PL209989B1 - Zastosowanie związku peptydowego oraz szczepionka przeciwko chorobie Alzheimera - Google Patents
Zastosowanie związku peptydowego oraz szczepionka przeciwko chorobie AlzheimeraInfo
- Publication number
- PL209989B1 PL209989B1 PL378333A PL37833304A PL209989B1 PL 209989 B1 PL209989 B1 PL 209989B1 PL 378333 A PL378333 A PL 378333A PL 37833304 A PL37833304 A PL 37833304A PL 209989 B1 PL209989 B1 PL 209989B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- peptide
- peptides
- compound
- antibody
- disease
- Prior art date
Links
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 23
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 27
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 26
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 191
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 73
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 44
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 4
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 52
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 37
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 19
- 101710137189 Amyloid-beta A4 protein Proteins 0.000 description 14
- 102100022704 Amyloid-beta precursor protein Human genes 0.000 description 14
- 101710151993 Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 14
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 14
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 13
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 12
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 10
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 9
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 8
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 7
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 7
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 3
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000007171 neuropathology Effects 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 2
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005556 structure-activity relationship Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 1-chloro-2-[chloro(diphenyl)methyl]benzene Chemical compound ClC1=CC=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UPMGJEMWPQOACJ-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[(2,4-dimethoxyphenyl)-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)methyl]phenoxy]acetic acid Chemical compound COC1=CC(OC)=CC=C1C(C=1C=CC(OCC(O)=O)=CC=1)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 UPMGJEMWPQOACJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000009091 Amyloidogenic Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010048112 Amyloidogenic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 206010018341 Gliosis Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000823051 Homo sapiens Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 208000026139 Memory disease Diseases 0.000 description 1
- 208000036110 Neuroinflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102000015499 Presenilins Human genes 0.000 description 1
- 108010050254 Presenilins Proteins 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000007791 alzheimer disease like pathology Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 108010064539 amyloid beta-protein (1-42) Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 208000037875 astrocytosis Diseases 0.000 description 1
- 230000007341 astrogliosis Effects 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 230000006736 behavioral deficit Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 230000035557 fibrillogenesis Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000046783 human APP Human genes 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000027928 long-term synaptic potentiation Effects 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000002241 neurite Anatomy 0.000 description 1
- 230000003959 neuroinflammation Effects 0.000 description 1
- 230000002314 neuroinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 238000009520 phase I clinical trial Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku peptydowego do wytwarzania szczepionki przeciwko chorobie Alzheimera oraz szczepionka przeciwko chorobie Alzheimera, która użyteczna jest w sposobach profilaktyki i leczenia choroby Alzheimera (AD).
Peptyd β-amyloidu (Αβ) odgrywa kluczową rolę w neuropatologii choroby Alzheimera (AD) (Roher i wsp. 1993: e-Amyloid-(1-42) is a major component of cerebrovascular amyloid deposits: Implications for the pathology of Alzheimer disease PNAS 90:10836). Rodzinne postaci tej choroby wiązano z mutacjami w genach prekursora białka amyloidu (ang. amyloid precursor protein, (APP)) oraz presenilin. Związane z chorobą mutacje w tych genach skutkują zwiększeniem wytwarzania 42-aminokwasowej postaci peptydu (Ae42), który stanowi główną postać stwierdzaną w płytkach amyloidowych w chorobie Alzheimera. Zwierzęcy model dla tej choroby jest komercyjnie dostępny. U myszy transgenicznej PDAPP, z nadekspresją zmutowanego ludzkiego APP (w którym aminokwas w pozycji aminokwasowej 717 stanowi F zamiast V), w sposób progresywny pojawia się wiele szczególnych oznak choroby Alzheimera, w sposób zależny od wieku i mózgu (Games i wsp. 1995: Alzheimer-type neuropathology m transgenic mice overexpressing V717F β-amyloid precursor protein Nature 373: 523).
Przeprowadzono już badania dotyczące szczepienia normalną, nieopartą na mimotopie szczepionką. Zwierzęta transgeniczne immunizowano zagregowanym Ae42, albo przed pojawieniem się neuropatologii typu AD (6 tygodni) albo w późniejszym wieku (11 miesięcy): Immunizacja młodych zwierząt zapobiegała rozwojowi tworzenia płytek, dystrofii neurytów i astrogliozie. Traktowanie starszych zwierząt znacząco zmniejszyło neuropatolog typu AD. Ta doświadczalna próba szczepienia indukowała powstawanie przeciwciał przeciwko Ae42 zdolnych do przekroczenia bariery krew-mózg i atakowania płytek amyloidowych (Schenk i wsp. 1999: Immunization with amyloid-β attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse Nature 400:173). Płytki następnie są usuwane za pomocą kilku mechanizmów, włącznie z zależną od receptora Fc fagocytozą (Bard i wsp. 2000: Peripherally administered antibodies against amyloid β-peptide enter the central nervous system and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease Nature Med 6:916). Szczepionka ta była również w stanie opóźnić pojawienie się deficytów pamięci (Janus i wsp. 2000: AS peptide immunization reduces behavioural impairment and plaques in a model of Alzheimer's disease Nature 408:979).
Od 1999 roku w fazie badań klinicznych znajduje się wysoce obiecująca terapia immunizacyjna dla choroby Alzheimera. Uważa się, że immunizacja stymuluje układ odpornościowy do atakowania płytek i usuwania tych złogów z dotkniętego chorobą mózgu, chociaż konieczne jest dokładniejsze określenie specyficznego mechanizmu leżącego u jej podłoża.
Te badania kliniczne przeprowadzała firma farmaceutyczna Elan w połączeniu ze swym partnerem korporacyjnym, American Home Products (szczepionka terapeutyczna AN-1792, QS21 jako adiuwant). Fazę I badań klinicznych pomyślnie zakończono w roku 2000. W roku 2001 rozpoczęto fazę II badań, aby testować skuteczność na zespole pacjentów z łagodną do umiarkowanej postacią AD.
Obecnie wstrzymano te badania fazy II permanentnie ze względu na stan zapalny w obrębie układu nerwowego u kilku pacjentów (Editorial 2002 Insoluble problem Nature Med 8:191). Objawy obejmowały aseptyczne zapalenie mózgu i rdzenia, co doprowadziło do natychmiastowego zatrzymania badań ogólnoświatowych. W przypadku najgorszego scenariusza zostanie wykazane, że u badanych pacjentów wystąpiła odpowiedź autoimmunizacyjna - ryzyko właściwe wielu immunoterapiom. Powikłania autoimmunizacyjne można było przewidzieć biorąc pod uwagę wszechobecność APP, które oczywiście niesie determinanty antygenowe podobne do jego produktu proteolitycznego. Stosunkowo niedawno, dodatkowe badania skoncentrowane na charakterze przeciwciał indukowanych immunizacją zagregowanymi Ae42 (u ludzi i myszy) wykazały, że większość przeciwciał rozpoznaje w Ae42 małą domenę między aminokwasem 4 a 10 (Ae4-10). Mysie przeciwciała były zdolne do blokowania tworzenia włókienek Ae i rozrywały występujące już włókienka Ae (McLaurin i wsp. 2002: Therapeutically effective antibodies against amyloid-β peptide target amyloid-β residues 4-10 and inhibit cytotoxicity and fibrillogenesis Nature Med 8: 1263). Należy zauważyć, że ludzkie przeciwciała nie reagują z APP eksponowanymi na powierzchni komórek lub innego dowolnego niezagregowanego produktu proteolitycznego prekursora (Hock i wsp., 2002: Generation of antibodies specific for β-amyloid by vaccination of patients with Alzheimer disease Nature Med 8: 1270). Zaobserwowano wyraźną różnicę pomiędzy surowicami ludzkimi a mysimi: w przeciwieństwie do ludzkich przeciwciał, mysie przeciwciała wykrywają monomeryczne, oligomeryczne i fibrylarne Λβ. Ma to istotne znaczenie i może być przesłanką co do potenciału terapeutycznego, jako że gromadzone są dowody na to, że
PL 209 989 B małe oligomery Αβ, które nie są rozpoznawane przez ludzkie anty-Αβ, odgrywają główną rolę toksyczną w tej chorobie (Walsh i wsp. 2002: Naturally secreted oligomers of amyloid β protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo Nature 416: 535). Zatem, potencjalną nową strategią jest immunizacja szczepionką zawierającą aminokwasy 4-10 β-amyloidu (zamiast zagregowanego Ae42). Pomimo nieznanej skuteczności strategia ta może również stanąć wobec problemów autoimmunizacyjnych, ponieważ pacjenci będą bezpośrednio immunizowani własnym epitopem (liniowa komórka B).
