CN102827269A

CN102827269A - 胸腺肽α1的类似物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN102827269A
Application number: CN2011101591151A
Authority: CN
Inventors: 李湘; 徐琪
Original assignee: HANGZHOU CHINESE PEPTIDE CO Ltd
Current assignee: HANGZHOU CHINESE PEPTIDE CO Ltd
Priority date: 2011-06-13
Filing date: 2011-06-13
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2031-06-13
Also published as: CN102827269B

Abstract

本发明涉及一种新的胸腺肽α₁的类似物及其制备方法，与天然胸腺肽α₁相比，本发明的化合物的化学稳定性得以提高，同时保留了天然胸腺肽α₁的药理活性。本发明的胸腺肽α₁类似物具有如下化学结构。

Description

胸腺肽α1的类似物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及胸腺肽α₁的类似物及其制备方法和在制备预防和治疗疾病的药物中的用途。

背景技术

胸腺肽是由胸腺上皮细胞分泌的一类多肽类激素混合物，其水平与机体的免疫功能关系密切。其中胸腺肽α₁是一种具有热稳定性的酸性多肽，由28个氨基酸组成，等电点为4.2，相对分子量3108。人胸腺肽α₁的序列为

Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH。

体外药效学试验显示，人胸腺肽α₁可以增加细胞因子的水平；增加自然杀伤细胞的活力；诱导T细胞标志物的表达；提高高亲和力的白介素-2受体表达；诱导抗肿瘤活力；提高机体对病毒、细菌和真菌的抵抗；增强宿主的抗感染能力等。药理活性广泛，是目前临床使用疗效确切的药物，用于治疗乙肝和免疫缺陷等疾病。已上市的全合成人胸腺肽α₁为活性成分的药物的商品名“日达仙”。

尽管天然序列的人胸腺肽α₁已经作为药物用于疾病治疗，但是其体内半衰期仅有2小时，药物动力学性质较差，需要频繁注射，极大地影响了其临床应用及治疗效果。

因此，今年来多种研究都集中在开发长效的胸腺肽α₁类似物，通过对胸腺肽α₁的修饰延长体内的稳定性和半衰期，以提高治疗质量。例如，CN101062950公开了用聚乙二醇修饰胸腺肽α₁的C端，获得胸腺肽α₁与聚乙二醇的共价连接物。CN10154228公开了N端含有半胱氨酸的聚乙二醇修饰的胸腺肽α₁；CN101591397公开了胸腺肽α₁与人白蛋白的重组融合蛋白，达到延长胸腺肽α₁体内半衰期的效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种胸腺肽α₁的类似物，其化学结构式如下：

其中每个R₁、R₂、R₃、R₄独立的选自H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂芳基烷基或杂环基烷基；R₁、R₂、R₃、R₄优选烷基，更优选C₁-C₄的烷基，最优选甲基；

R₅和R₆独立的选自烷基、烯基、炔基、[R₁′-K-R₁′]_n；

所述的R₁′选自烷基、炔基(烯基)或炔基；

所述的K是O、S、SO、SO2、CO、CO2、CONR₂′、或

所述的R₂′是H或烷基；

n是2-7的整数。

R₅和R₆优选烯基。

本发明胸腺肽α₁的类似物优选具有下列结构的化合物：

其中每个R₁、R₂、R₃、R₄独立的选自H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂芳基烷基或杂环基烷基；优选烷基，更优选C₁-C₄的烷基，最优选甲基；

n和m分别选自2-7的整数，优选当n是7时，m是4。

本发明胸腺肽α₁的类似物更优选具有下列结构的化合物：

本发明的胸腺肽α₁类似物具有天然的多肽二级结构，α螺旋程度增加，使其更接近于胸腺肽α₁的四级结构特点，更容易与靶位相结合，因此提高了多肽类似物对二肽酰基肽酶IV的耐受，降低了在体内被降解的可能。与天然胸腺肽α₁序列相比，本发明的多肽化合物的化学稳定性得以提高。而且本发明的多肽化合物保留了天然胸腺肽α₁的药理活性。

