ES2253839T3 - Supresion de cambios relacionados con amiloide beta en la enfermedad de alzheimer. - Google Patents

Abstract

Una formulación farmacéutica adaptada para la administración nasal en una forma de aerosol a un mamífero en riesgo de contraer la enfermedad de Alzheimer que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de amiloide â o un fragmento eficaz o análogo del mismo para inhibir o retrasar el comienzo de al menos uno de los siguientes (i) generación de una o más citoquinas Th1 proinflamatorias en el mamífero; (ii)descenso en la cantidad de una o más citoquinas Th2 o Th3 antiinflamatorias en el mamífero; o (iii) aparición de al menos un síntoma clínico de al enfermedad.

Description

Supresión de cambios relacionados con amiloide \beta en la enfermedad de Alzheimer.

Esta solicitud reivindica prioridad a tenor del artículo del código 35 U. S. C. \NAK 119 de la solicitud de Estados Unidos Nº de serie 60/067.219, presentada el 3 de diciembre de 1997 y la solicitud de Estados Unidos Nº de serie 60/079.697, presentada el 27 de marzo de 1998.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a un tratamiento para la enfermedad de Alzheimer basándose en la tolerancia mucosal.

Antecedentes de la invención 1. Enfermedad de Alzheimer

La enfermedad de Alzheimer es la causa más común de degeneración cognitiva en los ancianos. Selkoe, D. J., y col., Science, 235, 837 - 877 (1977). La extensa pérdida sináptica se produce dando como resultado la pérdida de memoria progresiva, inestabilidad psicológica, deterioro en el razonamiento abstracto, pérdida de la función corporal, coma, y por último la muerte. Las lesiones extracelulares conocidas como placas seniles se desarrollan en las víctimas de Alzheimer, comprendiendo agregados insolubles de la proteína amiloide \beta (A\beta) que rodea las neuritas distróficas. Mullan, M. y Crawford, F., Trends Neurosci., 16, 398 - 403 (1993). El amiloide \beta es un péptido hidrófobo que comprende 39 - 43 restos de aminoácidos; se caracteriza por una alta tendencia a formar agregados, y se produce por el procesamiento proteolítico de un precursor de proteína de membrana integral de 140 kDa conocida como proteína precursora de amiloide (APP).

Aunque anteriormente se ha pensado que el propio péptido amiloide \beta era responsable de la neurogeneración en la enfermedad de Alzheimer ya que puede matar neuronas in vitro, ahora se sabe que el precursor de APP se expresa en las células del cerebrode tanto cerebros sanos como de Alzheimer. Konig, G., y col., Mol. Brain. Res., 9, 259 - 262 (1991). Por lo tanto la presencia de péptido amiloide \beta no es por sí mismo suficiente para justificar la enfermedad.

Se ha desviado la atención recientemente a la implicación o participación potencial en los procesos inmunológicos de Alzheimer tal como inflamación. Se ha acumulado una gran cantidad de evidencia de investigación que muestra cierto paralelismo entre episodios inmunológicos y la enfermedad de Alzheimer. Los cerebros de Alzheimer muestran diversas características estructurales de lesión cerebral mediada por inmunización que incluye un incremento de poblaciones de células de microglía y astrocitos que expresan tales citoquinas inflamatorias y agentes asociados a la infamación como interleuquina-1 y \alpha1-antiquimotripsina, y que son inmunorreactivos con la clase I y II del principal complejo de histocompatibilidad (MHC). Abraham, y col., Cell, 52, 487 (1988). Las células de microglía se cree que son el equivalente funcional de macrófagos en el sistema nervioso central. Styren, y col., Exp. Neurol., 110, 93 (1990). Otras características observadas en la lesión cerebral tanto mediada por inmunización como de Alzheimer incluyen marcadores inmunorreactivos tales como glicoproteínas de la clase I y I de MCH, citoquinas, receptores de complemento y factores reguladores. McGeer, P. L. y col., Neurosci. Lett., 107, 341 - 344 (1989); McGeer, P. L. y col., Brain Res., 544, 315 - 320 (1990); Griffin, W. S., y col., Proc. Natl. Acad.Sci. U. S. A., 86, 7611 - 7615 (1989). También, el mediador inflamatorio interleuquina-6 (IL-6) que se encuentra en cerebros de Alzheimer se sabe que estimula la \alpha-2-macroglobulina (\alpha2M), un inhibidor de la proteasa humana altamente potente producido por neuronas de cerebros de Alzheimer, y se cree que interfiere con el procesamiento proteolítico normal de APP para formar amiloide \beta. Bauer, J., y col., FEBS Letts., 285, 111 - 114 (1991). La producción fisiológica de la proteína amiloide \beta y mecanismo de la enfermedad de Alzheimer se describe adicionalmente en Selkoe, Trends in Neurosciences., 16: 403 - 409
(1993).

También se sabe que el péptido amiloide \beta presente en forma insoluble en las placas del cerebro de Alzheimer puede unir y activar las proteínas de complemento clásicas (C1q) in vitro en ausencia de proteínas de anticuerpo (por ejemplo, inmunoglobulinas). Por el contrario, el A\beta de fase soluble se somete a regulación protectora mediante inhibidores de fase fluida, surgiendo que es la forma insoluble de A\beta que es neurotóxica y explicando la inocuidad aparente del A\beta soluble. Rogers, y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. U. S. A.., 89, 10016 - 10020 (1992). McGeer y Rogers y sus colaboradores han propuesto que el amiloide \beta agregado puede activar la cascada complementaria que conduce a la generación de proteínas capaces de destruir neuronas. Cf. Schnabel, J., New Scientist, 138, 22 (19 de junio de 1993). En un soporte adicional del mecanismo de unión entre la deposición de la placa amiloide y la respuesta inmune, se ha encontrado que las células de microglía, las células inmunes del cerebro, se pueden activar con interferón - \gamma (IFN - \gamma)
y [1-42] A\beta para producir significativamente más daño a las neuronas que cualquier estímulo solo. Meda, L., Nature, 374, 647 - 650 (1995). Este hallazgo sugiere un efecto sinérgico entre A\beta e IFN - \gamma en el desencadenamiento de la generación por las células de microglía de sustancias neurodegenerativas tales como intermedios de nitrógeno reactivos (por ejemplo, radicales libres tóxicos) y el factor de necrosis tumoral \alpha (TNF - \alpha). Véase, también Huberman, M. y col., J. Neuroimmunol., 52: 147 - 152, 1994 que reseñan un incremento de la secreción en pacientes de Alzheimer de citoquinas proinflamatorias, y una correlación entre niveles de citoquina y la fase de la enfermedad.

Los documentos WO 91/16819 y WO 95/31996 describen la administración de dosis bajas de 10^{-10} mg a 10^{-2} mg de proteína amiloide \beta para el tratamiento de enfermedad de Alzheimer y proponen que tales bajas dosificaciones operan mediante un mecanismo de retroalimentación negativo en el que la administración del péptido amiloide \beta evita la síntesis del péptido adicional.

La evidencia epidemiológica también soporta un nexo entre actividad inmunológica y la enfermedad de Alzheimer. Anderson, K. y col., Neurol., 45, 1441 - 1445 (19+95): En el estudio de Rótterdam que examina 7.983 sujetos, los fármacos antiinflamatorios no esteroides se mostró que tienen un efecto protector sobre el riesgo de desarrollar enfermedad de Alzheimer y un efecto mejorador sobre el componente de patológico de función cognitiva disminuida. A pesar de que estos estudios señalan a un papel para el sistema inmune en la inducción de la enfermedad de Alzheimer, no han emergido regímenes terapéuticos verdaderamente eficaces basándose en estos resultados de investigación.

Los tratamientos actuales para la enfermedad de Alzheimer son generalmente pocos e inadecuados. TACRINE ™ monoclorhidrato de (1,2,3,4-tetrahidro-9-acridinamina monohidrato; también comercializado como COGNEX ™) es un inhibidor reversible de la colinesterasa con alguna eficacia para tratar la enfermedad de Alzheimer. Watkins, P. B., y col., J. Amer. Med. Assoc., 271, 992 (1994). TACRINE ha sido sólo parcialmente eficaz en sujetos con vivienda comunitaria con demencia ligera o moderada. Weiner, M. F., Consultant, 35, 313 (1995). Aparte de su eficacia limitada, existe recelo para su uso. Éstos incluyen la elevación de los niveles de aminotransferasa en suero que pueden indicar lesión hepatocelular. Otros peligros implican un riesgo de desarrollar necrosis hepática, ictericia o hepatitis que puede ser grave o fatal en pacientes particularmente susceptibles.

Se han intentado otros planteamientos, tales como el tratamiento de síntomas psicológicos de la enfermedad de Alzheimer usando inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina, por ejemplo, paroxetina, fluoxetina, o trazodona, y la administración de agonistas o precursores colinérgicos, por ejemplo, lecitina y nicotina pero tienen de manera similar éxito limitado. Los estudios clínicos pilotos sugieren que la nicotina puede ser útil para tratar déficits en atención y procesamiento de la información que se producen por la enfermedad de Alzheimer. Sahakian, y col., Brit. J. Psych., 154, 797 (1989). Sin embargo, la nicotina, está escasamente biodisponible, y por lo tanto no útil como tratamiento clínico.

En la observación de la enfermedad de Alzheimer como estado inflamatorio crónico, McGeer y Rogers han propuesto el uso de agentes antiinflamatorios tales como indometazina, un fármaco que pone freno a la inflamación bloqueando la acción de la ciclooxigenasa, para tratar la enfermedad. McGeer, P. L., y col., patente de Estados Unidos Nº 5.192.753, emitida el 9 de marzo de 1993. En un estudio de 44 sujetos con demencia en fase temprana, se ha encontrado que el grupo que recibe el fármaco indometacina no deterioró la función mental durante el estudio. Schnabel, J., New Scientist, anteriormente. Sin embargo, diversos efectos secundarios de la indometacina, incluyendo efectos gastrointestinales, hacen su suo clínico problemático.