Pomimo tych rozczarowujących postępów w obecnych strategiach szczepienia AD, wciąż uważa się szczepionkę Ae za najbardziej obiecujący sposób zwalczania AD. Jednakże, istnieje pilne zapotrzebowanie na udoskonalenia oraz nowe strategie w szczepieniu AD. W szczególności taka szczepionka nie powinna indukować autoreaktywnych komórek T i/lub B.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie związku peptydowego o 5 do 15 aminokwasach, zawierającego sekwencję wybraną z grupy składające] się z DKELRI, DWELRI YAEFRG, EAEFRG, DYEFRG, DRSLRI, GREFRN, EYEFRG, DWEFRDA, SWEFRT i DKELR, oraz ewentualnie dodatkowo zawierającego kowalencyjnie lub niekowalencyjnie sprzężony łącznik lub nośnik, do wytwarzania szczepionki na chorobę Alzheimera (AD).
Korzystnie związek ten stanowi peptyd wybrany z grupy składającej się z DKELRI, DWELRI, YAEFRG, EAEFRG, DYEFRG, DRELRI, GREFRN, EYEFRG, DWEFRDA, SWEFRT albo DKELR.
Korzystnie związek ten stanowi polipeptyd o 6 do 12 resztach aminokwasowych.
Korzystnie związek ten jest sprzężony z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, korzystnie KLH, i ewentualnie wodorotlenkiem aluminium.
Korzystnie wytwarzana szczepionka zawiera związek w ilości 0,1 ng do 10 mg, korzystnie 10 ng do 1 mg, zwłaszcza 100 ng do 100 μg.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto szczepionka przeciwko chorobie Alzheimera, charakteryzująca się tym, że zawiera antygen zawierający co najmniej jeden peptyd wybrany z grupy
DKELRI, DWELRI, YAEFRG, EAEFRG, DYEFRG, DRELRI, GREERN, EYEFRG, DWEERDA, SWEFRT albo DKELR.
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem do szczepienia przeciwko AD stosowany jest mimotop Αβ42: Mimotop indukuje wytwarzanie przeciwciał przeciwko Αβ42 ale nie przeciwko natywnemu APP. Mimotop można zidentyfikować przy użyciu przeciwciała (monoklonalnego) i bibliotek peptydowych (komercyjnie dostępnych) (np. zgodnie z publikacją autorstwa Reineke i wsp. 2002: Identification of distinct antibody epitopes and mimotopes from a peptide array of 5520 randomly generated secuences J Immunol Methods 267:37). Stosowane jest przeciwciało (monoklonalne), które nie rozpoznaje APP, ale wykrywa jedynie różne rodzaje Αβ z amino-końcowym kwasem asparaginowym. (przykład dla takiego przeciwciała opisany jest w publikacji autorstwa Johnson-Wood i wsp. 1997: Amyloid precursor protein processing and Αβ42 deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer disease PNAS 94: 1550). Udowodniono, że takie przeciwciało jest idealnym narzędziem do identyfikowania mimotopów odpowiednich do szczepionek w przebiegu niniejszego wynalazku. Chociaż wykazano, że takie przeciwciała monoklonalne wywierają korzystne wpływy w przypadku mysiego modelu AD przy bezpośrednim podawaniu myszom (Bard i wsp., 2000: Peripherally administered antibodies against amyloid β-peptide enter the central nervous system, and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease Nature Med 6: 916), jednak przeciwciał tych nigdy nie proponowano do zastosowania jako narzędzi do wyszukiwania mimotopów w celu izolowania związków na szczepionki przeciwko AD.
W stanie techniki wszystkie wysiłki były skoncentrowane na naturalnie występującym. peptydzie Aβ. Jak wspomniano powyżej, badania kliniczne ze szczepionką z peptydem. Aβ zostały wstrzymane ze względu na przypadki stanów neurozapalnych. W istocie, programy do przewidywania epitopów komórek T (BIMAS dla epitopów z restrykcją dla klasy I oraz TEPITOPE dla epitopów z restrykcją dla klasy II) proponują wysokopunktowe (własne) epitopy w obrębie tej sekwencji. Może to sugerować, że zdarzenia neurozapalne powstają w wyniku reakcji autoimmunizacyjnych, co może sprawić że takie szczepionki będą nieodpowiednie do ogólnego stosowania.
W przeciwieństwie do tego rodzaju szczepionek proponowanych w stanie techniki, nie oczekuje się wystąpienia żadnych reakcji autoimmunizacyjnych w czasie leczenia szczepionką zawierającą mimotop do zastosowania w niniejszym. wynalazku, ponieważ przeciwciało (monoklonalne) stosowane do identyfikacji mimotopu do zastosowania w niniejszym wynalazku nie rozpoznaje APP a sekwencja mimotopu jest odmienna niż sekwencje własne pochodzące z Aβ42, które stosowano dotąd w badaniach lub które będą stosowane w przyszłych badaniach.
PL 209 989 B1
Przeciwciało stosowane do identyfikacji mimotopu do zastosowania w niniejszym wynalazku wykrywa pochodzącą z Αβ sekwencję aminokwasową DAEFRH (= oryginalny epitop) z wolnym amino-końcowym kwasem asparaginowym, zatem nie rozpoznaje ono natywnego APP. Przeciwciało może być kompozycją monoklonalnego lub poliklonalnego przeciwciała lub dowolną częścią przeciwciała lub jego fragmentem, jedyną przesłanką jest ta, że cząsteczka przeciwciała specyficznie rozpoznaje epitop DAEFRH, tzn. że nie wiąże się ona z naturalnie N-końcowo wydłużonymi postaciami białka prekursora amyloidu, co oznacza, że zdolność wiązania z epitopem DAEFRH jest przynajmniej 100 razy, dogodnie przynajmniej 1000 razy, w szczególności przynajmniej 105 razy, wyższa niż z cząsteczką APP. Przeciwciałem może być przeciwciało wykazujące taką samą lub wyższą zdolność wiązania z sekwencją DAEFRH jak przeciwciało opisane przez Johnson-Wood i wsp., 1997. Oczywiście, zastosowane mogą być również przeciwciała z niższą zdolnością wiązania (>10%, >50% lub >80% zdolności wiązania przeciwciała Johnson-Wood i wsp.), chociaż wyższa zdolność wiązania jest bardziej zalecana.
Związki do zastosowania w niniejszym wynalazku wiążą się z tymi przeciwciałami z porównywalną specyficznością jak z sekwencją DAEFRH.
Zalecany mimotop do zastosowania w niniejszym, wynalazku ma dogodnie długość 5 do 15 aminokwasów. Związek ten może być dostarczony w szczepionce w postaci wyizolowanej (peptyd) lub może być sprzężony lub skompleksowany z innymi cząsteczkami, takimi jak farmaceutyczne substancje nośnikowe lub struktury polipeptydowe, lipidowe lub węglowodanowe. Korzystnie, mimotopy do zastosowania w niniejszym wynalazku mają długość (minimum) pomiędzy 5 a 15, 6 a 12 reszt aminokwasowych, specyficznie pomiędzy 9 a 11. Mimotopy mogą jednakże być sprzęgane (kowalencyjnie lub niekowalencyjnie) z niespecyficznymi łącznikami lub nośnikami, zwłaszcza łącznikami peptydowymi lub nośnikami białkowymi. Ponadto, łączniki peptydowe lub nośniki białkowe mogą składać się z lub zawierać epitopy pomocniczych komórek T.
Korzystnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik stanowi KLH. Nośnikami mogą być także: anatoksyna tężcowa, białko wiążące albuminę, albumina surowicy bydlęcej, dendrimer (MAP; Biol. Chem. 358: 581), jak również substancje adiuwantowe opisane w publikacji autorstwa Singh i wsp., Nat. Biotech. 17(1999), 1075 - 1081 (dokładniej te w tabeli I tego dokumentu) oraz O'Hagan i wsp.. Nature Reviews, Drug Discovery 2(9) (2003), 727 - 735 (dokładniej związki nasilające odporność wrodzoną i układy dostarczania tam opisane), lub ich mieszaniny. Ponadto, kompozycja szczepionki może zawierać wodorotlenek aluminium.
