ES2389811T3 - Oligómeros de amiloide beta para uso en el tratamiento, el alivio o la prevención de la enfermedad de Alzheimer - Google Patents

Abstract

Un oligómero de péptido A que comprende un resto de tirosina reticulada para usar en el tratamiento, prevención o alivio de la enfermedad de Alzheimer.

Description

Oligómeros de amiloide beta para uso en el tratamiento, el alivio o la prevención de la enfermedad de Alzheimer.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para el tratamiento o alivio de la enfermedad de Alzheimer y de otras condiciones relacionadas con la agregación anormal de proteínas. En particular, la invención se refiere a: péptidos amiloides con tirosina reticulada, para usar en el tratamiento, alivio o prevención de la enfermedad de Alzheimer.

Antecedentes de la invención

Las lesiones amiloides características de la enfermedad de Alzheimer (AD) están compuestas primariamente por Amiloide (A) (Glenner & Wong, 1984), una proteína de 39-43 aminoácidos que es una proteína normalmente soluble hallada en fluidos biológicos. La formación de amiloides está ligada a la patogénesis de la enfermedad, identificando así los cambios neuroquímicos que llevan a la inhibición del catabolismo de A y su acumulación en la neocorteza sería una clave importante para la patogénesis de la AD.

A pesar de que la patología fundamental, la susceptibilidad genética y la biología asociada con la AD se están volviendo más claras, una base química y estructural racional para desarrollar fármacos efectivos para prevenir o curar la enfermedad sigue siendo difícil de alcanzar. Si bien la genética de la AD indica que el metabolismo de A está íntimamente asociada con la patogénesis de la enfermedad tal como se indicó con anterioridad, los fármacos para el tratamiento de AD se han centrado hasta ahora en “mejoradores de la cognición”, que no se dirigen a los procesos patológicos subyacentes. Estos fármacos han tenido sólo un éxito limitado.

La naturaleza del ambiente neuroquímico trastornado en la AD se puede deducir parcialmente de las modificaciones postraduccionales del A extraído de sistemas biológicos migra normalmente como un monómero aparente de ~ 4 kD en electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE; (Shoji et al., 1992)); sin embargo, el A extraído de especímenes de cerebro post mortem afectado por AD migra en SDS-PAGE como oligómeros resistentes a SDS, urea y ácido fórmico (Masters et al., 1985; Roher et al., 1996; Cherny et al., 1999).

La espectrometría de masa-ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-MS) de estos oligómeros resistentes a SDS extraídos de la placa neurítica y amiloide vascular indica la presencia de especies Av diméricas y triméricas reticuladas de forma covalente (Roher et al., 1996).

A 1-40 y A 1-42 sintéticos normalmente migran como monómeros aparentes en SDS-PAGE, pero forman especies de un peso molecular aparentemente mayor después de incubación (Burdick et al., 1992). Este proceso se acelera por exposición a sistemas oxidativos (Dyrks et al., 1992; Atwood et al., 1997).

(Atwood et al., 1997), es resistente, por ello, a la oligomerización oxidativa catalizada por metal y, quizás, esto explique la rareza de los depósitos amiloides en estos animales (Vaughan y Peters, 1981).

La reticulación con tirosina en proteínas es un marcador sensible al estrés oxidativo. Los puentes covalentes de carbono-carbono o los puentes de carbono-oxígeno se forman entre residuos de tirosilo simples y/o residuos de ditirosilo, lo que da como resultado una cantidad de productos de reacción fluorescentes estables (Gross y Sizer, 1959; Amado et al., 1984, Jacob et al., 1996). Los productos de reacción principales del radical de tirosilo libre son los aminoácidos intensamente fluorescentes 3,3’-ditirosina (DT), 3,3’,3’-tritirosina (TT) y pulcherosina (P) y la isoditirosina no fluorescente (iso-DT) (Gross y Sizer, 1959; Amado et al., 1984, Jacob et al., 1996; Heinecke et al., 1993). Los niveles de DT y 3-nitrotirosina son elevados en el hipocampo y las regiones neocorticales de cerebros de pacientes con AD en comparación con las mismas regiones de cerebro normal y también son elevados en el fluido cerebroespinal ventricular en pacientes con AD (Hensley et al., 1998).

La reticulación con tirosina también puede ser importante en otras enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Parkinson y otras condiciones en las que se depositan las fibrillas de -sinucleína. Incluyen la enfermedad de Parkinson propiamente dicha, demencia con formación de cuerpos de Lewy, atrofia sistémica múltiple, enfermedad de Hallerboden-Spatz y enfermedad de cuerpos de Lewy difusos. La exposición de sinucleína recombinante a agentes nitrantes da como resultado la nitración de residuos de tirosina, así como la oxidación de tirosina para formar DT; esto resulta en la reticulación de -sinucleína para formar agregados estables (Souza et al., 2000). Los mismos autores también hallaron que se producen anticuerpos monoclonales contra la sinucleína nitrada unida específicamente a cuerpos de Lewy y a inclusiones de células gliales en una variedad de sinucleinopatías (Duda et al., en la preparación referido a Souza et al., 2000).

derivado de amiloide humano contiene reticulaciones de tirosina e incluye especies reticuladas tanto de ditirosina como de tritirosina. Estas reticulaciones se pueden replicar in vitro, por ejemplo, al

humano sintético con peroxidasa y H2O2 o con H2O2 en presencia de iones cobre. Estas modificaciones son resistentes a proteasa y, por ello, proponemos que la reticulación de la tirosina en AD causada por la interacción anormal de A con H2O2 y peroxidasas o iones cobre contribuye a la formación de oligémeros de A neurotóxicos y a la deposición de A . La inmunización contra compuestos reticulados con tirosina de bajo peso molecular más que con A entero se puede usar, por ende, para el tratamiento o la prevención de AD, sin riesgo de provocar complicaciones autoinmunes que, de otro modo, podrían ser inducidas por inmunización con A intacto o grandes fragmentos de él. Al restringir el blanco de inmunoterapia a un fragmento o porción anormal de la molécula, puede ser posible minimizar una indeseable interferencia con la función normal de la molécula, proporcionando al mismo tiempo una terapia activa contra la molécula anormal. Se apreciará el uso de inmunización ya sea activa o pasiva.

Los procesos oxidativos que dan origen a una reticulación covalente de proteínas por medio de tirosina también están asociados con otros trastornos que se caracterizan por agregación patológica y acumulación de proteínas específicas. Por lo tanto, se considera que estas condiciones también serán responsables de la prevención o el tratamiento por medio del método de la invención.

Sumario de la invención

La invención proporciona un péptido A que comprende un resto de tirosina reticulada para usar en el tratamiento, prevención o alivio de la enfermedad de Alzheimer. El péptido puede ser una porción inmunogénica de la forma patológicamente agregada de A , donde el péptido comprende un resto de tirosina reticulada ligado a residuos corriente arriba y corriente abajo de la tirosina reticulada, un dímero, trímero o tetrámero del monómero de péptido AA

También se describe en la presente un método de prevención, tratamiento o alivio de una condición, en donde la condición se caracteriza por una agregación patológica y acumulación de una proteína específica asociada con el daño oxidativo y la formación de reticulaciones de tirosina, donde el método comprende la etapa de inmunizar a un sujeto que lo necesita con una dosis efectiva de inmunización de uno o varios compuestos seleccionados del grupo que consiste en ditirosina, tritirosina, tetratirosina (también conocida como pulcherosina), ortólogos de tirosina oxidados tales como o-tirosina y m-tirosina, nitrotirosina y péptidos que comprenden reticulaciones de tirosina y que opcionalmente comprenden iones cobre en complejo con el compuesto. Estos compuestos se mencionan

colectivamente en la presente como “compuestos de tirosina reticulada”.

