CN102675453A - 一种促肾上腺皮质激素的类似物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种促肾上腺皮质激素的类似物及其制备方法，与肾上腺皮质激素(ACTH)相比，本发明的化合物具有延长半衰期的效果，同时保留了肾上腺皮质激素的药理活性。本发明的促肾上腺皮质激素的类似物具有如下化学结构。

Description

一种促肾上腺皮质激素的类似物及其制备方法和用途

背景技术

促肾上腺皮质激素皮质激素(ACTH)是由垂体腺分泌的主要激素，研究表明垂体腺是产生多种重要生长激素和生理控制激素的器官。ACTH刺激肾上腺皮质，主要是刺激糖皮质激素的分泌。糖皮质激素与糖、蛋白质和脂肪的代谢有关，具有多种生理功能，例如心血管功能调节、神经损伤恢复与再生、及神经内分泌免疫调节作用等。在应激情况下，例如烧伤、中毒等，ACTH的分泌会增加，随即刺激肾上腺皮质激素的释放，增加机体的抵抗力。在医学上，ACTH可以用于炎症的治疗和抗过敏等。目前，ACTH已经用于癫痫、老年痴呆及类风湿性关节炎疾病的临床治疗及检测。

ACTH(1-24)是促肾上腺皮质激素的N端24肽，分子量为2933.50。ACTH分子的1-24位氨基酸是生物活性的中心区域，各类哺乳动物和人的ACTH前24为氨基酸都相同，故临床使用多为人工合成的1-24为氨基酸的活性片段，可以减少从动物体内提取的全长ACTH导致的过敏的不良反应。ACTH(1-24)具有高效、快速、剂量小的特点，非常适合于突发事件急救中使用。ACTH(1-24)只有通过注射方式才能被人体吸收，起到治疗效果。但由于半衰期极短，限制了ACTH(1-24)在炎症性疾病中的用途，例如风湿或类风湿性关节炎，为了治疗这些疾病，往往需要经常性的多次注射，给患者造成不便，降低了该药物的使用率。

因此，有必要提供一种具有ACTH(1-24)活性，但是能够相对延长半衰期的化合物。

发明内容

本发明提供了一种ACTH(1-24)的多肽类似物，其化学结构式如下：

其中每个R₁和R₂独立的选自H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂芳基烷基或杂环基烷基；R₁和R₂优选烷基，更有选甲基或庚烯基；

R₃是烷基、烯基、炔基、[R₄-K-R₄]_n；优选烯基，优选庚烯基；

其中R₄是烷基、炔基(烯基)或炔基；

K是O、S、SO、SO2、CO、CO2、CONR6、或

R₆是H或烷基；

n是2-7的整数，优选2-4的整数。

本发明的ACTH(1-24)的多肽类似物优选具有下列结构的化合物：

其中每个R₁和R₂独立的选自H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂芳基烷基或杂环基烷基；R₁和R₂优选烷基，更优选甲基或庚烯基；

n是2-7的整数，优选2-4的整数。

本发明的ACTH(1-24)的多肽类似物更优选具有下列结构的化合物：

本发明的化合物在ACTH(1-24)的基础上，将两个位置的氨基酸用上述基团取代，并环合连接，形成本发明的ACTH(1-24)多肽类似物，使该类似物具有天然的多肽二级结构，使其更接近于内源性ACTH的结构特点，并提高了多肽类似物对蛋白酶的耐受，降低了链状ACTH(1-24)在体内被酶解的可能使得其与未修饰的ACTH(1-24)序列相比，在体内的血清半衰期得以延长。而且本发明的ACTH(1-24)多肽类似物保留了ACTH(1-24)的药理活性。

尤其优选具有光学活性的(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚酸取代(即图1所示S₅)，所述的取代基通过化学催化的方式彼此环合后获得的多肽化合物，使得血清半衰期明显延长。

