CN105237628B - 一种用于治疗阿尔兹海默症的多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多肽结构以及其抑制阿尔兹海默症患者β‑淀粉样肽(Aβ)聚集的效果。本发明提供的多肽的氨基酸序列为:Gly‑Gly‑His‑Arg‑Tyr‑Tyr‑Ala‑Ala‑Phe‑Phe‑Ala‑Arg‑Arg(GGHRYYAAFFARR,GR)。本发明通过细胞毒性等实验研究,证实GR可以螯合铜离子并有效抑制β‑淀粉样肽(Aβ)的聚集,明显减小其由于Aβ聚集引起的神经细胞毒性。因此,本发明提供的多肽有可能用于预防和治疗阿尔兹海默症,在生物医学领域有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽,该多肽用于预防及治疗阿尔兹海默症,属于生物医学技术领域。
背景技术
阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)是一种神经退行性疾病,作为老年痴呆最常见的一种形式,它具有不可治愈性、进行性以及致命性。其主要的病理学特征之一就是由于细胞外β-淀粉样肽(amyloid-β,Aβ)积累引起的老年斑(Senile plaque,SP)(MastersC L,Simms G,Weinman N A,et al.Amyloid plaque core protein in Alzheimerdisease and Down syndrome[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1985,82(12):4245-4249)。淀粉样沉积假说将Aβ视为AD发病机理的核心,认为是Aβ错误折叠和自组装形成的聚集体导致了AD患者脑组织中的一系列病变,并最终导致痴呆。因此研究者们一度将Aβ聚集抑制剂作为治疗AD的可行方法,并设计了小分子、纳米粒子、多肽等不同种类的抑制剂。
近年来研究者发现,在老年斑周围的某些金属离子(如Fe2+,Cu2+,Zn2+等)的浓度明显要高过正常的脑组织(Kepp K P.Bioinorganic chemistry of Alzheimer’s disease[J].Chemical reviews,2012,112(10):5193-5239.),因此金属离子在阿尔兹海默症的病理学中扮演的角色也得到了广泛的关注。金属离子一方面可以改变Aβ的聚集行为,而Aβ的不同聚集形态产生的毒性作用也不相同,研究者普遍认为寡聚体是其中毒性最强的组分(Kayed R,Head E,Thompson J L,et al.Common structure of soluble amyloidoligomers implies common mechanism of pathogenesis[J].Science,2003,300(5618):486-489.)。另一方面对于像Cu2+这样具有一定氧化能力的离子具有催化产生活性氧组分(Reactive oxygen species,ROS)的能力,也会导致生理毒性的产生(Eskici G,Axelsen PH.Copper and oxidative stress in the pathogenesis of Alzheimer’s disease[J].Biochemistry,2012,51(32):6289-6311.)。因此,金属离子螯合剂也成为一种可能的AD的治疗手段。
发明内容
发明目的:现有报道的多肽类Aβ聚集抑制剂或者自身容易发生聚集有一定细胞毒性,或者只能延缓Aβ的聚集,不能完全抑制其毒性;或者需要很大用量才能起效。因此我们希望设计一种更高效的双功能的抑制剂。既可以抑制Aβ的聚集,又可以有一定金属离子螯合的能力,抑制Cu2+在AD发生发展中的不良作用。
技术方案:为了实现以上目的,本发明采用的技术方案为:
一种可用于治疗和预防阿尔兹海默症的多肽,该多肽的氨基酸序列为:Gly-Gly-His-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ala-Phe-Phe-Ala-Arg-Arg(GGHRYYAAFFARR),本发明简称该肽为GR。本发明中该多肽委托吉尔生化(上海)有限公司合成,纯度不低于95%。
本发明所述的用于治疗和预防阿尔兹海默症的多肽在治疗和预防阿尔兹海默症药物中的应用。
所述的用于治疗和预防阿尔兹海默症的多肽在治疗和预防阿尔兹海默症药物中的应用,把用于治疗和预防阿尔兹海默症的多肽和药学上可接受的载体或促血脑屏障穿越因子制备成丸剂、胶囊剂、片剂或注射剂制剂。
本发明所述的用于治疗和预防阿尔兹海默症的多肽可以通过螯合铜离子和抑制Aβ聚集两种功能共同作用,抑制铜离子诱导的Aβ聚集,并有效降低Cu-Aβ复合物的神经细胞毒性,从而具有预防和治疗阿尔兹海默症的前景。
本发明通过等温滴定微量热实验证实了GR可以螯合铜离子,其结合常数约为1.38×107M-1。
本发明通过硫黄素-T荧光实验证实了GR可以抑制铜离子诱导的Aβ的聚集。
