BRPI0709050A2 - anticorpo ou fragmento do mesmo, composição, métodos para prevenir ou tratar, e para diagnosticar distúrbios, métodos para detectar protofibrilas ab in vitro, e, uso do anticorpo - Google Patents

Abstract

ANTICORPO OU FRAGMENTO DO MESMO, COMPOSIçãO, METODOS PARA PREVENIR OU TRATAR, E PARA DIAGNOSTICAR DISTURBIOS, METODO PARA DETECTAR PROTOFIBRILAS AB IN VITRO, E, USO DO ANTICORPO. A presente invenção é ligada à prevenção, tratamento e diagnose de doenças neurodegenerativas, em particular mal de Alzheimer, e outra doença similar. Mais especificamente a anticorpos de alta afinidade seletivos para proteína beta amilóide (A<225>) em sua conformação de protofibrila e de classe IgG e subelasse IgG1 ou IgG4 ou combinações destes ou mutações destes, retendo alta ligação de receptor Fc e baixa ligação de Cl(Clq), efetivos em depuração de protofibrilas A<225> e com risco reduzido de inflamação.

Description

"ANTICORPO OU FRAGMENTO DO MESMO, COMPOSIÇÃO,MÉTODOS PARA PREVENIR OU TRATAR, E PARA DIAGNOSTICARDISTÚRBIOS, MÉTODO PARA DETECTAR PROTOFIBRILAS AB INVITRO, E, USO DO ANTICORPO"

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção é ligada à prevenção, tratamento e diagnose dedoenças neurodegenerativas, em particular mal de Alzheimer, e outra doençasimilar. Mais precisamente, à alta afinidade 10"7M, preferivelmente 10"8M,ainda menos do que 1 0"9M ou menos do que IO-10M ou IO-11M de anticorpos,seletivos para proteína beta amilóide (Αβ) em sua conformação de protofibrilae de classe IgG e subclasse IgGl ou IgG4 ou combinações destes ou mutaçõesdestes, retendo alta ligação de receptor Fc e baixa ligação de Cl(Clq), efetivosem depuração de protofibrilas Αβ e com risco reduzido de inflamação.

INTRODUÇÃO

Mal de Alzheimer (AD) é uma desordem neurodegenerativaprogressiva e irreversível causando deficiência cognitiva, de memória ecomportamental. Ele é a causa mais comum de demência na população idosaafetando aproximadamente 5% da população acima de 65 anos e 20% acimade 80 anos de idade. AD é caracterizado por um início insidioso edeterioração progressiva em múltiplas funções cognitivas. A neuropatologiaenvolve tanto depósitos proteináceos argirofílicos extracelulares comointracelulares. Os depósitos extracelulares, referidos como placas neuríticas,consistem principalmente de proteína beta amilóide (Αβ) circundada porneuritos distróficos (inchados, processos neuronais distorcidos). Αβ dentrodestes depósitos extracelulares são fibrilares em seu caráter com umaestrutura de folha β-pregueada. Αβ nestes depósitos podem ser coloridos comcertos corantes, e.g. Vermelho Congo, e apresentam uma estrutura ultrafibrilar. Estas características, adotadas por Αβ em sua estrutura fibrilar emplacas neuríticas, são a definição do termo genérico amilóide. A lesãopatológica intracelular clássica de AD é o emaranhado neurofibrilar (NFT)que consiste de estruturas filamentosas chamadas filamentos helicoidaispareados (PHFs), compostas de fitas trançadas de proteína tau associada amicrotúbulo hiperfosforilada. Placas neuríticas freqüentes e depósitos deemaranhado neurofibrilar no cérebro são critérios diagnósticos para AD5como realizado após a morte. Cérebros com AD também apresentam atrofiacerebral macroscópica, perda de célula nervosa, inflamação local (microgliosee astrocitose) e freqüentemente angiopatia amilóide cerebral (CAA) emparedes de vasos cerebrais.

Duas formas de peptídeos Αβ, Αβ40 e Al342, são as espéciesdominantes em placas neuríticas de AD enquanto A1340 é a espécieproeminente em amilóide cerebrovascular associado com AD. Atividadesenzimáticas permitem que Αβ seja continuamente formado a partir de umaproteína maior chamada proteína precursora de amilóide (APP) tanto emindivíduos saudáveis como afligidos por AD em todas as células do corpo.Dois principais eventos de processamento de APP através de atividades de β-e γ-secretase possibilitam produção de Αβ, enquanto uma terceira enzimachamada α-secretase, previne geração de Αβ por clivagem dentro daseqüência de Αβ (,Selkoe, 1994; Ester 2001;US5604102). O Αβ42 é umpeptídeo de quarenta e dois aminoácidos de comprimento, i.e. doisaminoácidos maior no término C, se comparado com Αβ40. Αβ42 é maishidrofóbico, e se agrega mais facilmente em estruturas maiores de peptídeosΑβ (,Jarret 1993) tal como dímeros Αβ, trímeros Αβ, tetrâmeros Αβ,oligômeros Αβ, protofibrilas Αβ ou fibrilas Αβ. Fibrilas Αβ são hidrofóbicas einsolúveis, enquanto as outras estruturas são todas menos hidrofóbicas esolúveis. Todas estas estruturas moleculares superiores de peptídeos Αβ sãoindividualmente definidas baseado em sua aparência biofísica e estrutural e.g.em microscopia eletrônica, e suas características bioquímicas e.g. por análisecom cromatografia de exclusão por tamanho/western blot. Estes peptídeosΑβ, particularmente Αβ42, irão se reunir gradualmente em várias estruturasmoleculares superiores de Αβ durante o tempo de vida. AD5 que é umadesordem fortemente dependente de idade, irá ocorrer mais cedo em vida seeste processo de agregação ocorre mais rapidamente. Este é o centro da"hipótese de cascata de amilóide" de AD que reivindica que processamento deAPP5 os níveis de Αβ42 e sua agregação em estruturas moleculares superioresé uma causa central de AD. Toda outra neuropatologia de cérebro com AD eos sintomas de AD tal como demência são de alguma forma causados por Αβou formas agregadas deste.

Αβ pode existir em diferentes comprimentos i.e. 1-39,1-40,1-42 e 1-43 e tamanhos de fragmentos i.e. 1-28 e 25-35. Truncamentos podemocorrer no término N do peptídeo. Todos estes peptídeos podem se agregar eformar intermediários solúveis e fibrilas insolúveis, cada forma moleculartendo uma exclusiva conformação estrutural e propriedade biofísica. Αβ1-42monomérico por exemplo, é um peptídeo solúvel e não tóxico de 42aminoácidos de comprimento, que é sugerido estar envolvido em funçõessinápticas normais. Em certas condições, o Αβ1-42 pode se agregar emdímeros, trímeros, tetrâmeros, pentâmeros até 12-mero e formas oligoméricasmaiores, todas com sua propriedade físico-química distinta tal como tamanhomolecular, estrutura de EM e formato molecular de AFM (microscopia deforça atômica). Um exemplo de uma forma oligomérica de Αβ de pesosuperior é a protofibrila (Walsh 1997), que tem um peso molecular aparente>100 kDa e uma estrutura curvilínea de 4-11 nm em diâmetro e < 200 nm decomprimento. Recentemente foi demonstrado que peptídeos Αβ oligoméricossolúveis tal como protofibrilas Αβ prejudicam potenciação de longo prazo(LTP) uma medida de plasticidade sináptica que, acredita-se, reflete formaçãode memória no hipocampo (Walsh 2002). Além disso, peptídeos Αβoligoméricos Árticos apresentam efeito inibidor muito mais profundo do queννΐΑβ em LTP no cérebro, provavelmente devido a sua forte propensão paraformar protofibrilas Αβ (Klyubin 2003).

Também existem outras formas oligoméricas solúveisdescritas na literatura que são distintamente diferentes de protofibrilas. Umatal forma oligomérica é ADDL (Ligante Difusível Derivado de Amilóide)(Lambert 1998). Análise AFM de ADDL revelou predominantementeespécies globulares pequenas de 4,7-6,2 nm ao longo do eixo z com pesosmoleculares de 17-42 kDa (Stine 1996). Outra forma é chamada ASPD(Amiloidesferóides) (Hoshi 2003). ASPD são oligômeros esféricos de Αβί-40. Estudos de toxicidade mostraram que ASPD esféricos >10 nm foram maistóxicos do que formas moleculares inferiores (Hoshi 2003). Esta idéia ganhousuporte a partir de recente descoberta da mutação Ártica (E693) de APP, quecausa AD de inicio precoce (Patente Norte-Americana 2002/0162129 Al;Nilsberth et al., 2001). A mutação está localizada dentro da seqüência depeptídeo Αβ. Carreadores de mutação com isso irão gerar variantes depeptídeos Αβ e.g. Αβ40 Ártico e Αβ42 Ártico. Tanto Αβ40 Ártico como Αβ42Ártico irão se agrupar muito mais facilmente em estruturas molecularessuperiores i.e. protofibrilas. Assim, o mecanismo patogênico da mutaçãoÁrtica sugere que as protofibrilas moleculares superiores solúveis estãocausando AD e contém um epítopo específico exclusivo i.e. "o epítopo dedoença AD".

No cérebro com mal de Alzheimer (AD), placas amilóidesextracelulares tipicamente são encontradas em parênquima e paredes devasos. As placas são compostas de peptídeos amilóides (Αβ) de 8-43aminoácidos de comprimento hidrofóbicos e auto-agregantes, que sepolimerizam gradualmente antes de deposição de placa. A espécieoligomérica Αβ solúvel foi proposta como sendo melhor correlação de doençado que as próprias placas amilóides (McLean et al., 1999; Neislund et al.,2000). Dentre estas espécies Αβ intermediárias pré-fibrilares, formasoligoméricas mostraram provocar efeitos biológicos adversos tanto in vitrocomo in vivo (Walsh et al, 2002) e assim podem desempenhar um papelcentral em patogênese de doença. Diversas espécies Αβ oligoméricas devários tamanhos moleculares são conhecidas. Com importância, aconformação de formas monoméricas, oligoméricas e fibrilares de Αβ sãodiferentes e podem ser visadas por anticorpos conformacionais. A identidadedo principal patógeno de Αβ não está clara, embora alguma evidência sugiraque oligômeros Αβ de alta peso molecular sejam especialmente neurotóxicos(Hoshi et al, 2003).

