CN104277105A

CN104277105A - 抑制β淀粉样蛋白聚集和毒性的多肽抑制剂及其应用

Info

Publication number: CN104277105A
Application number: CN201310294070.8A
Authority: CN
Inventors: 张敏; 李平; 王晨轩; 杨延莲; 王琛
Original assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Current assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Priority date: 2013-07-12
Filing date: 2013-07-12
Publication date: 2015-01-14
Anticipated expiration: 2033-07-12
Also published as: CN104277105B

Abstract

本发明公开了一种抑制β淀粉样蛋白聚集和毒性的多肽或其具有所述多肽功能的变体。本发明的多肽与Aβ蛋白存在强结合力，可以大大降低Aβ达到聚集平衡状态时β折叠结构的有效含量，改变Aβ在溶液环境中的二级结构，使得β折叠结构的含量大大降低甚至消失，并在极低的浓度下就可以明显降低Aβ对SH-SY5Y细胞的毒性并能够大大抑制Aβ诱导的活性氧的产生，从而为β淀粉样蛋白引起的阿尔兹海默症的治疗提供可行方法，并为治疗淀粉样蛋白相关疾病的多肽类先导化合物的发现提供思路与参考标准。

Description

抑制β淀粉样蛋白聚集和毒性的多肽抑制剂及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，更具体地涉及一种抑制β淀粉样蛋白的聚集和毒性的多肽抑制剂及其应用。

背景技术

阿尔兹海默症（Alzheimer’s disease，AD）是一种神经退行性疾病，主要临床表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能，甚至最终失去生活能力，对人类健康和生活有着巨大威胁，造成家庭和社会的巨大经济负担。在AD患者的神经细胞外发现有淀粉样沉淀形成的斑块（老年斑），β淀粉样蛋白（β-amyloid protein,Aβ）为老年斑的主要成分。

Aβ蛋白由39-43个氨基酸组成，分子量约4kDa，由β淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)水解而来，由细胞分泌，是大脑皮质老年斑的主要成分，其从可溶状态向具有生理毒性的寡聚体、原纤维、纤维的转变，是AD发生发展的重要环节（Hardy J,Selkoe DJ.The amyloid hypothesis ofAlzheimer's disease:progress and problems on the road to therapeutics.Science.2002;297:353-6.）。因此，通过研发淀粉样蛋白的抑制剂，实现对Aβ聚集过程的调控，降低Aβ对神经细胞的毒性，具有重要意义。目前，对淀粉样蛋白的聚集过程可以进行特异性地抑制或促进的药物分子，按种类可分为有机小分子与多肽分子两大类（Stains CI,Mondal K,Ghosh I.Molecules that Target beta-Amyloid.ChemMedChem.2007;2:1674-92.）。其中，多肽类调节剂由于其良好的生物相容性和可设计性，是其中重要的分支。

多肽类先导化合物的设计思路是筛选具有调节靶标蛋白聚集动力学过程的多肽片段，如阻止Aβ聚集的KLVFF片段，并结合组合化学改造分子结构等（L.Tjernberg,J.Biol.Chem.,1996,271,8545）。基于多肽分子在合成上与有机小分子相比更易于实现，且多肽分子易于在体内参与代谢过程，是实现有效抑制Aβ的神经毒性，发展可行的药物的有效途径。根据靶蛋白Aβ的序列和结构，设计与Aβ特异性结合的多肽片段，实现从体外实验中对Aβ蛋白的聚集结构和聚集动力学的调控，到体外实验的生理毒性的抑制，到治疗淀粉样蛋白相关疾病的最终目的的一系列多肽分子。

