KR102101339B1

KR102101339B1 - 피부질환 예방 또는 치료용 조성물 및 제조방법

Info

Publication number: KR102101339B1
Application number: KR1020180036460A
Authority: KR
Inventors: 주봉건; 정하얀; 변장웅; 이윤식; 김규한; 허찬영; 강소민; 전다솜
Original assignee: 주식회사 비드테크; 서강대학교산학협력단
Priority date: 2017-03-29
Filing date: 2018-03-29
Publication date: 2020-04-16
Also published as: KR20180110638A

Abstract

본 발명의 아토피 치료용 조성물에 따르면, 가려움증과 피부염을 비롯한 피부질환 관련 주요 염증성 사이토카인인 흉선간질성림프구신생인자(Thymic Stromal Lymphopoietin, TSLP) 또는 인터루킨(IL)의 발현 감소 활성을 유도하는 물질을 유효성분으로 포함하는 피부질환 예방 또는 치료용 조성물, 예를 들어 제형, 약학 조성물, 건강 기능식품을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 결합체와 이를 포함하는 조성물은 피부질환의 주요 인자인 혈청 면역 글로불린 IgE의 양을 감소시키고 제2형 T 림프구 기능을 줄이고 제1형 T 림프구 기능을 항진시켜 피부질환의 예방 또는 치료에 유용할 수 있다.

Description

피부질환 예방 또는 치료용 조성물 및 제조방법 {Composition for preventing or treating skin disease Inflammatory and method for preparing thereof}

본 발명은 피부질환 예방 또는 치료용 조성물 및 제조방법에 관한 것이다.

피부질환으로서 아토피 피부염(atopic dermatitis)과 건선(psoriasis) 등이 최근 사회적인 문제로 대두되고 있다. 특히 동반되는 참을 수 없는 가려움증 (피부 소양증)으로 인해 긁는 행동이 증가되어 증상이 더욱 악화된다.

이들 가려움증과 피부염을 비롯한 피부질환 관련 주요 염증성 사이토카인으로는 피부의 각질세포에서 분비되는 흉선간질성림프구신생인자(Thymic Stromal Lymphopoietin, TSLP)와 인터루킨 (interleukin) 등을 들 수 있다. 상기 TSLP의 경우 피하에 존재하는 감각신경을 자극하여 가려움증을 직접적으로 유발한다고 알려져 있다.

일반적으로 피부염 치료제로 사용하는 항히스타민제, 스테로이드 호르몬 (코티졸, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 덱사메타손 주사 및 연고), 보습제 등이 있으나 효과적이지 않고 스테로이드계 항염증제의 경우 모세혈관이 확장되고 피부층이 얇아져 심한 과민반응을 보인다. 피부가 연약한 부위에 상기 스테로이드계 항염증약을 장기 복용할 경우 피부가 얇아지거나 변색되는 부작용이 야기될 수 있다. 더욱이 스테로이드를 중단하였을 때 스테로이드 리바운드 (steroid rebound)라는 더 심한 아토피 증상을 보이게 된다.

비스테로이드계 면역조절제인 엘리델(Elidel, pimecrolimus) 크림과 프로토픽(Protopic, tacrolimus, FK506) 연고가 스테로이드 연고 약제로 개발되어 장기간 도포 시 기존의 스테로이드 연고에서 나타나던 부작용이 없으면서 얼굴이나 목 등 예민한 피부에까지 사용되었다. 그러나 최근 칼시뉴린(calcineurin) 억제제의 암 유발 가능성에 대한 위험이 제기되며 16세 미만인 환자에게는 저 농도 사용만 인정되고 2세 이하인 소아에서는 저농도 사용조차 인정되지 않는다. 기타 아토피 치료로서 항히스타민제를 사용하며, 심한 경우 단기간 부신피질 호르몬제 복용, 외용제 도포, 피부 자외선 치료나 인터페론 치료 등을 시행하고 있으나 대부분 잠시 호전을 보이나 투약을 멈추면 재발하는 난치성 질환이다. 최근에 허가된 항체 신약 두필루맵이 있으나 값이 비싸서 쉽게 사용하기에는 제한이 있다. 따라서 기존 치료제보다 부작용이 적고 높은 유효성을 보이는 치료/예방 약제의 개발이 절실히 필요하다.

또한, 음식 조절이나 스트레스 해소 등으로 아토피 피부염의 증상악화를 예방할 경우 영양관리에 문제가 있을 수 있으며, 아토피 증상의 일시적인 완화만 가능할 뿐 근본적인 예방 및 개선을 이루기 어려운 문제가 있다. 관련 선행문헌으로는 대한민국 등록특허 10-1169736호를 들 수 있으나, 피부질환에 대한 근본적이고 효과적인 치료제의 연구 및 개발이 여전히 요구된다.

한편, 펩타이드가 체내에 흡수되면 아미노산으로 분해되어 독성이 없고, 쉽게 변하거나 산화되지 않아 높은 안정성을 갖으며, 크기가 매우 작기 때문에 항체가 잘 생성되지 않고, 단일클론 항체 등에 비해 경제적인 장점이 있다. 또한 과일과 야채에 함유된 천연 생체 활성화합물질을 지칭하는 파이토케미칼류은 천연 항산화제로서 매우 강한 항염, 항암, 항산화 작용을 갖는 것으로 알려져 있으나, 난용성 물질로써 피부에 적용시 한계가 있으며, 소량을 용해시키더라도 용액 내에서 쉽게 산패되는 문제가 있어 이용상 제한이 있다.