Szczepionka zawierająca niniejszy związek (mimotop) i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik może być podawana dowolną drogą podawania, np. dożylnie, śródotrzewnowo, śródmięśniowo, donosowo, doustnie, podskórnie itp. oraz w dowolnym odpowiednim przyrządzie do dostarczania (O'Hagan i wsp., Nature Reviews, Drug Discovery 2(9) (2003), 727 - 735). Zazwyczaj, szczepionka zawiera związek do zastosowania w niniejszym wynalazku w ilości wynoszącej 0,1 ng do 10 mg, korzystnie 10 ng do 1 mg, zwłaszcza 100 ng do 100 μg albo, ewentualnie np. 100 fmoli do 10 μmoli, korzystnie 10 pmoli do 1 μmola, zwłaszcza 100 pmoli do 100 nmoli. Szczepionka może również zawierać typowe substancje dodatkowe, np. bufory, środki stabilizujące, itp.
Sposób izolowania związku wiążącego się z przeciwciałem specyficznym dla naturalnej N-końcowej sekwencji Αβ42 DAEFRH obejmuje etapy:
- dostarczania biblioteki związków peptydowych obejmującej peptydy zawierające następującą sekwencję aminokwasową:
X1X2X3X4X5X6 w której X1 oznacza aminokwas, z wyjątkiem C,
X2 oznacza aminokwas, z wyjątkiem C,
X3 oznacza aminokwas, z wyjątkiem. C,
X4 oznacza aminokwas, z wyjątkiem C,
X5 oznacza aminokwas, z wyjątkiem C,
X6 oznacza aminokwas, z wyjątkiem. C, i przy czym X1X2X3X4X5X6 nie stanowi DAEFRH,
- kontaktowania wspomnianej biblioteki peptydowej ze wspomnianym przeciwciałem i
- izolowania tych członków biblioteki peptydowej, którzy wiążą się ze wspomnianym przeciwciałem. Specyficzna postać realizacji tego sposobu izolowania związku wiążącego się z przeciwciałem specyficznym dla naturalnej N-końcowej sekwencji Αβ42 DAEFRH obejmuje etapy:
PL 209 989 B
- dostarczania biblioteki związku peptydowego obejmują cej peptydy zawierające następującą sekwencję aminokwasową
X1X2X3X4X5X6 w której X1 oznacza naturalny aminokwas, z wyją tkiem K i C,
X2 oznacza naturalny aminokwas, z wyjątkiem C,
X3 oznacza naturalny aminokwas, z wyjątkiem K i C,
X4 oznacza naturalny aminokwas, z wyjątkiem K i C X5 oznacza naturalny aminokwas, z wyjątkiem C,
X6 oznacza naturalny aminokwas, z wyjątkiem P i C, i przy czym X1X2X3X4X5X6 nie stanowi DAEFRH,
- kontaktowania wspomnianej biblioteki peptydowej ze wspomnianym przeciwciałem i - izolowania tych członków biblioteki peptydowej, którzy wiążą się ze wspomnianym przeciwciałem. Izolacji odpowiednich 5-merów do zastosowania w niniejszym wynalazku można dokonać sposobem opisanym powyżej, dostosowanym do bibliotek zmiennych 5 aminokwasowych, i można ją dogodnie przeprowadzić albo poprzez przeszukiwanie biblioteki ze zmiennymi aminokwasowymi X1 do X5 jak tu opisano albo poprzez identyfikowanie odpowiednich 5-merów wśród pozytywnych wyszukanych członków w bibliotece 6-merów (zobacz: powyżej). W taki sam sposób zastosować można również biblioteki odpowiednio 7-merów, 8-merów, 9-merów, 10-merów, w celu wyszukiwania sekwencji, które wiążą się z niniejszym typem przeciwciała. Odpowiednie fragmenty wiążące przeciwciało takich dłuższych sekwencji można znaleźć, przykładowo poprzez testowanie tych fragmentów o długości 5,
6, 7, 8, 9 reszt aminokwasowych pod kątem. ich wiązania z niniejszym przeciwciałem.
Udowodniono, że tego rodzaju sposób skutecznie dostarczał mimotopów Αβ do zastosowania w niniejszym wynalazku.
Dogodnie wspomniane peptydy dostarczane są we wspomniane] bibliotece w postaci zindywidualizowanej, zwłaszcza unieruchomione na powierzchni stałej, tak jak, przykładowo, jest to możliwe przy użyciu technologii peptydowej MULTIPIN™. Bibliotekę można także zapewnić w postaci mieszaniny peptydów a kompleksy przeciwciało: peptyd można wyizolować po związaniu przeciwciała. Ewentualnie, przeciwciało można immobilizować a bibliotekę peptydową (w zawiesinie lub roztworze) kontaktuje się następnie z unieruchomionymi przeciwciałami.
Dogodnie przeciwciała do przeszukiwania (lub członkowie biblioteki peptydowej) obejmują odpowiedni marker, który pozwala na wykrywanie lub izolację przeciwciała lub kompleksu przeciwciało: peptyd po związaniu z peptydem z biblioteki. Odpowiednie układy markerowe (tzn. markery do biotynylacji, markery fluorescencyjne, radioaktywne, magnetyczne i rozwijające kolor oraz przeciwciała drugorzędowe) są łatwo dostępne dla specjalistów w dziedzinie.
Biblioteka musi być skonstruowana z wyłączeniem naturalnie występującej sekwencji Ae (np. DAEFRH), ponieważ szczepienie tą sekwencją wyraźnie wyłączane jest z niniejszego wynalazku.
Dalszą odpowiednią techniką do izolowania epitopów do zastosowania w niniejszym wynalazku jest przeszukiwanie w fagowych bibliotekach peptydowych jak np. opisano w publikacji nr WO 03/020750.
Niniejszy wynalazek dotyczy również kompozycji zawierającej peptyd wiążący się z przeciwciałem, przeciw N-końcowi Ae42 wybrany z grupy składającej się z DKELRI, DWELRI, YAEERG, EAEFRG, DYEERG, DRELRI, GREFRN, EYEERG, DWEERDA, SWSERT i DKER (albo, w pewnych przypadkach dogodnie, większą cząsteczkę zawierającą taki peptyd (np. peptyd połączony z nośnikiem lub cząsteczką dostarczającą)) jak tu zdefiniowano (ewentualnie jako pojedynczy składnik czynny), dogodnie kompozycji szczepionki przeciwko chorobie Alzheimera zawierającej taki antygen, zwłaszcza antygen, który zawiera przynajmniej jeden peptyd wybrany z grupy DKELRI, DWELRI, YAEERG, EAEFRG, DYEFRG, DRELRI, GREFRN, EYEERG, DWEFRDA, SWEFRT i DKELR. Peptydy te są, oprócz innych peptydów dostarczanych przez niniejszy wynalazek specyficznie dopasowane do zastosowania w wytwarzaniu kompozycji farmaceutycznej, zwłaszcza szczepionek AD. Te sekwencje są wyłącznie sztucznymi mimotopami Ae. Peptydy te mogą - dla celów szczepienia - być sprzęgane (kowalencyjnie lub niekowalencyjnie) z odpowiednimi nośnikami i mogą być dostarczane jako związki peptydowe lub kompleksy wraz z innymi związkami lub ugrupowaniami, np. adiuwantami, nośnikami peptydowymi lub białkowymi, itp. i podawane w odpowiedni sposób (jak np. opisano w publikacji autorstwa O'Hagan i wsp., Nature Reviews, Drug Discovery 2(9) (2003), 727 - 735)).
Wynalazek opisany jest dalej w następujących przykładach oraz rysunkach figur, oczywiście bez ograniczenia do nich.
PL 209 989 B1
Fig. 1 przedstawia wyszczególnionych członków peptydowych biblioteki 4 stosowanej w niniejszym procesie wyszukiwania.
Fig. 2 przedstawia oznaczenie hamowania z mimotopami dla DAEFRH.
Fig. 3 przedstawia inne oznaczenie hamowania z innymi mimotopami dla DAEFRH.
Figury 4 i 5 opisują wyniki oznaczeń hamowania przeprowadzonych z mimotopami peptydowymi do zastosowania w niniejszym wynalazku.