Mutações patogênicas no gene de proteína precursora deamilóide (APP), causando AD de início precoce foram descritas. Uma delas, amutação APP Sueca (Mullan et al, 1992), causa níveis aumentados de Αβ. Aoutra a mutação APP Ártica (E693G) localizada dentro do domínio Αβ, foiencontrada estimulando a formação de protofibrilas, oligômeros Αβ grande,sugerindo que estes intermediários de Αβ sejam particularmente patogênicos((Patente Norte-Americana 2002/0162129 Al; Nilsberth et al, 2001). Aidentificação da mutação APP Ártica e a elucidação de efeitos tóxicos paraprotofibrilas Αβ aumentaram o foco em oligômeros Αβ em patogênese de AD.

Imunização ativa como uma estratégia terapêutica para mal deAlzheimer foi primeiramente relatada por (Schenk et al 1999). O alvo para aestratégia de imunização foi a forma fibrilar de Αβ encontrada em placas deAlzheimer. Um teste clínico recente de fase I/II de vacinação ativa de Αβusando Αβ como uma vacina (AN-1792) teve que ser interrompido devido aodesenvolvimento de meningoencefalite em um pequeno número de pacientes(Bayer et al, 2005). Os efeitos colaterais vistos neste estudo provavelmenteforam causados por anticorpos anti-Αβ reagindo contra amilóide fibrilar emparedes de vasos. O amilóide fibrilar em CAA está em íntima proximidadecom a barreira hematoencefálica (BBB) e a reação antígeno-anticorpo podeassim gerar dano a BBB levando à infiltração de linfócitos T no CNS (.Pfeiferet al, 2002; Racke et al., 2005). Além disso, apenas uma minoria dospacientes participantes apresentaram uma resposta imune à vacina Αβ.Embora o estudo tenha terminado prematuramente, ele parece indicar queimunização ativa de Αβ pode ser benéfica apenas para um subconjunto depacientes com AD.

Anticorpos monoclonais seletivos para protofibrilas Αβhumanas foram descritos (Patente Norte-Americana 2002/0162129 Al). OMétodo de gerar protofibrilas Αβ humanas altamente puras e estáveis,envolve o uso de peptídeos Αβ42 sintéticos com a mutação Ártica(Glu22Gly). A mutação facilita imunização e triagem de hibridoma paraanticorpos protofibrila Αβ seletivos. Com importância, estes anticorpos seligam tanto a protofibrilas Αβ tipo selvagem como protofibrilas Αβ-Arc(PCT/SE 2005/000993).

Anticorpos que são seletivos para outras conformações de Αβtal como fibrilas Αβ (0 'Nuallain 2002), Αβ micelar (Kayed 2003), ADDL(Lambert 2001), foram descritos. Entretanto, nenhum destes é protofibrila Αβseletivo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção é ligada a anticorpos melhorados i.e.anticorpos protofibrila Αβ seletivos de alta afinidade (menos do que IO"7 M)de classe IgG e subclasse IgGl ou IgG4 ou combinação destes ou mutaçõesdestes, com risco reduzido de inflamação, para prevenção, tratamento ediagnose melhorados de mal de Alzheimer, síndrome de Down ou outrosdistúrbios neurodegenerativos. Ditos anticorpos foram desenvolvidos portécnicas clássicas de hibridoma e engenharia de anticorpo.

A invenção descreve a seqüência de aminoácidos de consensodas regiões CDRl-3 nas cadeias VL e VH de anticorpos que se ligamseletivamente a formas oligoméricas de Αβ, i.e. protofibrilas Αβ constituindoo "epítopo de mal de Alzheimer combinadas com modificações da regiãoFc para reduzir ligação de fator de complemento Cl q, reduzindo o risco deativação de complemento e inflamação.

A região constante de um anticorpo tem muitas funçõesimportantes particularmente ligando receptores Fc e fator de complementoClq. A última função foi inativada para evitar reações inflamatórias.

Em resumo, este tipo de anticorpos protofibrila seletivos dealta afinidade têm as seguintes vantagens marcantes se comparados comoutras modalidades conhecidas de tratamento imunoterápico:

1) visa protofibrilas Αβ causando doença com alta afinidade

2) reduz o risco de efeitos colaterais inflamatórios i.e.meningoencefalite, por baixa ou nenhuma ligação a fator de complemento Clq

3) anticorpo de alta afinidade reduz a dose clínica necessáriapara um tratamento efetivo

4) fornece uma modalidade de dosagem acurada

5) menos ligação a fibrilas Αβ na parede de vaso sangüíneo i.e.CAA, reduzindo o risco de efeitos colaterais inflamatórios.

6) Menos anticorpo é ligado na periferia, assim mais irãocruzar a barreira hematoencefálica e estarão disponíveis para ligação eeliminação de formas oligoméricas de Αβ no cérebro.

Um aspecto da invenção é a descoberta da seqüência deaminoácidos de consenso de anticorpo das regiões CDR que se ligam aprotofibrilas Αβ humanas tipo selvagem (Exemplo 1). Esta descoberta defineos sítios de ligação (regiões CDR) que conferem alta afinidade e altaseletividade para protofibrilas Αβ humanas tipo selvagem para uso comoagentes terapêuticos ou diagnósticos. A estrutura básica de uma molécula deimunoglobulina (IgG) compreende duas cadeias leves idênticas e duas cadeiaspesadas idênticas ligadas juntas por pontes dissulfeto (Figura 1). A cadeialeve, que é ou lambda ou capa, tem uma região variável (VL) e uma regiãoconstante (CL) de aproximadamente 110 resíduos de aminoácidos cada. Acadeia pesada tem uma região variável (VH) de cerca de 110 resíduos deaminoácidos, mas uma região constante (CH) muito maior de 300-400resíduos de aminoácidos, compreendendo regiões ou domínios CHyl, CHy 2 eCHy 3.

A região constante (Fc) ativa o sistema de complemento e seliga a um receptor Fc em macrófagos, micróglia e neutrófilos, o qual ingere edestrói microorganismos infectantes ou antígenos exógenos/não próprios. Estafunção é particularmente importante uma vez que ela é parte do princípioterapêutico do anticorpo, i.e. fagocitose de micróglia mediada por receptor Fce depuração de protofibrilas Αβ. Outros mecanismos de depuração mediadospor anticorpo também são operantes, i.e. propriedades de anti-agregação deanticorpos Αβ e depuração de protofibrilas Αβ na periferia, de acordo com ahipótese de dissipação.

A região variável das cadeias pesadas e leves contém 3 regiõeshipervariáveis chamadas regiões determinantes de complementaridade ouCDRs. As regiões CDR são trechos curtos de cerca de 13-23 aminoácidos decomprimento, localizados nas regiões VL e VH. As seis regiões CDRs em um"braço" do anticorpo formam a "cavidade" que se liga ao antígeno. Figura 1mostra a atividade básica de uma imunoglobulina IgG e seus subdomínios.

Outro aspecto da invenção é ligado a anticorpos protofibrilaseletivos de alta afinidade. Afinidades no intervalo de 10-7M preferivelmente10"8M, ainda menos do que 10"9M, menos do que 10^40 M, ou menos do que10-11M para protofibrilas são descritas (Exemplo 2). Estes anticorpos têm avantagem de que eles podem ser administrados em doses menorescomparados com anticorpos com afinidades no âmbito de 10"6 M. Isto temvantagem clínica significante já que estes anticorpos de alta afinidade, que sãoadministrados por injeção, podem ser dados subcutaneamente uma vez queapenas uma pequena quantidade do anticorpo é necessária para atingireficácia. Modalidades de administração não são limitadas a injeçõessubcutâneas. Além disso, as menores doses necessárias para eficácia irãoreduzir custo de bens para produção do anticorpo.

Outro aspecto da invenção é que os anticorpos são de classeIgG, adequados para uso terapêutico uma vez que eles podem passar atravésda barreira hematoencefálica. Depuração de protofibrilas Αβ no parênquimacerebral é atingida por fagocitose mediada por receptor Fc por células demicróglia. Outros mecanismos de depuração anti-Αβ são propensos a operartambém. Esta depuração de protofibrilas Αβ solúveis é um mecanismo centraldo tratamento. Protofibrilas Αβ são consideradas altamente neurotóxicas,iniciando e dirigindo o processo de doença. Depuração de protofibrilas Αβ nocérebro é de valor clínico significante. Em adição a depuração de protofibrilasΑβ, outras formas oligoméricas de Αβ incluindo fibrilas Αβ, será reduzidaindiretamente através de remoção de protofibrilas Αβ uma vez que diferentesformas Αβ agregadas, i.e. dímeros, trímeros, tetrâmeros e formasoligoméricas superiores incluindo protofibrilas e fibrilas, estão em equilíbrio.Exemplo de redução de placas, que contêm fibrilas Αβ, é mostrado em ummodelo de camundongo transgênico com Alzheimer (APPswe) depois detratamento por 72 horas com um anticorpo protofibrila seletivo de altaafinidade (mAb 158) (Exemplo 3). Por conseguinte, depuração deprotofibrilas Αβ por dito anticorpo também terá a vantagem de reduzirindiretamente outras formas agregadas ou oligoméricas de Αβ.

Ainda outro aspecto da invenção é um anticorpo protofibrilaΑβ humana seletivo de alta afinidade de subclasse IgGl, que tem uma altaafinidade para receptores FcyRI humanos presentes em células de micrógliano cérebro. Um anticorpo de alta afinidade irá levar a eficiente depuração deprotofibrilas Αβ o que será de valor terapêutico significante. Por conseguinte,os anticorpos irão exibir depuração de protofibrilas Αβ, tanto em CNS comoperiferia se comparado com outras estratégias imunoterapêuticas tal comovacinação ativa ou tratamentos com anticorpo monoclonal ou com anticorposmonoclonais de subclasse IgGl visando outras formas Αβ. Com importância,o tratamento será eficiente no começo de processo de doença quando espéciesΑβ solúveis tóxicas tal como protofibrilas Αβ estão presentes em níveiselevados mas também no fim de processo de doença. Níveis elevados deformas oligoméricas de Αβ foram descritos em um modelo de camundongotransgênico exibindo as mutações Sueca e Ártica APP swearc (Lord A. et al.2006).