Garvey, y col., Patente de Estados Unidos Nº 5.409.946, emitida el 25 de abril de 1995, describen ciertos compuestos de oxazol, isotiazol y pirazol que potencian de manera supuesta la función cognitiva, pero no parece que traten la enfermedad de Alzheimer directamente.

En general, todos los procedimientos conocidos de tratamiento de la enfermedad de Alzheimer no han tenido éxito significativo. Por lo tanto, existe una clara necesidad de procedimientos mejorados de tratamiento de la enfermedad.

2. Tolerancia oral, y más generalmente, mucosal

Un planteamiento de tolerancia mucosal para tratar las enfermedades autoinmunes mediadas por células T se describe extensamente en la solicitud PCT internacional PCT Nº PCT/US93/0175. Este procedimiento implica la administración oral o mucosal de antígenos específicos al tejido bajo ataque autoinmune que pueden o no pueden ellos mismos ser una diana del ataque autoinmune ("antígenos espectadores"). La administración oral o mucosal de estos ("antígenos espectadores") produce la supresión activa, es decir la inducción de células T reguladoras (supresoras) en el tejido linfoide asociado al intestino (GALT), o, en el caso de la administración por inhalación, tejido linfoide asociado a bronquios (BALT). Véase también Miller, A., y col., J. Exp. Med., 174, 791 - 798 (1991). Estas células T supresores reguladoras en el tejido sanguíneo o linfático y después migran hasta el órgano o tejido aquejado con la enfermedad autoinmune en la que suprimen ataque autoinmune montado contra el órgano o tejido aquejado. Las células T generadas por el antígeno espectador (que reconoce al menos un epítope del antígeno espectador usado para generarlos) se dirigen al lugar del ataque autoinmune donde median la liberación local de una o más citoquinas inmunomoduladoras, tal como el factor de crecimiento transformante beta (TGF-\beta) interleuquina - 4 (IL - 4) o interleuquina - 10
(IL - 10) que regula hacia abajo la respuesta inmune.

De éstos, TGF-\beta es un factor inmunosupresor no específico de antígeno porque suprime todos los fenómenos de ataque inmune en la proximidad de su liberación independientemente del antígeno que desencadena estos fenómenos. (Sin embargo, debido a la tolerancia oral con un antígeno espectador provoca la liberación de sustancias inmunorreguladoras solamente en al vecindad de ataque autoinmune, no resulta inmunosupresión sistémica).

La IL - 4 e IL - 10 también son citoquinas inmunoreguladoras no específicas de antígeno. La IL - 4 en particular potencia la respuesta de Th2, es decir, actúa cobre los precursores de las células T y les provoca que se diferencien preferentemente en las células Th2. La IL - 4 también inhibe indirectamente la exacerbación de Th1. La IL - 10 es un inhibidor directo de las respuestas de Th1.

Después los mamíferos que se han hecho tolerantes de manera mucosal aquejados con enfermedad autoinmune, se observaron niveles aumentados de TGF - \beta, IL - 4 e IL - 10 en el tejido linfoide asociado a intestino (Chen, Y., y col., Science, 265, 1237 - 1240 (1994)) y una disminución simultánea en citoquinas asociado al sistema inmune (y particularmente activación de células T), tal como IL - 2, IFN - \gamma, etc. La regulación hacia abajo de citoquinas inflamatorias y regulación hacia arriba de TFB - \beta, e IL - 4, se observaron en los cerebros de ratas EAE después de la tolerancia mucosal de aquellos animales (Khoury y col., J. Exp. Med., 176, 1355 - 1364 (1992)).

Se diferencian células T no atacadas se diferencias en distintas poblaciones definidas por su patrón de secreción de citoquinas y función reguladora. Las células Th1 secretan predominantemente la interleuquina - 2 (IL - 2) e INF - \gamma
y están implicadas en reacciones de hipersensibilidad de tipo retrasado clásico, mientras que las células Th2, que secretan predominantemente IL - 4 e IL - 10, inducen la secreción de inmunoglobulina seleccionada y pueden regular hacia abajo las respuestas inmunes mediadas por Th1 Mossmann, T. R., y col., J. Immunol., 136, 2348 - 57 (1986); Romagnan, S., Annu. Rev. Immunol., 12, 227 - 57 (1994). De este modo, las citoquinas secretadas por las células T después de la activación influencian cuantitativamente en la naturaleza de la respuesta inmune. Recientes reseñas han sugerido que los factores dominantes que determinan la maduración de las células T no atacadas en o bien predominantemente en células Th1 o Th2 son citoquinas, particularmente IL - 2 e IFN - \gamma para Th1 e IL - 4 para Th2. Seder, R. A., y col., Annu. Rev. Immunol., 12, 635 - 673 (1994). Otros factores incluyen la dosis y tipo de antígeno, el tito de célula presentadora de antígeno (APC), y moléculas coestimuladoras implicadas en al activación. Una vez diferenciadas en tipo Th1 o Th2, las células T se pensó anteriormente que se sometían a la producción de un conjunto dado de linfoquinas tras estimulación. Sin embargo, se ha descubierto recientemente que ciertas células T CD4^{+}, específicas de MBP, aisladas del GALT de ratones SJL se hicieron tolerantes oralmente con proteína básica de mielina y los pacientes se hicieron tolerantes oralmente con mielina y estructuralmente idénticas a clones de Th1 que inducen enfermedad en términos de su uso de receptores de células T, restricción de MHC y reconocimiento de epítopes, se suprimen en lugar de inducir enfermedad y pueden representar un subconjunto de células T novedoso (Th3) con función tanto mucosal de auxiliares T como propiedades reguladoras hacia abajo respecto a Th1 y otras células inmunes.

La secreción de células T de ciertas citoquinas también está implicada en la inducción y regulación de enfermedad inflamatoria autoinmune, que está mediada por células T autorreactivas activadas que reconocen antígeno específico de tejido propio en el contexto de moléculas de clase II de MHC sobre APCs. En la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), un modelo para esclerosis múltiple, se cree que la secreción por las células T de IL - 2, IFN - \gamma,
y TNF media la inflamación y daño de tejido, mientras que la secreción de IL - 4, IL - 10, y TGF - \beta1 por las células T reactivas a la proteína básica de mielina (MBP) está a asociada a una actividad supresora potente y regulación hacia debajo de la inflamación del sistema nervioso central. Miller, A., y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. U. S. A.., anteriormente (1992). La inducción de citoquinas antiinflamatorias, incluyendo TGF - \beta1, parece ser de particular importancia en la regulación de EAE. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales anti - TGF - \beta1 inhiben el efecto supresor de células T reactivas a MBP reguladoras. Chen., Y., y col., Science, anteriormente (1994). De este modo, las células T autorreactivas no son necesariamente patológicas y pueden funcionar para regular hacia abajo respuestas inmunes asociadas a la inflamación de tejidos localmente. Similares hallazgos se han realizado en seres humanos aquejados con esclerosis múltiple. TNF se ha aislado de las placas del sistema nervioso central de pacientes de MS, ataques exacerbados IFN - \gamma, y TGF - \beta y/o IL - 4 y/o IL - 10 está secretado por células T de pacientes de MS hechos tolerantes con mielina.

Objetos de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar procedimientos inmunomoduladores novedosos para tratar individuos que padecen enfermedad de Alzheimer y para prevenir la enfermedad en los individuos con riesgo de contraer la enfermedad.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar composiciones y formulaciones farmacéuticas útiles para prevenir la inducción de enfermedad de Alzheimer en modelos de animales y para tratar mamíferos que padecen la enfermedad.

Un objeto adicional de esta invención es proyectar procedimientos y composiciones para suprimir ciertas respuestas de citoquinas asociadas a la enfermedad de Alzheimer en un individuo mediante un modo mucosal de administración, y para potenciar otras ciertas respuestas de citoquinas asociadas a la supresión de respuestas inflamatorias asociadas a la enfermedad.

Otro objeto de la invención es evitar la deposición de amiloide \beta.

Estos y otros objetos de la presente invención serán evidentes para los expertos en la técnica a la luz de lo siguiente.

Sumario de la invención

Inesperadamente se ha descubierto mediante los presentes inventores que la administración nasal en una forma de aerosol de un antígeno asociado a las placas amiloides \beta (tales como el péptido amiloide \beta y los fragmentos del mismo) es un tratamiento eficaz para la enfermedad asociada a dichas placas. En un aspecto, la invención se refiere al uso de una cantidad eficaz de un antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos de péptido amiloide \beta o un fragmento eficaz o análogo del mismo en la fabricación de un medicamento para la administración nasal en una forma de aerosol, para tratar un mamífero que sufre de enfermedad de Alzheimer en el que el medicamento se ha de administrar durante un período de tiempo suficiente para lograr al menos uno de lo siguiente:

(i)

reducción en el nivel de una o más citoquinas Th1 proinflamatorias;

(ii)

incremento en el nivel de uno o más citoquinas Th2 o Th3 antiinflamatoias;

(iii)

mejora, inhibición o retraso del comienzo de al menos un síntoma clínico de la enfermedad de Alzheimer.

El péptido amiloide administrado por vía nasal de acuerdo con la invención puede iniciar respuestas inmunológicas en un sujeto que evita, retrasa o detiene la destrucción de células de neuronas y/o prevención de la deposición de amiloide \beta en neuronas.

La presente invención también se refiere a una formulación farmacéutica adaptada para administración nasal en una forma de aerosol a un mamífero en riesgo de contraer enfermedad de Alzheimer que comprende una cantidad eficaz de un polpéptido que comprende una secuencia de aminoácidos del péptido amiloide \beta o un fragmento o análogo eficaz del mismo para inhibir o retrasar el comienzo de al menos uno de los siguientes:

(i)

generación de una o más citoquinas Th1 proinflamatorias en el mamífero;

(ii)

descenso en la cantidad de una o más citoquinas Th2 o Th3 antiinflamatorias en el mamífero; o

(iii)

aparición de al menos un síntoma clínico de al enfermedad.