本发明胸腺肽α₁类似物尤其优选分别以具有光学活性的(R)-2-氨基-2-甲基-6-癸烯酸(即图1中的R₈)和(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸(即图1中的S₅)取代序列中的天然氨基酸，所述的取代基通过化学催化的方式彼此环合后获得的多肽化合物。

所述的取代基以Fmoc进行保护，参与多肽的合成，所述的Fmoc-(R)-2-氨基-2-甲基-6-癸烯酸具有如下化学结构：

所述的Fmoc-(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸具有如下结构：

本发明的另一方面提供了制备上述胸腺肽α₁类似物的方法。可以采用本领域技术人员熟知的方法，选择顺序的或次序不同的合成步骤产生具有如下化学结构的物质：

所述的合成方法包括：例如液相合成或固相合成(SPPS)进行制备，优选SPPS。所述的固相合成可以选择常规聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇类树脂等，例如：王氏树脂(Wang Resin)，Fmoc-Pro-CTC树脂等，优选王氏树脂(Wang Resin)。本发明化合物的环状结构是通过催化环合的方式制备的，所述的催化剂可以是：钌催化剂，优选的催化剂是苯基亚甲基双(三环己基磷)二氯化钌(Grubbs 1^st)，或Grubbs 2^st。

本发明另一方面提供了包括上述胸腺肽α₁类似物的药物组合物。所述的药物组合物包含有效量的具有上述结构的多肽化合物和药学可接受的载体，所述的组合物可以根据本领域的公知技术进行制备，例如与常规的药用辅料进行混合，制备成注射剂、注射液，或局部给药的制剂类型例如乳剂、膏剂、霜剂或经鼻给药的剂型等，或具有缓释效果的制剂，例如微球、脂质体等。

本发明所述的“药学可接受的载体”包括任何一种药用辅料，例如填充剂、稀释剂、赋形剂等。例如包括但不限于：乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、纤维素类(如羧甲基纤维素、羟丙甲基纤维素等)、乙二醇、豆油、芝麻油、乙醇、无菌生理盐水、无菌水、乙醇等。通常，药学上可接受的载体是水溶性的pH缓冲液，例如柠檬酸盐、磷酸盐等；还可以含有抗氧化剂，稳定剂(如氨基酸)、抑菌剂等。

本发明另一方面提供了上述胸腺肽α₁类似物在制备预防和治疗免疫系统相关疾病的药物中的用途。所述的免疫系统相关疾病包括肝炎、肿瘤、免疫功能低下、流行性感冒等。

附图说明

图1是本发明优选的胸腺肽α₁类似物的制备流程，图1分子式中的R₈是(R)-2-氨基-2-甲基-6-癸烯基，S₅是(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯基

图2显示了小鼠药代动力学的研究结果

具体实施例

以下的实施例用于进一步的阐明本发明的技术方案。本发明说明书及实施例中所带保护基的氨基酸单体以及其他化学试剂等，均可从相关公司购买获得，未注明具体条件的试验方法，可按常规条件进行，或按商品供货商所建议的条件进行。

实施例1胸腺肽α1类似物的制备

按照固相合成的常规方法，将带保护基的氨基酸逐一接在树脂上，然后用催化剂催化环合，接着脱去保护基并将多肽从树脂上切下，制备如下式的优选胸腺肽α₁类似物：

1、固相合成

选择0.485gFmoc-Asn(trt)Wang树脂(取代度：0.309mmol/g)制备，在室温条件下用DMF浸泡树脂60min，将带有Fmoc保护的氨基酸按照序列：的顺序排列在合成仪中进行活化连接，获得图1所示的化合物2。

2、催化环合

将上述步骤所得的化合物2依次用DCM(20ml)和DCE(20ml)各冲洗两次，然后用DCE(8ml)浸泡30min，接着将Grubbs 1^st(25mg×2，20mg/0.1mmol)加入反应混合物中，室温振摇3小时。用MS检测环化情况，如果环化不完全，重复该步骤，通常重复2次，获得图1所示的化合物3(0.773g)。。