Un experto en la técnica reconocerá que una dosis efectiva de inmunización del compuesto es una que produce que el anticuerpo sea capaz de unirse con un compuesto reticulado con una tirosina. Dicha persona también será capaz de determinar si un compuesto particular reticulado con tirosina produce un anticuerpo.

La forma patológicamente agregada de la proteína específica puede comprender un resto reticulado con tirosina. El compuesto reticulado con tirosina puede ser un péptido que es una porción inmunogénica de la forma patológicamente agregada de la proteína específica, donde el péptido comprende un resto de tirosina reticulada ligado a residuos corriente arriba y corriente abajo de la tirosina reticulada.

El compuesto reticulado con tirosina puede ser un compuesto reticulado de ditirosina.

Se pueden usar hasta 3 equivalentes de cobre por equivalente de ditirosina, siempre que cada dosis administrada contenga no más de 1 M de cobre. Ópticamente, el compuesto usado para inmunización se acopla con una proteína portadora que es en sí inmunogénica, como toxoide tetánico, hemocianina de lapa californiana o albúmina. Además, el compuesto se puede administrar opcionalmente junto con un adyuvante como alumbre, lípido de monofosforilo, un péptido de muramilo, un iscom como QS21, y similares. Los expertos en la técnica serán conscientes de los portadores y adyuvantes apropiados.

El péptido que comprende reticulaciones de tirosina es preferentemente una porción mínima e inmunogénica de la proteína particular asociada con la condición que está constituida por el resto de ditirosina ligado a residuos corriente arriba y corriente abajo y corriente abajo de la tirosina reticulada. Con preferencia, el péptido que comprende reticulaciones de tirosina se deriva de la secuencia que rodea a la tirosina 10 en la secuencia de aminoácidos de A1-40 o A1-42 humano.

Se prefiere que las reticulaciones de tirosina se puedan obtener por oxidación en presencia de iones cobre.

Con mayor preferencia, el péptido también comprende iones cobre complejizados con ditirosina.

La inmunización de acuerdo con el método revelado con anterioridad o la inmunización del péptido A de la invención se puede realizar por medio de cualquier vía, incluyendo la inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa, la aplicación a superficies de mucosa o administración tópica, por ejemplo, en un ungüento.

La dosis del compuesto por administrar variará según la naturaleza del compuesto individual, el peso, la edad y el estado general de salud del paciente y si se usa un adyuvante. Se contempla que la dosis esté en la región de 0,1

g a 200 mg de DT, con mayor preferencia, 1 a 50 mg, con máxima preferencia, 10 a 20 mg.

A pesar de que se da una inmunización simple, se administran preferentemente múltiples inmunizaciones, por ejemplo, una vez por semana durante uno a doce meses, con mayor preferencia, durante cuatro meses. Se puede aplicar una serie de refuerzos después de seis a doce meses. La respuesta inmune se controla midiendo los anticuerpos DT; se puede usar cualquier sistema de ensayo conveniente, como ELISA.

En una forma de realización opcional del método revelado en la presente, dicho método también comprende las etapas adicionales de identificación de las formas predominantes de las reticulaciones de tirosina en la proteína específica patológicamente agregada; y síntesis de uno o varios compuestos reticulados con tirosina que comprenden una o varias de las formas predominantes de reticulaciones de tirosina. De acuerdo con la invención, el péptido A puede comprender preferentemente una o varias de las formas predominantes de reticulaciones de tirosina en la forma patológicamente agregada de A

La inmunización puede ser pasiva en los métodos revelados en la presente. Así, se describe la prevención, el tratamiento o el alivio de una condición, en donde la condición se caracteriza por la agregación patológica y la acumulación de una proteína específica asociada con el daño oxidativo y donde la forma patológicamente agregada de la proteína específica comprende una reticulación con tirosina, donde el método comprende la etapa de administración de una cantidad efectiva de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se produce contra un compuesto reticulado con tirosina, siendo dicho compuesto una porción inmunogénica de la forma patológicamente agregada de la proteína específica y que comprende una reticulación con tirosina y cuyo anticuerpo o fragmento de anticuerpo es capaz de unir específicamente la forma patológicamente agregada de la proteína específica, a un sujeto que necesita de dicho tratamiento.

La presente invención proporciona el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 10 para usar en la prevención, el tratamiento o el alivio de la enfermedad de Alzheimer, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es capaz de unir específicamente la forma patológicamente agregada de A

El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal. Cuando el anticuerpo es policlonal, es preferentemente de origen humano y se puede derivar, por ejemplo, de suero humano reunido de individuos sanos normales. De modo alternativo, se puede usar suero de individuos que fueron hiperinmunizados contra un compuesto reticulado con tirosina. Se conocen protocolos para hiperinmunización en la técnica. El anticuerpo se puede aislar de suero por medio de cualquier método conveniente; en la técnica se conoce una variedad de métodos apropiados. Cuando el anticuerpo es monoclonal, es preferentemente humanizado. Se entenderá claramente que el uso de fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos, tales como F(ab’), F(ab’)2 Fv o scFv monoclonal, están dentro del alcance de la invención. Los métodos para la producción y la purificación de anticuerpos policlonales y monoclonales y para la producción recombinante de anticuerpos monoclonales humanizados o de fragmentos de scFv son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Harlow y Vía (1988); documentos WO 90/07861; y WO 92/01047. Los anticuerpos monoclonales humanizados también se puede producir en mamíferos transgénicos; ver, por ejemplo, los documentos WO 91/10741 y WO 93/12227.

Se prefiere que el anticuerpo reaccione específicamente con la forma patológicamente agregada de la proteína específica y no reaccione de modo significativo con la forma no agregada de la proteína.

De acuerdo con la inmunización activa o pasiva, el paciente es controlado respecto de la mejoría clínica, que puede comenzar dentro de la primera semana, pero más probablemente se pueda observar a las seis semanas y puede tomar 12 meses. Se emplean los índices clínicos normales que se usan en el control de los pacientes con la condición relevante. El médico tratante será consciente de los ensayos más apropiados para usar.

Cuando el tratamiento es preventivo, el paciente es controlado respecto de signos de desarrollo de la condición. El paciente puede estar en riesgo como resultado de ligación genética, por ejemplo, en la enfermedad de Alzheimer familiar o enfermedad de Huntington.

En un segundo aspecto, por ende, la invención proporciona una composición preventiva o terapéutica para usar como un medicamento, que comprende un péptido A que comprende un resto de tirosina reticulada y que opcionalmente también comprende un adyuvante, y/o iones cobre en complejo con el péptido o un anticuerpo que se produce contra dicho péptido A o uno de sus fragmentos junto con un portador farmacéuticamente aceptable. También se describe una composición preventiva o terapéutica para usar en el método revelado en la presente o como un medicamento, que comprende un compuesto reticulado con tirosina, junto con un portador farmacéuticamente aceptable y que opcionalmente también comprende un adyuvante, y/o iones cobre en complejo con el compuesto.

Por otra parte, se revela una composición preventiva o terapéutica para usar en el método de inmunización pasiva revelado en la presente o como un medicamento, que comprende un anticuerpo dirigido contra un compuesto reticulado con tirosina tal como se definió con anterioridad o uno de sus fragmentos que es capaz de unirse con el compuesto reticulado con tirosina, junto con un portador farmacéuticamente aceptable.

