PL209989B1

PL209989B1 - Zastosowanie związku peptydowego oraz szczepionka przeciwko chorobie Alzheimera

Info

Publication number: PL209989B1
Application number: PL378333A
Authority: PL
Inventors: Frank Mattner
Original assignee: Affiris Forschungs Und Entw Gmbh
Priority date: 2003-01-14
Filing date: 2004-01-13
Publication date: 2011-11-30
Also published as: WO2004062556A3; US20060111301A1; WO2004062556A2; PT1679319E; AU2004204349A1; HK1091499A1; CN1826354A; CY1110634T1; US7732568B2; ATA14642003A; ATE458753T1; WO2004062556A8; AT413945B; ATE376559T1; CA2513218A1; DE602004009705T2; DK1679319T3; EP1679319B1; DK1583774T3; SI1583774T1

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku peptydowego do wytwarzania szczepionki przeciwko chorobie Alzheimera oraz szczepionka przeciwko chorobie Alzheimera, która użyteczna jest w sposobach profilaktyki i leczenia choroby Alzheimera (AD).

Peptyd β-amyloidu (Αβ) odgrywa kluczową rolę w neuropatologii choroby Alzheimera (AD) (Roher i wsp. 1993: e-Amyloid-(1-42) is a major component of cerebrovascular amyloid deposits: Implications for the pathology of Alzheimer disease PNAS 90:10836). Rodzinne postaci tej choroby wiązano z mutacjami w genach prekursora białka amyloidu (ang. amyloid precursor protein, (APP)) oraz presenilin. Związane z chorobą mutacje w tych genach skutkują zwiększeniem wytwarzania 42-aminokwasowej postaci peptydu (Ae42), który stanowi główną postać stwierdzaną w płytkach amyloidowych w chorobie Alzheimera. Zwierzęcy model dla tej choroby jest komercyjnie dostępny. U myszy transgenicznej PDAPP, z nadekspresją zmutowanego ludzkiego APP (w którym aminokwas w pozycji aminokwasowej 717 stanowi F zamiast V), w sposób progresywny pojawia się wiele szczególnych oznak choroby Alzheimera, w sposób zależny od wieku i mózgu (Games i wsp. 1995: Alzheimer-type neuropathology m transgenic mice overexpressing V717F β-amyloid precursor protein Nature 373: 523).

Przeprowadzono już badania dotyczące szczepienia normalną, nieopartą na mimotopie szczepionką. Zwierzęta transgeniczne immunizowano zagregowanym Ae42, albo przed pojawieniem się neuropatologii typu AD (6 tygodni) albo w późniejszym wieku (11 miesięcy): Immunizacja młodych zwierząt zapobiegała rozwojowi tworzenia płytek, dystrofii neurytów i astrogliozie. Traktowanie starszych zwierząt znacząco zmniejszyło neuropatolog typu AD. Ta doświadczalna próba szczepienia indukowała powstawanie przeciwciał przeciwko Ae42 zdolnych do przekroczenia bariery krew-mózg i atakowania płytek amyloidowych (Schenk i wsp. 1999: Immunization with amyloid-β attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse Nature 400:173). Płytki następnie są usuwane za pomocą kilku mechanizmów, włącznie z zależną od receptora Fc fagocytozą (Bard i wsp. 2000: Peripherally administered antibodies against amyloid β-peptide enter the central nervous system and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease Nature Med 6:916). Szczepionka ta była również w stanie opóźnić pojawienie się deficytów pamięci (Janus i wsp. 2000: AS peptide immunization reduces behavioural impairment and plaques in a model of Alzheimer's disease Nature 408:979).

Od 1999 roku w fazie badań klinicznych znajduje się wysoce obiecująca terapia immunizacyjna dla choroby Alzheimera. Uważa się, że immunizacja stymuluje układ odpornościowy do atakowania płytek i usuwania tych złogów z dotkniętego chorobą mózgu, chociaż konieczne jest dokładniejsze określenie specyficznego mechanizmu leżącego u jej podłoża.

Te badania kliniczne przeprowadzała firma farmaceutyczna Elan w połączeniu ze swym partnerem korporacyjnym, American Home Products (szczepionka terapeutyczna AN-1792, QS21 jako adiuwant). Fazę I badań klinicznych pomyślnie zakończono w roku 2000. W roku 2001 rozpoczęto fazę II badań, aby testować skuteczność na zespole pacjentów z łagodną do umiarkowanej postacią AD.

Obecnie wstrzymano te badania fazy II permanentnie ze względu na stan zapalny w obrębie układu nerwowego u kilku pacjentów (Editorial 2002 Insoluble problem Nature Med 8:191). Objawy obejmowały aseptyczne zapalenie mózgu i rdzenia, co doprowadziło do natychmiastowego zatrzymania badań ogólnoświatowych. W przypadku najgorszego scenariusza zostanie wykazane, że u badanych pacjentów wystąpiła odpowiedź autoimmunizacyjna - ryzyko właściwe wielu immunoterapiom. Powikłania autoimmunizacyjne można było przewidzieć biorąc pod uwagę wszechobecność APP, które oczywiście niesie determinanty antygenowe podobne do jego produktu proteolitycznego. Stosunkowo niedawno, dodatkowe badania skoncentrowane na charakterze przeciwciał indukowanych immunizacją zagregowanymi Ae42 (u ludzi i myszy) wykazały, że większość przeciwciał rozpoznaje w Ae42 małą domenę między aminokwasem 4 a 10 (Ae4-10). Mysie przeciwciała były zdolne do blokowania tworzenia włókienek Ae i rozrywały występujące już włókienka Ae (McLaurin i wsp. 2002: Therapeutically effective antibodies against amyloid-β peptide target amyloid-β residues 4-10 and inhibit cytotoxicity and fibrillogenesis Nature Med 8: 1263). Należy zauważyć, że ludzkie przeciwciała nie reagują z APP eksponowanymi na powierzchni komórek lub innego dowolnego niezagregowanego produktu proteolitycznego prekursora (Hock i wsp., 2002: Generation of antibodies specific for β-amyloid by vaccination of patients with Alzheimer disease Nature Med 8: 1270). Zaobserwowano wyraźną różnicę pomiędzy surowicami ludzkimi a mysimi: w przeciwieństwie do ludzkich przeciwciał, mysie przeciwciała wykrywają monomeryczne, oligomeryczne i fibrylarne Λβ. Ma to istotne znaczenie i może być przesłanką co do potenciału terapeutycznego, jako że gromadzone są dowody na to, że

PL 209 989 B małe oligomery Αβ, które nie są rozpoznawane przez ludzkie anty-Αβ, odgrywają główną rolę toksyczną w tej chorobie (Walsh i wsp. 2002: Naturally secreted oligomers of amyloid β protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo Nature 416: 535). Zatem, potencjalną nową strategią jest immunizacja szczepionką zawierającą aminokwasy 4-10 β-amyloidu (zamiast zagregowanego Ae42). Pomimo nieznanej skuteczności strategia ta może również stanąć wobec problemów autoimmunizacyjnych, ponieważ pacjenci będą bezpośrednio immunizowani własnym epitopem (liniowa komórka B).