本发明的另一方面提供了制备上述ACTH(1-24)多肽类似物的方法。可以采用本领域技术人员熟知的方法，合成多肽序列后催化环合制备。

优选的本发明化合物的制备方法是：

(1)选择顺序的或次序不同的合成步骤产生具有如下化学结构的物质(图1所示化合物2)：

所述的化合物2的合成方法包括：例如液相合成或固相合成(SPPS)进行制备，优选SPPS。所述的固相合成可以选择常规聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇类树脂等，例如：王氏树脂(Wang Resin)，Fmoc-Pro-CTC树脂等，优选Fmoc-Pro-CTC树脂。

(2)获得的化合物2通过催化环合的方式制备本发明的环状多肽，所述的催化剂可以是：Grubbs2^ND、钌催化剂，优选的催化剂是苯基亚甲基双(三环己基磷)二氯化钌(Grubbs 1^st)。

本发明另一方面提供了包括上述ACTH(1-24)多肽类似物的药物组合物。所述的药物组合物包含有效量的具有上述结构的ACTH(1-24)多肽类似物和药学可接受的载体，所述的组合物可以根据本领域的公知技术进行制备，例如与常规的药用辅料进行混合，制备成注射剂、注射液，或局部给药的制剂类型例如乳剂、膏剂、霜剂或经鼻给药的剂型等，或具有缓释效果的制剂，例如微球、脂质体等。

本发明所述的“药学可接受的载体”包括任何一种药用辅料，例如填充剂、稀释剂、赋形剂等。例如包括但不限于：乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、纤维素类(如羧甲基纤维素、羟丙甲基纤维素等)、乙二醇、豆油、芝麻油、乙醇、无菌生理盐水、无菌水、乙醇等。通常，药学上可接受的载体是水溶性的pH缓冲液，例如柠檬酸盐、磷酸盐等；还可以含有抗氧化剂，稳定剂(如氨基酸)、抑菌剂等。

本发明另一方面提供了上述ACTH(1-24)多肽类似物在制备预防、治疗和诊断ACTH相关疾病的药物中的用途。所述的ACTH相关疾病包括但不限于：肾上腺皮质功能减退症、癫痫、老年痴呆、类风湿性关节炎、红斑狼疮、过敏等。

附图说明

图1是本发明所述ACTH(1-24)的多肽类似物的制备流程。

具体实施例

以下的实施例用于进一步的阐明本发明的技术方案。本发明说明书及实施例中所带保护基的氨基酸单体以及其他化学试剂等，均可从相关公司购买获得，未注明具体条件的试验方法，可按常规条件进行，或按商品供货商所建议的条件进行。

实施例一、ACTH(1-24)的多肽类似物的制备

按照图1所示的步骤，将氨基酸逐一接在树脂上，然后用催化剂催化环合，接着脱去保护基并将多肽从树脂上切下。

1、固相合成

选择0.295g Fmoc-Pro-CTC树脂(取代度：0.51mmol/g)制备，在室温条件下用DMF浸泡树脂60min，将带有Fmoc保护的氨基酸按照序列的顺序排列在合成仪中进行活化连接，获得图1所示的化合物2。

2、催化环合

将上述步骤所得的化合物2依次用DCM(20ml)和DCE(20ml)各冲洗两次，然后用DCE(8ml)浸泡30min，接着将Grubbs 1^st(25mg x 2，20mg/0.1mmol)加入反应混合物中，室温振摇3小时。用MS检测环化情况，如果环化不完全，重复该步骤，通常重复2次，获得图1所示的化合物3(0.323g)。

3、切除树脂

将含有上述化合物3的反应混合物放在Cleavage cocktail裂解液(5ml)中，氮气保护下室温搅拌2.5小时。过滤，去除滤液，滤饼用TFA(2ml)冲洗，接着放置在冷的乙醚(50ml)中沉淀，离心；得到的滤饼用冷的乙醚(50ml)冲洗两次，真空干燥，获得本发明ACTH(1-24)多肽类似物(图1所示827161)93mg，产率20％，MW＝3069.8，理论值MW＝3069.67