이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해소하고 피부에 적용능과 효능을 개선시키기에 적절한 성분들이 특정 구조를 갖는 결합체를 제공함에 따라 아토피 피부염 치료 등과 같은 피부질환 완화, 치료, 예방의 기능을 제공할 수 있고, 이와 동시에 해당 성분들을 각각 피부에 적용시 발생하던 물리학적/생물학적 안정성 문제를 해소함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

구체적으로, 본 발명은 가려움증과 피부염을 비롯한 피부질환 관련 주요 염증성 사이토카인인 흉선간질성림프구신생인자(Thymic Stromal Lymphopoietin, TSLP) 또는 인터루킨(IL)의 발현 감소 활성을 유도하는 물질을 개발하여 이를 유효성분으로 포함하는 피부질환 예방 또는 치료용 조성물, 예를 들어 제형, 약학 조성물, 건강 기능식품을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 링커(Y)에 의해 파이토케미컬 분획(X)에 결합된 천연 활성화제(Z)를 포함하고,

식 (X-Y)m-(Z)n-R(여기서 Y는 O 또는 NH이고, (Z)n은 하기 식 2 내지 식 4로 나타낸 구조 중에서 선택되며, R은 NH₂ 또는 OH이고, m 및 n은 1 내지 3의 정수 중에서 독립적으로 선택된다)로 나타낸 구조를 갖는 항염 결합체를 유효 성분으로 포함하는 피부질환 예방 또는 치료용 조성물이 제공된다:

[식 2] AA1-His

[식 3] His-AA2

[식 4] AA1-His-AA2

(식들 중에서, AA1 및 AA2는 각각 독립적으로 20종의 아미노산으로 구성된 군에서 선택된 펩타이드이다.)

본 발명의 다른 측면에 따르면, a) 고체상 합성법으로 보호기, 링커 및 천연 활성화제의 치환자리를 갖는 수지 지지체를 제조하는 단계;

b) 상기 수지 지지체에 보호기와 OH기로 양 말단이 각각 캡핑된 구조를 갖는 천연 활성화제를 추가하여 개질시키는 단계;

c) 개질된 수지 지지체에 염증성 사이토카인 표적화 분획을 투입하고 상기 보호기 자리에 염증성 사이토카인 표적화 분획을 구비하도록 추가 개질시키는 단계;

d) 추가 개질된 수지 지지체에서 수지를 제거하고 항염 결합체를 제공하는 단계; 및

e) 상기 항염 결합체를 유효성분으로 하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 피부질환 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 아토피 치료 또는 피부 소양증 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.

본 발명에 따르면, 적절한 성분들이 특정 구조를 갖는 결합체로 제공됨에 따라 가려움증과 피부염을 비롯한 피부질환 관련 주요 염증성 사이토카인 염증인자의 조절, 즉 흉선간질성림프구신생인자(Thymic Stromal Lymphopoietin, TSLP) 또는 인터루킨(IL)의 발현 감소 활성을 나타냄에 따라 피부질환에 대한 약학 조성물, 건강식품 또는 화장품으로 유용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 결합체 및 조성물은 피부질환의 주요 인자인 혈청 면역 글로불린 IgE의 양을 감소시키고 제2형 T 림프구 기능을 줄이고 제1형 T 림프구 기능을 항진시켜 피부질환에 대한 약학 조성물, 건강식품 등에 유용할 수 있다.

도 1은 TSLP 유전자 발현을 증가시키는 조건을 세포 수준에서 재현하기 위해 TNF-α를 인간 피부상피 각질세포(keratinocyte)인 HaCaT에 각각 처리하여 흉선간질성림프구신생인자(Thymic Stromal Lymphopoietin, TSLP) 발현을 유도한 다음 증가된 TSLP, IL-13, IL-25, IL-33의 발현이 본 발명의 일 구현예에 따른 항염 결합체의 처리에 의해 RNA 수준에서 감소된 결과를 보이는 실시간 PCR 결과 그래프이다.
도 2는 MC-903 처리에 의해 생쥐의 귀에서 아토피 피부염을 유발한 다음 본 발명의 일 구현예에 따른 항염 결합체의 처리에 의해 증상 완화를 나타내는 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 항염 결합체 처리에 대하여 DPPH 라디칼 소거능과 리피드 퍼옥시데이션 테스트를 각각 수행한 결과를 도시한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 항염 결합체 처리의 ROS에 의한 vascular smooth muscle cells(VSMC) 증식 억제 기전 및 결과 데이터를 도시한 도면이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 아토피 피부염 동물 모델에 항염 결합체를 적용할 경우, 홍반, 출혈 및 부종과 같은 피부 병변과 귀의 부종이 완화되며 염증성 사이토카인 수용체로서 흉선간질성림프구신생인자(Thymic Stromal Lymphopoietin, TSLP)의 발현과 인터루킨(IL)의 발현억제/감소 효능을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

구체적으로, 본 발명의 조성물은 링커(Y)에 의해 파이토케미컬 분획(X)에 결합된 천연 활성화제(Z)를 포함하고, 식 (X-Y)m-(Z)n-R(여기서 Y는 O 또는 NH이고, R은 NH₂ 또는 OH이고, m 및 n은 1 내지 3의 정수 중에서 독립적으로 선택된다)로 나타낸 구조를 갖는 항염 결합체를 유효 성분으로 포함하는 것이다.