Éstas y otras realizaciones de la invención sujeto se describirán en la descripción detallada.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra la proliferación (expresada como índice de estimulación (S. I.)) de células T de bazos de ratones SWISSXBDBF1 de control o experimental o bien alimentados (75 \mug/alimento x 5) o tratados por vía nasal (25 \mug/aplicación x 3) con péptido amiloide \beta [1 - 40] e inmunizados 2 días después del último tratamiento con 100 \mug de péptido amiloide \beta [1 - 40] en 50 \mug de CFA por ratón. La proliferación se determinó diez días después de la inmunización.

La figura 1 B ilustra la proliferación (expresada como S. I.) de células T de ganglios linfáticos popliteales a partir de ratones SWISSXBDBF1 de control y experimental y ratones alimentados o administrados por vía nasal con péptido amiloide \beta [1 - 40] determinada diez días después de haber sido inmunizados en la almohadilla de alimentación con 100 \mug de péptido amiloide \beta [1 - 40] en 50 \mug de CFA por ratón. La proliferación se determinó diez días después de la inmunización. Los ratones de control (designados "non") estaban solamente inmunizados.

La figura 2 A ilustra la proliferación (expresada como \DeltaCPM con relación a ratones no inmunizados) de células T de ganglios linfáticos popliteales de ratones SJL/J, DBA/1, C57BL/6, BALB/C y C3H/EB inmunizados con péptido amiloide \beta [1 - 40] pero no alimentados con péptido.

La figura 2 B ilustra la proliferación (expresada como \DeltaCPM en la figura 2 A) de células T de bazo de ratones SJL/J, DBA/1, C57BL/6, BALB/C y C3H/EB inmunizados con péptido amiloide \beta [1 - 40] pero no alimentados con péptido.

La figura 3 A ilustra la secreción (expresada como \Deltapg/ml con relación a controles no inmunizados) de citoquinas IL - 2, IFN - \gamma, IL - 4, IL - 10 y TGF - \beta en células T de ganglios linfáticos popliteales de ratones SJL/J, DBA/1, C57BL/6, BALB/C y C3H/EB inmunizados con péptido amiloide \beta [1 - 40] pero no alimentados con péptido.

La figura 3 B ilustra la secreción (expresada en \Deltapg/ml como el la figura 3 A) de citoquinas IL - 2, IFN - \gamma, IL - 4, IL - 10 y TGF - \beta en células T aisladas de bazos de ratones SJL/J, DBA/1, C57BL/6, BALB/C y C3H/EB inmunizados con péptido amiloide \beta [1 - 40] pero no alimentado con péptido.

La figura 4 A ilustra la secreción (expresada como en la figura 3 A) de citoquinas IL - 10 en células T de ganglios linfáticos popliteales de ratones C3H/EB o bien alimentados con (5, 50 ó 500 \mug/aplicación durante 5 días) o administrados por vía nasal (5, 50 ó 500 \mug/aplicación durante 3 días) de péptido amiloide \beta [1 - 40] antes de la inmunización (2 días después de la última alimentación o aplicación nasal) con 100 \mug de péptido amiloide \beta [1 - 40] en 50 \mug de CFA.

La figura 4 B ilustra la secreción (expresada como en la figura 3 A) de citoquinas IL - 10 en células T de bazo de ratones C3H/EB o bien alimentados con (5, 50 ó 500 \mug/aplicación durante 5 días) o administrados por vía nasal (5, 50 ó 500 \mug/aplicación durante 3 días) de péptido amiloide \beta [1 - 40] antes de la inmunización (2 días después de la última alimentación o aplicación nasal) con 100 \mug de péptido amiloide \beta [1 - 40] en 50 \mug de CFA.

La figura 5 A ilustra la secreción (expresada como en la figura 3 A) de citoquinas IL - 10 en células T de ganglios linfáticos popliteales de ratones C3H/EB o bien alimentados con (5, 50 ó 500 \mug/aplicación durante 5 días) o administrados por vía nasal (5, 50 ó 500 \mug/aplicación durante 3 días) de péptido amiloide \beta [1 - 40] antes de la inmunización (2 días después de la última alimentación o aplicación nasal) con 100 \mug de péptido amiloide \beta [1 - 40] en 50 \mug de CFA.

La figura 5 B ilustra la secreción (expresada como en la figura 3 A) de citoquinas IL - 10 de TGB - \beta en células T de bazos de ratones C3H/EB o bien alimentados con (5, 50 ó 500 \mug/aplicación durante 5 días) o administrados por vía nasal (5, 50 ó 500 \mug/aplicación durante 3 días) de péptido amiloide \beta [1 - 40] antes de la inmunización (2 días después de la última alimentación o aplicación nasal) con 100 \mug de péptido amiloide \beta [1 - 40] en 50 \mug de CFA.

La figura 6 A ilustra la secreción (expresada como en la figura 3 A) de TGB - \beta en células T de ganglios linfáticos popliteales de ratones C3H/EB o bien alimentados con (5, 50 ó 500 \mug/aplicación durante 5 días) o administrados por vía nasal (5, 50 ó 500 \mug/aplicación durante 3 días) de péptido amiloide \beta [1 - 40] antes de la inmunización (2 días después de la última alimentación o aplicación nasal) con 100 \mug de péptido amiloide \beta [1 - 40] en 50 \mug de CFA.

La figura 6 B ilustra la secreción (expresada como en la figura 3 A) de TGB - \beta en células T de bazos de ratones C3H/EB o bien alimentados con (5, 50 ó 500 \mug/aplicación durante 5 días) o administrados por vía nasal (5, 50 ó 500 \mug/aplicación durante 3 días) de péptido amiloide \beta [1 - 40] antes de la inmunización (2 días después de la última alimentación o aplicación nasal) con 100 \mug de péptido amiloide \beta [1 - 40] en 50 \mug de CFA.

La figura 7 A ilustra la secreción (expresada como en la figura 3 A) de IFN - \gamma en células T de ganglios linfáticos popliteales de ratones SWISSXBDF1 alimentados con 0 ó 75 mg de péptido amiloide \beta [1 - 40] 5 veces o administrados por vía nasal con 25 mg de mismo péptido 3 veces.

La figura 7 B ilustra la secreción (expresada como en la figura 3 A) de ll - 2, IL - 10, IL - 4 y TGB - \beta de células T como se describe en la figura 7 A.

La figura 8 A ilustra la secreción (expresada como en la figura 3 A) de IFN - \gamma en células T como se ha descrito en la figura 6 B.

La figura 8 B ilustra la secreción (expresada como en la figura 3 A) de ll - 2, IL - 4 e IL - 10 y TGB - \beta de células T como se describe en la figura 6 B.

Las figuras 9 A, 9 B, 9 C, 9 D enumera los resultados de la determinación de la carga de placa, secreción de citoquinas, y marcadores inflamatorias basándose en el examen de secciones de cerebro obtenidas de ratones PDAPP a los que se les administró por vía oral o nasal amiloide \beta [1 - 40].

Las figuras 10 A, 10 B y 10 C muestra los valores P calculados usando la prueba de U de Mann - Withney de 1 cola para diversas comparaciones de grupos entre los ratones PDAPP a los que se les administró por vía oral o nasal amiloide \beta [1 - 40].

La figura 11 muestra los resultados de inmunoensayos llevados a cabo sobre antisuero de ratones obtenido de ratones PDAPP para determinar la presencia de diversos subtipos de anticuerpos a amiloide \beta.

La figura 12 es un gráfico de barras que muestra los resultados de experimentos in vitro en los que PLN de ratones PADPP que se inmunizaron con péptido amiloide \beta [1 - 40] antes de sacrificar se ensayaron para evaluar la producción de IL - 2.

La figura 13 es un gráfico de barras que muestra los resultados de experimentos in vitro en los que PLN de ratones PADPP que se inmunizaron con péptido amiloide \beta [1 - 40] antes de sacrificar se ensayaron para la evaluar la proliferación en presencia de amiloide \beta [1 - 40].

La figura 14 es un gráfico de barras que muestra los resultados de experimentos in vitro en los que PLN de ratones PADPP que se inmunizaron con péptido amiloide \beta [1 - 40] antes de sacrificar se ensayaron para la evaluar la producción de IFN - \gamma.

La figura 15 es un gráfico de barras que muestra los resultados de experimentos in vitro en los que PLN de ratones PADPP que se inmunizaron con péptido amiloide \beta [1 - 40] antes de sacrificar se ensayaron para la evaluar la producción de IL - 6.

La figura 16 es un gráfico de barras que muestra los resultados de experimentos in vitro en los que PLN de ratones PADPP que se inmunizaron con péptido amiloide \beta [1 - 40] antes de sacrificar se ensayaron para la evaluar la producción de IL - 10.

La figura 17 es un gráfico de barras que muestra los resultados de experimentos in vitro en los que PLN de ratones PADPP que se inmunizaron con péptido amiloide \beta [1 - 40] antes de sacrificar se ensayaron para la evaluar la producción de TGF - \beta.

La figura 18 muestra los resultados de un experimento en el que se administró por vía nasal péptido amiloide \beta [1 - 40] a ratones (B6D2) F1 junto con administración nasal de IL - 4 o IL - 10, y antes de la inmunización de los ratones con péptido amiloide \beta [1 - 40]. La figura muestra la proliferación in vitro de células de bazo de los ratones en presencia del péptido amiloide \beta [1 - 40].

La figura 19 muestra los resultados de un experimento en el que se administró por vía nasal péptido amiloide \beta
[1 - 40] a ratones (B6D2) F1 junto con administración nasal de IL - 4 o IL - 10, y antes de la inmunización de los ratones con péptido amiloide \beta [1 - 40]. La figura muestra la producción de INF - \gamma in vitro de células de bazo de los ratones en presencia del péptido amiloide \beta [1 - 40].

