AT413945B - Impfstoff für die alzheimer-krankheit - Google Patents

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Description

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AT 413 945 B
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Verhütung und Behandlung der Alzheimer-Krankheit (Alzheimer's disease, AD).
Amyloid-ß-Peptid (Aß) spielt in der Neuropathologie der Alzheimer-Krankheit (AD) eine zentrale 5 Rolle (Roher et al., 1993: ß-Amyloid-(1-42) is a major component of cerebrovascular amyloid deposits: Implications for the pathology of Alzheimer's disease (ß-Amyloid-(1-42) ist eine Hauptkomponente von zerebrovaskulären Ablagerungen: Implikationen für die Pathologie der Alzheimer-Krankheit] PNAS 90: 10836). Familiäre Formen der Erkrankung sind mit Mutationen im Amyloid-Vorläuferprotein (amyloid precursor protein, APP) und den Präsenilin-Genen in Verbin-io düng gebracht worden. Mit der Erkrankung verbundene Mutationen in diesen Genen führen zu einer erhöhten Produktion der 42-Aminosäureform des Peptids (Aß42), welches die Hauptform ist, die in den Amyloid-Plaques der Alzheimer-Krankheit zu finden ist. Ein Tiermodell der Erkrankung ist im Handel erhältlich. Die PDAPP transgene Maus, die mutantes humanes APP überexprimiert (wobei die Aminosäure in Position 717 F anstelle von V ist), entwickelt progres-15 siv viele der neuropathologischen Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit in Alters- und Gehirnabhängiger Weise (Games et al., 1995: Alzheimer-type neuropathology in transgenic mice overexpressing V717F ß-amyloid precursor protein [Neuropathologie vom Alzheimer-Typ bei transgenen Mäusen, die V717F ß-Amyloid-Vorläuferprotein überexprimieren], Nature 373: 523). 20
Es sind bereits Vakzinationsstudien mit einem normalen , nicht auf einem Mimotop basierenden Impfstoff durchgeführt worden. Transgene Tiere wurden mit aggregiertem Aß42 immunisiert, entweder vor Einsetzen der AD-typischen Neuropathologien (6 Wochen) oder in höherem Alter (11 Monate): Die Immunisierung der jungen Tiere verhinderte die Entwicklung der Plaque-25 bildung, neuritische Dystrophie und Astrogliose. Die Behandlung der älteren Tiere reduzierte die AD-artigen Neuropathologien deutlich. Dieser experimentelle Impfansatz löste die Entwicklung von Antikörpern gegen Aß42 aus, die in der Lage waren, die Blut-Hirn-Schranke zu durchbrechen und Amyloid-Plaques anzugreifen (Schenk et al., 1999: Immunization with amyloid-ß attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse [Die Immunisierung mit 30 Amyloid-ß schwächt die Alzheimer-artige Pathologie bei der PDAPP-Maus ab] , Nature 400: 173). Die Plaques werden in der Folge durch mehrere Mechanismen entfernt, einschließlich durch Fc-Rezeptor mediierte Phagozytose (Bard et al., 2000: Peripherally administered antibodies against amyloid ß-peptide enter the central nervous System and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease [Peripher verabreichte Antikörper gegen Amyloid-ß-Peptid 35 dringen in das Zentralnervensystem ein und reduzieren die Pathologie in einem Mäusemodell der Alzheimer-Krankheit] , Nature Med. 6: 916). Dieser Impfstoff war auch in der Lage, Erinnerungsdefizite aufzuschieben (Janus et al., 2000: Aß peptide immunization reduces behavioural impairment and plaques in a model of Alzheimer's disease [Aß-Peptid-Immunisierung reduziert Verhaltensbeeinträchtigungen und Plaques in einem Modell der Alzheimer-Krankheit] , Nature 40 408:979).
Seit Ende 1999 ist eine äußerst vielversprechende Immunisierungstherapie für AD in der klinischen Testphase. Es wird angenommen, dass die Immunisierung das Immunsystem dazu bringt, die Plaques anzugreifen und diese Ablagerungen aus dem betroffenen menschlichen 45 Gehirn zu entfernen, obwohl der zugrunde liegende genaue Mechanismus noch mehr im Detail charakterisiert werden muss.
Diese klinischen Versuche wurden von der pharmazeutischen Firma Elan zusammen mit ihrer Schwesterfirma American Home Products durchgeführt (therapeutischer Impfstoff AN-1792, so QS21 als Adjuvans). Die Versuche der Phase I wurden im Jahre 2000 erfolgreich abgeschlossen. Gegen Ende 2001 wurde mit den Versuchen der Phase II begonnen, um die Wirksamkeit an einer Gruppe von Patienten mit schwacher bis mittlerer AD zu testen.
Nun wurden diese Versuche der Phase II wegen Nervenentzündungen bei mehreren Patienten 55 ständig unterbrochen (Editorial 2002, Insoluble problem? [Unlösbares Problem?], Nature Med. 3
AT 413 945 B 8: 191). Die Symptome umfassten aseptische Meningoenzephalitis, die zu einem sofortigen Stopp dieser weltweiten Versuche führte. Im schlechtesten Fall wird sich zeigen, dass die betroffenen Patienten eine Autoimmunantwort aufgebaut haben - ein Risiko, das viele Immuntherapien mit sich bringen. Autoimmunkomplikationen hätten angesichts der Allgegenwart von APP 5 vorhergesehen werden können, das natürlich antigene Determinanten trägt, die es mit seinem proteolytischen Produkt gemeinsam hat. Seitdem haben sich zusätzliche Studien auf die Eigenschaften von aggregierten Aß42 Immunisierungs-induzierten Antikörpern (bei Menschen und Mäusen) konzentriert und herausgefunden, dass die meisten Antikörper eine kleine Domäne zwischen Aminosäure 4 und 10 von Aß42 (Aß4-10) erkennen. Die Maus-Antikörper waren in der io Lage, die Aß-Fibrillogenese zu blockieren, und zerstörten bereits vorhandene Aß-Fasern (McLaurin et al., 2002: Therapeutically effective antibodies against amyloid-ß peptide target amyloid-ß residues 4-10 and inhibit cyctotoxicity and fibrillogenesis [Therapeutisch wirksame Antikörper gegen Amyloid-ß-Peptid zielen auf Amyloid-ß-Reste 4-10 und inhibieren die Zytotoxizität und die Fibrillogenese] Nature Med. 8: 1263). Interessanter Weise reagieren die menschli-15 chen Antikörper nicht mit dem auf der Oberfläche von Zellen exponierten APP oder irgendeinem anderen nicht aggregierten proteolytischen Produkt des Vorläufers (Hock et al., 2002: Generation of antibodies specific for ß-amyloid by vaccination of patients with Alzheimer disease [Die Erzeugung von ß-Amyloid-spezifischen Antikörpern durch Impfung von Patienten mit Alzheimer-Krankheit] , Nature Med. 8:1270). Es wurde ein deutlicher Unterschied zwischen den 20 Seren von Menschen und Mäusen beobachtet: Im Gegensatz zu den menschlichen Antikörpern erkennen Mäuseantikörper monomere, Oligomere und fibrilläre Aß. Dies ist bedeutsam und kann eine Vorbedingung für die therapeutische Wirksamkeit sein, da es immer mehr Anzeichen dafür gibt, dass kleine Oligomere von Aß, die von humanem anti- Aß nicht erkannt werden, die toxischen Hauptakteure bei der Erkrankung sind (Walsh et al., 2002: Naturally secreted oligo-25 mers of amyloid ß protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo [Natürlich sekretierte Oligomere von Amyloid ß-Protein inhibieren sehr wirksam die Langzeit-Potenzierung im Hippocampus in vivo] , Nature 416: 535). Daher besteht eine potentielle neue Strategie in der Immunisierung mit einem Impfstoff, der ß-Amyloid-Aminosäuren 4-10 (anstelle von aggregiertem Aß42) enthält. Trotz der noch unbekannten Wirksamkeit kann sich auch diese Strategie 30 mit Autoimmunproblemen konfrontiert sehen, da die Patienten direkt mit einem (linearen B-Zellen-) Selbst -Epitop immunisiert werden sollen.