Ainda outro aspecto da invenção é que os anticorposprotofibrila Αβ seletivos de alta afinidade podem reduzir ou inibir agregaçãode Αβ com isso reduzindo níveis de formas oligoméricas de Αβ solúveis nocérebro

Ainda outro aspecto da invenção é que os anticorposprotofibrila Αβ seletivos de alta afinidade podem se ligar a formasoligoméricas de Αβ, i.e. protofibrilas Αβ fora de CNS também, com issomudar o equilíbrio de ditas formas Αβ através da barreira hematoencefálica deuma forma tal a diminuir níveis em CNS de ditas formas Αβ (drenagem).

Como discutido acima, o estudo clínico de Elan usando umavacina Αβ (AN-1792) seletiva para fibrilas Αβ para tratar pacientes comAlzheimer resultou em um efeito colateral, i.e. meningoencefalite, em 6% doscasos. A estratégia para atingir fibrilas Αβ, que são o centro de placasamilóides presentes no parênquima cerebral mas com importância tambémnas paredes de vasos sangüíneos, resultou em efeitos colaterais severos. Osefeitos colaterais foram mais provavelmente causados pela ligação dosanticorpos a CAA (Angiopatia Amilóide Cerebral) nas paredes de vasossangüíneos do cérebro, começando um processo inflamatório. Este problemaclínico significante é evitado pelos anticorpos protofibrila seletivos de altaafinidade melhorados com atividade reduzida de ativação de complemento.

Estes anticorpos irão reter alta eficácia de depuração de protofibrilas Αβreduzindo risco de efeitos colaterais, i.e. meningoencefalite.Outro aspecto da invenção é que os anticorpos protofibrilaseletivos de alta afinidade têm fraca ligação de fibrila Αβ (Veja exemplo 2),reduzindo o risco de efeitos colaterais, por menos ligação a fibrilas Αβpresentes em CAA.

Ainda outro aspecto da invenção é que os anticorpos IgGprotofibrila Αβ seletivos de alta afinidade são manipulados para reduzirligação de fator de complemento Clq ao domínio CH2 de IgGl e reduzirativação de complemento e risco de inflamação. Esta modificação pode serfeita de diversas maneiras diferentes. Uma forma é fazer um anticorpoquimérico onde o domínio CHy2 da região constante de IgGl foi deletado etrocado pelo domínio correspondente de IgG4 ou parte do domínio queconfere ligação de Clq. Está bem estabelecido que IgG4 não se liga a Clq epor conseguinte não ativa a cascata de complemento. Para atingir isto a regiãoconstante da cadeia pesada (CH) é manipulada de uma forma tal a combinar odomínio de receptor Fc de alta afinidade (CHy3) em IgGl com o domínio(CHy2) de IgG4 que não tem nenhuma ligação para o fator de complementoClq. Este novo anticorpo contendo a cadeia pesada constante quimérica(IgGhCHyl, CHy2:IgG4, CHy3:IgGl) terá as propriedades importante tantode depuração eficiente de protofibrilas Αβ através de fagocitose mediada porreceptor Fc e risco reduzido de efeitos colaterais, i.e inflamação tal comomeningoencefalite.

Ainda outra forma de reduzir o risco de inflamação é alterar aestrutura de oligossacarídeos do anticorpo o que irá reduzir ligação de fator decomplemento Clq e ativação de complemento. 30 estruturas diferentes dosoligossacarídeos complexos bi-particulados em Asn-297 em IgGl humanaforam descritas. Acredita-se que a ausência de carboidratos associados a CH2cause uma mudança conformacional na região de "articulação" do anticorpo,reduzindo eficácias de interação com moléculas efetoras e perda de função deativação de complemento e ligação de Clq.A modificação de um anticorpo protofibrila Αβ humanaseletivo de alta afinidade por mutagênese sítio dirigida de Asn-297 paraqualquer outro aminoácido irá gerar um anticorpo de ligação de receptor Fcmantida com menos ligação de Clq e por conseguinte risco reduzido deinflamação em particular na barreira hematoencefálica. Uma alternativa paramodificar a glicosilação no anticorpo é expressar o anticorpo em um tipocelular onde a enzima N-acteilglucosaminil-transferase I foi inativada. Isto iráproduzir um anticorpo com estrutura alterada de carboidrato em Asn297. Umaestrutura de Man5GlcNAc2, mas não limitado a esta estrutura, é formada. Estamodificação de carboidrato irá reduzir ligação de fator de complemento Clq einibir inflamação (Wright at al. 1998). Alternativamente, anticorposprotofibrila seletivos glicosilados podem ser atingidos cultivando célulasexpressando anticorpos na presença de tunicamicina, o que inibe glicosilação.

Estes anticorpos terão atividade de ativação de complemento alterada assimcomo função de receptor Fc alterada (Leatherbarrow el al. 1985). Triagem declones expressando anticorpos com fraca ativação de complemento e forteligação de receptor Fc irá gerar anticorpos protofibrila seletivos que exibemforte depuração mediada por Fc de protofibrilas Αβ e fraca ligação de Clq.

Ainda outro aspecto da invenção é um anticorpo protofibrilaΑβ humana seletivo de alta afinidade, de subclasse IgGl5 onde o sítio deligação de fator de complemento Clq foi modificado, i.e. Pro331>Ser331 (Xuet al. 1994), de uma maneira tal a reduzir ou inibir ligação de fator decomplemento Clq, para o tratamento ou prevenção de AD. O resíduo deprolina em posição 331 em IgGl humana também pode ser trocado por umatreonina ou glicina ou qualquer outro aminoácido polar. Esta modificaçãopode ser atingida por técnicas padrão de biologia molecular tal comomutagênese sítio dirigida ou deleções de DNA.

Ainda outro aspecto da invenção é o uso de anticorpos IgGprotofibrila Αβ humana seletivos de alta afinidade para determinarespecificamente níveis de protofibrila em tecidos humanos, em particular emfluido cerebroespinhal, sangue, urina ou saliva como uma ferramentadiagnostica ou biomarcador para mal de Alzheimer. Níveis de protofibrilasΑβ humanas em CSF ou sangue são propensos a serem diferentes secomparados com um grupo de controle idoso combinado não tendo mal deAlzheimer. Uma pessoa que está desenvolvendo mal de Alzheimer é propensaa ter níveis aumentados de níveis de protofibrila Αβ em CSF ou sangue. Porconseguinte, por determinação de níveis de protofibrila Αβ em CSF ou sangueuma diagnose precoce da doença pode ser feita. Isto é possível de atingir comos novos anticorpos protofibrila Αβ seletivos de alta afinidade emcombinação com um método de ELISA sanduíche (Exemplo 2A), ondeprotofibrilas Αβ foram determinadas até o nível de 10 pM. Interferência deoutras formas Αβ tal como fibrilas Αβ, monômeros Αβ e fragmentos Αβ (1-16; 17-40) no ensaio, é 10% ou menos.

A invenção é adicionalmente ligada ao uso de uns anticorposprotofibrila específicos de alta afinidade para determinações de protofibrilasΑβ em tecidos humanos e animais, por exemplo, fluido cerebroespinhal,sangue, soro, urina e tecido cerebral mas não limitado a estes tecidos,sustentando um possível método diagnóstico para mal de Alzheimer. Métodosadequados para ensaiar protofibrilas Αβ nestes tecidos assim como emculturas celulares usando um anticorpo anti-protofibrila Αβ são imunoensaiostal como ELISA, RIA, Western blotting ou dot blotting. O método deve seradequado para acompanhar eficácia de tratamento (redução de protofibrila)em testes clínicos e adequado como um teste diagnóstico para mal deAlzheimer ou síndrome de Down.

Uma vez que níveis de protofibrilas Αβ são muito baixos emCSF e sangue, um anticorpo protofibrila Αβ seletivo de alta afinidade énecessário em um teste diagnóstico baseado em um método ELISA, para sercapaz de medir baixos níveis de protofibrilas Αβ. Outros métodos supersensíveis tal como ligação de proximidade (Exemplo 4) (Gullberg 2004) ousistemas de amplificação similares ou Biacore ou técnicas similares, podemser usados para aumentar sensibilidade. A técnica de ligação de proximidade ébaseada na descoberta de que diferentes anticorpos, produzidos contradiferentes epítopos em um analito (neste caso uma proteína), podem se ligarperto um do outro em dito analito. Se ditos diferentes anticorpos estãoconjugados a oligonucleotídeos, a distância entre ditos oligonucleotídeos serácurta o suficiente para que um oligonucleotídeo conector, com o auxílio decomponentes de ligação, forme uma ponte entre os oligonucleotídeos.

Componentes de amplificação também são adicionados, mediante o que RT-PCR pode ser realizado. Por este princípio, uma seqüência de DNAamplificável, refletindo a identidade e quantidade da proteína alvo, é gerada.

Esta técnica torna possível obter uma resposta com sinal aumentado paradetectar concentrações inferiores de analito.

Os presentes requerentes surpreendentemente descobriram queuma técnica de ligação de proximidade modificada também pode ser usadacom seus anticorpos protofibrila Αβ específicos, para detectar baixasconcentrações de estruturas de peptídeo Αβ maiores, i.e. protofibrilas Αβ masnão monômeros Αβ. Foi descoberto que os peptídeos Αβ, na conformação deprotofibrila, exibe uma estrutura (unidades repetitivas) que torna possível paradois anticorpos, de acordo com a presente invenção, se ligar suficientementepróximos um ao outro na protofibrila. Se ditos anticorpos estão conjugados aoligonucleotídeos, ditos oligonucleotídeos podem ser ligados usando umoligonucleotídeo conector. PCR é realizado usando componentes deamplificação. Por este princípio, uma seqüência de DNA amplificável,refletindo a identidade e quantidade da protofibrila alvo, é gerada (veja Fig 4A).

Ligação de proximidade ou uma versão da técnica chamada"círculo rolante", é uma técnica altamente sensível e particularmente bemadequada para detecção de estruturas poliméricas com seqüências repetidas,tal como protofibrilas Αβ a serem usadas para diagnose de mal de Alzheimere outros distúrbios neurodegenerativos.