P r z y k ł a d y:
1.: Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych (mAb) do wykrywania różnych rodzajów peptydów pochodzących od Αβ42 z wolnym N-końcem. (wolny kwas asparaginowy na N-końcu)
Myszy szczepi się 6-merowym. peptydem. DAEFRH (naturalna N-końcowa sekwencja Ae42) związanym z białkiem, albuminą surowicy bydlęcej, BSA (dla wykorzystania efektu hapten-nośnik), zemulgowanym w CFA (pierwsze wstrzyknięcie) i IFA (wstrzyknięcia przypominające). Przy użyciu ELISA wykrywa się wytwarzające przeciwciała hybrydomy specyficzne dla peptydu DAEFRH (płytki ELISA opłaszczone peptydem DAEFRH). Jako peptydową kontrolę negatywną stosuje się peptyd SEVKMDAEFRH (naturalna N-końcowo wydłużona sekwencja, pochodząca od APP, zawierająca sekwencję pochodzącą od Ae42): hybrydomy rozpoznające wydłużony peptyd są wyłączane, ponieważ nie rozróżniają pomiędzy peptydami pochodzącymi od Ae42 z wolnym kwasem asparaginowym na N-końcu a pochodzącym od APP peptydem DAEFRH bez wolnego kwasu asparaginowego.
2.: Konstrukcja bibliotek peptydowych:
Mimotopy do zastosowania w niniejszym wynalazku wykryto przy użyciu zaadaptowanej metody Reinke i wsp., 2000, poprzez przeszukiwanie bibliotek peptydowych pod kątem wiązania z przeciwciałem (korzystnie przeciwciałem, monoklonalnym), które jest specyficzne dla różnych rodzajów Ae z amino-końcowym kwasem asparaginowym. Inną metodą jest komercyjnie dostępna technologia peptydu MULTIP-IN™.
Technologia peptydu Multipin™ wymaga syntetyzowania peptydów na specjalnie wytworzonych trzpieniach polietylenowych zamocowanych na blokach w formacie, który jest kompatybilny ze standardową płytką do mikromiareczkowania 8 x 12 stosowaną w wielu oznaczeniach biologicznych. Z użyciem tej metody wytworzone mogą być zarówno peptydy związane z trzpieniem (nieodcinalne peptydy, które pozostają kowalencyjnie związane z trzpieniem), jak i peptydy z fazy roztworu (te, które zostały odcięte z powierzchni trzpienia). PepSets, oparty na układzie syntezy Multipin, pozwala na jednoczesną syntezę i przeszukiwanie dużej liczby peptydów.
PepSets składa się z bloków 96 indywidualnie zsyntetyzowanych peptydów, z których dwa stanowią starannie wybrane sekwencje kontrolne. Odcięte kontrole oznacza się pod kątem czystości z użyciem HPLC w odwróconej fazie i ocenia ilościowo zawartość peptydu przy użyciu analizy aminokwasów. Pozytywne i negatywne nieodcinalne kontrole oznacza się z użyciem, standardowych technik ELISA.
Peptydy PepSet dostępne są z szeregiem różnych modyfikacji chemicznych, włącznie z acetylacją, biotynylacją, fosforylacją i cyklizacją. Peptydy z fazy roztworu (odcięte) przesyła się w postaci liofilizowanych proszków.
Do wytwarzania peptydów z fazy roztworu istnieje szereg zakończeń C-końcowych, włącznie z kwasem, i amidem, zależnie od zamierzonego zastosowania peptydu. Odcinalne wiązanie wprowadzane jest na powierzchnię trzpienia, albo jako wstępnie wytworzona pochodna estrowa C-końcowego aminokwasu, albo na łączniku amidowym typu Rink. Peptydy z kwasowymi lub amidowymi grupami końcowymi uwalnia się następnie poprzez traktowanie związanego z trzpieniem peptydu silnym, kwasem. Opcje co do skali syntezy stanowią: nominalna skala 1 mikromolowa i skala 5 mikromolowa. Czynniki takie jak hydrofobowość i wydajność cięcia będą wpływały na odzyskiwanie peptydu, w taki sposób że oczekiwana wydajność uzyskiwania peptydu wynosi 0,5 do 1 mikromola (około 1 mg dla 15-merowego peptydu) w przypadku gdy peptydy syntetyzuje się na nominalną skalę 1 mikromolową, albo wydajność wynosi 2,5 do 5 mikromola dla peptydów syntetyzowanych na nominalną skalę 5 mikromolową.
Nieodcinalne peptydy pozostają kowalencyjnie związane z trzpieniami i mogą być szybko przeszukiwane pod kątem peptydów będących przedmiotem zainteresowania przy użyciu technik ELISA. Tego rodzaju peptydy są użyteczne do skanowania epitopu przeciwciała oraz badań związków struktura-aktywność (SAR). Usunięcie związanych przeciwciał lub innych białek regeneruje peptydy i pozwala na ich ponowne zastosowanie w dalszych oznaczeniach. PepSets są stosowane w różnego rodzaju zastosowaniach, włącznie z identyfikacją peptydów liderowych będących przedmiotem zaintePL 209 989 B resowania w dziedzinie biologii ze skanowania sekwencji białkowych, optymalizacją peptydów liderowych i opracowaniem, nowych generacji analogów. Elastyczność pod względem ogólnej strategii stosowanej w procedurach przeszukiwania jest znacząco polepszona ze względu na zastosowanie różnorodnych wzorców syntez, które łącznie zapewniają sposób systematyczny do pełnego charakteryzowania wiodącego kandydata.
Obszerne wyniki uzyskane z systematycznych zestawów peptydowych nie tylko identyfikują peptydy będące przedmiotem zainteresowania, ale również wskazują reszty krytyczne, ich możliwość zastępowania oraz optymalną długość peptydu. W konsekwencji, w wyniku tych stwierdzeń można określić możliwy zakres pokrewnych peptydów. Zastępowanie L-aminokwasów D-aminokwasami i innymi niewystępującymi powszechnie resztami jest silnym narzędziem do manipulacji strukturą i konformacją peptydu. Sposób ten stanowi również szybką metodę odkrywania nowych analogów o odmiennych właściwościach farmakokinetycznych, takich jak antagoniści i peptydy o zwiększonej stabilności.
Wychodząc ze znanej sekwencji białkowej przy użyciu podejścia Multipin mapować można wszystkie kolejne epitopy przeciwciała. Obecnie możliwych jest kilka alternatywnych procedur do mapowania kolejnych epitopów komórek B. Obejmują one peptydy związane na trzpieniach, peptydy fazy roztworu opłaszczane bezpośrednio na płytki do mikromiareczkowania oraz biotynylowane peptydy wychwycone na płytkach do mikromiareczkowania uprzednio opłaszczonych awidyną lub streptawidyną.
W przypadku niniejszych przykładów przeciwciało opisane w przykładzie 1 jest stosowane do przeszukiwania bibliotek peptydowych, jednakże zastosowany może być dowolny preparat przeciwciała rozpoznającego sekwencję DAEFRH, ale nierozpoznającego naturalnie N-końcowo wydłużonej sekwencji cząsteczki Aβ (np. MDAEFRH, KMDAEFRH, SEVKMDAEFRH lub całe białko amyloidu (prekursor), APP), taki jak np. opisany przez Johnson-Wood i wsp., 1997.
W tym celu skonstruowano cztery biblioteki:
2.1.: Biblioteka 1: Ta 6-mierowa biblioteka zawiera peptydy o następujących sekwencjach (pozycje aminokwasowe 1 do 6):
Pozycja 1: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem D, K i C (17 możliwości)
Pozycja 2 wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem A, K i C (17 możliwości)
Pozycja 3: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem E, K i C (17 możliwości)
Pozycja 4: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem F, K i C (17 możliwości)
Pozycja 5: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem R, K i C (17 możliwości)
Pozycja 6: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem H, K, C i P (16 możliwości)
Bibliotekę 1 stanowi mieszanina heksapeptydów. Teoretycznie, zawarte są w niej wszystkie możliwe peptydy zawierające 17 różnych aminokwasów (zobacz poniżej). Mieszanina ta nie zawiera żadnej reszty lizyny ani cysteiny. Ponadto mieszanina nie zawiera:
kwasu asparaginowego w specyficznej pozycji 1, alaniny w specyficznej pozycji 2, kwasu glutaminowego w specyficznej pozycji 3, fenyloalaniny w specyficznej pozycji 4, argininy w specyficznej pozycji 5 i histydyny w specyficznej pozycji 6.
Syntezę przeprowadza się na syntezatorze Applied Biosystems 431A zgodnie z protokołem FastMoc, przy skali syntezy wynoszącej 0,25 mmol.