Pomimo tych rozczarowujących postępów w obecnych strategiach szczepienia AD, wciąż uważa się szczepionkę Ae za najbardziej obiecujący sposób zwalczania AD. Jednakże, istnieje pilne zapotrzebowanie na udoskonalenia oraz nowe strategie w szczepieniu AD. W szczególności taka szczepionka nie powinna indukować autoreaktywnych komórek T i/lub B.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie związku peptydowego o 5 do 15 aminokwasach, zawierającego sekwencję wybraną z grupy składające] się z DKELRI, DWELRI YAEFRG, EAEFRG, DYEFRG, DRSLRI, GREFRN, EYEFRG, DWEFRDA, SWEFRT i DKELR, oraz ewentualnie dodatkowo zawierającego kowalencyjnie lub niekowalencyjnie sprzężony łącznik lub nośnik, do wytwarzania szczepionki na chorobę Alzheimera (AD).

Korzystnie związek ten stanowi peptyd wybrany z grupy składającej się z DKELRI, DWELRI, YAEFRG, EAEFRG, DYEFRG, DRELRI, GREFRN, EYEFRG, DWEFRDA, SWEFRT albo DKELR.

Korzystnie związek ten stanowi polipeptyd o 6 do 12 resztach aminokwasowych.

Korzystnie związek ten jest sprzężony z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, korzystnie KLH, i ewentualnie wodorotlenkiem aluminium.

Korzystnie wytwarzana szczepionka zawiera związek w ilości 0,1 ng do 10 mg, korzystnie 10 ng do 1 mg, zwłaszcza 100 ng do 100 μg.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto szczepionka przeciwko chorobie Alzheimera, charakteryzująca się tym, że zawiera antygen zawierający co najmniej jeden peptyd wybrany z grupy

DKELRI, DWELRI, YAEFRG, EAEFRG, DYEFRG, DRELRI, GREERN, EYEFRG, DWEERDA, SWEFRT albo DKELR.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem do szczepienia przeciwko AD stosowany jest mimotop Αβ42: Mimotop indukuje wytwarzanie przeciwciał przeciwko Αβ42 ale nie przeciwko natywnemu APP. Mimotop można zidentyfikować przy użyciu przeciwciała (monoklonalnego) i bibliotek peptydowych (komercyjnie dostępnych) (np. zgodnie z publikacją autorstwa Reineke i wsp. 2002: Identification of distinct antibody epitopes and mimotopes from a peptide array of 5520 randomly generated secuences J Immunol Methods 267:37). Stosowane jest przeciwciało (monoklonalne), które nie rozpoznaje APP, ale wykrywa jedynie różne rodzaje Αβ z amino-końcowym kwasem asparaginowym. (przykład dla takiego przeciwciała opisany jest w publikacji autorstwa Johnson-Wood i wsp. 1997: Amyloid precursor protein processing and Αβ42 deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer disease PNAS 94: 1550). Udowodniono, że takie przeciwciało jest idealnym narzędziem do identyfikowania mimotopów odpowiednich do szczepionek w przebiegu niniejszego wynalazku. Chociaż wykazano, że takie przeciwciała monoklonalne wywierają korzystne wpływy w przypadku mysiego modelu AD przy bezpośrednim podawaniu myszom (Bard i wsp., 2000: Peripherally administered antibodies against amyloid β-peptide enter the central nervous system, and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease Nature Med 6: 916), jednak przeciwciał tych nigdy nie proponowano do zastosowania jako narzędzi do wyszukiwania mimotopów w celu izolowania związków na szczepionki przeciwko AD.

W stanie techniki wszystkie wysiłki były skoncentrowane na naturalnie występującym. peptydzie Aβ. Jak wspomniano powyżej, badania kliniczne ze szczepionką z peptydem. Aβ zostały wstrzymane ze względu na przypadki stanów neurozapalnych. W istocie, programy do przewidywania epitopów komórek T (BIMAS dla epitopów z restrykcją dla klasy I oraz TEPITOPE dla epitopów z restrykcją dla klasy II) proponują wysokopunktowe (własne) epitopy w obrębie tej sekwencji. Może to sugerować, że zdarzenia neurozapalne powstają w wyniku reakcji autoimmunizacyjnych, co może sprawić że takie szczepionki będą nieodpowiednie do ogólnego stosowania.

W przeciwieństwie do tego rodzaju szczepionek proponowanych w stanie techniki, nie oczekuje się wystąpienia żadnych reakcji autoimmunizacyjnych w czasie leczenia szczepionką zawierającą mimotop do zastosowania w niniejszym. wynalazku, ponieważ przeciwciało (monoklonalne) stosowane do identyfikacji mimotopu do zastosowania w niniejszym wynalazku nie rozpoznaje APP a sekwencja mimotopu jest odmienna niż sekwencje własne pochodzące z Aβ42, które stosowano dotąd w badaniach lub które będą stosowane w przyszłych badaniach.

PL 209 989 B1

Przeciwciało stosowane do identyfikacji mimotopu do zastosowania w niniejszym wynalazku wykrywa pochodzącą z Αβ sekwencję aminokwasową DAEFRH (= oryginalny epitop) z wolnym amino-końcowym kwasem asparaginowym, zatem nie rozpoznaje ono natywnego APP. Przeciwciało może być kompozycją monoklonalnego lub poliklonalnego przeciwciała lub dowolną częścią przeciwciała lub jego fragmentem, jedyną przesłanką jest ta, że cząsteczka przeciwciała specyficznie rozpoznaje epitop DAEFRH, tzn. że nie wiąże się ona z naturalnie N-końcowo wydłużonymi postaciami białka prekursora amyloidu, co oznacza, że zdolność wiązania z epitopem DAEFRH jest przynajmniej 100 razy, dogodnie przynajmniej 1000 razy, w szczególności przynajmniej 10⁵ razy, wyższa niż z cząsteczką APP. Przeciwciałem może być przeciwciało wykazujące taką samą lub wyższą zdolność wiązania z sekwencją DAEFRH jak przeciwciało opisane przez Johnson-Wood i wsp., 1997. Oczywiście, zastosowane mogą być również przeciwciała z niższą zdolnością wiązania (>10%, >50% lub >80% zdolności wiązania przeciwciała Johnson-Wood i wsp.), chociaż wyższa zdolność wiązania jest bardziej zalecana.

