CN117903302A - 抗-Aβ球聚体抗体，其相关产品，生产所述抗体的方法，所述抗体的应用以及使用方法 - Google Patents

抗-Aβ球聚体抗体，其相关产品，生产所述抗体的方法，所述抗体的应用以及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗‑Aβ球聚体抗体，其抗原结合部分，相应的杂交瘤、核酸、载体、宿主细胞，生产所述抗体的方法，包含所述抗体的组合物，所述抗体的应用以及使用所述抗体的方法。抗‑Aβ球聚体(Globulomer)抗体，其抗原结合部分，相应的杂交瘤，核酸，载体，宿主细胞，生产所述抗体的方法，包含所述抗体的组合物，所述抗体的应用以及使用所述抗体的方法。本发明涉及具有对Aβ(20‑42)球聚体的结合亲和力大于该抗体对Aβ(1‑42)球聚体的结合亲和力的抗‑Aβ球聚体抗体，其抗原结合部分，产生所述抗体的杂交瘤，编码所述抗体的核酸，包含所述核酸的载体，包含所述载体的宿主细胞，生产所述抗体的方法，包含所述抗体的组合物，涉及阿尔茨海默病和其他淀粉样变性病的所述抗体的治疗和诊断应用以及相应的方法。

Description

抗-Aβ球聚体抗体，其相关产品，生产所述抗体的方法，所述抗 体的应用以及使用方法
本申请是申请号为201510920357.6的发明专利申请的分案申请。
技术领域和背景技术
本发明涉及抗-Aβ球聚体(globulomer)抗体，其抗原结合部分，产生所述抗体的杂交瘤，编码所述抗体的核酸，包含所述核酸的载体，包含所述载体的宿主细胞，生产所述抗体的方法，包含所述抗体的组合物，涉及阿尔茨海默病和其他淀粉样变性病的所述抗体的治疗和诊断应用以及相应的方法。
1907年，医师爱洛依斯·阿尔茨海默(Alois Alzheimer)首次描述了一种痴呆病的神经病理学特征，随后由于对其尊敬而命名了这种病症(Alzheimer 1907)。阿尔茨海默病(AD)是老年人中最常见的痴呆病因，在65岁以上人群中发病率为约10％。随着年龄增长，发病几率也随之上升。在全世界范围内约1500万人患有该病并且预期寿命进一步增加，预计在下一个十年中患病人数会增加约3倍。
从分子观点来看阿尔茨海默病(AD)，其特征在于异常聚集的蛋白沉积物。就胞外淀粉状蛋白斑来说，这些沉积物主要由淀粉状蛋白-β-肽丝组成，就胞内Tau蛋白的神经纤维缠结(NFTs)来说，淀粉状蛋白β(Aβ)肽来自β-淀粉状前体蛋白的蛋白水解切割。该切割受称为α-、β-和γ-分泌酶的一些蛋白酶协同活性的影响。切割产生了许多不同长度的特异性片段。淀粉状蛋白斑主要由40或42个氨基酸长度的肽(Aβ40，Aβ42)组成。主要切割产物为Aβ40；然而，Aβ42具有更强的毒性效应。
非常类似于在阿尔茨海默病中所观察到的那些，大脑淀粉状蛋白沉积物和认知缺陷也是唐氏综合征(第21号染色体三体综合征)的病征，其发病率为800例分娩中约1例。
Hatdy和Higgins的淀粉状蛋白级联假设假定增加Aβ(1-42)的产生会导致Aβ斑的主要成分——初原纤维和原纤维形成，这些原纤维是造成阿尔茨海默病症状的原因。尽管在痴呆的严重性和沉积的Aβ斑负荷(burden)之间相关为弱，但直到最近该假设仍受欢迎。AD脑中可溶性Aβ形式(其较斑负荷(plaque load)与AD症状更相关)的发现已产生了一种修订的淀粉状蛋白级联假设。
使用Aβ肽的自动免疫接种导致斑块形成减少并引起现有斑块部分溶解。同时其还导致APP转基因小鼠模型中认知缺陷的缓解。
还发现使用针对Aβ肽的抗体进行被动免疫接种能减少Aβ斑负荷。
使用AN-1792(处于原纤维聚集条件中的Aβ(1-42)肽)进行自动免疫接种的IIa期试验(ELAN Corporation Plc，South San Francisco，CA，USA和Dublin，UK)的结果认为针对Aβ肽的免疫治疗是成功的。在30位患者的一个亚组中，通过MMSE和DAD指数测定在具有阳性抗-Aβ抗体效价的患者中疾病进展明显减缓。然而，由于产生了脑膜脑炎的严重副作用，因此停止了该研究(Bennett和Holtzman，2005，Neurology，64，10-12)。
脑膜脑炎具有神经炎症和T-细胞浸润入脑的特征。推测起来，是由于注射的Aβ(1-42)作为抗原诱导的T-细胞免疫应答所致。在被动免疫接种后这样的免疫应答并不是所期望的。迄今为止，尚未有与其相关的临床资料可以利用。然而，由于在一周一次持续5个月的接受针对Aβ(1-42)的N端表位的抗体的非常老的APP23小鼠中所进行的临床前研究，因此已有呼声担忧关于这样的用于免疫接种的被动方法的副作用分布。与用盐水处理的对照动物相比，这些小鼠显示增加的微出血(microhaemorrhages)量和严重性(Pfeifer等，2002，Science，298，1379)。还在非常老(＞24个月)的Tg2576和PDAPP小鼠中描述了可比较的微出血增加(Racke等，2005，J Neurosci，25，629-636；Wilcock等2004，J.Neuroinflammation，1(1)：24；De Mattos等，2004，Neurobiol.Aging 25(S2)：577)。在这两种小鼠中，抗体注射导致明显增加的微出血。与此相反，针对Aβ(1-42)肽中间区的抗体并不诱导微出血(deMattos等，同上)。诱导微出血的缺乏与不结合以CAA形式聚集的Aβ肽的抗体处理有关(Racke等，J Neurosci，25，629-636)。但是，还不清楚转基因APP小鼠中导致微出血的准确机制。推测起来，大脑淀粉样血管病(CAA)诱导或至少加剧了脑出血。CAA存在于几乎每一例阿尔茨海默病的脑中，并且约20％的病例被认为是“重度CAA”。因此，被动免疫接种应当通过选择识别Aβ肽的中间或羧基末端区的抗体着眼于避免微出血。
WO2004/067561描述了稳定的Aβ(1-42)寡聚体(Aβ(1-42)球聚体)以及特异性针对该球聚体的抗体。用非特异性的蛋白酶消化显示Aβ球聚体可从由球状核心结构突出的亲水N端起被消化(Barghorn等，2005，J Neurochem，95，834-847)。上述N端截短的Aβ球聚体(Aβ(12-42)和Aβ(20-42)球聚体)代表了该寡聚Aβ的基本结构单元。对于引起高抗体效价的兔和小鼠自动免疫接种，它们是非常有效的抗原(WO2004/067561)。近来，已有一些关于N端截短的Aβ形式在AD脑中存在的报告提出了它们在体内推定的病理学作用(Sergeant等，2003，J Neurochem，85，1581-1591；Thal等，1999，J Neuropathol.Exp Neurol，58，210-216)。在体内消化过程中，某些见于脑中的蛋白酶如中性溶酶(neprilysin)(NEP 24.11)或胰岛素降解酶(IDE)可能与此有关(Selkoe，2001，Neuron，32，177-180)。
发明内容
本发明的一个目的是提供在免疫治疗中改善患者的认知性能、与此同时仅与脑中所有Aβ肽的一小部分反应的针对Aβ球聚体的抗体。预计能阻止脑Aβ平衡的实质性紊乱并产生更小的副作用。例如，在使用处于原纤维聚集条件中的Aβ肽的自动免疫接种的研究(使用AN1792的ELAN试验)中已观察到的脑容量在治疗上可疑的减少。此外，在该试验中观察到了以脑膜脑炎形式存在的严重副作用。
本发明通过提供对截短形式的Aβ球聚体具有高亲和力的球聚体特异性抗体从而解决了该问题。这些抗体不但能区分其他形式的Aβ肽，特别是单体和原纤维，还能区分未截短形式的Aβ球聚体。
因此，本发明涉及一种具有对Aβ(20-42)球聚体的结合亲和力大于该抗体对Aβ(1-42)球聚体的结合亲和力的抗体。
此外，本发明涉及一种具有对Aβ(20-42)球聚体的结合亲和力大于该抗体对Aβ(12-42)球聚体的结合亲和力的抗体。
根据一个特定的实施方案，本发明因此涉及具有对Aβ(20-42)球聚体的结合亲和力大于该抗体对Aβ(1-42)球聚体和Aβ(12-42)球聚体的结合亲和力的抗体。
术语“Aβ(X-Y)”在此指包括X和Y的人淀粉状β蛋白的从氨基酸第X位到氨基酸第Y位的氨基酸序列，特别是氨基酸序列DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVVIAT(相应于氨基酸第1-43位)或任何一种其天然存在的变体的从氨基酸第X位到氨基酸第Y位的氨基酸序列，所述变体特别是那些具有至少一个选自A2T、H6R、D7N、A21G(“佛兰芒人”)、E22G(“北极地区人”)、E22Q(“荷兰人”)、E22K(“意大利人”)、D23N(“艾奥瓦人”)、A42T和A42V的突变的变体，其中编号相对于包括第X位和第Y位或具有至多3个额外的氨基酸取代的序列的Aβ肽的起点，所述取代都不会阻止球聚体形成，优选在从氨基酸第12位或第X位(不论哪一个编号更高)到氨基酸第42位或第Y位(不论哪一个编号更低)不具有额外的氨基酸取代，更优选在从氨基酸第20位或第X位(不论哪一个编号更高)到氨基酸第42位或第Y位(不论哪一个编号更低)不具有额外的氨基酸取代，以及最优选在从氨基酸第20位或第X位(不论哪一个编号更高)到氨基酸第40位或第Y位(不论哪一个编号更低)不具有额外的氨基酸取代，“额外的”氨基酸取代在此是任何一种未见于自然界中的背离了规范序列(canonical sequence)的取代。
更具体地说，术语“Aβ(1-42)”在此指包括1和42的人淀粉状β蛋白的从氨基酸第1位到氨基酸第42位的氨基酸序列，特别是氨基酸序列DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGAIIGLMVGGVV IA或任何一种其天然存在的变体，所述变体特别是那些具有至少一个选自A2T、H6R、D7N、A21G(“佛兰芒人”)、E22G(“北极地区人”)、E22Q(“荷兰人”)、E22K(“意大利人”)、D23N(“艾奥瓦人”)、A42T和A42V的突变的变体，其中编号相对于包括1和42或具有至多3个额外的氨基酸取代的序列的Aβ肽的起点，所述取代都不会阻止球聚体形成，优选在从氨基酸第20位到氨基酸第42位不具有额外的氨基酸取代。同样地，术语“Aβ(1-40)”在此指包括1和40的人淀粉状β蛋白的从氨基酸第1位到氨基酸第40位的氨基酸序列，特别是氨基酸序列DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV或任何一种其天然存在的变体，所述变体特别是那些具有至少一个选自A2T、H6R、D7N、A21G(“佛兰芒人”)、E22G(“北极地区人”)、E22Q(“荷兰人”)、E22K(“意大利人”)和D23N(“艾奥瓦人”)的突变的变体，其中编号相对于包括1和40或具有至多3个额外的氨基酸取代的序列的Aβ肽的起点，所述取代都不会阻止球聚体形成，优选在从氨基酸第20位到氨基酸第40位不具有额外的氨基酸取代。
更具体地说，术语“Aβ(12-42)”在此指包括12和42的人淀粉状β蛋白的从氨基酸第12位到氨基酸第42位的氨基酸序列，特别是氨基酸序列VHHQKLVFF AEDVGSNKGAIIGLMVGGVV IA或任何一种其天然存在的变体，所述变体特别是那些具有至少一个选自A21G(“佛兰芒人”)、E22G(“北极地区人”)、E22Q(“荷兰人”)、E22K(“意大利人”)、D23N(“艾奥瓦人”)、A42T和A42V的突变的变体，其中编号相对于包括12和42或具有至多3个额外的氨基酸取代的序列的Aβ肽的起点，所述取代都不会阻止球聚体形成，优选在从氨基酸第20位到氨基酸第42位不具有额外的氨基酸取代。
更具体地说，术语“Aβ(20-42)”在此指包括20和42的人淀粉状β蛋白的从氨基酸第20位到氨基酸第42位的氨基酸序列，特别是氨基酸序列F AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA或任何一种其天然存在的变体，所述变体特别是那些具有至少一个选自A21G(“佛兰芒人”)、E22G(“北极地区人”)、E22Q(“荷兰人”)、E22K(“意大利人”)、D23N(“艾奥瓦人”)、A42T和A42V的突变的变体，其中编号相对于包括20和42或具有至多3个额外的氨基酸取代的序列的Aβ肽的起点，所述取代都不会阻止球聚体形成，优选没有任何额外的氨基酸取代。
术语“Aβ(X-Y)球聚体”(Aβ(X-Y)球状寡聚体)在此指具有均质性及截然不同的物理特性的如上所定义的Aβ(X-Y)肽的可溶的、球状的、非共价的缔合物。根据一个方面，Aβ(X-Y)球聚体是通过与阴离子型去污剂温育可获得的Aβ(X-Y)肽的稳定的、非原纤维的、寡聚的集合。与单体和原纤维大不相同的是，这些球聚体具有规定的亚基装配数的特征(例如WO2004/067561中所描述的，如早期装配形式，n＝4-6，“寡聚体A”，和晚期装配形式，n＝12-14，“寡聚体B”)。该球聚体具有三维球形结构(“熔球(molten globule)”，参见Barghorn等，2005，J Neurochem，95，834-847)。它们可进一步具有一种或多种如下特征：
-N端氨基酸X-23为混栖蛋白酶(如嗜热菌蛋白酶或内切蛋白酶GluC)所可切割产生截短形式的球聚体；
，C，末端氨基酸24-Y不为混栖蛋白酶和抗体所可接近；
-这些球聚体的截短形式保持所述球聚体的三维核心结构，在其球聚体构象中核心表位Aβ(20-Y)具有更好的可接近性。
根据本发明以及特别是为了评价本发明的抗体的结合亲和力，术语“Aβ(X-Y)球聚体”在此特别是指通过如WO 2004/067561(在此并入作为参考文献)中所描述的方法可获得的产物。
所述方法包括解折叠天然、重组或合成的Aβ(X-Y)肽或其衍生物；将至少部分解折叠的Aβ(X-Y)肽或其衍生物暴露于去污剂，降低去污作用并持续温育。
为了解折叠肽，可让氢键断裂剂如六氟异丙醇(HFIP)作用于蛋白。当作用温度为约20-50℃，特别是约35-40℃时，几分钟的作用时间，例如约10-60分钟就足够了。之后在与含水缓冲液可混溶的适合的有机溶剂如二甲亚砜(DMSO)中，优选以浓缩形式溶解蒸发干燥的残留物，产生至少部分解折叠的肽或其衍生物的悬液，其可接着被使用。如果需要的话，原悬液可在低温下例如在约-20℃下贮藏临时的一段时间。
可选地，肽或其衍生物可处于微酸性、优选含水的溶液中，例如约10mM HCl水溶液中。在通常几分钟的温育时间后，通过离心除去不溶性成分。在10000g下离心几分钟是合适的。这些方法步骤优选在室温(即20-30℃)的温度下进行。离心后获得的上清液含有Aβ(X-Y)肽或其衍生物并可在低温下例如在约-20℃下贮藏临时的一段时间。
以下暴露于去污剂中涉及肽或其衍生物的寡聚化以产生中间类型的寡聚体(在WO2004/067561中称为寡聚体A)。为了该目的，让去污剂作用于至少部分解折叠的肽或其衍生物直至足够的中间类型寡聚体产生。
优选使用离子型去污剂，特别是阴离子型去污剂。
根据一个特定的实施方案，使用了通式(I)的去污剂：
R-X，
其中
基团R是具有6-20个，优选10-14个碳原子的直链或支链烷基或具有6-20个，优选10-14个碳原子的直链或支链烯基，
基团X是酸性基团或其盐，优选地，X选自：-COO-M+、-SO3 -M+，特别是-OSO3 -M+，并且M+是氢阳离子或优选选自碱金属和碱土金属阳离子以及铵阳离子的无机或有机阳离子。
优选其中R为直链烷基、特别是烷-1-基的通式(I)的去污剂。特别优选的是十二烷基硫酸钠(SDS)。月桂酸和油酸也可有利地使用。去污剂月桂酰基肌氨酸(lauroylsarcosin)(也称为肌氨酰NL-30或)的钠盐也是特别优选的。
去污剂的作用时间无论如何都具体取决于解折叠的肽或其衍生物寡聚化的程度。如果，根据解折叠步骤，已用氢键断裂剂即特别是用六氟异丙醇预先处理了肽或其衍生物，当作用温度为约20-50℃以及特别是约35-40℃时，则作用时间在几个小时的范围内，优选约1-20个小时，特别约2-10小时就足够了。如果在起点肽或其衍生物较少解折叠或基本上没有解折叠，相应地更长的作用时间是权宜的。如果肽或其衍生物已进行预处理，例如，根据上述操作可以替代HFIP的处理或所述肽或其衍生物直接寡聚化，当作用温度为约20-50℃以及特别是约35-40℃时，则作用时间为约5-30小时以及特别是约10-20小时就足够了。温育后，优选通过离心除去不溶性成分。在10000g下离心几分钟是合适的。
取决于所使用的去污剂选择去污剂浓度。如果使用SDS，则按重量计算浓度为0.01-1％，优选0.05-0.5％，例如约0.2％被证明是合适的。如果使用月桂酸或油酸，稍高的浓度是合适的，例如按重量计算为0.05-2％，优选0.1-0.5％，例如约0.5％。
去污作用应当在大约生理学范围的盐浓度下进行。因此，特别是50-500mM，优选100-200mM以及尤其是约140mM的NaCl浓度是合适的。
去污作用的随后降低以及持续温育涉及进一步的寡聚化以产生本发明的Aβ(X-Y)球聚体(在WO 2004/067561中称为寡聚体B)。由于获得自上述步骤的组合物通常含有去污剂并且盐浓度处于生理学范围内，因此方便降低去污作用以及优选地也方便减少盐浓度。这可通过减少去污剂和盐浓度来实行，例如通过方便地用水或更低盐浓度的缓冲液如Tris-HCl，pH 7.3稀释。已证实稀释因子为约2-10，优选为约3-8，以及特别是约4是合适的。还可通过添加能中和所述去污作用的物质实现降低去污作用。这些物质的例子包括能与去污剂络合的物质，如能在纯化和抽提方法过程中稳定细胞的物质，例如特定的EO/PO嵌段共聚物，特别是商标名为F 68的嵌段共聚物。处于特定临界胶束浓度周围或高于特定临界胶束浓度的浓度范围内的烷氧基化以及特别是乙氧基化烷基酚如X系列的乙氧基化叔辛基酚，特别是X100、3-(3-胆酰胺丙基二甲氨基)-1-丙磺酸内盐或烷氧基化以及特别是乙氧基化山梨糖醇酐脂肪酸酯如那些系列的，特别是20，可同等地使用。
随后，温育溶液直至足够的本发明的Aβ(X-Y)球聚体产生为止。当在约20-50℃下以及特别是在约35-40℃下作用时，作用时间在几个小时范围内，优选约10-30小时以及特别是约15-25小时就足够了。然后，可浓缩溶液并通过离心除去可能的残留物。这里也一样，在10000g下离心几分钟被证实是合适的。离心后获得的上清液含有本发明的Aβ(X-Y)球聚体。
本发明的Aβ(X-Y)球聚体可最终以一种本身已知的方法回收，如通过超滤、透析、沉淀或离心。
进一步优选如果在变性条件下Aβ(X-Y)球聚体的电泳分离如通过SDS-PAGE，则产生两条带(如对于Aβ(1-42)具有38/48kDa的表观分子量)，以及特别优选如果在分离前球聚体进行戊二醛处理，则这两条带合并为一条带。还优选如果球聚体进行大小排阻层析则分别产生单峰(如对于Aβ(1-42)球聚体相应于约100kDa的分子量或对于戊二醛交联的Aβ(1-42)球聚体相应于约60kDa的分子量)。
由Aβ(1-42)肽、Aβ(12-42)肽和Aβ(20-42)肽起始，所述方法特别适合于获得Aβ(1-42)球聚体、Aβ(12-42)球聚体和Aβ(20-42)球聚体。
在本发明的一个特定实施方案中，其中X选自数字2..24以及Y为如上所定义的Aβ(X-Y)球聚体是那些通过将Aβ(1-Y)球聚体截短至其中X选自数字2..24、优选20或12以及Y为如上所定义的更短形式而可获得的抗体，可通过用适当的蛋白酶处理来获得。例如，可通过对Aβ(1-42)球聚体进行嗜热菌蛋白酶蛋白水解获得Aβ(20-42)球聚体，以及可通过对Aβ(1-42)球聚体进行内切蛋白酶GluC蛋白水解获得Aβ(12-42)球聚体。当达到期望的蛋白水解程度时，以通常所知的方式失活蛋白酶。在本文业已描述的操作之后，分离所得到的球聚体，以及如果需要的话，通过进一步的检查和纯化步骤进行进一步的处理。所述处理的详细描述披露于WO 2004/067561中，其在此并入作为参考。
对于本发明来说，Aβ(1-42)球聚体具体来说是如本文实施例1a中所描述的Aβ(1-42)球聚体；Aβ(20-42)球聚体具体来说是如本文实施例1c中所描述的Aβ(20-42)球聚体，以及Aβ(12-42)球聚体具体来说是如本文实施例1d中所描述的Aβ(12-42)球聚体。
优选地，球聚体具有对神经元细胞的亲和性。优选地，球聚体还具有神经调节作用。
根据本发明的另一个方面，球聚体由11-16个Aβ(X-Y)肽，以及最优选地由12-14个Aβ(X-Y)肽组成。
根据本发明的另一个方面，术语“Aβ(X-Y)球聚体”在此指基本上由Aβ(X-Y)亚基组成的球聚体，其中优选平均起来至少11/12的亚基为Aβ(X-Y)型，更优选少于10％的球聚体包含任何非-Aβ(X-Y)肽，以及最优选非-Aβ(X-Y)肽的含量低于检出阈值。
更具体地说，术语“Aβ(1-42)球聚体”在此指基本上由如上所定义的Aβ(1-42)单位组成的球聚体；术语“Aβ(12-42)球聚体”在此指基本上由如上所定义的Aβ(12-42)单位组成的球聚体；以及术语“Aβ(20-42)球聚体”在此指基本上由如上所定义的Aβ(20-42)单位组成的球聚体。
术语“交联的Aβ(X-Y)球聚体”在此指通过交联、优选化学交联、更优选醛交联、最优选戊二醛交联球聚体组成单位，可获得自如上所描述的Aβ(X-Y)球聚体的分子。在本发明的另一个方面中，交联的球聚体基本上为其中单位是至少部分通过共价键连接而非仅通过非共价相互作用结合的球聚体。对于本发明来说，交联的Aβ(1-42)球聚体具体来说是如本文实施例1b中所描述的交联的Aβ(1-42)寡聚体。
术语“Aβ(X-Y)球聚体衍生物”在此特别是指通过共价连接便于检测的基团而被标记的球聚体，所述基团优选荧光团，如异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、维多利亚多管发光水母(Aequorea Victoria)荧光蛋白、网鳚属(Dictyosoma)荧光蛋白或它们的任何组合或荧光活性衍生物；生色团；化学发光体，如荧光素酶，优选北美萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶、费氏弧菌(Vibrio fischeri)荧光素酶或它们的任何组合或化学发光活性衍生物；酶活性基团，如过氧化物酶，如辣根过氧化物酶或其任何酶活性衍生物；高电子密度基团，如含有重金属的基团，如含有金的基团；半抗原，如酚衍生的半抗原；强抗原结构，如预计具有抗原性的肽序列，如通过Kolaskar和Tongaonkar的算法预计具有抗原性的肽序列；针对另一种分子的适体；螯合基团，如六组氨酸基；天然或天然衍生的蛋白结构介导的进一步的特异性蛋白-蛋白相互作用，如fos/jun对成员；磁性基团，如铁磁性基团；或放射性基团，如包含1H、14C、32P、35S或125I或它们的任何组合的基团；或指通过共价或非共价高亲和力相互作用所标签的球聚体，优选共价连接有便于失活、多价螯合、降解和/活沉淀的基团，优选用促进体内降解的基团、更优选用泛素进行标签，在此如果该标签的寡聚体在体内装配则是特别优选的；或指通过任何上述组合所修饰的球聚体。上述标记和标签基团及用于将它们连接在蛋白上的方法是本领域已知的。标记和/或标签可在球聚体化之前、期间或之后进行。在本发明的另一个方面中，球聚体衍生物是通过标记和/或标签反应可获得自球聚体的分子。
相应地，术语“Aβ(X-Y)单体衍生物”在此特别是指如对球聚体所描述的被标记或标签的Aβ单体。
有利地，本发明的抗体以1x10-6 M-1x10-12 M的KD结合Aβ(20-42)球聚体。优选地，抗体以高亲和力结合Aβ(20-42)球聚体，例如以1x10-7M的KD或更大的亲和力，如以3x10-8M的KD或更大的亲和力，以1x10-8M的KD或更大的亲和力，如以3x10-9M的KD或更大的亲和力，以1x10-9M的KD或更大的亲和力，如以3x10-10M的KD或更大的亲和力，以1x10-10M的KD或更大的亲和力，如以3x10-11M的KD或更大的亲和力，或以1x10-11M的KD或更大的亲和力结合。
术语“更大的亲和力”在此指一种相互作用的程度，其中未结合的抗体和未结合的球聚体在一边而抗体-球聚体复合物在另一边的平衡是更有利于抗体-球聚体复合物。同样地，术语“更小的亲和力”在此指一种相互作用的程度，其中未结合的抗体和未结合的球聚体在一边而抗体-球聚体复合物在另一边的平衡是更有利于未结合的抗体和未结合的球聚体。术语“更大的亲和力”与术语“更高的亲和力”是同义的，以及术语“更小的亲和力”与术语“更低的亲和力”是同义的。
根据一个特定的实施方案，本发明涉及以1x10-6M-1x10-12M的KD结合Aβ(20-42)球聚体，以及以10-12M的KD或更小的亲和力结合Aβ(1-42)球聚体，对Aβ(20-42)球聚体的结合亲和力大于对Aβ(1-42)球聚体的结合亲和力的抗体。
优选本发明的抗体对Aβ(20-42)球聚体的结合亲和力是至少2倍，如至少3倍或至少5倍，优选至少10倍，如至少20倍、至少30倍或至少50倍，更优选至少100倍，如至少200倍、至少300倍或至少500倍，以及还优选至少1000倍，如至少2000倍、至少3000倍或至少5000倍，更优选至少10000倍，如至少20000倍、至少30000或至少50000倍，以及最优选至少100000倍大于该抗体对Aβ(1-42)球聚体的结合亲和力。
根据一个特定的实施方案，本发明涉及以10-12M的KD或更小的亲和力结合Aβ(12-42)球聚体，对Aβ(20-42)球聚体的结合亲和力大于对Aβ(12-42)球聚体的结合亲和力的抗体。
还优选本发明的抗体对Aβ(20-42)球聚体的结合亲和力是至少2倍，如至少3倍或至少5倍，优选至少10倍，如至少20倍、至少30倍或至少50倍，更优选至少100倍，如至少200倍、至少300倍或至少500倍，以及还优选至少1000倍，如至少2000倍、至少3000倍或至少5000倍，更优选至少10000倍，如至少20000倍、至少30000或至少50000倍，以及最优选至少100000倍大于该抗体对Aβ(12-42)球聚体的结合亲和力。
优选地，本发明的抗体结合至少一种如上所定义的Aβ球聚体，并对至少一种Aβ的非球聚体形式具有相对更小的亲和力。
与对至少一种Aβ球聚体相比，对至少一种Aβ的非球聚体形式具有相对更小的亲和力的本发明的抗体包括具有对Aβ(20-42)球聚体的结合亲和力大于对Aβ(1-42)单体的结合亲和力的抗体。此外，可选地或另外地优选抗体对Aβ(20-42)球聚体的结合亲和力大于对Aβ(1-40)单体的结合亲和力。
在本发明的一个优选的实施方案中，抗体对Aβ(20-42)球聚体的亲和力大于其对Aβ(1-40)与Aβ(1-42)单体的亲和力。
术语“Aβ(X-Y)单体”在此指Aβ(X-Y)肽的分离形式，优选地指一种基本上不卷入与其他Aβ肽产生非共价相互作用的Aβ(X-Y)肽的形式。事实上，Aβ(X-Y)单体通常以水溶液形式提供。在本发明的一个特别优选的实施方案中，单体水溶液含有0.05％-0.2％，更优选约0.1％的NH4OH。在本发明的另一个特别优选的实施方案中，单体水溶液含有0.05％-0.2％，更优选约0.1％的NaOH。当使用(例如用于测定本发明的抗体的结合亲和力)时，可以适当的方式方便地稀释所述溶液。此外，通常有利的是在其沉淀后2小时内、特别是1小时内以及尤其在30分钟内使用所述溶液。
更具体地说，术语“Aβ(1-40)单体”在此指如本文实施例2中所描述的Aβ(1-40)单体植被物，以及术语“Aβ(1-42)单体”在此指如本文实施例2中所描述的Aβ(1-42)制品。
有利地，本发明的抗体以低亲和力结合一种或更优选地结合两种单体，最优选以1x10-8M的KD或更小的亲和力，如以3x10-8M的KD或更小的亲和力，以1x10-7M的KD或更小的亲和力，如以3x10-7M的KD或更小的亲和力，或以1x10-6M的KD或更小的亲和力，如以3x10-5M的KD或更小的亲和力，或以1x10-5M的KD或更小的亲和力结合。
特别优选的是本发明的抗体对Aβ(20-42)球聚体的结合亲和力是至少2倍，如至少3倍或至少5倍，优选至少10倍，如至少20倍、至少30倍或至少50倍，更优选至少100倍，如至少200倍、至少300倍或至少500倍，以及还优选至少1000倍，如至少2000倍、至少3000倍或至少5000倍，更优选至少10000倍，如至少20000倍、至少30000或至少50000倍，以及最优选至少100000倍大于该抗体对一种或更优选地对两种单体的结合亲和力。
