00000004
12.1 - Базы данных V-генов человека
Белковые последовательности иммуноглобулинов человека и мыши из International Immunogenetics Database 2006 и Kabat Database Release 5 of Sequences of Proteins of Immunological Interest (последняя корректировка 17 ноября 1999 года) использовали для компилирования базы данных белковых последовательностей иммуноглобулинов в сопоставлении Кабата. База данных авторов изобретения содержит 9322 последовательностей VH человека и 2689 последовательностей VK человека. Программу анализа последовательности, SR 7.6, использовали для запроса этих баз данных VH и VK человека с использованием белковых последовательностей VH 158 и VK 158 (таблица 20).
12.2 - Выбор каркасной области человека для 158RHA
12.2.1 - Сравнение VH 158 с последовательностями VH человека
Последовательности VH человека с наивысшей идентичностью VH 158 в остатках Vernier (Foote, J. and G. Winter. 1992. Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops. JMol.Biol. 224:487-499.). Канонических остатках (Canonical) (Morea,V., A.M.Lesk, and A.Tramontano. 2000. Antibody modeling: implications for engineering and design. Methods 20:267-279) и остатках VH-VL-границы раздела (VH-VL Interface) (Chothia,C, J.Novotny, R.Bruccoleri, and M.Karplus. 1985. Domain association in immunoglobulin molecules. The packing of variable domains. JMol.Biol. 186:651-663.), т.е. (VCI)-остатках, расположенных в каркасе (FW) V-области, показаны в таблице 21. Показаны также количество VCI-остатков (оценка VCI) и количество остатков FW (оценка FW), идентичных 158. Все эти VH-последовательности имеют общие идентичные VCI-остатки и длины CDR, как показано в таблице 22. AJ556669 имеет необычный Pro74, не наблюдаемый в других последовательностях человека в этом наборе данных, что приводит авторов изобретения к не принятию его в расчет в первоначальном анализе. Однако Pro74 присутствует в последовательности VH 158, и, следовательно, AJ556669 мог бы рассматриваться как альтернативный FW для гуманизации, если конструкция VH на основе AF062243 не связывает антиген. Сопоставление этих последовательностей (таблица 23) ясно показывает их различия. AF062243, единственный в этом наборе данных, имеет консервативное изменение T(82a)S и консервативный F79. Другими признаками AF062243 являются консервативные изменения D1E, K19R, A23S, T77S, S118T. Все другие изменения FW были общими для всех каркасов в таблице 23. AF062243 был выбран в качестве каркаса, на котором должен быть основан 158RHA.
12.3 - Генерирование 158RHA
Конструирование 158RHA является просто трансплантацией CDR 1, 2 и 3 из VH 158 в акцепторный FW AF062243. V-геном зародышевой линии человека, наиболее идентичным AF062243 является VH M99649 (VH3-07) (таблица 24), из которого извлекали лидерный пептид (таблица 25). Алгоритм SignalP (Nielsen,H., J.Engelbrecht, S.Brunak, and G.von Heijne. 1997. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Eng 10:1-6.) предсказывал, что он мог бы быть вырезан подходящим образом пептидазой сигнальной последовательности (таблица 26). Таблица 27 показывает схему трансплантации CDR 1, 2 и 3 VH 158 в FW AF062243 FW для генерирования последовательности белка 158RHA. Таблица 28 показывает генерирование ДНК-последовательности 158RHAss из природных ДНК-последовательностей VH 158 и AF062243. Анализ ДНК-последовательности 158RHAss предсказывал присутствие донорных сайтов сплайсинга, оценки предсказаний которых показаны в таблице 29. Некодирующие мутации вводили для инактивации этих предсказанных сайтов сплайсинга, как показано в таблице 30, для генерирования конечной ДНК-последовательности 158RHA (таблица 31).
12.4 - Выбор каркаса иммуноглобулина человека для 158RKA
12.4.1 - Сравнение VK 158 с последовательностями VK человека
Последовательности VK человека с наивысшей идентичностью с VK 158 в VCI-остатках показаны в таблице 32 вместе с количеством VCI-остатков (оценкой VCI) и остатков FW (оценкой FW), идентичных VK 158. Одиннадцать последовательностей имеют все VCI-остатки, идентичные VK 158. Таблица 33 показывает, что все эти последовательности имеют длины CDR, идентичные VK 158. Таблица 34 ясно показывает их различия, показывая, что K45 сохраняется только в AB064054, который сохраняет также I85. Изменение G100P является неудивительным, так как P100 является обычным, имеющим инцидентность 15% в базе данных VK человека авторов изобретения. Две замены T7S и K74R являются консервативными заменами, а все другие замены являются общими для всех последовательностей в таблице 34. По этим причинам для генерирования 158RКA был выбран AB064054.
12.5 - Генерирование 158RKA
Конструирование 158RКA является просто трансплантацией CDR 1, 2 и 3 из VК 158 в акцепторный FW AВ064054 человека. Ближайшим V-геном зародышевой линии к АВ064054 является А19 (таблица 35), из которого извлекали лидерный пептид (таблица 36). Алгоритм SignalP предсказывал подходящее вырезание (таблица 37) этого лидерного пептида. Таблица 38 показывает генерирование белковой последовательности 158RKA интеркаляцией CDR VK 158 в FW AB064054. Таблица 39 показывает генерирование ДНК-последовательности 158RKAss из природной ДНК-последовательности VK 158 и AB064054. Анализ 158RKAss предсказывал присутствие донорных сайтов сплайсинга, оценки которых показаны в таблице 40. Некодирующие мутации (41) вводили для инактивации этих сайтов и генерирования конечной ДНК-конструкции 158RKA (таблица 42).