También se revela un método de diagnosis de una condición, en donde la condición se caracteriza por agregación patológica y acumulación de una proteína específica asociada con el daño oxidativo y la formación de reticulaciones de tirosina, donde el método comprende la etapa de ensayar una muestra de un fluido biológico de un sujeto sospechado de sufrir de la condición por la presencia de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en ditirosina, tritirosina, tetratirosina, ortólogos oxidados de tirosina tales como o-tirosina y m-tirosina, nitrotirosina y péptidos que comprenden reticulaciones de tirosina.

El método comprende, de modo alternativo, la etapa de ensayar un fluido biológico de un sujeto sospechado de sufrir de la condición por la presencia de un anticuerpo dirigido contra un compuesto reticulado con tirosina.

La invención proporciona un método de diagnosis de enfermedad de Alzheimer que comprende la etapa de ensayar in vitro una muestra de un fluido biológico de un sujeto sospechado de sufrir de la condición por la presencia de una molécula que comprende reticulaciones de tirosina o un anticuerpo dirigido contra una molécula que comprende reticulaciones de tirosina.

Con preferencia, el fluido biológico está seleccionado del grupo que consiste en sangre, plasma, suero, fluido cerebroespinal, orina y saliva. Con preferencia, el compuesto es ditirosina.

El ensayo se puede llevar a cabo por cualquier medio apropiado, pero más convenientemente se lleva a cabo por medio de un ensayo ELISA usando anticuerpo dirigido contra compuesto reticulado con tirosinas. Dicho ensayo se puede usar, por el contrario, para detectar un anticuerpo dirigido contra un compuesto reticulado con tirosina. Con preferencia, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o Una mezcla de anticuerpos monoclonales. De modo alternativo, el ensayo se puede llevar a cabo midiendo la fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 325 nm y una longitud de onda de emisión de 350-500 nm.

En los métodos revelados en la presente, con preferencia la condición está seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad motoneuronal, catarata, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, enfermedad de Huntington, demencia con formación de cuerpos de Lewy, atrofia sistémica múltiple, enfermedad de Hallerboden-Spatz y enfermedad de cuerpos de Lewy difusos o catarata.

Con mayor preferencia, la condición es enfermedad de Alzheimer o enfermedad de Parkinson. Los métodos de la invención se refieren a la enfermedad de Alzheimer.

A los fines de esta memoria descriptiva, se entenderá claramente que la expresión “que comprende” implica “que incluye, pero sin limitación” y que la palabra “comprende” tiene un significado correspondiente.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra que A humano, pero no A de rata, desarrolla fluorescencia y resistencia a SDS después de la oxidación catalizada con peroxidasa. A 1-40 humano, A1-42 humano o A 1-40 de rata (50 M) se incubó en 50 mM de borato, pH 9,5 H2O2 (1 mM) y peroxidasa (7,5 g/ml), durante 1 día a 37 °C.

(A) espectros fluorescentes ( ex 325, exm 350-500);

(B)

migración en SDS-PAGE (por Western blot usando 4G8);

(C) A 1-42 (10 nM) se incubó con H2O2 (1 M) y peroxidasa (7,5 g/ml) durante 5 días a 37 °C en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4. El producto (vía 2) se comparó con péptido incubado en las mismas condiciones en ausencia de H2O2 /peroxidasa (vía 1) por SDS PAGE y Western blot (4G8).

y que se unen con cobre.

(A)

El amiloide humano se purificó, hidrolizó y el espectro de masa se determinó después de separación cromatográfica. Se muestran dos barridos individuales que reflejan análisis de la misma muestra que se eluye en diferentes tiempos de retención de cromatografía (RT).

(B)

Absorbancias a 280 nm y 315 nm de DT purificado en presencia de mayores concentraciones de CuSO4 o NaCl.

La figura 4 muestra que A humano soluble se une al cobre con gran afinidad.

(A)

Tinción plateada de extracto soluble crudo (1) y eluato a pH 1 de la columna de Sepharose quelante de cobre

(2).

(B)

Western blot de eluato a pH 1 sondeado con WO2, G211 y G210. La figura 5 muestra los resultados del análisis de LC-MS, lo que confirma que el A humano se une con el cobre.

(A)

Análisis de LC-MS de extractos solubles crudos y purificados con IMAC.

(B) Espectros de masa de A 1-41 y A 1-40 con dos átomos de cobre ligados.

Los datos de IMAC y LC-MS demuestran que el A derivado del cerebro se puede unir con el cobre.

La figura 6 muestra la detección de ditirosina en A 1-40 y A 1-42 reticulado en Western blots. También se comparan dos técnicas para crear las ligaciones de ditirosina. El Western blot superior (A) demuestra la presencia de A usando el anticuerpo W02. El blot inferior (B) demuestra la presencia de ligaciones de ditirosina reconocidas por el te anticuerpo monoclonal IC3. Este anticuerpo se produjo contra una forma de ditirosina preparada usando borato / H2O2 / peroxidasa de rábano picante.

Vía 7 Ditirosina conjugada con KLH

La figura 7 muestra ejemplos de las formas de reticulaciones de tirosina producidas como inmunógenos potenciales. Estas estructuras contienen reticulaciones de tirosina y tienen los términos carboxi y amino acetilados para simular la presencia de residuos de aminoácidos adicionales que normalmente estarían presentes en cada lado de un resto reticulado con tirosina en un péptido reticulado con tirosina. La presentación de múltiples copias del antígeno de ditirosina se diseña para mejorar la potencia de la respuesta inmune generada.

7A Tirosina, Ditirosina y Atee

7B DiAtee, IsoDiAtee y TriAtee

7C TetraAtee y forma alternativa de TriAtee con un isoenlace.

La figura 8 muestra la detección de enlaces de ditirosina en una variedad de especies reticuladas de tirosina en Western Blots. Las especies que contienen DT incluyen A 9-16 reticulado de ditirosina son diméricas o triméricas ligadas con BSA y diversas especies de poli-DT ligadas a proteínas portadoras de BSA o KLH. El Western blot superior (A) demuestra la capacidad de la muestra de unirse con un antisuero de conejo policlonal producido contra DT que se preparó usando la técnica de borato/ H2O2 / peroxidasa y se ligó con KLH usando glutaraldehído (tratado en el Ejemplo 7). El Western blot inferior (B) demuestra la presencia de ligaciones de ditirosina reconocidas por el anticuerpo monoclonal IC3. Este anticuerpo se produjo contra una forma de ditirosina también preparado usando la técnica de borato / H2O2 / peroxidasa.

Vía 3 ATEE – BSA crudo Vía 4 PoliTyr - BSA Vía 5 BSA

Vía 7 ATEE – KLH crudo Vía 8 PoliTyr - KLH Vía 9 KLH

Descripción detallada de la invención

La invención se describirá ahora en detalle a modo de referencia sólo por medio de los siguientes ejemplos no limitativos y los dibujos. Las abreviaturas usadas en la presente son las siguientes: AD enfermedad de Alzheimer DT 3,3’-ditirosina TT 3,3’3’-tritirosina P pulcherosina iso-DT isoditirosina Procedimientos experimentales

Reactivos y preparación del péptido A

El A oligomérico se extrajo de placas amiloides de cerebros afectados por AD tal como se describió previamente (Roher et al., 1996). El A amiloide purificado se solubilizó en ácido fórmico y luego se dializó de inmediato con 5 cambios de 100 mM de bicarbonato de amonio, pH 7,5, antes de usar.

A 1-40, A 1-42 humanos y A 1-40 de rata se sintetizaron, se purificaron y se caracterizaron por análisis de HPLC, análisis de aminoácidos y espectroscopia de masa por W. M. Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory (Yale University, New Haven, CT) y se realizaron estudios de corroboración usando un péptido sintetizado por Quality Control Biochemicals, Inc. (Hopkinton, MA).