与对至少一种Aβ球聚体相比，对至少一种Aβ的非球聚体形式具有相对更小的亲和力的本发明的抗体进一步包括具有对Aβ(20-42)球聚体的结合亲和力大于对Aβ(1-42)原纤维的结合亲和力的抗体。此外，可选地或另外地优选抗体对Aβ(20-42)球聚体的结合亲和力大于对Aβ(1-40)原纤维的结合亲和力。
术语“原纤维”在此指一种包含非共价缔合的单个Aβ(X-Y)肽的装配体的分子结构，其在电子显微镜中显示有原纤维结构，结合刚果红然后在偏振光下具有双折射，并且其的X-射线衍射图谱为交叉-β结构。
在本发明的另一个方面中，原纤维是一种通过包含如在0.1M HCl中，于去污剂不存在的情况下合适的Aβ肽的自身诱导的聚合聚集，所述聚集导致多于24个单体、优选多于100个单体的聚合物形成的处理可获得的分子结构。该处理为本领域众所周知。有利地，Aβ(X-Y)原纤维以水溶液形式得到使用。在本发明的一个特别优选的实施方案中，通过将Aβ肽溶解于0.1％NH4OH中，用20mM NaH2PO4，140mM NaCl，pH 7.4以1∶4稀释其，然后调pH至7.4，在37℃下温育溶液20小时，接着在10000g下离心10分钟并重悬于20mM NaH2PO4，140mMNaCl，pH 7.4中来制备原纤维水溶液。
术语“Aβ(X-Y)原纤维”在此指基本上由Aβ(X-Y)亚基组成的原纤维，其中优选平均起来至少90％的亚基为Aβ(X-Y)型，更优选至少98％的亚基为Aβ(X-Y)型，以及最优选非-Aβ(X-Y)肽的含量低于检出阈值。
更具体地说，术语“Aβ(1-42)原纤维”在此指如本文实施例3中所描述的Aβ(1-42)原纤维制品。
有利地，本发明的抗体以低亲和力结合一种或更优选地结合两种原纤维，最优选以1x10-8M的KD或更小的亲和力，如3x10-8M的KD或更小的亲和力，以1x10-7M的KD或更小的亲和力，如以3x10-7M的KD或更小的亲和力，或以1x10-6M的KD或更小的亲和力，如以3x10-5M的KD或更小的亲和力，或以1x10-5M的KD或更小的亲和力结合。
特别优选的是本发明的抗体对Aβ(20-42)球聚体的结合亲和力是至少2倍，如至少3倍或至少5倍，优选至少10倍，如至少20倍、至少30倍或至少50倍，更优选至少100倍，如至少200倍、至少300倍或至少500倍，以及还优选至少1000倍，如至少2000倍、至少3000倍或至少5000倍，更优选至少10000倍，如至少20000倍、至少30000或至少50000倍，以及最优选至少100000倍大于该抗体对一种或更优选地对两种原纤维的结合亲和力。
根据一个特定的实施方案，本发明涉及具有对Aβ(20-42)球聚体的结合亲和力大于其对Aβ(1-40)和Aβ(1-42)原纤维的结合亲和力的抗体。
根据一个特定的优选实施方案，本发明涉及与对至少一种Aβ球聚体、特别是Aβ(20-42)球聚体相比，具有对Aβ单体和原纤维形式相对更小的亲和力的抗体。这些抗体在下文中称为球聚体特异性抗体。
本发明的抗体进一步包括具有对Aβ(20-42)球聚体的结合亲和力大于对交联的Aβ(1-42)球聚体，特别是对戊二醛交联的Aβ(1-42)球聚体的结合亲和力的抗体，例如在本文实施例1b中所描述的抗体。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，抗体对Aβ(20-42)球聚体的结合亲和力是至少2倍，如至少3倍或至少5倍，优选至少10倍，如至少20倍、至少30倍或至少50倍，更优选至少100倍，如至少200倍、至少300倍或至少500倍，以及还优选至少1000倍，如至少2000倍、至少3000倍或至少5000倍，更优选至少10000倍，如至少20000倍、至少30000或至少50000倍，以及最优选至少100000倍大于该抗体对交联的Aβ(1-42)球聚体的结合亲和力。
本发明的抗体优选是分离的，特别是单克隆的以及更特别是重组的。
本发明还涉及可获得自指定为ATCC保藏编号PTA-7241的杂交瘤的单克隆抗体(5F7)。
本发明还涉及可获得自指定为ATCC保藏编号PTA-7239的杂交瘤的单克隆抗体(10F11)。
本发明还涉及可获得自指定为ATCC保藏编号PTA-7240的杂交瘤的单克隆抗体(7C6)。
本发明还涉及可获得自指定为ATCC保藏编号PTA-7242的杂交瘤的单克隆抗体(4B7)。
本发明还涉及可获得自指定为ATCC保藏编号PTA-7409的杂交瘤的单克隆抗体(6A2)。
本发明还涉及可获得自指定为ATCC保藏编号PTA-7408的杂交瘤的单克隆抗体(2F2)。
本发明还涉及可获得自指定为ATCC保藏编号PTA-7405的杂交瘤的单克隆抗体(4D10)。
本发明还涉及可获得自指定为ATCC保藏编号PTA-7809的杂交瘤的单克隆抗体(7E5)。
本发明还涉及可获得自指定为ATCC保藏编号PTA-7810的杂交瘤的单克隆抗体(10C1)。
本发明还涉及可获得自指定为ATCC保藏编号PTA-7851的杂交瘤的单克隆抗体(3B10)。
这些本发明的抗体，5F7、10F11、7C6、4B7、6A2、2F2、4D10、7E5、10C1和3B10，具有对Aβ(20-42)球聚体的结合亲和力大于这些抗体对Aβ(1-42)球聚体的结合亲和力的特征。
本发明还涉及与任何一种所述单克隆抗体5F7、10F11、7C6、4B7、6A2、2F2、4D10、7E5、10C1和3B10具有类似的结合状况(binding profile)的抗体。具有类似于任何一种所述单克隆抗体的结合状况的抗体应当理解为不限于具有对Aβ(20-42)球聚体的结合亲和力大于该抗体对Aβ(1-42)球聚体的结合亲和力的抗体。
具有结合状况类似于任何一种所述单克隆抗体5F7、10F11、7C6、4B7、6A2、2F2、4D10、7E5、10C1和3B10的结合状况的抗体包括与单克隆抗体5F7、10F11、7C6、4B7、6A2、2F2、4D10、7E5、10C1和3B10结合相同表位的抗体。
所有来自5F7、10F11、7C6、4B7、6A2、2F2、4D10、7E5、10C1和3B10的单克隆抗体都结合包含在20-42Aβ序列范围之内，特别是在20-30Aβ序列范围之内的表位。不受理论约束，认为所述表位是处于氨基酸20-42区域中，特别是处于氨基酸20-30区域中的亚基之间的结构的、非线性的表位。
本发明还涉及能与至少一种、优选所有的选自5F7、10F11、7C6、4B7、6A2、2F2、4D10、7E5、10C1和3B10的抗体竞争的抗体。
术语“竞争性抗体”在此指多种靶向相同分子或稳定地但非共价地连接超分子实体优选相同的分子的抗体，其中至少一种抗体能特异性减少另一种抗体的可测量的结合，优选通过在空间上阻碍其他抗体接近其靶表位或通过诱导和/或稳定靶实体中的构象从而减少对其他抗体的靶亲和力，更优选通过结合非常靠近其他抗体的靶表位、与之重叠或与之相同的表位，最优选通过结合重叠或相同的、特别是相同的表位而直接阻断接近其他抗体的靶表位。两个表位如果它们共同享有一部分的它们的化学结构优选它们的氨基酸序列，则在此被认为是“重叠的”，以及如果它们的化学结构优选它们的氨基酸序列是相同的，则被认为是“相同的”。
因此，本发明还涉及其靶表位与至少一种选自5F7、10F11、7C6、4B7、6A2、2F2、4D10、7E5、10C1和3B10的抗体的靶表位重叠、优选与之相同的抗体。
因此，与任何一种所述单克隆抗体5F7、10F11、7C6、4B7、6A2、2F2、4D10、7E5、10C1和3B10具有类似的结合状况的抗体进一步包括包含任何一种所述单克隆抗体5F7、10F11、7C6、4B7、6A2、2F2、4D10、7E5、10C1和3B10的至少一部分的抗原结合部分的抗体。优选地，所述部分包含任何一种所述单克隆抗体5F7、10F11、7C6、4B7、6A2、2F2、4D10、7E5、10C1和3B10的至少一个互补决定区(CDR)。
因此，根据一个更进一步的特定实施方案，本发明涉及包含单克隆抗体5F7、10F11、7C6、4B7、6A2、2F2、4D10、7E5、10C1或3B10的重链CDR3的氨基酸序列和/或轻链CDR3的氨基酸序列的抗体。上述抗体的具体例子包括那些还分别包含单克隆抗体5F7、10F11、7C6、4B7、6A2、2F2、4D10、7E5、10C1或3B10的重链CDR2的氨基酸序列和/或轻链CDR2的氨基酸序列的抗体。还更具体地说，上述抗体包括那些还分别包含单克隆抗体5F7、10F11、7C6、4B7、6A2、2F2、4D10、7E5、10C1或3B10的重链CDR1的氨基酸序列和/或轻链CDR1的氨基酸序列的抗体。
在一个方面中，本发明因此涉及包含其中CDR3、CDR2和/或CDR1区含有单克隆抗体5F7、10F11、7C6、4B7、6A2、2F2、4D10、7E5、10C1或3B10的重链CDR3、CDR2和/或CDR1的氨基酸序列的重链的抗体。
在另一个方面中，本发明因此涉及包含其中CDR3、CDR2和/或CDR1区含有单克隆抗体5F7、10F11、7C6、4B7、6A2、2F2、4D10、7E5、10C1或3B10的轻链CDR3、CDR2和/或CDR1的氨基酸序列的轻链的抗体。
优选地，抗体包含至少一个含有选自以下的氨基酸序列的CDR：SEQ ID NO：3的氨基酸残基31-35、SEQ ID NO：3的氨基酸残基50-66、SEQ ID NO：3的氨基酸残基99-109、SEQID NO：4的氨基酸残基24-39、SEQ ID NO：4的氨基酸残基55-61、SEQ ID NO：4的氨基酸残基94-102、SEQ ID NO：7的氨基酸残基31-35、SEQ ID NO：7的氨基酸残基50-66、SEQ ID NO：7的氨基酸残基97-109、SEQ ID NO：8的氨基酸残基24-39、SEQ ID NO：8的氨基酸残基55-61、SEQ ID NO：8的氨基酸残基94-102、SEQ ID NO：11的氨基酸残基31-35、SEQ ID NO：11的氨基酸残基50-65、SEQ ID NO：11的氨基酸残基98-107、SEQ ID NO：12的氨基酸残基24-39、SEQ ID NO：12的氨基酸残基55-61、SEQ ID NO：12的氨基酸残基94-102、SEQ ID NO：15的氨基酸残基31-35、SEQ ID NO：15的氨基酸残基50-66、SEQ ID NO：15的氨基酸残基99-107、SEQ ID NO：16的氨基酸残基24-40、SEQ ID NO：16的氨基酸残基56-62、SEQ ID NO：16的氨基酸残基95-103、SEQ ID NO：19的氨基酸残基31-35、SEQ ID NO：19的氨基酸残基50-66、SEQ ID NO：19的氨基酸残基99-109、SEQ ID NO：20的氨基酸残基24-39、SEQ ID NO：20的氨基酸残基55-61、SEQ ID NO：20的氨基酸残基94-102、SEQ ID NO：23的氨基酸残基31-35、SEQ ID NO：23的氨基酸残基50-66、SEQ ID NO：23的氨基酸残基99-109、SEQ ID NO：24的氨基酸残基24-39、SEQ ID NO：24的氨基酸残基55-61、SEQ ID NO：24的氨基酸残基94-102、SEQ ID NO：27的氨基酸残基31-35、SEQ ID NO：27的氨基酸残基50-65、SEQ ID NO：27的氨基酸残基98-101、SEQ ID NO：28的氨基酸残基24-39、SEQ ID NO：28的氨基酸残基55-61、SEQ ID NO：28的氨基酸残基94-102、SEQ ID NO：31的氨基酸残基31-35、SEQ ID NO：31的氨基酸残基50-66、SEQ ID NO：31的氨基酸残基99-107、SEQ ID NO：32的氨基酸残基24-40、SEQ ID NO：32的氨基酸残基56-62、SEQ ID NO：32的氨基酸残基95-103、SEQ ID NO：35的氨基酸残基31-35、SEQ ID NO：35的氨基酸残基50-66、SEQ ID NO：35的氨基酸残基99-107、SEQ ID NO：36的氨基酸残基24-40、SEQ ID NO：36的氨基酸残基56-62、SEQ ID NO：36的氨基酸残基95-103、SEQ ID NO：38的氨基酸残基31-35、SEQ ID NO：38的氨基酸残基50-66和SEQ ID NO：38的氨基酸残基98-109。
在一个优选的实施方案中，抗体包含至少3个选自上述披露的序列中的CDR。更优选地，该经选择的3个CDR是来自选自以下的可变区CDR组：
在一个实施方案中，本发明的抗体包含至少两个可变区CDR组。更优选地，这两个可变区CDR组选自：VH 5F7 CDR组&VL 5F7 CDR组；VH 10F11 CDR组&VL 10F11 CDR组；VH7C6 CDR组&VL 7C6 CDR组；VH 4B7 CDR组&VL 4B7 CDR组；VH 2F2 CDR组&VL 2F2 CDR组；VH6A2 CDR组&VL 6A2 CDR组；VH 4D10 CDR组&VL 4D10 CDR组；VH 7E5 CDR组&VL 7E5 CDR组；和VH 10C1 CDR组&VL 10C1 CDR组。
在另一个实施方案中，以上所披露的抗体进一步包含人受体构架区。
在一个优选的实施方案中，抗体为CDR嫁接抗体。优选地，CDR嫁接抗体包含一个或多个上述披露的CDRs。
优选地，CDR嫁接抗体包含人受体构架区。
在一个优选的实施方案中，抗体为人源化抗体。优选地，人源化抗体包含一个或多个上述披露的CDRs。更优选地，人源化抗体包含三个或更多个上述披露的CDRs。最优选地，人源化抗体包含6个上述披露的CDRs。在一个特定的实施方案中，将CDRs插入人抗体可变区的人受体构架区中。优选地，人抗体可变区为共有的人可变区。更优选地，人受体构架区在关键残基处包含至少一个构架区氨基酸取代，其中关键残基选自邻近于CDR的残基；糖基化位点残基；稀有残基；能对Aβ(20-42)球聚体有影响的残基；能对CDR有影响的残基；规范残基；重链可变区和轻链可变区之间的接触残基；游标(Vernier)区残基；和Chothia定义的可变重链CDR1与Kabat定义的第一重链构架区之间重叠区中的残基。优选地，人受体构架区包含至少一个构架区氨基酸取代，其中构架区的氨基酸序列至少65％相同于所述人受体构架区的序列并且包含至少70个与所述人受体构架区相同的氨基酸残基。
在又一个方面中，本发明涉及包含如上所定义的重链和轻链的抗体。
优选地，抗体包含至少一个具有选自：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：38的氨基酸序列的可变区。更优选地，抗体包含两个可变区，其中所述两个可变区具有选自：SEQ ID NO：3&SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7&SEQ ID NO：8&SEQ ID NO：11&SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15&SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：19&SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：23&SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：27&SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：31&SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：35&SEQ ID NO：36的氨基酸序列。
在另一个方面中，本发明的抗体包含选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD、IgE和人IgG1 Ala234 Ala235突变体恒定区的重链恒定区。特别是，抗体包含人恒定区。更优选地，抗体包含选自SEQ ID NOs：39-42的氨基酸序列。优选包含IgG1重链恒定区的抗体。
在另一个实施方案中，抗体为糖基化的抗体。优选糖基化型为人糖基化型或在此披露的任何一种真核细胞特别是CHO细胞所产生的糖基化型。
本发明还涉及本发明的抗体的抗原结合部分。上述抗原结合部分包括但不限于抗体的Fab片段、F(ab’)2片段和单链Fv片段。更多的抗原结合部分为Fab’片段、Fv片段和二硫键连接的Fv片段。
本发明还提供了一种编码任何一种在此披露的抗体的分离的核酸。进一步的实施方案提供了一种包含在此披露的分离的核酸的载体。所述载体可特别选自pcDNA；pTT(Durocher等，Nucleic Acids Research 2002，Vol 30，No.2)；pTT3(具有额外的多克隆位点的pTT)；pEFBOS(Mizushima，S.和Nagata，S.，(1990)Nucleic Acids Research Vol 18，No.17)；pBV；pJV和pBJ。
在另一个方面中，用本文所披露的载体转化宿主细胞。优选地，宿主细胞为原核细胞。更优选地，宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)。在一个相关实施方案中，宿主细胞为真核细胞。优选地，真核细胞选自原生生物细胞、动物细胞(如哺乳动物细胞、禽类细胞和昆虫细胞)、植物细胞和真菌细胞。更优选地，宿主细胞为哺乳动物细胞，包括但不限于CHO和COS；或为真菌细胞，如酵母细胞，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；或为昆虫细胞如Sf9。
本发明的另一个方面提供了一种产生本发明的抗体的方法，包括在适合于产生抗体的条件下，在培养基中培养本文所披露的任何一种宿主细胞或杂交瘤。另一个实施方案提供了一种通过本文所披露的方法可获得的抗体。
本发明的抗体可以本身已知的方法获得。
全都含有由数十亿种不同抗体特异性中的几百种组成的抗体库的B淋巴细胞是哺乳动物免疫系统的一部分。对特定抗原的正常免疫应答意味着特异性结合所述抗原的所述库的一种或多种抗体的选择，并且免疫应答的成功是至少部分基于所述抗体特异性识别(并最终消除)刺激的抗原并忽视所述抗体环境中其他分子的能力。
特异性识别一种特定靶抗原的抗体的有用性已导致了开发单克隆抗体技术。现在，标准的杂交瘤技术可使针对目的抗原具有单一特异性的抗体得以产生。新近，重组抗体技术如体外抗体文库筛选业已得到开发。这些技术同样可使针对目的抗原具有单一特异性的抗体得以产生。
在本发明的方法中，可让目的抗原在体内或体外作用于抗体库。
根据一个实施方案，通过用抗原在体内免疫接种动物让所述抗原作用于抗体库。此外，该体内方法可包含由动物的淋巴细胞建立许多杂交瘤并选择分泌与所述抗原特异性结合的抗体的特定杂交瘤。待免疫接种的动物可以是，例如小鼠、大鼠、兔、鸡、骆驼或绵羊，或可以是任何一种上述提及的动物的转基因变种，例如具有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠，其在抗原刺激后产生人抗体。其他类型的可被免疫接种的动物包括已用人外周单核血细胞(嵌合的hu-PBMC SCID小鼠)或淋巴样细胞或其前体重建的患有严重联合免疫缺陷(SCID)的小鼠，以及已用致死的全身照射处理、接着用来自患有严重联合免疫缺陷(SCID)的小鼠的骨髓细胞保护免受辐射并随后移植功能性人淋巴细胞的小鼠(“Trimera”系统)。另一种类型的待免疫接种的动物是其基因组中编码目的抗原的内源基因已关掉(基因敲除)的动物(如小鼠)，例如通过同源重组，使得在用抗原免疫接种后，所述动物将所述抗原识别为异种。对于本领域技术人员显而易见的是通过利用已知的筛选方法包括但不限于ELISA和斑点印迹技术可鉴定并选择经该方法产生的多克隆或单克隆抗体。
根据另一个实施方案，通过用抗原筛选重组抗体文库从而使所述抗原在体外作用于抗体库。重组抗体文库可以在例如噬菌体表面上或在酵母细胞表面上或在细菌细胞表面上表达。在多个实施方案中，重组抗体文库为例如scFv文库或Fab文库。根据另一个实施方案，抗体文库作为RNA-蛋白融合物表达。
用于产生本发明的抗体的另一种方法包括体内和体外方法的组合。例如，可通过用抗原体内免疫接种动物并接着用所述抗原在体外筛选制备自所述动物的淋巴样细胞的重组抗体文库或单区抗体文库(如含有重链和/或轻链)，使所述抗原得以作用于抗体库。根据另一种方法，通过用抗原体内免疫接种动物并接着让产生自所述动物的淋巴样细胞的重组抗体文库或单区文库经受亲和力成熟，使所述抗原得以作用于抗体库。根据另一种方法，通过用抗原体内免疫接种动物，接着选择分泌目的抗体的个体抗体产生细胞并从所述选择的细胞cDNAs获得重链和轻链可变区(如通过利用PCR)，并在体外于哺乳动物宿主细胞中表达所述重链和轻链的可变区(这称为经选择的淋巴细胞抗体法或SLAM)，由此能进一步选择并操作经选择的抗体基因序列，使所述抗原得以作用于抗体库。此外，可经在哺乳动物细胞中表达编码重链和轻链的抗体基因并选择那些分泌具有期望结合亲和力的抗体的哺乳动物细胞，通过表达克隆选择单克隆抗体。
本发明提供了用于筛选和反筛选的规定抗原。因此，根据本发明有可能选择那些以如上所定义的结合亲和力结合Aβ(20-42)球聚体的多克隆和单克隆抗体。
用于产生抗体的本发明的方法可用于产生多种类型的抗体。这些包括单克隆的、特别是重组抗体，基本上尤其是人抗体、嵌合抗体、人源化抗体和CDR嫁接抗体，以及它们的抗原结合部分。
本发明进一步涉及能产生(分泌)本发明的单克隆抗体的杂交瘤。本发明的杂交瘤包括那些为选自PTA-7241、PTA-7239、PTA-7240、PTA-7242、PTA-7408、PTA-7409、PTA-7405、PTA-7809、PTA-7810和PTA-7851的ATCC保藏编号所指定的杂交瘤。
注意到本发明的抗体还可与除本文所描述的Aβ球聚体以外的Aβ形式反应(即结合)。这些抗原可以是或可以不是寡聚体化或球聚体化的。因此，本发明的抗体结合的抗原包括任何包含与本发明的抗体反应的球聚体表位的Aβ形式。上述Aβ形式包括截短的和非截短的Aβ(X-Y)形式(所带有的X和Y为如上所定义的)，例如Aβ(20-42)、Aβ(20-40)、Aβ(12-42)、Aβ(12-40)、Aβ(1-42)和Aβ(1-40)形式，前提是所述形式包含球聚体表位。
本发明还涉及一种包含如上所定义的本发明的抗体或其抗原结合部分的组合物。
根据一个特定的实施方案，所述组合物是一种包含本发明的抗体或抗原结合部分以及药学上可接受的载体的药物组合物。
如上所定义的本发明的抗体或抗原结合部分优选能在体外和体内中和其所结合的Aβ球聚体或其衍生物的活性。因此，所述抗体或抗原结合部分可用于抑制所述球聚体或其衍生物的活性，例如在含有所述球聚体或其衍生物的制品中或在其中所述球聚体或其衍生物存在的人个体或其他哺乳动物中。
根据一个实施方案，本发明涉及一种抑制所述球聚体或其衍生物的活性的方法，该方法包括让本发明的抗体或其抗原结合部分作用于球聚体或其衍生物，以致抑制所述球聚体或其衍生物的活性。例如所述活性可在体外被抑制。例如，可将本发明的抗体或抗原结合部分添加到含有或怀疑含有所述球聚体或其衍生物的制品例如来源于个体或细胞培养物的样品中，以便抑制所述样品中所述球聚体或其衍生物的活性。可选地，球聚体或其衍生物的活性可在个体体内被抑制。
因此，本发明进一步涉及如上所定义的抗体或抗原结合部分在制备用于治疗或预防淀粉样变性病，特别是选自阿尔茨海默病和唐氏综合征的淀粉样变性病的淀粉样变性病的药物组合物中的应用。因此，本发明所述应用的一个方面是一种治疗或预防需要该治疗或预防的个体中淀粉样变性病，特别是阿尔茨海默病或唐氏综合征的淀粉样变性病的方法，其包括给予个体如上所定义的抗体或抗原结合部分。使用所述抗体或抗原结合部分用于治疗以及尤其是预防淀粉样变性病，特别是阿尔茨海默病或唐氏综合征的淀粉样变性病，特别是用于被动免疫接种。因此，在治疗或预防淀粉样变性病，特别是阿尔茨海默病或唐氏综合征的淀粉样变性病的方法中，在需要该治疗或预防的个体中给予该个体抗体或抗原结合部分的一个目的被动免疫个体以对抗淀粉样变性病，特别是阿尔茨海默病或唐氏综合征的淀粉样变性病。
如上所定义的本发明的抗体或抗原结合部分优选能在体外和体内检测其所结合的Aβ球聚体或其衍生物。因此，所述抗体或抗原结合部分可用于检测所述球聚体或其衍生物，例如在含有所述球聚体或其衍生物的制品中或在其中所述球聚体或其衍生物存在的人个体或其他哺乳动物中。
根据一个实施方案，本发明涉及一种检测所述球聚体或其衍生物的方法，该方法包括让本发明的抗体或其抗原结合部分作用于球聚体或其衍生物，使得与所述球聚体或其衍生物结合(并因此优选形成包含抗体或其抗原结合部分和球聚体或其衍生物的复合物)。所述球聚体可例如在体外检测。例如，可将本发明的抗体或抗原结合部分添加至制品，例如含有或被怀疑含有所述球聚体或其衍生物的来自个体的样品或细胞培养物，以便检测所述制品中的所述球聚体或其衍生物。可选地，可在个体体内检测球聚体或其衍生物。
因此，本发明进一步涉及如上所定义的抗体或抗原结合部分在制备用于诊断淀粉样变性病，特别是阿尔茨海默病或唐氏综合征的淀粉样变性病的组合物中的应用。本发明所述应用的一个方面是一种诊断怀疑患有淀粉样变性病，特别是阿尔茨海默病或唐氏综合征的淀粉样变性病的个体中淀粉样变性病，特别是阿尔茨海默病或唐氏综合征的淀粉样变性病的方法，其包括给予个体如上所定义的抗体或抗原结合部分并检测包含抗体或抗原结合部分与抗原的复合物的形成，存在该复合物则指示个体中存在淀粉样变性病，特别是阿尔茨海默病或唐氏综合征的淀粉样变性病。本发明所述应用的另一个方面是是一种诊断怀疑患有淀粉样变性病，特别是阿尔茨海默病或唐氏综合征的淀粉样变性病的个体中淀粉样变性病，特别是阿尔茨海默病或唐氏综合征的淀粉样变性病的方法，其包括提供来自个体的样品，将该样品与如上所定义的抗体或抗原结合部分接触并检测包含抗体或抗原结合部分与抗原的复合物的形成，存在该复合物则指示个体中存在淀粉样变性病，特别是阿尔茨海默病或唐氏综合征的淀粉样变性病。
发明详述
可利用标准的体外免疫测定法如ELISA、斑点印迹或BIAcore分析评价本发明的抗体的结合亲和力(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden and Piscataway，NJ)。关于进一步的描述，参见U.，等(1993)Ann.Biol.Clin.51：19-26；U.，等(1991)Biotechniques 11：620-627；Johnsson，B.，等(1995)J.Mol.Recognit.8：125-131和Johnsson，B.，等(1991)Anal.Biochem.198：268-277。
根据一个特定的实施方案，本文所定义的亲和力指通过进行如实施例8中所描述的斑点印迹并通过光密度分析评价其所获得的值。根据本发明的一个特定实施方案，通过斑点印迹测定结合亲和力包括如下：将一定量的抗原(例如，如上所述的Aβ(X-Y)球聚体、Aβ(X-Y)单体或Aβ(X-Y)原纤维)或方便地，例如在20mM NaH2PO4，140mM NaCl，pH 7.4，0.2mg/ml BSA中稀释至例如100pmol/μl、10pmol/μl、1pmol/μl、0.1pmol/μl和0.01pmol/μl的抗原浓度的其适当的稀释物印硝酸纤维膜在上，然后用牛奶封闭膜以阻止非特异性结合并洗涤，接着将膜与目的抗体接触，然后通过使用缀合酶的第二抗体及比色反应检测后者；在规定的抗体浓度下，抗体结合的量提供了亲和力测定。因此，两种不同的抗体针对一种靶或一种抗体针对两种不同的靶的相对亲和力在此定义为在其他方面均相同的斑点印迹条件下，使用两种抗体-靶组合所观察到的各自靶结合的抗体量的比率。不像基于蛋白质印迹的类似方法，斑点印迹法将测定抗体对以天然构象存在的给定靶的亲和力；不像ELISA法，斑点印迹法在不同的靶和基质之间的亲和力上没有区别，由此能在不同的靶之间进行更准确的比较。