Synteza zapoczątkowywana jest odważeniem 1 mmola wszystkich pożądanych aminokwasów (zabezpieczone grupy aminowe i łańcuchy boczne). Następnie wytwarzano mieszaninę Asn, Gln, Gly, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val. W sposób specyficzny dla pozycji dodaje się następujące aminokwasy:
Ala, Glu, Phe, Arg, His (pozycja/mieszanina 1),
Asp, Glu, Phe, Arg, His (pozycja/mieszanina 2),
Asp, Ala, Phe, Arg, His (pozycja/mieszanina 3),
Asp, Ala, Glu, Arg, His (pozycja/mieszanina 4),
Asp, Ala, Glu, Phe, His (pozycja/mieszanina 5), i
Asp, Ala, Glu, Phe, Arg (pozycja/mieszanina 6, bez Pro).
Mieszaninę 6 stosowano do pakowania żywicy (żywica 2-chloro-tritylochlorkowa, 1,49 mmol/g, Alexis Niemcy):
mmol mieszaniny 6 reszt aminokwasowych
611 mg żywicy (= 0,91 mmola grup reaktywnych)
PL 209 989 B1 ml dichlorometanu
5,5 równoważnika = 5 mmoli diizopropyloetyloaminy (871 μΐ).
Mieszaninę wytrząsa się w kolbie przez 1 godz. Następnie dodaje się 1 ml metanolu i mieszaninę wytrząsa się przez dodatkowe 10 min. Upakowaną żywicę ekstrahuje się przez filtr spiekany i płucze dwukrotnie dimetyloformamidem, dichlorometanem, izopropanolem, metanolem i eterem. (30 ml każdego). Suszenie przeprowadza się przez noc w wysokiej próżni. Ilość odważona wynosi 737 mg.
Porcję 5,66 mg traktuje się przez 30 min 1 ml 20% piperydyny w DMF w celu zdefiniowania gęstości żywicy. Następnie, mieszaninę wiruje się. W supernatancie mierzy się fotometrycznie wolną grupę zabezpieczającą Fmoc (301 nm, współczynnik ekstynkcji = 7800 M (e-1)). Zgodnie z tym, gęstość żywicy wynosi 0,49 mmol/g.
Wszystkie następujące etapy przeprowadza się na syntezatorze, stosując inne mieszaniny (umieszczone w 5 różnych wkładach). Stosuje się 515 mg upakowanej żywicy (co odpowiada 0,25 mmola: mieszaniny aminokwasów stosuje się w 4-krotnym nadmiarze). Na zakończenie syntezy odcina się N-końcową grupę zabezpieczającą Fmoc. Po płukaniu etanolem i suszeniu przez noc, przeprowadza się odcinanie peptydów z żywicy przy użyciu TFA/H2O (95:5, objętościowo). Roztwór TFA zatęża się w Speed Vac do 1/5 objętości, strąca i płucze eterem dietylowym oraz liofilizuje.
6-merowe peptydy EIDYHR, ELDYHR i EVDYHR stanowią przykłady mimotopów, które mogą być wykrywane przez przeciwciało monoklonalne wytwarzane zgodnie z przykładem 1 powyżej.
2.2. : Biblioteka 2: Ta 6-metrowa biblioteka zawiera peptydy o następujących sekwencjach aminokwasowych (pozycje aminokwasowe 1 do 6):
Pozycja 1: D (ustalony)
Pozycja 2: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem A, K i C (17 możliwości)
Pozycja 3: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem E, K i C (17 możliwości)
Pozycja 4: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem F, K i C (17 możliwości)
Pozycja 5: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem R, K i C (17 możliwości)
Pozycja 6: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem H, K, C i P (16 możliwości).
Bibliotekę peptydową 2 skonstruowano zgodnie ze sposobem, opisanym, powyżej (pod 2.1) dla biblioteki 1.
6-merowe peptydy DIDYHR, DLDYHR i DVDYKR stanowią przykłady mimotopów, które mogą być wykrywane przez przeciwciało monoklonalne wytworzone zgodnie z 1 powyżej.
2.3. : Biblioteka 3: trzecią bibliotekę peptydową stosuje się w dodatkowym podejściu do zdefiniowania sekwencji mimotopowych. Biblioteka ta zawiera sekwencję oryginalną i pozwala na wykrywanie mimotopów bardziej spokrewnionych z sekwencją oryginalną.
Ta 6-merowa biblioteka zawiera peptydy o następujących sekwencjach (pozycje aminokwasowe 1 do 6):
Pozycja 1: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem K i C (18 możliwości)
Pozycja 2: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem K i C (18 możliwości)
Pozycja 3: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem K i C (18 możliwości)
Pozycja 4: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem K i C (18 możliwości)
Pozycja 5: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem K i C (18 możliwości)
Pozycja 6: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem K, C I P (17 możliwości).
Bibliotekę peptydową 3 skonstruowano zgodnie ze sposobem opisanym, powyżej (pod 2.1) dla biblioteki 1.
6-merowe peptydy DIDYRR, DLDYRR i DYDYRR stanowią przykłady mimotopów, które mogą być wykrywane przez przeciwciało monoklonalne wytwarzane zgodnie z 1. powyżej (D w pozycji 1 i R w pozycji 5 są identyczne z epitopem oryginalnym).
2.4. : Biblioteka 4: Ta biblioteka peptydowa 4 składająca się z 5 x 18 = 90 peptydów, jest komercyjnie dostępna z Mimotopes Ltd. (Paris, Francja; zobacz wytyczne wytwórcy) a opracowana jest według naturalnej N-końcowej sekwencji Ae42 DAEFRH.
Pozycja 1: D (ustalona)
Pozycja 2: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem K i C (18 różnych peptydów)
Pozycja 3: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem K i C (18 różnych peptydów)
Pozycja 4: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem K i C (18 różnych peptydów)
Pozycja 5: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem K i C (18 różnych peptydów)
Pozycja 6: wszystkie naturalne aminokwasy za wyjątkiem K i C (18 różnych peptydów).
Poszczególni członkowie peptydowi biblioteki 4 przedstawieni są na Fig. 1. Peptydy o numerach 1, 24, 48, 56 i 80 mają oryginalną sekwencję N-końcowej sekwencji Ae42. Wszystkie inne peptydy
PL 209 989 B stanowią peptydy kandydujące, które są testowane pod względem, ich zdolności wiązania z przeciwciałem wiążącym się z DAEFRH.
2.5.: ELISA z bibliotekami peptydowymi:
Jak wspomniano powyżej biblioteki peptydowe 1, 2 i 3 wytwarzane są przy użyciu syntezatora a peptydów Applied Biosystems 431A zgodnie z klasyczną chemią Fmoc. Komercyjnie dostępną bibliotekę peptydową wytwarza się zgodnie z opisem wytwórcy (zobacz powyżej i poniżej www.mimotopes.com). 90 peptydów jest C-końcowo związanych z trzpieniem.
ELISA dla każdej z bibliotek peptydowych przeprowadzano zgodnie z następującymi standardowymi protokołami:
Bibliotekę peptydową rozpuszcza się w 100% DMSO (końcowe stężenie 10 mg/ml).
Roztwór peptydu rozcieńcza się następnie w PBS.
Mieszaninę peptydową opłaszcza się następnie przez noc (4°C) na płytki ELISA (Nunc Maxisorp, Germany), począwszy od 500 μg/studzienkę, i miareczkuje do 100 ng/studzienkę.
Płytki przepłukuje się 3x PBS/Tween 20 (0,1% objętościowo).
Płytki blokuje się PBS/BSA (2 godz. w temperaturze pokojowej).
Płytki płucze się 3x PBS/Tween.
Płytki inkubuje się z biotynylowanym DAEFRH-specyficznym mAb (10 μg/mi w PBS) przez 4 godz. w temperaturze pokojowej.
Płytki płucze się 3x PBS/Tween. Płytki inkubuje się ze streptawidyną-peroksydazą chrzanową (30 min. w temperaturze pokojowej).
Płytki płucze się 5x PBS/Tween.
Płytki inkubuje się z ABTS + H2O2 (0,1% wag./obj.; 10 do 45 min.) i reakcję zatrzymuje się przy pomocy kwasu cytrynowego a następnie przeprowadza się ocenę fotometryczną (długość fali 405 nm).