Trotz dieser enttäuschenden Entwicklungen bei den jüngsten AD-Impfstrategien wird ein Aß-Impfstoff noch immer als der verheißungsvollste Weg im Kampf gegen AD angesehen. Es 35 sind jedoch dringend Verbesserungen und neue Strategien bei der AD-Impfung erforderlich. Insbesondere sollte ein solcher Impfstoff keine autoreaktiven T- und/oder B-Zellen anregen.
Daher liefert die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Verbindung, die die folgende Aminosäuresequenz umfasst: 40 X1X2X3X4X5X6, worin X, eine Aminosäure außer C ist, X2 eine Aminosäure außer C ist, 45 X3 eine Aminosäure außer C ist, X4 eine Aminosäure außer C ist, X5 eine Aminosäure außer C ist, X6 eine Aminosäure außer C ist, und worin X^X^XsXe nicht DAEFRH ist, wobei diese Verbindung eine Bindefähigkeit an so einen Antikörper hat, der für die natürliche N-terminale Aß42 Sequenz DAEFRH spezifisch ist, zur Herstellung eines Impfstoffs für die Alzheimer-Krankheit (Alzheimer's disease, AD).
Erfindungsgemäß wird ein Aß42 Mimotop zur Impfung gegen AD verwendet: Das Mimotop löst die Produktion von Antikörpern gegen Aß42, jedoch nicht gegen das native APP aus. Das Miss motop kann mit einem (monoklonalen) Antikörper und (im Handel erhältlichen) Peptidbibliothe- 4
AT 413 945 B ken identifiziert werden (z.B. gemäß Reineke et al., 2002: Identification of distinct antibody epitopes and mimotopes from a peptide array of 5520 randomly generated sequences [Identifizierung distinkter Antikörperepitope und Mimotope von einer Peptidsammlung von 5520 willkürlich hergestellten Sequenzen] , J. Immunol. Methods 267: 37). Es wird ein (monoklonaler) Anti-5 körper verwendet, der APP nicht erkennt, jedoch nur verschiedene Aß Spezies mit Amino-terminaler Asparaginsäure erkennt (ein Beispiel für einen solchen Antikörper ist in Johnson-Wood et al., 1997, beschrieben: Amyloid precursor protein processing and Aß42 deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer disease [Die Verarbeitung von Amyloid-Vorläuferprotein und die Ablagerung von Aß42 in einem transgenen Maus-Modell der Alzheimer-Krankheit] , io PNAS 94: 1550). Ein solcher Antikörper hat sich im Laufe der vorliegenden Erfindung als ein ideales Werkzeug zur Identifizierung von für die Impfung geeigneten Mimotopen erwiesen. Obwohl sich gezeigt hat, dass derartige monoklonale Antikörper in einem Maus-Modell von AD positive Wirkungen haben, wenn sie direkt an die Mäuse verabreicht werden (Bard et al., 2000;
Peripherally administered antibodies against amyloid ß-peptide enter the central nervous sys-15 tem and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease [Peripher verabreichte Antikörper gegen Amyloid ß-Peptid dringen in das Zentralnervensystem ein und verringern die Pathologie in einem Maus-Modell der Alzheimer-Krankheit] , Nature Med. 6: 916), ist niemals vorgeschlagen worden, diese Antikörper als Mimotop-Suchwerkzeuge zur Isolierung von AD-Impfstoffverbindungen zu verwenden. 20
Im Stand der Technik konzentrierten sich alle Bemühungen auf die natürlich vorkommenden Aß-Peptide. Wie oben erwähnt, wurden die klinischen Versuche mit Aß-Peptid-Impfstoffen auf Grund von Nervenentzündungsereignissen gestoppt. Tatsächlich schlagen T-Zellen-Epitop-Vorhersageprogramme (BlMAS für Klasse l-beschränkte Epitope und TEPITOPE für Klasse 25 Il-beschränkte Epitope) eine große Anzahl von (Selbst-)Epitopen innerhalb der Sequenz vor. Dies könnte implizieren, dass die Nervenentzündungsereignisse durch Autoimmunreaktionen ausgelöst wurden, was einen solchen Impfstoff für die allgemeine Anwendung ungeeignet machen würde. 30 Im Gegensatz zu solchen Aß-Impfstoffen, die im Stand der Technik vorgeschlagen wurden, ist während der Behandlung mit einem Impfstoff, der ein erfindungsgemäßes Mimotop enthält, kein Auftreten von Autoimmunreaktionen zu erwarten, da der erfindungsgemäß für die Mimotopeni-dentifizierung verwendete (monoklonale) Antikörper APP nicht erkennt und sich die Mimotopse-guenz von von Aß42 abgeleiteten Selbstsequenzen unterscheidet, die in Versuchen bisher 35 verwendet wurden oder in zukünftigen Versuchen verwendet werden sollen.