如本文中所使用的，术语“Kd”意指如本领域中所知的特定抗体-抗原相互作用的解离常数。
本发明的抗体优选是分离的抗体。“分离的抗体”意指具有如上所述的结合亲和力并且基本上不含有具有不同结合亲和力的其他抗体的抗体。术语“基本上不含有”在此指其中至少95％的抗体、优选至少98％的抗体以及更优选至少99％的抗体具有期望的结合亲和力的抗体制品。此外，分离的抗体可基本上不含有其他细胞物质和/或化学制品。
本发明的分离的抗体包括单克隆抗体。如本文中所使用的，与含有不同氨基酸序列的抗体的混合物的“多克隆”抗体制品大不相同的是，“单克隆抗体”意指抗体享有相同的重链和相同的轻链氨基酸序列的抗体分子制品。可通过一些新技术如噬菌体、细菌、酵母或核糖体展示以及通过作为例证的通过杂交瘤来源的抗体(如通过杂交瘤技术如标准的Kohler和Milstein杂交瘤方法学((1975)Nature 256：495-497)制备的杂交瘤所分泌的抗体)的传统方法产生单克隆抗体。因此，具有相同序列的非杂交瘤来源的抗体在此也称为单克隆抗体，尽管其可通过非经典的方法学获得，术语“单克隆”并不限于杂交瘤来源的抗体，而是用于指所有来源于一个核酸克隆的抗体。
因此，本发明的单克隆抗体包括重组抗体。在此，术语“重组”指例如通过化学合成或通过基因工程技术操作分离的核酸区段所得到的两条不同的相分离的序列区段的任何人工组合。特别是，术语“重组抗体”指通过重组手段产生、表达、生成或分离的抗体，例如使用转染入宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体；分离自重组组合抗体文库的抗体；分离自转入人免疫球蛋白基因的转基因动物(如小鼠)的抗体(参见例如Taylor，L.D.，等(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)；或以其中将特定的免疫球蛋白基因序列(例如人免疫球蛋白基因序列)与其他DNA序列进行装配的任何其他方法产生、表达、生成或分离的抗体。重组抗体包括例如嵌合抗体、CDR嫁接抗体和人源化抗体。本领域技术人员应知道在异源系统中表达常规的杂交瘤衍生的单克隆抗体需要产生重组抗体，即使所得到的抗体蛋白的氨基酸序列没有改变或意在要去改变。
在本发明一个特定的实施方案中，抗体是人源化抗体。
根据多个实施方案，抗体可包含完全来源于单一物种的氨基酸序列，如人抗体或小鼠抗体。根据其他实施方案，抗体可以是嵌合抗体或CDR嫁接抗体或不同类型的人源化抗体。
术语“抗体”意指由4条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)组成的免疫球蛋白分子。链通常通过二硫键彼此连接。每条重链由所述重链的可变区(在此简称为HCVR或VH)和所述重链的恒定区组成。重链恒定区由三个区CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由所述轻链的可变区(在此简称为LCVR或VL)和所述轻链的恒定区组成。轻链恒定区由CL区组成。VH和VL区可进一步分成称为互补决定区(CDRs)的高变区和称为构架区(FR)的交替分布的保守区。因此，每一VH和VL区由以如下顺序从N末端到C末端的排列的三个CDR和四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。该结构对于本领域技术人员是众所周知的。
术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)一个或多个本发明的抗体的片段，所述片段仍具有如上所定义的结合亲和力。完全抗体的片段已显示能实现抗体的抗原结合功能。根据术语抗体的“抗原结合部分”，结合片段的例子包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1区组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，即包含两个通过二硫桥键在铰链区彼此连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1区组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的FL和VH区组成的Fv片段；(v)由VH区或VH、CH1、CH2、DH3，或VH、CH2、CH3组成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。尽管Fv片段的两个区(即VL和VH)为单独的基因所编码，但使用合成的接头如多-G4S氨基酸序列以及重组方法可将它们进一步连接在一起，使得它们可以作为其中VL和VH区结合以便形成单价分子(被称为单链Fv(ScFv)；参见例如Bird等(1988)Science 242：423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)的单条蛋白链而得以制备。术语抗体的“抗原结合部分”也意在包括这样的单链抗体。其他形式的单链抗体如“双抗体”也同样地包括于此。双抗体是二价的、双特异性抗体，其中VH和VL区在单多肽链上表达，但对于这两个能结合在同一条链上的区而言使用的接头肽太短，由此迫使所述区与不同链的互补区配对并形成两个抗原结合部位(参见例如Holliger，P.，等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.，等(1994)Structure 2：1121-1123)。免疫球蛋白恒定区指重链或轻链恒定区。人IgG重链和轻链恒定区氨基酸序列是本领域已知的并示于表1中。
表1：人IgG重链恒定区和轻链恒定区序列
此外，本发明的抗体或其抗原结合部分可以是由所述抗体或抗体部分与一种或多种其他蛋白或肽共价或非共价缔合所形成的更大的免疫黏附素分子的一部分。与上述免疫黏附素分子有关的是使用链霉抗生物素蛋白核心区以便制备四聚scFv分子(Kipriyanov，S.M.，等(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6：93-101)以及使用半胱氨酸残基、标记肽和C-末端多组氨酸基如六组氨酸基标签以便产生二价和生物素化的scFv分子(Kipriyanov，S.M.，等(1994)Mol.Immunol.31：1047-1058)。
术语“人抗体”指如通过Kabat等(参见Kabat，等(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版物编号91-3242)所描述的，其可变区和恒定区相应于或来源于人种系免疫球蛋白序列的抗体。然而，本发明的人抗体可含有例如在CDR中，以及特别是在CDR3中不为人种系免疫球蛋白序列所编码的氨基酸残基(例如已通过体外随机或位点专一诱变或体内体细胞突变所导入的突变)。本发明的重组人抗体具有可变区，并还可包含来自人种系免疫球蛋白序列的恒定区(参见Kabat，E.A.，等(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版物编号91-3242)。然而，根据特定的实施方案，对上述重组人抗体进行体外诱变(或如果使用转入人Ig序列基因的动物，则进行体内体细胞诱变)，使得重组抗体VH和VL区的氨基酸序列为尽管与人种系VH和VL序列相关或来源于之，但并不天然存在于体内人抗体种系库中的序列。根据特定的实施方案，这种类型的重组抗体是选择诱变或回复突变或两者的结果。优选地，诱变导致与亲本抗体相比针对靶的亲和力更大，和/或针对非靶结构的亲和力更小。
术语“嵌合抗体”指含有来自一种物种的重链和轻链可变区序列以及来自另一物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人恒定区连接的鼠重链和轻链可变区的抗体。
术语“CDR嫁接抗体”指包含来自一种物种的重链和轻链可变区序列，但其中VH和/或VL的一个或多个CDR区序列为另一物种的CDR序列所取代的抗体，例如具有其中一个或多个鼠CDR(如CDR3)已为人CDR序列所取代的鼠重链和轻链可变区的抗体。
术语“人源化抗体”指含有来自非人物种(如小鼠、大鼠、兔、鸡、骆驼、绵羊或山羊)的重链和轻链可变区序列，但其中至少一部分的VH和/或VL序列已被改变以便更加“人样”，即更类似于人种系可变区序列的抗体。一种类型的人源化抗体是其中已将人CDR序列插入非人VH和VL序列中取代相应的非人CDR序列的CDR嫁接抗体。
在本文中，术语“Kabat编号、“Kabat定义”和“Kabat标记”可交换使用。这些为本领域所公认的术语指编号与抗体或其抗原结合部分的重链和轻链可变区中的其他氨基酸残基相比更加可变(即超变)的氨基酸残基的体系(Kabat等(1971)Ann.NY Acad，Sci.190：382-391和Kabat，E.A.，等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版物编号91-3242)。对于重链可变区，高变区CDR1从氨基酸第31位到第35位，CDR2从氨基酸第50位到第65位，CDR3从氨基酸第95位到第1 02位。对于轻链可变区，高变区CDR1从氨基酸第24位到第34位，CDR2从氨基酸第50位到第56位，CDR3从氨基酸第89位到第97位。
如本文中所使用的，术语“受体”和“受体抗体”指提供或编码至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的一个或多个构架区的氨基酸序列的抗体或核酸序列。在某些实施方案中，术语“受体”指提供或编码恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在又一个实施方案中，术语“受体”指提供或编码一个或多个构架区和恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在一个特定的实施方案中，术语“受体”指提供或编码至少80％、优选至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的一个或多个构架区的氨基酸序列的人抗体氨基酸或核酸序列。根据该实施方案，受体可含有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少10个不存在于人抗体的一个或多个特定位置上的氨基酸残基。受体构架区和/或受体恒定区可以是例如来源于或获得自种系抗体基因、成熟抗体基因、功能性抗体(如本领域众所周知的抗体、开发中的抗体或市售抗体)。
如本文中所使用的，术语“CDR”指抗体可变序列内的互补决定区。在每一重链和轻链可变区内存在三个CDR，对于每一可变区其称为CDR1、CDR2和CDR3。如本文中所使用的，术语“CDR组”指存在于能结合抗原的单个可变区中的一组三个CDR。根据不同的系统对这些CDR的确切边界已作不同的定义。Kabat描述的该系统(Kabat等，Sequences of Proteinsof Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987)和(1991))不仅提供了可适用于任何抗体可变区的明确的残基编号系统，还提供了限定这三个CDR的精确的残基边界。这些CDR可称为Kabat CDR。Chothia及其同事(Chothia&Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)和Chothia等，Nature 342：877-883(1989))发现KabatCDR中的某些子位置尽管在氨基酸序列水平上差异较大，但采用了几乎相同的肽主链构象。这些子位置被命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指轻链和重链区。这些区可称为Chothia CDR，其具有与Kabat CDR重叠的边界。其他与Kabat CDR重叠的边界定义的CDRs已为Padlan(FASEB J.9：133-139(1995))及MacCallum(J Mol Biol 262(5)：732-45(1996))所描述。尽管如此，其他CDR边界定义可以不必严格地遵照上述系统中的任何一种，但仍然是与Kabat CDR重叠的，尽管根据预测或特定的残基或残基组或甚至整个CDR都不明显影响抗原结合的实验结论它们可以更短或更长。用于本文中的方法可利用根据任何一种这些系统所定义的CDR，尽管优选的实施方案利用了Kabat或Chothia定义的CDR。
如本文中所使用的，术语“规范”残基指规定了如Chothia等(J.Mol.Biol.196：901-907(1987)；Chothia等，J.Mol.Biol.227：799(1992)，两者都在此并入作为参考)所定义的特定的规范CDR结构的CDR中或构架区中的残基。根据Chothia等，许多抗体CDR的关键位置尽管在氨基酸序列水平上差异较大，但具有几乎相同的肽主链构象。每个规范结构规定了主要是一组形成环的氨基酸残基的连续区段的肽主链扭转。
如本文中所使用的，术语“供体”和“供体抗体”指提供一个或多个CDR的抗体。在一个优选的实施方案中，供体抗体是一种来自不同于构架区所获得自或来源于的抗体的物种的抗体。在人源化抗体的上下文中，术语“供体抗体”指提供一个或多个CDR的非人抗体。
如本文中所使用的，术语“构架区”或“构架区序列”指可变区减去CDR所剩下的序列。因为可使用不同系统确定CDR序列的确切定义，因此构架区序列的含义可相应地进行不同的解释。6个CDRs(轻链的CDR-L1、-L2和-L3和重链的CDR-H1、-H2和-H3)还将轻链和重链每条链上的构架区分成四个亚区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位于FR1和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间，以及CDR3位于FR3和FR4之间。没有规定特定的亚区为FR1、FR2、FR3或FR4，他人所提及的构架区代表了天然存在的免疫球蛋白链的单个可变区中组合的FR′s，。如本文中所使用的，FR代表四个亚区中的一个，FR代表了构成构架区的四个亚区中的两个或更多个。
人重链和轻链受体序列是本领域已知的。
如本文中所使用的，术语“种系抗体基因”或“基因片段”指为没有经历导致用于特定免疫球蛋白表达的基因重排及突变的成熟过程的非淋巴样细胞所编码的免疫球蛋白序列(参见如Shapiro等，Crit.Rev.Immunol.22(3)：183-200(2002)；Marchalonis等，Adv ExpMed Biol.484：13-30(2001))。本发明多个实施方案所提供的一个优点源于这样的发现，即与成熟抗体基因相比，种系抗体基因更有可能在物种中保存个体基本的氨基酸序列结构特征，因此当用于该物种中时较不可能被识别为非自身抗体。
如本文中所使用的，术语“关键”残基指对抗体，特别是人源化抗体的结合特异性和/或亲和力具有更大影响的可变区中的某些残基。关键残基包括但不限于如下的一种或多种：与CDR邻接的残基、可能的糖基化位点(其可以是N-或O-糖基化位点)、稀有残基、能与抗原相互作用的残基、能与CDR相互作用的残基、规范残基、重链可变区和轻链可变区之间接触残基、游标(Vernier)区中的残基以及在Chothia定义的重链可变区CDR1与Kabat定义的第一重链构架区之间重叠的区中的残基。
如本文中所使用的，术语“人源化抗体”特别是指一种与目的抗原免疫特异性结合并包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的构架区(FR)和基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)的抗体或其变体、衍生物、类似物或片段。如本文中所使用的，在CDR上下文中术语“基本上”指CDR具有至少80％，优选至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一于非人抗体CDR的氨基酸序列的氨基酸序列。人源化抗体包含基本上所有的至少一个，以及特别是两个可变区(Fab、Fab′、F(ab′)2、FabC、Fv)，其中所有或基本上所有的CDR区都相应于非人免疫球蛋白(即供体抗体)的那些CDR区以及所有的或基本上所有的构架区都是人免疫球蛋白的那些构架区共有序列。优选地，人源化抗体还包含至少一部分的的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区。在某些实施方案中，人源化抗体含有轻链以及至少重链的可变区。抗体还可包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在某些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化的轻链。在某些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化的重链。在特定的实施方案中，人源化抗体仅含有人源化的轻链可变区和/或人源化的重链。
人源化抗体可选自任何类型的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何亚类的免疫球蛋白，包括但不限于IgG 1、IgG2、IgG3和IgG4。，
人源化抗体的构架区和CDR区不需要准确相应于亲本序列，如供体抗体CDR或共有构架区可通过取代、插入和/或缺失至少一个氨基酸残基得到诱变，使得在该位点的CDR或构架区残基不与供体抗体或共有构架区准确相应。然而，在一个优选的实施方案中，上述突变不应当是广泛的。一般来说，至少80％，优选至少85％，更优选至少90％以及最优选至少95％的人源化抗体残基应当相应于亲本FR和CDR序列的那些残基。如本文中所使用的，术语“共有构架区”指以共有免疫球蛋白序列存在的构架区。如本文中所使用的，术语“共有免疫球蛋白序列”指由相关的免疫球蛋白序列家族中最常见的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见如Winnaker，From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany1987)。在免疫球蛋白家族中，共有序列中的每一个位置为在该家族中于该位置处最常见的氨基酸所占据。在两个氨基酸以相同频率占据的情况下，皆可包括在共有序列中。
如本文中所使用的，“游标(Vernier)”区指如Foote和Winter(1992，J.Mol.Biol.224：487-499，其在此并入作为参考)中所描述的一亚组的可调节CDR结构并调整使适于抗原的构架区残基。游标(Vernier)区残基构成一支承CDR的层并可影响CDR结构及抗体的亲和力。
术语“表位”包括任何能与免疫球蛋白特异性结合的多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，以及在某些实施方案中，可具有特定的三维结构特性和/或特定的荷电特性。表位是为抗体所结合的抗原的一个区域。在某些实施方案中，当抗体在蛋白和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶抗原时，就说该抗体特异性结合抗原。
当在本文中提及时，术语“多核苷酸”意指两个或更多个核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任何一种类型的核苷酸的修饰形式)的多聚形式。该术语包括单链和双链形式的DNA但优选为双链DNA。
如本文中所使用的，术语“分离的多核苷酸”应当意指根据其来源的多核苷酸(如基因组、cDNA或合成来源的，或任何它们的组合)，“分离的多核苷酸”与该“分离的多核苷酸”所存在的自然界中同时存在的多核苷酸的全部或一部分无关；任选地与其在自然界中无关的多核苷酸相关；或不作为更大序列的一部分存在于自然界中。
如本文中所使用的，术语“载体”意指一种能转运另一种其业已连接的核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指其中可连接额外的DNA区段的环状双链DNA。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可连接到病毒基因组中。某些载体能在它们导入的宿主细胞中自主复制(如具有细菌复制起点的细菌载体以及附加型哺乳动物载体)。其他载体(如非附加型哺乳动物载体)刚一导入宿主细胞中就可并入宿主细胞的基因组中，由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能指导其可操作连接的基因的表达。上述载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中表达载体通常是以质粒形式应用。在本发明说明书中，“质粒”和“载体”可交换地使用，因为质粒是载体最常使用的形式。然而，本发明意在包括上述其他形式的表达载体例如病毒载体(如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，其提供了相同的作用。
术语“可操作地连接”指一种其中所描述的组分以容许它们以它们预期的方式起作用的关系存在的毗邻关系。控制序列“可操作地连接”编码序列是以这样一种方式即在相容于控制序列的条件下实现编码序列的表达来连接的。“可操作地连接的”序列包括邻接目的基因的表达控制序列和反式作用或在远处控制目的基因的表达控制序列。如本文中所使用的，术语“表达控制序列”指为影响它们所连接的编码序列表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括适当的转录起点、终点、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；提高蛋白稳定性的序列；以及当需要时，增加蛋白分泌的序列。取决于宿主生物体上述控制序列的特性有所差异；在原核生物中，上述控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，上述控制序列通常包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”意在包括其存在对表达和加工必不可少的元件，并还可包括其存在是有利的额外元件，例如前导序列和融合伴侣序列。
如本文中所定义的，“转化”指任何外源DNA进入宿主细胞的处理。使用本领域众所周知的多种方法可在天然或人工条件下发生转化。转化可依赖于任何已知的用于将外源核酸序列插入原核或真核宿主细胞中的方法。该方法是基于要被转化的宿主细胞进行选择的并且可包括但不限于病毒感染、电穿孔、脂质转染和粒子轰击。上述“转化的”细胞包括其中插入的DNA能作为自主复制质粒或作为宿主染色体一部分复制的稳定转化的细胞。它们还包括持续有限的一段时间瞬时表达插入的DNA或RNA的细胞。
如本文中所使用的，术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)意指外源DNA已导入其中的细胞。应当理解的是上述术语不仅意指特定的受试细胞，还指这样的细胞的后代。由于突变或环境影响某些修饰可在后代中发生，因此事实上上述后代可以不同于亲本细胞，但仍包括在如本文中所使用的术语“宿主细胞”的范围中。优选地，宿主细胞包括选自任何生命界的原核和真核细胞。优选的真核细胞包括原生生物、真菌、植物和动物细胞。最优选的宿主细胞包括但不限于原核细胞系大肠杆菌；哺乳动物细胞系CHO、HEK 293和COS；昆虫细胞系Sf9和真菌细胞酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养以及转化(如电穿孔、脂质转染)。可根据厂商使用说明书或如本领域中所通常实行的或如本文中所描述的进行酶促反应和纯化技术。在前的技术和方法可通常根据本领域众所周知的常规方法以及如各种常用的和在本发明说明书全文中所引证和讨论的更具体的参考文献所描述的来执行。参见如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))，其在此并入作为用于任何用途的参考文献。
如本领域中已知的及本文中所使用的，“转基因生物”指具有含有转基因的细胞的生物体，其中导入生物体(或该生物体的祖先)中的转基因表达在该生物体中不天然表达的多肽。“转基因”是一种DNA构建物，其稳定且可操作地整合入发育自转基因生物体的细胞的基因组中，在转基因生物体的一种或多种细胞类型或组织中指导编码基因产物的表达。
产生本发明抗体的方法描述于下。在此对体内方法、体外方法或它们的组合进行区分。
某些产生本发明的抗体的方法描述于下。在此对体内方法、体外方法或它们的组合进行区分。
体内方法
取决于期望抗体的类型，不同的宿主动物可用于体内免疫接种。可使用自身表达内源形式的目的抗原的宿主。可选地，有可能使用目的抗原的内源形式已被缺陷的宿主。例如，通过在相应的内源基因处同源重组已使特定的内源蛋白缺陷的小鼠(即基因敲除小鼠)已显示能产生针对已免疫接种它们的蛋白的体液应答，并因此能用于产生针对该蛋白的高亲和力单克隆抗体(参见例如Roes，J.等(1995)J.Immunol.Methods 183：231-237；Lunn，M.P.等(2000)J.Neurochem.75：404-412)。
为了产生本发明的非人抗体，多种非人哺乳动物是适用于抗体产生的宿主。它们包括小鼠、大鼠、鸡、骆驼、兔、绵羊和山羊(及它们的基因敲除模型)，尽管优选小鼠用于产生杂交瘤。此外，表达人抗体库的非人宿主动物可用于产生具有双特异性的针对人抗原的基本上的人抗体。该类型的非人动物包括携带人免疫球蛋白转基因的转基因动物(如小鼠)(嵌合型hu-PBMC SCID小鼠)和以下更详细描述的人/小鼠辐射性嵌合体。
根据一个实施方案，用Aβ(20-42)球聚体或其衍生物免疫接种的动物是非人哺乳动物，优选小鼠，其被转入人免疫球蛋白基因使得所述非人哺乳动物在抗原刺激下制造人抗体。典型地，将编码具有人种系构型的重链和轻链的免疫球蛋白转基因导入业已改变使得其内源重链和轻链基因座失活的上述动物中。如果用抗原(如用人抗原)刺激上述动物，则产生来源于人免疫球蛋白序列的抗体(人抗体)。通过使用标准的杂交瘤技术，有可能从上述动物的淋巴细胞中制备人单克隆抗体。关于带有人免疫球蛋白的转基因小鼠及其在产生人抗体中的应用的进一步描述参见例如US 5,939,598，WO 96/33735，WO 96/34096，WO98/24893和WO 99/53049(Abgenix Inc.)，以及US 5,545,806，US 5,569,825，US 5,625,126，US 5,633,425，US 5,661,016，US 5,770,429，US 5,814,318，US 5,877,397和WO 99/45962(Genpharm Inc.)；还参见MacQuitty，J.J.和Kay，R.M.(1992)Science 257：1188；Taylor，L.D.等(1992)Nucleic Acids Res.20：6287-6295；Lonberg，N.等(1994)Nature368：856-859；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Int.Rev.Immunol.13：65-93；Harding，F.A.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546；Fishwild，D.M.等(1996)NatureBiotechnology 14：845-851；Mendez，M.J.等(1997)Nature Genetics 15：146-156；Green，L.L.和Jakobovits，A.(1998)J.Exp.Med.188：483-495；Green，L.L.(1999)J.Immunol.Methods 231：11-23；Yang，X.D.等(1999)J.Leukoc.Biol.66：401-410；Gallo，M.L.等(2000)Eur.J.Immunol.30：534-540。