3.: Weryfikacja mimotopów przez oznaczenie hamowania
3.1. Biblioteka dodatkowa
Oprócz 4 opisanych powyżej bibliotek (zobacz 2.1., 2.2., 2.3. i 2.4.), do zdefiniowania sekwencji mimotopów stosuje się piątą bibliotekę. Ta 6-merowa biblioteka jest komercyjnie dostępna z mikrokolekcji EMC (Tiibingen, Niemcy) i zawiera 114 różnych mieszanin heksapeptydowych, jedna pozycja na mieszaninę zdefiniowana jest przez jeden ze wszystkich naturalnych aminokwasów za wyjątkiem C (19 możliwości), pozostałych 5 pozycji są zmienne:
Mieszaniny 01 do 06 (jedna pozycja ustalona, alanina A, pozostałe 5 zmienne, X):
Mieszanina 01: AXXXXX
Mieszanina 02: XAXXXX
Mieszanina 03: XXAXXX
Mieszanina 04: XXXAXX
Mieszanina 05: XXXXAX
Mieszanina 06: XXXXXA
Mieszaniny 07 do 12 (jedna pozycja ustalona, arginina R, pozostałe 5 zmienne, X):
Mieszanina 07 RXXXXX
Mieszanina 08 XRXXXX
Mieszanina 09 XXRXXX
Mieszanina 10 XXXRXX
Mieszanina 11 XXXXRX
Mieszanina 12 XXXXXR
Zgodnie z tym, mieszaniny 13 do 114 projektowane są przy użyciu wszystkich naturalnych aminokwasów za wyjątkiem C.
3.2. Oznaczenie hamowania
Figury 2 i 3 opisują wyniki oznaczeń hamowania przeprowadzanych z peptydami mimotopowymi zawartymi w i uzyskanymi z 5 bibliotek (jak opisano). Peptydy mimotopowe współzawodniczą z oryginalnym epitopem o rozpoznanie przez przeciwciało monoklonalne. Epitop oryginalny i peptydy mimotopowe zawierają dodatkową C na C-końcu do sprzęgania z nośnikiem białkowym (jeżeli jest to wskazane).
Stosuje się następujące peptydy:
Peptyd 1737 DAEFRH
Peptyd 3001 DKELRI
Peptyd 3002 DWELRI
Peptyd 3003 YREFFI
PL 209 989 B1
Peptyd 3004 YREFRI
Peptyd 3005 YAEFRG
Peptyd 3006 EAEFRG
Peptyd 3007 DYEFRG
Peptyd 3008 ELEFRG
Peptyd 3009 SFEFRG
Peptyd 3010 DISFRG
Peptyd 3011 DIGWRG
Procedura:
Płytki ELISA (Nunc Maxisorp) opłaszcza się oryginalnym epitopem peptydowym DAEFRH (C-końcowo wydłużony przez C i sprzęgany z albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w stężeniu 0,1 μg/ml peptyd-BSA (100 μl/studzienkę, 12 godz., 4°C). Po blokowaniu PBS/BSA 1% (200 μl/studzienkę, 12 godz., 4°C), płytki płucze się 3x PBS/Tween. Następnie dodaje się biotynylowane przeciwciało monoklonalne (1:2000, 50 μl/studzienkę) i peptydy (50 μl/studzienkę) w stężeniu 50; 5; 0,5; 0,05; 0,005; i 0,0005 μg/ml na 20 min. w 37°C. Płytki płucze się 3x PBS/Tween i inkubuje ze streptawidyną znakowaną peroksydazą chrzanową (HRP) (100 μl/studzienkę, 30 min., RT). Płytki płucze się 5x PBS/Tween i inkubuje z ABTS + H2O2 (0,1% wag./obj., 10 do 45 min.) a reakcje zatrzymuje się przy użyciu kwasu cytrynowego a następnie przeprowadza się ocenę fotometryczną (długość fali 405 nm).
Jak oczekiwano i jak to jest widoczne na Fig. 2, peptyd 1737 DAEFRH może współzawodniczyć ze sprzężonym z BSA, związanym, z płytką peptydem. DAEFRH a zatem hamuje rozpoznanie przez przeciwciało monoklonalne. Ponadto, pokazano, że peptyd 3003 nie jest zdolny do hamowania wiązania przeciwciała monoklonalnego z oryginalnym, epitopem. W przeciwieństwie do tego, peptydy 3001, 3002, 3004, 3005, 3006 i 3007 (w różnym stopniu) blokują rozpoznanie epitopu. Podczas gdy peptyd 3004 wykazuje działanie hamujące jedynie w wysokich stężeniach (50 μg/ml), peptydy 3001, 3006 i 3007 wykazują silne działanie hamujące przy IC50 wynoszącym mniej niż 0,5 μg/ml. Peptydy 3002 i 3005 są pośrednimi inhibitorami o IC50 wynoszącym ponad 0,5 μg/ml.
Jak oczekiwano i jak to jest widoczne na Fig. 3, peptyd 1737 DAEFRH może pomyślnie współzawodniczyć ze sprzężonym z BSA, związanym z płytką peptydem. DAEFRH o rozpoznanie przez przeciwciało monoklonalne w niezależnym dodatkowo przeprowadzonym doświadczeniu. Ponadto, wykazano, że peptydy 3010 i 3011 nie wykazują działania hamującego w testowanych stężeniach, podczas gdy peptydy 3008 i 3009 są (względnie) słabymi inhibitorami o IC50 wynoszącym mniej niż 5 μg/ml.
Tabela 1 w skrócie podsumowuje zdolność hamowania mimotopów zawartych w i uzyskanych z bibliotek (jak opisano):
T a b e l a 1: Zdolność hamowania mimotopów
Peptyd 3001 DKELRI silna
Peptyd 3002 DWELRI pośrednia
Peptyd 3003 YREFFI żadna
Peptyd 3004 YREFRI słaba
Peptyd 3005 YAEFRG pośrednia
Peptyd 3006 EAEFRG silna
Peptyd 3007 DYEFRG silna
Peptyd 3008 ELEFRG słaba
Peptyd 3009 SFEFRG słaba
Peptyd 3010 DISFRG żadna
Peptyd 3011 DIGWRG żadna.
4. Oznaczenie hamowania dla dodatkowych mimotopów wyszukiwanych zgodnie z niniejszym wynalazkiem
Oznaczenie hamowania
Figury 4 i 5 opisują wyniki oznaczeń hamowania przeprowadzanych z peptydami mimotopowymi zawartymi w i uzyskanymi z 5 bibliotek (jak opisano). Peptydy mimotopowe współzawodniczą z oryginalnym epitopem o rozpoznawanie przez przeciwciało monoklonalne. Oryginalne peptydy epitopowe i mimotopowe zawierają dodatkową C na C-końcu (pozycja 7) do sprzęgania z białkiem, nośnikowym (jeżeli jest to wskazane).
PL 209 989 B
Stosuje się następujące peptydy:
Peptyd 1737 DAEFRH (oryginalny epitop + C)
Peptyd 1234 KKELRI
Peptyd 1235 DRELRI
Peptyd 1236 DKELKI
Peptyd 1237 DRELKI
Peptyd 1238 DKELR
Peptyd 1239 EYEFRG
Peptyd 1241 DWEFRDA
Peptyd 4002 SWEFRT
Peptyd 4003 GREFRN
Peptyd 4004 WHWSWR
Procedura:
Płytki ELISA (Nunc Maxisorp) opłaszcza się oryginalnym epitopem peptydowym DAEFRH (C-końcowo wydłużonym przez C i sprzęga z albuminą surowicy bydlęcej BSA) w stężeniu 0,1 μg/ml peptyd-BSA (100 μl/studzienkę, 12 godz., 4°C). Po blokowaniu przy pomocy PBS/BSA 1% (200 μl/studzienkę, 12 godz., 4°C), płytki płucze się 3x PBS/Tween. Następnie, dodaje się biotynylowane przeciwciało monoklonalne (1:2000, 50 μl/studzienkę) i peptydy (50 μl/studzienkę) w różnych stężeniach na 20 min. w 37°C. Płytki płucze się 3x PBS/Tween i inkubuje ze streptawidyną znakowaną peroksydazą chrzanową (HRP) (100 μl/studzienkę, 30 min., RT). Płytki płucze się 5x PBS/Tween inkubuje z ABTS + H2O2 (0,1% wag./obj., 10 do 45 min.) a reakcję zatrzymuje się przy użyciu kwasu cytrynowego a następnie przeprowadza się ocenę fotometryczną (długość fali 405 nm).