Der erfindungsgemäß für die Mimotopenidentifizierung verwendete Antikörper erkennt die von Aß abgeleitete Aminosäuresequenz DAEFRH (= ursprüngliches Epitop) mit einer freien Amino-terminalen Asparaginsäure, natives APP jedoch nicht. Der Antikörper kann ein monoklonales 40 oder polyklonales Antikörperpräparat oder jeglicher Antikörperteil oder Derivat davon sein, die einzige Vorbedingung ist, dass das Antikörpermolekül spezifisch das DAEFRH-Epitop erkennt, d.h. dass es nicht an die natürlichen N-terminal verlängerten Formen des Amyloid-Vorläuferproteins bindet, was bedeutet, dass die Bindungsfähigkeit an das DAEFRH-Epitop mindestens 100 Mal, vorzugsweise mindestens 1000 Mal, noch mehr bevorzugt mindestens 45 105 Mal höher ist als an das APP-Molekül. Der Antikörper kann ein Antikörper sein, der die gleiche oder eine höhere Bindungsfähigkeit an die DAEFRH-Sequenz aufweist als der Antikörper, der von Johnson-Wood et al. 1997 beschrieben wurde. Selbstverständlich können auch Antikörper mit einer geringeren Bindungsfähigkeit verwendet werden (> 10%, > 50% oder > 80% der Bindungsfähigkeit des Antikörpers von Johnson-Wood et al.), obwohl die höhere so Bindungsfähigkeit mehr bevorzugt ist.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen binden an jene Antikörper mit vergleichbarer Spezifität wie die DAEFRH-Sequenz. 55 Die erfindungsgemäß zu verwendende Verbindung umfasst oder besteht vorzugsweise aus 5
AT 413 945 B einem Peptid, worin X, eine Aminosäure mit einer Hydroxygruppe oder eine negativ geladene Aminosäure ist, vorzugsweise E, Y, S oder D, X2 eine hydrophobe Aminosäure oder eine positiv geladene Aminosäure ist, vorzugsweise I, L, s V, K, W, R, Y, F oder A, X3 eine negativ geladene Aminosäure ist, vorzugsweise D oder E, X4 eine aromatische Aminosäure oder L ist, vorzugsweise Y, F oder L, X5 Η, K, Y, F oder R ist, vorzugsweise H, F oder R, und X6 R, I, K, Y oder G ist, vorzugsweise R, I oderG, io insbesondere EIDYHR, ELDYHR, EVDYHR, DIDYHR, DLDYHR, DVDYHR, DIDYRR, DLDYRR, DVDYRR, DKELRI, DWELRI, YREFRI, YAEFRG, EAEFRG, DYEFRG, ELEFRG oder SFEFRG.
Die erfindungsgemäße Verbindung (Mimotop) hat eine bevorzugte Länge von 5 bis 15 Amino-15 säuren. Diese Verbindung kann im Impfstoff in isolierter (Peptid-)Form vorliegen oder kann an andere Moleküle gekoppelt oder komplexiert sein, wie pharmazeutische Trägersubstanzen oder Polypeptid-, Lipid- oder Kohlenhydratstrukturen. Vorzugsweise haben die erfindungsgemäßen Mimotope eine (Mindest-)Länge zwischen 5 und 15, 6 und 12 Aminosäureresten, spezifisch zwischen 9 und 11. Die Mimotope können jedoch (kovalent oder nicht kovalent) an unspezifi-20 sehe Linker oder Träger gekoppelt sein, insbesondere Peptidlinker oder Proteinträger. Weiters können die Peptidlinker oder Proteinträger aus T-Zellen-Helfer-Epitopen bestehen oder solche enthalten.
Vorzugsweise ist der pharmazeutisch annehmbare Träger KLH, Tetanustoxoid, Albumin bin-25 dendes Protein, bovines Serumalbumin, ein Dendrimer (MAP; Biol. Chem. 358: 581) sowie die Adjuvanssubstanzen, die in Singh etal., Nat. Biotech. 17 (1999), 1075-1081 (insbesondere jene in Tabelle 1 dieses Dokuments), und O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9) (2003), 727-735 (insbesondere die darin beschriebenen endogenen immunpotenzierenden Verbindungen und die Abgabesysteme) beschrieben sind, oder Mischungen davon. Außerdem 30 kann die Impfstoffzusammensetzung Aluminiumhydroxid enthalten.
Ein Impfstoff, der die vorliegende Verbindung (Mimotop) und den pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst, kann auf jegliche geeignete Anwendungsweise, z.B. i.v., i.p., i.m., intranasal, oral, subkutan, etc. und in jeglicher geeigneten Abgabevorrichtung (O'Hagan et al., Nature 35 Reviews, Drug Discovery 2 (9), (2003), 727-735) verabreicht werden. Typischer Weise enthält der Impfstoff die erfindungsgemäße Verbindung in einer Menge von 0,1 ng bis 10 mg, vorzugsweise 10 ng bis 1 mg, insbesondere 100 ng bis 100 pg oder, alternativ dazu, z.B. 100 fMol bis 10 pMol, vorzugsweise 10 pMol bis 1 μΜοΙ, insbesondere 100 pMol bis 100 nMol. Der Impfstoff kann auch typische Hilfsstoffe, z.B. Puffer, Stabilisatoren, etc. enthalten. 40
Gemäß einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung weiters auf ein Verfahren zur Isolierung einer Verbindung, die an einen Antikörper bindet, der für die natürliche N-terminale Aß42 Sequenz DAEFRH spezifisch ist, umfassend die folgenden Schritte: 45 - Zur-Verfügung-Stellung einer Peptidverbindungsbibliothek, umfassend Peptide, die die folgen de Aminosäuresequenz enthalten: X1X2X3X4X5X6, so worin X! eine Aminosäure außer C ist, X2 eine Aminosäure außer C ist, X3 eine Aminosäure außer C ist, X4 eine Aminosäure außer C ist, X5 eine Aminosäure außer C ist, 55 X6 eine Aminosäure außer C ist, 6
AT 413 945 B und worin X1X2X3X4X5X6 nicht DAEFRH ist, - In-Kontakt-Bringen dieser Peptidbibliothek mit diesem Antikörper, und - Isolierung jener Mitglieder der Peptidbibliothek, die an diesen Antikörper binden. 5 Gemäß einer spezifischen Ausführungsform dieses Aspektes bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Isolierung einer Verbindung, die an einen Antikörper bindet, der für die natürliche N-terminale Aß42 Sequenz DAEFRH spezifisch ist, umfassend die folgenden Schritte: io - Zur-Verfügung-Stellung einer Peptidverbindungsbibliothek, umfassend Peptide, die die folgende Aminosäuresequenz enthalten: X1X2X3X4X5X6, 15 worin eine natürliche Aminosäure außer K und C ist, X2 eine natürliche Aminosäure außer C ist, X3 eine natürliche Aminosäure außer K und C ist, X4 eine natürliche Aminosäure außer K und C ist, X5 eine natürliche Aminosäure außer C ist, 20 X6 eine natürliche Aminosäure außer P und C ist, und worin Χ1Χ2Χ3Χ4Χ5Χ6 nicht DAEFRH ist, - In-Kontakt-Bringen dieser Peptidbibliothek mit diesem Antikörper, und - Isolierung jener Mitglieder der Peptidbibliothek, die an diesen Antikörper binden. 25 Ein solches Verfahren hat sich zur Beschaffung von Aß Mimotopen gemäß der vorliegenden Erfindung als erfolgreich erwiesen.