La figura 20 muestra los resultados de un experimento en el que se administró por vía nasal péptido amiloide \beta
[1 - 40] a ratones (B6D2) F1 junto con administración nasal de IL - 4 o IL - 10, y antes de la inmunización de los ratones con péptido amiloide \beta [1 - 40]. La figura muestra la producción de IL - 6 in vitro de células de bazo de los ratones en presencia del péptido amiloide \beta [1 - 40].

La figura 21 muestra los resultados de un experimento en el que se administró por vía nasal péptido amiloide \beta
[1 - 40] a ratones (B6D2) F1 junto con administración nasal de IL - 4 o IL - 10, y antes de la inmunización de los ratones con péptido amiloide \beta [1 - 40]. La figura muestra la producción de IL - 10 in vitro de células de bazo de los ratones en presencia del péptido amiloide \beta [1 - 40].

La figura 22 muestra los resultados de un experimento en el que se administró por vía nasal péptido amiloide \beta
[1 - 40] a ratones (B6D2) F1 junto con administración nasal de IL - 4 o IL - 10, y antes de la inmunización de los ratones con péptido amiloide \beta [1 - 40]. La figura muestra la producción de TGB - \beta in vitro de células de bazo de los ratones en presencia del péptido amiloide \beta [1 - 40].

Descripción detallada de la invención

Los siguientes términos como se usan es esta descripción tienen los significados atribuidos a ellos más adelante.

"Mamífero" se define en esta memoria descriptiva como un organismo vertebrado superior de sangre caliente (incluyendo un ser humano que tiene un sistema inmune y que es susceptible a la enfermedad de Alzheimer o un modelo animal inducido o espontáneo del mismo.

"Péptido amiloide \beta" pretende incluir un fragmento peptídico de entre aproximadamente 10 y 43 (preferiblemente 13 - 43) restos de aminoácidos, cuya secuencia se deriva de proteína precursora de amiloide \beta, preparada o bien mediante procedimientos químicos de síntesis conocidos en la técnica de péptidos, incluyendo procedimientos enzimáticos o procedimientos de biosíntesis tales como mediante aislamiento de fragmentos de péptidos de cualquier otra fuente, incluyendo cultivos de tejido nativo, o mediante procedimientos de ingeniaría genética recombinante. Los ejemplos no limitantes de fragmentos de péptido amiloide \beta comprendidos por el presente procedimiento y formulaciones incluyen [1 - 40] A\beta, [1 - 42] A\beta, [25 - 35] A\beta, y los análogos de los mismos que contienen sustancialmente secuencias similares y homólogas; reemplazos no peptídicos o isostéricos para residuos seleccionados. Los fragmentos peptídicos eficaces incluyen los que tienen la propiedad de suprimir una citoquina Th1 proinflamatoria, que disminuye la cantidad de un marcador inflamatorio; incrementando la cantidad de una citoquina Th2 o Th3 antiinflamatoria, o suprimiendo la deposición de amiloide \beta,. Los reemplazos homólogos suponen residuos de aminoácidos de estructura relacionada y diferenciándose solamente en el número de grupos metileno presentes en el resto. Los reemplazos no peptídicos incluyen estructuras orgánicas con propiedades conformacionales similares a los restos aminoácidos naturales. Los reemplazos isostéricos se refieren a restos con o bien sustituciones de átomos individuales (por ejemplo, S por O en el hidroxilo aromático en tirosina) o sustituciones de un resto por otro que ocupa un volumen similar de espacio (por ejemplo, un grupo aminoácido por un grupo metilo). Los péptidos amiloides \beta útiles administrados de acuerdo con la invención incluyen, entre otros, los que tienen las secuencias de amiloide \beta humano, bovino, y de ratón. Se prefiere administrar a seres humanos un péptido amiloide \beta que tiene la secuencia de aminoácidos del péptido A\beta humano o bovino [1 - 43] o un fragmento del mismo reconocido por las células T del huésped que suprime la reacción autoinmune asociada a la enfermedad de Alzheimer. El péptido puede formar parte de una secuencia de aminoácidos más larga mientras que el sitio de reconocimiento de células T no se altere.

"Disminución", "supresión" o "reducción" de una respuesta o reacción inmune incluye reducción o mejora parcial de uno o más síntomas del ataque o reacción, por ejemplo, reducción en el número de células T activadas o en número de anticuerpos o en los niveles de al menos una citoquina proinflamatoria en los niveles de al menos una citoquina antiinflamatoria, tal como TGF - \beta, IL - 4, IL - 10.

"Tratamiento" de enfermedad de Alzheimer pretende incluir, aunque sin limitación a, uno o más de lo siguiente:

(i)

alteración de un perfil de una o más citoquinas o marcadores inflamatorios en un paciente o modelo animal de Alzheimer de manera que sea conforme a o se aproxime al perfil de citoquina de un sujeto emparejado de sexo y edad sin alteración cognitiva;

(ii)

un retraso en el progreso de demencia relacionada con Alzheimer según se evalúa por al menos una alteración cognitiva y otros criterios de NINCDS - ADRFA (McKhan y col., 1984) que incluye sin limitación recuento sanguíneo, química de la sangre, vitamina B12, ácido fólico, VDRL, función tiroide, electroencefalograma, tomografía por ordenador, o criterios de acuerdo con el registro de seres vivos independientes.

(iii)

una mejora de demencia evaluada mediante uno o más de los síntomas, factores y criterios detallados en el punto (ii) de esta definición, o mediante observación por un medico especializado en Alzheimer, o

(iv)

una disminución en la cantidad de placa asociada a amiloide \beta que de otra manera se habría observado ausente del tratamiento.

La tolerancia mucosal de acuerdo con la invención es un procedimiento ventajoso para tratar la enfermedad de Alzheimer, disfunción por al menos las siguientes razones:

(1) Ausencia de toxicidad. Por ejemplo, no se ha observado toxicidad en ensayos clínicos o experimentos de animales que implican administración oral o distinta de la mucosal de otros antígenos de proteínas, tales como mielina bovina (que contiene MBP y PLP) a seres humanos aquejados de esclerosis múltiple, o administración oral o mediante inhalación de colágeno de tipo II de pollo a seres humanos o roedores aquejados de artritis reumatoide (o una enfermedad de modelo animal correspondiente); o administración oral de S-antígeno de bovinos aquejados de uveorretinitis; o administración oral de insulina a voluntarios sanos.

(2) Conveniencia de terapia. La administración mucosal es más conveniente que la parenteral, u otras formas de administración.

Los presentes inventores llevaron a cabo una serie de experimentos para descubrir si las técnicas de tolerancia mucosal provocan la supresión de inflamación relacionada con el amiloide \beta característica de la enfermedad de Alzheimer. El uso de la vía mucosal para inducir tolerancia contra una respuesta autoinmune se encontró eficaz en un modelo animal para suprimir respuestas inmunes indeseables asociadas a la enfermedad de Alzheimer, y para reducir los síntomas histológicos de la enfermedad en un modelo animal. La alimentación de antígeno se implementó en animales de ensayo como un medio de generación de tolerancia periférica, y era exitoso en hacer tolerante las respuestas de tipo Th1, mientras incrementaba la respuesta de linfocitos Th2 y Th3, incluyendo incremento de respuestas de citoquinas antiinflamatorias así como un descenso de la proliferación de ganglios linfáticos popliteales en ratones C3H/eb y DBA/1. En un modelo de ratón de al enfermedad de Alzheimer que estimula la deposición de amiloide \beta, el modelo de PDAPP, las respuestas de tipo Th1 antiinflamatorias se suprimían mediante administración mucosal de amiloide \beta.

El presente procedimiento de tratamiento de enfermedad de Alzheimer basada en la administración mucosal da como resultado, en una realización, la regulación de la respuesta inmune específica que se piensa que está asociada a la enfermedad. Aunque sin querer estar sujeto a ninguna teoría, los presentes inventores creen que la supresión de esta respuesta se efectúa principalmente mediante un mecanismo de supresión activo., es decir, la generación de células T caracterizadas por un perfil de citoquina antiinflamatorio. También, como se describe más adelante, el procedimiento de la invención ha estado asociado con la inducción de anticuerpos de amiloide \beta que, sin querer estar sujeto a ninguna teoría de la invención, puede tener un papel en los resultados beneficiosos observados.

Como se muestra en los resultados descritos más adelantes, el procedimiento presente puede dar como resultado la supresión de la deposición de amiloide \beta. Los experimentos descritos en los ejemplos muestran que la deposición de amiloide \beta estaba suprimido en un modelo de enfermedad de Alzheimer de ratón.

Administración "mucosal" incluye administración oral, entérica, intragástrica, nasal, bucal o intrapulmonar, y más generalmente cualquier procedimiento de administración (por ejemplo, mediante inhalación) de un ingrediente activo que pone el ingrediente en contacto con el sistema inmune del sujeto tratado en el tejido linfoide asociado a mucosa, (MALT), incluyendo la mucosa del intestino, nasal, bucal, bronquial o pulmonar. En los experimentos descritos más adelante, la administración mediante inhalación se ha encontrado que es particularmente eficaz.

En una realización, la presente invención proporciona el uso de una cantidad eficaz de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de péptido amiloide \beta o un fragmento análogo del mismo en al fabricación de un medicamento para administración nasal en una forma de aerosol para tratar un mamífero que sufre (o en riesgo de desarrollar) enfermedad de Alzheimer. El polipéptido puede ser, por ejemplo, amiloide [1 - 40], amiloide [1 - 42], amiloide [25 - 35] u otro péptido amiloide \beta mayor que aproximadamente 10 aminoácidos de longitud. En una realización, la secuencia del péptido amiloide \beta es mayor que 15 aminoácidos de longitud, y en otra mayor que 20 aminoácidos de longitud. El medicamento a administrar durante un período de tiempo suficiente para lograr un cambio en uno de los parámetros descritos anteriormente. En una realización preferida, la presente invención proporciona el uso como se ha descrito en el que el mamífero es un ser humano.