根据另一个实施方案，用Aβ(20-42)球聚体或其衍生物免疫接种的动物可以是具有严重联合免疫缺陷(SCID)的小鼠，其已用人外周单核血细胞或淋巴样细胞或它们的前体重建。如已证实的，上述称为嵌合型hu-PBMC SCID小鼠的小鼠产生应答于抗原刺激的人免疫球蛋白。对于这些小鼠以及它们在产生抗体中的应用的进一步描述参见例如，Leader，K.A.等(1992)Immunology 76：229-234；Bombil，F.等(1996)Immunobiol.195：360-375；Murphy，W.J.等(1996)Semin.Immunol.8：233-241；Herz，U.等(1997)Int.Arch.AllergyImmunol.113：150-152；Albert，S.E.等(1997)J.Immunol.159：1393-1403；Nguyen，H.等(1997)Microbiol.Immunol.41：901-907；Arai，K.等(1998)J.Immunol.Methods 217：79-85；Yoshinari，K.和Arai，K.(1998)Hybridoma 17：41-45；Hutchins，W.A.等(1999)Hybridoma 18：121-129；Murphy，W.J.等(1999)Clin.Immunol.90：22-27；Smithson，S.L.等(1999)Mol.Immunol.36：113-124；Chamat，S.等(1999)J.Infect.Diseases 180：268-277和Heard，C.等(1999)Molec.Med.5：35-45。
根据另一个实施方案，用Aβ(20-42)球聚体或其衍生物免疫接种的动物是一种已用致死剂量的全身照射处理，然后使来自严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠的骨髓细胞免于辐射并接着用功能性人淋巴细胞进行移植的小鼠。为了通过用目的抗原免疫接种所述小鼠并接着通过使用标准的杂交瘤技术产生单克隆抗体从而产生人单克隆抗体，使用了称为Trimera系统的这种类型的嵌合体。对于这些小鼠以及它们用于产生抗体的应用的进一步描述参见例如Eren，R.等(1998)Immunology 93：154-161；Reisner，Y和Dagan，S.(1998)Trends Biotechnol.16：242-246；Ilan，E.等(1999)Hepatology 29：553-562；以及Bocher，W.O.等(1999)Immunology 96：634-641。
由体内产生的抗体产生细胞起始，可通过利用标准的技术如最初为Kohler和Milstein(1975，Nature 256：495-497)(也参见Brown等(1981)J.Immunol 127：539-46；Brown等(1980)J Biol Chem 255：4980-83；Yeh等(1976)PNAS 76：2927-31；和Yeh等(1982)Int.J.Cancer 29：269-75)所描述的杂交瘤技术产生单克隆抗体。产生单克隆抗体杂交瘤的技术是充分所知的(通常参见R.H.Kenneth，in Monoclonal Antibodies：A NewDimension In Biological Analyses，Plenum Publishing Corp.，New York，New York(1980)；E.A.Lerner(1981)Yale J.Biol.Med.，54：387-402；M.L.Gefter等(1977)SomaticCellGenet.，3：231-36)。简言之，将无限增殖细胞系(通常为骨髓瘤)与用本发明的Aβ球聚体或其衍生物免疫接种的哺乳动物的淋巴细胞(通常为脾细胞或淋巴结细胞或外周血淋巴细胞)融合，并筛选所得到的杂交瘤细胞的培养物上清液，以便鉴定产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤。诸多众所周知的用于融合淋巴细胞和无限增殖细胞系的方法中的任何一种都可用于该目的(也参见G.Galfre等(1977)Nature 266：550-52；Gefter等Somatic CellGenet.，在前引证的；Lerner，Yale J.Biol.Med.，在前引证的；Kenneth，Hybridoma，在前引证的)。此外，本领域技术人员应当理解存在着上述方法的不同变化，其同样是有用的。典型地，无限增殖细胞系(如骨髓瘤细胞系)来源于与淋巴细胞相同的哺乳动物物种。例如，可通过将来自用本发明的免疫原性制品免疫接种的小鼠的淋巴细胞与无限增殖的小鼠细胞系融合建立鼠杂交瘤。优选的无限增殖细胞系为对含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基(HAT培养基)敏感的小鼠骨髓瘤细胞系。多种骨髓瘤细胞系中的任何一种均可默认用作为融合伴侣，例如P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14骨髓瘤细胞系。这些骨髓瘤细胞系可获得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD。典型地，使用聚乙二醇(PEG)将HAT-敏感的小鼠骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞融合。然后利用HAT培养基选择由融合产生的杂交瘤细胞，由此杀死未融合的以及没有出产物的融合的骨髓瘤细胞(几天后由于未融合的脾细胞没有转化因此死亡了)。通过对上述抗体筛选杂交瘤培养物上清液鉴定产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞，例如通过利用以上及实施例8中所描述的斑点印迹测定，以便选择具有如上所定义的结合亲和力的那些抗体。
使用上述体内方法已产生了全部单克隆抗体5F7、10F11、7C6、4B7、6A2、2F2、4D10、7E5、10C1和3B10并由此可获得自如本文所定义的杂交瘤。
同样地，如以下所更进一步详细描述的，所述杂交瘤可用作为编码轻链和/或重链的核酸的来源以便重组产生本发明的抗体。
体外方法
作为通过免疫接种和选择产生本发明的抗体的替换方案，可通过用Aβ(20-42)球聚体或其衍生物筛选重组的组合免疫球蛋白文库，由此分离具有所需结合亲和力的免疫球蛋白文库成员，从而鉴定并分离本发明的抗体。用于产生及筛选展示文库的试剂盒在市场上可以买到(如Pharmacia重组噬菌体抗体系统，产品目录号27-9400-01；和Stratagene噬菌体展示试剂盒，产品目录号240612)。在许多实施方案中，展示文库为scFv文库或Fab文库。已详尽地描述了用于筛选重组抗体文库的噬菌体展示技术。可特别有利地用于产生及筛选抗体展示文库的方法和化合物的例子可见于例如McCafferty等的WO 92/01047，US 5,969,108和EP 589 877(详细描述了scFv展示)，Ladner等的US 5,223,409，US5,403,484，US 5,571,698，US 5,837,500和EP 436 597(例如描述了pIII融合)；Dower等的WO 91/17271，US 5,427,908，US 5,580,717和EP 527 839(详细描述了Fab展示)；Winter等的国际公布WO 92/20791和EP 368,684(特别是描述了克隆免疫球蛋白可变区的序列)；Griffiths等的US 5,885,793和EP 589 877(详细描述了通过使用重组文库分离针对人抗原的人抗体)；Garrard等的WO 92/09690(特别是描述了噬菌体表达技术)；Knappik等的WO97/08320(描述了人重组抗体文库HuCal)；Salfeld等的WO 97/29131(描述了针对人抗原(人肿瘤坏死因子α)的重组人抗体的产生以及该重组抗体的体外亲和力成熟)和Salfeld等的美国临时申请号60/126,603以及基于此的专利申请(同样地描述了针对人抗原(人白细胞介素-12)的重组人抗体的产生，还描述了该重组抗体的体外亲和力成熟)中。
筛选重组抗体文库的更多描述可见于科技出版物，例如Fuchs等(1991)Bio/Technology 9：1370-1372；Hay等(1992)Hum Antibod Hybridomas 3：81-85；Huse等(1989)Science 246：1275-1281；Griffiths等(1993)EMBO J 12：725-734；Hawkins等(1992)J MolBiol226：889-896；Clarkson等(1991)Nature 352：624-628；Gram等(1992)PNAS 89：3576-3580；Garrard等(1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Hoogenboom等(1991)Nuc Acid Res19：4133-4137；Barbas等(1991)PNAS 88：7978-7982；McCafferty等Nature(1990)348：552-554和Knappik等(2000)J.Mol.Biol.296：57-86中。
作为使用噬菌体展示系统的替换方案，重组抗体文库可在酵母细胞或细菌细胞表面表达。WO 99/36569描述了制备并筛选在酵母细胞表面上表达的文库的方法。WO 98/49286描述了更详细的制备并筛选在细菌细胞表面上表达的文库的方法。
在所有的体外方法中，一种用于富集具有期望特性的重组抗体的选择方法构成了该方法的主要部分，其通常称为“淘选”并常采取在已将靶结构连接到其基质的柱子上进行亲和层析的形式。然后对期望的候选分子单独测定它们的绝对和/或相对亲和力，优选如以上和实施例8中所描述的通过利用标准的斑点印迹测定。
一旦鉴定并充分表征了组合文库的目的抗体，通过利用标准的分子生物学技术分离编码所述抗体轻链和重链的DNA序列，例如通过利用来自在文库筛选期间已分离的展示包装物(如噬菌体)的DNA的PCR扩增。可用于制备PCR引物的编码抗体轻链和重链的基因的核苷酸序列是本领域技术人员已知的。多种上述序列描述于例如Kabat，E.A.，等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department ofHealth and Human Services，NIH出版物编号91-3242和人种序列数据库VBASE中。
可通过在宿主细胞中重组表达编码免疫球蛋白轻链和重链的基因产生本发明的抗体或抗体部分。为了重组表达抗体，用一种或多种携带编码所述抗体的免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段的重组表达载体转染宿主细胞，由此在宿主细胞中表达轻链和重链并优选将它们分泌入培养所述宿主细胞的培养基中。可从该培养基分离抗体。使用标准的重组DNA方法以便获得编码抗体重链和轻链的基因，将所述基因插入重组表达载体中以及将所述载体导入宿主细胞中。该类方法描述于例如Sambrook，Fritsch和Maniatis(编)，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，Ausubel，F.M.等(编)Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAssociates，(1989)和Boss等的US 4,816,397中。
一旦获得编码目的抗体的VH和VL区段的DNA片段，就可利用标准的重组DNA技术进一步操作所述DNA片段，例如为了将编码可变区的基因转变为编码全长抗体链的基因、编码Fab片段的基因或scFv基因。这些操作包括将VL-或VH-编码DNA片段可操作地连接编码另一种蛋白例如抗体恒定区或柔性接头的另一种DNA片段。术语“可操作地连接”在此应当理解为这样的含义，即两条DNA片段以所述两条DNA片段所编码的氨基酸序列保留在框内的这样一种方式连接。
通过将编码DNA的VH-区与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一种DNA分子可操作地连接，可将分离的编码VH区的DNA转变为编码全长重链的基因。人重链恒定区基因的序列是众所周知的(参见例如，Kabat，E.A.，等(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版物编号91-3242)，并且可通过利用标准的PCR扩增获得跨越所述区域的DNA片段。重链恒定区可以是来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgE或IgD的恒定区，优选恒定区来自IgG，特别是IgG1或IgG4。为获得编码重链Fab片段的基因，可将VH-编码DNA可操作地连接到仅编码重链恒定区CH1的另一种DNA分子上。
可通过将VL-编码DNA可操作地连接到编码轻链恒定区CL的另一种DNA分子上，从而将所分离的编码VL区的DNA转变为编码全长轻链的基因(以及编码Fab轻链的基因)。人轻链恒定区的基因序列是众所周知的(参见Kabat，E.A.，等(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版编号91-3242)，以及跨越所述区的DNA片段可通过利用标准的PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，优选κ恒定区。
为了产生scFv基因，可将VH-和VL-编码DNA片段可操作地连接到编码柔性接头例如氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一片段上，使得VH和VL序列作为具有VL和VH区彼此通过所述柔性接头连接的连续的单链蛋白表达(参见Bird等(1988)Science 242：423-426；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等，Nature(1990)348：552-554)。
可通过上述方法从单区文库分离具有如上所述的结合亲和力的单区VH和VL。如本文中所描述的，具有期望结合亲和力的两条VH单区链(带有或没有CH1)或两条VL链或一条VH链和一条VL链的配对可用于本发明的抗体。
为了表达本发明的重组抗体或抗体部分，可将编码部分或全长轻链和重链的DNAs插入表达载体中，使得可操作连接该基因至适当的转录或翻译控制序列。在上下文中，术语“可操作地连接”应当理解为这样的含义，即抗体基因以载体中的转录和翻译控制序列履行其预期的调节所述抗体基因的转录和翻译作用的这样一种方式连接在载体中。
优选地，选择表达载体和表达控制序列使得相容于所使用的表达宿主细胞。可将编码抗体轻链的基因和编码抗体重链的基因插入不同的载体中，或将这两个基因插入同一个表达载体中，这是常见的情况。通过利用标准方法将抗体基因插入表达载体中(例如通过在抗体基因片段和载体上连接互补的限制性切割位点，或如果没有限制性切割位点存在则通过连接平端)。表达载体可在插入编码轻链和重链的序列之前就已携带编码抗体恒定区的序列。例如，一种方法是通过将VH和VL序列插入已分别编码重链和轻链恒定区的表达载体中，由此可操作地在载体中连接VH区段和CH区段并还可操作地在载体中连接VL区段和CL区段，从而将VH和VL序列转变为全长抗体基因。
此外或可选地，重组表达载体可编码利于抗体链从宿主细胞中分泌的信号肽。可将所述抗体链编码基因克隆入载体中，由此将信号肽与该抗体链编码基因的N端以符合读框的形式连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白蛋白的信号肽)。除抗体链编码基因之外，本发明的表达载体可具有在宿主细胞中控制抗体链编码基因表达的调节序列。
术语“调节序列”意在包括启动子、增强子和控制抗体链编码基因转录或翻译的更多的表达控制元件(如多腺苷酸化信号)。该类型的调节序列描述于例如Goeddel；GeneExpression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中。本领域技术人员应当理解包括选择调节序列的表达载体设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白表达强度等因素。用于在哺乳动物宿主细胞中表达的优选的调节序列包括在哺乳动物细胞中导致强和组成型蛋白表达的病毒元件，例如来自巨细胞病毒(CMV)(如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(如SV40启动子/增强子)、腺病毒(如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。对于病毒调节元件及其序列的进一步描述，参见例如Stinski的US 5,168,062、Bell等的US 4,510,245和Schaffner等的US 4,968,615。
除编码抗体链和调节序列的基因之外，本发明的重组表达载体可具有额外的序列如那些调节载体在宿主细胞中复制的序列(如复制起点)以及选择标记基因。选择标记基因利于选择载体已导入的宿主细胞(参见例如Axel等的US专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，选择标记基因共性在于使得载体已插入的宿主细胞对细胞毒素药如G418、潮霉素或氨甲蝶呤有抗性。优选的可选择的标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)编码基因(供具有氨甲蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞使用)和neo基因(用于G418选择)。
为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码所述重链和轻链的表达载体转染入宿主细胞。术语“转染”的各种形式意在包括多种常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。尽管理论上有可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但优选在真核细胞中表达抗体，特别是在哺乳动物宿主细胞中，这是因为与原核细胞相比，在上述真核细胞特别是哺乳动物细胞中正确折叠和免疫活性抗体被装配并分泌的几率更高。已报道了抗体基因的原核表达不能有效地产生高产率的活性抗体(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)Immunology Today 6：12-13)。
优选用于表达本发明的重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括CHO细胞(包括描述于Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中的dhfr-CHO细胞，其与如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中所描述的DHFR-选择标记一起使用)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过培养宿主细胞直至抗体在所述宿主细胞中表达，从而产生抗体，或优选地，抗体分泌入宿主细胞生长的培养基中。然后可通过使用标准的蛋白纯化方法从培养基中分离抗体。
为了产生完整抗体的一部分如Fab片段或scFv分子，同样有可能使用宿主细胞。上述方法的变形当然包括在本发明中。例如，用编码本发明的抗体的轻链或重链(但非两者)的DNA转染宿主细胞可能是合乎需要的。如果轻链或重链的存在对于目的抗原结合不是必需的，则通过利用重组DNA技术可部分或完全除去编码上述轻链或上述重链或两者的DNA。上述截短的DNA分子所表达的分子同样地包括于本发明的抗体中。此外，通过利用标准的化学方法将本发明的抗体与另一种抗体交联，有可能产生其中一条重链和一条轻链为本发明的抗体的以及另一条重链和另一条轻链具有针对不同于目的抗原的抗原的特异性的双功能抗体。
在用于重组表达本发明的抗体或其抗原结合部分的优选的系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体导入dhfr-CHO细胞中。在该重组表达载体中，编码抗体重链和轻链的基因在所有情况下都可操作地连接CMV增强子/AdMLP-启动子控制元件以便有力影响所述基因的转录。重组表达载体还携带有DHFR基因，其通过利用氨甲喋呤分泌/扩增能用于选择用该载体转染的dhfr-CHO细胞。培养经选择的转化宿主细胞，使得抗体重链和轻链表达，并从培养基重分离完整的抗体。使用标准的分子生物学技术，以便制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养所述宿主细胞以及从培养基中获得抗体。因此，本发明涉及一种通过在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞直至本发明的重组抗体已被合成，从而合成本发明的重组抗体的方法。此外，该方法可包括从所述培养基中分离所述重组抗体。
作为通过噬菌体展示筛选重组抗体文库的替换方案，可将其他本领域技术人员已知的方法用于筛选大的组合文库以鉴定本发明的抗体。基本上，可以使用其中在核酸和由其编码的抗体之间建立密切的物理连锁并可依靠其编码的抗体特性用于选择合适的核酸序列的任何表达系统。
在一种类型的可选表达系统中，如Szostak和Roberts的WO 98/31700以及Roberts，R.W.和Szostak，J.W.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：12297-12302中所描述的，重组抗体文库以RNA-蛋白融合物的形式表达。在该系统中，在其3’末端上携带嘌呤霉素(一种肽基受体抗生素)的合成mRNAs的体外翻译产生了mRNA和其所编码的肽或蛋白的共价融合物。因此，可基于编码肽或蛋白(如抗体或其部分)的特性例如所述抗体或所述其部分与Aβ(20-42)球聚体或其衍生物的结合，浓缩mRNAs复杂混合物(如组合文库)的一种特定mRNA。编码抗体或其部分并可通过筛选上述文库获得的核酸序列可以上述方式(如在哺乳动物宿主细胞中)通过重组方法得以表达，此外并可通过更多轮次的筛选mRNA-肽融合物，将突变导入最初选择的序列中，或以上述方式使用重组抗体体外亲和力成熟的其他方法经受进一步的亲和力成熟。
体内和体外方法的组合
本发明的抗体可同样地通过使用体内和体外方法的组合得以产生，例如在一个方法中，首先让Aβ(20-42)球聚体或其衍生物在宿主动物体内作用于抗体库以刺激Aβ(20-42)球聚体或衍生物结合抗体的产生，然后借助于一种或多种体外技术实现进一步的抗体选择和/或抗体成熟(即最优化)。根据一个实施方案，该类的一种组合方法可包括首先用所述Aβ(20-42)球聚体或其衍生物免疫接种非人动物(如小鼠、大鼠、兔、鸡、骆驼、绵羊或山羊或它们的转基因变种或嵌合小鼠)以刺激针对抗原的抗体应答，然后通过利用在体内在所述Aβ(20-42)球聚体或衍生物作用下已受刺激的淋巴细胞的免疫球蛋白序列制备并筛选噬菌体展示文库。该组合方法的第一步可以上述与体内方法有关的方式进行，而该方法的第二步则可以上述与体外方法有关的方式进行。优选的用随后体外筛选制备自所述受刺激的淋巴细胞的噬菌体展示文库超免疫非人动物的方法包括那些为BioSite Inc.所描述的，参见例如WO 98/47343、WO 91/17271、US 5,427,908和US 5,580,717。
根据另一个实施方案，一种组合的方法包括首先用本发明的Aβ(20-42)球聚体或其衍生物免疫接种非人动物(如小鼠、大鼠、兔、鸡、骆驼、绵羊、山羊或它们的基因敲除和/或转基因变种，或嵌合小鼠)，以刺激响应于所述Aβ(20-42)球聚体或其衍生物的抗体并通过筛选杂交瘤(例如制备自经免疫的动物)选择产生具有期望特异性的抗体的淋巴细胞。从所选择的克隆中分离编码抗体或单区抗体的基因(通过使用标准的克隆方法如逆转录酶聚合酶链反应)并经受体外亲和力成熟，以便由此改善所选择抗体的结合特性。该方法的第一步可以上述与体内方法有关的方式进行，而该方法的第二步则可以上述与体外方法有关的方式进行，特别是通过利用体外亲和力成熟的方法，例如那些描述于WO 97/29131和WO 00/56772中的方法。
在更进一步的组合方法中，通过使用本领域技术人员已知的方法如经选择的淋巴细胞抗体法(SLAM)以及描述于US 5,627,052，WO 92/02551和Babcock，J.S.等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：7843-7848中的方法从单个分离的淋巴细胞产生重组抗体。在该方法中，首先用Aβ(20-42)球聚体或其衍生物体内免疫接种非人动物(如小鼠、大鼠、兔、鸡、骆驼、绵羊、山羊或它们的转基因变种，或嵌合小鼠)以刺激针对所述寡聚体或衍生物的免疫应答，接着通过利用抗原特异性溶血斑点测定选择分泌目的抗体的个体细胞。为此，可使用诸如生物素的接头将球聚体或其衍生物或结构相关的目的分子偶联至羊红细胞，由此通过利用溶血斑点测定使之可能鉴定分泌具有合适的特异性的抗体的个体细胞。在鉴定分泌目的抗体的细胞后，通过逆转录酶PCR由细胞获得编码轻链和重链可变区的cDNA，并接着在哺乳动物宿主细胞如COS或CHO细胞中将所述可变区与合适的免疫球蛋白恒定区(如人恒定区)一起表达。然后，通过展开转染的细胞，让用扩增的来自体内选择的淋巴细胞的免疫球蛋白序列转染的宿主细胞经受进一步的体外分析和体内选择，例如为了分离表达具有结合亲和力的抗体的细胞。此外，可在体外操作所扩增的免疫球蛋白序列。
可通过执行基本上如上所述的斑点印迹选择具有本文所定义的所需亲和力的抗体。简言之，将连续稀释的抗原附于固体基质上，优选印在硝酸纤维膜上。然后让固定化的抗原与目的抗体接触，接着通过利用缀合酶的第二抗体以及比色反应检测后者；在规定的抗体和抗原浓度下，抗体结合的量提供了亲和力测定。因此，两种不同的抗体针对一种靶或一种抗体针对两种不同的靶的相对亲和力在此定义为在其他方面均相同的斑点印迹条件下，使用两种抗体-靶组合所观察到的各自靶结合的抗体量的比率。
可以本就已知的方法获得结合的表位与单克隆抗体5F7、10F11、7C6、4B7、6A2、2F2、4D10、7E5、10C1或3B10结合的表位相同的抗体。
如同上述抗体可竞争不同的靶结构一样，如果至少一种的这些结构能特异性减少另一种结构的可测量的结合，优选通过提供重叠或相同的表位，更优选相同的表位，则在此被认为是对特定抗体的“竞争”。
依靠它们对上述靶结构的相对亲和力，竞争靶实体能用于直接选择抗体。因此，可通过利用竞争测定法直接测定相对亲和力，在该测定法中将可区分形式的竞争实体如不同标记的竞争结构与目的抗体接触，并从与抗体结合的这些实体的相对量推出抗体针对这些实体中每一种的相对亲和力。
通过将期望对抗体具有更大亲和力的实体附于固体基质载体上并添加合适量(优选摩尔过量)的期望对抗体具有更小亲和力的竞争实体到该介质上，上述竞争可用于直接富集具有期望的针对靶实体的相对亲和力的抗体。因此，与其他抗体相比显示期望相对亲和力的抗体会趋向于与基质结合更紧并可在洗掉较不期望形式的抗体后得以获得，如通过在低盐浓度下洗涤并接着通过利用高盐浓度将抗体从其靶上可逆解离收获结合的抗体。如果需要的话，可进行几轮富集。在本发明的一个特定实施方案中，其中如在杂交瘤或抗原展示噬菌体或酵母细胞库中，将抗体潜在基因型与该抗体物理连锁，从而可拯救相应的表型。