Cada péptido se identificó como un pico único por HPLC. Los péptidos de A sintéticos se disolvieron en agua doblemente desionizada a una concentración de 0,5-1,0 mg/ml, se sonicaron durante 3 min y luego se centrifugaron durante 20 min a 10 000 g y el sobrenadante (A madre) se usó el día del experimento. Las concentraciones de los péptidos de Amadre se determinaron por absorbancia espectrofotométrica a 214 nm o por ensayo de proteína Micro BCA (Pierce, Rockford, IL) tal como se describió previamente (Atwood et al., 1998). Antes de usar, todos los tampones y soluciones madre de iones metálicos se filtraron a través de un filtro de 0,22 (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI) para eliminar las materias particuladas. Todos los otros reactivos tenía grado analítico o eran más puros. La peroxidasa de rábano picante se obtuvo de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).

Preparación y análisis de fluorescencia de A reticulado de ditirosina y tirosina

Se generaron estándares de DT incubando L-tirosina (1 mg/ml) solubilizada en tampón de borato (50 mM, pH 9,5) con H2O2 (5 mM) y peroxidasa de rábano picante (7,5 g/ml) durante 1 día a 37 °C (Amado et al., 1984). Se generó A reticulado incubando A (50 M) en tampón de borato (50 mM, pH 9,5) y con H 2O2 (1 mM) y peroxidasa (7,5 g/ml) durante 5 días a 37 °C. En un experimento separado para estudiar este reacción en condiciones que se acercan a las fisiológicas, se diluyó el A 1-42 hasta 10 nM en solución fisiológica tamponada con fosfato (PBS, pH 7.4) y se incubó con 1 M de H2O2 y peroxidasa (7,5 g/ml) durante 5 días a 37 °C. Después de la incubación, las muestras se liofilizaron para llevar al péptido a un intervalo de concentración que podría ser detectado por Western blot (ver más abajo).

Los productos de reacción se separaron por cromatografía líquida de fase rápida (FPLC). El exceso de borato se precipitó primero de muestras antes de la cromatografía por centrifugación a 0 °C. Las muestras se acidificaron luego por adición de TFA al 0,25% y el material insoluble restante se eliminó por filtración (tamaño de poro 0,22 Las muestras se cargaron en una columna de 3 ml Resource RPC (Pharmacia, Uppsala, Suecia) y la columna se lavó con agua que contenía TFA al 0,1%. Se eluyeron especies ligadas con un gradiente lineal del 0-100% de acetonitrilo con TFA al 0,1% a 1 ml/min durante 45 min y se recolectaron en fracciones de 0,5 ml. Las fracciones se secaron, se reconstituyeron en agua y se ensayaron respecto de ditirosina por fluorescencia (excitación 330 nm; emisión 400 nm) y absorbancia UV (284 nm). Las fracciones pico luego se caracterizaron por espectrometría de masa y la ditirosina se cuantificó usando el coeficiente de extinción (E315 nm = 8380 M-1 cm-1; Malencik et al., 1996).

Las soluciones se analizaron respecto de la presencia de compuestos fluorescentes usando un espectrofluorímetro Hitachi F-4500. DT, TT y P tienen espectros de emisión característicos ( ex 325 nm, em 350-500 nm), que son muy distintos de los de tirosina y triptófano, que no son fluorescentes en estas longitudes de onda. Había un incremento lineal en la fluorescencia en este intervalo de emisión con mayor concentración de ditirosina entre 0-50

Espectrometría de masa MALDI-TOF

Las muestras de A derivado de amiloide humano oligomérico resistente a SDS se hidrolizaron al vacío con HCl 6 N durante 48 h a 105 °C. Según ello, las muestras se analizaron por cromatografía líquida MALDI-TOF espectrometría de masa (LCMS) en las instalaciones para espectrometría de masa de la Harvard University.

Los espectros de masa se obtuvieron usando un espectrómetro de masa LCT (Micromass Inc, Beverly MA) en interfaz con un cromatógrafo líquido HP 1100, unido a una columna C18 de fase inversa (2,1 mm x 250 mm). Se realizó LC-MS usando un gradiente de tampón A (agua-0,1% de ácido fórmico (FA)) y tampón B (acetonitrilo-0,1% de FA). El gradiente era del 2% de B (0 - 2 min) al 100% de B (20 - 23 min).

Análisis Western Blot

20%; Novex, San Diego, CA), se transfirieron a membranas de PVDF (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), se fijaron con glutaraldehído (1%, v/v), se bloquearon con leche (10%, p/v) y luego se sondearon con el anticuerpo monoclonal anti-A4G8 (Senetek, Maryland Heights, MI) durante la noche a 4 °C. En un experimento, se usaron los anticuerpos monoclonales WO2 (epíitope:residuos 5-8), G211 (epítope:residuos 35-42) o G210 (epítope:residuos 3340). El blot se incubó luego con peroxidasa de rábano picante antirratón (HRP) conjugada (Pierce, Rockford, IL) durante 2 h a temperatura ambiente y se desarrolló con reactivo ECL (Amersham, Little Chalfont, Reino Unido) o Supersignal Ultra (Pierce, Rockford, IL). La señal quimioluminiscente se capturó usando el sistema de análisis Fluoro-S Image (Bio-Rad, Hercules, CA) y se analizaron imágenes electrónicas usando el Multi-Analyst Software (Bio-Rad, Hercules, CA). Los marcadores de tamaño molecular eran de Amersham (Arlington Heights, IL).

Ejemplo 1: polimerización de A catalizada por peroxidasa está acompañada por formación de reticulaciones de tirosina

Inicialmente ensayamos si si las condiciones oxidativas catalizadas por peroxidasa podrían promover la polimerización de A al medir la fluorescencia de A 1-40 humano, A 1-42 humano y A 1-40 de rata (50 M) incubados con o sin H2O2 y peroxidasa durante 1 día. El análisis fluorimétrico de estas muestras indicó un marcado incremento de la fluorescencia en las muestras que contenían A

y A 1-42, tal como se ilustra en la figura 1A. Estos resultados son similares a los informados previamente para A humano sintético, logrado con una concentración mucho mayor de péptido, 1,25 mM (Galeazzi et al., 1999). Contrariamente al comportamiento del péptido A de secuencia humana, no se observó un aumento en la señal de fluorescencia de A 1-40 de rata después de incubación con H2O2 y peroxidasa, tal como se muestra en la figura 1A. Esto sugirió que la señal fluorescente era específica para los productos de oxidación de tirosina de A , dado que el A de rata carece de tirosina (Shivers et al., 1988).

Para confirmar que estas reacciones daban por resultado la polimerización de A , se corrieron A 1-40 y A 1-42 tratados como se describió antes en SDS-PAGE y se analizaron por Western blot. Ambos A 1-40 y A1-42 sintéticos humano incubados con H2O 2 y peroxidasa mostraron marcados incrementos en polímeros aparentes resistentes a SDS en comparación con A no tratado, tal como se muestra en la figura 1B. No se observaron ni la polimerización ni una mayor fluorescencia al incubar A con H2O2 o peroxidasa sola.

Ejemplo 2: la polimerización se produce en condiciones fisiológicas

Para determinar si la polimerización inducida por H 2O2 / peroxidasa de A sintético se produce en condiciones que se acercan a las fisiológicas, también incubamos A1-42 a 10 nM con H2O2 a 1 M y peroxidasa (7,5 g/ml) en PBS a pH 7,4. Observamos que la resistencia a SDS del péptido se volvió a inducir, tal como se muestra en la figura 1C; sin embargo, se generaron oligómeros de menor peso molecular aparente que los generados al usar mayores concentraciones de sustratos, tal como se ilustra en la figura 1B. La migración en SDS-PAGE de los polímeros de A aparentes en estas condiciones sugirió la formación de dímeros (8 Kd), trímeros (13 kD,) y tetrámeros (17 kD).