12.6 - Связывающая активность гуманизированного антитела (BAN2401)
Гены 158RKA и 158RHA встраивали в экспрессирующий вектор, содержащий константную область IgG1. Эту конструкцию экспрессировали в клетках COS для генерирования гуманизированного антитела 158. Это гуманизированное антитело испытывали на активность и специфичность связывания в конкурентном ELISA. Это гуманизированное антитело проявляло свойства связывания, идентичные свойствам связывания mAb158 и химерного антитела 158 (см. фигуру 14).
12.7 - Дополнительные мутации в цепях 158RHA и 158RKA
Сравнением V-генов VH зародышевой линии мыши AAK71612 с VH 158 идентифицировали единственную соматическую мутацию A60G в CDR2. Кроме того, молекулярная модель антитела 158 содержит три остатка FW VH в пределах 5 Ангстрем остатков CDR, которые являются не сохраненными в 158RHA. Этими заменами являются D1E, P74A и T82S (таблица 43). Аналогично, имеются два остатка FW VK в пределах 5 Ангстрем остатков CDR, которые являются не сохраненными в 158RKA. Этими заменами являются L3V и G100P (таблица 44). Введение обратных мутаций в положениях VH-I, VH-74, VH-82, VK-3 и VK-100 в 158RHA и 158RKA в гуманизированных версиях 158RHB, 158RHC, 158RHD, 158RKB и 158RKC показано в таблицах 43 и 44.
ССЫЛКИ
Bacskai et al., Nat. Med. 7:369-372, 2001.
Bard et al., Nat. Med. 6:916-919, 2000.
Bayer et al., Neurology 64:94-101, 2005.
Brendza et al., J. Clin. Invest. 115:428-33, 2005.
Chen et al., Nature, 408:975-9, 2000.
Chothia,C. et al, J Mol. Biol., 186:651-663, 1985.
Ester W.P. Science 293, 1449-1459, 2001.
Gullberg et al., Proc. Natl Acad Sci, 101:8420-4, 2004.
Foote,J. et al., J Mol. Biol, 224:487-499, 1992.
Hoshi et al. Proc. Natl Acad. Sci, 100:6370-6375, 2003.
Jarret J.T., Biochemistry, 32, 4693-4697, 1993.
Leatherbarrow R.J. et al., Mol. Immunol. 22, 407, 1985.
Lord et al., Neurobiol. Aging, 27:67-77, 2006.
McLean et al., Ann. Neurol. 46:860-866, 1999.
Morea,V. et al., Methods 20:267-279, 2000.
Mullan et al., Nat Genet. 1:345-347, 1992.
Nielsen,H. et al. Protein Eng 10: 1-6, 1997.
Nilsberth et al., Nat Neurosci. 4:887-893, 2001.
Naslund et al., JAMA, 283:1571-1577, 2000.
Pfeifer et al., Science 298:1379, 2002.
Racke et al., J. Neurosci 25:629-36, 2005.
Schenk D. et al. Nature, 400, 173-177, 1999.
Stenh et al., Ann. Neurol. 58:147-50, 2005.
Walsh D. M. et al., 272, 22364-22372, 1997
Walsh D. M.et al., Nature, 416, 535-9, 2002.
Wilcock et al., J. Neurosci., 23:3745-51, 2003.
Wright A. et al., J. of Immunology, 3393-3402, 1998.
Xu Y. et al. J. Biol. Chem. 269, 3469-3474, 1994.

Claims (28)

1. Антитело или его фрагмент, являющиеся селективными и имеющими высокую аффинность в отношении протофибрилл Аβ человека, причем это антитело или фрагмент в его шести участках CDR имеет следующие консенсусные последовательности:
VH-CDR1 SFGMH (SEQ ID NO. I) VH-CDR2 YISSGSSTIYYGDTVKG (SEQ ID NO. 2) VH-CDR3 EGGYYYGRSYYTMDY (SEQ ID NO. 3) VL-CDR1 RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO. 4) VL-CDR2 KVSNRFS (SEQ ID NO. 5) VL-CDR3 FQGSHVPPT (SEQ ID NO. 6).
2. Антитело по п.1, где указанное антитело является моноклональным.
3. Антитело по п.1, где аминокислота пролин в положении 331 в человеческом IgG1 заменена серином или другой полярной аминокислотой.
4. Антитело по п.1, где указанное антитело является антителом класса IgG.
5. Антитело по п.4, где указанное антитело является антителом подкласса IgG1 или IgG4.
6. Антитело по п.5, где указанное антитело является химерой подкласса IgG1 или IgG4, где константная область СН2 или часть СН2 тяжелой цепи произведена из IgG4, а области СН1 и СН3 произведены из IgG1, для уменьшенной активации комплемента.
7. Антитело по п.1, где указанное антитело содержит полную последовательность тяжелой цепи в соответствии с таблицей 31 (SEQ ID NO. 178) и полную последовательность легкой цепи в соответствии с таблицей 42 (SEQ ID NO. 264).
8. Антитело, которое связывается с человеческими Аβ протофибриллами, где антитело содержит тяжелую цепь и легкую цепь, причем тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность 158RHA в таблице 27 (SEQ ID NO. 158), и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность 158RKA в таблице 38 (SEQ ID NO. 244).