Związki do zastosowania w niniejszym wynalazku wiążą się z tymi przeciwciałami z porównywalną specyficznością jak z sekwencją DAEFRH.

Zalecany mimotop do zastosowania w niniejszym, wynalazku ma dogodnie długość 5 do 15 aminokwasów. Związek ten może być dostarczony w szczepionce w postaci wyizolowanej (peptyd) lub może być sprzężony lub skompleksowany z innymi cząsteczkami, takimi jak farmaceutyczne substancje nośnikowe lub struktury polipeptydowe, lipidowe lub węglowodanowe. Korzystnie, mimotopy do zastosowania w niniejszym wynalazku mają długość (minimum) pomiędzy 5 a 15, 6 a 12 reszt aminokwasowych, specyficznie pomiędzy 9 a 11. Mimotopy mogą jednakże być sprzęgane (kowalencyjnie lub niekowalencyjnie) z niespecyficznymi łącznikami lub nośnikami, zwłaszcza łącznikami peptydowymi lub nośnikami białkowymi. Ponadto, łączniki peptydowe lub nośniki białkowe mogą składać się z lub zawierać epitopy pomocniczych komórek T.

Korzystnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik stanowi KLH. Nośnikami mogą być także: anatoksyna tężcowa, białko wiążące albuminę, albumina surowicy bydlęcej, dendrimer (MAP; Biol. Chem. 358: 581), jak również substancje adiuwantowe opisane w publikacji autorstwa Singh i wsp., Nat. Biotech. 17(1999), 1075 - 1081 (dokładniej te w tabeli I tego dokumentu) oraz O'Hagan i wsp.. Nature Reviews, Drug Discovery 2(9) (2003), 727 - 735 (dokładniej związki nasilające odporność wrodzoną i układy dostarczania tam opisane), lub ich mieszaniny. Ponadto, kompozycja szczepionki może zawierać wodorotlenek aluminium.

Szczepionka zawierająca niniejszy związek (mimotop) i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik może być podawana dowolną drogą podawania, np. dożylnie, śródotrzewnowo, śródmięśniowo, donosowo, doustnie, podskórnie itp. oraz w dowolnym odpowiednim przyrządzie do dostarczania (O'Hagan i wsp., Nature Reviews, Drug Discovery 2(9) (2003), 727 - 735). Zazwyczaj, szczepionka zawiera związek do zastosowania w niniejszym wynalazku w ilości wynoszącej 0,1 ng do 10 mg, korzystnie 10 ng do 1 mg, zwłaszcza 100 ng do 100 μg albo, ewentualnie np. 100 fmoli do 10 μmoli, korzystnie 10 pmoli do 1 μmola, zwłaszcza 100 pmoli do 100 nmoli. Szczepionka może również zawierać typowe substancje dodatkowe, np. bufory, środki stabilizujące, itp.

Sposób izolowania związku wiążącego się z przeciwciałem specyficznym dla naturalnej N-końcowej sekwencji Αβ42 DAEFRH obejmuje etapy:

- dostarczania biblioteki związków peptydowych obejmującej peptydy zawierające następującą sekwencję aminokwasową:

X1X2X3X4X5X6 w której X1 oznacza aminokwas, z wyjątkiem C,

X2 oznacza aminokwas, z wyjątkiem C,

X3 oznacza aminokwas, z wyjątkiem. C,

X4 oznacza aminokwas, z wyjątkiem C,

X5 oznacza aminokwas, z wyjątkiem C,

X6 oznacza aminokwas, z wyjątkiem. C, i przy czym X1X2X3X4X5X6 nie stanowi DAEFRH,

- kontaktowania wspomnianej biblioteki peptydowej ze wspomnianym przeciwciałem i

- izolowania tych członków biblioteki peptydowej, którzy wiążą się ze wspomnianym przeciwciałem. Specyficzna postać realizacji tego sposobu izolowania związku wiążącego się z przeciwciałem specyficznym dla naturalnej N-końcowej sekwencji Αβ42 DAEFRH obejmuje etapy:

PL 209 989 B

- dostarczania biblioteki związku peptydowego obejmują cej peptydy zawierające następującą sekwencję aminokwasową

X1X2X3X4X5X6 w której X1 oznacza naturalny aminokwas, z wyją tkiem K i C,

X2 oznacza naturalny aminokwas, z wyjątkiem C,

X3 oznacza naturalny aminokwas, z wyjątkiem K i C,

X4 oznacza naturalny aminokwas, z wyjątkiem K i C X5 oznacza naturalny aminokwas, z wyjątkiem C,

X6 oznacza naturalny aminokwas, z wyjątkiem P i C, i przy czym X1X2X3X4X5X6 nie stanowi DAEFRH,

- kontaktowania wspomnianej biblioteki peptydowej ze wspomnianym przeciwciałem i - izolowania tych członków biblioteki peptydowej, którzy wiążą się ze wspomnianym przeciwciałem. Izolacji odpowiednich 5-merów do zastosowania w niniejszym wynalazku można dokonać sposobem opisanym powyżej, dostosowanym do bibliotek zmiennych 5 aminokwasowych, i można ją dogodnie przeprowadzić albo poprzez przeszukiwanie biblioteki ze zmiennymi aminokwasowymi X1 do X5 jak tu opisano albo poprzez identyfikowanie odpowiednich 5-merów wśród pozytywnych wyszukanych członków w bibliotece 6-merów (zobacz: powyżej). W taki sam sposób zastosować można również biblioteki odpowiednio 7-merów, 8-merów, 9-merów, 10-merów, w celu wyszukiwania sekwencji, które wiążą się z niniejszym typem przeciwciała. Odpowiednie fragmenty wiążące przeciwciało takich dłuższych sekwencji można znaleźć, przykładowo poprzez testowanie tych fragmentów o długości 5,

6, 7, 8, 9 reszt aminokwasowych pod kątem. ich wiązania z niniejszym przeciwciałem.

Udowodniono, że tego rodzaju sposób skutecznie dostarczał mimotopów Αβ do zastosowania w niniejszym wynalazku.

Dogodnie wspomniane peptydy dostarczane są we wspomniane] bibliotece w postaci zindywidualizowanej, zwłaszcza unieruchomione na powierzchni stałej, tak jak, przykładowo, jest to możliwe przy użyciu technologii peptydowej MULTIPIN™. Bibliotekę można także zapewnić w postaci mieszaniny peptydów a kompleksy przeciwciało: peptyd można wyizolować po związaniu przeciwciała. Ewentualnie, przeciwciało można immobilizować a bibliotekę peptydową (w zawiesinie lub roztworze) kontaktuje się następnie z unieruchomionymi przeciwciałami.