En realizaciones adicionales, la presente invención proporciona la formulación farmacéutica como se ha descrito anteriormente que comprende además un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

La presente invención suministra también una formulación farmacéutica para la administración a un mamífero que sufre enfermedad de Alzheimer que comprende una forma de dosificación de acuerdo con la invención adaptada para administración nasal. En una realización preferida, la presente invención proporciona la formulación farmacéutica en forma de pulverización o aerosol a administrar mediante inhalación como se ha descrito anteriormente que comprende además un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. La formulación puede, por ejemplo, administrarse en un nebulizador o inhalador. Tales formas de dosificación se usan para lograr los resultados particularmente beneficiosos que se han determinado por los inventores que están asociados con la administración mediante inhalación, por ejemplo, mediante administración nasal.

Antígenos que se pueden usar para inducir tolerancia

Los antígenos adecuados para uso en la invención incluyen antígenos específicos de la enfermedad de Alzheimer, es decir, antígenos que se reconocen por las células T de un huésped humano o animal., Los ejemplos no limitantes incluyen péptido amiloide \beta sintético o biosintético, incluyendo fragmentos peptídicos de los mismos que contienen entre 10 y 43 residuos, preferiblemente entre 13 t 43 residuos. Los ejemplos de tales antígenos incluyen los péptidos amiloide \beta [1 - 40] A\beta, [1 - 42] A\beta y [25 - 35] A\beta. Abarcadas dentro de la presente invención son diversas sustancias relacionadas que comparten al menos uno de tales sitios de reconocimiento de células T con péptido amiloide \beta. Tales sustancias incluyen análogos de péptido amiloide \beta que varía en longitud o composición, pero conteniendo sustancialmente secuencias similares (es decir, que poseen niveles significantes, por ejemplo, entre aproximadamente 40% y aproximadamente 95%, de homología de secuencia primaria). Tales sustancias también incluyen construcciones peptídicas de análogos de péptido amiloide \beta (o anteriormente mencionada) del mismo y una o más secuencia de aminoácidos flanqueantes encontrada en la proteína de amiloide \beta o de origen amiloide \beta extra. La invención incluye la administración de proteína precursora amiloide, y de homólogos de esa proteína; los ejemplos se describen en las patentes de Estados Unidos números 5.525.714, 5.441.931, y 5.436.153. La proteína precursora amiloide también se describe en las patentes números 5.318.958 y 5.218.100. Los clones de ADNc que codifican amiloide se describen también en la patente de Estados unidos nº 4.912.206. La invención también abarca péptidos que tienen sustituciones de aminoácidos conservadoras con respecto a péptidos de amiloide \betade origen natural, por ejemplo, que tienen una o más, preferiblemente menos que cinco, sustituciones conservadoras con respecto a las secuencias humanas, bovinas, o de ratón. Los procedimientos para determinar la eficacia de tales péptidos de amiloide \beta, análogos de péptido amiloide \beta y construcciones que comparten al menos un sitio de reconocimiento de células T con péptido de amiloide \beta se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, el procedimiento de superposición de péptido se puede usar para ensayar diversos fragmentos (que tienen al menos 10 y preferiblemente 20 residuos de aminoácidos) de péptido amiloide \beta A\beta [1 - 39] (o A\beta [1 - 43] como puede ser el caso) colocándolos en contacto con una preparación que contiene células T inmunes aisladas a partir de un huésped que sufre de enfermedad de Alzheimer y determinar la proliferación de tales células. Adicionalmente, los patrones de citoquina de tales células se pueden analizar usando la metodología proporcionada más adelante en los ejemplos para purificar adicionalmente la elección de un péptido. En una realización, el péptido es uno que provoca que las células T secreten citoquinas antiinflamatorias para proliferar. En otra realización, el péptido es uno que provoca supresión de una o más respuestas inflamatorias, si provoca o no que las células T secreten citoquinas antiproliferativas que de otra manera incrementa la producción de tales citoquinas antiinflamatorias. Están también abarcados los péptidos que suprimen la deposición de amiloide \beta, como se muestra, por ejemplo, en el modelo de ratón descrito en los ejemplos. En otra realización, están abarcados los péptidos que provocan un incremento en la calidad de anticuerpos anti - amiloide \beta presente en suero, por ejemplo, en el suero de un huésped humano o no humano que sufre, o predispuesto a, enfermedad de Alzheimer o un modelo de enfermedad de enfermedad de Alzheimer de péptido amiloide \beta, pero incluyendo uno, dos, o tres puntos de contacto alterado para MHC o receptor de células T, como se determina por procedimientos conocidos en la técnica usando células obtenidas de paciente de
Alzheimer.

Formulaciones para la administración mucosal

La administración de uno o más antígenos es posible, y puede ser deseable (por ejemplo, cuando las células T inmunes del paciente reconocen más de un antígeno).

La formulación adecuada de acuerdo con la invención, es una formulación adaptada para administración nasal. La preparación de tal formulación se encuentra también dentro de la experiencia en la técnica. Se prefiere que los antígenos empleados sean de procedencia sintética y no aislados de fuentes biológicas para evitar el riesgo de invención (notablemente, pero no exclusivamente, para evitar la transmisión del agente responsable de la enfermedad de Creutzfeld - Jacob). Adicionalmente, se prefiere que la formulación no contenga agentes promotores de adsorción o ingredientes que protegen contra la degradación proteolítica. Sin embargo, como de describe adicionalmente más adelante, los antígenos se pueden combinar con uno o más agentes potenciadores, tales como IL - 4 o IL - 10, para incrementar la eficacia de la formulación.

Para la administración mediante inhalación (es decir, distribución a la mucosa broncopulmonar) de pulverizaciones y aerosoles se pueden usar, por ejemplo usando un nebulizador tal como los descritos en las patentes de Estados Unidos números 4.624.251 emitida el 25 de noviembre de 1986; 3.703.173 emitida el 21 de noviembre de 1972; 3.561.444 emitida el 9 de febrero de 1971 y 4.635.627 emitida el 13 de enero de 1971. El material aerosol se inhala por el sujeto a tratar.

Otros sistemas de distribución de aerosol, tal como el inhalador de dosis medida presurizada (MDI) y el inhalador de polvo seco como se describe en Newman, S. P. en Aerosols and the Lung, Clarke, S. W y Davia, D, eds. p. 197 - 224, Butterworths, Londres, Inglaterra, 1984, se pueden usar cuando se practica la presente invención.

Los sistemas de distribución de aerosol del tipo describen esta memoria descriptiva están disponibles de numerosas fuentes comerciales incluyendo Fisons Corporation (Bedford, MA), Schering Corpo. (Kenilworth, NJ) y American Pharmoseal Co. (Valencia, CA).

Las formulaciones para administración nasal se pueden administrar en forma de un polvo seco o en una solución acuosa. Las formulaciones farmacéuticas de aerosol preferidas pueden comprender por ejemplo, una solución salina tamponada fisiológicamente aceptable que contiene el antígeno amiloide \beta de la presente invención.

El aerosol seco en la forma de partículas de amiloide \beta finamente divididas que no se disuelven o suspenden en un líquido son útiles en las forma de polvos sueltos y comprenden partículas finamente divididas que tienen un tamaño medio de partícula de entre aproximadamente 1 y 5 \mum, preferiblemente entre 2 y 3 \mum. Las partículas de antígeno finamente divididas se pueden preparar mediante pulverización y filtración por tamiz usando técnicas bien conocidas en la técnica. Las partículas se pueden administrar mediante inhalación de una cantidad predeterminada del material finamente dividido, que puede estar en la forma de un polvo.

Los ejemplos específicos no limitantes de los vehículos y/o diluyentes que son útiles en las formulaciones farmacéuticas incluyen agua y soluciones salinas tamponadas fisiológicamente aceptables tales como soluciones salinas tamponadas con fosfato pH 7,0 - 8,0.

La formulación administrada por vía nasal de la presente invención puede incluir un gel termofijador que incrementa en viscosidad a temperatura del cuerpo tras contacto con la mucosa nasal.

Las cantidades eficaces se anticipa que varían de acuerdo con la formulación empleada. Para la formulación administrada mediante inhalación la cantidad eficaz es probablemente menor que la de una dosis oral.

La duración del tratamiento en seres humanos debe ser un mínimo de dos semanas, y típicamente tres meses, y se puede continuar indefinidamente mientras persistan los beneficios. El tratamiento se puede discontinuar si se desea (a juicio del médico asistente) y el paciente controlarse para signos de recaída. Si los síntomas clínicos u otros indicadores de enfermedad muestran que el paciente esta recayendo, el tratamiento se debe continuar.

Como entenderán los expertos en al técnica, la dosificación variará con e antígeno administrado y puede variar con el sexo, edad, y condición física del paciente así como otros tratamientos simultáneos que se están administrando. Por consiguiente, el ajuste y refinamiento de una o ambas de las dosificaciones usadas y los programas de administración se determinarán preferiblemente basándose en estos factores y especialmente en al respuesta del paciente al tratamiento. Sin embargo, tales determinaciones no requieren más que experimentación rutinaria, como se ilustra en los ejemplos proporcionados más adelante.