A invenção é adicionalmente ligada ao uso de anticorposprotofibrila específicos de alta afinidade em imagiologia para detecção,localização e quantificação de protofibrilas Αβ em tecidos humanos eanimais. O anticorpo pode ser marcado com um ligante radioativo tal como1131, C14, n. ou Gálio68 , mas não limitado a estes radioisótopos, parapropósitos de detecção. O método será adequado como uma ferramentadiagnostica para mal de Alzheimer ou síndrome de Down.

Ainda outro aspecto da invenção é fazer as espécies deanticorpos específicos para uso em medicina veterinária. Os métodosdiagnósticos descritos também são adequados para uso veterinário.

Outro aspecto da invenção é a humanização de ditosanticorpos para evitar efeito colateral, i.e. para evitar uma resposta imunecontra ditos anticorpos em humanos quando usados como um agenteterapêutico ou diagnóstico.

Ainda outro aspecto é uma formulação do anticorpo em umtampão fisiológico, por exemplo PBS mas não limitado a PBS, adequado paraadministração a humanos e animais. O produto de anticorpo pode serliofilizado para melhor estabilidade. A formulação liofilizada pode conter umexcipiente tal como manitol mas não limitado a manitol para estabilizar oproduto depois de liofilização.

O produto de anticorpo pode conter um agente antibacteriano.

Os anticorpos ou fragmentos de acordo com as invençõespodem exibir deleções, substituições e inserções de aminoácidos dentro deditas regiões CDR e/ou sua estrutura. Aminoácidos inseridos ou substituídostambém podem ser derivados de aminoácido, com a condição de que aafinidade e especificidade do anticorpo sejam ainda intactas.EXEMPLOS

Os exemplos seguintes são fornecidos para ilustração e não sãopretendidos para limitar a invenção a estes exemplos específicos.

Exemplo 1.

Anticorpos monoclonais protofibrila Αβ humana tiposelvagem seletivos foram clonados e seqüenciados. A seqüência deaminoácidos da região variável de cadeia pesada (VH) e da região variável decadeia leve (VL) são mostradas em Tabela 1. As posições das regiões CDR1-3 são sublinhadas e mostradas também em Tabela 2 e 3. As seqüências deaminoácidos das regiões CDR formam a base estrutural para ligarprotofibrilas Αβ humanas tipo selvagem constituindo o "epítopo de mal deAlzheimer ".

A seqüência de aminoácidos das regiões CDR 1-3 das cadeiasVL e VH para um anticorpo protofibrila específico de alta afinidade BA9/158são mostradas em Tabela 1, 2 e 3.

Dados de seqüenciamento de outros anticorpos protofibrilaseletivos (BA2, BA3, BA4 e BA7) fornecem seqüências de aminoácidosalternativas das regiões CDR mas não limitado a estas. As seqüências deaminoácidos combinadas das regiões CDRl-3 das cadeias VH e VL criam a"cavidade" molecular que se liga a protofibrilas Αβ humanas tipo selvagemcom alta afinidade e especificidade. Esta "cavidade" forma a base estruturaldo "epítopo de mal de Alzheimer". Variações no comprimento da seqüênciade aminoácidos de CDR são observadas em ambas cadeias VH e a VL écompatível se ligando a protofibrilas Αβ humanas (Tabela 2 e 3). Uma regiãoCDR mais curta fornece uma estrutura tridimensional mais restrita dacavidade de ligação do anticorpo, ao passo que uma mais longa é maisflexível.

São reivindicadas as seqüências de CDR como mostrado emTabelas 1, 2 e 3 assim como seqüências de aminoácidos nas regiões de"estrutura de camundongo" das cadeias VH e VL, i.e. fora das regiões CDRassim como as regiões de estrutura de VL e VH humanas para anticorposprotofibrila específicos como mostrado em Tabela 4 e 5, mas não limitado aestes.

A seqüência de aminoácidos da região de estrutura de regiõesVL e VH 1-3 das cadeias VL e VH de um anticorpo protofibrila específico dealta afinidade BA9/158 é mostrada em Tabela 4 e 5.

Outra substituição de aminoácido nas regiões CDR do que aque é mostrada em Tabela 1, 2 e 3 são compatíveis com ligação de altaafinidade e alta especificidade a protofibrilas Αβ humanas tipo selvagem.Onde um aminoácido polar está presente em uma posição particular em umaregião CDR tal aminoácido particular pode ser substituído por outroaminoácido polar, com ligação de alta afinidade e especificidade mantida oumelhorada para protofibrilas Αβ. Da mesma maneira, se um aminoácido nãopolar ou negativamente ou positivamente carregado está presente em umacerta posição, tal aminoácido pode ser substituído por um aminoácido similardo mesmo grupo.

Também, um aminoácido ou aminoácidos particulares sãotrocados em qualquer posição nas regiões CDR por equivalentes funcionaisque conferem uma função e estrutura similar ao anticorpo.

Exemplo 2. Caracterização de um anticorpo monoclonalprotofibrila Αβ humana tipo selvagem seletivo de alta afinidade por ELISA

Exemplo 2 shows um anticorpo protofibrila seletivo de altaafinidade que reage de forma cruzada umas 200-1000 vezes menos commonômeros Αβ e menos do que 40 vezes com fibrilas Αβ, se medido por umELISA sanduíche (Fig.2A). A partir de experimentos de ELISA competitivo,o anticorpo tem uma forte afinidade para protofibrilas Αβ42 humanas tiposelvagem, mas apenas afinidade muito fraca para a parte N-terminal dopeptídeo Αβ e monômeros Αβ. Nenhuma ligação foi observada ao fragmentoC-terminal de Αβ (Fig.2B). Além disso, o anticorpo não reage de formacruzada com outros tipos de amilóides, como medina ou transtiretina. Alémdisso o anticorpo não reconhece APP humano, o precursor abundante de Αβ.

Na Figura 2A um ELISA sanduíche é mostrado. Anticorpo158 foi revestido nos poços e diferentes formas de Αβ subseqüentementeadicionadas ao poço em concentrações crescentes. Mensuração de formas deΑβ ligadas foi feita adicionando mAb 158 biotinilado e Estreptavidinamarcada com HRP. Desenvolvimento de cor foi medido de acordo com oprocedimento recomendado pelo fabricante.

Na Figura 2B um ELISA competitivo é mostrado. Uma placade ELISA foi revestida com protofibrilas Αβ humanas. Anticorpo 158 foisubseqüentemente incubado com quantidades crescentes de diferentes formasde Αβ (competição). A mistura de incubação foi adicionada aos poços deplaca de microtítulo e anticorpo livre foi permitido se ligar a protofibrilasimobilizadas nos poços. Anticorpo 158 ligado foi medido por um segundoanticorpo usando procedimentos padrão.

Exemplo 3

A eficácia de anticorpo protofibrila Αβ seletivo de altaafinidade foi determinada em um modelo de camundongo transgênico comAlzheimer (APPswe) por uma injeção intracranial aguda. Camundongostransgênicos usados para avaliação de eficácia expressam APP humano, coma mutação Sueca (APPswe). Neste paradigma, anticorpos são injetadosdiretamente em regiões ricas em plaquetas do parênquima cerebral e efeitosem neuropatologia são verificados depois de 72 horas (Wilcock et al, 2003).

Outros estudos mostraram que a aplicação direta de anticorpos anti-Αβ resultaem uma rápida depuração de depósitos amilóides in vivo (Bacskai et al,2001; Brendza et al., 2005). A injeção de anticorpo protofibrila Αβ seletivode alta afinidade leva a uma significante redução de placas no modelo decamundongo APPswe (Figura 3).Na Figura 3 a eficácia terapêutica de um anticorpo protofibrilaseletivo de alta afinidade em modelo de camundongo transgênico (APPswe)foi testada. A: Um camundongo transgênico APPSwe de 14 meses de idade foiintracranialmente injetado com PBS e B: anticorpo protofibrila seletivo dealta afinidade (158) a 1 μg/μl e avaliado 72 horas depois de injeção.Depuração acentuada de carga de Αβ é notável no subiculum perto do sítio deinjeção (B; seta) se comparado com o lado de controle (A; seta).

Exemplo 4

Ligação de proximidade em combinação com anticorpoprotofibrila seletivo de alta afinidade para mensuração de protofibrilasΑβ. Protofibrilas Αβ humanas tipo selvagem foram detectadas atéintervalo de 10 pM ao passo que a preparação de monômero Αβ não foinem um pouco detectada. A combinação do método de ligação deproximidade hipersensível e de um anticorpo de alta afinidade éparticularmente vantajosa uma vez que ela fornece um sistema parardeterminar apenas formas oligoméricas do analito, o que éparticularmente adequado quando diagnosticando mal de Alzheimer eoutras doenças de "agregação" de proteínas tal como doença de príon,Creutzfelt-Jacob, amiloidose e mal de Parkinson.

Na Figura 4 protofibrilas Αβ humanas são medidas emníveis de pM pelo técnica de ligação de proximidade. Ensaio de ligaçãode proximidade: Descrição de método (a partir de Gullberg et al., 2004):Etapa 1, incubação de amostra com par de sondas de proximidade (pJ1 h);etapa 2, adição de todos os componentes requeridos para ligação edetecção por PCR quantitativo (tempo de ligação de 5 min). Um anticorpomonoclonal protofibrila seletivo de alta afinidade foi usado no ensaio;etapa 3, PCR quantitativo (2 h). Preparações sintéticas de monômero Αβ eprotofibrila Αβ foram diluídas e testadas para sua reatividade em ensaiode ligação de proximidade descrito acima.Exemplo 5

mAb 158 não reconhece um epítopo de amilóide genérico.