Dogodnie przeciwciała do przeszukiwania (lub członkowie biblioteki peptydowej) obejmują odpowiedni marker, który pozwala na wykrywanie lub izolację przeciwciała lub kompleksu przeciwciało: peptyd po związaniu z peptydem z biblioteki. Odpowiednie układy markerowe (tzn. markery do biotynylacji, markery fluorescencyjne, radioaktywne, magnetyczne i rozwijające kolor oraz przeciwciała drugorzędowe) są łatwo dostępne dla specjalistów w dziedzinie.

Biblioteka musi być skonstruowana z wyłączeniem naturalnie występującej sekwencji Ae (np. DAEFRH), ponieważ szczepienie tą sekwencją wyraźnie wyłączane jest z niniejszego wynalazku.

Dalszą odpowiednią techniką do izolowania epitopów do zastosowania w niniejszym wynalazku jest przeszukiwanie w fagowych bibliotekach peptydowych jak np. opisano w publikacji nr WO 03/020750.

Niniejszy wynalazek dotyczy również kompozycji zawierającej peptyd wiążący się z przeciwciałem, przeciw N-końcowi Ae42 wybrany z grupy składającej się z DKELRI, DWELRI, YAEERG, EAEFRG, DYEERG, DRELRI, GREFRN, EYEERG, DWEERDA, SWSERT i DKER (albo, w pewnych przypadkach dogodnie, większą cząsteczkę zawierającą taki peptyd (np. peptyd połączony z nośnikiem lub cząsteczką dostarczającą)) jak tu zdefiniowano (ewentualnie jako pojedynczy składnik czynny), dogodnie kompozycji szczepionki przeciwko chorobie Alzheimera zawierającej taki antygen, zwłaszcza antygen, który zawiera przynajmniej jeden peptyd wybrany z grupy DKELRI, DWELRI, YAEERG, EAEFRG, DYEFRG, DRELRI, GREFRN, EYEERG, DWEFRDA, SWEFRT i DKELR. Peptydy te są, oprócz innych peptydów dostarczanych przez niniejszy wynalazek specyficznie dopasowane do zastosowania w wytwarzaniu kompozycji farmaceutycznej, zwłaszcza szczepionek AD. Te sekwencje są wyłącznie sztucznymi mimotopami Ae. Peptydy te mogą - dla celów szczepienia - być sprzęgane (kowalencyjnie lub niekowalencyjnie) z odpowiednimi nośnikami i mogą być dostarczane jako związki peptydowe lub kompleksy wraz z innymi związkami lub ugrupowaniami, np. adiuwantami, nośnikami peptydowymi lub białkowymi, itp. i podawane w odpowiedni sposób (jak np. opisano w publikacji autorstwa O'Hagan i wsp., Nature Reviews, Drug Discovery 2(9) (2003), 727 - 735)).

Wynalazek opisany jest dalej w następujących przykładach oraz rysunkach figur, oczywiście bez ograniczenia do nich.

PL 209 989 B1

Fig. 1 przedstawia wyszczególnionych członków peptydowych biblioteki 4 stosowanej w niniejszym procesie wyszukiwania.

Fig. 2 przedstawia oznaczenie hamowania z mimotopami dla DAEFRH.

Fig. 3 przedstawia inne oznaczenie hamowania z innymi mimotopami dla DAEFRH.

Figury 4 i 5 opisują wyniki oznaczeń hamowania przeprowadzonych z mimotopami peptydowymi do zastosowania w niniejszym wynalazku.

P r z y k ł a d y:

1.: Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych (mAb) do wykrywania różnych rodzajów peptydów pochodzących od Αβ42 z wolnym N-końcem. (wolny kwas asparaginowy na N-końcu)

Myszy szczepi się 6-merowym. peptydem. DAEFRH (naturalna N-końcowa sekwencja Ae42) związanym z białkiem, albuminą surowicy bydlęcej, BSA (dla wykorzystania efektu hapten-nośnik), zemulgowanym w CFA (pierwsze wstrzyknięcie) i IFA (wstrzyknięcia przypominające). Przy użyciu ELISA wykrywa się wytwarzające przeciwciała hybrydomy specyficzne dla peptydu DAEFRH (płytki ELISA opłaszczone peptydem DAEFRH). Jako peptydową kontrolę negatywną stosuje się peptyd SEVKMDAEFRH (naturalna N-końcowo wydłużona sekwencja, pochodząca od APP, zawierająca sekwencję pochodzącą od Ae42): hybrydomy rozpoznające wydłużony peptyd są wyłączane, ponieważ nie rozróżniają pomiędzy peptydami pochodzącymi od Ae42 z wolnym kwasem asparaginowym na N-końcu a pochodzącym od APP peptydem DAEFRH bez wolnego kwasu asparaginowego.

2.: Konstrukcja bibliotek peptydowych:

Mimotopy do zastosowania w niniejszym wynalazku wykryto przy użyciu zaadaptowanej metody Reinke i wsp., 2000, poprzez przeszukiwanie bibliotek peptydowych pod kątem wiązania z przeciwciałem (korzystnie przeciwciałem, monoklonalnym), które jest specyficzne dla różnych rodzajów Ae z amino-końcowym kwasem asparaginowym. Inną metodą jest komercyjnie dostępna technologia peptydu MULTIP-IN™.

Technologia peptydu Multipin™ wymaga syntetyzowania peptydów na specjalnie wytworzonych trzpieniach polietylenowych zamocowanych na blokach w formacie, który jest kompatybilny ze standardową płytką do mikromiareczkowania 8 x 12 stosowaną w wielu oznaczeniach biologicznych. Z użyciem tej metody wytworzone mogą być zarówno peptydy związane z trzpieniem (nieodcinalne peptydy, które pozostają kowalencyjnie związane z trzpieniem), jak i peptydy z fazy roztworu (te, które zostały odcięte z powierzchni trzpienia). PepSets, oparty na układzie syntezy Multipin, pozwala na jednoczesną syntezę i przeszukiwanie dużej liczby peptydów.

PepSets składa się z bloków 96 indywidualnie zsyntetyzowanych peptydów, z których dwa stanowią starannie wybrane sekwencje kontrolne. Odcięte kontrole oznacza się pod kątem czystości z użyciem HPLC w odwróconej fazie i ocenia ilościowo zawartość peptydu przy użyciu analizy aminokwasów. Pozytywne i negatywne nieodcinalne kontrole oznacza się z użyciem, standardowych technik ELISA.

Peptydy PepSet dostępne są z szeregiem różnych modyfikacji chemicznych, włącznie z acetylacją, biotynylacją, fosforylacją i cyklizacją. Peptydy z fazy roztworu (odcięte) przesyła się w postaci liofilizowanych proszków.