3、切除树脂

将含有上述化合物3的反应混合物放在裂解液中，氮气保护下室温搅拌2.5小时。过滤，去除滤液，滤饼用TFA(2ml)冲洗，接着放置在冷的乙醚(50ml)中沉淀，离心；得到的滤饼用冷的乙醚(50ml)冲洗两次，真空干燥，获得本发明Thymalfasin多肽类似物(图1所示827172)425mg，产率86％，MW＝3296.7，理论值MW＝3296.7

4、纯化

将上述粗品用HPLC进行纯化，获得纯度95％以上的纯品。

实施例2胸腺肽α₁类似物的体内半衰期检测

采用天然序列胸腺肽α₁制备抗人胸腺肽α₁的兔抗血清。取6只小鼠分为2组，腹腔分别注射0.2ml的含有500μg日达仙的PBS溶液，和0.2ml的含有500μg实施例类似物的PBS溶液。分别于5、20、40、60、120、360分钟取血样，离心，取血清，以人胸腺肽α1(Thymosinα1).ELISA检测试剂盒测定血样中样品浓度。如图2结果显示，本发明胸腺肽α₁类似物显著延长了胸腺肽α₁的半衰期。

实施例3胸腺肽α₁类似物的药效学评价

制备无菌小鼠脾细胞悬液，用含20％小牛血清的RPMI-1640培养液调节细胞浓度为5×10⁶细胞/ml，于24孔培养板中分别加入0.5ml细胞悬液、0.25mlCon A(0.5μg/ml)和0.25ml待测样品(日达仙，本发明胸腺肽α₁类似物)，空白对照为RPMI-1640培养液。置37℃，5％CO₂的条件下孵育24小时，离心收集上清液，采用双抗体夹心ELISA法测定其中IFN-γ的含量。从表1结果中可以看出，本本发明胸腺肽α₁类似物仍具有促脾细胞产生IFN-γ的活性。

表1实施例1的胸腺肽α₁类似物在ConA刺激下诱导脾细胞产生IFN-γ的试验

Claims

1.一种胸腺肽α₁类似物，其化学结构式如下：

其中每个R₁、R₂、R₃、R₄独立的选自H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂芳基烷基或杂环基烷基；

R₅和R₆独立的选自烷基、烯基、炔基、[R₁’-K-R₁’]_n；

所述的R₁’选自烷基、炔基(烯基)或炔基；

所述的K是O、S、SO、SO2、CO、CO2、CONR₂’、或

所述的R₂’是H或烷基；

n是2-7的整数。

2.如权利要求1所述的胸腺肽α₁类似物，其化学结构式如下：

n、m分别独立选自是2-7的整数。

3.如权利要求2所述的胸腺肽α₁类似物，其化学结构式如下：

4.一种制备权利要求3所述胸腺肽α₁类似物的方法，其特征在于：

(1)制备具有下述结构的物质

(2)通过催化剂处理步骤(1)的化合物，使其环合。

5.如权利要求4的方法，其特征在于，步骤(1)通过固相合成技术制备。

6.如权利要求5的方法，其特征在于，步骤(1)采用Fmoc保护的固相合成技术。

7.如权利要求4的方法，其特征在于，步骤(2)的催化剂是钌催化剂。

8.如权利要求7的方法，其特征在于，所述的钌催化剂是Grubbs 1^st。

9.权利要求1-3任一项的胸腺肽α₁类似物在治疗在制备预防、治疗免疫系统相关疾病药物中的用途。

10.如权利要求9的用途，其特征在于，所述的免疫系统相关疾病包括：肝炎、肿瘤、免疫功能低下、流行性感冒。

11.一种药物组合物，包括有效量的权利要求1-3任一项所述的胸腺肽α₁类似物和药学可接受的载体。