本发明通过透射电子显微镜证实了GR可以抑制Cu-Aβ复合物聚集形成纤维。
本发明用过MTT细胞毒性实验证明了GR可以有效降低Cu-Aβ复合物对于分化后的PC-12细胞的细胞毒性。
有益效果:本发明和已有技术相比具有以下优点:
本发明通过大量实验证实了GR是一种双功能的Aβ聚集抑制肽,其既可以抑制Aβ的聚集,又可以螯合铜离子,从而减小Cu-Aβ复合物的神经细胞毒性。本发明可能形成预防和治疗阿尔兹海默症的药物,在生物医学领域有很好的应用前景。
附图说明
图1是实施例1中GR与Cu2+结合强度测定的ITC结果图。
图2是实施例1中GR对于Aβ聚集抑制效果的ThT荧光检测结果图。
图3是实施例1中GR抑制Cu-Aβ复合物聚集形成纤维的TEM结果图
图4是实施例1中GR对于Cu-Aβ复合物神经细胞毒性抑制效果的结果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
本说明书中公开的任一特征,除非特别叙述,均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即,除非特别叙述,每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
实施例1:
实验方法:
等温滴定微量热(ITC):ITC用于测定铜离子和GR的螯合能力,本实施例中采用的仪器为MicroCal VP-ITC(GE,USA)。将CuCl2和GR溶解于20mM ACES(pH7.4,100mM NaCl)缓冲液中,分别配制成5mM和2.5mM溶液。首先,将所用溶液真空脱气15min。CuCl2溶液置于上方注射器中,GR溶液置于下方反应池内。滴定过程中,温度为37℃,注射器旋转速度为307rmp。第一滴延迟时间120s,体积为2μL。之后,每滴5μL,平衡时间为210s,共34滴。滴定结束,采用Origin 7.0软件采用单结合位点模型拟合分析,最终得到结合常数,反应熵变和反应焓变。
硫黄素T(ThT)荧光分析:ThT荧光用于测定Aβ聚集体重β-sheet结构的含量,本实施例中采用F-7000荧光光谱仪(Hitachi,Japan)。1)Aβ样品的预处理:取1mg的Aβ样品溶于1mL HFIP中,室温震荡,待Aβ逐渐溶解后,用氮气把HFIP吹干,后用DMSO溶解配置成1mg/mL的Aβ储备液于-4℃保存。2)将Aβ储备液及CuCl2,GR分别用10mM HEPES缓冲液稀释至培养所需浓度(Aβ组:Aβ20μM,Aβ+Cu组:Aβ20μM+Cu 5μM,Aβ+Cu+GR组:Aβ20μM+Cu 5μM+GR 20μM)。37℃,120rmp震荡孵育。3)测试:在不同时间点,取1mL样品与10μL的ThT工作液(1mg/mL)共混,混匀后加入石英比色皿中测定。测量方法为440nm激发,485nm发射,记录485nm处的峰值,每组样品测三次取平均值。
透射电子显微镜:取10μL培养3天的ThT样品溶液滴加至铜网上,静置60s后用滤纸从反面吸干,后滴加10%的磷钨酸溶液(pH 6.8)对样品进行负染色,静置60sec后再用滤纸从反面吸干,晾干后置于干燥器中待测。
细胞毒性实验:本研究中细胞实验均采用高度分化的PC12细胞,PC12细胞来源大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤,广泛用于神经系统疾病的体外研究。使用的培养基为90%的DMEM液加10%的胎牛血清再加1%的双抗,在细胞培养箱中培养(37℃,5%CO2)。在细胞实验中采用MTT的方法来考察抑制剂GR、Aβ、Aβ-Cu复合物对细胞存活率的影响。
MTT实验方法:处于正常状态的PC12细胞种植在96孔板中,每孔8000细胞,置于培养箱预先培养24h后细胞给药,给药后继续培养48h后加MTT,过4h后要用酶标仪检测细胞存活率(490nm)。各组样品浓度为(Aβ组:Aβ20μM,Aβ+Cu组:Aβ20μM+Cu 5μM,Aβ+Cu+GR组:Aβ20μM+Cu 5μM+GR 20μM)。各组样品均在摇床中37℃孵育一天后进行细胞给药。
Claims (3)
1.一种用于治疗和预防阿尔兹海默症的多肽,该多肽的氨基酸序列为:Gly-Gly-His-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ala-Phe-Phe-Ala-Arg-Arg(GGHRYYAAFFARR)。
2.权利要求1所述的用于治疗和预防阿尔兹海默症的多肽在制备用于治疗和预防阿尔兹海默症药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的用于治疗和预防阿尔兹海默症的多肽在制备用于治疗和预防阿尔兹海默症药物中的应用,其特征在于,把用于治疗和预防阿尔兹海默症的多肽和药学上可接受的载体或促血脑屏障穿越因子制备成丸剂、胶囊剂、片剂或注射剂制剂。
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