在本发明的另一个实施方案中，使用了改良的斑点印迹，其中固定化的抗原与溶解的实体竞争与抗体的结合，使得抗体的相对亲和力可由与固定化的抗原的结合百分数推出。
抗体部分如Fab和F(ab’)2片段可通过使用常规技术如用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化而产生自全抗体。此外，可通过使用标准的重组DNA技术获得抗体、抗体部分和免疫黏附素分子。
本发明还涉及包含本发明抗体和任选的药学上适合的载体的药物制剂(组合物)。本发明的药物组合物可额外包含至少一种附加治疗剂，例如一种或多种用于释放本发明的抗体是有用的疾病的治疗的附加治疗剂。如果，例如本发明的抗体与本发明的球聚体结合，则药物组合物可额外包含一种或多种用于其中所述球聚体活性是重要的病症的治疗的附加治疗剂。
药学上适合的载体包括任何溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等等，只要它们是生理学相容的。药学上可接受的载体包括例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等等，以及它们的组合。在多数情况下，优选使用等渗剂例如糖类、诸如甘露糖醇或山梨糖醇的多元醇类或氯化钠。药学上适合的载体可额外包含相对少量的增加抗体半衰期或有效性的辅助物质如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂。
例如，药物组合物可以是适合于肠胃外给药的。在此，抗体被优选制备为具有0.1-250mg/ml的抗体含量的可注射的溶液。可以液体或冻干形式制备可注射的溶液，剂型为氧化铅玻璃瓶或管形瓶、安瓿或载药注射器。缓冲剂可含有L-组氨酸(1-50mM，优选5-10mM)并具有5.0-7.0，优选6.0的pH。更多适合的缓冲剂包括但不限于琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾缓冲剂。可使用氯化钠以便将溶液张度调节到0-300mM的浓度(对于液体剂型，优选150mM)。对于冻干剂型，还可包括冷冻保护剂如蔗糖(如0-10％，优选0.5-1.0％)。其他合适的冷冻保护剂为海藻糖和乳糖。对于冻干剂型，还可包括填充剂如甘露糖醇(如1-10％，优选2-4％)。稳定剂如L-甲硫氨酸(如51-50mM，优选5-10mM)可用于液体和冻干剂型中。个更多适合的填充剂为甘氨酸和精氨酸。还可使用表面活性剂如聚山梨醇酯80(如0-0.05％，优选0.005-0.01％)。更多的表面活性剂为聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂。
本发明的组合物可具有多种剂型。这些剂型包括液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(如可注射和可输注的溶液)、分散液或混悬剂、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选的剂型取决于期望的给药类型以及治疗应用。典型地，组合物优选以可注射的或能输注的溶液形式给予，例如类似于用于人被动免疫接种的其他抗体的组合物。优选的给药途径为肠胃外(如静脉内、皮下、腹膜内或肌内)给药。根据一个优选的实施方案，通过静脉输注或注射给予抗体。根据另一个优选的实施方案，通过肌内或皮下注射给予抗体。
在制备和贮藏条件下，治疗组合物通常应当是无菌且稳定的。组合物可配制为溶液、微乳剂、分散剂、脂质体或其他适合于高浓度活性物质的有序结构。可通过将需要量活性物质(即抗体)引入合适的溶剂(根据需要适当时使用一种上述成分或其组合)中，并接着无菌过滤所述溶液，从制备无菌可注射溶液。通常通过将活性物质引入包含基本分散介质的无菌载体以及适当时其他必需成分中制备分散剂。就用于制备无菌可注射溶液的无菌冻干粉来说，真空干燥和喷雾干燥是优选的制备方法，其由之前无菌过滤的溶液产生了活性成分以及适当时更多所需成分的粉末。可例如通过使用诸如卵磷脂的包衣，通过在分散剂情况下维持所需的颗粒尺寸或通过利用表面活性剂，从而可以保持溶液合适的流动性。通过将延迟吸收的制剂如单硬脂酸盐和明胶额外引入组合物中，可以实现可注射组合物的延长吸收。
尽管对于诸多治疗应用优选的给药类型为皮下注射、静脉注射或输注，本发明的抗体可通过多种本领域技术人员已知的方法给药。本领域技术人员应当理解给药途径和/或类型取决于所期望的结果。根据特定的实施方案，可用保护活性物质免于快速释放的载体制备该活性物质，例如，具有持续或控制释放的配方，其包括植入物、透皮膏剂以及微囊包埋释放系统。可使用生物学上可降解的生物相容的聚合物如乙二醇二乙酸酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、多正酯类和聚乳酸。制备上述剂型的方法是本领域技术人员众所周知的；参见例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，编，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
根据特定的实施方案，本发明的抗体可经口给予，例如处于惰性稀释剂或可代谢食用的载体中。抗体(以及更多的成分，如果需要的话)还可包封于硬或软胶囊中、压制成片或直接添加到食品中。为了口服治疗，可将抗体与赋形剂混合并以口服片剂、口含片剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂等形式使用。如果意在通过不同于肠胃外的途径给予本发明的抗体，可能需要从阻止该抗体失活的物质中选择包衣。
本发明还涉及一种在个体内抑制本发明的球聚体活性的方法，其中所述个体患有其中涉及淀粉状β蛋白以及其中所述本发明的球聚体的活性特别重要的病症。为了抑制抗体结合的球聚体的活性，所述方法包括将至少一种本发明的抗体给予个体。所述个体优选为人类。本发明的抗体可出于治疗性目的给予人类个体。此外，本发明的抗体可出于兽医目的或在具体疾病的动物模型框架内给予非人哺乳动物。上述动物模型可用于评价本发明抗体的治疗效果(例如用于检测给药剂量和时程)。
其中本发明的球聚体起作用的病症包括特别是其中其发展和/或进展涉及本发明的球聚体的病症。这些病症特别是那些其中本发明的球聚体明显地或推测起来是造成所述病症的病理生理学的原因，或其是有助于所述病症发展和/或进展的因素的那些病症。因此，在此包括了其中抑制本发明的球聚体的活性能缓解病症的症状和/或进展的那些病症。上述病症可例如通过在患有特定病症的个体的生物学液体中本发明的球聚体增加的浓度(如血清、血浆、CSF、尿等中增加的浓度)而得以证实。这可例如通过使用本发明的抗体得到检测。在与其中涉及神经变性因素、认知缺陷、神经毒性因素以及炎性因素的多种病症相关的病理学中本发明的球聚体起了重要作用。
在本发明的另一个方面中，可被治疗或预防的病症包括那些与淀粉样变性病相关的病症。术语“淀粉样变性病”在此指许多以身体不同组织中特定蛋白(淀粉状蛋白、纤维状蛋白和它们的前体)的异常折叠、凝块、聚集和/或积聚为特征的病症。在阿尔茨海默病和唐氏综合征中，影响了神经组织，在大脑淀粉样血管病(CAA)中，影响了血管。
本发明的药物组合物可包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体或抗体部分。“治疗有效量”指在剂量和必需的一段时间上能有效地达到期望的治疗效果的一种量。抗体或抗体部分的治疗有效量可为本领域技术人员所确定，并可随诸如个体疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体或抗体部分在个体中引发期望应答的能力的因素而改变。治疗有效量还是一种其中抗体或抗体部分的治疗有益效果超过任何毒性或有害作用的量。“预防有效量”指在剂量和必需的一段时间上能有效地达到期望的预防效果的一种量。典型地，由于在疾病发作前或发作早期将预防剂量用于个体，因此预防有效量应当小于治疗有效量。
此外，本发明包括一种预防或治疗需要上述预防或治疗的患者中阿尔茨海默病的更进一步的方法。该方法包括以足以起预防或治疗作用的量将上述疫苗给予患者的步骤。
此外，本发明包括一种鉴定适合于预计发展为淀粉样变性病如阿尔茨海默病的患者自动免疫接种的化合物的方法。该方法包括：1)将一种或多种目的化合物暴露于一种或多种上述抗体一段时间并处于足以使该一种或多种化合物与抗体结合的条件下；2)鉴定那些与抗体结合的化合物，所鉴定的化合物要被用于预计发展为淀粉样变性病如阿尔茨海默病的患者自动免疫接种。
在抗体诊断性使用的框架内，特异性球聚体的定性或定量测定特别用于诊断疾病相关的淀粉状蛋白β形式。在上下文中，特异性指能以足够的灵敏度检测特定球聚体或其衍生物或其混合物的可能性。本发明的抗体有利地具有低于10ng/ml样品、优选地低于1ng/ml样品以及特别优选地低于100pg/ml样品的检测阈值浓度，意味着可以通过本发明的抗体检测到至少在各例中指明的每毫升样品中的球聚体浓度，以及有利的更低浓度。
根据免疫学的方法进行检测。原则上，其可通过使用任何其中使用了抗体的分析或诊断测定方法执行，包括凝集和沉淀技术、免疫测定法、免疫组织化学法和免疫印迹技术，例如蛋白质印迹，或优选地斑点印迹法。体内方法例如成像法也包括在此。
应用免疫测定是有利的。竞争性免疫测定(即其中抗原和标记抗原(示踪剂)竞争与抗体结合的测定)和夹心免疫测定(即其中通过第二种抗体通常为标记的抗体检测特异性抗体与抗原的结合的测定)都是合适的。这些测定可以是同相的(即不分离为固相和液相)或多相的(即将结合的标记与未结合的标记相分离，例如通过固相结合的抗体来分离)。取决于标记和测定方法，不同的多相和同相免疫测定可分成特定的类别，例如RIAs(放射免疫测定)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、FIA(荧光免疫测定)、LIA(发光免疫测定)、TRFIA(时间分辨FIA)、IMAC(免疫激活测定)、EMIT(酶倍增免疫测定试验)、TIA(比浊免疫测定)、I-PCR(免疫-PCR)。
对于本发明的球聚体定量，优选竞争性免疫测定，其中规定量的标记的球聚体衍生物作为示踪剂与要被定量的样品(含有未知量的未标记的球聚体)的球聚体竞争与所使用的抗体的结合。借助于标准曲线，可从被取代的示踪剂的量测定样品中抗原的量，即球聚体的量。
在可用于这些目的的标记中，经证实酶是有利的。例如可使用基于过氧化物酶特别是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-D-半乳糖苷酶的系统。其转变可通过光度测定监测的特异性底物是例如这些酶可以利用的。对于碱性磷酸酶，适合的底物体系是基于磷酸对硝基苯酯(p-NPP)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/氮蓝四唑(BCIP/NPT)、坚牢红/萘酚-AS-TS磷酸酯的；对于过氧化物酶，适合的底物体系是基于2,2-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、邻苯二胺(OPT)、3，3‘，5,5‘-四甲基联苯胺(TMB)、邻联二茴香胺、5-氨基水杨酸、3-二甲氨基苯甲酸(DMAB)和3-甲基-2-苯并噻唑啉腙(MBTH)；对于β-D-半乳糖苷酶，适合的底物体系是基于邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷(o-NPG)、对硝基苯基-β-D-半乳糖苷和4-甲基伞形苯基-β-D-半乳糖苷(MUG)。在多数情况下，这些底物体系是以随时可用的形式从商业上可获得的，例如以片剂的形式，其还可含有更多的试剂如适当的缓冲剂等等。
所使用的示踪剂可以是标记的球聚体。在该意义上，可通过标记待测定的球聚体并使用其作为示踪剂来测定特定的球聚体。
可以用本身已知的方式将标记与球聚体偶联用于制备示踪剂。通过类推上文关于本发明的球聚体衍生化的注释也适用。此外，可获得大量为与蛋白缀合而适当修饰的标记，例如缀合生物素-、抗生物素蛋白-、extravidin-或链霉抗生物素蛋白的酶，马来酰亚胺活化的酶等等。这些标记可与寡聚体或如果需要的话与适当衍生化的球聚体直接反应以生成示踪剂。例如，如果使用链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶缀合物，则首先需要生物素化球聚体。这相应地应用于相反的顺序。适合于该目的的方法也是本领域技术人员所知道的。
如果选择多相免疫测定形式，可以通过将抗原-抗体复合物与载体结合而将其分离，例如通过与所述载体偶联的抗独特型抗体如抗兔IgG抗体来分离。适合的载体，特别是用合适的抗体包被的微量滴定板是已知的且部分可商业获得。
本发明进一步涉及具有至少一种如上所述抗体以及更多组分的免疫测定套装。所述套装通常以包装单位(一种用于执行本发明的球聚体测定的手段的组合)形式存在。为了尽可能地容易操作，所述手段优选以基本上随时可用的形式提供。一种有利的配置是以试剂盒的形式提供免疫测定。试剂盒通常含有多个用于独立配置组分的容器。所有的组分都以随时可用于稀释的形式提供，如用于稀释的浓缩物或作为干物质或冻干物用于溶解或重悬；单一或所有的组分可冷冻或在室温下贮藏直至使用。血清优选是例如在-20℃下迅速冷冻(shock-frozen)的，使得在这些情况下免疫测定在使用前肯定能更好地保持在冰点以下温度。
提供给免疫测定的更多组分取决于所述免疫测定的类型。通常，将标准蛋白、可能需要或可能不需要的示踪剂以及对照血清与抗血清一起提供。此外，还包括微量滴定板(优选抗体包被的)，例如用于测试、洗涤或底物转化的缓冲液和酶底物本身。
免疫测定以及作为实验室和医院中辅件的抗体生产和使用的一般原理可见于例如Antibodies，A Laboratory Manual(Harlow，E.，和Lane，D.，编，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY，1988)。
因此，本发明还包括一种诊断怀疑或患有该疾病的患者中淀粉样变性病如阿尔茨海默病的方法。该方法包括步骤：1)从患者分离生物样品；2)将生物样品与至少一种上述抗体接触一段时间并处于足以形成抗原/抗体复合物的条件下；和3)检测所述样品中抗原/抗体复合物的存在，复合物存在指示了患者中淀粉样变性病如阿尔茨海默病的诊断。抗原可以是例如球聚体或具有与完整球聚体相同的功能特性(如结合活性)的其部分或片段。
此外，本发明包括另一种诊断怀疑或患有该疾病的患者中淀粉样变性病如阿尔茨海默病的方法。该方法包括步骤：1)从患者分离生物样品；2)将生物样品与抗原接触一段时间并处于足以形成抗体/抗原复合物的条件下；3)添加缀合物到所得到的抗体/抗原复合物中一段时间并处于足以使缀合物与结合的抗体结合的条件下，其中缀合物包含一种连接有能产生可检测信号的信号产生化合物的上述抗体；和4)通过检测信号产生化合物所产生的信号检测可能存在于生物样品中的抗体的存在，信号指示了患者中淀粉样变性病如阿尔茨海默病的诊断。抗原可以是球聚体或具有与完整球聚体相同的功能特性(如结合活性)的其部分或片段。
本发明包括一种诊断怀疑患有淀粉样变性病如阿尔茨海默病的患者中淀粉样变性病如阿尔茨海默病的额外方法。该方法包括步骤：1)从患者分离生物样品；2)将生物样品与抗-抗体(其中抗-抗体特异性针对一种上述抗体)接触一段时间并处于足以容许形成抗-抗体/抗体复合物的条件下，该复合物含有存在于生物样品中的抗体；2)添加缀合物到所得到的抗-抗体/抗体复合物中一段时间并处于足以使缀合物与结合的抗体结合的条件下，其中缀合物包含与能产生可检测信号的信号产生化合物结合的抗原；和3)检测信号产生化合物所产生的信号，信号指示了患者中淀粉样变性病如阿尔茨海默病的诊断。
同样，本发明包括一种试剂盒，其包含：a)至少一种上述抗体，和b)包含连接有信号产生化合物的抗体的缀合物，其中缀合物的抗体不同于分离的抗体。
本发明还包括一种试剂盒，其包含：a)针对上述抗体之一的抗-抗体，和b)包含连接有信号产生化合物的抗原的缀合物。抗原可以是球聚体或具有与该球聚体相同功能特性(如结合活性)的其片段或部分。
在本发明的一个诊断实施方案中，将本发明的抗体或其部分包被在固相上(或存在于液相中)。然后将试样或生物样品(如全血、脑脊液、血清等)与该固相接触。如果抗原(如球聚体)存在于样品中，则上述抗原结合固相上的抗体并接着通过直接或间接方法进行检测。直接方法包括简单地检测复合物自身的存在以及因此抗原的存在。在间接方法中，将缀合物添加到结合的抗原中。该缀合物包含连接有信号产生化合物或标记的与结合的抗原结合的第二抗体。第二抗体一旦与结合的抗原结合，信号产生化合物就产生可测量的信号。于是上述信号指示了试样中抗原的存在。
用于诊断免疫测定的固相的例子是多孔和无孔材料、胶乳粒子、磁性颗粒、微粒(参见U.S.专利号5,705,330)、珠子、薄膜、微量滴定孔和塑料试管。如果需要的话，固相材料和标记存在于缀合物中的抗原或抗体的方法的选择取决于期望的测定形式的性能特性。
如上所述，缀合物(或指示剂)应包含连接有信号产生化合物或标记的抗体(或许是抗-抗体，取决于测定法)。该信号发生化合物或“标记”是自身可检测的或可与一种或多种其他化合物起反应以产生可检测的产物。信号产生化合物的例子包括发色团，放射性同位素(如125I、131I、32P、3H、35S和14C)、化学发光化合物(如吖啶)、颗粒(可见的或荧光的)、核酸、络合剂或催化剂如酶(如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶和核糖核酸酶)。在使用酶(如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)的情况下，添加显色、发出荧光或发光的底物能引起可检测信号的产生。其他检测系统如时间分辨荧光测定、内反射荧光测定、扩增(如聚合酶链反应)和拉曼光谱学也是有用的。
可通过上述免疫测定进行检验的生物液体的例子包括血浆、全血、干的全血、血清、脑脊液或组织和细胞的水或有机-水提取物。
本发明还包括一种用于检测试样中抗体存在的方法。该方法包括步骤：(a)在足以使得抗-抗体/抗体复合物形成的时间和条件下，将怀疑或含有抗体的试样与特异性针对患者样品中抗体的抗-抗体接触，其中抗-抗体是一种结合患者样品中抗体的本发明的抗体；(b)添加缀合物到所得到的抗-抗体/抗体复合物中，该缀合物包含连接有能检测可检测信号的信号产生化合物的抗原(其结合抗-抗体)；和(d)通过检测信号产生化合物所产生的信号检测可能存在于试样中的抗体的存在。可使用包含针对抗-抗体的抗体的对照或校准物。
试剂盒也包括在本发明的范围内。更具体地说，本发明包括用于测定在怀疑患有阿尔茨海默病或特征在于认知缺陷的另外病症的患者中抗原(如球聚体)存在的试剂盒。特别是，一种用于测定试样中抗原存在的试剂盒包含a)如本文所定义的抗体或其部分；和b)包含连接有能产生可检测的信号的信号产生化合物的第二抗体(具有针对抗原的特异性)的缀合物。该试剂盒还可包含含有与该抗原结合的试剂的对照或校准物。
本发明还包括用于检测试样中抗体的试剂盒。该试剂盒可包含a)特异性针对目的抗体的抗-抗体(例如本发明之一的)，和b)如上所定义的抗原或其部分。包含与该抗原结合的试剂的对照或校准物也可包括在其中。更具体地说，该试剂盒可包括a)特异性针对抗体的抗-抗体(例如本发明之一的)，和b)包含连接有能产生可检测信号的信号产生化合物的抗原(如球聚体)的缀合物。此外，该试剂盒还可包含含有与该抗原结合的试剂的对照或校准物。
该试剂盒还可包含一个含有预调固相的容器例如管形瓶、瓶子或条片，以及含有相应的缀合物的其他容器。这些试剂盒还可包含含有进行该测定所需要的其他试剂的管形瓶或容器，例如洗涤、处理和指示试剂。
还应当注意的是本发明不仅包括上述全长抗体，还包括其部分或片段，例如其Fab部分。此外，本发明包括根据例如结合特异性、结构等与本发明抗体具有相同特性的任何抗体。
本发明的优点：
通过使用Aβ(20-42)球聚体免疫接种，可获得在通过如上所述的竞争性斑点印迹所测定的耐受性或识别不同的Aβ(1-42)寡聚体和Aβ(X-42)寡聚体方面有差异的不同的单克隆抗体。这使得开发在认知增强作用、期望的超过其他Aβ形式的特异性以及最低限度的副作用分布之间具有最佳关系的针对N-末端截短的Aβ寡聚体的抗体得以可能。令人惊讶地，Aβ(1-42)和Aβ(12-42)球聚体尽管含有结构元件，但仅为通过利用进一步截短的Aβ(20-42)球聚体作为抗原所获得的抗体所部分识别。
通过将特定的寡聚Aβ形式限制酶切为基本的结构成分(即使用N端截短的Aβ球聚体)，在自动免疫接种中所产生的抗体谱是高度特异于Aβ寡聚形式的。这也适用于供被动免疫接种之用的单克隆抗体。这样一种用于免疫接种(自动或被动)的特定策略的优点在于其不会诱导针对Aβ单体、以聚集的原纤维状态存在的Aβ肽或sAPPα的免疫应答。在以下几个方面中其是有利的：
1)在AD脑中以不溶性Aβ斑、以聚集的原纤维状态存在的Aβ肽占据了整个Aβ肽库的较大部分。通过抗-Aβ抗体与这些斑的反应诱导的Aβ斑溶解导致的Aβ的过量释放被认为是有害的。接着该大量释放的Aβ会穿过血脑屏障，进入血流并潜在地增加微出血的风险。此外，在ELAN试验中，由于6％的病例发作脑膜脑炎，因此该使用原纤维状Aβ肽形式免疫接种的特别策略就迫使该试验取消。
2)针对单体Aβ肽形式的免疫应答是不希望的，因为有可能表明单体Aβ肽形式可发挥认知增强作用。
3)针对sAPPα的免疫应答同样是不希望的，因此有可能导致与生理学上存在的前体蛋白APP产生反应并因此导致自身免疫反应。此外，sAPPα还显示发挥认知增强作用。
4)为了避免不希望的微出血副作用，应当避免针对以CAA形式存在的血管Aβ肽的应答(当与上述针对N-末端的抗体相比时，针对Aβ的中央部分而且不与以CAA形式聚集的Aβ-肽结合的抗体诱导较小的微出血，参见如上)。
5)相对于病理生理学相关的Aβ物质，与Aβ寡聚体特异性反应的抗体会具有更高的生物利用度，因为它们不会与如原纤维状Aβ结合并因此无法获得治疗效果。
保藏物信息：根据布达佩斯条约条款，产生单克隆抗体5F7的杂交瘤于2005年12月1日交付于美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia20110保藏，并得到保藏编号PTA-7241。此外，根据布达佩斯条约条款，产生单克隆抗体10F11的杂交瘤于2005年12月1日交付于美国典型培养物保藏中心，10801 UniversityBoulevard，Manassas，Virginia 10801保藏，并得到保藏编号PTA-7239。另外，根据布达佩斯条约条款，产生单克隆抗体4B7的杂交瘤于2005年12月1日交付于美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 10801保藏，并得到保藏编号PTA-7242，以及根据布达佩斯条约条款，产生单克隆抗体7C6的杂交瘤于2005年12月1日交付于美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 10801保藏，并得到保藏编号PTA-7240。此外，根据布达佩斯条约条款，产生单克隆抗体6A2的杂交瘤于2006年2月28日交付于美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 10801保藏，并得到保藏编号PTA-7409，以及根据布达佩斯条约条款，产生单克隆抗体2F2的杂交瘤于2006年2月28日交付于美国典型培养物保藏中心，10801University Boulevard，Manassas，Virginia 10801保藏，并得到保藏编号PTA-7408。根据布达佩斯条约条款，产生单克隆抗体4D10的杂交瘤于2006年2月28日交付于美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 10801保藏，并得到保藏编号PTA-7405。根据布达佩斯条约条款，产生单克隆抗体7E5的杂交瘤于2006年8月16日交付于美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 10801保藏，并得到保藏编号PTA-7809。根据布达佩斯条约条款，产生单克隆抗体10C1的杂交瘤于2006年8月16日交付于美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 10801保藏，并得到保藏编号PTA-7810。根据布达佩斯条约条款，产生单克隆抗体3B10的杂交瘤于2006年9月1日交付于美国典型培养物保藏中心，10801University Boulevard，Manassas，Virginia 10801保藏，并得到保藏编号PTA-7851。所有的保藏都是以阿伯特(Abbott)实验室，100 Abbott Park Road，Abbott Park，Illinois60064(US)的名义进行的。
附图说明
在附图中：
图1显示了Aβ(1-42)和Aβ(1-40)的大小排阻层析。Aβ(1-42)单体溶解于A)0.1％NH4OH、B)70％甲酸、C)0.1％NaOH中以及D)Aβ(1-40)溶解于0.1％NaOH中。随后，样品在20mMNaH2PO4，140mM NaCl，pH 7.4中以1∶10进一步稀释。在室温下溶解后，温育这些样品5分钟(左栏)或1小时(右栏)，然后施加于大小排阻柱子；
图2A)显示了标准蛋白(分子标记蛋白，泳道1)；Aβ(1-42)原纤维制品，对照(泳道2)；Aβ(1-42)原纤维制品+mAb 5F7，20h，37℃，上清液(泳道3)；Aβ(1-42)原纤维制品+mAb5F7，20h，37℃，沉淀(泳道4)；Aβ(1-42)原纤维制品+mAb 6E10，20h，37℃，上清液(泳道5)；Aβ(1-42)原纤维制品+mAb 6E10，20h，37℃，沉淀(泳道6)的SDS PAGE；
B)显示了与Aβ-原纤维结合mAbs占总抗体百分数的定量分析结果；
图3是一张直条图，其显示了与野生型小鼠(阳性对照)及PBS-处理的APP/L小鼠(阴性对照)相比，在用溶于O.1％NH4OH中的Aβ(1-42)单体、Aβ(1-42)球聚体和Aβ(20-42)球聚体自动免疫接种后，使用APP/L转基因小鼠的物体识别测试的结果，其中根据在ANOVA中P＜0.05后对不同组之间的事后t-检验，圆圈表示对PBS-处理的APP/L小鼠显著差异，星号表示对随机水平(50％)高度显著差异；图4显示了100pmol/μl(A行)；10pmol/μl(B行)；1pmol/μl(C行)；0.1pmol/μl(D行)和0.01pmol/μl(E行)的Aβ(1-42)球聚体(第1栏)；溶于PluronicF68中的HFIP预处理的Aβ(1-42)单体(第2栏)；Aβ(20-42)球聚体(第3栏)；Aβ(12-42)球聚体(第4栏)；溶于DMSO中的HFIP预处理的Aβ(1-40)单体(第5栏)；Aβ(1-42)单体，NH4OH(第6栏)；Aβ(1-42)原纤维制品(第7栏)和来自Sigma的sAPPα(第8栏)与用Aβ(20-42)球聚体自动免疫接种APP/L Tg小鼠后获得的不同抗血清的反应性的斑点印迹；
图5是一张直条图，其显示了用Aβ(1-42)单体(0.1％NH4OH)、Aβ(1-42)球聚体、Aβ(20-42)球聚体或作为对照的载体自动免疫接种的APP/PS1 Tg-小鼠的脑提取物中可溶性和不溶性Aβ(1-42)和Aβ(1-40)肽的浓度；
图6是一张直条图，其显示了与对照小鼠相比，在用抗Aβ(20-42)球聚体抗体5F7、10F11和7C6被动免疫接种后用APP/L转基因小鼠进行的物体识别测试的结果，A)分别针对每种抗体和B)所有抗体一并考虑；
图7A)显示了不同的抗-Aβ抗体(-6E10、-5F7、-4B7、-10F11、-6A2、-4D10、-3B10、-2F2、-7C6、-7E5、-10C1)的特异性的斑点印迹分析。在此接受测试的单克隆抗体是通过用Aβ(20-42)球聚体自动免疫接种小鼠，随后通过选择融合的杂交瘤细胞获得的(除市售6E10，Signet编号9320之外)。将单个Aβ形式连续稀释并与相应的单克隆抗体温育用于免疫反应：