La administración de antígenos de amiloide \beta se pueden juntar con la administración mucosal de uno o más potenciadores, es decir, sustancias que potencian uno o más efectos beneficiosos de los antígenos de amiloide \beta. Tales potenciadores incluyen LPS, Lípido A (como se describe en la solicitud de Estados Unidos Nº de serie 08/202.677, publicada como el documento WO 91/01333 IL - 4, IL - 10 e interferones de tipo I, que incluyen interferón \alpha e interferón \beta (véase, por ejemplo, la solicitud de Estados Unidos Nº de serie 08/420.980 y 08/420.979 y documentos WO 95/27499 y WO 95/27500, subunidad \beta de la toxina de cólera, y LTB (enterotoxina lábil al calor). Los experimentos que se han llevado a cabo, descritos adicionalmente mas adelante, en los que la administración de IL - 4 junto con péptido amiloide \beta reencontró que era particularmente eficaz. Como se usa en este párrafo, "junto con" significa antes, sustancialmente simultáneamente con, o después de la administración de estos antígenos. Naturalmente, la administración de la sustancia conjunta no debe preceder ni seguir a la administración del antígeno mientras que un intervalo de tiempo hasta que los efectos relevantes de la sustancia administrada se haya agotado primero. Por lo tanto, los potenciadores se deben administrar usualmente dentro de las 24 horas antes o después de los antígenos amiloide \beta y preferiblemente dentro de aproximadamente una hora.

La invención se describe adicionalmente más adelante con referencia a los ejemplos, cuyo propósito es ilustrar la presente invención sin limitar su alcance.

Ejemplo 1

Animales experimentales

Se usaron ratones BAlB/C hembras (de 6 - 8 semanas de edad); DBA/2; C3H/eb; C47b1/6; SWISSXBDF1 o SHL/J. Los animales se mantuvieron en un ambiente controlado de temperatura ambiente con acceso libre a alimento y agua.

Inmunización

Los ratones se inmunizaron con 100 \mug de péptido amiloide \beta [1 - 40] ([1 - 40] A\beta) emulsionado en 50 \mug de CFA (Difco Laboratories, Inc.). El día 10, se retiraron los ganglios linfáticos popliteales y los bazos y para la proliferación de células T y producción de citoquinas.

Ensayo de proliferación

Se cultivarin células (5 x 105 por pocillo) por triplicado en placas de fondo redondo de 96 pocillos (Falcon ™, Becton Dickinson, Lincoln Park, New Jersey) en presencia de antígeno (1 - 100 \mug/ml) durante 72 horas. Se añadió [^{3}H] Timidina (1 \muCi/pocillo) durante las últimas 7 horas de cultivo antes de recoger las células. La incorporación de [^{3}H] timidina se determinó usando un contador de centelleo Betaplate (Beckman Instruments Inc., Fullerton, California). La respuesta de proliferación se midió como \Deltacpm (cpm [ensayo] - cpm [control sin antígeno]). En índice de estimulación (SI) se calculó como cpm medias [con antígeno]/cpm medias [sin antígeno].

La figura 1 A muestra la supresión significativa de la proliferación de células de bazo de ratones SWISSXBDF1 (hermanos de camada no transgénicos de modelo de Alzheimer) o bien alimentados (75 \mug/alimentación x 5) o tratados por vía nasal (25 \mug/aplicación directa e inmunizados dos días después del último tratamiento con 100 \mug de péptido amiloide \beta [1 - 40] en 50 \mug de CFA por ratón. La figura 1 B muestra la supresión de la proliferación en ganglios linfáticos popliteales de ratones SWISSXBDF1 o bien alimentados o tratados por vía nasal con péptido amiloide \beta [1 - 40] se determinó diez días después de estar inmunizados en el lecho de alimentación con 100 \mug de péptido amiloide \beta [1 - 40] en 50 \mug de CFA por ratón. Los resultados muestran que la proliferación de células T de ganglios linfáticos popliteales a péptido amiloide \beta [1 - 40] se suprimía significativamente en los ratones tratados (alimentados o tratados por vía nasal con el mismo péptido) comparado con los controles no tratados. Estos resultados son particularmente significativos dado que las células ensayadas para evaluar la respuesta proliferativa se recogieron justo 10 días después de inmunización, antes de que el efecto de inmunización se redujera.

La figura 2 A compara la proliferación de células T de ganglios popliteales de ratones SJL/J, DBA/1, C5/BL/6, BALB/C y C3H/EB inmunizados con péptido amiloide \beta [1 - 40]. La figura 2 B compara la proliferación en células de bazo de ratones SJL/J, DBA/1, C5/BL/6, BALB/C y C3H/EB inmunizados con péptido amiloide \beta [1 - 40]. Estos experimentos muestran que muchas raza de ratones normales (ratones no transgénicos, no modelo de Alzheimer) responden a ratones SJL/J, DBA/1, C5/BL/6, BALB/C y C3H/EB inmunizados con péptido amiloide \beta [1 - 40]., dentro de un corto tiempo después de la inmunización. Se debe observar que las células para el experimento mostrado en este ejemplo están estimuladas con antígeno solamente una vez in vitro antes del ensayo de proliferación. Las estimulaciones adicionales emplearía la respuesta de la cepa no respondedora aparente C57BL/6 y (DBA/1). Este experimento proporciona información sobre la capacidad de respuesta de las células de diversas cepas y era útil en el diseño de los experimentos posteriores descritos a continuación. Se cree que es ventajoso seleccionar "buenos respondedores" (tales como C3H/EB) pero no "demasiado altos respondedores" (SJL/J era de este modo no
elegido).

Ejemplo 2

Ensayos de producción de citoquinas

Se determinaron los niveles de IL - 4, IL - 2, IL - 10, TGF - \beta e INF - \gamma en sobrenadantes mediante ELISA de captura como se ha descrito. Friedman, A., y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. U. S. A.., 91, 6688 (1994); Yang, X., y col., J. Immunol., 150, 4354 (1993). En resumen, los sobrenadantes se añadieron para microvalorar (Maxisorp) las placas, previamente revestidas con anticuerpos monoclonales IL - 4, IL - 2, IL - 10, TGF - \beta o IFN - \gamma anti - ratón de rata (anticuerpos de captura, Pharmingen; 1 \mug/ml a 4ºC durante la noche) y se bloquearon con BSA - diluyente/ solución de bloqueo (KPL). Se lavaron las placas, y se añadieron patrones y muestras para otra incubación durante la noche a 4ºC. La citoquina unida se detectó mediante la adición de ABTS (Kirkegaard y Perry). Se lavaron los pocillos, y los niveles de citoquina se determinaron usando anticuerpos monoclonales IL - 4, IL - 2, IL - 10, TGF - \beta o IFN - \gamma anti - ratón de rata biotinilados (anticuerpos de detección, Pharmingen) y un sistema de visualización de peróxido (estreptavidina marcada con peroxidasa). IL - 2 e IFN - \gamma después de 40 horas y TGF - \beta después de 72 horas. Los niveles de citoquina se calcularon a partir de una representación gráfica log - log de absorbancia frente concentración de citoquinas recombinantes (Pharmigen), y los resultados se expresan en pg/ml (para IL - 4, IL - 2, IL - 10, TGF - \beta o IFN - \gamma) Las sensibilidades umbrales se los ensayos de ELISA eran 5 pg/ml, 10 pg/ml y 2,5 ng/ml para IL - 4, IL - 2 e IFN - \gamma respectivamente.

Análisis estadístico

La significación estadística de las diferencias entre grupos experimentales se determinó usando el ensayo de r de Student de dos colas no apareada, con diferencias consideradas significativas a P < 0,05.

Determinación de que los ratones expuestos a péptido A\beta o bien alimentados o administrados por vía nasal muestran supresión de citoquinas inmunoestimuladoras (proinflamatorias) (por ejemplo, IL - 2 e IFN - \gamma) y potenciación de las citoquinas inmunorreguladoras (antiinflamatorias) (por ejemplo, IL - 4, IL - 10 y TGF - \beta) in vivo

Ratones C3H/eb se alimentaron con A\beta [1 - 40] 500 \mug/alimentación, 50 \mug/alimentación, o 5 \mug/alimentación (200 \mul/alimentación). La administración nasal se proporcionó a 50 \mug/aplicación o 5 \mug/aplicación cada día durante 3 días (10 \mul/aplicación). Dos días después de la última alimentación o administración nasal, ratones alimentados, por vía nasal o no alimentados se inmunizaron en el lecho de alimentación con 100 \mug A\beta [1 - 40] en 50 \mug de CFA por ratón.

La figura 3 A proporciona una comparación de al secreción de citoquinas IL - 2, IFN - \gamma, IL - 4, IL - 10 y TGF - \beta en ganglios linfáticos popliteales de ratones SJL/J, DBA/1, C57BL/6, BALB/C y C3H/EB inmunizados con péptido amiloide \beta [1 - 40] pero no alimentados o tratados de otra manera con el péptido. La figura 3 B compara la secreción de estas citoquinas en células de bazo de un intervalo similar de raza de ratones inmunizados con péptido amiloide \beta
[1 - 40] (también no tratado con el péptido). La comparación de los resultados en la figura 3 A y figura 3 B muestra que las células T de bazos secretan un perfil de citoquina diferente del de las células T de ganglios linfáticos popliteales, y que el perfil de citoquina varía con la raza de ratón. De la misma manera, la razón para este experimento es seleccionar respondedores que mostrarán un diferencia en la propiedad ensayada en las condiciones experimentales.

La figura 4 A muestra la secreción de la citoquina IL - 10 inmunorreguladora en ganglios linfáticos popliteales de ratones C3H/EB o bien alimentados (5, 50 ó 500 \mug/alimentación durante 5 días) o administrados por vía nasal (5 ó 50 \mug/aplicación durante 3 días) péptido amiloide \beta [1 - 40] antes de la inmunización (2 días después de la última alimentación o aplicación nasal) con 100 \mug de péptido amiloide \beta [1 - 40] en 50 \mug de CFA. La figura 4 A muestra la secreción de citoquina IL - 10 en células de bazo de ratones C3H/EB o bien alimentados o administrados por vía nasal con péptido amiloide \beta [1 - 40] en condiciones similares. Este experimento también servía como un experimento de respuesta de dosis preliminar para esta raza de ratón. Dado que las células T experimentaron una única estimulación in vitro y que los efectos de la inmunización (que suprimirían los niveles de IL - 10 en todos los ratones ensayados) no habían disminuido, los resultados, que muestran potenciación significativa de IL - 10 a menos uno de los bazos y células PLN tratados con al menos una dosis, proporciona una muestra de que el perfil de citoquina de las células T que reconocen péptido amiloide \beta [1 - 40] se puede alterar haciéndose tolerante al mismo
antígeno.