Do wytwarzania peptydów z fazy roztworu istnieje szereg zakończeń C-końcowych, włącznie z kwasem, i amidem, zależnie od zamierzonego zastosowania peptydu. Odcinalne wiązanie wprowadzane jest na powierzchnię trzpienia, albo jako wstępnie wytworzona pochodna estrowa C-końcowego aminokwasu, albo na łączniku amidowym typu Rink. Peptydy z kwasowymi lub amidowymi grupami końcowymi uwalnia się następnie poprzez traktowanie związanego z trzpieniem peptydu silnym, kwasem. Opcje co do skali syntezy stanowią: nominalna skala 1 mikromolowa i skala 5 mikromolowa. Czynniki takie jak hydrofobowość i wydajność cięcia będą wpływały na odzyskiwanie peptydu, w taki sposób że oczekiwana wydajność uzyskiwania peptydu wynosi 0,5 do 1 mikromola (około 1 mg dla 15-merowego peptydu) w przypadku gdy peptydy syntetyzuje się na nominalną skalę 1 mikromolową, albo wydajność wynosi 2,5 do 5 mikromola dla peptydów syntetyzowanych na nominalną skalę 5 mikromolową.

Nieodcinalne peptydy pozostają kowalencyjnie związane z trzpieniami i mogą być szybko przeszukiwane pod kątem peptydów będących przedmiotem zainteresowania przy użyciu technik ELISA. Tego rodzaju peptydy są użyteczne do skanowania epitopu przeciwciała oraz badań związków struktura-aktywność (SAR). Usunięcie związanych przeciwciał lub innych białek regeneruje peptydy i pozwala na ich ponowne zastosowanie w dalszych oznaczeniach. PepSets są stosowane w różnego rodzaju zastosowaniach, włącznie z identyfikacją peptydów liderowych będących przedmiotem zaintePL 209 989 B resowania w dziedzinie biologii ze skanowania sekwencji białkowych, optymalizacją peptydów liderowych i opracowaniem, nowych generacji analogów. Elastyczność pod względem ogólnej strategii stosowanej w procedurach przeszukiwania jest znacząco polepszona ze względu na zastosowanie różnorodnych wzorców syntez, które łącznie zapewniają sposób systematyczny do pełnego charakteryzowania wiodącego kandydata.

Obszerne wyniki uzyskane z systematycznych zestawów peptydowych nie tylko identyfikują peptydy będące przedmiotem zainteresowania, ale również wskazują reszty krytyczne, ich możliwość zastępowania oraz optymalną długość peptydu. W konsekwencji, w wyniku tych stwierdzeń można określić możliwy zakres pokrewnych peptydów. Zastępowanie L-aminokwasów D-aminokwasami i innymi niewystępującymi powszechnie resztami jest silnym narzędziem do manipulacji strukturą i konformacją peptydu. Sposób ten stanowi również szybką metodę odkrywania nowych analogów o odmiennych właściwościach farmakokinetycznych, takich jak antagoniści i peptydy o zwiększonej stabilności.

Wychodząc ze znanej sekwencji białkowej przy użyciu podejścia Multipin mapować można wszystkie kolejne epitopy przeciwciała. Obecnie możliwych jest kilka alternatywnych procedur do mapowania kolejnych epitopów komórek B. Obejmują one peptydy związane na trzpieniach, peptydy fazy roztworu opłaszczane bezpośrednio na płytki do mikromiareczkowania oraz biotynylowane peptydy wychwycone na płytkach do mikromiareczkowania uprzednio opłaszczonych awidyną lub streptawidyną.

W przypadku niniejszych przykładów przeciwciało opisane w przykładzie 1 jest stosowane do przeszukiwania bibliotek peptydowych, jednakże zastosowany może być dowolny preparat przeciwciała rozpoznającego sekwencję DAEFRH, ale nierozpoznającego naturalnie N-końcowo wydłużonej sekwencji cząsteczki Aβ (np. MDAEFRH, KMDAEFRH, SEVKMDAEFRH lub całe białko amyloidu (prekursor), APP), taki jak np. opisany przez Johnson-Wood i wsp., 1997.

W tym celu skonstruowano cztery biblioteki:

2.1.: Biblioteka 1: Ta 6-mierowa biblioteka zawiera peptydy o następujących sekwencjach (pozycje aminokwasowe 1 do 6):

Pozycja 1: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem D, K i C (17 możliwości)

Pozycja 2 wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem A, K i C (17 możliwości)

Pozycja 3: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem E, K i C (17 możliwości)

Pozycja 4: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem F, K i C (17 możliwości)

Pozycja 5: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem R, K i C (17 możliwości)

Pozycja 6: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem H, K, C i P (16 możliwości)

Bibliotekę 1 stanowi mieszanina heksapeptydów. Teoretycznie, zawarte są w niej wszystkie możliwe peptydy zawierające 17 różnych aminokwasów (zobacz poniżej). Mieszanina ta nie zawiera żadnej reszty lizyny ani cysteiny. Ponadto mieszanina nie zawiera:

kwasu asparaginowego w specyficznej pozycji 1, alaniny w specyficznej pozycji 2, kwasu glutaminowego w specyficznej pozycji 3, fenyloalaniny w specyficznej pozycji 4, argininy w specyficznej pozycji 5 i histydyny w specyficznej pozycji 6.

Syntezę przeprowadza się na syntezatorze Applied Biosystems 431A zgodnie z protokołem FastMoc, przy skali syntezy wynoszącej 0,25 mmol.

Synteza zapoczątkowywana jest odważeniem 1 mmola wszystkich pożądanych aminokwasów (zabezpieczone grupy aminowe i łańcuchy boczne). Następnie wytwarzano mieszaninę Asn, Gln, Gly, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val. W sposób specyficzny dla pozycji dodaje się następujące aminokwasy:

Ala, Glu, Phe, Arg, His (pozycja/mieszanina 1),

Asp, Glu, Phe, Arg, His (pozycja/mieszanina 2),

Asp, Ala, Phe, Arg, His (pozycja/mieszanina 3),

Asp, Ala, Glu, Arg, His (pozycja/mieszanina 4),

Asp, Ala, Glu, Phe, His (pozycja/mieszanina 5), i

Asp, Ala, Glu, Phe, Arg (pozycja/mieszanina 6, bez Pro).

Mieszaninę 6 stosowano do pakowania żywicy (żywica 2-chloro-tritylochlorkowa, 1,49 mmol/g, Alexis Niemcy):

mmol mieszaniny 6 reszt aminokwasowych

611 mg żywicy (= 0,91 mmola grup reaktywnych)

PL 209 989 B1 ml dichlorometanu

5,5 równoważnika = 5 mmoli diizopropyloetyloaminy (871 μΐ).