1.Aβ(1-42)单体，0.1％NH4OH
2.Aβ(1-40)单体，0.1％NH4OH
3.Aβ(1-42)单体，0.1％NaOH
4.Aβ(1-40)单体，0.1％NaOH
5.Aβ(1-42)球聚体
6.Aβ(12-42)球聚体
7.Aβ(20-42)球聚体
8.Aβ(1-42)原纤维制品
9.sAPPα(Sigma)(第一斑点：1pmol)
B)使用光密度分析进行定量评价。对于每种Aβ形式，只有相应于最低抗原浓度的斑点得到评价，前提条件是其具有较在最终光学上清楚鉴定的Aβ(20-42)球聚体斑点的相对密度(阈值)大20％的相对密度。对每一斑点印迹独立测定该阈值。该值指示对于给定的抗体在识别Aβ(20-42)球聚体和相应的Aβ形式之间的关系；
图8显示了在不同浓度下的抗体与阿尔茨海默病(AD)患者或老的APP转基因小鼠新皮质的横向切片的结合：
A)通过刚果红染色验证淀粉状蛋白沉积物，在APP转基因小鼠系Tg2576和AD患者(RZ55)的脑组织中作为斑块，在脑血管中作为大脑淀粉样血管病(CAA)；
B)AD患者(RZ16)中Aβ(淀粉状蛋白斑)实质性沉淀的强染色仅发生在使用6G1和市售抗体6E10(左栏)的情况下，而抗体5F7、2F2和6A2(第二栏)，4D10、10F11和3B10(第三栏)以及7C6、7E5和10C1(右栏)则没有显示染色。所有抗体都在0.7μg/ml浓度下使用；
C)在19个月大的Tg2576中Aβ(淀粉状蛋白斑)实质性沉淀的强染色仅发生在使用6G1和市售抗体6E10(左栏)的情况下，而抗体5F7、2F2和6A2(第二栏)，4D10、10F11和3B10(第三栏)以及7C6、7E5和10C1(右栏)则没有显示染色。所有抗体都在0.7μg/ml浓度下使用；
D)-G)使用图像分析，对组织学图像中Aβ斑染色进行定量分析。通过将斑块的灰度值减去背景组织的灰度值计算光密度值(0％＝无染色)：D)在老的Tg2576小鼠中在0.7μg/ml抗体下染色，E)在APP/L小鼠中在3种不同浓度的抗体下染色，F)在AD患者(RZ55)中在0.7μg/ml抗体下染色，和G)在AD患者(RZ16)中在3种不同浓度的抗体下染色。对市售抗体6E10(星号)和4G8(圆圈)与所有其他抗体(3个星号/圆圈：相对于对照p＜0.001；在ANOVA后的事后Bonferroni’s t-检验为p＜0.001)的染色之间的差异进行统计学评价(D,F)。在E)和G)中，与市售抗体6E10和4G8相比，除6G1之外的所有抗体总是显示显著较少的染色(在ANOVA中p＜0.001后，在事后t-检验中p＜0.001)。
H)Aβ血管沉积物的强染色(箭头)仅发生于6G1和市售抗体6E10(左栏)，而抗体5F7、2F2和6A2(第二栏)，4D10、10F11和3B10(第三栏)以及7C6、7E5和10C1(右栏)均显示无染色。所有抗体都在0.7μg/ml浓度下使用。定性的类似情况见于Tg2576小鼠(在此未显示)；
图9自动免疫接种约1年后TG2576小鼠血浆中的抗-Aβ-抗体效价和斑点印迹选择性谱。评价用A)Aβ(20-42)球聚体、B)Aβ(12-42)球聚体、C)Aβ(1-42)单体和D)载体最后一次免疫接种约1年后Tg2576-小鼠的血浆样品的抗-Aβ抗体产生并还通过斑点印迹进行表示。
1.Aβ(1-42)球聚体
2.Aβ(1-42)单体，HFIP预处理的，溶于0.1％Pluronic F68中
3.Aβ(20-42)球聚体
4.Aβ(12-42)球聚体
5.Aβ(1-40)单体，HFIP预处理的，5mM DMSO溶液
6.Aβ(1-42)单体，0.1％NH4OH
7.Aβ(1-42)原纤维制品
8.sAPPα(Sigma)；(第一斑点：1pmol)；
图10显示了总结患有阿尔茨海默病的人和无痴呆对照的脑组织中Aβ(20-42)球聚体水平的表格；
图11图解说明了如下单克隆抗体(mAbs)的重链和轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列(在每条氨基酸序列中，互补决定区(CDRs)加下划线)：
以下实施例旨在举例说明本发明，而不限制其范围。
具体实施方式
实施例1：球聚体的制备
a)Aβ(1-42)球聚体
将Aβ(1-42)合成肽(H-1368，Bachem，Bubendorf，Switzerland)以6mg/mL悬浮于100％1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(HFIP)中，并在37℃下振荡温育1.5小时以完全溶解。HFIP作为氢键断裂剂并用于消除Aβ肽中预先存在的结构异质性。通过在SpeedVac中蒸发除去HFIP，并将Aβ(1-42)在5mM浓度下重悬于二甲亚砜中并超声处理20秒。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(20mM NaH2PO4，140mM NaCl，pH 7.4)中将HFIP预处理的Aβ(1-42)稀释至400μM并添加1/10体积的2％十二烷基硫酸钠(SDS)(水溶液)(0.2％SDS的终浓度)。在37℃下温育6小时产生了16/20-kDa Aβ(1-42)球聚体(球状寡聚体的短形式)中间体。通过用3体积的H2O进一步稀释并在37℃下温育18小时产生了38/48-kDa Aβ(1-42)球聚体。在3000g下离心20分钟后，通过超滤(30-kDa截留分子量)浓缩样品，对5mM NaH2PO4，35mM NaCl，pH 7.4透析，在10000g下离心10分钟，并取出包含38/48-kDa Aβ(1-42)球聚体的上清液。作为透析的备选方案，还可通过在4℃下用9倍过量(v/v)的冰冷甲醇/乙酸溶液(33％甲醇，4％乙酸)沉淀38/48-kDa Aβ(1-42)球聚体1小时。接着沉淀38/48-kDa Aβ(1-42)球聚体(在16200g下10分钟)，重悬于5mM NaH2PO4，35mM NaCl，pH 7.4中，并将pH调至7.4。
b)交联的Aβ(1-42)球聚体
将Aβ(1-42)合成肽(H-1368，Bachem，Bubendorf，Switzerland)以6mg/mL悬浮于100％1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(HFIP)中，并在37℃下振荡温育1.5小时至完全溶解。HFIP作为氢键断裂剂并用于消除Aβ肽中预先存在的结构异质性。通过在SpeedVac中蒸发除去HFIP，并将Aβ(1-42)在5mM浓度下重悬于二甲亚砜中并超声处理20秒。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(20mM NaH2PO4，140mM NaCl，pH 7.4)中将HFIP预处理的Aβ(1-42)稀释至400μM并添加1/10体积的2％十二烷基硫酸钠(SDS)(水溶液)(0.2％SDS的终浓度)。在37℃下温育6小时产生了16/20-kDa Aβ(1-42)球聚体(球状寡聚体的短形式)中间体。通过用3体积的H2O进一步稀释并在37℃下温育18小时产生了38/48-kDa Aβ(1-42)球聚体。现在通过与1mM戊二醛在21℃室温(RT)下温育2小时，接着在RT下用乙醇胺(5mM)处理30分钟进行38/48-kDa Aβ(1-42)球聚体的交联。
c)Aβ(20-42)球聚体
将根据实施例1a制备的1.59ml Ap(1-42)球聚体制品与38ml缓冲液(50mM MES/NaOH，pH 7.4)和200μl 1mg/ml嗜热菌蛋白酶(Roche)水溶液混合。在RT下搅拌反应混合物20小时。然后添加80μl 100mM EDTA水溶液，pH 7.4，并用400μl的1％浓度的SDS溶液将混合物进一步调至0.01％的SDS含量。通过15ml 30kDa Centriprep管将反应混合物浓缩至大约1ml。将浓缩物与9ml缓冲液(50mM MES/NaOH，0.02％SDS，pH 7.4)混合并再次浓缩至1ml。在透析管中于6℃下将浓缩物对1l缓冲液(5mM磷酸钠，35mM NaCl)透析16小时。用2％浓度的SDS水溶液将透析液调节至0.1％的SDS含量。在10000g下离心样品10分钟并取出Aβ(20-42)球聚体上清液。
d)Aβ(12-42)球聚体
将根据实施例1a制备的2ml Aβ(1-42)球聚体制品与38ml缓冲液(5mM磷酸钠，35mM氯化钠，pH 7.4)和150μl 1mg/ml GluC内切蛋白酶(Roche)水溶液混合。在RT下搅拌反应混合物6小厮后，然后添加另外的150μl 1mg/ml GluC内切蛋白酶(Roche)水溶液。在RT下搅拌反应混合物又16小时，然后添加8μl 5M DIFP溶液。通过15ml 30kDa Centriprep管将反应混合物浓缩至大约1ml。将浓缩物与9ml缓冲液(5mM磷酸钠，35mM氯化钠，pH 7.4)混合并再次浓缩至1ml。在透析管中于6℃下将浓缩物对11缓冲液(5mM磷酸钠，35mM NaCl)透析16小时。用1％浓度的SDS水溶液将透析液调节至0.1％的SDS含量。在10000g下离心样品10分钟并取出Aβ(12-42)球聚体上清液。
实施例2：不同的Aβ(1-42)单体和Aβ(1-40)单体制品的大小排阻层析Aβ(1-42)，0.1％NH4OH：
将1mg Aβ(1-42)(Bachem，产品目录号H-1368)溶解在500μl 0.1％NH4OH水溶液中并在室温下搅拌1分钟。在10'000 g下离心样品5分钟。收集上清液。根据Bradford’s法(BIO-RAD)测定上清液中的Aβ(1-42)浓度。
5分钟样品：
用20mM NaH2PO4，140mM NaCl，pH 7.4将20μl溶于含0.1％NH4OH的上清液中的Aβ(1-42)稀释至0.2mg/ml的Aβ(1-42)浓度。在室温下温育样品5分钟。然后通过大小排阻层析(SEC)分析100μl。
1小时样品：
用20mM NaH2PO4，140mM NaCl，pH 7.4将20μl溶于含0.1％NH4OH的上清液中的Aβ(1-42)稀释至0.2mg/ml的Aβ(1-42)浓度。在室温下温育样品1小时。然后通过大小排阻层析(SEC)分析100μl。
Aβ(1-42)，70％HCOOH：
将1mg Aβ(1-42)溶解在50μl70％HCOOH水溶液中并在室温下搅拌1分钟。在10'000g下离心样品5分钟。收集上清液。根据Bradford’s法(BIO-RAD)测定上清液中的Aβ(1-42)浓度。
5分钟样品：
用20mM NaH2PO4，140mM NaCl，pH 7.4将2μl溶于70％HCOOH中的Aβ(1-42)稀释至0.2mg/ml的Aβ(1-42)浓度并用1M NaOH调至pH 7.4。在室温下温育样品5分钟。然后通过大小排阻层析分析100μl。
1小时样品：
用20mM NaH2PO4，140mM NaCl，pH 7.4将2μl溶于70％HCOOH中的Aβ(1-42)稀释至0.2mg/ml的Aβ(1-42)浓度并用1M NaOH调至pH 7.4。在室温下温育样品1小时。然后通过大小排阻层析分析100μl。
Aβ(1-42)，0.1％NaOH：
将1mg Aβ(1-42)(Bachem，产品目录号H-1368)溶解在500μl 0.1％NaOH水溶液中并在室温下搅拌1分钟。在10'000g下离心样品5分钟。收集上清液。根据Bradford’s法(BIO-RAD)测定上清液中的Aβ(1-42)浓度。
5分钟样品：
用20mM NaH2PO4，，140mM NaCl，pH 7.4将20μl溶于0.1％NaOH中的Aβ(1-42)稀释至0.2mg/ml Aβ(1-42)的浓度。在室温下温育样品5分钟。然后通过大小排阻层析分析100μl。
1小时样品：
用20mM NaH2PO4，，140mM NaCl，pH 7.4将20μl溶于0.1％NaOH中的Aβ(1-42)稀释至0.2mg/ml Aβ(1-42)的浓度。在室温下温育样品1小时。然后通过大小排阻层析分析100μl。
Aβ(1-40)，0.1％NaOH：
将1mg Aβ(1-40)(Bachem，产品目录号H-1194)溶解在500μl 0.1％NaOH水溶液中并在室温下搅拌1分钟。在10’000g下离心样品5分钟。收集上清液。根据Bradford’s法(BIO-RAD)测定上清液中的Aβ(1-42)浓度。
5分钟样品：
用20mM NaH2PO4，，140mM NaCl，pH 7.4将20μl溶于0.1％NaOH中的Aβ(1-40)稀释至0.2mg/ml Aβ(1-40)的浓度。在室温下温育样品5分钟。然后通过大小排阻层析分析100μl。
1小时样品：
用20mM NaH2PO4，，140mM NaCl，pH 7.4将20μl溶于0.1％NaOH中的Aβ(1-40)稀释至0.2mg/ml Aβ(1-40)的浓度。在室温下温育样品1小时。然后通过大小排阻层析分析100μl。
用于大小排阻层析(SEC)的条件：
SEC柱：Superose 12HR 10/300GL(Amersham，产品目录号17-5173-01)
流速：0.5ml/min
送纸：0.2cm/min
在214nm处吸收度：0-0.2吸收单位
流动相：20mM NaH2PO4，140mM NaCl，pH 7.4
结果示于图1中。
由于Aβ肽尤其是Aβ(1-42)单体强烈倾向于聚集成为原纤维，因此制备纯粹的单体Aβ-溶液是一项巨大的挑战工作。尽管如此，为了筛选并鉴定区分Aβ(1-42)-单体和Aβ(1-40)-单体的抗-Aβ(20-42)球聚体，就应当使用最好的技术来获得Aβ-单体制品。这里测试了在20mM NaH2PO4，140mM NaCl，pH 7.4中进一步稀释之后，Aβ肽的初始溶剂对聚集效应的作用。Aβ肽供应商(Bachem)在它们的技术资料中声明Aβ(1-42)应溶解在0.1％NH4OH中。在Aβ(1-42)于中NH4OH溶解并立即在20mM NaH2PO4，140mM NaCl，pH 7.4中进一步1∶10稀释后，在室温(RT)下5分钟，大小排阻层析显示在74kD处具有小峰的Aβ(1-42)聚集为原纤维前体的第一个迹象。单体Aβ(1-42)在11kD主峰以及6kD肩部处流出。在室温(RT)下温育1小时后，溶于NH4OH中的Aβ(1-42)肽已高度聚集为Aβ(1-42)原纤维，导致损失没有进入大小排阻层析柱的可检测的物质。如果使用70％甲酸作为Aβ(1-42)肽的初始溶剂，则在RT下1小时后所发生的高度聚集仅使较小部分的Aβ(1-42)单体留下(注意到在蛋白检测波长处甲酸自身导致高背景吸收)。用于Aβ(1-42)来阻止聚集的最好初始溶剂是0.1％NaOH，其甚至在1小时的温育后都还是溶液化的，并且进一步稀释显示仅有较小部分的聚集的Aβ(1-42)，而大部分的Aβ(1-42)仍然是单体。最初溶解在0.1％NaOH中的Aβ(1-40)甚至在RT下温育1小时后也全然没有显示聚集的迹象。
实施例3：通过Aβ(20-42)球聚体选择性抗体针对Aβ(1-42)原纤维的区分的SDS-PAGE可视化半定量分析
Aβ(1-42)原纤维制品：
在室温下，将1mg Aβ(1-42)(Bachem，产品目录号：H-1368)溶解在500μl 0.1％NH4OH水溶液中并搅拌1分钟。在10'000g下离心样品5分钟。收集上清液。根据Bradford’s法(BIO-RAD)测定上清液中Aβ(1-42)浓度。
将100μl溶于0.1％NH4OH中的Aβ(1-42)与300μl 20mM NaH2PO4，140mM NaCl，pH7.4混合并用2％HCl调至pH 7.4。然后在37℃下温育样品20小时。在样品于10'000g下离心10分钟后。弃去上清液，并将残留物与400μl 20mM NaH2PO4，140mM NaCl，pH 7.4混合，通通过剧烈搅动(“涡旋”)1分钟重悬并在10'000g下离心10分钟。弃去上清液，并将残留物与400μl 20mM NaH2PO4，140mM NaCl，pH 7.4混合，再次通过剧烈搅动(“涡旋”)1分钟重悬并在10'000g下离心10分钟。弃去上清液。将残留物重悬于380μl 20mM NaH2PO4，140mM NaCl，pH 7.4中并通过剧烈搅动(“涡旋”)促进重悬。
抗-Aβ抗体与Aβ(1-42)原纤维的结合：
用160μl 20mM NaH2PO4，140mM NaCl，0.05％Tween 20，pH 7.4稀释40μl Aβ(1-42)原纤维制品并在室温下搅拌5分钟，接着在10’000g下离心样品10分钟。弃去上清液，并将残留物重悬于95μl 20mM NaH2PO4，140mM NaCl，0.05％Tween 20，pH 7.4中。通过剧烈搅动(“涡旋”)促进重悬。
将10μl的原纤维制品等分试样各自与以下混合：
a)10μl 20mM NaH2PO4，140mM NaCl，pH 7.4
b)10μl 0.5μg/μl的5F7，溶于20mM NaH2PO4，140mM NaCl，pH 7.4中
c)10μl 0.5μg/μl的6E10(Signet Nr.：9320)，溶于20mM NaH2PO4，140mM NaCl，pH7.4中
在37℃下温育样品20小时，然后在10'000g下离心10分钟。收集上清液并与20μlSDS-PAGE样品缓冲液混合。将残留物与50μl 20mM NaH2PO4，140mM NaCl，0.025％Tween 20，pH 7.4混合并通过“涡旋”重悬，接着在10’000g下离心样品10分钟。弃去上清液，并将残留物与20μl 20mM NaH2PO4，140mM NaCl，0.025％Tween 20，pH 7.4混合，然后与20μl SDS-PAGE样品缓冲液混合。将样品施加到4-20％Tris/甘氨酸凝胶上进行凝胶电泳。
SDS-PAGE参数：
SDS样品缓冲液：0.3g SDS
4ml 1M Tris/HCl pH 6.8
8ml甘油
1ml 1％溴酚蓝乙醇溶液
用H2O充满至50ml
4-20％Tris/甘氨酸凝胶：(Invitrogen，产品目录号：EC6025BOX)
电泳缓冲液：7.5g Tris
36g甘氨酸
2.5g SDS
用H2O充满至2.51
在20mA的恒定电流下跑凝胶。
凝胶染色：考马斯蓝R250
结果示于图2中。
不同的抗-Aβ抗体的半定量分析及它们的Aβ(1-42)原纤维的区分。抗体位置，Aβ(1-42)原纤维和Aβ(1-42)单体标记在凝胶边缘。鉴于它们的大小，Aβ(1-42)原纤维无法进入SDS-PAGE凝胶并可在凝胶槽中被看见。
1.标记
2.Aβ(1-42)原纤维制品；对照
3.Aβ(1-42)原纤维制品；+mAb 5F7；20h 37℃；上清液
4.Aβ(1-42)原纤维制品；+mAb 5F7；20h 37℃；沉淀
5.Aβ(1-42)原纤维制品；+mAb 6E10；20h 37℃；上清液
6.Aβ(1-42)原纤维制品；+mAb 6E10；20h 37℃；沉淀
通过测定在离心后原纤维结合的(沉淀级分)和上清液级分中抗体重链的光密度(OD)值，由SDS-PAGE分析评价与原纤维型Aβ的相对结合。与Aβ原纤维结合的抗体应当与Aβ-原纤维共沉淀并因此见于沉淀级分中，而非-Aβ-原纤维结合的(游离的)抗体则见于上清液。根据如下公式计算与Aβ-原纤维结合的抗体的百分数：
与Aβ-原纤维结合的抗体的百分数＝
OD原纤维级分x100％/(OD原纤维级分+OD上清液级分).
对mAbs 6E10(Signet，产品目录号：9320)、5F7、2F2、6A2、4D10、10F11、3B10、7C6、7E5和10C1进行该操作。
在阿尔茨海默病大脑中，Aβ原纤维是总Aβ肽库的主要成分。通过用抗Aβ-抗体攻击这些原纤维，由于释放出大量Aβ，其随后可增加微出血的危险，因此升高了反面副作用的危险。在用Aβ肽的原纤维聚集物自动免疫接种方法中观察到了增加的微出血危险(Bennett和Holtzman，2005，Neurology，64，10-12；Orgogozo J，Neurology，2003，61,46-54；Schenk等，2004，Curr Opin Immunol，16，599-606)。
与识别AA1-17之间的线性Aβ-表位的市售抗体6E10(Signet 9320)对比，在共沉淀实验中Aβ(20-42)球聚体选择性抗体5F7(与其他Aβ-形式相比，对于Aβ(20-42)球聚体其实际上具有最低的选择性)不与Aβ(1-42)原纤维结合。这表明了在上清液中沉淀步骤后，在与Aβ(1-42)原纤维温育后5F7抗体仍保留且不共沉淀(共沉淀是因为与Aβ(1-42)原纤维结合)的事实。
实施例4：与野生型相比，在用Aβ(1-42)单体(0.1％NH4OH)、Aβ(1-42)球聚体或Aβ(20-42)球聚体自动免疫接种后通过利用物体识别测试分析小鼠的认知性能
在这些实验中，使用了过表达带有点突变的人APP的小鼠。该点突变指氨基酸717(异亮氨酸取代缬氨酸)并已见于伦敦(London)家族中，在该家族中其在60岁前导致AD发作(Mullan等，Nature Genetics 2(1992)340-342)。Leuven创建并首次描述了本文中称为APP/L的转基因小鼠(Moechars等，J.Biol.Chem.274(1999)6483-6492)。在6周龄时对雌性APP/L小鼠进行自动免疫接种。
小鼠腹膜内接受与等量完全弗氏佐剂混合的100μg的溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的Aβ(1-42)单体(0.1％NH4OH)、Aβ(1-42)球聚体或Aβ(20-42)球聚体，接着每隔三周用处于不完全弗氏佐剂中的相同量的抗原加强注射，持续三个月。在整个实验过程中，在相反的昼/夜循环(开始于下午7点的14小时光照/10小时黑暗)中将动物始终保持在标准的条件下。随着实验时间的过去，预计体重增加并且与单独接受PBS/佐剂的对照组没有区别，暗示抗原处理具有良好耐受。
通过如本领域中所描述的物体识别测试检验小鼠在4.5月龄的认知能力(Dewachter等Journal of Neuroscience 22(2002)3445-3453)。为此，让小鼠习惯于活动场所并接着暴露于探测(acquisition)阶段10分钟，在此期间将它们单独置于现含有两个相同元件(大约4cm类似尺寸的蓝色锥体、绿色立方体、黄色圆柱体)的活动场所中。记录小鼠探测物体的持续时间和频率。在记忆阶段期间，2.5小时之后，将小鼠送回除已知物体之外现含有随机选自其他物体的未知物体的活动场所中。对新物体的识别记录为相对于总时间(探测旧和新的物体)的小鼠探测旧物体过程中的时间。“识别指数(recognitionindex)”表达了这种关系(用于新物体的时间/总时间)。没有记住已知物体的小鼠被认为是其对新物体同样感兴趣并花费同样的时间探测，换句话说，具有50％的识别指数。记住已知物体的小鼠被认为是不一样感兴趣的并因此具有明显更高的识别指数。已知APP/L小鼠在4.5月龄是认知缺陷的，并具有在随机水平(即50％)尺度内的识别指数。
结果示于图3中。
在小鼠中进行物体识别测试。该测试报告了根据在10分钟测试阶段期间的探测行为所测定的与未知物体相比对已知物体的识别。识别指数定义为相对于花费在探测两种物体上的时间，小鼠花费在探测未知物体上的时间百分比。在测试阶段前3小时，在10分钟探测阶段期间将已知物体暴露于小鼠。比较了五组小鼠(在条柱下给出了编号n)。正常的C57B1/6小鼠(野生型)显示与随机水平(50％，即花费在已知和未知物体上探测时间相等)高的RI显著差异(***＝p＜0.001；学生氏t-检验)。其他四组APP转基因小鼠在三个月前经历了自动免疫接种。所使用的免疫原为Aβ(1-42)单体、Aβ(1-42)球聚体和Aβ(20-42)球聚体。磷酸盐缓冲盐水(PBS)用作对照。在PBS和其他组之间的显著差异表示为圆圈：○＝p＜0.05；○○＝p＜0.01(在ANOVA中p＜0.05后，事后t-检验)。
与非转基因小鼠相比，已知APP/L小鼠在4.5月龄时表现出认知缺陷，评分结果接近于随机水平(即50％识别指数)。事实上，与非转基因小鼠(野生型)相比，PBS处理的小鼠显示了随机的行为。在APP/L小鼠中用天然Aβ(1-42)球聚体以及Aβ(20-42)球聚体免疫接种产生显著改善的物体识别。
因为在APP转基因动物中两种球聚体制品(天然和截短的)都产生了记忆改善，甚至在用Aβ(20-42)球聚体处理的动物中产生了非常良好的识别，因此有理由去推定针对截短的Aβ(20-42)球聚体的抗体诱导会产生最好的结果，并且使用与该物质具有反应特异性的抗体进行被动免疫接种代表了治疗的最优策略。
实施例5：在用Aβ(20-42)球聚体自动免疫接种APP/L Tg小鼠后，针对不同Aβ-形式的抗体谱的斑点印迹分析
在用不同形式的Aβ免疫接种APP/L小鼠(Moechars等，1999，J.Biol.Chem.274，6483-6492)(参考实施例4)后，评价血浆样品抗-Aβ抗体。为此，在补充有0.2mg/ml BSA的PBS中制备了范围在100pmol/μl-0.01pmol/μl的单一Aβ(1-42)形式的连续稀释物。将1μl的每种样品印在硝酸纤维膜上。为了检测使用了相应的小鼠血浆样品(1∶400稀释的)。使用缀合碱性磷酸酶的抗-小鼠-IgG和染色剂NBT/BCIP进行免疫染色。
用于斑点印迹的Aβ-标准样品：
1.Aβ(1-42)球聚体
Aβ(1-42)球聚体制品描述于实施例1a中。
2.HFIP预处理的Aβ(1-42)单体，溶于Pluronic F68中
在1.7ml Eppendorff管中将3mg Aβ(1-42)(Bachem Inc.；产品目录号H-1368)溶解于0.5ml HFIP(6mg/ml悬浮液)中并在37℃下振荡(Eppendorff热混合器，1400rpm)1.5小时直至获得澄清溶液。在SpeedVac浓缩器中干燥样品(1.5小时)并重悬于13.2μl DMSO中，振荡10秒，接着超声处理(20秒)，并振荡(如在Eppendorff热混合器中，1400rpm)10分钟。添加6ml 20mM NaH2PO4；140mM NaCl；0.1％Pluronic F68；pH 7.4并在室温下搅拌1小时。在3000g下离心样品20分钟。弃去上清液并将沉淀溶解在0.6ml 20mM NaH2PO4；140mM NaCl；1％Pluronic F68，pH 7.4中。添加3.4ml H2O并在室温下搅拌1小时，然后在3000g下离心20分钟。将8份等分试样(每份0.5ml上清液)贮藏在-20°下供进一步使用。
3.Aβ(20-42)球聚体
Aβ(20-42)球聚体制品描述于实施例1c中。
4.Aβ(12-42)球聚体
Aβ(12-42)球聚体制品描述于实施例1d中。
5.HFIP预处理的Aβ(1-40)单体，5mM溶于DMSO中
在Eppendorff管中将1mg Aβ(1-40)(Bachem Inc，产品目录号H-1194)悬浮于0.25ml HFIP中(4mg/ml悬浮液)。在37℃下振荡该管(如在Eppendorff热混合器中，1400rpm)1.5小时以获得澄清溶液，然后在speed vac浓缩器中干燥(1.5小时)。将样品重溶于46μl DMSO中(21.7mg/ml溶液＝5mM)，振荡10秒并接着超声处理20秒。在10分钟振荡(如在Eppendorff热混合器中，1400rpm)后将样品贮藏在-20℃下供进一步使用。
6.Aβ(1-42)单体，0.1％NH4OH
将1mg Aβ(1-42)(Bachem Inc.，产品目录号H-1368)溶解于0.5ml 0.1％NH4OH水溶液(新鲜配制的)中(＝2mg/ml)并立即在室温下振荡30秒以得到澄清溶液。将样品贮藏在-20℃下供进一步使用。
7.Aβ(1-42)原纤维
将1mg Aβ(1-42)(Bachem Inc.产品目录号H-1368)溶解于500μl 0.1％NH4OH水溶液中(Eppendorff管)并在室温下搅拌样品1分钟。用300μl 20mM NaH2PO4；140mM NaCl，pH7.4中和100μl该新鲜配制的Aβ(1-42)溶液。用1％HCl调pH至pH 7.4。在37℃下温育样品24小时并离心(在10000g下，10分钟)。弃去上清液并通过涡旋1分钟用400μl 20mM NaH2PO4；140mM NaCl，pH 7.4重悬原纤维沉淀。