Anticorpos dependentes de conformação de Αβ previamenterelatados mostraram se ligar a oligômeros e fibrilas de outras proteínasamiloidogênicas, sugerindo que um epítopo comum está presente em todos osagregados amilóides. Devido a dificuldades técnicas para gerar protofibrilas apartir de outras proteínas amiloidogênicas do que Al3, mAb 158 foi aocontrário testado contra fibrilas amilóides diferentes. O ensaio dot blot foiusado para estes experimentos uma vez que ELISA de inibição, onde asreações anticorpo-antígeno ocorrem em solução, não é adequado paraantígenos insolúveis como fibrilas. O ensaio dot blot entretanto não éadequado para avaliação de especificidade de anticorpo para várias formas deΑβ, i.e. para medir diferenças em seletividade para protofibrilas e fibrilas.Fibrilas de medina, polipeptídeo amilóide de ilhota (IAPP) e a-sinucleínaforam imobilizados em uma membrana de nitrocelulose para manter suasconformações nativas. mAb 158 não exibiu reatividade com qualquer amilóideoutro do que fibrila Αβ (Fig 5A). A ligação de mAb 158 s fibrilas Αβ sugereque parte do epítopo de protofibrila Αβ está presente também na estrutura defibrila Αβ. Como controles positivos os anticorpos 6E10 (A(3), pAbl79(medina), ρAbAl 10 (IAPP) e mAb211 (α-sinucleína) foram usados (Fig 5B).Blots representativos de experimentos repetidos (n=3).

mAbl58 não se liga a APP

Níveis de APP e fragmentos solúveis de APP comumenteexcedem os níveis de Αβ em amostras biológicas tal como CSF ehomogenado cerebral, e portanto uma reatividade cruzada de anticorpo Αβpara APP pode inibir um tratamento através de ligação a APP, resultando emmenos anticorpo livre para ligação e eliminação de protofibrilas Αβ e/ouoligômeros Αβ. Também, ela poderia perturbar mensurações de protofibrilasΑβ em amostras biológicas por um ensaio ELISA sanduíche de Αβ. Paraelucidar se mAbl58 se liga a APP nativo, experimentos de imunoprecipitaçãoforam realizados. Meio de cultura de células HEK (não expostas ao vetor,APPswe e APPArc_swe) e homogenados cerebrais de camundongo (nãotransgênico, APPswe e APPArc-swe) foram imunoprecipitados com mAbl58ou 6E10, seguido por um Western blot desnaturante com 6E10 comoanticorpo de detecção (Fig 5C). Como visto em Figura 5C, mAbl58 nãoimunoprecipitou aAPPs de meio de cultura celular ou APP de comprimentocompleto a partir de homogenados cerebrais de camundongo, ao passo que,como esperado, 6E10 sim. As protofibrilas Αβ sintéticas usadas comocontrole foram imunoprecipitadas igualmente bem por ambos anticorpos (Fig5C). Blots representativos de experimentos repetidos (n=3).

Exemplo 6

Estabelecimento de um ELISA sanduíche protofibrila Αβespecífico. Para possibilitar mensurações de protofibrilas Αβ em amostrasbiológicas um ELISA sanduíche com mAbl58 tanto como anticorpo decaptura como de detecção foi estabelecido. Este ensaio mede protofibrilas Αβcom um limite de detecção de 1 pM e com um intervalo linear de até 250 pM(Fig 6A, linhas indicam regressão linear das curvas padrão). Devido aincertezas em relação ao tamanho das protofibrilas Αβ usadas na curvapadrão, a concentração 1 pM é baseada no peso molecular de um monômeroΑβ (4514 g/mol). De qualquer forma, uma vez que o peso molecular de umaprotofibrila foi estimado como sendo pelo menos 100 kDa, o limite dedetecção calculado como protofibrilas Αβ molares pode ser tão baixo quanto50 fM. Uma curva padrão de protofibrilas ApArc produziu um sinal maisfraco do que protofibrilas Αβ tipo selvagem, possivelmente devido adiferenças em tamanho de protofibrila Αβ (Fig 6A, 6B). LMW-Αβ sintéticotitulado (Αβ de Baixo Peso Molecular). Pelo termo "β de Baixo PesoMolecular", é pretendido monômeros, dímeros e trímeros de Αβ tendo umpeso molecular de aproximadamente 4-12 kDa. Protofibrilas Αβ e Αβ1-16foram usadas para validar a especificidade de conformação do ELISA (Fig6B), onde o peptídeo Αβ1-16 hidrofílico foi usado uma vez que não éesperado que ele se agregue. Um ELISA composto de dois anticorposidênticos requer pelo menos um dímero de uma proteína para produzir umsinal e como previsto, Αβ1-16 não foi detectado com o ELISA sanduíche demAbl58 mesmo em concentrações de μΜ (Fig 6B). Ao pré-tratar o LMW-Αβe protofibrilas Αβ com 70% de ácido fórmico (FA), conhecido por dissociarΑβ agregado em monômeros, o ELISA sanduíche o sinal foi perdido (dadosnão mostrados). Por conseguinte, a detecção de LMW-Αβ em altasconcentrações de nM (Fig 6B) provavelmente é devido a um pequenoconteúdo de agregado da preparação de peptídeo.

Um grande excesso de Αβ monomérico, holoAPP efragmentos de APP, naturalmente ocorrentes em amostras biológicas,pode interferir na análise de protofibrila Αβ ocupando sítios de ligação dorevestimento de anticorpo de captura, assim inibindo a ligação deprotofibrilas. Este problema foi investigado adicionando um excessocrescente de Αβ 1-16 a uma concentração fixa de protofibrilas Αβ (50 pM,expresso como unidades de monômero) e analisando ele tanto com oELISA de mAbl58 como um ELISA sanduíche de 6E10-6E10 (Fig 6C).

Um excesso molar de 500 000 vezes de Αβ1-16, se comparado comprotofibrilas Αβ, não perturbou as mensurações com o ELISA sanduíchede mAbl58, como esperado uma vez que Αβ1-16 se liga fracamente aoanticorpo de captura. Em contraste, um excesso de 500 vezes de Αβ1-16foi suficiente para diminuir o sinal no ELISA de 6E10-6E10, onde Αβί-16 se liga com alta afinidade ao anticorpo de captura (Fig 6C). Alémdisso, quando protofibrilas Αβ sintéticas foram adicionadas a meios decultura de célula HEK não exposta ao vetor ou homogenados cerebrais decamundongo não transgênico, 90% do sinal foi recuperado (dados nãomostrados).Exemplo 7

Mensuração de protofibrilas Αβ em amostras biológicas.

A presença de protofibrilas Αβ em modelos celulares e decamundongos carregando a mutação Ártica foram sugeridos, embora atéagora não tenha havido nenhum Método de ensaio direto de protofibrilas Αβem amostras biológicas. O ELISA sanduíche de mAbl58 portanto fornece aprimeira oportunidade para medir níveis de protofibrila Αβ em tais modeloscelulares e de camundongos e para comparar eles a modelos sem esta mutaçãointra-Αβ. Amostras de células e camundongos carregando apenas a mutaçãoSueca foram comparadas com a curva padrão de protofibrila Αβ tiposelvagem, ao passo que amostras de células e camundongos expressando Αβcom a mutação Ártica foram comparadas com a curva padrão de protofibrilaΑβΑτο (Fig 6A). Para assegurar que todo o Αβ medido neste ensaio estivesseno estado solúvel, e para excluir qualquer interferência possível de fibrilasΑβ, todas as amostras foram centrifugadas por 5 min a 17 900 χ g antes deanálise. Grupos de meio celular de células HEK APPswe e APPArc-swetransientemente transfectadas foram analisados e comparados a meios decultura de célula HEK não exposta ao vetor. Níveis de protofibrila Αβ foramcalculados a partir das curvas padrão (Fig 6A) como o valor médio detriplicatas e foram então normalizados para níveis de APP para compensar asdiferenças em níveis de transfecção (de acordo com Stenh et al.). Aconcentração de protofibrila Αβ em meio de cultura de célula HEK APPArc-swefoi 28 pM (L2), significantemente maior (p<0,0001) do que a 8,2 pM (±0,3)vista em APPswe (Fig 7A). Nenhuma protofibrila Αβ pode ser detectada emmeio não exposto ao vetor. Níveis de protofibrilas Αβ também foram medidosem cérebros de camundongos transgênicos APPArc-Swe e APPswe com 10meses de idade tanto com placas como patologia intraneuronal Αβ (de acordocom Lord et al.). Cérebros foram homogeneizados em TBS e centrifugadosantes de análise a fim de recuperar a fração solúvel de Αβ. Similar à análiseusando meio de cultura celular, níveis de protofibrila Αβ diferiramsignificantemente (p=0,005) entre os grupos, com 397 pM (±59) em cérebrosde camundongos transgênicos APPMcSwe e 108 pM (±14) em APPswe (Fig7B).

Nas figuras mencionadas acima (Figs. 6 e 7) o número deamostras foram; células não expostas ao vetor (n=3) e transientementetransfectadas com APPswe (n=8) e APPArc-swe(n=l 1). Níveis deprotofibrilas Αβ em meio APPAre_sWe foram aproximadamente 9 vezesmaiores do que em meio APPswe, ao passo que meio não exposto aovetor não produziu nenhum sinal (A). Mensurações de níveis deprotofibrila Αβ na fração solúvel de TBS de homogenados cerebrais decamundongos não transgênicos (n~6) foram comparadas a camundongostransgênicos (APPswe, n=3, e AppArc-sWe, n=6) (B). Similar ao meio decultura celular, níveis de protofibrila Αβ de camundongos APPAre_sweforam 7 vezes maiores do que em camundongos APPswe. Barras de erromostram ± SEM.

Exemplo 8

mAbl58 diminui significantemente protofibrilas Αβ e Αβ totalem camundongos APPswearc transgênicos depois de administração i.p.

mAbl58 (12 mg/kg) foi injetado i.p. uma vez por semanapor 18 semanas em camundongos APPswearc com 9-10 meses de idade.Depois do estudo, cérebros foram isolados e homogeneizados em TBS esubseqüentemente centrifugados para sedimentar material insolúvel. Omaterial insolúvel foi solubilizado em ácido fórmico. Por conseguinte,duas frações foram obtidas a partir de cérebros de camundongos i.e. umafração de TBS e uma fração de ácido fórmico. Níveis de protofibrila Αβnas frações de TBS foram determinados por um ELISA. Uma reduçãosignificante de protofibrilas Αβ foi encontrada no grupo de tratamentocom mAbl58 comparado com o grupo de placebo (Fig 8). Figura 8 mostraos níveis de protofíbrila Αβ em extratos de TBS de cérebro decamundongo transgênico APPswearc depois de tratamento por 4 meses oucom mAbl58 ou placebo.