Mieszaninę wytrząsa się w kolbie przez 1 godz. Następnie dodaje się 1 ml metanolu i mieszaninę wytrząsa się przez dodatkowe 10 min. Upakowaną żywicę ekstrahuje się przez filtr spiekany i płucze dwukrotnie dimetyloformamidem, dichlorometanem, izopropanolem, metanolem i eterem. (30 ml każdego). Suszenie przeprowadza się przez noc w wysokiej próżni. Ilość odważona wynosi 737 mg.

Porcję 5,66 mg traktuje się przez 30 min 1 ml 20% piperydyny w DMF w celu zdefiniowania gęstości żywicy. Następnie, mieszaninę wiruje się. W supernatancie mierzy się fotometrycznie wolną grupę zabezpieczającą Fmoc (301 nm, współczynnik ekstynkcji = 7800 M (e-1)). Zgodnie z tym, gęstość żywicy wynosi 0,49 mmol/g.

Wszystkie następujące etapy przeprowadza się na syntezatorze, stosując inne mieszaniny (umieszczone w 5 różnych wkładach). Stosuje się 515 mg upakowanej żywicy (co odpowiada 0,25 mmola: mieszaniny aminokwasów stosuje się w 4-krotnym nadmiarze). Na zakończenie syntezy odcina się N-końcową grupę zabezpieczającą Fmoc. Po płukaniu etanolem i suszeniu przez noc, przeprowadza się odcinanie peptydów z żywicy przy użyciu TFA/H2O (95:5, objętościowo). Roztwór TFA zatęża się w Speed Vac do 1/5 objętości, strąca i płucze eterem dietylowym oraz liofilizuje.

6-merowe peptydy EIDYHR, ELDYHR i EVDYHR stanowią przykłady mimotopów, które mogą być wykrywane przez przeciwciało monoklonalne wytwarzane zgodnie z przykładem 1 powyżej.

2.2. : Biblioteka 2: Ta 6-metrowa biblioteka zawiera peptydy o następujących sekwencjach aminokwasowych (pozycje aminokwasowe 1 do 6):

Pozycja 1: D (ustalony)

Pozycja 2: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem A, K i C (17 możliwości)

Pozycja 6: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem H, K, C i P (16 możliwości).

Bibliotekę peptydową 2 skonstruowano zgodnie ze sposobem, opisanym, powyżej (pod 2.1) dla biblioteki 1.

6-merowe peptydy DIDYHR, DLDYHR i DVDYKR stanowią przykłady mimotopów, które mogą być wykrywane przez przeciwciało monoklonalne wytworzone zgodnie z 1 powyżej.

2.3. : Biblioteka 3: trzecią bibliotekę peptydową stosuje się w dodatkowym podejściu do zdefiniowania sekwencji mimotopowych. Biblioteka ta zawiera sekwencję oryginalną i pozwala na wykrywanie mimotopów bardziej spokrewnionych z sekwencją oryginalną.

Ta 6-merowa biblioteka zawiera peptydy o następujących sekwencjach (pozycje aminokwasowe 1 do 6):

Pozycja 1: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem K i C (18 możliwości)

Pozycja 2: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem K i C (18 możliwości)

Pozycja 3: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem K i C (18 możliwości)

Pozycja 4: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem K i C (18 możliwości)

Pozycja 5: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem K i C (18 możliwości)

Pozycja 6: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem K, C I P (17 możliwości).

Bibliotekę peptydową 3 skonstruowano zgodnie ze sposobem opisanym, powyżej (pod 2.1) dla biblioteki 1.

6-merowe peptydy DIDYRR, DLDYRR i DYDYRR stanowią przykłady mimotopów, które mogą być wykrywane przez przeciwciało monoklonalne wytwarzane zgodnie z 1. powyżej (D w pozycji 1 i R w pozycji 5 są identyczne z epitopem oryginalnym).

2.4. : Biblioteka 4: Ta biblioteka peptydowa 4 składająca się z 5 x 18 = 90 peptydów, jest komercyjnie dostępna z Mimotopes Ltd. (Paris, Francja; zobacz wytyczne wytwórcy) a opracowana jest według naturalnej N-końcowej sekwencji Ae42 DAEFRH.

Pozycja 1: D (ustalona)

Pozycja 2: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem K i C (18 różnych peptydów)

Pozycja 3: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem K i C (18 różnych peptydów)

Pozycja 4: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem K i C (18 różnych peptydów)

Pozycja 5: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem K i C (18 różnych peptydów)

Pozycja 6: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem K i C (18 różnych peptydów).

Poszczególni członkowie peptydowi biblioteki 4 przedstawieni są na Fig. 1. Peptydy o numerach 1, 24, 48, 56 i 80 mają oryginalną sekwencję N-końcowej sekwencji Ae42. Wszystkie inne peptydy

PL 209 989 B stanowią peptydy kandydujące, które są testowane pod względem, ich zdolności wiązania z przeciwciałem wiążącym się z DAEFRH.

2.5.: ELISA z bibliotekami peptydowymi:

Jak wspomniano powyżej biblioteki peptydowe 1, 2 i 3 wytwarzane są przy użyciu syntezatora a peptydów Applied Biosystems 431A zgodnie z klasyczną chemią Fmoc. Komercyjnie dostępną bibliotekę peptydową wytwarza się zgodnie z opisem wytwórcy (zobacz powyżej i poniżej www.mimotopes.com). 90 peptydów jest C-końcowo związanych z trzpieniem.

ELISA dla każdej z bibliotek peptydowych przeprowadzano zgodnie z następującymi standardowymi protokołami:

Bibliotekę peptydową rozpuszcza się w 100% DMSO (końcowe stężenie 10 mg/ml).

Roztwór peptydu rozcieńcza się następnie w PBS.

Mieszaninę peptydową opłaszcza się następnie przez noc (4°C) na płytki ELISA (Nunc Maxisorp, Germany), począwszy od 500 μg/studzienkę, i miareczkuje do 100 ng/studzienkę.

Płytki przepłukuje się 3x PBS/Tween 20 (0,1% objętościowo).

Płytki blokuje się PBS/BSA (2 godz. w temperaturze pokojowej).

Płytki płucze się 3x PBS/Tween.

Płytki inkubuje się z biotynylowanym DAEFRH-specyficznym mAb (10 μg/mi w PBS) przez 4 godz. w temperaturze pokojowej.

Płytki płucze się 3x PBS/Tween. Płytki inkubuje się ze streptawidyną-peroksydazą chrzanową (30 min. w temperaturze pokojowej).

Płytki płucze się 5x PBS/Tween.