상기 파이토케미컬 분획(X)은 일례로, 갈릭산, 카페익산, 페루릭산, 쿠마릭산, 또는 이들의 조합일 수 있고, 강한 항산화효과를 고려할 때 카페익산을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 결합체는 상기 파이토케미컬 분획(X)과 천연 활성화제(Z)를 부착시키는 1종 이상의 링커(Y)를 함유한다. 링커(Y)는 1종 이상의 파이토케미컬 분획(X)과 1종 이상의 천연 활성화제(Z)에 결합되어 결합체를 형성한다. 링커(Y)는 에스터 결합, 디설파이드, 아미드, 아실하이드라존, 에테르, 카바메이트, 카보네이트 또는 우레아로부터 독립적으로 선택된 작용기에 의해 파이토케미컬 분획(X) 및 천연 활성화제(Z)에 부착된다.

상기 결합체는 적어도 1종의 천연 활성화제(Z)를 포함한다. 결합체는 동일하거나 다른 1종 초과의 천연 활성화제(Z)를 포함할 수 있다. 상기 천연 활성화제는 치료제, 예방제, 진단제, 영양제일 수 있고, 특히 본 발명에서는 상기 파이토케미컬 분획의 용해도와 활성 증진제의 역할을 포함할 수 있다. 일 구현예에서 상기 천연 활성화제는 단백질, 펩타이드, 지질, 탄수화물, 당, 핵산 또는 이들의 조합일 수 있다.

구체적인 예로, 상기 천연 활성화제(Z)는 펩타이드이고, 상기 식 중 (Z)n은 하기 식 2 내지 식 4로 나타낸 구조 중에서 선택된 구조인 것이 바람직하다.

[식 2] AA1-His

[식 3] His-AA2

[식 4] AA1-His-AA2

상기 식들 중에서, AA1 및 AA2는 각각 독립적으로 20종의 아미노산으로 구성된 군에서 선택된 펩타이드이다. 다른 예로, 상기 AA1 및 AA2는 각각 독립적으로 알라닌(Ala), 시스테인(Cys), 페닐알라닌(Phe), 리신(Lys), 프롤린(Pro) 및 세린(Ser) 중에서 선택된 1종일 수 있다.

본 발명에 따른 항염 결합체는 하기 화학식 1로 나타내는 구조를 포함하는 것이 바람직하다:

[식 1]

상기 식에서, R₁, R₄ 및 R₅는 각각 독립적으로 H, OH, C₁-C₆의 알킬기 또는 C₁-C₆의 알콕시기이고, R₂ 및 R₃는 OH이며, R은 NH₂ 또는 COOH이고, Y는 O 또는 NH이고, m은 1 내지 3의 정수이고, Z는 AA1-HiS, HiS-AA2 또는 AA1-HiS-AA2이고, 여기서 AA1 및 AA2는 각각 독립적으로 20종의 아미노산으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드이다.

본 명세서에서 C₁-C₆의 알킬기는 탄소수 1 내지 6개로 구성된 직쇄형 또는 분지형 탄화수소를 의미하며, 예를 들어 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸 등이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다. C₁-C₆의 알콕시기는 탄소수 1 내지 6개로 구성된 직쇄형 또는 분지형 알콕시기를 의미하며, 예를 들어 메톡시, 에톡시, n-프로판옥시 등이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 천연 활성화제의 일종인 펩타이드를 명명하는 일반적인 규칙은 달리 특정하지 않는 한 3문자 또는 1문자 아미노산 코드 적용을 기초로 한다. 다시 말해서, 아미노산 구조의 중심부를 3문자 코드(예를 들어, Ala, Lys) 또는 1문자 코드(예를 들어, A, K)로 표시하며, 3문자 코드의 앞에 "D-"를 적음으로써 D-입체형태(예를 들어, D-Ala, D-Lys)를, 그리고 달리 특정하지 않은 경우에는 L-입체형태로 가정한다. 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기는 천연 또는 비-천연아미노산 잔기가 모두 가능하다.

일 예로, 상기 R₁, R₄ 및 R₅는 서로 독립적으로 수소, OH 또는 C₁-C₄ 알콕시일 수 있다.

다른 예로, 상기 R₁, R₄ 및 R₅는 수소일 수 있다.

일 예로, Y는 O 또는 NH, 또는 이를 함유한 링커일 수 있다.

일 예로, m은 1 또는 2일 수 있다.