Vorzugsweise werden diese Peptide in der genannten Bibliothek in individualisierter Form zur Verfügung gestellt, insbesondere immobilisiert auf einer festen Oberfläche, wie es z.B. mit der 30 MULTIPIN Peptidtechnologie möglich ist. Die Bibliothek kann auch als Peptidmischung zur Verfügung gestellt sein, und die Antikörper: Peptid-Komplexe können nach der Antikörperbindung isoliert werden. Alternativ dazu kann der Antikörper immobilisiert sein, und die Peptidbibliothek (in Suspenion oder Lösung) wird dann mit den immobilisierten Antikörpern in Kontakt gebracht. 35
Vorzugsweise umfassen die Screening-Antikörper (oder die Mitglieder der Peptidbibliothek) einen geeigneten Marker, der den Nachweis oder das Isolieren des Antikörpers oder des Antikörper: Peptid-Komplexes bei Bindung an ein Peptid der Bibliothek ermöglicht. Geeignete Markersysteme (u.a. Biotinylierung, Fluoreszenz, Radioaktivität, magnetische Marker, Farben ent-40 wickelnde Marker, sekundäre Antikörper) sind für den Fachmann leicht verfügbar.
Die Bibliothek muss konstruiert werden, um die natürlich vorkommende Aß Sequenz (z.B. DAEFRH) auszuschließen, da eine Impfung mit dieser Sequenz von dieser Erfindung eindeutig ausgeschlossen ist. 45
Eine weitere geeignete Technik zur Isolierung der Epitope gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Screening in Phage-Peptid-Bibliotheken, wie z.B. in WO 03/020750 beschrieben.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf einen Impfstoff gegen die Alzheimer-Krankheit, so umfassend ein Antigen, das zumindest ein Peptid beinhaltet, ausgewählt aus der Gruppe EIDYHR, ELDYHR, EVDYHR, DIDYHR, DLDYHR, DVDYHR, DIDYRR, DLDYRR, DVDYRR, DKELRI, DWELRI, YREFRI, YAEFRG, EAEFRG, DYEFRG, ELEFRG oder SFEFRG. Diese Peptide sind neben den anderen mit der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellten Peptiden spezifisch für die Verwendung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammenset-55 zung, insbesondere für AD-Impfstoffe, geeignet. Diese Sequenzen sind rein künstliche 7
AT 413 945 B Aß-Mimotope. Die Peptide können - für Impfzwecke - (kovalent oder nicht kovalent) an geeignete Träger gekoppelt sein und können als Peptidverbindungen oder Komplexe zusammen mit anderen Verbindungen oder Moietäten, z.B. Adjuvantien, Peptiden oder Proteinträgem, etc. vorliegen und auf geeignete Weise verabreicht werden (wie z.B. in O'Hagan et al., Nature Re-5 views, Drug Discovery 2 (9) (2003), 727-735 beschrieben).
Die Erfindung ist in den folgenden Beispielen und Zeichnungen noch weiter beschrieben, selbstverständlich ohne darauf beschränkt zu sein. io Fig. 1 zeigt die individualisierten Peptidmitglieder von Bibliothek 4, die für den vorliegenden Screening-Prozess verwendet werden.
Fig. 2 zeigt einen Inhibitionsassay mit Mimotopen für DAEFRH.
Fig. 3 zeigt einen weiteren Inhibitionsassay mit anderen Mimotopen für DAEFRH. 15 BEISPIELE: 1. : Herstellung monoklonaler Antikörper (mAb) zum Nachweis von von Aß42 abgeleiteten Peptidarten mit freiem N-Terminus (freie Asparaginsäure am N-Terminus) 20 Mäuse werden mit dem 6-meren Peptid DAEFRH (natürliche N-Terminale Aß42-Sequenz) geimpft, das mit dem Protein Rinderserumalbumin BSA verbunden ist (um den Hapten-Träger-Effekt auszunützen), emulgiert in CFA (erste Injektion) und IFA (Auffrischungsinjektionen). DAEFRH-Peptid-spezifische, Antikörper produzierende Hybridome werden mittels ELISA nachgewiesen (DAEFRH-Peptid-beschichtete ELISA-Platten). Peptid SEVKMDAEFRH (natürliche 25 N-terminal verlängerte Sequenz, von APP abgeleitet, enthaltend die von Aß42 abgeleitete Sequenz DAEFRH) wird als negatives Kontrollpeptid verwendet: Hybridome, die das verlängerte Peptid erkennen, werden ausgeschlossen, da sie nicht zwischen von Aß42 abgeleiteten Peptiden mit freier Asparaginsäure am N-Terminus und von APP abgeleitetem Peptid DAEFRH ohne freie Asparaginsäure unterscheiden. 30 2. : Konstruktion von Peptidbibliotheken:
Die Mimotope der vorliegenden Erfindung wurden durch Adaptierung des Verfahrens von Rein-ke et al., 2000, durch Screening von Peptidbibliotheken auf Bindungen an einen Antikörper 35 (vorzugsweise einen monoklonalen Antikörper) gefunden, der spezifisch für Aß-Arten mit Ami-no-terminaler Asparaginsäure ist. Ein weiteres Verfahren ist im Handel als MULTIPIN Peptidtechnologie erhältlich.
Die MULTIPIN Peptidtechnologie beinhaltet das Synthetisieren von Peptiden auf speziell 40 hergestellte Polyethylennadeln (pins), die in einem Format, das zur standardmäßigen 8 x 12 Mikrotiterplatte passt, die für zahlreiche biologische Assays verwendet wird, auf Blöcken montiert sind. Sowohl an Nadeln gebundene (nicht spaltbare Peptide, die kovalent an der Nadel gebunden bleiben) als auch Lösungsphasen-Peptide (jene, die von der Oberfläche der Nadel abgespalten wurden) können mit Hilfe dieses Verfahrens hergestellt werden. PepSets, basie-45 rend auf dem Multipin-Synthesesystem, ermöglichen gleichzeitig die Synthese und das Screening großer Mengen von Peptiden.