La figura 5 A ilustra el resultado en la secreción de la citoquina IL - 2 inmunoestimuladora (proinflamatoria) de Th1 en ganglios linfáticos popliteales de ratones C3H/EB a diversos niveles de alimentación (5, 50 y 500 \mug/alimentación durante 5 días) y cuando se administran por vía nasal (5 ó 50 \mug/aplicación durante 3 días) con péptido amiloide \beta
[1 - 40] antes de la inmunización (2 días después de la última alimentación o aplicación nasal) con 100 \mug de péptido amiloide \beta [1 - 40] en 50 \mug de CFA. La figura 5 B de manera similar muestra la secreción de citoquina IL - 10 en células de bazo de ratones C3H/EB o bien alimentados (a dosis bajas, por ejemplo, 5 \mug/alimentación durante 5 días) o administrados por vía nasal (a 50 \mug/alimentación durante 3 días) con péptido amiloide \beta [1 - 40] antes de la inmunización (2 días después de al última alimentación o aplicación nasal) con 100 \mug de péptido amiloide \beta [1 - 40] en 50 \mug de CFA. El hecho de que la secreción de IL - 2 se suprime al menos a una dosis de tratamiento en o bien el bazo o células T muestra la supresión de respuesta de Th1 a pesar de la programación no óptima (i), del experimento (con relación al tiempo de inmunización); (ii) y cantidad de alimento; y (iii) estimulación de células in vitro (solamente una vez). La supresión de la secreción de IL - 2 era clara por administración nasal (figura 5 A) y a 5 \mug de alimento y 50 \mug nasal (figura 5 B). Basándose en los resultados para la figura 5 A, y las figuras 5 B, 6 A, 6 B, y 7 A, 7 B, se decidió usar 25 \mug por vía nasal y 75 \mug por vía oral en experimentos posteriores. Éstas no son cantidades óptimas, pero proporcionan una cantidad para demostrar diferencias dentro de las condiciones experimentales empleadas. Véanse las figuras 8 A y 8 B más adelante.

La figura 6 A muestra la secreción de TGF - \beta en ganglios linfáticos popliteales de ratones C3H/EB o bien alimentados (a dosis bajas, 5 o 50 \mug/alimentación durante 5 días) o administrados por vía nasal (a 50 \mug/alimentación durante 3 días) con péptido amiloide \beta [1 - 40] antes de la inmunización (2 días después de al última alimentación o aplicación nasal) con 100 \mug de péptido amiloide \beta [1 - 40] en 50 \mug de de células de bazo de ratones C3H/EB o bien alimentados (a dosis bajas, 5 y 50 \mug/alimentación durante 5 días) o administrados por vía nasal (a 50 \mug/alimentación durante 3 días) con péptido amiloide \beta [1 - 40] antes de la inmunización (2 días después de al última alimentación o aplicación nasal) con 100 \mug de péptido amiloide \beta [1 - 40] en 50 \mug de CFA.

Ejemplo 3

Perfiles de citoquina después de la alimentación o administración nasal e inmunización de hermanos de camada no transgénicos del modelo de ratón transgénico de la enfermedad de Alzheimer

Alimentación e inmunización: ratones SWSSXXB6D2F1 se alimentaron con A\beta [1 - 40] 75 \mug/alimentación x 5 o administrados por vía nasal con 25 \mug/aplicación x 3, y 2 días después del último tratamiento, se inmunizaron con 100 \mug de A\beta [1 - 40] en 50 \mug de CFA. Diez días después, células T de ganglios linfáticos popliteales y de bazo se comprobaron para producción de citoquina como se ha descrito anteriormente. Los resultados de estos experimentos demostraron que ratones pretratados con péptido A\beta e inmunizados con péptido A\beta tenían un reducida respuesta in vitro a la estimulación por A\beta para las citoquinas proinfalmatorias (Th1) (e IFN - \gamma e IL - 2 al menos conforme a la administración nasal de 25 \mug) y un aumento de respuesta para las citoquinas antiinflamatorias (Th2)
(TGF - \beta e IL - 10). La ausencia de TGF - \beta en ratones no tratados en la figura 8 B es particularmente significativo. Estas observaciones confirmaron los estudios descritos en los ejemplos 1 - 2 en ratones normales de varias razas que muestran un aumento de respuestas de citoquinas antiinflamatorias así como un descenso de la proliferación de PLN en ratones de ciertas cepas (por ejemplo, C3H/EB y DBA/1) que se habían hecho tolerantes por vía mucosal con péptido
A\beta.

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Ejemplo 4

Administración por alimentación, nasal e inmunización de ratones transgénicos PDAPP heterocigóticos (modelo animal de enfermedad de Alzheimer)

Se adquirieron ratones PDAPP transgénicos de Athena Neurosciences, Inc (Sur de San Francisco, CA). Estos ratones expresan un gen humano que codifica una forma mutante de la proteína precursora amiloide \beta y desarrolla de manera progresiva depósitos de amiloide \beta en el hipocampo y córtex cerebral de una manera similar a la observada en al enfermedad de Alzheimer. Los depósitos de amiloide \beta en los ratones transgénicos se llegaron a asociar con células microgliales activadas, astrocitos reactivos y otras características de la respuesta inflamatoria de la periplaca observada en cerebros de la enfermedad de Alzheimer.

Ratones PADPP de 4 a 5 meses de edad se administraron por alimentación o por vía nasal o bien péptido amiloide \beta [1 - 40] o una proteína control (proteína básica de mielina u ovoalbúmina en cantidades de 50 ó 500 \mug por alimentación). La administración se llevó a cabo tres veces (nasal) o cinco consecutivamente (oral) durante un período inicial de una semana, y después en bases semanales hasta que los animales tuvieron 11 y 12 meses de edad. El péptido amiloide \beta se administró por vía oral en una dosificación de 10 ó 100 \mug, el amiloide \beta administrado por vía nasal estaba en una dosificación de 5 ó 25 \mug.

La administración por alimentación y nasal de péptido amiloide \beta, u ovoalbúmina a ratones PDAPP se llevó a cabo entre los siguientes grupos de ratones:

Grupo 0: no tratados; ratones números 0,1 - 0,7

Grupo 1: alimentados con péptido amiloide \beta [1 - 40] 100 \mug/alimentación; ratones números 1,1 - 1,9

Grupo 2: alimentados con péptido amiloide \beta [1 - 40] 10 \mug/alimentación; ratones números 2,1 - 2,9

Grupo 3: nasal con péptido amiloide \beta [1 - 40] 25 \mug/tratamiento; ratones números 3,1 - 3,9

Grupo 4: nasal con péptido amiloide \beta [1 - 40] 5 \mug/tratamiento; ratones números 4,1 -4,7

Grupo 5: alimentados con ovoalbúmina 500 \mug/alimentación; ratones números 5,1 - 5,6

Grupo 6: ovoalbúmina nasal 50 \mug/tratamiento; ratones números 6,1 - 6,6

Grupo 7: alimentados con MBP 50 \mug/alimentación; ratones números 8,1 - 8,6

Grupo 6: MBP nasal 50 \mug/tratamiento; ratones números 8,1 – 8,6.

Dos ratones de cada uno de los grupos 1, 5, y 8 se inmunizaron con péptido amiloide \beta 10 días antes de sacrificar.

Al final del período de tratamiento, los ratones se sacrificaron y se retiraron los cerebros, ganglios linfáticos popliteales y bazos. Los cerebros se retiraron y se sumergieron en etanol al 70% fijativo después mediante incrustación y seccionamiento. Un hemisferio se congeló y se seccionó en el criostato.

Después, las secciones de los cerebros de los ratones tratados por vía oral se examinaron usando anticuerpos y tintes histológicos. Los anticuerpos para proteína ácida fibrilar (GFAP) se emplearon para mostrar astrocitos anormales y anticuerpo a proteína precursora amiloide empleada para mostrar neuritas anormales. Los linfocitos se examinaron para evaluar la producción de citoquinas in vitro en presencia de amiloide \beta.

Los resultados obtenidos en el examen de secciones de cerebros se muestran en la figura 9 A y figura 9 B. Especialmente, los resultados se muestran para análisis de imágenes tanto visual como asistida por ordenador de carga de placas de péptido amiloide \beta para los 8 grupos experimentales de ratones que se trataron; los valores de muestran para cada ratón en el grupo relevante. El análisis por ordenador de carga de placa representa el porcentaje de área identificado como placa. La determinación visual de carga de placa se puntuó de acuerdo con la tabla mostrada en la parte de debajo de la figura 9 A.

Estos resultados mostraron una diferencia en el desarrollo de depósitos de amiloide \beta en los ratones tratados con amiloide \beta en oposición a los grupos de control, con la excepción de ciertos grupos tratados con óvulos, como se describe adicionalmente más adelante, es decir, los grupos tratados desarrollan menos depósitos de amiloide \beta. La diferencia era estadísticamente significativa para ratones que se administraron por vía nasal con 25 \mug de amiloide \beta frente a controles. Los valores P calculados usando el ensayo U de Mann - Whitney de 1 cola para comparaciones de diversos grupos se muestran en la figura 10.

Se muestran los resultados de ensayos de inmunorreactividad llevados a cabo en las secciones se muestran también en las figuras 9 A y 9 B, muestran inmunorreactividad (IR) de anticuerpos específicos con células que llevan los marcadores inmunológicos, o que secretan las citoquinas. Los resultados se muestran en particular para la presencia de: Mac - 1, un marcador para células presentadoras de antígenos activados, tales como microglia; F4/80, un marcador para células presentadoras de antígenos; y MHC - II. Los resultados se muestran también para inmunorreactividad con las citoquinas inflamatorias IFN - \gamma, TNF - \alpha, y para las citoquinas antiinflamatorias IL - 4, IL - 10, y TGF \beta. Estos resultados muestran que los ratones tratados por vía mucosal con amiloide \beta mostraron una activación microglial disminuida en el cerebro y una producción disminuida de citoquinas inflamatorias.