促肾上腺皮质激素（adrenocorticotrophic hormone,ACTH）是一种多肽类激素，生产并分泌于脑垂体，是下丘脑-垂体-肾上腺轴（hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA）中的重要化学物质。HPA中的其他激素，如上游的促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin releasing hormone,CRH）已被证明能够保护Aβ诱导的神经细胞损伤，下游的糖皮质激素可通过参与Aβ前体蛋白的剪切，促进Aβ的形成（Pedersen WA,McCullers D,Culmsee C,Haughey NJ,Herman JP,Mattson MP.Corticotropin-releasing hormone protectsneurons against insults relevant to the pathogenesis of Alzheimer's disease.Neurobiology of disease.2001;8:492-503和Green KN,Billings LM,Roozendaal B,McGaugh JL,LaFerla FM.Glucocorticoids increase amyloid-βand tau pathology ina mouse model of Alzheimer’s disease.The Journal of neuroscience.2006;26:9047-56）。HPA轴可直接或者间接的在Aβ聚集和毒性中发挥作用（DongH,Csernansky JG.Effects of Stress and Stress Hormones on Amyloid-\beta Proteinand Plaque Deposition.Journal of Alzheimer's Disease.2009;18:459-69）。但是目前对ACTH与Aβ直接作用并调控其聚集过程的研究没有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的多肽类调节剂，该调节剂来源于促肾上腺皮质激素。该序列可以实现对β淀粉样蛋白聚集过程的调控，从而降低β淀粉样蛋白的细胞毒性。

在本发明的第一方面中，提供了一种促肾上腺皮质激素来源的抑制β淀粉样蛋白聚集和毒性的多肽，其特征在于，所述多肽为序列为SEQ ID NO：1的多肽或具有所述多肽功能的对SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、添加修饰的变体。

本发明中的所指“促肾上腺皮质激素来源的多肽”是指本发明的多肽来源于促肾上腺皮质激素（ACTH）。从鲨、蛙、鸵鸟、哺乳动物垂体中制取的ACTH均为三十九肽，经本发明发明人研究得知，这些多肽明显的结构差异反映在分子的羧端区（25～33位），而其氨端部分（1～24位）的氨基酸排列顺序较为一致，且为生物活性的中心区域。已能人工合成ACTH与其氨端区的二十四肽，后者已呈现充分的ACTH活性。

在一些实施方案中，所述变体可以为将所述多肽序列中的赖氨酸残基和精氨酸残基中的一个或多个突变为其他种带正电的氨基酸残基所获得的变体，优选地，所述带正电的氨基酸残基为组氨酸、赖氨酸或精氨酸。

在一些实施方案中，所述变体的序列可以为SEQ ID NO：3～19。

在本发明的第二方面中，提供了编码如第一方面所述的多肽的核苷酸序列。

在本发明的第三方面中，提供了包含如第二方面所述的核苷酸序列的重组载体。

在本发明的第四方面中，提供了含有如第三方面所述的重组载体的重组细胞。

在本发明的第五方面中，提供了一种组合物，其包含如第一方面所述的多肽和药学上可接受的辅料，优选地所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂、填充剂中的一种或几种。

在本发明的第六方面中，提供了如第一方面所述的多肽，如第二方面所述的核苷酸序列、如第三方面所述的重组载体、如第四方面所述的重组细胞或如第五方面所述的组合物在抑制β淀粉样蛋白聚集和毒性中的用途。

在本发明的第七方面中，如第一方面所述的多肽，如第二方面所述的核苷酸序列、如第三方面所述的重组载体、如第四方面所述的重组细胞或如第五方面所述的组合物在用于诊断和/或治疗与β淀粉样蛋白相关的疾病的药物的制备中的用途。