PepSets bestehen aus Blöcken von 96 individuell synthetisierten Peptiden, von welchen zwei sorgfältig ausgewählte Kontrollsequenzen sind. Abgespaltene Kontrollen werden mittels Re-5o versphasen-HPLC auf Reinheit geprüft, und der Peptidgehalt wird mittels Aminosäureanalyse quantifiziert. Positive und negative nicht spaltbare Kontrollen werden mittels standardmäßiger ELISA-Techniken geprüft.
PepSet-Peptide sind mit einer Vielzahl von chemischen Modifikationen erhältlich, einschließlich 55 Acetylierung, Biotinylierung, Phosphorylierung und Zyklisierung. Die Lösungsphasen- (gespal- 8
AT 413 945 B tenen) Peptide werden als lyophilisierte Pulver transportiert. Für die Herstellung von Peptiden in der Lösungsphase gibt es eine Auswahl an C-terminalen Endungen, einschließlich Säure und Amid, je nach der angestrebten Anwendung des Peptids. 5 Die spaltbare Bindung wird auf die Nadeloberfläche inkorporiert, entweder als ein vorgeformtes Esterderivat der C-terminalen Aminosäure, oder auf den Rink Amidlinker. Peptide mit Säureoder Amid-Endgruppen werden dann freigesetzt, indem die an die Nadeln gebundenen Peptide mit starker Säure behandelt werden. Möglichkeiten für den Maßstab der Synthese sind eine Nominalmenge von 1 Mikromol oder 5 Mikromol. Faktoren wie Hydrophobizität und Spalteffi-io zienz beeinflussen die Gewinnung der Peptide, so dass die erwartete Ausbeute an Peptid 0,5 bis 1 Mikromol beträgt (etwa 1 mg eines 15-meren Peptids), wenn die Peptide auf dem nominalen Maßstab von 1 Mikromol synthetisiert werden, oder eine Ausbeute von 2,5 bis 5 Mikromol für Peptide, die auf dem nominalen Maßstab von 5 Mikromol synthetisiert werden. 15 Nicht spaltbare Peptide bleiben kovalent an die Nadeln gebunden und können verwendet werden, um unter Verwendung von ELISA-Techniken rasch auf interessante Peptide zu screenen. Solche Peptide sind für die Zwecke des Scannens von Antikörperepitopen und für Studien zum Verhältnis von Struktur und Aktivität (structure activity relationship, SAR) nützlich. Das Entfernen von gebunden Antikörpern oder anderen Proteinen regeneriert die Peptide und ermöglicht 20 ihre Wiederverwendung in weiteren Assays. PepSets werden für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet, einschließlich Identifizierung von Peptidbahnen (peptide leads) von biologischem Interesse vom Durchscannen von Proteinsequenzen, Optimierung von Peptidbahnen und Entwicklung von neuen Generationen von Analogen. Die Flexibilität im Hinblick auf die Gesamtstrategie, die bei Screeningverfahren verwendet wird, wird durch die Verwendung einer 25 Vielzahl von Synthesedesigns sehr verstärkt, die zusammen ein systematisches Verfahren bieten, um den Hauptkandidaten vollständig zu charakterisieren.
Die Gesamtresultate, die von systematischen Peptidsets erhalten werden, identifizieren nicht nur Peptide von Interesse, sondern geben auch kritische Reste, ihre Ersetzbarkeit und die 30 optimale Peptidlänge an. Daher kann an Hand solcher Ergebnisse ein Ranking einer Reihe von verwandten Peptiden erstellt werden. Das Ersetzen der L-Aminosäuren durch D-Aminosäuren und andere unübliche Reste ist ein wirkungsvoller Ansatz, um die Struktur und Konformation eines Peptids zu manipulieren. Dieses Verfahren ist auch ein rascher Weg, um neue Analoge mit verschiedenen pharmakologischen Eigenschaften zu entdecken, wie Antagonisten und 35 Peptide mit erhöhter Stabilität.
Ausgehend von einer bekannten Proteinsequenz kann unter Verwendung des Multipin-Ansatzes ein Plan von allen sequenziellen Antikörperepitopen erstellt werden. Heute sind mehrere alternative Verfahren zur Kartierung sequenzieller B-Zellen-Epitope möglich. Diese beinhal-40 ten nadelgebundene Peptide, Lösungsphasen-Peptide, die direkt als Schicht auf Mikrotiterplatten aufgetragen werden, und biotinylierte Peptide, die auf Mikrotiterplatten gefangen sind, die vorher mit Avidin oder Streptavidin beschichtet wurden. Für die vorliegenden Beispiele wird der in Beispiel 1 beschriebene Antikörper verwendet, um 45 Peptidbibliotheken zu screenen, jedoch jegliches Antikörperpräparat, das spezifisch die DAEFRH-Sequenz erkennt, jedoch nicht die natürliche N-Terminal verlängerte Sequenz des Aß Moleküls (z.B. MDAEFRH, KMDAEFRH, SEVKMDAEFRH oder das komplette Amyloid- (Vorläufer-) Protein (amyloid precursor protein, APP)), wie z.B. von Johnson-Wood et al., 1997, beschrieben. 50
Vier Bibliotheken sind für diesen Zweck konstruiert worden: 2.1.: Bibliothek 1: Diese 6-mere Bibliothek enthält Peptide mit den folgenden Sequenzen (Aminosäurepositionen 1 bis 6): 55 9
AT 413 945 B
Position 1: alle natürlichen Aminosäuren außer D, K und C (17 Möglichkeiten)
Position 2: alle natürlichen Aminosäuren außer A, K und C (17 Möglichkeiten)
Position 3: alle natürlichen Aminosäuren außer E, K und C (17 Möglichkeiten)
Position 4: alle natürlichen Aminosäuren außer F, K und C (17 Möglichkeiten)
Position 5: alle natürlichen Aminosäuren außer R, K und C (17 Möglichkeiten)
Position 6: alle natürlichen Aminosäuren außer Η, K, C und P (16 Möglichkeiten)
Bibliothek 1 ist eine Mischung von Hexapeptiden. Theoretisch beinhaltet sie alle möglichen Peptide, die 17 verschiedene Aminosäuren haben (siehe unten). Die Mischung enthält keine Lysin- und Cystein-Reste. Weiters enthält die Mischung nicht:
Asparaginsäure in der spezifischen Position 1,
Alanin in der spezifischen Position 2,
Glutaminsäure in der spezifischen Position 3,
Phenylalanin in der spezifischen Position 4,
Arginin in der spezifischen Position 5 und Histidin in der spezifischen Position 6.