Jak oczekiwano i jak to jest widoczne na Fig. 4, peptyd 1737 DAEFRH może współzawodniczyć ze sprzężonym, z BSA, związanym, z płytką peptydem DAEFRH a zatem hamuje rozpoznawanie przez przeciwciało monoklinalne. Ponadto, pokazano, że peptyd 4004 nie jest zdolny do hamowania wiązania przeciwciała monoklonalnego z oryginalnym, epitopem. Przeciwnie, peptydy 4002 i 4003 (w różnym, stopniu) blokują rozpoznawanie epitopu. Podczas gdy peptyd 4003 wykazuje działanie hamujące jedynie przy względnie wysokich stężeniach (10 μg/ml), peptyd 4002 wykazuje silne działanie hamujące przy IC50 wynoszącym mniej niż 0,4 μg/ml.
Jak oczekiwano i jak to jest widoczne na Fig. 5, peptyd 1737 DAEFRH może z sukcesem, współzawodniczyć ze sprzężonym, z BSA, związanym z płytką peptydem DAEFRH o rozpoznawanie przez przeciwciało monoklonalne w dodatkowo przeprowadzonym niezależnym doświadczeniu. Ponadto, wykazano, że peptyd 1234 wcale nie jest hamujący przy testowanych stężeniach, podczas gdy peptydy 1235, 1236, 1237, 1238, 1239 i 1241 (w różnym stopniu) blokują rozpoznawanie epitopu. Peptydy 1235, 1238 i 1241 są silnymi inhibitorami o IC50 wynoszącym, mniej niż 0,5 μg/ml, podczas gdy peptydy 1236 i 1237 są (względnie) słabymi inhibitorami o IC50 wynoszącym powyżej 5 μg/ml. Peptyd 1239 stanowi pośredni inhibitor o IC50 wynoszącym powyżej 0,5 μg/ml.
Tabela 2 w skrócie podsumowuje zdolność hamującą mimotopów zawartych w i uzyskanych z bibliotek (jak opisano):
T a b e l a 2: Zdolności hamujące mimotopów:
Peptyd 1234 KKELRI żadna Peptyd 1235 DRELRI silna Peptyd 1236 DKELKI słaba Peptyd 1237 DRELKI słaba Peptyd 1238 DKELR silna Peptyd 1239 EYEFRG pośrednia Peptyd 1241 DWEFRDA silna Peptyd 4002 SWEFRT silna Peptyd 4003 GREFRN słaba Peptyd 4004 WHWSWR żadna
Wyniki przedstawione na Figurach 4 i 5 pokazują, że oprócz różnych 6-merowych peptydów (jak pokazano tu i wcześniej), w szczepionce przeciwko chorobie Alzheimera opartej na mimotopach mogą być zastosowane peptydy 5-merowe (mianowicie peptyd 1238 DKELR) i peptydy 7-merowe (mianowicie peptyd 1241 DWEFRDA).
Claims (6)
1. Zastosowanie związku peptydowego o 5 do 15 aminokwasach, zawierającego sekwencję wybraną z grupy składającej się z DKELRI, DWELRI YAEFRG, EAEFRG, DYEFRG, DRELRI, GREFRN, EYEFRG, DWEFRDA, SWEERT i DKELR, oraz ewentualnie dodatkowo zawierającego kowalencyjnie lub niekowalencyjnie sprzężony łącznik lub nośnik, do wytwarzania szczepionki na chorobę Alzheimera (AD).
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że związek ten stanowi peptyd wybrany z grupy składającej się z DKELRI, DWELRI, YAEFRG, EAEFRG, DYEFRG, DRELRI, GREFRN, EYEFRG, DWEFRDA, SWEFRT albo DKELR.
3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że związek ten stanowi polipeptyd o 6 do 12 resztach aminokwasowych.
4. Zastosowanie według jednego z zastrz. od 1 do 3, znamienne tym, że związek ten jest sprzężony z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, korzystnie KLH, i ewentualnie wodorotlenkiem aluminium.
5. Zastosowanie według jednego z zastrz. od 1 do 4, znamienne tym, że zawiera ona związek w ilości 0,1 ng do 10 mg, korzystnie 10 ng do 1 mg, zwłaszcza 100 ng do 100 μg.
6. Szczepionka przeciwko chorobie Alzheimera, znamienna tym, że wytwarzana szczepionka zawiera antygen zawierający co najmniej jeden peptyd wybrany z grupy DKELRI, DWELRI, YAEERG, EAEFRG, DYEFRG, DRELRI, GREFRN, EYEFRG, DWEFRDA, SWEFRT albo DKELR.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT362003 | 2003-01-14 | ||
| AT0146403A AT413945B (de) | 2003-01-14 | 2003-09-17 | Impfstoff für die alzheimer-krankheit |
| PCT/EP2004/000162 WO2004062556A2 (en) | 2003-01-14 | 2004-01-13 | Methods for preventing and treating alzheimer’s disease (ad) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL378333A1 PL378333A1 (pl) | 2006-03-20 |
| PL209989B1 true PL209989B1 (pl) | 2011-11-30 |
Family
ID=32714004
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL378333A PL209989B1 (pl) | 2003-01-14 | 2004-01-13 | Zastosowanie związku peptydowego oraz szczepionka przeciwko chorobie Alzheimera |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7732568B2 (pl) |
| EP (2) | EP1679319B1 (pl) |
| JP (2) | JP4547373B2 (pl) |
| CN (2) | CN1826354B (pl) |
| AT (3) | AT413945B (pl) |
| CA (1) | CA2513218C (pl) |
| CY (2) | CY1107146T1 (pl) |
| DE (2) | DE602004009705T2 (pl) |
| DK (2) | DK1583774T3 (pl) |
| ES (2) | ES2296084T3 (pl) |
| PL (1) | PL209989B1 (pl) |
| PT (2) | PT1583774E (pl) |
| SI (1) | SI1583774T1 (pl) |
| WO (1) | WO2004062556A2 (pl) |
Families Citing this family (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070010435A1 (en) | 2002-12-19 | 2007-01-11 | New York University | Method for treating amyloid disease |
| DE10303974A1 (de) | 2003-01-31 | 2004-08-05 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
| AT413336B (de) * | 2003-09-12 | 2006-02-15 | Mattner Frank Dr | Apherese-vorrichtung |
| US20070172496A1 (en) * | 2004-01-28 | 2007-07-26 | Curix Aps | Conjugates of amyloid proteins as vaccines for amyloid-related diseases |
| AT500483B1 (de) * | 2004-07-13 | 2006-01-15 | Mattner Frank Dr | Set zur vorbeugung oder behandlung der alzheimer'schen erkrankung |
| AT413946B (de) | 2004-07-13 | 2006-07-15 | Mattner Frank Dr | Impfstoff gegen die alzheimer-krankheit |
| DK1976877T4 (en) | 2005-11-30 | 2017-01-16 | Abbvie Inc | Monoclonal antibodies to amyloid beta protein and uses thereof |
| ES2527661T3 (es) | 2005-11-30 | 2015-01-28 | Abbvie Inc. | Método de exploración, proceso para purificar oligómeros Abeta no difundibles, anticuerpos selectivos contra dichos oligómeros Abeta no difundibles y un proceso para fabricar dichos anticuerpos |
| PT2361638E (pt) * | 2005-12-12 | 2014-04-17 | Ac Immune Sa | Anticorpos monoclonais específicos beta 1-42 com propriedades terapêuticas |
| EP1878747A1 (en) | 2006-07-11 | 2008-01-16 | greenovation Biotech GmbH | Glyco-engineered antibodies |
| KR101605207B1 (ko) | 2006-07-14 | 2016-03-22 | 에이씨 이뮨 에스.에이. | 아밀로이드 베타에 대해 인간화된 항체 |
| US8455626B2 (en) | 2006-11-30 | 2013-06-04 | Abbott Laboratories | Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies |
| EP2124952A2 (en) | 2007-02-27 | 2009-12-02 | Abbott GmbH & Co. KG | Method for the treatment of amyloidoses |
| HRP20150086T1 (xx) * | 2007-06-12 | 2015-02-27 | Ac Immune S.A. | Humanizirana antitijela za beta amiloid |
| US8613923B2 (en) | 2007-06-12 | 2013-12-24 | Ac Immune S.A. | Monoclonal antibody |
| US8048420B2 (en) | 2007-06-12 | 2011-11-01 | Ac Immune S.A. | Monoclonal antibody |
| SG185277A1 (en) * | 2007-10-05 | 2012-11-29 | Genentech Inc | Humanized antibody |
| EP2205632B1 (en) * | 2007-10-05 | 2016-11-16 | Genentech, Inc. | Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases |
| EP2238166B1 (en) * | 2007-10-05 | 2013-11-27 | Genentech, Inc. | Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases |
| JP5219225B2 (ja) * | 2007-10-25 | 2013-06-26 | 国立大学法人 鹿児島大学 | アミロイドβペプチドのミミック分子を用いたペプチドワクチン |
| US8445649B2 (en) * | 2007-10-29 | 2013-05-21 | Tao Health Life Pharma Co., Ltd. | Antibody and use thereof |