在本发明中，所述与β淀粉样蛋白相关的疾病可以是阿尔茨海默症。

本发明的有益效果：

（1）本发明的多肽与Aβ蛋白的平衡解离常数K_D为1.38×10^-8M，结合常数Ka为6.27×10⁵（1/MS），存在强结合力；

（2）本发明的多肽可以大大降低聚集平衡状态时Aβ结构中β折叠结构的有效含量；

（3）本发明的多肽可以改变Aβ在溶液环境中的二级结构，使得β折叠结构的含量大大降低甚至消失；

（4）本发明的多肽可以改变Aβ的聚集体形貌，抑制Aβ的纤维状组装行为，使得典型的成熟纤维状的淀粉样聚集体大大减少，形成以颗粒和短纤维为主的结构；

（5）本发明的多肽在极低的浓度下（10pg-100ng）就可以明显降低Aβ对SH-SY5Y细胞的毒性并能够大大抑制Aβ诱导的活性氧的产生；

（6）本发明的多肽为β淀粉样蛋白引起的阿尔兹海默症的治疗提供可行方法，并可以为治疗淀粉样蛋白相关疾病的多肽类先导化合物的发现提供思路与参考标准。

附图说明

图1表明本发明所述的多肽与Aβ的吸附解离曲线以及根据Langmuir公式计算的平衡结合/解离常数；图2表明本发明所述的多肽（图中简称为s-ACTH，以下同）调节Aβ聚集过程的ThT荧光光谱；

图3表明本发明所述的多肽调节Aβ二级结构的圆二色谱；

图4表明本发明所述多肽对Aβ形貌的调节作用，其中，（4A）为Aβ纤维的原子力显微镜成像；（4B）为本发明所述多肽的原子力显微镜成像；（4C）为所述多肽与Aβ混合体系比例为1:1的原子力显微镜成像；（4D）为所述多肽与Aβ混合体系比例为5:1的原子力显微镜成像；

图5表明本发明所述多肽对Aβ形貌的调节作用，其中（5A）为Aβ纤维的透射电子显微镜成像；（5B）为本发明所述多肽的透射电子显微镜成像；（5C）为所述多肽与Aβ混合体系比例为1:1的透射电子显微镜成像；（5D）为所述多肽与Aβ混合体系比例为5:1的透射电子显微镜成像；

图6表明所述多肽对Aβ细胞毒性的抑制作用，其中，（6A）为Aβ对SH-SY5Y细胞存活率的影响；（6B）为所述多肽对SH-SY5Y细胞存活率的影响；（6C）为所述多肽对30μM的Aβ细胞毒性的抑制作用；

图7表明所述多肽对Aβ诱导的活性氧产生的抑制作用，荧光强度与细胞内活性氧含量成正比，其中，（7A）为Aβ对SH-SY5Y细胞内产生活性氧的影响；（7B）为所述多肽对SH-SY5Y细胞内产生活性氧的影响；（7C）为所述多肽对30μM的Aβ诱导细胞产生活性氧的抑制作用。

图8表明点突变的多肽序列调节Aβ聚集过程的ThT荧光光谱，分别为将多肽序列中的赖氨酸【K】突变为组氨酸【H】，标示为s-ACTH(K)；将多肽序列中的精氨酸【R】突变为组氨酸【H】，标记为s-ACTH(R)。

图9表明点突变的多肽Aβ细胞毒性的抑制作用，其中，（9A）为所述点突变多肽s-ACTH(K)对SH-SY5Y细胞存活率的影响；（9B）为所述点突变多肽s-ACTH(K)对30μM的Aβ细胞毒性的抑制作用。

图10表明点突变的多肽Aβ细胞毒性的抑制作用，其中，（10A）为所述点突变多肽s-ACTH(R)对SH-SY5Y细胞存活率的影响；（10B）为所述点突变多肽s-ACTH(R)对30μM的Aβ细胞毒性的抑制作用。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯试剂，且可从正规渠道商购获得。

除非特别指明，以下实施例中所用的神经瘤细胞系SH-SY5Y购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。