8.sAPPα
来自于Sigma(产品目录号S9564；25μg溶于20mM NaH2PO4；140mM NaCl；pH 7.4中)。用20mM NaH2PO4，140mM NaCl，pH 7.4，0.2mg/ml BSA稀释sAPPα至0.1mg/ml(＝1pmol/μl)。
用于斑点印迹的材料：
Aβ-标准样品：
溶于20mM NaH2PO4，140mM NaCl，pH 7.4+0.2mg/ml BSA中的Aβ抗原的连续稀释
1)100pmol/μl
2)10pmol/μl
3)1pmol/μl
4)0,1pmol/μl
5)0,01pmol/μl
硝酸纤维素：
电转移印迹(Trans-Blot)转移介质，清洁的硝酸纤维膜(0.45μm)；BIO-RAD
抗-小鼠-AP：
AQ330A(Chemicon)
检测试剂：
NBT/BCIP片(Roche)
牛血清白蛋白(BSA)：
A-7888(SIGMA)
封闭试剂：
5％低脂乳TBS溶液
缓冲溶液：
TBS
25mM Tris/HCl-缓冲液pH 7.5
+150mM NaCl
TTBS
25mM Tris/HCl-缓冲液pH 7.5
+150mM NaCl
+0.05％Tween 20
PBS+0.2mg/ml BSA
20mM NaH2PO4缓冲液pH 7.4
+140mM NaCl
+0.2mg/ml BSA
抗体溶液I：
来自用Aβ(20-42)球聚体进行的自动免疫接种研究的小鼠血浆样品(在20ml 1％低脂乳TBS溶液中以1∶400稀释的)
抗体溶液II：
1∶5000稀释
抗-小鼠-AP，溶于1％低脂乳TBS溶液
斑点印迹步骤：
1)将1μl每种不同的Aβ-标准样品(在它们的5倍连续稀释中)印在硝酸纤维膜上，彼此相距大约1cm。
2)在室温(RT)下，风干硝酸纤维膜上的Aβ-标准样品斑点至少10分钟(＝斑点印迹)
3)封闭：
在RT下用30ml 5％低脂乳TBS溶液温育斑点印迹1.5小时。
4)洗涤：
弃去封闭溶液并在RT下用20ml TTBS振荡温育斑点印迹10分钟。
5)抗体溶液I：
弃去洗涤缓冲液并在RT下用抗体溶液I温育斑点印迹过夜。
6)洗涤：
弃去抗体溶液I并在RT下用20ml TTBS振荡温育斑点印迹10分钟。弃去洗涤溶液并在RT下用20ml TTBS振荡温育斑点印迹10分钟。弃去洗涤溶液并在RT下用20ml TBS振荡温育斑点印迹10分钟。
7)抗体溶液II：
弃去洗涤缓冲液并在RT下用抗体溶液II温育斑点印迹1小时。
8)洗涤：
弃去抗体溶液II并在RT下用20ml TTBS振荡温育斑点印迹10分钟。弃去洗涤溶液并在RT下用20ml TTBS振荡温育斑点印迹10分钟。弃去洗涤溶液并在RT下用20ml TBS振荡温育斑点印迹10分钟。
9)显影：
弃去洗涤溶液。将1片NBT/BCIP溶解在20ml H2O中并用该溶液温育斑点印迹5分钟。通过用H2O彻底洗涤终止显影。
结果示于图4中。
对用Aβ(20-42)球聚体自动免疫接种小鼠后所产生的抗-Aβ抗体进行斑点印迹分析以评价它们对不同形式的Aβ的特异性。将单个形式的Aβ以连续稀释形式印在膜上并与含有在免疫反应过程中产生的抗Aβ-抗体的相应的小鼠血浆温育。单个斑点印迹相应于不同的免疫小鼠个体。
1.Aβ(1-42)球聚体
2.Aβ(1-42)单体，HFIP预处理的，溶于0.1％Pluronic F68中
3.Aβ(20-42)球聚体
4.Aβ(12-42)球聚体
5.Aβ(1-40)单体，HFIP预处理的，5mM DMSO溶液
6.Aβ(1-42)单体，0.1％NH4OH
7.Aβ(1-42)原纤维制品
8.sAPPα(Sigma)；(第一斑点：1pmol)
在APP/L Tg-小鼠的自动免疫接种研究中，显示与PBS处理的相比，在缓解这些小鼠认知缺陷中用Aβ(20-42)球聚体免疫接种产生了最好的结果。来自用Aβ(20-42)球聚体自动免疫接种后的APP/L Tg小鼠的血浆样品具有类似于本文中所请求保护的Aβ(20-42)球聚体mAbs的抗体谱(主要识别Aβ(20-42)球聚体和Aβ(12-42)球聚体)。
实施例6：用Aβ(1-42)单体、Aβ(1-42)球聚体、Aβ(20-42)球聚体或作为对照的载体自动免疫接种的APP/PS1 Tg小鼠的脑提取物中可溶性和不溶性Aβ(1-42)和Aβ(1-40)肽的浓度
对于该研究，使用了40只4月龄的雌性小鼠(在FVBxC57Bl/6J背景中的阿尔茨海默病双转基因小鼠模型(APP/PS1 Tg小鼠))。APP/PS1 Tg小鼠含有来自带有V717I(位置指的是最长的APP-同种型)突变的人APP的695个氨基酸以及另外的带有A264E突变的人衰老蛋白1基因。这两个基因都处于Thy1启动子控制下。在reMYND，the Experimental GeneticsGroup，Campus Gasthuisberg，Catholic University Leuven的一间基础实验室中，由FredVan Leuven教授等繁殖并鉴定小鼠。
将所有3周龄小鼠通过聚合酶链反应(PCR)进行基因分型，一旦知道PCR结果，就给予唯一的身份编号。
小鼠能自由接触预过滤和无菌的水(UV-灯)及标准的鼠食。在干冷环境下将食品贮藏在通风良好的储藏室中。每日检查一次水和食品的量，需要时补充，设定每周更新两次。
在反昼夜节律下：下午7点开始的14小时光照/10小时黑暗，让小鼠住在标准的RVST2型金属笼子(面积540cm2)中。笼子装备有硬地板和作为被褥的干草层。根据动物福利法规限制每只笼子的小鼠数量。在行为测试开始前5天，将小鼠转移到macrolon 2型笼子并运输到实验室，以便适应实验室环境准备行为测试。
小鼠腹膜内接受与等量完全弗氏佐剂混合的100μg的溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的Aβ(1-42)单体(0.1％NH4OH)、Aβ(1-42)球聚体或Aβ(20-42)球聚体，接着每隔三周用处于不完全弗氏佐剂中的相同量的抗原加强注射，持续4个月。
生物化学
通过ELISA测定1个半球可溶性级分中的Aβ(1-40)和Aβ(1-42)。此外，通过ELISA测定1个半球不溶性膜级分的Aβ(1-40)和Aβ(1-42)。
用盐氯胺酮(Ketalar)(开他敏)、甲苯噻嗪(Rompun)(2％甲苯噻嗪)和阿托品的2∶1∶1混合物麻醉小鼠并在4℃下经贲门用生理性血清冲洗。进行该冲洗以从脑血管中除去血液，该操作不影响器官完整性。
经颅骨和第一颈椎骨之间的颈肌肉中切口收集脑脊液(CSF)。使用26号计量注射针进行小脑延髓池穿刺并用细玻璃吸管收集10-20μl CSF。
通过心脏穿刺和1ml注射器将血液收集在肝素包被的Eppendorf管中。在4℃下以14.000rpm离心血液5分钟。将血清贮藏在-70℃下。
在4℃下经贲门用生理性血清冲洗小鼠。
将脑与颅骨分离，并通过冠状面/额面切割分离后脑和前脑。弃去小脑。通过使用中线矢状切割将前脑平分为左半球和右半球。
将一个半球立即浸入液氮中并贮藏在-70℃下直至生物化学分析。
一个脑半球的匀浆和分级分离
使用Potter、玻璃管(无去污剂，2cm3)和机械匀浆器(650rpm)进行脑匀浆。6,5x1/2脑重量体积的新鲜配制的含蛋白酶抑制剂(每50ml Tris/HCl缓冲液1片，CompleteTM，Roche，Mannheim，Germany)的20mM Tris/HCl缓冲液(pH 8.5)用作为匀浆缓冲液。
将样品从-70℃中转移到带液氮的样品容器中，并在匀浆前通过在工作台上温育几秒钟预热每一样品。将匀浆收集在Beckman离心管TLX中并在离心前在冰上冷却。在两种样品之间，用无去污剂的蒸馏水(AD)仔细漂洗Potter和玻璃管并用吸水纸干燥。
在4℃下以48000rpm(135.000x g)在预冷的超速离心机(Beckman，Mannheim，Germany)中离心样品1小时20分钟。由于有限数量的离心机支架(N＝8)，通过脑重量来分类样品(以平衡离心机)并随机打乱，以便在不同的离心时间上分成不同的处理组。
将上清液(含有分泌的APP和淀粉状蛋白肽的可溶性级分)与沉淀(在年老小鼠的情况下，含有膜结合APP-片段和斑有关的淀粉状蛋白肽的膜级分)分离。将上清液分成两管，其中一管贮藏在-20℃下备用，另一管进行进一步的柱层析处理以浓缩淀粉状蛋白肽。
脑重量、使用的Tris/HCl缓冲液体积、离心时间(通过颜色标记)和用于柱层析的可溶性级分体积在作为例证的下表中给出。
将小的反相柱(C18-Sep-Pack Vac 3cc柱体，Waters，Massachusetts，MA)安装在真空系统上并用溶于0.1％三氟乙酸中的80％乙腈(A-TFA)洗涤，接着用0.1％TFA洗涤两次。然后将样品施加到柱子上并用依次5％和25％A-TFA洗涤。用75％A-TFA洗脱淀粉状蛋白肽并在冰上将洗脱液收集于2ml管中。在SpeedVac浓缩器(Savant，Farmingdale，NY)中冷冻干燥洗脱液过夜，并重溶于330μl ELISA试剂盒提供的样品稀释剂中。
将沉淀进一步分级成不同的膜级分：膜级分A(MFA)、含全长APP的膜级分B(MFB)和含斑有关的淀粉状蛋白的膜级分C(MFC)。因此，将沉淀溶解于含蛋白酶抑制剂(每50ml TBS缓冲液1片，CompleteTM，Roche，Mannheim，Germany)的TBS缓冲液中，并将MFA分成两管，其中一管贮藏在-20℃下备用。添加溶于含蛋白酶抑制剂的TBS中的NP40(2％终体积)和TritonX-100(2％终体积)进一步处理60％的MFA，并使用水平(swing-out)转子(SW60)，在4℃下于Beckman超速离心机中以27.000rpm(98'000x g)离心1小时。将上清液(MFB)与沉淀(MFC)相分离并都贮藏在-20℃下。
脑重量、60％的脑重量、使用的TBS+PI+NP40+Triton X-100缓冲液体积以及离心时间(通过颜色标记)在作为例证的下表中给出。
在一个半球的可溶性级分中的人Aβ的ELISA
为定量脑匀浆的可溶性级分和/或脑脊液(CSF)中人Aβ(1-40)和人Aβ(1-42)的量，使用市售酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(人淀粉状蛋白β40或β42 ELISA高灵敏度的，The Genetics Company，Zurich，Switzerland)。根据厂商实验方案进行ELISA。简言之，在没有蛋白结合能力的96-孔聚丙烯平板(Greiner bio-one，Frickenhausen，Germany)中制备标准样品(合成的Aβ(1-40)或Aβ(1-42)的稀释物)和样品。在ELISA试剂盒提供的样品稀释剂中制备具有1000、500、250、125、62.5、31.3和15.6pg/ml终浓度的标准样品稀释物和样品至60μl的终体积。由于淀粉状蛋白水平随小鼠年龄而增加，以及实际评价需要样品读数处于标准曲线的线性部分中，因此用于Aβ(1-40)分析的样品1：3稀释，用于Aβ(1-42)分析的样品1：6稀释。
将样品、标准样品和空白(50μl)添加到抗-Aβ-包被的聚苯乙烯平板上(捕捉选择性识别抗原C-末端的抗体)，此外该平板还带有选择性抗-Aβ-抗体缀合物(生物素化的检测抗体)，并在4℃下温育过夜，以便使得抗体-淀粉状蛋白-抗体复合物形成。第二天，添加链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶-缀合物，30分钟后添加TMB/过氧化物混合物，使底物转变为有色产物。通过添加硫酸(1M)停止该反应并通过利用带450nm滤光片的酶标仪进行光度测定从而测定颜色强度。通过与使用合成的Aβ(1-40)或Aβ(1-42)制备的标准曲线比较吸光度获得样品Aβ含量的定量。
在一个半球的不溶性级分中的人Aβ的ELISA
为定量脑匀浆的不溶性膜级分中人Aβ(1-40)和人Aβ(1-42)的量，对MFC样品进行进一步处理并溶于8M胍80mM Tris/HCl溶液中。然后在25℃下于热混合器(thermomixer)中温育样品3小时并每小时用100μl移液管往复吸液以将MFC沉淀溶解入胍缓冲液中。最后，在4000rpm下离心样品仅1分钟以除去碎屑。
脑重量，MFC沉淀重量以及8M胍缓冲液体积在作为例证的下表中给出。
为定量最终样品中人Aβ(1-40)和人Aβ(1-42)的量，使用了市售酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(人淀粉状蛋白β40或β42 ELISA高灵敏度的，The Genetics Company，Zurich，Switzerland)。除标准样品(合成的Aβ(1-40)or Aβ(1-42)的稀释物)制备之外，根据厂商实验方案进行ELISA。在ELISA试剂盒提供的样品稀释剂中制备样品至60μl的终体积。由于胍影响了标准曲线的OD-值，因此在与样品具有相同浓度的胍的样品稀释剂中制备终浓度1000、500、250、125、62.5、31.3和15.6pg/ml的标准稀释物。其在没有蛋白结合能力的96-孔聚丙烯平板(Greiner bio-one，Frickenhausen，Germany)中进行。
由于淀粉状蛋白水平随小鼠年龄而增加，以及实际评价需要样品读数处于标准曲线的线性部分中，因此用于不溶性Aβ(1-40)和不溶性Aβ(1-42)分析的样品1∶500稀释。
将样品、标准样品和空白(50μl)添加到抗-Aβ-包被的聚苯乙烯平板上(捕捉选择性识别抗原C-末端的抗体)，此外该平板还带有选择性抗-Aβ-抗体缀合物(生物素化的检测抗体)，并在4℃下温育过夜，以便使得抗体-淀粉状蛋白-抗体复合物形成。第二天，添加链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶-缀合物，30分钟后添加TMB/过氧化物混合物，使底物转变为有色产物。通过添加硫酸(1M)停止该反应并通过利用带450nm滤光片的酶标仪进行光度测定从而测定颜色强度。通过与使用合成的Aβ(1-40)或Aβ(1-42)制备的标准曲线比较吸光度获得样品Aβ含量的定量。
结果示于图5中。
用Aβ(1-42)单体(0.1％NH4OH)、Aβ(1-42)球聚体、Aβ(20-42)球聚体或作为对照的载体自动免疫接种的APP/PS1 Tg-小鼠的脑提取物中可溶性和不溶性Aβ(1-42)和Aβ(1-40)肽的浓度。
在用Aβ(20-42)球聚体自动免疫接种的APP/PS1 Tg-小鼠脑提取物的可溶性和不溶性级分中，Aβ(1-40)-和Aβ(1-42)-肽的水平与载体对照没有显著差异。与此相反，用Aβ(1-42)球聚体和Aβ(1-42)单体免疫接种导致脑Aβ(1-40)-和Aβ(1-42)水平的减。这表明Aβ(20-42)球聚体直接免疫接种方法不会显著改变总的Aβ-脑水平，但尽管如此还是能有效地缓解Aβ-肽有关的认知缺陷(参见实施例4)。
实施例7：在用抗-Aβ(20-42)球聚体抗体被动免疫接种后，通过物体识别测试分析APP/L转基因小鼠认知性能
在这些实验中，使用了过表达带有点突变的人APP的小鼠。该点突变指氨基酸717(异亮氨酸取代了缬氨酸)并已见于伦敦(London)家族中，在该家族中其在60岁前导致AD发作(Mullan等，Nature Genetics 2(1992)340-342)。在此称为APP/L的转基因小鼠为Leuven所创建并首次描述(Moechars等，J.Biol.Chem.274(1999)6483-6492)。对3月龄的雌性APP/L小鼠进行被动免疫接种。小鼠接受溶于100μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的250μg的任何一种的单克隆小鼠抗体5F7、10F11或7C6。在整个实验过程中，在相反的昼/夜循环(开始于下午7点的14小时光照/10小时黑暗)中将动物始终保持在标准的条件下。它们很好地耐受了被动免疫接种，没有任何不利效应的病征。
在第三次注射(实验的第15天)后，通过如本领域中所描述的物体识别测试(Dewachter等Journal of Neuroscience 22(2002)3445-3453)检验小鼠的认知能力。为此，让小鼠习惯于活动场所并接着暴露于探测(acquisition)阶段10分钟，在此期间将它们单独置于现含有两个相同元件(大约4cm类似尺寸的绿色立方体或橙色圆柱体)的活动场所中。记录小鼠探测物体的持续时间和频率。在记忆阶段期间，2.5小时之后，将小鼠送回除已知物体之外现含有其他物体的活动场所中。对新物体的识别记录为相对于总时间(探测旧和新的物体)的小鼠探测旧物体过程中的时间。“识别指数(recognition index)”表达了这种关系(用于新物体的时间/总时间)。没有记住已知物体的小鼠被认为是其对新物体同样感兴趣并花费同样的时间探测，换句话说，具有50％的识别指数。记住已知物体的小鼠被认为是不一样感兴趣的并因此具有明显更高的识别指数。已知APP/L小鼠在4.5月龄是认知缺陷的，并具有在随机水平(即50％)尺度内的识别指数。
结果示于图6中。
在小鼠中进行物体识别测试。该测试报告了根据在10分钟测试阶段期间的探测行为所测定的与未知物体相比对已知物体的识别。识别指数定义为相对于花费在探测两种物体上的时间，小鼠花费在探测未知物体上的时间百分比。在测试阶段前2.5小时，在10分钟探测阶段期间将已知物体暴露于小鼠。
a)通过腹膜内注射250μg抗体5F7(n＝9)、抗体10F11(n＝11)或抗体7C6(n＝11)免疫APP转基因小鼠，每周一次，持续三周；对照动物接受PBS(n＝6)。与随机水平(50％，即花费在探测已知和未知物体上的时间是相等的)显著差异表示为星号。*＝p＜0.05(t-检验)
b)比较所有用抗体(5F7、10F11和7C6；(n＝31))处理的小鼠和用磷酸盐缓冲盐水(PBS；n＝6)处理的小鼠。抗体处理组的RI与随机水平显著差异(**＝P＜0.01；t-检验)。
已知APP/L小鼠在4.5月龄是认知缺陷的，并具有在随机水平(即50％)尺度内的识别指数。
实际上，PBS-处理的小鼠显示了随机行为。用所有三种抗体(5F7、10F11和7C6)被动免疫接种导致了显著增加的识别指数。当作为混合组与对照相比时，识别指数显著增加。在给予所有三种抗体后对APP/L小鼠的记忆性能的该有益效果暗示针对截短的Aβ(20-42)球聚体的抗体足以实现认知改善。
实施例8：抗-Aβ(20-42)球聚体抗体选择性的斑点印迹谱
为了表征单克隆抗Aβ(20-42)球聚体抗体的选择性，探查它们与不同的Aβ-形式的识别。为此，在补充有0.2mg/ml BSA的PBS中制备了范围在100pmol/μl-0.01pmol/μl的单一Aβ(1-42)形式的连续稀释。将1μl的每种样品印在硝酸纤维膜上。为了检测使用了相应的抗体(O.2μg/ml)。使用缀合过氧化物酶的抗-小鼠-IgG和染色剂BM Blue POD底物(Roche)进行免疫染色。
用于斑点印迹的Aβ-标准样品：
1.Aβ(1-42)单体，0.1％NH4OH
将1mg Aβ(1-42)(Bachem Inc.，产品目录号H-1368)溶解于0.5ml 0.1％NH4OH水溶液(新鲜配制的)中(＝2mg/ml)并立即在室温下振荡30秒以得到澄清溶液。将样品贮藏在-20℃下供进一步使用。
2.Aβ(1-40)单体，0.1％NH4OH
将1mg Aβ(1-40)(Bachem Inc.，产品目录号H-1368)溶解于0.5ml 0.1％NH4OH水溶液(新鲜配制的)中(＝2mg/ml)并立即在室温下振荡30秒以得到澄清溶液。将样品贮藏在-20℃下供进一步使用。
3.Aβ(1-42)单体，0.1％NaOH
将2.5mg Aβ(1-42)(Bachem Inc.，产品目录号H-1368)溶解于0.5ml 0.1％NaOH水溶液(新制备的)中(＝5mg/ml)并立即在室温下振荡30秒以获得澄清溶液。将样品贮藏在-20℃下供进一步使用。
4.Aβ(1-40)单体，0.1％NaOH
将2.5mg Aβ(1-40)(Bachem Inc.，产品目录号H-1368)溶解于0.5ml 0.1％NaOH水溶液(新制备的)中(＝5mg/ml)并立即在室温下振荡30秒以获得澄清溶液。将样品贮藏在-20℃下供进一步使用。
5.Aβ(1-42)球聚体
Aβ(1-42)球聚体制品描述于实施例1a中。
6.Aβ(12-42)球聚体
Aβ(12-42)球聚体制品描述于实施例1d中。
7.Aβ(20-42)球聚体
Aβ(20-42)球聚体制品描述于实施例1c中。
8.Aβ(1-42)原纤维
将1mg Aβ(1-42)(Bachem Inc.产品目录号H-1368)溶解于500μl 0.1％NH4OH水溶液中(Eppendorff管)并在室温下搅拌样品1分钟。用300μl 20mM NaH2PO4；140mM NaCl，pH7.4中和100μl该新鲜配制的Aβ(1-42)溶液。用1％HCl调pH至pH 7.4。在37℃下温育样品24小时并离心(在10000g下，10分钟)。弃去上清液并通过涡旋1分钟用400μl 20mM NaH2PO4；140mM NaCl，pH 7.4重悬原纤维沉淀。
9.sAPPα
来自于Sigma(产品目录号S9564；25μg溶于20mM NaH2PO4；140mM NaCl；pH 7.4中)。用20mM NaH2PO4，140mM NaCl，pH 7.4，0.2mg/ml BSA稀释sAPPα至0.1mg/ml(＝1pmol/μl)。
用于斑点印迹的材料：
Aβ-标准样品：
溶于20mM NaH2PO4，140mM NaCl，pH 7.4+0.2mg/ml BSA中的Aβ抗原的连续稀释
1)100pmol/μl
2)10pmol/μl
3)1pmol/μl
4)0,1pmol/μl
5)0,01pmol/μl
硝酸纤维素：
电转移印迹(Trans-Blot)转移介质，清洁的硝酸纤维膜(0.45μm)；BIO-RAD
抗-小鼠-POD：
产品目录号：715-035-150(Jackson Immuno Research)
检测试剂：
BM Blue POD底物，沉淀的(Roche)
牛血清白蛋白，(BSA)：
产品目录号：A-7888(SIGMA)
封闭试剂：
5％低脂乳TBS溶液
缓冲溶液：
TBS
25mM Tris/HCl缓冲液pH 7.5
+150mM NaCl
TTBS
25mM Tris/HCl-缓冲液pH 7.5
+150mM NaCl
+0.05％Tween 20
PBS+0.2mg/ml BSA
20mM NaH2PO4缓冲液pH 7.4
+140mM NaCl
+0.2mg/ml BSA
抗体溶液I：
在20ml 1％低脂乳TBS溶液中稀释的0.2μg/ml抗体
抗体溶液II：
1∶5000稀释
抗-小鼠-POD，溶于1％低脂乳TBS溶液
斑点印迹步骤：
1)将1μl每种不同的Aβ-标准样品(在它们的5倍连续稀释中)印在硝酸纤维膜上，彼此相距大约1cm。
2)在室温(RT)下，风干硝酸纤维膜上的Aβ-标准样品斑点至少10分钟(＝斑点印迹)
3)封闭：
在RT下用30ml 5％低脂乳TBS溶液温育斑点印迹1.5小时。
4)洗涤：
弃去封闭溶液并在RT下用20ml TTBS振荡温育斑点印迹10分钟。
5)抗体溶液I：
弃去洗涤缓冲液并在RT下用抗体溶液I温育斑点印迹2小时。
6)洗涤：
弃去抗体溶液I并在RT下用20ml TTBS振荡温育斑点印迹10分钟。弃去洗涤溶液并在RT下用20ml TTBS振荡温育斑点印迹10分钟。弃去洗涤溶液并在RT下用20ml TBS振荡温育斑点印迹10分钟。
7)抗体溶液II：
弃去洗涤缓冲液并在RT下用抗体溶液II温育斑点印迹过夜。
8)洗涤：
弃去抗体溶液II并在RT下用20ml TTBS振荡温育斑点印迹10分钟。弃去洗涤溶液并在RT下用20ml TTBS振荡温育斑点印迹10分钟。弃去洗涤溶液并在RT下用20ml TBS振荡温育斑点印迹10分钟。
9)显影：
弃去洗涤溶液。用10 ml BM Blue POD底物显影斑点印迹10分钟。通过用H2O彻底洗涤斑点印迹终止显影。使用光密度分析(GS800光密度计(BioRad)和软件包Quantityone，4.5.0版(BioRad))进行斑点强度的定量评价。只有具有较在最终光学上清楚鉴定的Aβ(20-42)球聚体斑点的相对密度大20％的相对密度的斑点得到评价。对每一斑点印迹独立测定该阈值。该计算值指示对于给定的抗体在识别Aβ(20-42)球聚体和相应的Aβ形式之间的关系。
结果示于图7中。
对不同的抗-Aβ抗体(6E10、5F7、4B7、10F11、6A2、4D10、2F2；3B10、7C6、7E5、10C1)针对不同形式的Aβ的特异性进行斑点印迹分析。通过用Aβ(20-42)球聚体自动免疫接种小鼠，然后通过选择融合的杂交瘤细胞，获得所测试的单克隆抗体(除6E10外)。将单个Aβ形式连续稀释并与相应的单克隆抗体温育用于免疫反应。
1.Aβ(1-42)单体，0.1％NH4OH
2.Aβ(1-40)单体，0.1％NH4OH
3.Aβ(1-42)单体，0.1％NaOH
4.Aβ(1-40)单体，0.1％NaOH
5.Aβ(1-42)球聚体
6.Aβ(12-42)球聚体
7.Aβ(20-42)球聚体
8.Aβ(1-42)原纤维制品
9.sAPPa(Sigma)；(第一斑点：1pmol)
就区分Aβ(1-42)球聚体和Aβ(12-42)球聚体而论，抗Aβ(20-42)球聚体选择性mAbs可分为三类。第一类包括抗体6A2、5F7和2F2，优先识别Aβ(20-42)球聚体并在某种程度上识别Aβ(1-42)球聚体(以及Aβ(12-42)球聚体)。第二类包括抗体10F11、4D10和3B10，优先识别Aβ(20-42)球聚体，还识别Aβ(12-42)球聚体，但在较小程度上且并不明显识别Aβ(1-42)球聚体。第三类包括抗体7C6、4B7、7E5和10C1，识别Aβ(20-42)球聚体，但没有显示对其他Aβ球聚体的明显识别。所有三类都不明显识别单体Aβ(1-42)、单体Aβ(1-40)、Aβ(1-42)原纤维或sAPPα。
在被动免疫接种中抗-Aβ(20-42)球聚体抗体的选择性谱显示了明显升高的识别指数(在图6中)，主要是归因于选择性识别截短的Aβ(20-42)球聚体和Aβ(12-42)球聚体，和很小程度的识别Aβ(1-42)球聚体以及不识别单体Aβ(1-42)、单体Aβ(1-40)、Aβ(1-42)原纤维或sAPPα。
实施例9：Aβ(20-42)选择性抗体与原纤维状Aβ肽(在老的TG2576小鼠中以Aβ斑形式存在的和在脑膜血管中以Aβ淀粉状蛋白形式存在的)特异性反应的原位分析
对于这些实验，使用了19月龄的TG2576小鼠(Hsiao等，1996，Science；274(5284)，99-102)或9月龄的APP/LxPS1小鼠(描述如上；ReMYND，Leuven，Belgium)的脑材料或两位阿尔茨海默病患者(RZ16和RZ55；获得自BrainNet，Munich)的尸体解剖材料。小鼠过表达带有所谓的瑞典人突变(K670N/M671L；Tg2576)或所谓的伦敦人突变(V717I)的人APP，此外还过表达带有A264E突变的人衰老蛋白1基因(APP/LxPS1)，并且在约7-11月龄时在脑实质中形成β淀粉状蛋白沉积物，在约18月龄时在较大的大脑血管中形成β淀粉状蛋白沉积物(Tg2576)。将动物深度麻醉并经颈动脉灌注0.1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)以冲洗血液。然后颅骨上取下脑并纵向分开。迅速冷冻脑的一个半球，另一个半球则通过浸没于4％多聚甲醛中进行固定。通过吸入30％蔗糖PBS溶液低温保护浸没固定的半球并安装在冷冻切片机上。对完整的前脑切40μm切片，收集于PBS中并用于随后的染色步骤。人脑材料是一约1cm3的深度冻结的新皮质块。将一小部分的块浸没固定于4％多聚甲醛中并像小鼠脑材料一样进行进一步处理。