9. Антитело по п.1, где указанное антитело содержит мутации в тяжелой цепи (VH) в соответствии с таблицей 43 (SEQ ID NO. 265), причем указанные мутации выбраны из (по Kabat): от Е до D позиция 1 (E1D в SEQ ID NO. 265), от А до Р позиция 74 (А75Р в SEQ ID NO. 265) и от S до Т позиция 82А (S84T в SEQ ID NO. 265) и/или мутации в легкой цепи (VK) в соответствии с таблицей 44 (SEQ ID NO. 269), причем указанные мутации выбраны из (по Kabat): от V до L позиция 3 (V3L в SEQ ID NO. 269) и от Р до G позиция 100 (P105G в SEQ ID NO. 269), или комбинации этих мутаций VH и VK.
10. Антитело по п.1, где указанное антитело содержит полную последовательность тяжелой цепи в соответствии с таблицей 31 (SEQ ID NO. 178) и полную последовательность легкой цепи в соответствии с таблицей 42 (SEQ ID NO. 264), за исключением того, что в тяжелую цепь внесена мутация S23A (S42A в SEQ ID NO. 178).
11. Антитело по любому из пп.1 или 8, где указанное антитело является антителом человека или гуманизированным или мутированным антителом для уменьшения антигенности в людях.
12. Антитело по любому из пп.1 или 8, где индекс специфичности между мономерами и протофибриллами Аβ равен по меньшей мере 1:200, как определено конкурентным ELISA.
13. Антитело по п.1, где указанное антитело является антителом мыши.
14. Антитело по п.13, где указанное антитело содержит полную последовательность легкой цепи, закодированную ДНК последовательностью VK 158 в соответствии с таблицей 11 (SEQ ID NO. 97), и полную последовательность тяжелой цепи, закодированную ДНК последовательностью VH 158 в соответствии с таблицей 15 (SEQ ID NO. 106).
15. Композиция, содержащая антитело, определенное в любом из предыдущих пунктов в терапевтически эффективном количестве, и фармацевтически приемлемый буфер, где композиция является селективной и имеет высокую аффинность в отношении протофибрилл Аβ человека.
16. Композиция по п.15, дополнительно включающая антибактериальный агент.
17. Композиция по любому из пп.15 или 16, где эта композиция является лиофилизированной.
18. Композиция по п.17, где эта композиция лиофилизирована вместе с эксципиентом для увеличения стабильности этого антитела во время и после лиофилизации.
19. Композиция по п.18, где этим эксципиентом является маннит или трегалоза.
20. Способ детектирования протофибрилл Аβ in vitro, включающий стадии:
- добавления антитела, определенного в любом из пп.1-14, в биологическую пробу, содержащую протофибриллы Аβ или предположительно содержащую протофибриллы Аβ,
- измерения концентрации комплекса, образованного между указанной протофибриллой Аβ и указанным антителом.
21. Способ по п.20, где указанным способом детектирования является иммуноанализ.
22. Способ по п.20, где указанным способом детектирования является анализ лигирования на основе близости.
23. Антитело по любому из пп.1 или 8 для применения при диагностике заболевания Альцгеймера.
24. Антитело по любому из пп.1 или 8 для применения при диагностике синдрома Дауна, деменции с тельцами Леви или сосудистой деменции.
25. Применение антитела, определенного в любом из пп.1-14, или композиции, определенной в любом из пп.15-19, для получения лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера.
26. Применение антитела, определенного в любом из пп.1-14, или композиции, определенной в любом из пп.15-19, для получения лекарственного средства для лечения синдрома Дауна, деменции с тельцами Леви, сосудистой деменции.
27. Композиция по п.15 для применения при лечении болезни Альцгеймера.
28. Композиция по п.15 для применения при лечении синдрома Дауна, деменции с тельцами Леви, сосудистой деменции.
RU2008141905/10A 2006-03-23 2007-03-23 Улучшенные селективные в отношении протофибрилл антитела и их применение RU2429244C2 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE0600662-1 2006-03-23
SE0600662 2006-03-23
SE0602591 2006-11-30
SE0602591-0 2006-11-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2008141905A RU2008141905A (ru) 2010-04-27
RU2429244C2 true RU2429244C2 (ru) 2011-09-20

Family

ID=38522718

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2008141905/10A RU2429244C2 (ru) 2006-03-23 2007-03-23 Улучшенные селективные в отношении протофибрилл антитела и их применение

Country Status (25)

Country Link
US (2) US8025878B2 (ru)
EP (2) EP2325209A3 (ru)
JP (1) JP5033868B2 (ru)
KR (1) KR101413615B1 (ru)
CN (1) CN101421303B (ru)
AT (1) ATE492561T1 (ru)
AU (1) AU2007227813B2 (ru)
BR (1) BRPI0709050B1 (ru)
CA (1) CA2630344C (ru)
CY (1) CY1111337T1 (ru)
DE (1) DE602007011415D1 (ru)
DK (1) DK2004688T4 (ru)
HK (1) HK1120056A1 (ru)
HR (1) HRP20110203T4 (ru)
IL (1) IL191331A (ru)
MX (1) MX2008012223A (ru)
MY (1) MY169492A (ru)