Tal como se indica en la figura 2A y la figura 2B, respectivamente, el análisis de fluorescencia de A purificado de tejido de cerebro post mortem afectado por AD reveló el patrón característico espectrofluorimétrico de especies reticuladas de tirosina; esta proteína purificada migro como oligómeros aparentes en SDS-PAGE, tal como se describió previamente (Roher et al., 1996).

Ejemplo 3: reticulación con tirosina de oligómeros

Para confirmar que el A derivado de amiloide humano aparentemente oligomérico era tirosina reticulada, se hidrolizó una muestra y luego se analizó por MALDITOF-MS. Este análisis, ilustrado en la figura 3A, indicó un pico correspondiente a 361 Da (m/z 361, representativo de M + H), confirmando así la existencia de DT o iso-DT en la muestra. Un menor pico correspondiente a 540 Da también se detectó, consistente con la presencia de TT o P. Se detectaron otros picos prominentes a 247, 263, 307, 309 y 538 Da; pueden representar otras modificaciones a los aminoácidos de A, como carbonilación (Atwood, 1999) y otras reticulaciones de aminoácidos. También se detectaron fragmentos más abundantes de la hidrólisis de A humano a 423 y 425 Da (relación 3:2), que sugiere la unión de Cu con DT o iso-DT (masa de Cu = 63 & 65 Da, = abundancia de isótopos naturales 2:1).

Ejemplo 4: Unión de cobre por ditirosina

A fin de ensayar si los picos a 423 y 425 podrían deberse a la unión de DT con Cu, examinamos la interacción de Cu2+ con DT por análisis espectroscópico. Se solubilizó la ditirosina (50 M) en tampón de fosfato (50 mM, pH 7,4) y los espectros de absorbancia (200 - 1000 nm) medidos en un SPECTRAmax Plus (Molecular Devices). Una depresión (280 nm) y un pico (315 nm) eran obvios. Luego se incubó la ditirosina con mayores concentraciones de CuNO3 (0-200 M) o NaCl (0-200 M) y se controlaron los cambios en la absorbancia tanto a 280 nm como a 315 nm.

Hallamos que como DT se incubó con mayores concentraciones de Cu2+, su pico de absorbancia característico a 315 nm se redujo, mientras que se desarrolló un nuevo pico de absorbancia a 280 nm. Los cambios espectroscópicos alcanzaron una meseta en una relación estequiométrica de entre 1:1 - 2:1 (Cu:DT) y luego se saturaron a 3:1, lo que sugiere que DT puede unir hasta 3 equivalentes de Cu. El enlace de dicloruro también produciría un incremento de unidad de masa p + 2 similar (masa de Cl = 35 y 37 Da, 3:1 abundancia isotópica natural), pero al coincubar DT con NaCl, no se indujo cambios de absorbancia espectroscópicos. Estos resultados se muestran en la figura 3C.

Ejemplo 5: Ditirosinación de A aumenta su capacidad de unión con cobre

Pronosticamos que una proporción del A hallada en la fracción soluble de cerebro humano mostraría mejores propiedades de unión al cobre debido a la ditirosinación. Para ensayar si este era de hecho el caso, pasamos una porción de extracto soluble de cerebro afectado por AD por una columna quelante de Sepharose cargada con cobre. 0,5 g de materia gris de corteza cerebral de AD congelado y cerebros de control (AC) se homogeneizaron en 3 ml de solución salina tamponada con fosfato helada (PBS). Las muestras se centrifugaron a 175 000 g durante 1 hora y el sobrenadante se retuvo para análisis del contenido de A . Se cargaron 10 ml de sobrenadante en una columna quelante de Sepharose cargada con 1 mg/ml de sulfato de cobre. Se lavaron las proteínas no ligadas usando 0,05 M de tampón de acetato de Na con 0,5 M de NaCl a pH 8. El material ligado se eluyó en un gradiente gradual de mayor acidez, usando etapas sucesivas de pH 5.5, 3 y 1, seguido de un lavado con 50 mM de EDTA para destilar la columna. Los eluatos se sometieron a diálisis exhaustiva para eliminar el cobre libre y las sales usando un corte de de 2 kDa de tamaño, se liofilizaron y se sometieron a análisis de SDS-PAGE, Western blot y LC-MS. Los espectros de masa ESI (+ ve ion) se adquirieron en un Quatro II triple cuadrupolar (Micromass). Los espectros de masa se recolectaron en modo continuo cada 8 segundos de 650 a 1650 m/z. Se introdujeron las muestras en la fuente iónica en 5 mM de tampón de acetato de amonio. Los análisis de slot blot no mostraron inmunorreactividad de WO2 en el eluato a pH 3 y se realizó una posterior elución a pH 1. Se detectó una fuerte inmunorreactividad a este pH y la muestra dializada era de color azul.

Los análisis Western blot revelaron la presencia de A en el pH 1 y las fracciones de EDTA; esto sugirió una unión al cobre de muy alta afinidad, dado que un pH de 3 es usualmente suficiente para eluir la proteína de mayor unión al cobre de una columna de este tipo. El material en estas fracciones se mostró altamente enriquecido en A oligomérico. Estos resultados se ilustran en la figura 4. La tinción con plata (figura 4A) demostró una purificación a base de afinidad metálica sustancial (vía 1 vs. 2) y el análisis Western blot mostró bandas inmunorreactivas que parecen corresponder con múltiples A monoméricos (figura 4B). La figura 5 muestra trazas LC (superior) y MS (inferior) de extractos de sobrenadante crudo y purificado por IMAC de tejido cerebral de AD. Llama la atención que los espectros de LC y MS sean sustancialmente más limpios para la muestra purificada por IMAC. El análisis de LC-MS de la muestra purificada por IMAC produjo señales correspondientes a especies de A , incluyendo A1-40 que lleva 2 átomos de cobre, tal como se confirmó por análisis de LC-MS de péptido sintético en presencia o en ausencia de cobre. Los grupos de picos destacados en espectros de masa representativos indican relaciones de masa / carga consistentes con iones principales de las masas 4515,1 (A 1-42) y 4457,9 (A1-40 +2 Cu).

A fin de confirmar si esta fracción de A fuertemente unida a cobre contenía DT, empleamos el anticuerpo monoclonal IC3 producido contra DT generado por medio de un proceso usando H2O2 y peroxidasa de rábano picante (Kato et al. (1998); esto fue el obsequio de Dr. Yoji Kato del Himeji Institute of Technology, Himeji, Japón.). Hallamos que los oligómeros de mayor peso molecular de A observados en Western blot se colocalizaban con tinción positiva de DT. Las fracciones que contenían A también exhibían espectros de emisión de fluorescencia característicos de la presencia del resto de ditirosina. Esta emisión se neutralizó con la adición de cobre de una forma pronosticada para la unión mejorada de cobre debida a esta modificación.

Ejemplo 6: Ulterior caracterización de A ditirosinado

Se aísla A enriquecido con DT de la fracción soluble de cerebro humano en cantidad suficiente para llevar a cabo otra caracterización. Estos estudios incluyen estudios de toxicidad en cultivo tisular, secuenciación de aminoácidos, estudios de unión con metales y experimentos para determinar si el A enriquecido con DT tenía mejor actividad electroquímica, por ejemplo, inducción de formación de peróxido de hidrógeno y reducción de cobre.

Ejemplo 7: Efecto de inmunización contra ditirosina

Intentamos producir una respuesta inmune a DT en ratones de tipo salvaje. En este experimento, se preparó DT mezclando tirosina en tampón de borato con H2O2 e incubando esta mezcla con peroxidasa de rábano picante, tal como se describe en los procedimientos experimentales.