일예로, 상기 AA1 및 AA2는 각각 독립적으로 알라닌(Ala), 시스테인(Cys), 페닐알라닌(Phe), 리신(Lys), 프롤린(Pro) 및 세린(Ser)중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

다른 예로, 상기 Z는 프롤린-히스티딘(PH), 알라닌-히스티딘(AH), 시스테인-히스티딘(CH), 페닐알라닌-히스티딘(FH), 리신-히스티딘(KH), 세린-히스티딘(SH), 히스티딘-프롤린(HP), 히스티딘-알라닌(HA), 히스티딘-시스테인(HC), 히스티딘-페닐알라닌(HF), 히스티딘-리신(HK), 히스티딘-세린(HS), 프롤린-히스티딘-리신(PHK), 리신-히스티딘-프롤린(KHP), 알라닌-히스티딘-리신(PHK), 리신-히스티딘-알라닌(KHP), 시스테인-히스티딘-리신(CHK), 리신-히스티딘-페닐알라닌-시스테인(KHFC), 리신-히스티딘-리신(KHK), 세린-히스티딘-리신(SHK), 세린-히스티딘-세린(SHS), 프롤린-히스티딘-프롤린(PHP), 히스티딘-프롤린-리신(HPK), 히스티딘-알라닌-리신(HAK), 히스티딘-시스테인-리신(HCK), 히스티딘-페닐알라닌-리신(HFK), 히스티딘-리신-리신(HKK) 및 히스티딘-세린-리신(HSK)의 아미노산 서열로 구성된 그룹 중에서 선택된 펩타이드일 수 있다.

또 다른 예로, 상기 Z는 프롤린-히스티딘(PH), 히스티딘-프롤린(HP), 프롤린-히스티딘-리신(PHK) 및 히스티딘-프롤린-리신(HPK)의 아미노산 서열로 구성된 그룹 중에서 선택된 펩타이드일 수 있다.

다른 예로, 상기 Z의 N 말단에 카페익산기가 결합될 수 있다.

또 다른 예로, 상기 Z의 C 말단에 NH₂ 또는 OH기가 결합될 수 있다. 여기서 OH기는 고체상 합성에서 수지의 절단(cleavage)시 COO가 제거된 다음 잔기를 고려할 때 카복실기를 지칭한다. 참고로, NH₂기는 고체상 합성에서 수지로부터 절단시 CONH가 제거된 이후 잔기를 고려할 때 아마이드기를 지칭한다.

본 발명의 항염 결합체는 예를 들면 다음과 같은 순서로 제조될 수 있다.

우선, 특정 펩타이드를 먼저 레진상에서 합성한 다음, 카페익산과 커플링 반응시켜 제조할 수 있다. 상기 특정 펩타이드는 두개 이상의 아미노산이 펩타이드 결합(peptide bond)이라는 화학결합 형태로 연결된 물질로서, 본 발명에 따른 카페익산-펩타이드 결합체의 고효율 생산을 위하여, 고체상 합성 플랫폼을 기반으로 하는 고체상 펩타이드 합성법(Solid-Phase Peptide Synthesis; SPPS)을 이용한다. 이를 위해 불용성 폴리스티렌 레진에 보호기를 가지고 있는 아미노산을 이용해 특정 펩타이드를 우선 합성한 후, 이를 합성 지지체에서 분리하지 않고, 직접 카페익산을 화학적으로 합성한 후, 결합되지 않은 카페익산을 반응체에서 제거하는 방법을 플랫폼으로 개발한데 특징이 있다.

상기 특정 펩타이드는 생체 내의 단백질을 추출한 다음 단백질 분해효소로 처리하여 저분자량화하거나, 유전자 재조합과 단백질 발현시스템을 이용하여 제조할 수도 있고, 바람직하게는 펩타이드 합성기 등을 이용한 화학 합성 방법으로 제조할 수도 있다.

본 발명에 따른 결합체는 예를 들어, (1) 통상의 고체상 펩타이드 합성법(solid phase peptide synthesis: SPPS)에 의해 -NH₂ 말단의 펩타이드-레진을 수득하는 단계; (2) 수득된 -NH₂ 말단의 펩타이드-레진을 카페익산과 반응시키는 단계; 및 (3) 레진을 제거하는 단계를 포함하여 제조할 수 있다.

이때 목적하는 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기의 측쇄에 작용기가 존재하는 경우에는 상기 단계 (1)에서 상기 작용기가 보호된 아미노산을 사용하여 펩타이드를 합성할 수 있으며, 상기 작용기에 결합된 보호기는 상기 단계 (3)에서 제거된다.

작용기가 보호된 아미노산을 사용한 본 발명에 따른 결합체의 제조과정의 구체적인 반응 메커니즘은 다음 반응식 1(펩타이드의 C-말단이 아마이드인 반응 메카니즘) 또는 반응식 2(펩타이드의 C-말단이 카복실기인 반응메카니즘)로 도식화될 수 있다:

[반응식 1]

[반응식 2]

이상 제시한 방법에 대하여 단계별로 살펴보면 다음과 같다.

우선, a) 고체상 합성법으로 보호기, 링커 및 천연 활성화제의 치환자리를 갖는 수지 지지체를 제조한다. 일례로, 상기 a) 단계에서 수지 지지체의 원료는 다음 식 5 또는 식 6으로 나타낼 수 있다.

[식 5]

[식 6]

이와 같은 원료를 사용하여 a) 단계에서 제조된 수지 지지체는 하기 식 7 또는 식 8로 나타내어질 수 있다.