NO (1) NO347079B1 (ru)
NZ (1) NZ567888A (ru)
PL (1) PL2004688T5 (ru)
RS (1) RS51723B2 (ru)
RU (1) RU2429244C2 (ru)
SI (1) SI2004688T2 (ru)
WO (1) WO2007108756A1 (ru)
ZA (1) ZA200805805B (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2700104C2 (ru) * 2014-07-10 2019-09-12 Байоарктик Ньюросайенс Аб УЛУЧШЕННЫЕ АНТИТЕЛА, СВЯЗЫВАЮЩИЕ Аβ-ПРОТОФИБРИЛЛЫ

Families Citing this family (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2082749A3 (en) 2000-07-07 2010-06-30 Bioarctic Neuroscience AB Prevention and treatment of Alzheimer's disease
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
SE0401601D0 (sv) 2004-06-21 2004-06-21 Bioarctic Neuroscience Ab Protofibril specific antibodies and uses thereof
DK1976877T4 (en) 2005-11-30 2017-01-16 Abbvie Inc Monoclonal antibodies to amyloid beta protein and uses thereof
PT1954718E (pt) 2005-11-30 2014-12-16 Abbvie Inc Anticorpos anti-globulómeros aβ, suas porções de ligação ao antigénio, correspondentes hibridomas, ácidos nucleicos, vectores, células hospedeiras, métodos de produção dos ditos anticorpos, composições compreendendo os ditos anticorpos, usos dos ditos anticorpos e métodos para uso dos ditos anticorpos
RU2429244C2 (ru) 2006-03-23 2011-09-20 Байоарктик Ньюросайенс Аб Улучшенные селективные в отношении протофибрилл антитела и их применение
WO2007114319A1 (ja) 2006-03-31 2007-10-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体の血中動態を制御する方法
CN101500608A (zh) 2006-06-08 2009-08-05 中外制药株式会社 炎性疾病的预防或治疗药
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
JP2010515717A (ja) 2007-01-11 2010-05-13 フィリップス−ウニベルジテート・マールブルク アルツハイマーおよび他の神経性認知症疾患の診断ならびに処置
WO2008104386A2 (en) 2007-02-27 2008-09-04 Abbott Gmbh & Co. Kg Method for the treatment of amyloidoses
US8613923B2 (en) 2007-06-12 2013-12-24 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
US8048420B2 (en) 2007-06-12 2011-11-01 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
WO2009041613A1 (ja) 2007-09-26 2009-04-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体定常領域改変体
CN101874042B9 (zh) 2007-09-26 2019-01-01 中外制药株式会社 利用cdr的氨基酸取代来改变抗体等电点的方法
AU2008311367B2 (en) 2007-10-05 2014-11-13 Ac Immune S.A. Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases
MY158903A (en) * 2007-11-16 2016-11-30 Univ Rockefeller Antibodies specific for the protofibril form of beta-amyloid protein
ES2834741T3 (es) * 2007-12-05 2021-06-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-NR10 y uso del mismo
PT2246427T (pt) * 2008-02-08 2017-03-03 Immunas Pharma Inc Anticorpos capazes de se ligar especificamente a oligómeros beta amilóides e a sua utilização
PT2282758T (pt) 2008-04-29 2019-02-12 Bioarctic Ab Anticorpos e vacinas para uso em métodos terapêuticos e diagnósticos para perturbações relacionadas com a alfa-sinucleína
US9085614B2 (en) * 2008-08-01 2015-07-21 Immunas Pharma, Inc. Antibodies that specifically bind to Aβ oligomers and uses thereof
EP2328930B1 (en) * 2008-08-20 2014-12-24 Probiodrug AG Antibodies directed against pyroglutamate monocyte chemoattractant protein-1 (mcp-1 n1pe)
TWI544077B (zh) 2009-03-19 2016-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody constant region change body
EP2409991B1 (en) 2009-03-19 2017-05-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
ES2641612T3 (es) 2009-04-17 2017-11-10 Immunas Pharma, Inc. Anticuerpos que se unen específicamente a oligómeros de beta A y uso de los mismos
FR2945538B1 (fr) 2009-05-12 2014-12-26 Sanofi Aventis Anticorps humanises specifiques de la forme protofibrillaire du peptide beta-amyloide.
DK2448968T3 (da) * 2009-06-29 2021-04-12 Bioarctic Ab ANTISTOFFER SOM ER SELEKTIVE FOR N-TERMINAL-TRUNKEREDE AMYLOID-ß PROTOFIBRILLER/OLIGOMERER
EP2273273A1 (en) * 2009-07-11 2011-01-12 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Inhibitors of the nitration of amyloid ß peptides and their uses in the diagnosis and treatment of alzheimer's disease
CN102574915B (zh) 2009-08-06 2014-10-22 伊缪纳斯制药株式会社 特异性结合Aβ寡聚体的抗体及其用途
JP5599454B2 (ja) * 2009-08-06 2014-10-01 イムナス・ファーマ株式会社 Ａβオリゴマーに特異的に結合する抗体およびその利用
US10266585B2 (en) 2009-08-28 2019-04-23 The Board Of Regents Of The Univerity Of Texas System Methods of treating brain injury
DK2504363T3 (da) 2009-11-24 2019-07-29 Alethia Biotherapeutics Inc Anti-clusterin-antistoffer og antigenbindende fragmenter og deres anvendelse til reducering af tumorvolumen
EP2539366B1 (en) 2010-02-26 2017-11-08 BioArtic Neuroscience AB Protofibril-binding antibodies and their use in therapeutic and diagnostic methods for parkinson's disease, dementia with lewy bodies and other alpha-synucleinopathies
MX360403B (es) 2010-04-15 2018-10-31 Abbvie Inc Proteinas de union a amiloide beta.