除非特别指明，以下实施例中所用的β淀粉样蛋白（Aβ）购自上海吉尔生化技术有限公司，其纯度>95%。

除非特别指明，以下实施例中所用的多肽由上海科肽生物科技有限公司采用固相多肽合成法制备，其纯度>98%。

除非特别指明，以下实施中超纯水，水质参数为电阻率18.2MΩ.cm25℃。

实施例所述多肽调节β淀粉样蛋白的作用

1、所使用物质的化学结构

β淀粉样蛋白（Aβ）：

DAEFR HDSGY EVHHQ KLVFF AEDVG SNKGA IIGLM VGGVV IA（SEQID NO：2）。

来源于促肾上腺皮质激素的多肽s-ACTH

NH₂-SYSME HFRWG KPVGK KRRPV KVYP-COOH（SEQ ID NO：1）

点突变多肽s-ACTH(K)：

NH₂-SYSME HFRWG HPVGH HRRPV HVYP-COOH（SEQ ID NO：19）

点突变多肽s-ACTH(R)：

NH₂-SYSME HFHWG KPVGK KHHPV KVYP-COOH（SEQ ID NO：14）

2、测定方法

2.1SPR检测所述多肽对β淀粉样蛋白的亲和力

1)β淀粉样蛋白分散方法：先将Aβ固体粉末1mg，溶于1mL六氟异丙醇中，超声5分钟，待充分溶解后，将其放在摇床上，120rpm摇动匀质作用下，保持12小时。再将此Aβ的六氟异丙醇溶液按每瓶200μL分装在棕色玻璃瓶中，用氮气将六氟异丙醇溶剂吹干，将此含有Aβ的玻璃瓶置于冷冻干燥机中抽真空冻干45分钟。此时每瓶中含有0.2mg已分散的Aβ。

2)向含有已分散的0.2mg Aβ的玻璃瓶中加入5μL DMSO，超声5分钟，使Aβ溶解完全。以1×PBS配置终浓度为1mg/mL的Aβ溶液。

3)多肽处理方法：使用1×PBS配制10nM，100nM，1000nM的所述多肽溶液。

制备SPR芯片：

1)在Plexera公司KxV5型SPR标配玻璃基底上，使用离子源辅助热蒸镀，沉积1.5-5.0nm厚Cr，50nm厚Au。使用等离子体溅射5分钟。在SPR芯片表面通过共价键，修饰上一层含羧基的硫醇分子自组装层。将5mL的羧基双硫醇分子(dithiosole-COOH，1μM)与羟基双硫醇分子(dithiosole-OH，10μM)混合乙醇溶液，滴在SPR芯片表面，吸附15分钟。然后吸走剩余液体。

2)以乙醇清洗芯片表面两次，用高纯氮气吹干。

3)使用碳二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化表面。将75mg/mL的EDC与11.5mg/mL的NHS等体积混合，取5mL至于双硫醇修饰后的SPR芯片表面，反应20分钟。再将剩余液体移走。

4)以乙醇清洗芯片表面两次，用高纯氮气吹干。

5)将0.2μL Aβ溶液滴在SPR芯片表面。反应时间为2小时，反应过程中，使用加湿器使芯片表面保持潮湿环境。

6)以乙醇胺封闭表面未参与反应的活性位点。5mL乙醇胺滴在芯片表面，反应20分钟之后，将剩余液体吸走。

7)以乙醇清洗芯片表面两次，用高纯氮气吹干。

8)将芯片用微流控膜封装，装入SPR仪器中。

9)以0.5%磷酸与1×PBS反复交替清洗芯片表面，1×PBS的配制为0.4gNaCl，0.01g KCl，182mg Na2HPO4·12H2O，12mg KH2PO4，0.01g NaN3，使用50mL超纯水溶解，用0.22μm水相滤膜过滤。固定流动相流速为1μL/s，利用SPR仪器的微流控管道清洗芯片表面，每次更换流动相的周期为240s。持续清洗芯片表面，直至所用固定相的SPR信号曲线不再下降为止，即此时表面上的固定相（Aβ）为特异吸附在芯片表面。

利用该芯片计算所述多肽与β淀粉样蛋白结合解离的动力学常数：

1)以1μL/s的流速，依次将所述多肽溶液由低浓度向高浓度通过芯片表面。结合时间150s，解离时间150s，重生时间250s。以1×PBS作为解离溶液，以0.5%磷酸作为重生液。在Kx5型SPR仪（Plexea）上记录所述多肽与Aβ结合解离的SPR曲线，如图1所示。