일례로, 하기 식 7의 지지체는 상기 식 5의 원료를 사용하여 도출된 수지 지지체에 해당하고, 하기 식 8의 지지체는 상기 식 6의 원료를 사용하여 도출된 수지 지지체에 해당한다. 여기서 고체상 합성법으로는 당업계 공지된 기술을 다양하게 적용하여도 무방하며, 상기 반응식 1,2에 제시된 방식 또한 일례로서 이에 한정되는 것은 아니다.

[식 7]

[식 8]

상기 a) 단계는 6-클로로-1-히드록시벤조티아졸(HOBt), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt), 3-히드록시-3,4-디히드록-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진(HOOBt), HOSu(N-hydroxysuccinimide), p-nitrophenol, -Cl 및 -Br로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1 이상이 결합된 활성화제 및 N,N'-디이소프로필에틸아민(DIPEA) 하에 수행되는 것이 반응의 효율상 바람직하다.

그런 다음 b) 상기 수지 지지체에 보호기와 OH기로 양 말단이 각각 캡핑된 구조를 갖는 천연 활성화제를 추가하여 개질시킨다. 상기 b) 단계에서 추가하는 천연 활성화제는 일례로 20종의 아미노산으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드이고, N-말단이 보호기로 캡핑되고 C-말단이 OH 구조를 갖는 것이 개질 효율을 고려할 때 바람직하다.

상기 b) 단계 또한 반응 효율상 6-클로로-1-히드록시벤조티아졸(HOBt), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt), 3-히드록시-3,4-디히드록-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진(HOOBt), HOSu(N-hydroxysuccinimide), p-nitrophenol, -Cl 및 -Br로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1 이상이 결합된 활성화제 및 N,N'-디이소프로필에틸아민(DIPEA) 하에 수행되는 것이 좋다.

이어서, 상기 c) 개질된 수지 지지체에 파이토케미컬 분획(X)를 투입하고 상기 보호기 자리에 파이토케미컬 분획(X)을 구비하도록 추가 개질시킨다. 상기 c) 단계 또한 반응 효율을 고려하여 6-클로로-1-히드록시벤조티아졸(HOBt), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt), 3-히드록시-3,4-디히드록-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진(HOOBt), HOSu(N-hydroxysuccinimide), p-nitrophenol, -Cl 및 -Br로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1 이상이 결합된 활성화제 및 N,N'-디이소프로필에틸아민(DIPEA) 하에 수행되는 것이 바람직하다.

그런 다음 d) 추가 개질된 수지 지지체에서 수지를 분리 제거하고, 필요에 따라 결합체에서 미결합된 파이토케미컬 분획을 회수하여 반응을 종료하여 항염 결합체를 제공할 수 있다.

본 발명은 상기 항염 결합체를 유효성분으로 하고, 적어도 1종의 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약제학적 제형, 특히 피부 가려움 방지 또는 완화효과를 나타내는 조성물을 제공할 수 있다.

상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화한 것일 수 있다. 제제화 용도에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 경구투여용 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 단순한 부형제외에도 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

경구용 액상 제제에는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 단순 희석제인 물 또는 리퀴드 파라핀 이외에 여러 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여용 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식으로는 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 기관지내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사 등을 들 수 있다.

상기 항염 결합체는 일례로 전체 조성물 100 중량부에 대하여 1 내지 10 중량부로 함유될 수 있고, 5 내지 10 중량부로 함유되는 것이 약효를 고려할 때 적절할 수 있다. 만약, 상기 화합물이 상기 범위를 벗어나 소량으로 함유되면 약효 발생이 저하될 가능성이 있는 반면, 다량으로 함유되면 복통, 설사, 오심, 구토와 같은 부작용이 야기될 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.

상기 항염 결합체를 이용하여 아토피 치료 또는 피부 소양증 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 본 발명에 따른 항염 결합체의 치료적 유효량은 당업계에서 알려진 기술을 사용하여 동물 실험 등의 in vivo 데이터로부터 산정될 수 있다. 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 동물 데이터에 기초하여 사람에 대한 투여를 용이하게 최적화할 수 있다. 정확한 산정, 투여 루트 및 투여량은 환자의 상태를 고려하여 개개의 의사에 의해 선택될 수 있다. 통상적으로, 환자에게 투여되는 조성물의 선량 범위는 환자 체중의 약 0.5 내지 1000 mg/kg 일 수 있다. 투여량은, 환자에게 요구되는 정도에 따라, 한 번에 또는 하루 또는 그 이상의 과정으로 일련의 둘 또는 그 이상으로 제공될 수도 있다. 또한, 본 발명에 따른 항염 결합체의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　

본 발명은 상기 항염 결합체를 포함하는 피부질환 개선용 건강식품을 제공할 수 있다.

본 발명은 상기 항염 결합체를 유효성분으로 포함하며, 상기 염증성 사이토카인인 TSLP, IL-13, IL-25, IL-33에 대한 발현 억제, 감소용 다양한 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 항염 결합체는 피부에 안전하면서도 동시에 온도 변화 등에도 안정성이 뛰어나 아토피, 소양증 치료 등의 항염 용도의 소재에 유용하다.