Płytki inkubuje się z ABTS + H2O2 (0,1% wag./obj.; 10 do 45 min.) i reakcję zatrzymuje się przy pomocy kwasu cytrynowego a następnie przeprowadza się ocenę fotometryczną (długość fali 405 nm).

3.: Weryfikacja mimotopów przez oznaczenie hamowania

3.1. Biblioteka dodatkowa

Oprócz 4 opisanych powyżej bibliotek (zobacz 2.1., 2.2., 2.3. i 2.4.), do zdefiniowania sekwencji mimotopów stosuje się piątą bibliotekę. Ta 6-merowa biblioteka jest komercyjnie dostępna z mikrokolekcji EMC (Tiibingen, Niemcy) i zawiera 114 różnych mieszanin heksapeptydowych, jedna pozycja na mieszaninę zdefiniowana jest przez jeden ze wszystkich naturalnych aminokwasów za wyjątkiem C (19 możliwości), pozostałych 5 pozycji są zmienne:

Mieszaniny 01 do 06 (jedna pozycja ustalona, alanina A, pozostałe 5 zmienne, X):

Mieszanina 01: AXXXXX

Mieszanina 02: XAXXXX

Mieszanina 03: XXAXXX

Mieszanina 04: XXXAXX

Mieszanina 05: XXXXAX

Mieszanina 06: XXXXXA

Mieszaniny 07 do 12 (jedna pozycja ustalona, arginina R, pozostałe 5 zmienne, X):

Mieszanina 07 RXXXXX

Mieszanina 08 XRXXXX

Mieszanina 09 XXRXXX

Mieszanina 10 XXXRXX

Mieszanina 11 XXXXRX

Mieszanina 12 XXXXXR

Zgodnie z tym, mieszaniny 13 do 114 projektowane są przy użyciu wszystkich naturalnych aminokwasów za wyjątkiem C.

3.2. Oznaczenie hamowania

Figury 2 i 3 opisują wyniki oznaczeń hamowania przeprowadzanych z peptydami mimotopowymi zawartymi w i uzyskanymi z 5 bibliotek (jak opisano). Peptydy mimotopowe współzawodniczą z oryginalnym epitopem o rozpoznanie przez przeciwciało monoklonalne. Epitop oryginalny i peptydy mimotopowe zawierają dodatkową C na C-końcu do sprzęgania z nośnikiem białkowym (jeżeli jest to wskazane).

Stosuje się następujące peptydy:

Peptyd 1737 DAEFRH

Peptyd 3001 DKELRI

Peptyd 3002 DWELRI

Peptyd 3003 YREFFI

PL 209 989 B1

Peptyd 3004 YREFRI

Peptyd 3005 YAEFRG

Peptyd 3006 EAEFRG

Peptyd 3007 DYEFRG

Peptyd 3008 ELEFRG

Peptyd 3009 SFEFRG

Peptyd 3010 DISFRG

Peptyd 3011 DIGWRG

Procedura:

Płytki ELISA (Nunc Maxisorp) opłaszcza się oryginalnym epitopem peptydowym DAEFRH (C-końcowo wydłużony przez C i sprzęgany z albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w stężeniu 0,1 μg/ml peptyd-BSA (100 μl/studzienkę, 12 godz., 4°C). Po blokowaniu PBS/BSA 1% (200 μl/studzienkę, 12 godz., 4°C), płytki płucze się 3x PBS/Tween. Następnie dodaje się biotynylowane przeciwciało monoklonalne (1:2000, 50 μl/studzienkę) i peptydy (50 μl/studzienkę) w stężeniu 50; 5; 0,5; 0,05; 0,005; i 0,0005 μg/ml na 20 min. w 37°C. Płytki płucze się 3x PBS/Tween i inkubuje ze streptawidyną znakowaną peroksydazą chrzanową (HRP) (100 μl/studzienkę, 30 min., RT). Płytki płucze się 5x PBS/Tween i inkubuje z ABTS + H2O2 (0,1% wag./obj., 10 do 45 min.) a reakcje zatrzymuje się przy użyciu kwasu cytrynowego a następnie przeprowadza się ocenę fotometryczną (długość fali 405 nm).

Jak oczekiwano i jak to jest widoczne na Fig. 2, peptyd 1737 DAEFRH może współzawodniczyć ze sprzężonym z BSA, związanym, z płytką peptydem. DAEFRH a zatem hamuje rozpoznanie przez przeciwciało monoklonalne. Ponadto, pokazano, że peptyd 3003 nie jest zdolny do hamowania wiązania przeciwciała monoklonalnego z oryginalnym, epitopem. W przeciwieństwie do tego, peptydy 3001, 3002, 3004, 3005, 3006 i 3007 (w różnym stopniu) blokują rozpoznanie epitopu. Podczas gdy peptyd 3004 wykazuje działanie hamujące jedynie w wysokich stężeniach (50 μg/ml), peptydy 3001, 3006 i 3007 wykazują silne działanie hamujące przy IC₅₀ wynoszącym mniej niż 0,5 μg/ml. Peptydy 3002 i 3005 są pośrednimi inhibitorami o IC₅₀ wynoszącym ponad 0,5 μg/ml.

Jak oczekiwano i jak to jest widoczne na Fig. 3, peptyd 1737 DAEFRH może pomyślnie współzawodniczyć ze sprzężonym z BSA, związanym z płytką peptydem. DAEFRH o rozpoznanie przez przeciwciało monoklonalne w niezależnym dodatkowo przeprowadzonym doświadczeniu. Ponadto, wykazano, że peptydy 3010 i 3011 nie wykazują działania hamującego w testowanych stężeniach, podczas gdy peptydy 3008 i 3009 są (względnie) słabymi inhibitorami o IC₅₀ wynoszącym mniej niż 5 μg/ml.

Tabela 1 w skrócie podsumowuje zdolność hamowania mimotopów zawartych w i uzyskanych z bibliotek (jak opisano):

T a b e l a 1: Zdolność hamowania mimotopów

Peptyd 3001 DKELRI silna

Peptyd 3002 DWELRI pośrednia

Peptyd 3003 YREFFI żadna

Peptyd 3004 YREFRI słaba

Peptyd 3005 YAEFRG pośrednia

Peptyd 3006 EAEFRG silna

Peptyd 3007 DYEFRG silna

Peptyd 3008 ELEFRG słaba

Peptyd 3009 SFEFRG słaba

Peptyd 3010 DISFRG żadna

Peptyd 3011 DIGWRG żadna.