Αβ total na fração de ácido fórmico foi determinado por umELISA (o ácido fórmico foi usado para solubilizar todas as formas de Αβ, afim de tornar todas as formas de Αβ detectáveis. Uma redução significante deΑβ total foi observada no grupo de tratamento comparado com o grupo deplacebo (Fig 9). Figura 9 mostra os níveis de Αβ total em extratos de ácidofórmico de cérebro de camundongo transgênico APPswearc depois detratamento por 4 meses ou com mAb 158 ou placebo.

Exemplos 9-11

Abreviações

A Adenina

protocolo Ab protocolo biomédico de AERES

BHK rim de filhote de hamster

bp pares de bases

C Centígrado

C Citosina

CHO Ovário de Hamster Chinês

CMF Livre de Cálcio e Magnésio

COS 7 linhagem celular de fibroblasto de rim de macaco

verde Africano

dhfr Dihidrofolato redutase

DMEM meio de Dulbecco modificado por Eagle

DMSO Dimetil sulfóxido

DNA Ácido desoxirribonucléico

ELISA Ensaio imunoenzimático

FCS Soro Fetal Bovino

g gramasG Guanina

h hora

HRP peroxidase de rábano

IgG Imunoglobulina

K G ou T (convenção IUPAC)

LSAP Produto Amilóide Solúvel Grande

mAb anticorpo monoclonal

seg segundo

min minuto

M A ou C (convenção IUPAC)

MTX Metotrexato

NIMR National Institute for Medicai Research (UK)

nm nanômetro

OD densidade ótica

PBS Salinatamponadacomfosfato

PCR Reação em cadeia da polimerase

R A ou G (convenção IUPAC)

RT Temperatura ambiente

S C ou G (convenção IUPAC)

T Timina

UV Ultra Violeta

V variável

V A ou C ou G (convenção IUPAC)

VH Região variável de cadeia pesada de imunoglobulina

VK Região variável de cadeia leve capa deimunoglobulina

W A ou T (convenção IUPAC)

V C ou T (convenção IUPAC)Materiais

Equipamento

<table>table see original document page 28</column></row><table>

Consumíveis plásticos

<table>table see original document page 28</column></row><table>Reagentes de imunologia e biologia molecular

<table>table see original document page 29</column></row><table>Soluções de National Institute of Medicai Research

<table>table see original document page 30</column></row><table>

Exemplo 9 - Seqüência de DNA de anticorpo 158

9.1 - Preparação de RNA

Glóbulos celulares congelados do hibridoma de camundongo158, (frascos marcados 060824# 158 5xl06 células) foram recebidos por TAGem 3 de Outubro de 2006. Estas células foram armazenadas congeladas atéprocessamento usando o kit Qiagen RNeasy midi para isolar RNA seguindo oprotocolo do fabricante.9.2 - Síntese de primeira fita

Cerca de 5 microgramas de RNA de 158 foi indivíduo àtranscrição reversa para produzir cDNA de 158 usando o kit de síntese deprimeira fita de Amersham Biosciences seguindo o protocolo do fabricante -Isto foi repetido para gerar 3 produtos de cDNA independentes (ciclos 1, 2 e3) a fim de evitar mutações de DNA devido à reação RT.

9.3 Clonagem do cDNA de imunoglobulina 158

cDNA de hibridoma 158 foi amplificado por PCR em 23reações separadas. cDNA de região variável de cadeia capa deimunoglobulina (VK) foi amplificado usando 11 iniciadores VK (MKVl-Il)em combinação com o iniciador de região constante capa MKC (Tabela 6).Similarmente, cDNA de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina(VH) foi amplificado por PCR usando 12 diferentes iniciadores VH (MHV1-12) em combinação com uma mistura dos quatro iniciadores de regiãoconstante de IgG (MHCG1 /2a/2b/3: Tabela 7).

O resultado do conjunto inicial de reações de PCR de IgH foi oúnico produto de amplificação usando iniciador MHV5. Nenhum dos outros11 pares de iniciadores geraram um produto de PCR. O produto da reação dePCR iniciada pelos iniciadores de oligonucleotídeos: MHV5 + (mistura deMHCGl/2a/2b/3) foi ligado no vetor pCR2.10-TOPO0 usando o kit TOPO-TA cloning®. O resultado do conjunto inicial de reações de PCR de IgK foidois únicos produtos de amplificação usando iniciadores MKVl e MKV2com MKC. Os outros 9 pares de iniciadores não geraram nenhum produto. Osprodutos da reação de PCR iniciada pelos iniciadores de oligonucleotídeos:MKVl ou MKV2 + MKC foram ligados no vetor pCR2.10-TOPO0 usando okit TOPO-TA cloning®.

Bactérias E. coli transformadas com o vetor ligado foramclonadas em placas de LB/ampicilina/X-gal ágar, separando em grade de ágare em mistura de triagem de PCR. Os insertos de plasmídeos clonados foramtriados por amplificação por PCR. Os produtos de PCR passaram poreletroforese em gel e clones produzindo produto de amplificação por PCR detamanho correto (500bp aprox) foram identificados. Culturas noturnas (5ml)de cada clone foram processadas usando o Protocolo de Kit QlAprep SpinMiniprep, para produzir minipreps de plasmídeo de DNA.

9.4 - Determinação de seqüência de cDNA

O ciclo completo de RT-PCR, clonagem, e análise deseqüência de DNA foi repetido para obter três conjuntos completamenteindependentes de informação de seqüência para cada cadeia deimunoglobulina. Clones de plasmídeos de cada conjunto independente dereações de RT-PCR foram seqüenciados em ambas as direções usando osiniciadores 1212 e 1233 (Tabela 10). Plasmídeos foram seqüenciados usandoo Kit BigDye® Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction (ABI),ciclados em uma máquina de PCR de GeneAmp9600 PCR e analisados emum seqüenciador capilar ABI 310.

9.5 - Seqüência de DNA de VTC de 158

Seqüências de clones de VK gerados usando iniciadores dePCR MKV2 e MKC em ciclos 1 e 2 de cDNAs de primeira fita, foramidênticas a um transcrito capa estéril originado a partir do parceiro de fusão demieloma tal como MOPC-21, SP2 e Ag8. Isto é um transcrito estéril.

A seqüência de consenso (VK de 158) de clones de VKgerados usando iniciadores de PCR MKVl e MKC em ciclos 1-3 de cDNAsde primeira fita é mostrada em Tabela 11. Isto é um rearranjo funcional.Tabela 11 mostra algumas diferenças da seqüência mostrada em Tabelas 1, 4e 5. Estas diferenças estão na região FWl onde o iniciador de PCR foilocalizado. A seqüência líder de VK de camundongo mais idêntica aofragmento de líder em VK de 158, não codificada pelos iniciadores derequerentes, foi K5.1# (Tabela 12). A previsão de o peptídeo sinal clivarcorretamente a seqüência sinal #K5.1 foi feita por um programa de previsão.Sítio de clivagem mais propenso previsto foi corretamente entre resíduo deaminoácido 19 e 20. (Tabela 13). A proteína quimérica 158VK e seqüência deDNA são mostradas em Tabela 14.

9.6 - Seqüência de DNA de VH de 158

A seqüência de consenso (VH de 158) de VH clones geradosusando iniciadores de PCR MHV5 e mistura de MHCGl/2a/2b/3 em ciclos 1-3 de cDNAs de primeira fita é mostrada em Tabela 15. Como com VK de158, existem algumas diferenças da seqüência de FWl mostrada em Tabelas1, 4 e 5. A seqüência líder de VH de camundongo mais idêntica ao fragmentode líder, não codificada pelos iniciadores de requerentes, foi NL-I (Tabela 16).

Exemplo 10 - Construção de vetores de expressão quiméricos

Construção de vetores de expressão quiméricos exigeadicionar uma seqüência líder adequada a VH e VK, precedida por um sítiode restrição HindlIl e uma seqüência Kozak. A seqüência Kozak (Tabela 8)assegura tradução eficiente da seqüência de região variável. Ela define ocódon AUG correto a partir do qual um ribossomo pode começar tradução, e abase mais crítica é a adenina em posição -3, antes do começo de AUG. Aseqüência líder é selecionada como a seqüência líder de camundongo mais nobanco de dados de Kabat. Estas adições estão codificadas dentro dosiniciadores diretos (Tabela 9). Além disso, a construção dos vetores deexpressão quiméricos exige introduzir um fragmento 5' da região constante γΐhumana, até um sítio de restrição Apa I natural, contíguo com a extremidade3' da região J de 158. O CH é codificado no vetor de expressão depois daseqüência de VH inserida mas carece do íntron V-C. Para a cadeia leve, osítio doador de processamento natural (Tabela 8) e um sítio Bam HI sãoadicionados depois da região V. A seqüência doadora de processamentofacilita remoção do íntron V:C de capa o que é necessário para acoplamentoem quadro do VK à região constante.Os genes VH e VK de camundongo foram analisados paraidentificar quaisquer sítios doadores de processamento indesejados, sítiosaceptores de processamento, seqüências Kozak e para a presença de quaisquersítios de restrição de subclonagem extra que podem posteriormente interferirna subclonagem e/ou expressão de anticorpo funcional inteiro. Neste casonenhum foi encontrado.

10.1 - Vetores de expressão

Preparações de DNA de plasmídeo dos vetores de expressãopKN100, e pGlD200 foram purificadas usando kits Maxi da Qiagen seguindoo protocolo do fabricante. Purificação de DNA de plasmídeo usando KitsPlasmid Midi and Maxi da QIAGEN, a partir de culturas de 5 OOml debactérias TOPlO transfectadas com qualquer vetor. Os mapas de vetores sãomostrados em Figs IOe 11.

10.2 - Os iniciadores de quimerização de cadeia leve

A seqüência líder de camundongo K5.1# foi incorporada nomodelo do VK de 158 quimérico. Iniciadores foram concebidos para gerar umproduto de PCR contendo este líder completo, e VK de 158, com sítios derestrição terminais Hind III e Bam HI para clonagem no vetor de expressãopKN100 (Tabela 9). O iniciador direto 158vl introduz um sítio de restriçãoHind III; um sítio Kozak e a seqüência líder K5.1#. O iniciador reverso158vlrev introduz: um sítio doador de processamento e um sítio de restriçãoBam m.