본 발명은 상기 항염 결합체를 이용한 염증 완화, 치료, 예방 방법 또는 아토피 치료 또는 예방 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 항염 결합체를 이용한 피부 가려움 방지 또는 완화 방법을 제공한다.

상기 방법들의 구체적인 단계로, 상기 결합체 자체 또는 적절한 공지의 투여 방법(예컨대, 피부에 도포, 경구투여, 정맥내 투여 등)을 이용해 대상에 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 항염 결합체의 함량은 일례로 50 내지 200,000ppm 수용액의 중량으로서 0.005 내지 40중량% 혹은 0.01 내지 30 중량%인 것이 바람직하다.

본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 하기에 제시한다. 그러나 이러한 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

<실험 준비>

1) 쥐: ICR 6주령 암컷 생쥐를 사용하였다. 사이토카인 TSLP의 발현을 증가시키기 위해 한쪽 귀는 4 nmole/㎠ 농도의 MC903을 다른 한쪽 귀에는 에탄올을 하루에 한 번씩 발라 주었다. CA-PH와 덱사메타손을 처리할 때에는 14일 동안 MC903을 발라준 후 5 nmole/㎠ 농도의 CA-PH와 2 nmole/㎠ 농도의 덱사메타손을 각 각 하루에 두 번씩 발라 주었다.

2) 세포배양: 사람의 각질세포인 HaCaT keratinocyte를 10% fetal bovine serum (FBS) 와 100 units/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지에 적정 습도와 5% CO2가 유지되는 37℃ 배양기에서 배양하였다. TSLP 유전자 발현 조사를 위해 12개의 웰에 계대하여 TNFα (50ng/ml)를 처리하였다. 1시간 후 같은 배지에 하기 제조예 1에서 제조된 항염 결합체를 처리하고 추가로 1시간 배양하였다.

3) RNA 추출 및 실시간 PCR: RNAiso Plus (TAKARA, Japan)를 이용하여 RNA를 추출하였다. cDNA 합성 키트 (TAKARA, JAPAN)을 이용하여 cDNA를 합성하였고 합성된 cDNA와 Sybrgreen 키트 (Enzynomics, Korea)를 이용하여 중합반응을 수행하였다. 사용한 프라이머는 human GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) forward, 5'-CAC CCA CTC CTC CAC CTT TGA C-3'(서열번호 1), reverse, 5'-GTC CAC CAC CCT GTT GCT GTA G-3' (서열번호 2)(112bp), human TSLP forward, 5'-AAT CCA GAG CCT AAC CTT CAA TC-3'(서열번호 3), reverse, 5'-GTA GCA TTT ATC TGA GTT TCC GAA TA-3'(서열번호 4)(97bp), human IL-13 forward, 5'-CCT CAT GGC GCT TTT GTT GAC-3'(서열번호 5), reverse, 5'-TCT GGT TCT GGG TGA TGT TGA-3'(134bp)(서열번호 6), human IL-25 forward, 5'-GTA CCA GGT CAG TGC AGA GG-3'(서열번호 7), reverse, 5'-CAG TTT CTC ACT CCA CTT GG-3'(서열번호 8)(128bp), human IL-31 forward, 5'-CAC GTT GCC CGT CCG TTT A-3'(서열번호 9), reverse, 5'-TCT TCG AGA GGG ACT GTA ATT CC-3'(서열번호 10)(77bp)를 사용하였다. GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 internal control로 사용하였다.

<제조예 1>

(1) 폴리스티렌 레진을 이용한 고체상 펩타이드 합성

고체상 합성법을 이용하여, 링크아마이드 링커가 도입된 AM 폴리스티렌 레진 상에 2당량의 Fmoc-아미노산을 커플링 시약 BOP(benzotriazol-1-yloxy-tris(dimethylamino)-phosphonium hexaflyoro-phosphate), HOBt(1-hydroxybenzotriazole) 및 DIEA(Diisopropylethylamine)와 N-메틸피롤리돈(NMP, N-methylpyrrolidone) 하에서 2시간 동안 반응시켰다.

그런 다음 20% 피페리딘/NMP를 각각 3분, 7분씩 2회 처리하고 Fmoc 보호기를 제거하였다.

그런 다음 해당 Fmoc-아미노산을 이용, 위 방법을 레진 상에서 반복하여, 프롤린-히스티딘(PH), 알라닌-히스티딘(AH), 시스테인-히스티딘(CH), 페닐알라닌-히스티딘(PH), 리신-히스티딘(KH), 세린-히스티딘(SH), 히스티딘-프롤린(HP), 히스티딘-알라닌(HA), 히스티딘-시스테인(HC), 히스티딘-페닐알라닌(HP), 히스티딘-리신(HK), 히스티딘-세린(HS), 프롤린-히스티딘-리신(PHK), 리신-히스티딘-프롤린(KHP), 알라닌-히스티딘-리신(PHK), 리신-히스티딘-알라닌(KHP), 시스테인-히스티딘-리신(CHK), 리신-히스티딘-페닐알라닌-시스테인(KHC), 리신-히스티딘-리신(KHK), 세린-히스티딘-리신(SHK), 세린-히스티딘-세린(SHS), 프롤린-히스티딘-프롤린(PHP), 히스티딘-프롤린-리신(HPK), 히스티딘-알라닌-리신(HAK), 히스티딘-시스테인-리신(HCK), 히스티딘-페닐알라닌-리신(HPK), 히스티딘-리신-리신(HKK), 히스티딘-세린-리신(HSK)을 각각 합성하였다.