4. Oznaczenie hamowania dla dodatkowych mimotopów wyszukiwanych zgodnie z niniejszym wynalazkiem

Oznaczenie hamowania

Figury 4 i 5 opisują wyniki oznaczeń hamowania przeprowadzanych z peptydami mimotopowymi zawartymi w i uzyskanymi z 5 bibliotek (jak opisano). Peptydy mimotopowe współzawodniczą z oryginalnym epitopem o rozpoznawanie przez przeciwciało monoklonalne. Oryginalne peptydy epitopowe i mimotopowe zawierają dodatkową C na C-końcu (pozycja 7) do sprzęgania z białkiem, nośnikowym (jeżeli jest to wskazane).

PL 209 989 B

Stosuje się następujące peptydy:

Peptyd 1737 DAEFRH (oryginalny epitop + C)

Peptyd 1234 KKELRI

Peptyd 1235 DRELRI

Peptyd 1236 DKELKI

Peptyd 1237 DRELKI

Peptyd 1238 DKELR

Peptyd 1239 EYEFRG

Peptyd 1241 DWEFRDA

Peptyd 4002 SWEFRT

Peptyd 4003 GREFRN

Peptyd 4004 WHWSWR

Procedura:

Płytki ELISA (Nunc Maxisorp) opłaszcza się oryginalnym epitopem peptydowym DAEFRH (C-końcowo wydłużonym przez C i sprzęga z albuminą surowicy bydlęcej BSA) w stężeniu 0,1 μg/ml peptyd-BSA (100 μl/studzienkę, 12 godz., 4°C). Po blokowaniu przy pomocy PBS/BSA 1% (200 μl/studzienkę, 12 godz., 4°C), płytki płucze się 3x PBS/Tween. Następnie, dodaje się biotynylowane przeciwciało monoklonalne (1:2000, 50 μl/studzienkę) i peptydy (50 μl/studzienkę) w różnych stężeniach na 20 min. w 37°C. Płytki płucze się 3x PBS/Tween i inkubuje ze streptawidyną znakowaną peroksydazą chrzanową (HRP) (100 μl/studzienkę, 30 min., RT). Płytki płucze się 5x PBS/Tween inkubuje z ABTS + H2O2 (0,1% wag./obj., 10 do 45 min.) a reakcję zatrzymuje się przy użyciu kwasu cytrynowego a następnie przeprowadza się ocenę fotometryczną (długość fali 405 nm).

Jak oczekiwano i jak to jest widoczne na Fig. 4, peptyd 1737 DAEFRH może współzawodniczyć ze sprzężonym, z BSA, związanym, z płytką peptydem DAEFRH a zatem hamuje rozpoznawanie przez przeciwciało monoklinalne. Ponadto, pokazano, że peptyd 4004 nie jest zdolny do hamowania wiązania przeciwciała monoklonalnego z oryginalnym, epitopem. Przeciwnie, peptydy 4002 i 4003 (w różnym, stopniu) blokują rozpoznawanie epitopu. Podczas gdy peptyd 4003 wykazuje działanie hamujące jedynie przy względnie wysokich stężeniach (10 μg/ml), peptyd 4002 wykazuje silne działanie hamujące przy IC₅₀ wynoszącym mniej niż 0,4 μg/ml.

Jak oczekiwano i jak to jest widoczne na Fig. 5, peptyd 1737 DAEFRH może z sukcesem, współzawodniczyć ze sprzężonym, z BSA, związanym z płytką peptydem DAEFRH o rozpoznawanie przez przeciwciało monoklonalne w dodatkowo przeprowadzonym niezależnym doświadczeniu. Ponadto, wykazano, że peptyd 1234 wcale nie jest hamujący przy testowanych stężeniach, podczas gdy peptydy 1235, 1236, 1237, 1238, 1239 i 1241 (w różnym stopniu) blokują rozpoznawanie epitopu. Peptydy 1235, 1238 i 1241 są silnymi inhibitorami o IC₅₀ wynoszącym, mniej niż 0,5 μg/ml, podczas gdy peptydy 1236 i 1237 są (względnie) słabymi inhibitorami o IC₅₀ wynoszącym powyżej 5 μg/ml. Peptyd 1239 stanowi pośredni inhibitor o IC₅₀ wynoszącym powyżej 0,5 μg/ml.

Tabela 2 w skrócie podsumowuje zdolność hamującą mimotopów zawartych w i uzyskanych z bibliotek (jak opisano):

T a b e l a 2: Zdolności hamujące mimotopów:

Peptyd 1234 KKELRI żadna Peptyd 1235 DRELRI silna Peptyd 1236 DKELKI słaba Peptyd 1237 DRELKI słaba Peptyd 1238 DKELR silna Peptyd 1239 EYEFRG pośrednia Peptyd 1241 DWEFRDA silna Peptyd 4002 SWEFRT silna Peptyd 4003 GREFRN słaba Peptyd 4004 WHWSWR żadna

Wyniki przedstawione na Figurach 4 i 5 pokazują, że oprócz różnych 6-merowych peptydów (jak pokazano tu i wcześniej), w szczepionce przeciwko chorobie Alzheimera opartej na mimotopach mogą być zastosowane peptydy 5-merowe (mianowicie peptyd 1238 DKELR) i peptydy 7-merowe (mianowicie peptyd 1241 DWEFRDA).

Claims

1. Zastosowanie związku peptydowego o 5 do 15 aminokwasach, zawierającego sekwencję wybraną z grupy składającej się z DKELRI, DWELRI YAEFRG, EAEFRG, DYEFRG, DRELRI, GREFRN, EYEFRG, DWEFRDA, SWEERT i DKELR, oraz ewentualnie dodatkowo zawierającego kowalencyjnie lub niekowalencyjnie sprzężony łącznik lub nośnik, do wytwarzania szczepionki na chorobę Alzheimera (AD).

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że związek ten stanowi peptyd wybrany z grupy składającej się z DKELRI, DWELRI, YAEFRG, EAEFRG, DYEFRG, DRELRI, GREFRN, EYEFRG, DWEFRDA, SWEFRT albo DKELR.

3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że związek ten stanowi polipeptyd o 6 do 12 resztach aminokwasowych.

4. Zastosowanie według jednego z zastrz. od 1 do 3, znamienne tym, że związek ten jest sprzężony z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, korzystnie KLH, i ewentualnie wodorotlenkiem aluminium.

5. Zastosowanie według jednego z zastrz. od 1 do 4, znamienne tym, że zawiera ona związek w ilości 0,1 ng do 10 mg, korzystnie 10 ng do 1 mg, zwłaszcza 100 ng do 100 μg.

6. Szczepionka przeciwko chorobie Alzheimera, znamienna tym, że wytwarzana szczepionka zawiera antygen zawierający co najmniej jeden peptyd wybrany z grupy DKELRI, DWELRI, YAEERG, EAEFRG, DYEFRG, DRELRI, GREFRN, EYEFRG, DWEFRDA, SWEFRT albo DKELR.