Los resultados de experimentos inmunohistoquímicos llevados a cabo sobre antisueros de ratón se muestran en la figura 11. En estos experimentos, los antisueros se ensayaron en un inmunoensayo para la presencia de subtipos de IgG contra amiloide \beta. En el inmunoensayo, secciones de cerebro de síndrome de Down, que contienen grandes cantidades de amiloide \beta, se emplearon como antígeno de "captura". IgG en los antisueros de ratones se unieron a las secciones, y la presencia de subtipos de IgG en los anticuerpos unidos se distinguieron mediante anticuerpos secundarios (2º) específicos para cada subtipo. Estos resultados muestran un incremento en anticuerpos de clase IgG1 contra amiloide \beta en antisueros de ratones que se trataron inicialmente por vía nasal con 25 \mug de amiloide \beta sobre el observado en controles. Estos anticuerpos están asociados a las respuestas inmunes celulares de tipo Th2.

Las figuras 12 - 17 son gráficos de barras que muestran los resultados de experimentos in vitro en los que PLN de los ratones PADPP que se inmunizaron con amiloide \beta [1 - 40] antes de sacrificar se ensayaron mediante estimulación con el péptido, y se ensayaron para evaluar la producción de citoquinas. En los animales a los que se administró péptido amiloide \beta [1 - 40], las respuestas inmunes de PLN se caracterizaron por una producción incrementada de
IL - 10 y TGF - \beta y producción disminuida de IFN - \gamma, IL - 6, e IL - 2.

En varios de los experimentos descritos anteriormente, los resultados se obtuvieron para la administración de ovoalbúmina entera que eran sustancialmente diferentes de los obtenidos usando los otros controles, y similares a los resultados obtenidos usando amiloide \beta [1 - 40]. Por consiguiente se llevaron a cabo experimentos adicionales en los que se determinó que al ovoalbúmina entera es reactiva de manera cruzada con amiloide \beta [1 - 40]. Por consiguiente la ovoalbúmina no es un control eficaz en los experimentos diseñados para ensayar propiedades inmunológicas de amiloide \beta [1 - 40].

Ejemplo 5

Administración de amiloide \beta junto con IL - 4 o IL - 10

Se llevaron a cabo experimentos en los que se administró por vía nasal amiloide \beta [1 - 40] a ratones (B6D2) F1 junto con administración nasal de IL - 4 o IL - 10, y antes de la inmunización de los ratones con amiloide \beta [1 - 40]. Específicamente, los ratones (B6D2) F1 se trataron por vía nasal con las siguientes composiciones:

1)

PBS;

2)

amiloide \beta [1 - 40];

3)

IL - 4;

4)

amiloide \beta [1 - 40 + IL - 4;

5)

IL - 10; o

El amiloide \beta [1 - 40] + IL - 10El amiloide \beta [1 - 40] se administró en una dosis de 25 \mug y la IL - 4 e IL - 10 se administraron en una dosis de 1 \mug. Las composiciones se administraron tres veces, a intervalos de dos días. Dos días después del último tratamiento los ratones se inmunizaron con 100 \mug de amiloide \beta [1 - 40] en 50 \mug de CFA. Dos semanas después los esplenocirtos de los ratones se examinaron para evaluar la proliferación y producción de citoquinas en presencia de 50 \mug/ml de amiloide \beta [1 - 40] in vitro.

Los resultados de estos experimentos se muestran en las figuras 18 - 22. En estos experimentos, la administración de IL - 4 se mostró que era particularmente eficaz en la potenciación de respuestas supresoras inducidas por péptido amiloide \beta, como se muestra, por ejemplo en la supresión de la producción de TGF - \beta, e incremento de respuestas proliferativas. La disminución sustancial en al producción de IL - 6 inducida por la administración de IL – 4 junto con péptido amiloide \beta es relevante ya que el incremento de la producción de IL - 6 se correlaciona con la enfermedad de Alzheimer.

Ejemplo 6

Un individuo aquejado con enfermedad de Alzheimer se administra primero por vía oral o nasal con 0,05 mg de péptido amiloide \beta [1 - 40] una vez al día durante un período de una a dos semanas al final del cual las respuestas de citoquina del paciente se miden usando técnicas de ELISA como se ha descrito anteriormente. Si no se observa ninguna mejora, se incrementa la dosis diaria (de manera progresiva) hasta 0,1 mg, 0,5 mg, 1 mg, 2,5 mg, 5 mg, 50 mg o 100 mg, etc. (y las respuestas de citoquina se controlan semanalmente o cada dos semanas) hasta que se determina una dosificación eficaz. (El número de dosis diarias también se puede incrementar progresivamente hasta seis al día o bien en lugar de o en adición hasta un incremento en la cantidad diaria total de antígeno administrado). Una vez que se han identificado una cantidad eficaz y programa de administración para este paciente (durante el curso de no más de varias semanas o más), la terapia continúa a esta cantidad y programa mientras sea beneficiosa. Periódicamente, se administran ensayos de muerte cognitiva para controlar el progreso.

Ejemplo 7

Prevención de enfermedad de Alzheimer en seres humanos

Se determina que un individuo está en riesgo de contraer la enfermedad de Alzheimer mediante examen del historial familiar del individuo de la enfermedad, y mediante análisis de resonancia magnética, tomografía de emisión de positrones, formación de imágenes de cámara gamma SPECT, y/u otra formación de imágenes del cerebro junto agentes de potenciación de imágenes adecuados actualmente disponibles. De esta manera, se observa la presencia de formación de placa amiloide en el cerebro. Además, el tamaño del hipocampo se mide y se compara con el tamaño del hipocampo típicamente observado en el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer. Estas mediciones proporcionan una prognosis razonable de aumento de riesgo del desarrollo de la enfermedad de Alzheimer.

Un individuo en riesgo de contraer la enfermedad de Alzheimer se administra primero por vía oral o nasal con 0,05 mg de péptido amiloide \beta [1 - 40] una vez al día durante un período de una a dos semanas al final de lo cual se miden las respuestas de citoquinas y anticuerpos del paciente usando técnicas de ELISA como se ha descrito anteriormente. Si no se observa ningún efecto beneficioso, se incrementa (progresivamente) la dosis diaria hasta 0,1 mg, 0,5mg 1 mg, 2,5 mg, 5 mg, 50 mg o 100 mg, etc. (y las respuestas de citoquina se controlan semanalmente o cada dos semanas) hasta que se determina una dosificación eficaz. (El número de dosis diarias también se puede incrementar progresivamente hasta seis al día o bien en lugar de o en adición hasta un incremento en la cantidad diaria total de antígeno administrado). Una vez que se han identificado una cantidad eficaz y programa de administración para este paciente (durante el curso de no más de varias semanas o más), la terapia continúa a esta cantidad y durante al menos 6 meses. Periódicamente, se administran ensayos de muerte cognitiva para controlar el progreso.

La invención se ha descrito anteriormente mediante referencia a realizaciones preferidas. Se entenderá que diversas modificaciones son posibles dentro del alcance de las reivindicaciones que siguen.. En el caso de conflicto, la presente descripción incluyendo las presentes definiciones se controlarán.

Claims (13)

1. Una formulación farmacéutica adaptada para la administración nasal en una forma de aerosol a un mamífero en riesgo de contraer la enfermedad de Alzheimer que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de amiloide \beta o un fragmento eficaz o análogo del mismo para inhibir o retrasar el comienzo de al menos uno de los siguientes

(i)

generación de una o más citoquinas Th1 proinflamatorias en el mamífero;

(ii)

descenso en la cantidad de una o más citoquinas Th2 o Th3 antiinflamatorias en el mamífero; o

(iii)

aparición de al menos un síntoma clínico de la enfermedad.

2. Una formulación farmacéutica según la reivindicación 1, que comprende además un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

3. La formulación farmacéutica según la reivindicación 1 ó reivindicación 2, en la que la dosis es mayor que 50 \mug al día.

4. La formulación farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, adaptada para la administración mediante un nebulizador, de un inhalador de dosis medida presurizada o un inhalador de polvo seco.

5. La formulación farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, formulada en forma de un polvo seco.

6. La formulación farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, formulada en forma de una solución acuosa.

7. El uso de una cantidad eficaz de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos del péptido amiloide \beta o un fragmento eficaz o análogo del mismo en la fabricación de un medicamento para la administración nasal en la forma de aerosol, para tratar un mamífero que sufre de enfermedad de Alzheimer en la que el medicamento se ha de administrar durante un período de tiempo suficiente para lograr al menos uno de los siguientes:

(i)

reducir la cantidad de una o más citoquinas Th1 proinflamatorias en el mamífero;

(ii)

incrementar la cantidad de una o más citoquinas Th2 o Th3 en el mamífero; o

(iii)

mejorar, inhibir o retrasar el comienzo de al menos un síntoma clínico de la enfermedad.

8. El uso según la reivindicación 7 en el que el medicamento es para la administración mediante inhalación.

9. Un uso según la reivindicación 7 o reivindicación 8 en el que el péptido amiloide \beta, o en el que dicho fragmento de péptido comprende un reemplazo homólogo, conservador, no peptídico o isostérico por uno o más aminoácidos de péptido amiloide \beta.

10. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que la dosis es mayor que 50 \mug al día.

11. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que el medicamento se adapta para la administración nasal mediante un nebulizador, inhalador de dosis medida presurizada o un inhalador de polvo seco.

12. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que el medicamento es un polvo seco.

13. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que el medicamento es una solución acuosa.