(2) 천연 활성화제가 도입된 새로운 결합체의 제조

상기 제조예 1 중 (1) 항목의 폴리스티렌 레진 상에서 제조한 펩타이드 합성체 중에서 선택된 1종에 Fmoc-아미노산과 같은 방식으로 카페익산을 도입하되 반응시간을 5시간으로 하여 신규 결합체들을 제조하였다(하기 화학식 1에서 R₁, R₄ 및 R₅는 수소이고, R₂ 및 R₃는 OH이고, R은 NH₂이고, Y는 NH이고, Z은 프롤릴-히스티딘(PH) 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로서, 상기 Z의 N 말단에 카페오일기가 결합되고, m은 1에 해당).

[식 1]

이어서 95% 트리플루오르아세트산(TFA)/디클로로메탄(DCM)으로 처리하여 목표 물질을 상기 레진에서 분리한 후, 에테르를 이용하여 침전시켜 결합체를 수율 60~80%로 수득하였다.

실시예 1

상기 제조예 1의 (2) 항목에서 수득한 결합체들을 HPLC를 사용하여 순도를 확인한 결과 79%의 순도를 보이는 단일 순수 물질임을 확인하였고, ESI-MS를 사용하여 질량 분석한 결과 계산값은 414.41([M+H]+)이었고 실제값은 409.18로서 동등 내지 유사한 값을 보이는 점으로부터 카페익산-펩타이드 결합체인 것을 확인하였다. 참고로, 계산 결과가 원래의 분자량보다 많은 것은 양이온화된 상태 때문인 것으로 예측된다.

실시예 2

<항염 결합체의 염증성 사이토카인 수용체(TSLP, 인터루킨)에 대한 발현능 테스트>

TSLP 유전자 발현을 증가시키는 조건을 세포 수준에서 재현하기 위해 TNFα를 인간 피부상피 각질세포 (keratinocyte)인 HaCaT에 각각 처리하여 TSLP 발현을 유도하였다.

이어서 상기 실시예 1에서 확인된 결합체를 처리하였다. 구체적으로 HaCaT keratinocyte에서 TNFα 처리에 의해 증가되었던 사이토카인 발현이 실시예 1의 결합체 처리에 의해 감소되는 것을 Real time PCR 방법으로 측정하여 확인하였다(도 1 참조). 도 1에서 보듯이, 사이토카인들인 TSLP, interleukin 13, 25, 31 (IL-13, IL-25, IL-31)의 발현이 RNA수준에서 모두 유의하게 감소한 것을 확인하였다.

실시예 3

<항염 결합체의 아토피 피부염 증상 완화능 테스트>

화학식 1의 결합체가 아토피 피부염 치료제로서 효능을 확인하는데 MC-903 아토피 피부염 생쥐 모델을 이용하였다. MC903 (Calcipotriol)은 비타민 D3 유사체로서 가려움증을 유발하는 사이토카인 TSLP의 발현을 증가시키는 것으로 알려진 물질이다.

구체적으로, 쥐 모델의 귀 안쪽에 MC903을 4 nmole/㎠ 농도로 하루에 한 번씩 14일 동안 바른 결과, 아토피 피부염 증상, 즉 귀가 붓고 혈관이 확장되어 빨갛게 변했고, 긁는 행동으로 인한 상처가 많이 생겼다.

이러한 방식으로 MC903을 14일간 바르고 15일째부터 실시예 1의 결합체 혹은 양성대조군인 덱사메타손을 처리하였으며 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 보듯이, 실시예 1의 결합체의 경우 양성대조군인 덱사메타손과 유사하게 증상이 완화되어 5일째에는 정상적인 형태를 보이는 것을 확인하였다.

실시예 4

<항염 결합체의 항산화능 테스트>

화학식 1의 결합체에 대하여, DPPH 자유 라디칼 소거능과 지방 자가산화 억제능 테스트를 각각 수행하였다(도 3 참조). 도 3에서 보듯이, DPPH 자유 라디칼 소거능과 리피드 퍼옥시데이션 테스트에서 본건 제조예의 화학식 1로 표시되는 결합체가 탁월한 항산화 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

실시예 5

화학식 1의 결합체의 ROS에 의한 혈관 평활근 세포(vascular smooth muscle cells, VSMC) 증식 억제 기전을 도 4에 나타내었다. 도 4의 A. 항목에서 백색 막대는 혈소판 유래 성장인자(platelet derived growth factor, PDGF) 처리 전, 흑색 막대는 PDGF 처리 후를 각각 나타내며, Control은 무처리 버퍼를 나타낸다.

구체적으로 혈관 평활근 세포 VSMC을 기아 상태로 100nM의 카페익산과 본건 화학식 1의 결합체로 각각 24hr 처리한 다음 10ng/ml의 PDGF를 처리하였다. 세포를 채취하고 방법 (B)에 기재된 바와 같이 BrdU 분석 및 ROS 생성 (A) 및 웨스턴 블롯팅을 수행하고 PCNA, pAkt 및 Akt 발현을 평가하였다. 3 회 독립 실험에서 추출된 데이터를 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 대조군 대비 유의수준 *P는 0.05 미만이었다. PDGF-, 비히클 처리 세포와 비교하여 유의수준 ##P는 0.001 미만이었다.