10.3 - Os iniciadores de quimerização de cadeia pesada

A seqüência líder NL-I foi incorporada no modelo do VHde 158 quimérico. Iniciadores foram concebidos para gerar um produto dePCR contendo este líder, e a região VH de 158, com sítios de restriçãoterminais Hin dlll e Αρα I para clonagem no vetor de expressão pGlD200.Estes são mostrados em Tabela 9. O iniciador direto, 158vh, introduz umsítio de restrição Hin dlll; um sítio de início de tradução Kozak e aseqüência líder NL-1. O iniciador reverso, 158vhrev, introduz aextremidade 5' da região C γΐ e um sítio de restrição Αρα I natural. Estaprevisão de sítio de clivagem de peptídeo sinal para seqüência líder K5.1de VK é mostrada em Tabela 17.

10.4 - Geração da construção quimérica de VH de 158:pGlD200158VH

O fragmento de DNA de VH de 158 foi amplificado cominiciadores: 158vh e 158vhrev (Tabela 9). O produto de PCR de 450bp(aprox) foi T-A ligado no vetor pCR2.1 e usado para transformar bactériasTOP 10 quimicamente competentes. Clones foram selecionados por tamanhode inserto apropriado e seqüenciados usando o iniciador 1212 (Tabela 10). Oinserto de expressão correto foi subclonado em vetor de expressão pGlD200e o subclone correto foi selecionado por seqüenciamento de DNA usandoiniciador BDSH61R (Tabela 10). Este clone foi crescido em cultura de 200 mlpara produzir DNA de plasmídeo usando o Kit Maxi de Qiagen usando oprotocolo de fabricante. A proteína quimérica 158VH e seqüência de DNAsão mostradas em Tabela 18.

10.5 - Geração da construção quimérica de VK de 158:pKN100158VK

- O fragmento de DNA de VK de 158 foi amplificado cominiciadores 158vl e 158vlrev (Tabela 9). O produto de PCR de 450bp (aprox)foi T-A ligado no vetor pCR2.1 e usado para transformar bactérias TOP 10quimicamente competentes. Clones foram selecionados tamanho de inserto eseqüenciados usando o iniciador 1212 (Tabela 10). O clone correto foisubclonado em vetor de expressão ρΚΝΙΟΟ. O subclone correto foiselecionado triando por tamanho de inserto e seqüenciamento de DNA usandoiniciador Hu-K2 (Tabela 10). Este clone foi crescido em cultura de 200 mlpara produzir DNA de plasmídeo usando o Kit Maxi da Qiagen usando oprotocolo de fabricante.Exemplo 11 - Produção e propriedades de ligação de anticorpoquimérico 158

11.1— Transformação de célula COS 7 e cultura celular

Um frasco de células COS 7 foi descongelado e crescido emDMEM suplementado com 10% de soro de clone I fetal e antibióticos. Umasemana depois, células (0,8ml a 10 /ml) foram eletroporadas compGlD200158VH mais pKN100158VK (IOjig de cada DNA). As célulasforam crescidas em 8ml de meio de crescimento em placas de petri por 3dias.

11.2 - Produção de anticorpo quimérico

Um ELISA sanduíche foi usado para medir concentrações deanticorpo nos sobrenadantes de COS 7. Anticorpo quimérico 158 VH χ 158VK foi expresso a 0^g/ml e subseqüentemente a 3^g/ml (Tabela 19) emmeio condicionado com célula COS transientemente co-transfectada.

11.3— Atividade de anticorpo quimérico

Dois ELISAs foram usados para analisar a ligação de antígenode 158 quimérico. Usando o meio condicionado com anticorpo quimérico a3^g/ml, ligação de monômero Αβ foi medida por um protocolo de ELISAdireto (Figura 12) e comparada com a IgG 158 de camundongo.

Secundariamente, um ELISA de competição foi feito usando ou monômeroou protofibrila misturada na fase fluida com anticorpo, que subseqüentementese ligou a monômero Αβ na fase sólida (Figura 13). Estes mostraram que oanticorpo 158 quimérico se liga a monômero e protofibrila amilóide Αβsimilarmente ao anticorpo 158 de camundongo original.

Comentário

Seqüenciamento posterior mostrou que os dados de seqüênciade anticorpo de camundongo, como mostrado em Tabelas 1 e 4 contêm errostanto em cadeias VH como VK na extremidade 5'. Os requerentes sugeremque isto é devido ao uso de iniciadores localizados dentro da região V. Emseqüenciamento posterior, iniciadores localizados dentro das seqüênciaslíderes, que não podem introduzir mutações dentro das regiões V, foramusados. O seqüenciamento posterior mostrou diferenças de seqüências (vejaTabelas 15 e 11). Ditas diferenças entretanto não estão localizadas dentro dasregiões CDR.

O anticorpo quimérico se liga a monômero e protofibrilas deamilóide Αβ como mostrado pelo ELISA de ligação direta e o ELISA decompetição respectivamente. Esta evidência confirma que a combinação decadeias 158 VH e 158 VK codifica o anticorpo 158 anti-LSAP e indica queestas seqüências são adequadas para o procedimento de humanização paragerar um anticorpo 158 humanizado.

Exemplo 12 - Concepção e discussão de anticorpohumanizado Abreviações e definições

158 anticorpo monoclonal 158 de camundongo anti-LSAP™

158 VH VH de anticorpo 158 de camundongo

158 VK VK de anticorpo 158 de camundongo

158 RKAss Versão humanizada de VK de 158 retendo sítios deprocessamento críticos

158RKA Versão humanizada de VK de 158 com sítios deprocessamento críticos removidos 158RHAss Versãohumanizada de 158 VH retendo sítios de processamentocríticos

158RHA Versão humanizada de 158 VH com sítios deprocessamento críticos removidos

A Adenina

bp pares de bases

C Citosina

CDR região determinante de complementaridade nas regiõesvariáveis de imunoglobulina, definida usando o sistemade numeração de Kabat

<table>table see original document page 38</column></row><table>

Equipamento

<table>table see original document page 38</column></row><table>12.1 — Bancos de dados de gene V humano

As seqüências protéicas de imunoglobulinas humanas e decamundongo da International

Inununogenetics Database 2006 e da Publicação 5 de Bancode Dados de Kabat de Seqüências de Proteínas de Interesse Imunológico(última atualização 17-Nov-1999) foram usadas para compilar um banco dedados de seqüências protéicas de imunoglobulina em alinhamento de Kabat.

O banco de dados dos requerentes contém 9322 seqüências de VH humano e2689 de VK humano. O programa de análise de seqüências, SR 7.6, foi usadopara consultar os bancos de dados de VH e VK humano com seqüênciasprotéicas de VH de 158 e VK de 158 (Tabela 20).

12.2 - Seleção de uma estrutura humana para 158RHA

12.2.1 - Comparação de VH de 158 com seqüências de VHhumano

Seqüências de VH humano com maior identidade para VH de158 em resíduos (VCI) Nônios (Foote5J. and G.Winter. 1992. Antibodyframework residues affecting the conformation of the hypervariable loops.JMo 1.BioL 224:487-499.), Çanônicos (Morea5V., A.M.Lesk, and A.Tramontano.2000. Antibody modeling: implications for engineering and design. Methods20:267-279.) e VH-VL Interface (Chothia5C., J.Novotny, R.Bruccoleri, andM.Karplus. 1985. Domain association in immunoglobulin molecules. Thepacking of variable domains. J MoLBioL 186:651-663.), localizadas dentro daestrutura de região V (FW), são mostradas em Tabela 21. O número de resíduosVCI (escore de VCI) e resíduos FW (escore de FW) idênticos a 158 também sãomostrados. Todas estas seqüências de VH compartilham resíduos VCI idênticos,e comprimentos de CDR, como mostrado em Tabela 22. AJ556669 tem umaPro74 incomum não vista nas outras seqüências humanas neste conjunto dedados, levando os requerentes a descontá-la na análise inicial. Pro74, entretanto,está presente na seqüência 158VH, então AJ556669 pode ser considerado comoum FW alternativo para humanização, se a construção VH baseada emAF062243 não se liga a antígeno. O alinhamento destas seqüências (Tabela 23)destaca suas diferenças. AF062243 especificamente dentro deste conjunto dedados tem a mudança conservativa T(82a)S e a conservação de F79. As outrascaracterísticas de AF062243 são as mudanças conservativas DlE, K19R, A23S,T77S, S118T. Todas as outras mudanças de FW foram comuns a todos asestruturas em Tabela 23. AF062243 foi selecionado como o estrutura em qualbasear 158RHA.

12.3 - Geração de 158RHA

A concepção de 158RHA é simplesmente o enxerto de CDR 1,2 e 3 de VH de 158 no FW aceptor de AF062243. O gene V de linhagemgerminativa humana mais idêntico a AF062243 é VH M99649 (VH3-07),(Tabela 24) do qual o peptídeo líder foi extraído (Tabela 25). O algoritmoSignalP (Nielsen5H., J.Engelbrecht, S.Brunak, and G.von Heijne. 1997.Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction oftheir cleavage sites. Protein Eng 10:1-6.) previu que ele seria cortadoapropriadamente com peptidase sinal (Tabela 26). Tabela 27 mostra oesquema de enxertar CDR 1, 2 e 3 de VH de 158 no FW de AF062243, paragerar seqüência protéica 158RHA. Tabela 28 mostra a geração da seqüênciade DNA 158RHAss das seqüências de DNA naturais de VH de 158 eAF062243. Análise da seqüência de DNA de 158RHAss previu a presença desítios doadores de processamento, os escores de previsão dos quais sãomostrados em Tabela 29. Mutações não codificantes foram introduzidas parainativar estes sítios de processamento previstos, como mostrado em Tabela 30para gerar a seqüência de DNA 158RHA final (Tabela 31).

12.4 - Seleção de uma estrutura humana para 158RKA

12.4.1 - Comparação de VK de 158 com seqüências de VK humano

As seqüências de VK humano com maior identidade para VKde 158 em resíduos VCI são mostradas em Tabela 32 junto com o número deresíduos VCI (escore de VCI) e resíduos de FW (escore de FW) idênticos aVK de 158. Onze seqüências têm todos os resíduos VCI idênticos a VK de158. Tabela 33 mostra que todas estas seqüências têm comprimentos de CDRidênticos a VK de 158. Tabela 34 destaca suas diferenças, mostrando que K45é mantido em AB064054 apenas, que também retém 185. A mudança Gl OOPé desinteressante porque PlOO é comum, tendo uma incidência de 15% embanco de dados de VK humano de requerentes. As duas substituições: T7S eK74R, são conservativas, e todas as outras substituições são comuns a todasas seqüências em Tabela 34. Por estas razões AB064054 foi selecionado paragerar 158RKA.