2)以Langmuir公式拟合所述多肽与Aβ结合解离的SPR曲线。经计算可以获得结合解离常数。如表格1所示，所述多肽与Aβ的平衡解离常数K_D值为1.38×10^-8M，表明所述多肽与Aβ的结合能力很强。

2.2ThT染色检测所述多肽对β淀粉样蛋白聚集能力的调节作用

配制1×PBS溶液：如2.1所述，待用。

配制ThT储液：称取15.9mg ThT，14.36g Na₂HPO₄·12H₂O，1.36g KH₂PO₄，量取100mL超纯水使其溶解，超声5分钟使充分溶解。

配制10μM的ThT测试液：量取2mL ThT储液，718mg Na₂HPO₄·12H₂O，68mg KH₂PO₄，使用超纯水定容至100mL，再用0.22μm水相滤膜过滤，待用。

β淀粉样蛋白分散方法：如2.1所述。

多肽处理方法：ACTH取1mg，使用1136μL1×PBS溶解，超声5分钟使溶解完全，此时多肽储液的浓度为300μM。

β淀粉样蛋白-多肽溶液配制方法：向含有已分散的0.2mg Aβ的玻璃瓶中加入5μL DMSO，超声5分钟，使Aβ溶解完全。向瓶中加入148μL上述多肽储液，1326μL1×PBS，然后向瓶中加一颗直径为400-600μm的玻璃球（SigmaAldrich）。此时，溶液中的Aβ和多肽的浓度均为30μM。同样地，向瓶中加入738μL上述多肽储液，733μL1×PBS，则溶液中的Aβ和多肽的浓度分别为30μM，150μM。此为实验组样品溶液。将玻璃瓶置于120rpm，37℃恒温的摇床中。另取0.2mg Aβ先加入5μL DMSO助溶，超声5分钟，使β淀粉样蛋白溶解完全，再加入加1472μL1×PBS溶解，此时β淀粉样蛋白的浓度为30μM。此为对照组样品溶液。

从样品配制完成的时刻开始计时，每隔3小时，从样品溶液中取出20μL，与180μL浓度为10μM的ThT测试液混合，加到黑色低吸附量96孔板（Corning）中。每个样品设置3个副孔。在连续光谱多功能酶标仪（Tecan Infinite M200）中，以450nm作为激发波长，收集482nm的发射光信号，增益值为100。

结果如图2所示，β淀粉样蛋白在溶液中向β折叠结构转变，在第40小时转变完全。按照1:5比例加入所述多肽后，平衡状态时的ThT荧光增强强度明显降低，即此时该多肽可以有效阻止Aβ向β折叠结构的转变。ThT染色实验反映了多肽的以β折叠结构为主的淀粉样聚集过程随时间的变化。

2.3圆二色谱检测所述多肽对β淀粉样蛋白二级结构的影响

β淀粉样蛋白分散方法：同2.1所述。

多肽处理方法：同2.2所述。

β淀粉样蛋白-多肽混合溶液配制方法：同2.1所述。在120rpm，37℃恒温的摇床中老化72小时后，从样品溶液中取出300μL，加到光程为0.1cm的石英比色皿中。在圆二色光谱仪（J-810）中，测量190nm-260nm的圆二色光谱，狭缝宽设置为1.0nm，5.0nm，测量结果取六次的平均值。

结果如图3所示，β淀粉样蛋白经72小时后，β折叠（216nm处负峰）和无规卷曲结构（200nm处负峰）为其主要空间构象。加入所述多肽后，β淀粉样蛋白与所述多肽的混合体系变为以无规卷曲结构为主。即该多肽可以抑制β淀粉样蛋白向β折叠结构的转变。