Se conjugó DT con la proteína portadora de hemocianina de lapa californiana (KLH) usando glutaraldehído y de acuerdo con protocolos estándar. Se preparó una emulsión de cada uno de DT-KLH, KLH solo o tirosina no tratada en adyuvante completo de Freund y dos animales fueron inoculados cada uno por vía intraperitoneal con un inóculo que contenía 100 mg de DT-KLH o tirosina sin reaccionar o KLH solo. Se extrajo suero preinmune en ese momento. Los primeros sueros inmunes se recolectaron 10 días después de inmunización. Se administraron dos inmunizaciones de refuerzo a intervalos de quince días. Se extrajeron muestras de sangre en cada inoculación y una semana después del refuerzo final.

Se adaptó un ELISA para ensayar la respuesta inmune a DT. Hallamos que las respuestas inmunes a DT de los ratones que se inmunizaron con DT-KLH o tirosina sin reaccionar nunca eran más grandes que las respuestas de los ratones inmunizados con KLH solo. El anticuerpo monoclonal IC3 de DT obtenido de Dr. Kato se usó como un control positivo y produjo una modesta reacción positiva contra DT en este ensayo.

En un segundo experimento, se inmunizaron dos conejos con DT-KLH de la forma descrita con anterioridad. Los resultados de ELISA para sueros producidos por estos animales demostraron una respuesta inmune moderada contra DT.

También intentamos demostrar la presencia de anticuerpos endógenos a DT en sueros individuales de cuatro pacientes humanos con diagnóstico de enfermedad de Alzheimer por histopatología post mortem. No se observó una inmunorreactividad contra DT en estos sueros por ELISA o por Western blot.

En otra iteración experimental, examinamos si los antisueros de ratón o de conejo producidos contra el DTKLH descrito con anterioridad reconocieron restos de DT en los oligómeros de A diméricos y de orden superior extraídos de cerebro humano. Sorprendentemente, ninguno de los sueros demostró actividad contra restos de DT en A de cerebro humano. El anticuerpo de control positivo IC3 también era negativo en este ensayo.

Ejemplo 8: Efecto del método de producción de restos de ditirosina en inmunogenicidad y reactividad a anticuerpos

Sospechamos que la falta inesperada de una respuesta inmune se podía deber a una baja antigenicidad de los restos de ditirosina.

Para investigar esta hipótesis, preparamos A 1-40 y A 1-42 sintético reticulado con tirosina por medio de dos métodos diferentes. El primer método implicaba la incubación de los péptidos de A en tampón de borato con peroxidasa de rábano picante y H2O2, tal como se describió en los procedimientos experimentales anteriores.

En el segundo método, se preparó una solución 2,5 μM de A en agua desionizada doble con 30 μM de CuCl2 y 200 M de H2O2 y se incubó durante uno a cinco días a temperatura ambiente.

Se sometieron muestras de cada variedad de A reticulado a PAGE y se realizó Western blot usando el anticuerpo W02 específico de A o el anticuerpo IC3 anti-DT de control positivo. Los resultados de estos blots se presentan en la figura 6. El anticuerpo IC3 detectó DT en el A reticulado en los ensayos tanto de ELISA como de Western. Además, en los Western blots, el anticuerpo reconoció la presencia de ditirosina en DT-KLH producido en el Ejemplo 7. De estos resultados, parecía que A 1-42 es reticulado de manera más eficaz por los métodos de borato o de cobre que A Además, A1-40 pierde inmunorreactividad a WO2 cuando se reticula con el método que incluye cobre. Esto se puede deber a una mayor susceptibilidad del péptido a daño de radicales libres o la modificación, enmascaramiento

o impedimento del sitio de unión de anticuerpo después de la reticulación.

Sorprendentemente, también era evidente de la tinción diferencial con IC3 que el patrón de la reticulación de Através de la ditirosina depende de diversas reacciones usadas para producir la reticulación. El anticuerpo monoclonal IC3 no detectó el DT producido por el método de ácido bórico, pero sí detectó el DT producido por el método de cobre.

También de manera sorprendente, el anticuerpo IC3 detectó la reticulación de DT en A 1-40 en preferencia a A 1-42. Este patrón es la inversa de lo observado con el anticuerpo W02 anti A Estos resultados demuestran que el método de inducción de reticulación de DT y la estructura del polipéptido reticulado son variables cruciales en el reconocimiento de DT por un anticuerpo. En este caso, la adición de dos residuos de aminoácido a A 1-40 ligado con ditirosina dio como resultado una reducción dramática de la capacidad de unión de un anticuerpo de antiditirosina. Este resultado se puede extrapolar a la situación in vivo, lo que sugiere que la selección de antígeno es crítica para producir una respuesta inmune fisiológicamente relevante.

Ejemplo 9: Efecto de la forma de reticulación con tirosina en el reconocimiento de anticuerpos

Se anticipó que un inóculo de DT se debe conjugar con una proteína portadora grande para provocar una respuesta inmune. Por otra parte, la calidad de la respuesta inmune generada también sería en parte dependiente de la selección de un portador apropiado. Para examinar esto, seleccionamos dos portadores alternativos para diversas especies de DT, albúmina de suero bovino (BSA) y hemocianina de lapa californiana (KLH).

Además, para investigar el papel de las diferentes formas de ditirosina en el inmunorreconocimiento, preparamos una mezcla cruda que contenía una variedad de formas de DT, incluyendo numerosos oligómeros y formas ramificadas de DT. Las reticulaciones de tirosina en esta mezcla cruda se crearon usando el método de borato / H2O2 / peroxidasa descrito con anterioridad. La mezcla de DT resultante contenía moléculas con ligaciones en una variedad de posiciones en el anillo y la estructura de la molécula de tirosina. Los ejemplos de las estructuras producidas se ilustran en la figura 7.

La mezcla cruda luego se separó por HPLC en fase inversa en fracciones que contenían predominantemente monoditirosina, ditirosina, tritirosina y politirosina.

Dos importantes características de las estructuras oligoméricas son que pueden presentar múltiples copias de antígeno deseado para mejorar la inmunogenicidad y mejorar la respuesta inmune y que pueden permitir la presentación de formas alternativas de enlaces químicos entre los residuos de tirosina.

mostradas). Las reticulaciones resultantes representan más probablemente una mezcla racémica de una variedad de formas de reticulaciones de tirosina.

Se caracterizaron una cantidad de nuevas estructuras descritas con anterioridad en Western blots usando el anti-DT monoclonal IC3 o el inmunosuero de un conejo que se inmunizó con DT-KLH (descrito en el Ejemplo 7). Estos resultados se presentan en la figura 8.

Los resultados demostraron que el dímero pero no el trímero de A 9-16 ligado a BSA era inmunorreactivo tanto al inmunosuero de conejo como al anticuerpo monoclonal IC3.

La presencia de KLH fue reconocida por el inmunosuero de conejo en los blots sin tener en cuenta si estaba conjugado con un antígeno reticulado con tirosina adicional. Se reconoerion politirosina-BSA y politirosina-KLH por medio de IC3, pero el inmunosuero de conejo no pudo distinguir entre KLH solo y politirosina-KLH.

Queda claro de estos resultados que la inmunización del conejo produjo un anticuerpo que era reactivo con ciertas formas de ditirosina pero no otras, tal como se pronosticó a partir de los datos presentados en la figura 6.