Die Synthese wird auf einem Applied Biosystems 431A-Synthesizer nach dem FastMoc Protokoll mit einem Synthesemaßstab von 0,25 mMol durchgeführt.
Die Synthese beginnt mit dem Abwiegen von 1 mMol aller gewünschten Aminosäuren (Aminogruppen und geschützten Seitenketten). Dann wurde eine Mischung aus Asn, Gin, Gly, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val hergestellt. Positionsspezifsch werden die folgenden Aminosäuren zugesetzt:
Ala, Glu, Phe, Arg, His (Position/Mischung 1),
Asp, Glu, Phe, Arg, His (Position/Mischung 2),
Asp, Ala, Phe, Arg, His (Position/Mischung 3),
Asp, Ala, Glu, Arg, His (Position/Mischung 4),
Asp, Ala, Glu, Phe, His (Position/Mischung 5) und Asp, Ala, Glu, Phe, Arg (Position/Mischung 6, ohne Pro).
Mischung 6 wurde verwendet, um das Harz (2-Chlor-tritylchlorid-Harz, 1,49 mMol/g, Alexis, Deutschland) zu laden: 1 mMol Aminosäurerest-Mischung 6 611 mg Harz (= 0,91 mMol reaktive Gruppen) 15 ml Dichlormethan 5,5 Äquivalent = 5 mMol Diisopropylethylamin (871 pl).
Die Mischung wird in einem Kolben 1 Std. lang geschüttelt. Dann wird 1 ml Methanol zugesetzt, und die Mischung wird weitere 10 min geschüttelt. Das geladene Harz wird über eine Fritte extrahiert und zwei Mal mit Dimethylformamid, Dichlormethan, Isopropanol, Methanol und Ether (jeweils 30 ml) gewaschen. Das Trocknen erfolgt über Nacht in hohem Vakuum. Die ausgewogene Menge beträgt 737 mg.
Ein Aliquot von 5,66 mg wird 30 min lang mit 1 ml 20% Piperidin in DMF behandelt, um die Dichte des Harzes zu definieren. Dann wird die Mischung zentrifugiert. Die freie Fmoc Schutzgruppe wird fotometrisch im Überstand gemessen (301 nm, Extinktionskoeffizient = 7800 M (e-1)). Daher beträgt die Dichte des Harzes 0,49 mMol/g.
Alle folgenden Schritte werden beim Synthesizer durchgeführt, wobei die anderen Mischungen (in 5 verschiedenen Patronen) verwendet werden. Es werden 515 mg geladenes Harz verwendet (entsprechend 0,25 mMol: Aminosäuremischungen werden in 4-fachem Überschuss 1 0
AT 413 945 B verwendet). Die N-terminale Fmoc Schutzgruppe wird am Ende der Synthese abgespalten. Nach dem Waschen mit Ethanol und Trocknen über Nacht wird die Abspaltung der Peptide vom Harz mittels TFA/H20 (95:5, v:v) durchgeführt. Die TFA-Lösung wird in einem Speed Vac auf 1/5 des Volumens konzentriert und ausgefällt und in Diethylether gewaschen und lyophilisiert. 5
Die 6-meren Peptide EIDYHR, ELDYHR und EVDYHR sind Beispiele für Mimotope, die vom monoklonalen Antikörper, hergestellt nach Beispiel 1 oben, nachgewiesen werden können. 2.2.: Bibliothek 2: Diese 6-mere Bibliothek enthält Peptide mit den folgenden Sequenzen (Ami-io nosäurepositionen 1 bis 6):
Position 1: D (fixiert)
Position 2: alle natürlichen Aminosäuren außer A, K und C (17 Möglichkeiten)
Position 3: alle natürlichen Aminosäuren außer E, K und C (17 Möglichkeiten) 15 Position 4: alle natürlichen Aminosäuren außer F, K und C (17 Möglichkeiten)
Position 5: alle natürlichen Aminosäuren außer R, K und C (17 Möglichkeiten)
Position 6: alle natürlichen Aminosäuren außer Η, K, C und P (16 Möglichkeiten)
Die Peptidbibliothek 2 wurde gemäß dem oben (unter 2.1) für Bibliothek 1 beschriebenen Ver-20 fahren aufgebaut.
Die 6-meren Peptide DIDYHR, DLDYHR und DVDYHR sind Beispiele für Mimotope, die vom gemäß 1. oben hergestellten monoklonalen Antikörper nachgewiesen werden können. 25 2.3.: Bibliothek 3: In einem zusätzlichen Ansatz wird eine dritte Peptidbibliothek verwendet, um
Mimotopsequenzen zu definieren. Diese Bibliothek enthält die ursprüngliche Sequenz und ermöglicht den Nachweis von Mimotopen, die mit dem ursprünglichen Epitop näher verwandt sind. 30 Die 6-mere Bibliothek enthält Peptide mit den folgenden Sequenzen (Aminosäurepositionen 1 bis 6):
Position 1: alle natürlichen Aminosäuren außer K und C (18 Möglichkeiten)
Position 2: alle natürlichen Aminosäuren außer K und C (18 Möglichkeiten) 35 Position 3: alle natürlichen Aminosäuren außer K und C (18 Möglichkeiten)
Position 4: alle natürlichen Aminosäuren außer K und C (18 Möglichkeiten)
Position 5: alle natürlichen Aminosäuren außer K und C (18 Möglichkeiten)
Position 6: alle natürlichen Aminosäuren außer K, C und P (17 Möglichkeiten) 40 Die Peptidbibliothek 3 wurde gemäß dem oben (unter 2.1) für Bibliothek 1 beschriebenen Verfahren aufgebaut.