WO2011151076A2 (en) 2010-06-04 2011-12-08 Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffentlichen Rechts, Universitätsmedizin MONOCLONAL ANTIBODIES TARGETING Αβ OLIGOMERS
CN103179981B (zh) 2010-07-30 2017-02-08 Ac免疫有限公司 安全和功能性的人源化抗β‑淀粉样蛋白抗体
EP2603524A1 (en) 2010-08-14 2013-06-19 AbbVie Inc. Amyloid-beta binding proteins
AU2011315920B2 (en) 2010-10-15 2016-04-28 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Antibodies that bind amyloid oligomers
EP2663579B1 (en) 2011-01-14 2017-04-26 The Regents of the University of California Therapeutic antibodies against ror-1 protein and methods for use of same
EP2497782A1 (en) 2011-03-08 2012-09-12 Alzinova AB Anti oligomer antibodies and uses thereof
IN2014CN03555A (ru) 2011-10-25 2015-07-03 Onclave Therapeutics Ltd
JP2013159596A (ja) * 2012-02-08 2013-08-19 Nihon Univ β−アミロイド前駆体タンパク質のマイクロ凝集体に特異的なモノクローナル抗体
EP2817028A4 (en) 2012-02-22 2015-11-04 Alethia Biotherapeutics Inc COMMON USE OF A CLUSTERIN INHIBITOR AND EGFR INHIBITOR FOR TREATING CANCER
JP6462680B2 (ja) 2013-07-09 2019-01-30 アネクソン，インコーポレーテッド 抗補体因子Ｃ１ｑ抗体及びその使用
CN112457403B (zh) 2013-09-13 2022-11-29 广州百济神州生物制药有限公司 抗pd1抗体及其作为治疗剂与诊断剂的用途
EP3071597B1 (en) * 2013-11-21 2020-07-29 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-alpha-synuclein antibodies and methods of use
KR102130600B1 (ko) 2014-07-03 2020-07-08 베이진 엘티디 Pd-l1 항체와 이를 이용한 치료 및 진단
RU2711141C2 (ru) 2014-07-22 2020-01-15 СиБи ТЕРЕПЬЮТИКС, ИНК. Антитела против pd-1
SG10201901057UA (en) 2014-08-05 2019-03-28 Cb Therapeutics Inc Anti-pd-l1 antibodies
CN107207587B (zh) 2014-11-05 2022-04-19 安尼艾克松股份有限公司 人源化抗-补体因子c1q抗体及其应用
US10357563B2 (en) 2014-12-18 2019-07-23 The University Of Chicago Methods and composition for neutralization of influenza
BR112017022101A2 (pt) 2015-04-14 2018-07-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha composição farmacêutica para prevenção e/ou tratamento de dermatite atópica contendo antagonista de il-31 como ingrediente ativo
WO2017013599A1 (en) 2015-07-21 2017-01-26 Bioarctic Neuroscience Ab Method for treatment of traumatic brain injury targeting aggregated peptides
US10723788B2 (en) 2015-11-24 2020-07-28 Annexon, Inc. Anti-complement factor C1q Fab fragments and uses thereof
JP2017132742A (ja) * 2016-01-29 2017-08-03 国立大学法人 大分大学 Ａβオリゴマー特異的抗体の新規薬理用途
TWI798751B (zh) 2016-07-01 2023-04-11 美商美國禮來大藥廠 抗－N3pGlu類澱粉β肽抗體及其用途
CN109475536B (zh) 2016-07-05 2022-05-27 百济神州有限公司 用于治疗癌症的PD-l拮抗剂和RAF抑制剂的组合
RU2019102746A (ru) 2016-07-14 2020-08-14 Биоарктик Аб Белок для транспорта в мозг
CN118252927A (zh) 2016-08-19 2024-06-28 百济神州有限公司 使用包含btk抑制剂的组合产品治疗癌症
JP2019536471A (ja) 2016-09-27 2019-12-19 セロ・セラピューティクス・インコーポレイテッドＣＥＲＯ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． キメラエンガルフメント受容体分子
SG11201903601QA (en) 2016-10-27 2019-05-30 Eisai R&D Man Co Ltd Composition comprising an anti-abeta protofibril antibody and a beta-secretase bace1 inhibitor for the treatment of alzheimer's disease
CN110461847B (zh) 2017-01-25 2022-06-07 百济神州有限公司 (S)-7-(1-(丁-2-炔酰基)哌啶-4-基)-2-(4-苯氧基苯基)-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的结晶形式、其制备及用途
AU2018290532A1 (en) 2017-06-26 2019-11-21 Beigene, Ltd. Immunotherapy for hepatocellular carcinoma
CA3067597C (en) 2017-06-29 2023-03-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Chimeric antibodies for treatment of amyloid deposition diseases
US11382974B2 (en) 2017-08-01 2022-07-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods and compositions for treatment of amyloid deposition diseases
AU2018341244A1 (en) 2017-09-26 2020-03-05 Cero Therapeutics, Inc. Chimeric engulfment receptor molecules and methods of use
WO2019108795A1 (en) 2017-11-29 2019-06-06 Beigene Switzerland Gmbh Treatment of indolent or aggressive b-cell lymphomas using a combination comprising btk inhibitors
EP3753952A4 (en) * 2017-12-13 2022-04-13 XDCExplorer (Shanghai) Co., Ltd. EGFRVIII ANTIBODY AND CONJUGATE, METHOD FOR THE PREPARATION AND USE THEREOF
WO2019191332A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Cero Therapeutics, Inc. Chimeric engulfment receptors and uses thereof for neurodegenerative diseases
US12018069B2 (en) 2018-06-28 2024-06-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods and compositions for imaging amyloid deposits
CN111094340B (zh) 2018-07-17 2022-11-22 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗Abeta抗体、其抗原结合片段及应用
IL280315B2 (en) * 2018-07-24 2024-06-01 Eisai R&D Man Co Ltd Methods for treating and preventing Alzheimer's disease
BR112022006590A2 (pt) 2019-11-20 2022-06-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Preparação contendo anticorpos