2.4原子力显微技术检测所述多肽对β淀粉样蛋白聚集形貌的影响

β淀粉样蛋白分散方法：同2.1所述。

多肽处理方法：ACTH取1mg，使用1136μL超纯水溶解，超声5分钟使溶解完全，此时多肽储液的浓度为300μM。

β淀粉样蛋白-多肽混合溶液配制方法：向含有已分散的0.2mg Aβ的玻璃瓶中加入5μL DMSO，超声5分钟，使Aβ溶解完全。向瓶中加入148μL上述多肽储液，1326μL超纯水，然后向瓶中加一颗直径为400-600μm的玻璃球（SigmaAldrich）。此时，溶液中的Aβ和多肽的浓度均为30μM。同样地，向瓶中加入738μL上述多肽储液，733μL超纯水，则溶液中的Aβ和多肽的浓度分别为30μM，150μM。此为实验组样品溶液。将玻璃瓶置于120rpm，37℃恒温的摇床中。另取0.2mg Aβ先加入5μL DMSO助溶，超声5分钟，使β淀粉样蛋白溶解完全，再加入加1472μL超纯水溶解，此时β淀粉样蛋白的浓度为30μM。此为对照组样品溶液。

72小时老化之后，从样品溶液中各取10μL，分别滴在新解理的云母表面，静置10分钟，再用高纯氮气吹干。

利用扫描探针显微镜（Dimension3100，Bruker Nano，美国），原子力探针轻敲模式，对测试样品在云母表面的形貌进行成像。图4所示，Aβ会自组装成为纤维状结构。所述多肽能抑制Aβ的纤维状组装行为，二者的混合体系可以在云母表面形成以颗粒和短纤维为主的结构。

2.5透射电子显微技术检测所述多肽对β淀粉样蛋白聚集形貌的影响

β淀粉样蛋白分散方法：同2.1所述。

多肽处理方法：同2.4所述。

β淀粉样蛋白-多肽混合溶液配制方法：同2.4所述。

72小时老化之后，从样品溶液中各取50μL，分别滴在超薄镀碳铜网表面，静置10分钟，将剩余液体吸走。在沉积样品的铜网表面滴20μL的1mg/mL磷钨酸铵水溶液，沉积5分钟，将剩余液体吸走。制备好的样品在干燥器中干燥过夜。利用200kV六硼化镧透射电子显微镜（Tecnai G220S-TWIN）成像，成像时加速电压为200kV。如图5中的（A）所示，Aβ会自组装成为长纤维状结构。所述多肽能抑制Aβ的纤维状组装行为，二者的混合体系为短纤维为主的结构。

2.6所述多肽对β淀粉样蛋白诱导的神经瘤细胞毒性的影响

β淀粉样蛋白分散方法：同2.1所述。

以神经瘤细胞SH-SY5Y作为研究模型，使用RPMI-1640培养基（含15%北美胎牛血清，1%青链霉素）进行细胞培养。在96孔细胞培养板（Corning）中，每孔培养1×10⁴个细胞，在细胞中板后24小时，向培养板中加入一系列浓度梯度的β淀粉样蛋白及所述多肽孵育。（具体浓度可见图5）每孔培养液的终体积为200μL。在孵育72小时后，向培养板中每孔加入20μL的5mg/mL噻唑蓝（MTT）1×PBS溶液。在37°C反应4小时。将培养板中的溶液吸走，每孔用100μL的DMSO溶解甲瓒沉淀。在连续光谱多功能酶标仪（Tecan Infinite M200）中，测定其在490nm处的吸光度值。

如图6（A）所示，β淀粉样蛋白对SH-SY5Y细胞系具有显著的细胞毒性。对于实验所述体系，在β淀粉样蛋白的浓度为30μM时，细胞存活率已有明显的下降（约为67%）。如图6（B）所示，当所述多肽的浓度小于100ng/mL时，细胞存活率均大于正常生长的对照组。说明，在实验浓度下，该多肽对SH-SY5Y细胞并无毒性。如图6（C）所示，将β淀粉样蛋白与所述多肽共孵育SH-SY5Y细胞，可以显著提高细胞的存活率。当所述多肽的浓度为10pg/mL至100ng/mL时（β淀粉样蛋白浓度为30μM），细胞的存活率逐渐提升，最终在100ng/mL时达到最大，约为93%。即所述多肽可以有效抑制β淀粉样蛋白对SH-SY5Y细胞的毒性。