使用如下实验方案用刚果红染色单个切片：
材料：
-淀粉状蛋白染料刚果红试剂盒(Sigma-Aldrich；HT-60)，由含乙醇的NaCl溶液、NaOH溶液和刚果红溶液组成
-染色比色皿
-显微镜载玻片SuperfrostPlus和盖玻片
-乙醇、二甲苯、包埋剂
试剂：
-用NaCl溶液1∶100稀释NaOH产生碱性盐水
-用刚果红溶液1∶100稀释碱性盐水产生碱性刚果红溶液(载使用前15分钟内制备，过滤液)
-将切片固定在载玻片上并使之干燥
-在染色比色皿中温育载玻片，首先在碱性盐水中温育30-40分钟，接着在碱性刚果红溶液中温育30-40分钟
-用新鲜的乙醇漂洗3次并在二甲苯上包埋
首先用Zeiss Axioplan显微镜对染色照相并定性评价。红颜色指示以斑形式存在的和在较大的脑膜血管中的淀粉状蛋白沉积物。这些结果示于图8A中。稍后，评价集中在这些结构的抗体染色。
根据如下实验方案，通过将切片与含0.07-7.0μg/ml相应抗体的溶液温育进行抗体染色：
材料：
-TBST洗涤液(含Tween 20的Tris缓冲盐水；10x浓缩；DakoCytomation；S3306 1∶10溶于重蒸馏水中)
-0.3％H2O2甲醇溶液
-5％驴血清(Serotec)TBST溶液
-在TBST中稀释的单克隆小鼠-抗-球聚体抗体
-第二抗体：生物素化的驴-抗-小鼠抗体(Jackson Immuno；715-065-150；以1∶500稀释于TBST中)
-StreptAB复合物(StreptABComplex)(DakoCytomation；K 0377)
-过氧化物酶底物试剂盒二氨基联苯胺(＝DAB；Vector Laboratories；SK-4100)
-SuperFrost Plus显微镜载玻片和盖玻片
-不含二甲苯的包埋剂(Medite；X-tra Kitt)
方法：
-将浮起的切片转移到冰冷的0.3％H2O2中并温育30分钟
-在TBST缓冲液中洗涤5分钟
-与驴血清/TBST温育20分钟
-在室温下与第一抗体温育24小时
-在TBST缓冲液中洗涤5分钟
-与来自Vectastain Elite ABC过氧化物酶试剂盒的封闭血清温育20分钟
-在TBST缓冲液中洗涤5分钟
-在室温下与第二抗体温育60分钟
-在TBST缓冲液中洗涤5分钟
-在室温下与StreptABComplex温育60分钟
-在TBST缓冲液中洗涤5分钟
-与来自Vectastain Elite ABC过氧化物酶试剂盒的DAB温育20分钟
-将切片固定在载玻片上，风干，用乙醇脱水并包埋
除目视检查染色之外，通过使用ImagePro 5.0图像分析系统从组织学图像上切下10个随机选择的斑块并测定它们的平均灰度值对斑块染色进行额外定量。通过减去来自淀粉状蛋白斑密度的染色物质的平均背景密度，根据灰度值计算光密度值(0％-无斑块染色，上述环境背景，100％-无透射/最大染色)，并且用ANOVA分别检验了对照和抗体之间以及6G1和选择性针对Aβ(20-42)的抗体之间差异的统计显著性。
Tg2576和APP/LxPS1小鼠中染色结果示于图8B-D和H中。
在0.7μg/ml浓度下的不同抗体与19月龄的转基因TG 2576小鼠的新皮质的横向切片的结合：
C)实质Aβ沉积物(淀粉状蛋白斑)仅为6G1和6E10所染色，而不为球聚体选择性抗体(即5F7、2F2、6A2、4D10、10F11、3B10、7C6、7E5和10C1)所染色。
D)与市售抗体6E10和4G8相比，所有球聚体选择性抗体(即5F7、2F2、6A2、4D10、10F11、3B10、7C6、7E5和10C1)都显示明显更少的实质斑块染色。
在0.07-7.0μg/ml浓度下不同抗体与11月龄的转基因APP/LxPS1小鼠的新皮质的横向切片的结合：
E)与球聚体选择性抗体(即5F7、2F2、6A2、4D10、10F11、3B10、7C6、7E5和10C1)相比，实质Aβ沉积物(淀粉状蛋白斑)明显更多并且在更低的浓度下为6G1、6E10和4G8所染色。
在这之前已通过嗜刚果红染色验证了所有的淀粉状蛋白沉积物(刚果红；参见图8A)。条带＝100μm。
对褐色DAB沉积物的评价显示Aβ-无选择性6G1和6E10抗体染色斑块和脑膜血管，而Aβ(20-42)球聚体选择性抗体5F7、2F2、6A2、4D10、10F11、3B10、7C6、7E5和10C1则没有染色。该发现证实了这些抗体与Aβ原纤维或其他存在于体内淀粉状蛋白结构中的Aβ物质的结合不存在或明显很少。该减少的结合被认为减少了由于斑块太快溶解并随后增加可溶性Aβ所导致的副作用或由于斑块结合抗体与小胶质细胞相互作用所致的神经炎症的危险。
人阿尔茨海默病脑中的染色结果示于图8B、F-H中。
在0.7μg/ml浓度下的不同抗体与患者RZ55的新皮质的横向切片的结合：
B)实质Aβ沉积物(淀粉状蛋白斑)仅为6G1和6E10所染色，而不为球聚体选择性抗体(即5F7、2F2、6A2、4D10、10F11、3B10、7C6、7E5和10C1)所染色。
F)与市售抗体6E10和4G8相比，所有球聚体选择性抗体(即5F7、2F2、6A2、4D10、10F11、3B10、7C6、7E5和10C1)都显示明显更少的染色。
H)血管Aβ沉积物(箭头)仅为6G1和6E10所染色，而不为球聚体选择性抗体(即5F7、2F2、6A2、4D10、10F11、3B10、7C6、7E5和10C1)所染色。
在0.07-7.0μg/ml浓度下不同抗体与11月龄的转基因APP/LxPS1小鼠的新皮质的横向切片的结合：
G)与球聚体选择性抗体(即5F7、2F2、6A2、4D10、10F11、3B10、7C6、7E5和10C1)相比，实质Aβ沉积物(淀粉状蛋白斑)明显更多并且在更低的浓度下为6G1、6E10和4G8所染色。
在这之前已通过嗜刚果红染色验证了所有的淀粉状蛋白沉积物(刚果红；参见图8A)。
对褐色DAB沉积物的评价显示Aβ-无选择性6G1和6E10抗体染色斑块和脑膜血管，而Aβ(20-42)球聚体选择性抗体5F7、2F2、6A2、4D10、10F11、3B10、7C6、7E5和10C1则没有染色。与球聚体选择性抗体相比，市售抗体6E10和4G8显示更强的染色，但较6G1染色为弱。该发现确证了APP转基因小鼠中的染色谱，即球聚体选择性抗体与Aβ原纤维或其他存在于体内淀粉状蛋白结构中的Aβ物质的结合不存在或明显很少。该减少的对人淀粉状蛋白的结合被认为减少了由于斑块太快溶解并随后增加可溶性Aβ所导致的副作用或由于斑块结合抗体与小胶质细胞相互作用所致的神经炎症的危险。
实施例10：在自动免疫接种后约一年TG2576小鼠血浆中抗-Aβ-抗体效价和斑点印迹选择性谱
在Tg 2576小鼠(来自实施例9)最后一次免疫接种(用Aβ(20-42)球聚体、Aβ(12-42)球聚体、Aβ(1-42)单体和载体)后大约一年，评价血浆样品所产生并仍然存在的抗-Aβ抗体。为此，在PBS+0.2mg/ml BSA中制备了浓度范围在100pmol/μl-0.01 pmol/μl的不同形式的Aβ(1-42)的连续稀释物。将1μl的每种样品印在硝酸纤维膜上。为了检测使用了相应的小鼠血浆样品(1∶400稀释的)。使用缀合碱性磷酸酶的抗-小鼠-IgG和染色剂NBT/BCIP进行免疫染色。将1μl的每种样品施加于硝酸纤维膜上。使用合适的小鼠血浆样品(1∶400稀释的)进行检测。使用缀合碱性磷酸酶的抗-小鼠-IgG以及附加的染色剂NBT/BCIP进行染色。
用于斑点印迹的Aβ-标准样品：
1.Aβ(1-42)球聚体
Aβ(1-42)球聚体的制品描述于实施例1a中。
2.HFIP预处理的Aβ(1-42)单体，溶于Pluronic F68中
在1.7ml Eppendorff管中将3mg Aβ(1-42)(Bachem Inc.；产品目录号H-1368)溶解于0.5ml HFIP(6mg/ml悬浮液)中并在37℃下振荡(Eppendorff热混合器，1400rpm)1.5小时直至获得澄清溶液。在SpeedVac浓缩器中干燥样品(1.5小时)并重悬于13.2μl DMSO中，振荡10秒，接着超声处理(20秒)，并振荡(如在Eppendorff热混合器中，1400rpm)10分钟。添加6ml 20mM NaH2PO4；140mM NaCl；0.1％Pluronic F68；pH 7.4并在室温下搅拌1小时。在3000g下离心样品20分钟。弃去上清液并将沉淀溶解在0.6ml 20mM NaH2PO4；140mM NaCl；1％Pluronic F68，pH 7.4中。添加3.4ml H2O并在室温下搅拌1小时，然后在3000g下离心20分钟。将8份等分试样(每份0.5ml上清液)贮藏在-20°下供进一步使用。
3.Aβ(20-42)球聚体
Aβ(20-42)球聚体的制品描述于实施例1c中。
4.Aβ(12-42)球聚体
Aβ(1-42)球聚体的制品描述于实施例1d中。
5.Aβ(1-40)单体，HFIP预处理的，5mM溶于DMSO中
在Eppendorff管中将1mg Aβ(1-40)(Bachem Inc，产品目录号H-1194)悬浮于0.25ml HFIP中(4mg/ml悬浮液)。在37℃下振荡该管(如在Eppendorff热混合器中，1400rpm)1.5小时以获得澄清溶液，然后在speed vac浓缩器中干燥(1.5小时)。将样品重溶于46μl DMSO中(21.7mg/ml溶液＝5mM)，振荡10秒并接着超声处理20秒。在10分钟振荡(如在Eppendorff热混合器中，1400rpm)后将样品贮藏在-20℃下供进一步使用。
6.Aβ(1-42)单体，0.1％NH4OH
将1mg Aβ(1-42)(Bachem Inc.，产品目录号H-1368)溶解于0.5ml 0.1％NH4OH水溶液(新鲜配制的)中(＝2mg/ml)并立即在室温下振荡30秒以得到澄清溶液。将样品贮藏在-20℃下供进一步使用。
7.Aβ(1-42)原纤维
将1mg Aβ(1-42)(Bachem Inc.产品目录号H-1368)溶解于500μl 0.1％NH4OH水溶液中(Eppendorff管)并在室温下搅拌样品1分钟。用300μl 20mM NaH2PO4；140mM NaCl，pH7.4中和100μl该新鲜配制的Aβ(1-42)溶液。用1％HCl调pH至pH 7.4。在37℃下温育样品24小时并离心(在10000g下，10分钟)。弃去上清液并通过涡旋1分钟用400μl 20mM NaH2PO4；140mM NaCl，pH 7.4重悬原纤维沉淀。
8.sAPPα
来自于Sigma(产品目录号S9564；25μg溶于20mM NaH2PO4；140mM NaCl；pH 7.4中)。用20mM NaH2PO4，140mM NaCl，pH 7.4，0.2mg/ml BSA稀释sAPPα至0.1mg/ml(＝1pmol/μl)。
用于斑点印迹的材料：
Aβ-标准样品：
溶于20mM NaH2PO4，140mM NaCl，pH 7.4+0.2mg/ml BSA中的Aβ抗原的连续稀释
1)100pmol/μl
2)10pmol/μl
3)1pmol/μl
4)0.1pmol/μl
5)0.01pmol/μl
硝酸纤维素：
电转移印迹(Trans-Blot)转移介质，清洁的硝酸纤维膜(0.45μm)；BIO-RAD
抗-小鼠-AP：
AQ330A(Chemicon)
检测试剂：
NBT/BCIP片(Roche)
牛血清白蛋白，(BSA)：
A-7888(Fa.SIGMA)
封闭试剂：
5％低脂乳TBS溶液
缓冲溶液：
TBS
25mM Tris/HCl-缓冲液pH 7.5
+150mM NaCl
TTBS
25mM Tris/HCl-缓冲液pH 7.5
+150mM NaCl
+0.05％Tween 20
PBS+0.2mg/ml BSA
20mM NaH2PO4缓冲液pH 7.4
+140mM NaCl
+0.2mg/ml BSA
抗体溶液I：
在20ml 1％低脂乳TBS溶液中以1/400稀释的自动免疫接种的TG2576小鼠的血浆。
抗体溶液II：
1∶5000稀释
抗-小鼠-AP，溶于1％低脂乳TBS溶液
斑点印迹步骤：
1)将1μl每种不同的Aβ-标准样品(在它们的5倍连续稀释中)印在硝酸纤维膜上，彼此相距大约1cm。
2)在室温(RT)下，风干硝酸纤维膜上的Aβ-标准样品斑点至少10分钟(＝斑点印迹)
3)封闭：
在RT下用30ml 5％低脂乳TBS溶液温育斑点印迹1.5小时。
4)洗涤：
弃去封闭溶液并在RT下用20ml TTBS振荡温育斑点印迹10分钟。
5)抗体溶液I：
弃去洗涤缓冲液并在RT下用抗体溶液I温育斑点印迹过夜。
6)洗涤：
弃去抗体溶液I并在RT下用20ml TTBS振荡温育斑点印迹10分钟。弃去洗涤溶液并在RT下用20ml TTBS振荡温育斑点印迹10分钟。弃去洗涤溶液并在RT下用20ml TBS振荡温育斑点印迹10分钟。
7)抗体溶液II：
弃去洗涤缓冲液并在RT下用抗体溶液II温育斑点印迹1小时。
8)洗涤：
弃去抗体溶液II并在RT下用20ml TTBS振荡温育斑点印迹10分钟。弃去洗涤溶液并在RT下用20ml TTBS振荡温育斑点印迹10分钟。弃去洗涤溶液并在RT下用20ml TBS振荡温育斑点印迹10分钟。
9)显影：
弃去洗涤溶液。将1片NBT/BCIP溶解在20ml H2O中并用该溶液温育斑点印迹5分钟。通过用H2O彻底洗涤终止显影。
结果示于图9中。
对于不同的抗体谱，在斑点印迹中针对不同的Aβ形式，测试不同免疫接种组的血清：a)Aβ(20-42)球聚体；b)Aβ(12-42)球聚体；c)Aβ(1-42)单体，0.1％NH4OH；d)载体对照。
1.Aβ(1-42)球聚体
2.Aβ(1-42)单体，HFIP预处理的，溶于0.1％Pluronic F68中
3.Aβ(20-42)球聚体
4.Aβ(12-42)球聚体
5.Aβ(1-40)单体，HFIP预处理的，5mM DMSO溶液
6.Aβ(1-42)单体，溶于0.1％NH4OH中
7.Aβ(1-42)原纤维制品
8.sAPPα(Sigma)；(第一斑点：1pmol)
与使用作为对照的载体或Aβ(1-42)单体的自动免疫接种对比，用Aβ(20-42)球聚体或Aβ(12-42)球聚体免疫接种即使在最后一次免疫接种大约一年后仍然具有高抗体效价。在Aβ(20-42)球聚体免疫接种情况下，这些抗体选择性针对Aβ(20-42)球聚体，或在Aβ(12-42)球聚体免疫接种的情况下，这些抗体是Aβ(20-42)球聚体和Aβ(12-42)球聚体选择性的。这表明截短的Aβ(20-42)球聚体和Aβ(12-42)球聚体是非常好的抗原，并且针对它们的抗体在体内存留非常久。
(注意到在某些斑点印迹上观察到非特异性染色信号，其很可能是鼠抗体与在Aβ肽的连续稀释中所使用的BSA交叉反应所致)
实施例11：阿尔茨海默病患者中Aβ(20-42)球聚体表位的脑水平
SDS-DTT-脑提取物：
AD脑样品：RZ 16；RZ 52和RZ 55(获得自Brain Net，Munich)
对照样品：RZ 92(获得自Brain Net，Munich)
将1片Complete蛋白酶抑制剂(Roche，产品目录号1697 498)溶解于1ml H2O中(＝蛋白酶抑制剂溶液)。在玻璃罐中敲击20次均质溶于2.5ml NaH2PO4，140mM NaCl，0.05％Tween 20，0.5％BSA(补充有25μl蛋白酶抑制剂溶液)中的100mg AD脑样品。在冰上超声处理悬浮液30秒，然后在37℃下温育16小时。在100’000g和8℃下离心悬浮液1小时，然后收集上清液。将残留物溶解在5mM NaH2PO4，35mM NaCl，pH 7.4中并在玻璃罐中敲击10次使之均质。添加75μl 10％SDS和125μl 0.16mg/ml DTT并在室温下搅拌20分钟。在10’000g下离心样品10分钟，并将上清液过夜贮藏在-20℃下。在使用之前，解冻上清液并在10’000g下再离心10分钟。将上清液(＝SDS/DTT脑提取物)用于ELISA。
a)用于Aβ(20-42)球聚体表位的夹心-ELISA
试剂列表：
1.F96 Cert.Maxisorp NUNC-免疫平板(Immuno Plate)(产品目录号：439454)
2.结合抗体：5F7、7C6、10F11
3.偶联缓冲液：
100mM碳酸氢钠，pH9.6
4.ELISA封闭试剂(Roche Diagnostics GmbH产品目录号：1112589)
5.PBST缓冲液：
20mM NaH2PO4、140mM NaCl、0.05％Tween 20，pH 7.4
6.Aβ(20-42)校准用基准
7.第一抗体：
抗-Aβ pRAb BA199；亲和纯化的(通过Aβ(1-42)球聚体-琼脂糖凝胶(Sepharose))IgG PBS溶液；浓度：0.22mg/ml
8.第二抗体：
抗-兔-POD缀合物；(Jackson ImmunoResearch，产品目录号：111-036-045)
9.显影：
-TMB；(Roche Diagnostics GmbH产品目录号：92817060)42mM DMSO溶液
-3％H2O2水溶液
-100mM醋酸钠，pH4.9
-停止溶液：2M硫酸
试剂制备：
1.结合抗体：
在偶联缓冲液中将单个结合抗体5F7、7C6和10F11稀释至0.7μg/ml的终浓度。
2.封闭试剂：
为了制备封闭储液，将封闭试剂溶解于100ml H2O中并以每一10ml的等分试样贮藏在-20℃下。
用27ml H2O稀释3ml封闭储液用于封闭一块ELISA板。
3.Aβ(20-42)校准用基准(CS1)
Aβ(1-42)球聚体制品描述于实施例1a中。
在Bradford(BioRad)后测定了Aβ(20-42)球聚体蛋白浓度(6.81mg/ml)。将14.68μl Aβ(20-42)球聚体(6.81mg/ml)稀释于10ml 20mM NaH2PO4，140mM NaCl，0.05％Tween20，pH 7.4，0.5％BSA中(＝10μg/ml)。将10μl 10μg/ml溶液进一步稀释于10ml 20mM NaH2PO4，140mM NaCl，0.05％Tween20，pH 7.4，0.5％BSA中(＝10ng/ml＝CS1)。
用于Aβ(20-42)的校准用基准：
SDS/DTT-脑提取物：
SDS/DTT-脑提取物＝E#
(#代表4种人脑样品(1)RZ 16；(2)RZ 52；(3)RZ 55；(4)RZ 92)
提取样品 提取样品的体积 PBST+0.5％BSA 稀释因数
E#.1 1ml E# 0.0ml 直接
E#.2 0.316ml E#.1 0.684ml 1∶3.16
E#.3 0.316ml E#.1 0.684ml 1∶10
E#.4 0.316ml E#.1 0.684ml 1∶31.6
4.第一抗体：
在PBST+0，5％BSA中将抗-Aβ pRAb储液稀释至0.05μg/ml。立即使用该抗体溶液。
5.第二抗体：
将冻干的抗-兔-POD缀合物溶解于0.5ml H2O中并与500μl甘油混合。接着将抗体浓缩物以100μl的等分试样贮藏在-20℃下。
在PBST缓冲液中以1∶10'000稀释浓缩物。立即使用该抗体溶液。
6.TMB溶液：
将20ml 100mM醋酸钠，pH 4.9与200μl TMB溶液以及29.5μl3％过氧化氢混合。立即使用该溶液。
用于Aβ(20-42)的ELISA-板：
测定两次校准用基准(CS1.1-CS1.8)和4种人脑样品(1)RZ 16；(2)RZ 52；(3)RZ55；(4)RZ 92的SDS/DTT-脑提取物(＝E1-E4在它们的4个连续稀释E#.1-E#.4中)：
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A CS1.1 CS1.1 E1.1 E1.1 E3.1 E3.1
B CS1.2 CS1.2 E1.2 E1.2 E3.2 E3.2
C CS1.3 CS1.3 E1.3 E1.3 E3.3 E3.3
D CS1.4 CS1.4 E1.4 E1.4 E3.4 E3.4
E CS1.5 CS1.5 E2.1 E2.1 E4.1 E4.1
F CS1.6 CS1.6 E2.2 E2.2 E4.2 E4.2
G CS1.7 CS1.7 E2.3 E2.3 E4.3 E4.3
H CS1.8 CS1.8 E2.4 E2.4 E4.4 E4.4
对结合的单克隆抗体5F7、7C6、10F11中的每一个进行该ELISA。
步骤
1.每孔添加100μl mAb溶液。在+6℃(冰箱)下温育ELISA板过夜。
2.滗析抗体溶液并用PBST缓冲液洗涤孔三次，每次250μl。
3.添加250μl/孔封闭溶液。在室温下温育2小时。
4.滗析封闭溶液并用PBST缓冲液洗涤孔三次，每次250μl。
5.添加100μl/孔的每种校准用基准和SDS/DTT脑提取物。在室温下温育平板2小时，然后在6℃下过夜。
6.滗析校准用基准和SDS/DTT脑提取物溶液并用PBST缓冲液洗涤孔三次，每次250μl。
7.添加200μl/孔的第一抗体溶液并在室温下温育1小时。
8.滗析第一抗体溶液并用PBST缓冲液洗涤孔三次，每次250μl。
9.添加200μl/孔的第二抗体溶液并在室温下温育1小时。
10.滗析第二抗体溶液并用PBST缓冲液洗涤孔三次，每次250μl。
11.添加100μl/孔的TMB溶液。
12.在显影期间(在室温下，5-15分钟)监测板颜色，当适合的颜色显影时，通过添加50μl/孔的停止溶液终止反应。
13.测定450nm处吸收度。
14.使用校准计算结果。
15.评价：如果样品的吸收度远离线性校准范围，再次稀释它们并重复。
结果示于图10中。
来自AD患者和对照个体的脑提取物中Aβ(20-42)球聚体表位的脑水平
夹心ELISA用于评价脑提取物截短的Aβ(20-42)球聚体表位含量。使用针对Aβ(20-42)球聚体的相应抗体的ELISA用作校准。
与对照患者相比，阿尔茨海默病患者脑组织的提取物显示了明显升高的Aβ(20-42)球聚体表位含量。这表明事实上Aβ(20-42)球聚体表位不但与阿尔茨海默病动物模型相关，还是人阿尔茨海默病患者脑中相关的Aβ-物质。因此，针对Aβ(20-42)球聚体表位的抗体是非常期望用于治疗阿尔茨海默病的。
实施例12：开发抗-Aβ(20-42)球聚体杂交瘤细胞系
可使用多种本领域已知技术制备单克隆抗体，包括使用杂交瘤、重组体以及噬菌体展示技术或它们的组合。例如，可使用杂交瘤技术产生单克隆抗体，所述杂交瘤技术包括那些本领域已知的和例如在Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold SpringHarbor Laboratory Press，第2版.1988)；Hammerling，等，in：Monoclonal Antibodiesand T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981)(所述参考文献以其全文在此并入作为参考)中教导的技术。如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指一种来源于包括任何真核生物、原核生物或噬菌体克隆在内的单一克隆而非来源于产生其的方法的抗体。
用于产生本文所描述的抗体的具体实验方案如下：
小鼠的免疫接种：用50ug溶于CFA中的抗原皮下免疫接种Balb/c和A/J小鼠(6-8周龄)。每三周用50ug溶于ImmuneasyTM(Qiagen)中的抗原加强，总共加强三次。在融合前4天，用10ug的抗原静脉内加强小鼠。
细胞融合和杂交瘤筛选：使用标准技术将来自经免疫动物的脾细胞与SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞以5∶1的比率融合。融合7-10天后，当观察到肉眼可见的集落时，对于针对Aβ(20-42)球聚体的抗体通过ELISA检验SN。通过有限稀释扩增并克隆来自ELISA阳性孔的细胞。
抗体同种型测定：使用Zymed EIA同种型试剂盒测定抗-Aβ(20-42)球聚体mAb的同种型。
单克隆抗体的放大和纯化：在含有5％低IgG胎牛血清(Hyclone)的培养基中扩增杂交瘤。收获上清液并浓缩。使用纯化mAb并在PBS中透析。
血清滴度：用Aβ(20-42)球聚体免疫接种10只小鼠。所有血清转化的小鼠都具有1∶5000-10,000的ELISA滴度(1/2Max OD 450nm)。
********
产生单克隆抗体的杂交瘤的命名
用于保藏物的阿伯特实验室内部命名。
保藏的细胞系：
1)ML13-7C6.1D4.4A9.5G8(在本文中也称为“7C6”)
2)ML15-5F7.5B10(在本文中也称为“5F7”)
3)ML15-10F11.3D9(在本文中也称为“10F11”)
4)ML15-4B7.3A6(在本文中也称为“4B7”)
5)ML15-2F2.3E12(在本文中也称为“2F2”)
6)ML15-6A2.4B10(在本文中也称为“6A2”)
7)ML13-4D10.3F3(在本文中也称为“4D10”)
8)ML15-7E5.5E12(在本文中也称为“7E5”)
9)ML15-10C1.5C6.3H4(在本文中也称为“10C1”)
10)ML15-3B10.2D5.3F1(在本文中也称为“3B10”)
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Claims (18)

1.具有对Aβ(20-42)球聚体的结合亲和力至少10倍大于该抗体对Aβ(1-42)球聚体的结合亲和力的单克隆抗体。
2.权利要求1的抗体，其中抗体对Aβ(20-42)球聚体的结合亲和力至少100倍、至少1000倍、至少10000倍或至少100000倍大于该抗体对Aβ(1-42)球聚体的结合亲和力。
3.权利要求1或2的抗体，其中抗体以1x10-7M的KD或更大的亲和力、以1x10-8M的KD或更大的亲和力、以1x10-9M的KD或更大的亲和力、以1x10-10M的KD或更大的亲和力或以1x10-11M的KD或更大的亲和力结合Aβ(20-42)球聚体。
4.权利要求1的抗体，其中抗体包含至少3个选自如下的可变区CDR组的CDR：
5.权利要求1-4任一项的抗体，其中所述抗体是人源化的。
6.权利要求1-5任一项的抗体，其中所述抗体包含人恒定区。
7.权利要求1-5任一项的抗体，其中所述抗体具有人糖基化型。
8.如权利要求1-7任一项所定义的抗体的抗原结合部分。
9.权利要求8的抗原结合部分，其中所述部分为抗体的Fab片段、F(ab’)2片段或单链Fv片段。
10.编码权利要求1-9任一项的抗体或抗原结合部分氨基酸序列的分离的核酸。
11.包含权利要求10的分离的核酸的载体。
12.包含权利要求11的载体的宿主细胞。
13.产生权利要求1-7任一项的抗体的方法，所述方法包括在适合于产生抗体的条件下，在培养基中培养权利要求12的宿主细胞。
14.包含如权利要求1-9任一项所定义的抗体或抗原结合部分和药学上可接受的载体的药物组合物。
15.如权利要求1-9任一项所定义的抗体或抗原结合部分在制备用于治疗或预防或诊断淀粉样变性病的药物组合物中的应用。
16.如权利要求1-9任一项所定义的抗体或抗原结合部分在制备用于治疗或预防或诊断阿尔茨海默病或唐氏综合征的药物组合物中的应用。
17.如权利要求1-9任一项所定义的抗体或抗原结合部分在制备用于诊断淀粉样变性病的方法中的试剂盒中的用途，其中所述方法包含提供来自怀疑患有淀粉样变性病的个体的样品，将该样品与如权利要求1-9任一项所定义的抗体或抗原结合部分接触，并检测包含抗体或抗原结合部分与抗原的复合物的形成，存在复合物则指示个体患有淀粉样变性病。
18.如权利要求1-9任一项所定义的抗体或抗原结合部分在制备用于诊断阿尔茨海默病或唐氏综合征的方法中的试剂盒中的用途，其中所述方法包含提供来自怀疑患有阿尔茨海默病或唐氏综合征的个体的样品，将该样品与如权利要求1-9任一项所定义的抗体或抗原结合部分接触，并检测包含抗体或抗原结合部分与抗原的复合物的形成，存在复合物则指示个体患有阿尔茨海默病或唐氏综合征。
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