US20230108300A1 (en) * 2020-01-29 2023-04-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods of t cell receptor vb family member targeting for the treatment of t cell associated disease
AU2021298222A1 (en) 2020-06-26 2022-12-15 Bioarctic Ab α-synuclein protofibril-binding antibodies
TW202300517A (zh) 2021-03-12 2023-01-01 美商美國禮來大藥廠 抗類澱粉β抗體及其用途
WO2022251048A1 (en) 2021-05-24 2022-12-01 Eli Lilly And Company Anti-amyloid beta antibodies and uses thereof
JP2024522627A (ja) 2021-06-11 2024-06-21 バイオアークティック アクティエボラーグ 二重特異性結合分子
JP2024525559A (ja) 2021-07-09 2024-07-12 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 アルツハイマー病治療用バイオマーカー
KR20240053620A (ko) 2021-08-30 2024-04-24 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 항-a베타 프로토피브릴 항체의 피하 제형 및 이를 사용하는 방법
WO2023099788A1 (en) 2021-12-03 2023-06-08 Neurimmune Ag Novel potency assay for antibody-based drugs and useful means therefor
CA3242280A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Eisai R&D Management Co., Ltd. Methods of using an anti-amyloid beta protofibril antibody and anti-tau antibody
WO2023111618A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Eisai R&D Management Co., Ltd. Methods of using an anti-amyloid beta protofibril antibody and anti-tau antibody
KR20240142535A (ko) 2022-02-02 2024-09-30 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 P-tau181 수준을 사용한 치료 방법
WO2024118665A1 (en) 2022-11-28 2024-06-06 Eisai R&D Management Co., Ltd. Methods of treatment using a tau pet level
WO2024155876A1 (en) 2023-01-20 2024-07-25 Mabwell Therapeutics, Inc. ANTI-AMYLOID β PROTOFIBRIL/OLIGOMER ANTIBODIES AND USES THEREOF

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5231000A (en) 1987-10-08 1993-07-27 The Mclean Hospital Antibodies to A4 amyloid peptide
US5753624A (en) * 1990-04-27 1998-05-19 Milkhaus Laboratory, Inc. Materials and methods for treatment of plaquing disease
US6174916B1 (en) * 1990-04-27 2001-01-16 Milkhaus Laboratory, Ltd. Methods for treating herpes virus infections
ATE153534T1 (de) 1990-04-27 1997-06-15 John Mcmichael Verfahren und zusammensetzung zur behandlung von erkrankungen des zns hervorgerufen durch abnormales beta-amyloid-protein
US5604102A (en) 1992-04-15 1997-02-18 Athena Neurosciences, Inc. Methods of screening for β-amyloid peptide production inhibitors
AU702293B2 (en) * 1993-10-27 1999-02-18 Athena Neurosciences, Inc. Transgenic animals harboring APP allele having Swedish mutation
AU686818B2 (en) 1994-05-25 1998-02-12 John Mcmichael Materials and methods for treatment of plaquing diseases
US6114133A (en) * 1994-11-14 2000-09-05 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods for aiding in the diagnosis of Alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41)
US7427392B1 (en) * 1994-11-14 2008-09-23 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods for aiding in the diagnosis of alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41) and tau
US5786180A (en) * 1995-02-14 1998-07-28 Bayer Corporation Monoclonal antibody 369.2B specific for β A4 peptide
US6303567B1 (en) * 1995-03-14 2001-10-16 Praecis Pharmaceuticals, Inc . Modulators of β-amyloid peptide aggregation comprising D-amino acids
ES2175083T3 (es) * 1995-03-14 2002-11-16 Praecis Pharm Inc Moduladores de la agregacion de amiloides.
US5817626A (en) * 1995-03-14 1998-10-06 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of beta-amyloid peptide aggregation
US5854215A (en) * 1995-03-14 1998-12-29 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of β-amyloid peptide aggregation
US5985242A (en) * 1995-10-27 1999-11-16 Praecis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of β-amyloid peptide aggregation comprising D-amino acids
JPH09178743A (ja) 1995-12-27 1997-07-11 Oriental Yeast Co Ltd 可溶性ａｐｐの定量法
WO1997041856A1 (en) 1996-05-08 1997-11-13 Massachusetts Institute Of Technology ORGANOMETALLIC LIGANDS FOR THE LOCALIZATION AND QUANTIFICATION OF AMYLOID IN VIVO AND $i(IN VITRO)
US6218506B1 (en) * 1997-02-05 2001-04-17 Northwestern University Amyloid β protein (globular assembly and uses thereof)
US20030068316A1 (en) * 1997-02-05 2003-04-10 Klein William L. Anti-ADDL antibodies and uses thereof
US20060178302A1 (en) * 1997-02-05 2006-08-10 Northwestern University & The University Of Southern California Amyloid beta protein (globular assembly and uses thereof)
TWI239847B (en) * 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
ES2253839T3 (es) 1997-12-03 2006-06-01 Neuralab, Ltd. Supresion de cambios relacionados con amiloide beta en la enfermedad de alzheimer.