결과, 도 4의 A 그래프에서 보듯이, PDGF 미처리시에도 세포 증식과 ROS 발생을 조금 억제하였으나, PDGF 처리 후 확연하게 억제하는 것을 확인할 수 있고, Control과 비교하면 거의 2배에 가까운 억제 효과를 확인할 수 있다.

또한, 도 4의 B. 항목에서 보듯이, 화학식 1의 결합체 처리후 PCNA(Proliferating cell nuclear antigen, transcription factor for cell proliferation)와 AKT의 인산화가 확연히 줄어든 것을 확인하였다.

제형예

<주사제 제조>

실시예 1의 결합체 10 mg, 소디움 메타비설파이트 3.0 mg, 메틸파라벤 0.8 mg, 프로필파라벤 0.1 mg 및 주사용 멸균증류수 적량을 혼합하고 통상의 방법으로 최종 부피가 2㎖이 되도록 제조한 후, 2㎖ 용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.

<정제 제조>

실시예 1의 결합체 10 mg, 유당 100 mg, 전분 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 적량을 혼합하고 통상의 정제 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.

<캡슐 제조>

실시예 1의 결합체 10 mg, 유당 50 mg, 전분 50 mg, 탈크 2 mg 및 스테아린산 마그네슘 적량을 혼합하고 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<건강식품 제조>

실시예 1의 결합체 0.5 mg, 비타민 혼합물 적량(비타민 A 아세테이트 70 ㎍, 비타민 E 1.0 mg, 비타민 B 1 0.13 mg, 비타민 B 2 0.15 mg, 비타민 B 6 0.5 mg, 비타민 B 12 0.2 ㎍, 비타민 C 10 mg, 비오틴 10 ㎍, 니코틴산아미드 1.7 mg, 엽산 50 ㎍, 판토텐산 칼슘 0.5 mg) 및 무기질 혼합물 적량(황산제1철 1.75 mg, 산화아연 0.82 mg, 탄산마그네슘 25.3 mg, 제1인산칼륨 15 mg, 제2인산칼슘 55 mg, 구연산칼륨 90 mg, 탄산칼슘 100 mg, 염화마그네슘 24.8 mg)을 혼합한 다음 과립을 제조하고 통상의 방법에 따라 건강식품을 제조하였다.

<110> BeadTech, Inc. Sogang University Research & Business Development Foundation <120> Composition for preventing or treating skin disease Inflammatory and method for preparing thereof <130> SDP2018-1025 <150> KR 10-2017-0040166 <151> 2017-03-29 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 1 cacccactcc tccacctttg ac 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 2 gtccaccacc ctgttgctgt ag 22 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSLP forward primer <400> 3 aatccagagc ctaaccttca atc 23 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSLP reverse primer <400> 4 gtagcattta tctgagtttc cgaata 26 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-13 forward primer <400> 5 cctcatggcg cttttgttga c 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-13 reverse primer <400> 6 tctggttctg ggtgatgttg a 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-25 forward primer <400> 7 gtaccaggtc agtgcagagg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-25 reverse primer <400> 8 cagtttctca ctccacttgg 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-31 forward primer <400> 9 cacgttgccc gtccgttta 19 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-31 reverse primer <400> 10 tcttcgagag ggactgtaat tcc 23

Claims

유효 성분으로 하기 화학식 1로 나타낸 구조를 포함하는 항염 결합체; 및
약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및 희석제로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하고,
상기 항염 결합체는 흉선간질성림프구신생인자(TSLP)의 발현을 억제하는 것인 아토피 또는 피부 소양증 예방 또는 치료용 조성물:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서
R₁, R₄ 및 R₅는 각각 독립적으로 수소, OH, C₁-C₆의 알킬기 또는 C₁-C₆의 알콕시기이고;
R₂ 및 R₃는 OH이며;
R은 NH₂ 또는 OH이고;
Y는 O 또는 NH이고;
m 및 n은 각각 독립적으로 1 내지 3의 정수이고;
Z는 AA1-His, His-AA2 또는 AA1-His-AA2이고, 여기서 AA1 및 AA2는 각각 독립적으로 20종의 아미노산으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상이다.
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제1 항에 있어서,
상기 AA1 및 AA2는 각각 독립적으로 알라닌(Ala), 시스테인(Cys), 페닐알라닌(Phe), 리신(Lys), 프롤린(Pro) 및 세린(Ser) 중에서 선택된 1종인 조성물.
제1 항에 있어서,
상기 R₁, R₄ 및 R₅는 수소인 것인 조성물.
제1 항에 있어서,
상기 Z는 AA1-His인 것인 조성물.
제1 항에 있어서,
상기 항염 결합체는 인터루킨-13(IL-13), 인터루킨-25(IL-25) 및 인터루킨-33(IL-33)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 발현을 억제하는 것인 조성물.
제1 항에 있어서,
경구제, 주사제, 좌제 또는 외용제의 형태로 제형화된 것인 조성물.
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