Die 6-meren Peptide DIDYRR, DLDYRR und DVDYRR sind Beispiele für Mimotope, die von dem gemäß 1. oben hergestellten monoklonalen Antikörper nachgewiesen werden können (D in 45 Position 1 und R in Position 5 sind ident mit dem ursprünglichen Epitop). 2.4.: Bibliothek 4: Diese Peptidbibliothek 4 besteht aus 5 x 18 = 90 Peptiden, ist im Handel von Mimotopes Ltd. (Paris, Frankreich; siehe Anweisungen des Herstellers) erhältlich und ist entsprechend der natürlichen N-terminalen Aß42 Sequenz DAEFRH angelegt. 50
Position 1: D (fixiert)
Position 2: alle natürlichen Aminosäuren außer K und C (18 verschiedene Peptide)
Position 3: alle natürlichen Aminosäuren außer K und C (18 verschiedene Peptide)
Position 4: alle natürlichen Aminosäuren außer K und C (18 verschiedene Peptide) 55 Position 5: alle natürlichen Aminosäuren außer K und C (18 verschiedene Peptide) 1 1
AT 413 945 B
Position 6: alle natürlichen Aminosäuren außer K und C (18 verschiedene Peptide)
Die individualisierten Peptidmitglieder von Bibliothek 4 sind in Fig. 1 dargestellt. Peptide Nr. 1, 24, 48, 56 und 80 haben die ursprüngliche Sequenz der Aß42 N-terminalen Sequenz. Alle 5 anderen Peptide sind Kandidatenpeptide, die in Bezug auf ihre Bindungsfähigkeit an einen DAEFRH bindenden Antikörper getestet werden. 2.5.: ELISA mit Peptidbibliotheken: io Wie oben erwähnt, werden die Peptidbibliotheken 1, 2 und 3 mit einem Applied Biosystems 431A Peptidsynthesizer gemäß der klassischen Fmoc-Chemie hergestellt. Die im Handel erhältliche Peptidbibliothek 4 wird nach der Beschreibung des Herstellers hergestellt (siehe oben und unterwww.mimotopes.com). Die 90 Peptide sind C-terminal an eine Nadel gebunden. 15 Die ELISA mit jeder der Peptidbibliotheken wurden nach folgenden Standardprotokollen durchgeführt:
Die Peptidbibliothek wird in 100% DMSO gelöst (Endkonzentration 10 mg/ml).
Die Peptidlösung wird in PBS weiter verdünnt. 20 Die Peptidmischung wird über Nacht (4°C) als Schicht auf ELISA-Platten aufgetragen (Nunc Maxisorp, Deutschland), beginnend mit 500 pg/Näpfchen, und titriert bis 100 ng/Näpfchen.
Die Platten werden 3 Mal mit PBS/Tween 20 (0,1% v/v) gewaschen.
Die Platten werden mit PBS/BSA (2 h bei Zimmertemperatur) blockiert.
Die Platten werden 3 Mal mit PBS/Tween gewaschen. 25 Die Platten werden 4 h lang bei Zimmertemperatur mit biotinyliertem DAEFRH-spezifischen mAb (10 pg/ml in PBS) inkubiert.
Die Platten werden 3 Mal mit PBS/Tween gewaschen.
Die Platten werden mit Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase (30 min bei Zimmertemperatur) inkubiert. 30 Die Platten werden 5 Mal mit PBS/Tween gewaschen.
Die Platten werden mit ABTS + H202 (0,1% w/v; 10 bis 45 min) inkubiert, und die Reaktion wird mit Zitronensäure gestoppt, gefolgt von einer fotometrischen Auswertung (Wellenlänge 405 nm). 35 3.: Verifizierung von Mimotopen mittels Inhibitionsassay 3.1. Zusätzliche Bibliothek
Zusätzlich zu den oben beschriebenen 4 Bibliotheken (siehe 2.1, 2.2, 2.3 und 2.4) wird eine 40 fünfte Bibliothek verwendet, um Mimotopsequenzen zu definieren. Diese 6-mere Bibliothek ist im Handel bei EMC Microcollections (Tübingen, Deutschland) erhältlich und enthält 114 verschiedene Hexapeptidmischungen; eine Position pro Mischung ist durch eine von allen natürlichen Aminosäuren außer C definiert (19 Möglichkeiten), die restlichen 5 Positionen sind variabel: 45
Mischungen 01 bis 06 (eine Position ist fix, Alanin A, die restlichen 5 variabel, X):
Mischung 01: AXXXXX Mischung 02: XAXXXX so Mischung 03: XXAXXX Mischung 04: XXXAXX Mischung 05: XXXXAX Mischung 06: XXXXXA 55 Die Mischungen 07 bis 12 (eine Position fix, Arginin R, die restlichen 5 variabel, X): 1 2
AT 413 945 B
Mischung 07: RXXXXX Mischung 08: XRXXXX Mischung 09: XXRXXX Mischung 10: XXXRXX 5 Mischung 11: XXXXRX Mischung 12: XXXXXR
Dem entsprechend sind die Mischungen 13 bis 114 unter Verwendung aller natürlichen Aminosäuren außer C angelegt. 10 3.2. Inhibitionsassay
Die Figuren 2 und 3 beschreiben die Ergebnisse von Inhibitionsassays, die mit Mimotopenpep-tiden durchgeführt wurden, die in den 5 Bibliotheken enthalten sind und von diesen erhalten 15 wurden (wie beschrieben). Die Mimotopenpeptide konkurrieren mit dem ursprünglichen Epitop um die Erkennung durch den monoklonalen Antikörper. Das ursprüngliche Epitop und Mimotopenpeptide enthalten ein zusätzliches C am C-Terminus zur Koppelung an einen Proteinträger (falls erwünscht). 20 Es werden die folgenden Peptide verwendet:
Peptid 1737 DAEFRH Peptid 3001 DKELRI Peptid 3002 DWELRI 25 Peptid 3003 YREFFI Peptid 3004 YREFRI Peptid 3005 YAEFRG Peptid 3006 EAEFRG Peptid 3007 DYEFRG 30 Peptid 3008 ELEFRG Peptid 3009 SFEFRG Peptid 3010 DISFRG Peptid 3011 DIGWRG 35 Verfahren: ELISA-Platten (Nunc Maxisorp) werden mit dem ursprünglichen Peptidepitop DAEFRH (C-terminal verlängert mit C und an bovines Serumalbumin BSA gekoppelt) in einer Konzentration von 0,1 pg/ml Peptid-BSA (100 pl/Näpfchen, 12 h, 4°C) beschichtet. Nach dem Blockieren 40 mit PBS/BSA 1% (200 pl/Näpfchen, 12 h, 4°C) werden die Platten 3 Mal mit PBS/Tween gewaschen. Dann werden 20 min lang bei 37°C biotinylierter monoklonaler Antikörper (1 : 2000, 50 μΙ/Näpfchen) und Peptide (50 μΙ/Näpfchen) zu 50, 5, 0,5, 0,05, 0,005 und 0,0005 μΙ/ml zugesetzt. Die Platten werden 3 Mal mit PBS/Tween gewaschen und mit mit Meerrettichp-Peroxidase (horseradish peroxidase, HRP) markiertem Streptavidin (100 μΙ/Näpfchen, 30 min, 45 RT) inkubiert. Die Platten werden 5 Mal mit PBS/Tween gewaschen und mit ABTS + H202 (0,1% w/v, 10 bis 45 min) inkubiert, und die Reaktion wird mit Zitronensäure gestoppt, worauf eine fotometrische Auswertung erfolgt (Wellenlänge 405 nm).