AU2486900A (en) 1998-12-29 2000-07-31 University Of Georgia Research Foundation, Inc., The Rubredoxin fusion proteins, protein expression system and methods
US6670195B1 (en) 1999-05-26 2003-12-30 New York University Mutant genes in Familial British Dementia and Familial Danish Dementia
UA81216C2 (en) 1999-06-01 2007-12-25 Prevention and treatment of amyloid disease
PE20010212A1 (es) 1999-06-01 2001-02-22 Neuralab Ltd Composiciones del peptido a-beta y procesos para producir las mismas
ATE445639T1 (de) 1999-08-04 2009-10-15 Univ Southern California Globularer aufbau vom amyloid-beta- protein und deren verwendungen
AU784312B2 (en) 1999-11-29 2006-03-09 Bellus Health (International) Limited Vaccine for the prevention and treatment of alzheimer's and amyloid related diseases
DE60108111T2 (de) 2000-05-22 2005-12-08 New York University Synthetische immunogene jedoch nicht amyloidogene peptide, die homolog zu amyloid beta sind und deren verwendung zur induktion einer immunantwort gegen amyloid beta und amyloidaggregate
EP2082749A3 (en) 2000-07-07 2010-06-30 Bioarctic Neuroscience AB Prevention and treatment of Alzheimer's disease
US20030187011A1 (en) * 2001-12-20 2003-10-02 Lashuel Hilal A. Apomorphine inhibitors of amyloid-beta (Abeta) fibril formation and their use in amyloidosis based disease
KR20040082421A (ko) * 2002-02-11 2004-09-24 제넨테크, 인크. 빠른 항원 결합 속도를 갖는 항체 변이체
EP1497321B1 (en) * 2002-04-19 2011-06-29 The Governing Council Of The University Of Toronto Immunological methods and compositions for the treatment of alzheimer's disease
JP2003334075A (ja) * 2002-05-21 2003-11-25 Japan Tobacco Inc 簡便な変異抗体の製造方法
US20040049134A1 (en) * 2002-07-02 2004-03-11 Tosaya Carol A. System and methods for treatment of alzheimer's and other deposition-related disorders of the brain
WO2004024090A2 (en) * 2002-09-12 2004-03-25 The Regents Of The University Of California Immunogens and corresponding antibodies specific for high molecular weight aggregation intermediates common to amyloids formed from proteins of differing sequence
EP1545582A4 (en) 2002-10-01 2008-09-17 Univ Northwestern DIFFUSIBLE DERIVATIVES DERIVED FROM AMYLOID BETA (ADDL), ADDL SUBSTITUTE, ADDL BINDING MOLECULES, AND USES THEREOF
AU2003285151A1 (en) * 2002-11-04 2004-06-07 Bioarctic Neuroscience Ab Methods for the identification of agents that modulate the structure and processing of beta-amyloid precursor protein
DE10303974A1 (de) * 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
WO2005011599A2 (en) * 2003-08-01 2005-02-10 Northwestern University Antibodies specific for toxic amyloid beta protein oligomers
EP1668369B1 (en) 2003-08-20 2016-01-06 ProMIS Neurosciences Inc. Epitope protection assay and method for detecting protein conformations
JP2007527865A (ja) 2003-09-12 2007-10-04 ザ・レジェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・カリフォルニア 種々の配列を有するタンパク質から形成されたアミロイドに共通の高分子量凝集中間体に特異的なモノクローナル抗体
SE0400707D0 (sv) 2004-03-22 2004-03-22 Bioarctic Neuroscience Ab Transgenic animal model
SE0401601D0 (sv) * 2004-06-21 2004-06-21 Bioarctic Neuroscience Ab Protofibril specific antibodies and uses thereof
AU2005269940A1 (en) 2004-07-02 2006-02-09 Northwestern University Monolocal antibodies that target pathological assemblies of amyloid beta (Abeta)
US20060079447A1 (en) * 2004-10-08 2006-04-13 Wetzel Ronald B Stabilized A-beta protofibrillar aggregates
US20080044356A1 (en) 2004-10-22 2008-02-21 Regents Of The University Of Minnesota Assemblies of Oligomeric Amyloid Beta Protein and Uses Thereof
AU2005306997B2 (en) 2004-10-25 2012-07-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-ADDL antibodies and uses thereof
WO2006066233A1 (en) * 2004-12-15 2006-06-22 Neuralab Limited An immunoprecipitation-based assay for predicting in vivo efficacy of beta-amyloid antibodies
EP1853299A4 (en) 2005-01-14 2009-11-11 Univ California COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING THE PRESENCE OF DRUGS AND DIAGNOSING OR TREATING DRUG-INDUCED DISEASES
GT200600031A (es) * 2005-01-28 2006-08-29 Formulacion anticuerpo anti a beta
US7731962B2 (en) * 2005-02-14 2010-06-08 Merck & Co., Inc. Anti-ADDL monoclonal antibody and use thereof
US7700099B2 (en) * 2005-02-14 2010-04-20 Merck & Co., Inc. Non-immunostimulatory antibody and compositions containing the same