2.7DCFH-DA荧光探针检测所述多肽对β淀粉样蛋白诱导的活性氧产生的影响

β淀粉样蛋白分散方法：同2.1所述。

DCFH-DA探针的处理方法：使用DMSO溶解，使储液浓度为10mM，待用。

以神经瘤细胞SH-SY5Y作为研究模型，使用不含酚红的RPMI-1640培养基（含15%北美胎牛血清，1%青链霉素）进行细胞培养。在96孔细胞培养板（底为透明，壁为黑色，Corning）中，每孔培养1×10⁴个细胞，在细胞中板后24小时，向培养板中加入一系列浓度梯度的β淀粉样蛋白及所述多肽孵育。（具体浓度可见图6）在孵育24h后，去除原培养基。使用不含血清的和酚红的RPMI-1640培养基稀释DCFH-DA，使终浓度为20μM。每孔加入100μL稀释后的DCFH-DA溶液。在37°C反应半小时。在连续光谱多功能酶标仪（Tecan Infinite M200）中，使用488nm激发波长，525nm发射波长，检测荧光强度。

如图7（A）所示，β淀粉样蛋白能够诱导SH-SY5Y细胞产生大量的活性氧，且活性氧的产生量随Aβ的浓度的提高而增加。如图7（B）所示，当所述多肽的浓度为10pg/mL至100ng/mL时，活性氧的产生量与对照组未处理细胞相当。说明该多肽对SH-SY5Y细胞内活性氧的含量无影响。如图7（C）所示，将β淀粉样蛋白与所述多肽共孵育SH-SY5Y细胞，可以显著降低细胞内的活性氧含量。且在加入极低浓度的所述多肽（10pg/mL）时，已能明显抑制Aβ诱导的活性氧产生（β淀粉样蛋白浓度为30μM），使细胞内活性氧含量下降到未处理对照组水平。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用材料和步骤的等效替换以及辅助材料和步骤的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种促肾上腺皮质激素来源的抑制β淀粉样蛋白聚集和毒性的多肽，其特征在于，所述多肽为序列为SEQ ID NO：1的多肽或具有所述多肽功能的对SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、添加修饰的变体。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述变体为将所述多肽序列中的赖氨酸残基和精氨酸残基中的一个或多个突变为其他种带正电的氨基酸残基所获得的变体，优选地，所述带正电的氨基酸残基为组氨酸、赖氨酸或精氨酸。

3.如权利要求1或2所述的多肽，其特征在于，所述变体的序列为SEQID NO：3～19。

4.编码如权利要求1至3中任一项所述的多肽的核苷酸序列。

5.包含如权利要求4所述的核苷酸序列的重组载体。

6.含有如权利要求5所述的重组载体的重组细胞。

7.一种组合物，其包含如权利要求1至3中任一项所述的多肽和药学上可接受的辅料，优选地所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂、填充剂等中的一种或几种。

8.如权利要求1至3中任一项所述的多肽，如权利要求4所述的核苷酸序列、如权利要求5所述的重组载体、如权利要求6所述的重组细胞或如权利要求7所述的组合物在抑制β淀粉样蛋白聚集和毒性中的用途。

9.权利要求1至3中任一项所述的多肽，如权利要求4所述的核苷酸序列、如权利要求5所述的重组载体、如权利要求6所述的重组细胞或如权利要求7所述的组合物在用于诊断和/或治疗与β淀粉样蛋白相关的疾病的药物的制备中的用途。

10.如权利要求9所述的用途，其中所述疾病是阿尔茨海默症。