Ejemplo 10: Efecto de la inmunización con ditirosina en depósitos de A en animales transgénicos

Están a disposición modelos de ratones transgénicos para una cantidad de trastornos neurológicos, incluyendo enfermedad de Alzheimer (Games et al., 1995; Hsiao et al., 1996); enfermedad de Parkinson (Masliah et al., 2000); familial esclerosis lateral amiotrófica (ALS) (Gurney et al., 1994); enfermedad de Huntington (Reddy et al., 1998); y enfermedad de Creutzfeld-Jakob (CJD) (Telling et al., 1994).

Hallamos que uno de los modelos transgénicos para la enfermedad de Alzheimer, el ratón APP2576 tg (Hsiao et al., 1996) también tiene una alta incidencia de catarata. Estos modelos animales son apropiados para ensayar los métodos de la invención.

Se usan ratones transgénicos de la cepa APP2576 (Hsiao et al., 1996). Se seleccionan ratones hembras de ocho a nueve meses de edad y se dividen en grupos para tratamiento.

Se preparan antígenos reticulados con tirosina usando una variedad de técnicas para generar diferentes formas de reticulaciones de tirosina. Los antígenos usados incluyen:

Antígeno

Proteína portadora

AA 9-16 dímero

BSA

AA 9-16 trímero

BSA

ATEE (crudo)

BSA

poli-tirosina

BSA

AA trímero

KLH

ATEE (crudo)

KLH

poli-tirosina

KLH

Cada inmunización comprende 25 g de antígeno en adyuvante completo de Freund, en un volumen total de 0,5 ml, dados por vía subcutánea.

Los animales de control recibieron proteína portadora sin el antígeno reticulado con tirosina.

5 Las muestras de suero se extraen a intervalos de 14 días, con inmunizaciones de refuerzo dadas a los 28 días. Las muestras séricas se ensayan respecto de la presencia de anticuerpo anti-DT, usando, por ejemplo, el método ELISA de Kato et al. Se espera obtener títulos altos de anticuerpo a aproximadamente las cinco semanas, después de la inyección de refuerzo final. Los niveles de A en sangre también fueron determinados. Una vez presente un anticuerpo de alto título, los ratones se sacrificaron a intervalos y se examinaron sus cerebros

10 para determinar si la inmunización reduce la formación de amiloide cerebral y para identificar el protocolo de inmunización más efectivo. Los niveles de A soluble e insoluble en el cerebro y en suero se determina usando Western blots calibrados. La carga de placa A en el cerebro se examina inmunohistoquímicamente. Otros ratones en cada grupo se ensayan durante un período de hasta ocho meses respecto del rendimiento cognitivo usando un laberinto de agua de Morris de acuerdo con métodos estándar. La salud general y el bienestar

15 de los animales también se midió todos los días por medio de un operador ciego usando una escala de números enteros de cinco puntos que calcula de forma subjetiva una combinación de características que incluyen la actividad motriz, la capacidad de alerta y los signos vitales generales.

Ejemplo 11: Efecto de tratamiento con anticuerpos contra ditirosina

Ratones normales fueron hiperinmunizados por medio de procedimientos estándar bien conocidos en la técnica con

20 uno o varios de los inmunógenos descritos en el Ejemplo 7. Los ratones se desangran a intervalos y sus sueros se ensayan respecto de anti-DT, tal como se describió con anterioridad. Después de detectar anticuerpo de alto título, se colectan los sueros y el componente de anticuerpo se aísla y/o se enriquece usando métodos comúnmente asequibles en la técnica.

Estos anticuerpos se inyectan por vía intravenosa o directamente en el CSF de ratones transgénicos APP2576, ya 25 sea en una dosis única o en dosis repetidas durante el transcurso de días o semanas.

Los ratones transgénicos se sacrifican a intervalos después del tratamiento con anticuerpos anti-ditirosina y sus cerebros se examinan para determinar si el tratamiento con anticuerpos reduce la formación de amiloides cerebrales.

Ejemplo 12: Diagnosis de condiciones asociadas con la reticulación con tirosina

30 Las muestras séricas y de fluido cerebroespinal (CSF) de pacientes con padecimiento confirmado de AD y de controles según la edad se ensayaron respecto de la presencia de compuestos reticulados con tirosina usando análisis de fluorescencia tal como se describió con anterioridad. En un grupo de muestras, los compuestos reticulados con tirosina en la muestra se enriquecen primero pasando la muestra por un soporte sólido acoplado con ácido nitrilotriacético, tal como se describe en la patente de EE.UU. nº 5972674.

35 Se realizan similares ensayos usando muestras de pacientes que padecen ALS, enfermedad de Parkinson y CJD.

Es posible que pacientes también puedan tener anticuerpos en circulación dirigidos contra compuestos reticulados con tirosina y así en un ensayo alternativo, tales anticuerpos se dirigen a sueros o CSF usando un ensayo de ELISA, empleando anticuerpos monoclonales dirigidos contra DT (Kato et al., 1998).

Ejemplo 13: Identificación de las formas de ditirosina presentes en A oxidativamente modificados

A fin de identificar la forma o las formas predominantes de DT presentes en A oxidativamente modificados, se generan fragmentos por digestión enzimática de oligómeros de A catalizados por cobre y los fragmentos se analizaron por espectrometría de masa. Esta técnica se aplicó recientemente al análisis de modificaciones oxidativas catalizadas por cobre a la proteína priónica (Requena, J. R., et al. 2001 PNAS 98: 7170-7175)

Esto permite que la identificación del antígeno sea más probablemente efectiva para producir anticuerpos monoclonales apropiados para usar en la inmunización pasiva, tal como se describe en el Ejemplo 11. Los métodos para generar anticuerpos monoclonales altamente específicos contra cualquier antígeno específico son bien conocidos en la técnica. Una vez seleccionado el antígeno, se lleva a cabo un análisis sistemático de los medios más efectivos de presentación de antígenos usando métodos conocidos.

Discusión

El daño neuronal en AD está asociado con A soluble más que con A insoluble que se inmoviliza en las placas neuríticas (McLean et al., 1999). Ahora mostramos por primera vez que los oligómeros de A neutóxicos extraídos de cerebros afectados por AD contienen reticulaciones de tirosina), que pueden ser DT, iso-DT, TT y/o P. Estas modificaciones se emularon in vitro incubando A con peroxidasa y H2O2 o por oxidación de A en presencia de iones cobre. Estas modificaciones pueden interferir con el metabolismo de A

pueden contribuir con la neurotoxicidad vista en AD y son indicativas del trastorno neuroquímico en la enfermedad.

Se cree que la formación del puente de carbono-carbono entre DT, T y P es irreversible; las reticulaciones de DT son muy resistentes al clivaje hidrolítico por HCl 6 N a 110 °C durante 24 h y a la digestión de las proteasas (Smail et al., 1995). Patológicamente, la resistencia catabólica de las modificaciones de DT de proteínas podría explicar la contribución de polímeros de tirosina a la formación de lipofuscina (Kato et al., 1998) y la reticulación de -cristalina en la formación de catarata fluorescente (Kikugawa et al., 1991). Claramente, se espera que la reticulación con tirosina de A inhiba su catabolismo y así pueda ser una etapa importante en la evolución de depósitos en la placa amiloide en AD.