AU2006222193B2 (en) 2005-03-05 2011-11-17 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Screening method, process for purifying of non-diffusible A-beta oligomers, selective antibodies against said non-diffusible A-beta oligomers and a process for manufacturing of said antibodies
EP1921137A4 (en) 2005-06-21 2011-01-26 Med & Biological Lab Co Ltd ANTIBODIES WITH INHIBITOR EFFECT ON THE FORMATION OF AMYLOID FIBRILLES
TW200726774A (en) 2005-06-30 2007-07-16 Merck & Co Inc Composition and method for producing stable amyloid beta oligomers
TW200726482A (en) 2005-06-30 2007-07-16 Merck & Co Inc Method for preparing a covalently cross linked oligomer of amyloid beta peptides
EP1940466B1 (en) 2005-10-21 2012-11-28 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-addl monoclonal antibodies and use thereof
CA2630964A1 (en) 2005-11-22 2007-05-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Antibody treatment of alzheimer's and related diseases
RU2429244C2 (ru) 2006-03-23 2011-09-20 Байоарктик Ньюросайенс Аб Улучшенные селективные в отношении протофибрилл антитела и их применение
MY158903A (en) 2007-11-16 2016-11-30 Univ Rockefeller Antibodies specific for the protofibril form of beta-amyloid protein
DK2448968T3 (da) 2009-06-29 2021-04-12 Bioarctic Ab ANTISTOFFER SOM ER SELEKTIVE FOR N-TERMINAL-TRUNKEREDE AMYLOID-ß PROTOFIBRILLER/OLIGOMERER

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Kayed R, et al, "Common structure of soluble amyloid oligomers implies common mechanism of pathogenesis". Science. 2003 Apr 18; 300(5618):486-489. Chromy BA, et al. "Self-assembly of Abeta(1-42) into globular neurotoxins". Biochemistry. 2003 Nov 11; 42(44): 12749-12760. Кудинова Н.В. и др. В-АМИЛОИД: БОЛЕЗНЬ АЛЬЦГЕЙМЕРА И В-АМИЛОИДОЗЫ МОЗГА. Биохимия, 1999, 64, с 899-905. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2700104C2 (ru) * 2014-07-10 2019-09-12 Байоарктик Ньюросайенс Аб УЛУЧШЕННЫЕ АНТИТЕЛА, СВЯЗЫВАЮЩИЕ Аβ-ПРОТОФИБРИЛЛЫ

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20110203T4 (hr) 2014-05-09
BRPI0709050A2 (pt) 2011-06-21
MY169492A (en) 2019-04-15
HK1120056A1 (en) 2009-03-20
CN101421303B (zh) 2013-06-12
NO347079B1 (no) 2023-05-08
DE602007011415D1 (de) 2011-02-03
CN101421303A (zh) 2009-04-29
RS51723B (en) 2011-10-31
KR20080106288A (ko) 2008-12-04
NZ567888A (en) 2010-08-27
KR101413615B1 (ko) 2014-07-18
US8025878B2 (en) 2011-09-27
EP2004688B2 (en) 2014-03-05
MX2008012223A (es) 2008-12-17
RU2008141905A (ru) 2010-04-27
JP2009530374A (ja) 2009-08-27
EP2004688B8 (en) 2011-03-02
AU2007227813A1 (en) 2007-09-27
ZA200805805B (en) 2010-09-29
IL191331A (en) 2015-07-30
PL2004688T3 (pl) 2011-06-30
SI2004688T1 (sl) 2011-03-31
RS51723B2 (sr) 2018-03-30
CA2630344A1 (en) 2007-09-27
DK2004688T3 (da) 2011-03-21
HRP20110203T1 (en) 2011-04-30
SI2004688T2 (sl) 2014-05-30
WO2007108756A1 (en) 2007-09-27
ATE492561T1 (de) 2011-01-15
EP2325209A2 (en) 2011-05-25
US20120076726A1 (en) 2012-03-29
US20090258009A1 (en) 2009-10-15
JP5033868B2 (ja) 2012-09-26
CA2630344C (en) 2015-04-28
EP2004688B1 (en) 2010-12-22
BRPI0709050B1 (pt) 2018-12-26
US9034334B2 (en) 2015-05-19
EP2325209A3 (en) 2011-08-03
PL2004688T5 (pl) 2014-09-30
DK2004688T4 (da) 2014-05-12
NO20084445L (no) 2008-10-22
AU2007227813B2 (en) 2012-09-27
CY1111337T1 (el) 2015-08-05
EP2004688A1 (en) 2008-12-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2429244C2 (ru) Улучшенные селективные в отношении протофибрилл антитела и их применение
JP5898715B2 (ja) アミロイドβに対するヒト化抗体
TWI551607B (zh) 人類化抗體
RU2571859C2 (ru) Применение антитела против амилоида-бета при глазных заболеваниях
AU2008311365B2 (en) Humanized antibody
MX2013001834A (es) Proteinas de union a amiloide beta.
KR20100097651A (ko) 베타-아밀로이드 펩티드에 특이적인 신규 항체 및 진단제 또는 진단약으로서의 그 용도
TWI608014B (zh) 抗β-類澱粉抗體或其抗原結合片段、其用途及使用方法
ES2356159T5 (es) Anticuerpos selectivos de protofibrillas mejorados y su uso
JP6076274B2 (ja) アミロイドβに対するヒト化抗体
JP2022070853A (ja) アミロイドβに対するヒト化抗体
Class et al. Patent application title: PROTOFIBRIL SELECTIVE ANTIBODIES AND THE USE THEREOF Inventors: Par Gellerfors (Lidingo, SE) Lars Lannfelt (Stockholm, SE) Dag Sehlin (Uppsala, SE) Frida Ekholm Pettersson (Uppsala, SE) Hillevi Englund (Uppsala, SE) Assignees: BIOARCTIC NEUROSCIENCE AB