Wie erwartet und in Fig. 2 zu sehen ist, kann das Peptid 1737 DAEFRH mit dem BSA-50 gekoppelten, plattengebundenen Peptid DAEFRH konkurrieren und verhindert dadurch das Erkennen durch den monoklonalen Antikörper. Weiters zeigt sich, dass das Peptid 3003 nicht in der Lage ist, die Bindung des monoklonalen Antikörpers an das ursprüngliche Epitop zu inhibieren. Im Gegensatz dazu blockieren die Peptide 3001, 3002, 3004, 3005, 3006 und 3007 (in verschiedenem Ausmaß) die Erkennung des Epitops. Während das Peptid 3004 nur in einer hohen Konzentration inhibierend wirkt (50 pg/ml) sind die Peptide 3001, 3006 und 3007 mit 55

Claims (9)

1 3 AT 413 945 B einem IC50 von weniger als 0,5 pg/ml stark hemmend. Die Peptide 3002 und 3005 sind mittlere Inhibitoren mit einem IC50 von mehr als 0,5 pg/ml. Wie erwartet und in Fig. 3 zu sehen ist, kann in einem zusätzlich durchgeführten, unabhängigen Experiment das Peptid 1737 DAEFRH erfolgreich mit dem mit BSA gekoppelten, plattengebundenen Peptid DAEFRH um die Erkennung durch den monoklonalen Antikörper konkurrieren. Weiters zeigt sich, dass die Peptide 3010 und 3011 bei den getesteten Konzentrationen nicht inhibierend wirken, während die Peptide 3008 und 3009 mit einem IC50 von weniger als 5 pg/ml (relativ) schwache Inhibitoren sind. Tabelle 1 fasst kurz die inhibierende Wirkung von Mimotopen zusammen, die in Bibliotheken enthalten sind und von solchen erhalten werden (wie beschrieben): Tabelle 1: Inhibitionsfähigkeit von Mimotopen: Peptid 3001 DKELRI stark Peptid 3002 DWELRI mittel Peptid 3003 YREFFI keine Peptid 3004 YREFRI schwach Peptid 3005 YAEFRG mittel Peptid 3006 EAEFRG stark Peptid 3007 DYEFRG stark Peptid 3008 ELEFRG schwach Peptid 3009 SFEFRG schwach Peptid 3010 DISFRG keine Peptid 3011 DIGWRG keine Patentansprüche: 1. Verwendung einer Verbindung umfassend die folgende Aminosäuresequenz X1X2X3X4X5X6, worin Xeine Aminosäure außer C ist, X2 eine Aminosäure außer C ist, X3 eine Aminosäure außer C ist, X4 eine Aminosäure außer C ist, X5 eine Aminosäure außer C ist, X6 eine Aminosäure außer C ist, und worin X1X2X3X4X5X6 nicht DAEFRH ist, wobei die Verbindung eine Bindefähigkeit an einen Antikörper hat, der für die natürliche N-terminale Aß42 Sequenz DAEFRH spezifisch ist, zur Herstellung eines Impfstoffs für die Alzheimer-Krankheit (Alzheimer's disease, AD).
2. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass diese Verbindung ein Peptid umfasst oder aus einem solchen besteht, worin Xi eine Aminosäure mit einer Hydroxygruppe oder eine negativ geladene Aminosäure ist, vorzugsweise E, Y, S oder D, X2 eine hydrophobe Aminosäure oder eine positiv geladene Aminosäure ist, vorzugsweise I, L, V, K, W, R, Y, F oder A, X3 eine negativ geladene Aminosäure ist, vorzugsweise D oder E, X4 eine aromatische Aminosäure oder L ist, vorzugsweise Y, F oder L, X5 Η, K, Y, F oder R ist, vorzugsweise H, F oder R, und Xe R, I, K, Y oder G ist, vorzugsweise R, I oder G, insbesondere EIDYHR, ELDYHR, EVDYHR, DIDYHR, DLDYHR, DVDYHR, DIDYRR, 1 4 AT 413 945 B DLDYRR, DVDYRR, DKELRI, DWELRI, YREFFI, YREFRI, YAEFRG, EAEFRG, DYEFRG, ELEFRG oder SFEFRG.
3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung ein 5 Polypeptid ist, das 5 bis 15 Aminosäurereste umfasst.
4. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung an einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, vorzugsweise KLH, und vorzugsweise Aluminiumhydroxid gekoppelt ist. 10
5. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung in einer Menge von 0,1 ng bis 10 mg enthalten ist, vorzugsweise 10 ng bis 1 mg, insbesondere 100 ng bis 100 pg.
6. Verfahren zur Isolierung einer Verbindung, die an einen Antikörper bindet, der für die natür liche N-terminale Aß42 Sequenz DAEFRH spezifisch ist, umfassend die folgenden Schritte: - Zur-Verfügung-Stellung einer Peptidverbindungsbibliothek, umfassend Peptide, die die folgende Aminosäuresequenz enthalten: 20 X1X2X3X4X5X6, worin Xt eine Aminosäure außer C ist, X2 eine Aminosäure außer C ist, X3 eine Aminosäure außer C ist, 25 X4 eine Aminosäure außer C ist, X5 eine Aminosäure außer C ist, X6 eine Aminosäure außer C ist, und worin X1X2X3X4X5X6 nicht DAEFRH ist, - In-Kontakt-Bringen dieser Peptidbibliothek mit diesem Antikörper, und
30 - Isolierung jener Mitglieder der Peptidbibliothek, die an diesen Antikörper binden.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass diese Peptide in der genannten Bibliothek in individualisierter Form zur Verfügung gestellt sind, insbesondere immobilisiert auf einer festen Oberfläche. 35
8. Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass dieser Antikörper einen Marker umfasst, der seinen Nachweis oder seine Isolierung bei Bindung an ein Peptid der Bibliothek ermöglicht.
9. Impfstoff gegen die Alzheimer-Krankheit, umfassend ein Antigen, das zumindest ein Peptid beinhaltet, ausgewählt aus der Gruppe EIDYHR, ELDYHR, EVDYHR, DIDYHR, DLDYHR, DVDYHR, DIDYRR, DLDYRR, DVDYRR, DKELRI, DWELRI, YREFRI, YAEFRG, EAEFRG, DYEFRG, ELEFRG oder SFEFRG. Hiezu 4 Blatt Zeichnungen 50 55
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