4、纯化

将上述粗品用HPLC进行纯化，获得纯度95％以上的纯品。

实施例二、药代动力学试验

取正常雄性小鼠10只，体重20±1g，禁食过夜，分为2组，腹腔注射地塞米松(0.4mg/0.1mlPBS/0.5％BAS)，以抑制内源性ACTH产生。

90-120min后，给对照组皮下注射ACTH(1-24)1μg/0.1ml PBS/0.5％BAS，分别于0、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90分钟鼠尾静脉取血，分离上清液，ELISA测定血清中的多肽浓度。类似物组按照同样的方式给予实施例1的化合物(1μg/0.1mlPBS/0.5％BAS)，测定血清中的多肽浓度。

结果显示，ACTH(1-24)的血液半衰期为15min，而本发明实施例1的化合物的血液半衰期为50min，本发明实施例1化合物有效增加了体内的稳定性。

实施例三、实施例1化合物抗炎作用

1、实验材料：ECV304细胞；(武汉大学典型培养物保藏中心)；RPMI-1640培养基(美国Gibco)；.脂多糖(LPS)(Sigma公司)；NO检测试剂盒

2、实验步骤：

(1)细胞培养与实验分组：

将细胞按1×105个/ml接种于96孔板中，于37℃5％的CO2培养箱中培养，待细胞贴壁生长后随机分为对照组、LPS损伤组和实施例1组。

损伤组：使用含有LPS(50μg/ml)的培养液；

实施例1组：在加入LPS的同时再加入不同浓度的实施例1化合物(25、50、100nmol/L)；

对照组：加入等量培养液。

(2)将上述细胞继续培养24h后，检测各组细胞上清液中NO值

3、实验结果

LPS损伤组NO释放量较对照组明显增加，实施例1组NO释放量较损伤组减少，具有显著性差异，并呈现剂量依赖关系，见下表

实施例1化合物对LPS损伤的细胞NO释放量的影响

组别	NO(μmol/L)
		对照组	487.34±10.67
LPS损伤组	712.56±20.81
		实施例1组25nmol/L	533.02±15.52
实施例1组50nmol/L	515.89±16.30
		实施例1组100nmol/L	504.72±15.22

NO是组织炎症反应的重要因素之一。炎症发生时，NOS催化产生NO，继而参与组织炎性损伤。抑制NO有利于减轻组织炎性损伤。实验结果表明，本发明ACTH(1-24)多肽类似物可以减少NO的生成，具有抗炎效果。

Claims (11)

1.一种ACTH(1-24)多肽类似物，其化学结构式如下：

其中每个R₁和R₂独立的选自H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂芳基烷基或杂环基烷基；

R₃是烷基、烯基、炔基、[R₄-K-R₄]_n；

R₄是烷基、炔基烯基或炔基；

K是O、S、SO、SO₂、CO、CO₂、CONR₆、或

R₆是H或烷基；

n是1-4的整数。

2.如权利要求1所述的多肽类似物，其化学结构式如下：

其中每个R₁和R₂独立的选自H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂芳基烷基或杂环基烷基；

n是1-4的整数。

3.如权利要求2所述的多肽类似物，其化学结构式如下：

4.一种制备权利要求3所述ACTH(1-24)多肽类似物的方法，其特征在于：

(1)制备具有下述结构的物质

(2)通过催化剂处理步骤(1)的化合物，使其环合。

5.如权利要求4的方法，其特征在于，步骤(1)通过固相合成技术制备。

6.如权利要求5的方法，其特征在于，步骤(1)采用Fmoc保护的固相合成技术。

7.如权利要求4的方法，其特征在于，步骤(2)的催化剂是钌催化剂。

8.如权利要求7的方法，其特征在于，所述的钌催化剂是Grubbs 1^st。

9.权利要求1-3任一项的多肽类似物在治疗在制备预防、治疗或诊断ACTH相关疾病的药物中的用途。

10.如权利要求9的用途，所述的ACTH相关疾病包括：肾上腺皮质功能减退症、癫痫、老年痴呆、类风湿性关节炎、红斑狼疮、过敏。

11.一种药物组合物，包括有效量的权利要求1-3任一项所述的多肽类似物和药学可接受的载体。

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