La formación de reticulaciones de tirosina necesita que las moléculas que contienen radicales de tirosilo entren en contacto. Nuestros resultados sugieren que el residuo de tirosina de A debe ser accesible a las peroxidasa(s) y que los residuos de tirosilo entre subunidades A de amiloide deben ser opuestos en cierta etapa. Como el H2O2 se requiere para la formación de DT, la detección de modificaciones de DT en A de cerebro derivado de AD implica que el H2O2 es elevado en el cerebro en la AD. Sin pretender quedar ligado por ningún mecanismo opuesto, creemos que la activación fagocítica de las células microgliales en el parénquima cerebral, que está

(Van Muiswinkel et al., 1996). Los fagocitos activados liberan mieloperoxidasa (Pember et al., 1983) y generan especies de oxígeno reactivo durante el estallido respiratorio. Esta respuesta está diseñada para matar patógenos invasores o células tumorales; sin embargo, también se mostró que este ambiente promueve la oxidación de proteínas y lípidos circundantes (Byun et al., 1999). Se puede generar un microambiente similar en la vecindad de microglía activada. In vitro, los sistemas de mieloperoxidasa-H2O2 promueven la síntesis de especies reticuladas de tirosina tales como DT, TT, P e isoDT (Jacob et al., 1996).

Así, la activación de microglía en respuesta a la acumulación de A puede promover la reticulación con tirosina del A, inhibiendo su clearance y llevando a un ciclo vicioso. Al contribuir con este posible ciclo vicioso, se puede generar una fuente próxima de H2O2 para la formación de DT por el A en sí, dado que A forma H2O2 por reacción con O2 a través de la reducción de cantidades subestequiométricas de Cu2+ o Fe2+ (Huang, Atwood, et al., 1999; Huang, Cuajungco, et al., 1999). En consecuencia, es altamente significativo que el A se purificara intacto, junto con cobre ligado, de amiloide humano (figura 3A). El A1-42 sintético se une con Cu2+ con afinidad attomolar y como el cobre está enriquecido en amiloide AD (Lovell et al., 1998), sospechamos que A se podría unir con cobre in vivo. El hallazgo de que el A derivado de amiloide contenga cobre también es relevante para la patofisiología de la AD, porque el Cu2+ precipita el A(Atwood et al., 1998) y la toxicidad del péptido está potenciada por el Cu2+ (Huang, et al., 1999).

Curiosamente, el Cu2+ quedó ligado a DT después de una hidrólisis ácida del A derivado de amiloide humano, así como en condiciones ácidas de la espectrometría de masa (figura 3A). Esta afinidad inusual por Cu 2+ podría ser el resultado de un sitio de unión con Cu2+ de alta afinidad adventicia en el A que se formó por modificación de DT. Como consecuencia de esta exagerada afinidad por Cu2+, la neurotoxicidad del A modificado con DT o su actividad electroquímica se pueden incrementar en comparación con AA no modificado. La unión de Cu2+ adventicia causada por la modificación de DT también podría exagerar la precipitación de A en amiloide, que explicaría por qué el tratamiento con agentes quelantes a pH 7,4 promovían la liberación de A dimérico en mayor medida que la de A monomérico (ensayado por Western blot) de tejido cerebral post mortem de AD (Cherny et al., 1999). La combinación de mayor resistencia proteolítica y unión metálica adventicia puede tener consecuencias

particularmente perniciosas de la reticulación con tirosina de A que contribuye con la patología de AD.

Los ratones transgénicos PDAPP sobreproducen la forma humana de A 1-42 y muestran una extensa deposición de placas amiloides cerebrales con el avance de la edad, así como déficits de comportamiento y cognitivos (Games et al., 1995; documento WO 96/40896). La inmunización de ratones maduros PDAPP con A 1-42 sintético da como 5 resultado una disminución notable en la cantidad y la intensidad de placas amiloides, mientras que los ratones PDAPP inmunizados con este antígeno fallaron al desarrollar placas amiloides (Schenk et al., 1999 y documento WO 99/27944). Parece que se indujo una respuesta inmune exitosa a A 1-42, con evidencia de células microgliales depuradoras en la cercanía inmediata de placas amiloides remanentes y la presencia en sangre de anticuerpos dirigidos contra A1-42. Los autores sugirieron que la inmunización con A podría usarse para prevenir o tratar AD. 10 Sin embargo, se piensa ampliamente que es improbable que una inmunoterapia para AD sea viable, ya que un receptor humano sería incapaz de montar una respuesta inmune significativa a una proteína propia debido a la tolerancia inmunológica. Los resultados obtenidos por Schenk et al. sugieren que el cerebro puede tener la capacidad para resorber y clarificar depósitos amiloides intratables de otro modo, dado el estímulo apropiado. Sin embargo, es indeseable usar la inmunización con A en sí, debido al potencial para inducción de respuestas

15 autoinmunes nocivas y/o la inducción de una respuesta inadecuada no clarificante de placas. Al inmunizar con ditirosina no nativa o compuestos que contienen ditirosina de acuerdo con la presente invención, se puede evitar este problema.

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un oligómero de péptido A que comprende un resto de tirosina reticulada para usar en el tratamiento, prevención

   o alivio de la enfermedad de Alzheimer.

2. 2. El oligómero de péptido A para usar de acuerdo con la reivindicación 1, que es una porción inmunogénica de la forma patológicamente agregada de A, donde el péptido comprende un resto de tirosina reticulada ligado a residuos corriente arriba y corriente abajo de la tirosina reticulada.

3. 3. El péptido A para usar de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que es un dímero, trímero o tetrámero de un monómero de péptido A

4. 4. El péptido A para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es un dímero de un monómero de péptido seleccionado del grupo que consiste en A 1-40, A1-42 y A 9-16 humano.

5. 5. El oligómero de péptido A para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde las reticulaciones de tirosina en el péptido se pueden obtener por oxidación en presencia de iones cobre.

6. 6. El oligómero de péptido A para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que se acopla con una proteína portadora que en sí es inmunogénica.

7. 7. El oligómero de péptido A para usar de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la proteína portadora está seleccionada del grupo que consiste en toxoide tetánico, hemocianina de lapa californiana y albúmina.

8. 8. El oligómero de péptido A para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el péptido se formula para administrar junto con un adyuvante.

9. 9. El oligómero de péptido A para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho péptido comprende una o varias de las formas predominantes de reticulaciones de tirosina en la forma patológicamente agregada de A

10. 10. Un anticuerpo que se produce contra un péptido A de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 ó 9

    o un fragmento de anticuerpo de él para usar en la prevención, el tratamiento o el alivio de la enfermedad de Alzheimer, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es capaz de unir específicamente la forma patológicamente agregada de A

11. 11.

    El anticuerpo o fragmento de anticuerpo para usar de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicho anticuerpo es policlonal.

12. 12.

    El anticuerpo o fragmento de anticuerpo para usar de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en donde dicho anticuerpo es de origen humano.

13. 13.

    El anticuerpo o fragmento de anticuerpo para usar de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el anticuerpo es monoclonal.

14. 14.

    El anticuerpo o fragmento de anticuerpo para usar de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el anticuerpo es humanizado.

15. 15.

    Una composición preventiva o terapéutica para usar como un medicamento que comprende un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, junto con un portador farmacéuticamente aceptable.

16. 16.

    Una composición preventiva o terapéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 15, que también comprende un adyuvante.

17. 17. El uso de un péptido A de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14 en la fabricación de un medicamento para tratar, prevenir o aliviar la enfermedad de Alzheimer.

18. 18.

    Un método de diagnosis de la enfermedad de Alzheimer, que comprende la etapa de ensayar in vitro una muestra de un fluido biológico de un sujeto sospechado de sufrir de la condición por la presencia de una molécula que comprende reticulaciones de tirosina o un anticuerpo dirigido contra una molécula que comprende reticulaciones de tirosina.

19. 19. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde dicha molécula que comprende reticulaciones de tirosina es un péptido A de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 ó 9.

20. 20. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde el péptido A comprende ditirosina.

21. 21.

    El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en donde el fluido biológico está seleccionado del grupo que consiste en sangre, plasma, suero, fluido cerebroespinal, orina y saliva.