| EP2278998A1 (en) | 2008-04-17 | 2011-02-02 | Declion Pharmaceuticals, Inc. | Design and synthesis of directed sequence polymer compositions and antibodies thereof for the treatment of protein conformational disorders |
| MX2010013647A (es) * | 2008-06-12 | 2011-04-05 | Affiris Ag | Compuestos para tratar sintomas asociados con la enfermedad de parkinson. |
| AT506819B1 (de) * | 2008-06-12 | 2011-06-15 | Affiris Forschungs Und Entwicklungs Gmbh | Vakzin zur behandlung von alzheimer-krankheit |
| AT509611B1 (de) * | 2008-06-12 | 2012-04-15 | Affiris Forschungs-Und Entwicklungs Gmbh | Vakzin |
| CN102933601B (zh) | 2010-04-15 | 2016-06-08 | Abbvie公司 | β淀粉样蛋白结合蛋白 |
| EP2598882B1 (en) | 2010-07-30 | 2017-07-26 | AC Immune S.A. | Safe and functional humanized antibodies for use in treating an amyloidosis |
| US9062101B2 (en) | 2010-08-14 | 2015-06-23 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Amyloid-beta binding proteins |
| US20120328605A1 (en) * | 2010-10-27 | 2012-12-27 | Daniel Larocque | Compositions and uses |
| GB201113570D0 (en) | 2011-08-05 | 2011-09-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
| SI2579042T1 (sl) | 2011-10-04 | 2014-09-30 | Affiris Ag | Postopek za detektiranje Ass-specifičnih protiteles v biološkem vzorcu |
| EP2787347A1 (en) | 2013-04-03 | 2014-10-08 | Affiris AG | Method for detecting Aß-specific antibodies in a biological sample |
| US10381614B2 (en) * | 2013-04-17 | 2019-08-13 | Samsung Sdi Co., Ltd. | Battery module |
| WO2015165961A1 (en) | 2014-04-29 | 2015-11-05 | Affiris Ag | Treatment and prevention of alzheimer's disease (ad) |
| BR112018008697A2 (en) | 2015-11-03 | 2018-10-30 | Affiris Ag | method and kit for vaccination against an autoantigen, use of a kit, and vaccine for use in vaccination. |
| CN105237628B (zh) * | 2015-11-17 | 2018-08-07 | 南开大学 | 一种用于治疗阿尔兹海默症的多肽 |
| CN107022019B (zh) * | 2016-11-24 | 2020-10-30 | 桂林医学院 | 一种用于脑内降铁除自由基的多肽、制备方法与应用 |
| JP7368856B2 (ja) | 2017-07-25 | 2023-10-25 | トゥルーバインディング，インコーポレイテッド | Ｔｉｍ－３とそのリガンドとの相互作用の遮断によるがん治療 |
| CN116063520A (zh) | 2019-01-30 | 2023-05-05 | 真和制药有限公司 | 抗gal3抗体及其用途 |
| JP2023528797A (ja) | 2020-05-26 | 2023-07-06 | トゥルーバインディング，インコーポレイテッド | ガレクチン－３を遮断することにより炎症性疾患を処置する方法 |
| US20250186595A1 (en) | 2022-02-28 | 2025-06-12 | Tridem Bioscience Gmbh & Co Kg | A CONJUGATE CONSISTING OF OR COMPRISING AT LEAST A ß-GLUCAN OR A MANNAN |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK590288D0 (da) * | 1988-10-24 | 1988-10-24 | Symbicom Ab | Kemiske forbindelser |
| US5650489A (en) * | 1990-07-02 | 1997-07-22 | The Arizona Board Of Regents | Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof |
| GB9022190D0 (en) * | 1990-10-12 | 1990-11-28 | Perham Richard N | Immunogenic material |
| US5639603A (en) * | 1991-09-18 | 1997-06-17 | Affymax Technologies N.V. | Synthesizing and screening molecular diversity |
| US7964192B1 (en) * | 1997-12-02 | 2011-06-21 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Prevention and treatment of amyloidgenic disease |
| US6088993A (en) | 1999-02-05 | 2000-07-18 | Irace; Francisco D. | Closure system |
| JP2002537354A (ja) * | 1999-02-25 | 2002-11-05 | スミスクライン ビーチャム バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | ペプチド、及びＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのプロテインＤ由来の担体を含む免疫原 |
| US6703491B1 (en) * | 1999-03-17 | 2004-03-09 | Exelixis, Inc. | Drosophila sequences |
| CA2349434A1 (en) * | 1999-09-03 | 2001-03-15 | Ramot University Authority For Applied Research & Industrial Development Ltd. | Agents and compositions and methods utilizing same useful in diagnosing and/or treating or preventing plaque forming diseases |
| ES2219517T3 (es) * | 2000-03-03 | 2004-12-01 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vacuna para el tratamiento de la aterosclerosis. |
| GB0024200D0 (en) * | 2000-10-03 | 2000-11-15 | Smithkline Beecham Sa | Component vaccine |
| ES2276732T3 (es) | 2001-09-03 | 2007-07-01 | Bio Life Science Forschungs- Und Entwicklungsges.M.B.H. | Mimotopos de antigenos y vacuna contra enfermedades cancerosas. |
| DK1361439T3 (da) | 2002-05-07 | 2007-03-26 | Pasteur Institut | Screening for peptider, der hæmmer PP1c-binding til Bcl-2, Bcl-xl- og Bcl-w-proteiner |
-
2003
- 2003-09-17 AT AT0146403A patent/AT413945B/de not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-01-13 EP EP05107898A patent/EP1679319B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-13 ES ES05107898T patent/ES2296084T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-13 CN CN200480002213.2A patent/CN1826354B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2004-01-13 EP EP04701585A patent/EP1583774B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-13 ES ES04701585T patent/ES2339447T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-13 JP JP2006500553A patent/JP4547373B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-01-13 DE DE602004009705T patent/DE602004009705T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-13 SI SI200431399T patent/SI1583774T1/sl unknown
- 2004-01-13 PT PT04701585T patent/PT1583774E/pt unknown
- 2004-01-13 DK DK04701585.4T patent/DK1583774T3/da active
- 2004-01-13 DK DK05107898T patent/DK1679319T3/da active
- 2004-01-13 PL PL378333A patent/PL209989B1/pl unknown
- 2004-01-13 CN CN2011103110387A patent/CN102526699A/zh active Pending
- 2004-01-13 US US10/540,551 patent/US7732568B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-01-13 CA CA2513218A patent/CA2513218C/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-01-13 AT AT04701585T patent/ATE458753T1/de active
- 2004-01-13 DE DE602004025668T patent/DE602004025668D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2004-01-13 AT AT05107898T patent/ATE376559T1/de active
- 2004-01-13 WO PCT/EP2004/000162 patent/WO2004062556A2/en not_active Ceased
- 2004-01-13 PT PT05107898T patent/PT1679319E/pt unknown
-
2008
- 2008-01-17 CY CY20081100069T patent/CY1107146T1/el unknown
-
2010
- 2010-03-08 JP JP2010051012A patent/JP5282058B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-04-01 US US12/752,451 patent/US20110015131A1/en not_active Abandoned
- 2010-05-07 CY CY20101100399T patent/CY1110634T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2513218C (en) | Peptides and uses thereof for preventing and treating alzheimer's disease(ad) | |
| US8022180B2 (en) | Method for preventing and treating Alzheimer's disease | |
| JP4662719B2 (ja) | アルツハイマー病の処置のための免疫学的方法および組成物 | |
| EP2143447A1 (en) | Bioconjugates comprising Aß-autoantibody-specific epitopes for active immunotherapy and diagnosis of Alzheimer's disease | |
| JP5219225B2 (ja) | アミロイドβペプチドのミミック分子を用いたペプチドワクチン | |
| US20060057636A1 (en) | Composite peptide compounds for diagnosis and treatment of diseases caused by prion proteins | |
| AU2004204349B2 (en) | Methods for preventing and treating Alzheimer's disease (AD) | |
| Gevorkian et al. | Mimotopes of conformational epitopes in fibrillar β-amyloid | |
| HK1091499B (en) | Methods for preventing and treating alzheimer's disease (ad) |