12.5 - Geração de 158RKA

A concepção de 158RKA é simplesmente o enxerto dos CDRs1, 2 e 3 de VK de 158 no FW aceptor de AB064054 humano. O gene V delinhagem germinativa mais próxima a AB064054 é Al9 (Tabela 35), a partirdo qual o peptídeo líder foi extraído (Tabela 36). O algoritmo SignalP previuincisão apropriada (Tabela 37) deste peptídeo líder. Tabela 38 mostra ageração da seqüência protéica de 158RKA por intercalação das CDRs de VKde 158 no FW de AB064054. Tabela 39 mostra a geração da seqüência deDNA de 158RKAss da seqüência de DNA natural de VK de 158 eAB064054. Análise dos 158RKAss previu a presença de sítios doadores deprocessamento, os escores dos quais são mostrados em Tabela 40. Mutaçõesnão codificantes (41) foram introduzidas para inativar estes sítios e gerar aconstrução de DNA de 158RKA final (Tabela 42).

12.6 Atividade de ligação de anticorpo humanizado(BAN2401)

Os genes 158RKA e 158RHA foram inseridos em um vetor deexpressão contendo a região constante de IgGl. Esta construção foi expressaem células COS para gerar o anticorpo 158 humanizado. O anticorpo 158humanizado foi testado para atividade e especificidade de ligação em umELISA competitivo. O anticorpo humanizado exibiu propriedades de ligaçãoidênticas a mAbl58 e ao anticorpo quimérico 158 (veja Figura 14.)

12.7 Mutações adicionais nas cadeias 158RHA e 158RKA.

Comparando genes V de linhagem germinativa decamundongo VH AAK71612 a VH de 158 uma única mutação somáticaA60G na CDR2 foi identificada. Além disso, o modelo molecular deanticorpo 158 que contém três resíduos VH FW dentro de 5A de resíduos deCDR que não são conservados em 158RHA. Estas substituições são DlE5P74A e T82S (Tabela 43). Similarmente, existem dois resíduos VK FWdentro de 5A de resíduos de CDR que não é conservada em 158RKA. Estasubstituição é L3V e Gl OOP (Tabela 44). Introdução de mutações reversasem posições VH-1, VH-74, VH-82, VK-3 e VK-100 em 158RHA e 158RKA,em versões humanizadas 158RHB, 158RHC, 158RHD, 158RKB e 158RKCsão mostradas em Tabela 43 e 44.

REFERÊNCIAS

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Claims (35)

1. Anticorpo ou fragmento do mesmo sendo seletivo e tendoalta afinidade para protofibrilas Αβ humanas tipo selvagem, caracterizadopelo fato de que o anticorpo ou fragmento em suas seis regiões CDR tem asseguintes seqüências de consenso:VH-CDRl SFGMHVH-CDR2 YISSGSSTIYYGDTVKGVH-CDR3 EGGYYYGRS YYTMDYVL-CDRl RSSQSIVHSNGNTYLEVL-CDR2 KVSNRF SVL-CDR3 FQGSHVPPTem que dito anticorpo ou fragmento pode exibir deleções, substituições einserções de aminoácidos dentro de ditas regiões CDR.

2. Anticorpo de acordo com reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o anticorpo exibe 1-10 deleções, substituições e inserções deaminoácidos dentro de ditas regiões CDR.

3. Anticorpo de acordo com reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o anticorpo exibe 1-5 deleções, substituições e inserções deaminoácidos dentro de ditas regiões CDR.

4. Anticorpo de acordo com reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o anticorpo exibe 1-3 deleções de aminoácidos dentro deditas regiões CDR.

5. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo é monoclonal.

6. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo tem atividadereduzida de ativação de complemento.

7. Anticorpo de acordo com reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que dita atividade reduzida de ativação de complemento foiatingida mudando o aminoácido prolina em posição 331 por serina ou umoutro aminoácido polar.

8. Anticorpo de acordo com reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que dita atividade reduzida de ativação de complemento foiatingida inibindo ou diminuindo ou mudando a glicosilação.

9. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo é de classe IgG.

10. Anticorpo de acordo com reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que dito anticorpo é de subclasse IgGl ou IgG4.

11. Anticorpo de acordo com reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que dito anticorpo é uma quimera de subclasse IgGl ou IgG4,onde a região constante de cadeia pesada CH2 ou parte de CH2 é derivada deIgG4 e as regiões CH1 e CH3 são derivadas de IgGl, para ativação reduzidade complemento.

12. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo compreende aseqüência de cadeia pesada completa de acordo com Tabela 31 e a seqüênciade cadeia leve completa de acordo com Tabela 42.

13. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações- 1 a 11, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo compreende mutações nacadeia pesada (VH) de acordo com Tabela 43, ditas mutações sendoselecionadas a partir de A60G, P74A e T82S, e/ou mutações na cadeia leve(VK) de acordo com Tabela 44, ditas mutações sendo selecionadas a partir deL3V e GlOOP, ou combinações destas mutações em VH e VK.

14. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações- 1 a 11, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo compreende a seqüênciade cadeia pesada completa de acordo com Tabela 31 e a seqüência de cadeialeve completa de acordo com Tabela 42, com a exceção de que o oitavoaminoácido à esquerda da seqüência de cadeia pesada de CDRl é S.

15. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo é humano ouhumanizado ou mutado para reduzir antigenicidade em humanos.

16. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 11, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo é um anticorpo decamundongo.

17. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a proporção de especificidadeentre monômeros e protofibrilas Αβ é pelo menos 1:200.

18. Anticorpo de acordo com reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que dito anticorpo em suas seis regiões CDR tem as seguintesseqüências de consenso:VH-CDRl AASGFTFSSFGMHWVRVH-CDR2 WV A YIS S GS STIYYGDTVKGRFTVH-CDR3 C AREGG YYYGRSYYTMD YWGQVL-CDRl ISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLVL-CDR2 LIYKVSNRFSGVPVL-CDR3 YYCFQGSHVPPTFGGem que dito anticorpo ou fragmento pode exibir deleções, substituições einserções de aminoácidos dentro de ditas regiões CDR.

19. Anticorpo de acordo com reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que dito anticorpo é um anticorpo de camundongo.

20. Anticorpo de acordo com reivindicação 18 ou 19,caracterizado pelo fato de que dito anticorpo compreende a seqüência decadeia leve completa 158 VIA de acordo com Tabela Ilea seqüência decadeia pesada completa 158 VH de acordo com Tabela 15.

21. Composição, caracterizada pelo fato de compreender oanticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes eum tampão farmaceuticamente aceitável para uso humano e veterinário.

22. Composição de acordo com reivindicação 21, caracterizadapor compreender adicionalmente um agente antibacteriano.

23. Composição de acordo com reivindicação 22, caracterizadapelo fato de que a composição é liofilizada.

24. Composição de acordo com reivindicação 22, caracterizadapelo fato de que a composição é liofilizada junto com um excipiente paraaumentar estabilidade do anticorpo durante e depois de liofilização.

25. Composição de acordo com reivindicação 23, caracterizadapelo fato de que o excipiente é manitol ou trealose.

26. Método para prevenir ou tratar mal de Alzheimer,caracterizado por compreender a etapa de administrar a um paciente, tendo oususpeito de ter mal de Alzheimer, o anticorpo como definido em qualqueruma das reivindicações 1 a 20 ou a composição como definida em qualqueruma das reivindicações 21 a 25.

27. Método para prevenir ou tratar distúrbios, tais como,síndrome de Down, demência com corpos de Lewy, demência vascular eoutros distúrbios neurodegenerativos, caracterizado por compreender a etapade administrar a um paciente tendo ou suspeito de ter síndrome de Down,demência com corpos de Lewy, demência vascular e outros distúrbiosneurodegenerativos tendo o anticorpo como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 20 ou a composição como definida em qualquer uma dasreivindicações 21 a 25.

28. Método para detectar protofibrilas Αβ in vitro,caracterizado por compreender as etapas de:- adicionar o anticorpo como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 20 a uma amostra biológica compreendendo ou suspeita decompreender protofibrilas Αβ.- medir a concentração do complexo formado entre ditaprotofibrila Αβ e dito anticorpo.

29. Método de acordo com reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que dito método de detecção é um imunoensaio.

30. Método de acordo com reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que dito método de detecção é um ensaio de ligação deproximidade.

31. Método para detectar protofibrilas Αβ in vivo,caracterizado por compreender as etapas de:- adicionar o anticorpo como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 20 a um mamífero compreendendo ou suspeito decompreender protofibrilas Αβ.- medir a concentração do complexo formado entre ditaprotofibrila Αβ e dito anticorpo.

32. Método para diagnosticar distúrbio, o distúrbio sendo malde Alzheimer, caracterizado por compreender as etapas de:- tirar uma amostra biológica de um indivíduo,- adicionar o anticorpo como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 20 a dita amostra,- medir a concentração do complexo formado entre ditoanticorpo e quaisquer protofibrilas Αβ em dita amostra.

33. Método para diagnosticar distúrbios, tais como, síndromede Down, demência com corpos de Lewy, demência vascular e outrosdistúrbios neurodegenerativos, caracterizado por compreender as etapas de:- tirar uma amostra biológica de um indivíduo,- adicionar o anticorpo como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 20 a dita amostra,- medir a concentração do complexo formado entre ditoanticorpo e quaisquer protofibrilas Αβ em dita amostra.

34. Uso do anticorpo como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 20 ou da composição como definida em qualquer uma dasreivindicações 21 a 25, caracterizado por ser para a preparação de ummedicamento para tratamento de mal de Alzheimer.

35. Uso do anticorpo como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 20 ou da composição como definida em qualquer uma dasreivindicações 21 a 25, caracterizado por ser para a preparação de ummedicamento para tratamento de síndrome de Down, demência com corpos deLewy, demência vascular e outros distúrbios neurodegenerativos.