CN110621349A

CN110621349A - 甲氨蝶呤和肽的偶联物

Info

Publication number: CN110621349A
Application number: CN201880031177.4A
Authority: CN
Inventors: 郑镕池; 金银美; 金先洙
Original assignee: Kergorn Co Ltd
Current assignee: Kergorn Co Ltd
Priority date: 2017-05-11
Filing date: 2018-05-11
Publication date: 2019-12-27
Anticipated expiration: 2038-05-11
Also published as: BR112019023587A2; KR20180124412A; US11253604B2; US20210236648A1; EP3613437A1; JP7018075B2; WO2018208125A1; CN110621349B; JP2020519623A; KR102095284B1; EP3613437A4

Abstract

本发明涉及一种化合物以及包含该化合物的抗癌或抗炎药物组合物，所述化合物具有甲氨蝶呤和肽通过共价键相连的结构。本发明所述的具有甲氨蝶呤和肽通过共价键相连的结构的化合物具有优异的生物活性，例如抗癌或抗炎作用，并且对细胞的毒性显著降低，因此可有利地用于各种领域，例如用于医药和医疗用品。

Description

甲氨蝶呤和肽的偶联物

技术领域

本发明涉及一种化合物及其应用，所述化合物具有甲氨蝶呤和肽通过共价键相互连接的结构。

背景技术

甲氨蝶呤(MTX)是治疗各种儿童癌症(包括急性淋巴细胞白血病、骨肉瘤和非霍奇金淋巴瘤)最常用的药物，并且被用作急性淋巴细胞白血病的巩固和维持治疗中的重要药物。甲氨蝶呤是一种代谢拮抗剂，并且是一种通过与二氢叶酸还原酶(该还原酶是将二氢叶酸(FH2)转化为四氢叶酸(FH4)所必需的酶)结合而表现出抗增殖细胞毒性作用的药物，其抑制FH4的生成，从而抑制DNA、RNA和蛋白质的合成。当甲氨蝶呤以高剂量施用时，90％的剂量是从尿液排泄的，因此甲氨蝶呤的排泄与肾功能密切相关。由于甲氨蝶呤施用后的延迟排泄增加了因药物累积导致副作用的可能性，因此在施用后监测药物浓度非常重要。甲氨蝶呤施用后可能发生的常见副作用是肝毒性、肾毒性、血液学毒性、口腔炎和神经症状等，报告的毒性死亡率约为5％至6％。甲氨蝶呤与聚谷氨酸(例如叶酸)结合存在于细胞中。

此外，已知甲氨蝶呤可用于治疗炎性疾病。在这方面，韩国专利待审查公开No.2009-0079876披露了甲氨蝶呤溶液用于治疗炎性自身免疫性疾病；韩国专利待审查公开No.2007-0100261披露了一种治疗炎症的方法，该方法包括施用有效量的甲氨蝶呤和A3腺苷受体激动剂(A3AR激动剂)的组合；韩国专利待审查公开No.2007-0083862披露了一种用于治疗自身免疫性疾病的经皮施用的药物组合物，其包含甲氨蝶呤和蛋白转导结构域(PTD)的偶联物，以及辅料；韩国专利待审查公开No.2002-0032079披露了一种用于治疗关节炎的经皮施用的组合物，其含有甲氨蝶呤作为有效组分。

然而已知的是，使用这样的甲氨蝶呤可能会引起副作用，例如骨髓破坏、因过度出血而导致斑块破坏、消化器官出血、胃肠道穿孔、脱发、肝肾功能受损等。

因此，需要开发能够减少具有上述特征的甲氨蝶呤的副作用、并进一步增强其生理功效的新的化合物。

发明内容

技术问题

本发明旨在对上述的常规甲氨蝶呤的问题加以改进，本发明的一个技术目的是提供一种新的甲氨蝶呤衍生化合物，与天然甲氨蝶呤相比，该化合物具有相同或更优的生理活性，并且副作用减少。

技术方案

为了实现上述目的，本发明提供了这样的化合物，该化合物具有甲氨蝶呤和肽通过共价键相互连接的结构。

根据本发明的一个实施方案，所述肽可由2-30个、优选5-20个、更优选8-15个、更优选10-12个的氨基酸序列组成，但是不限于此。

根据本发明的另一实施方案，所述肽优选(但不限于)水溶性肽。根据本发明的优选实施方案，优选的是，所述水溶性肽中具有亲水性侧链的氨基酸的比例高达50％或更高、优选60％或更高、更优选70％或更高、更优选80％或更高、更优选90％或更高、最优选100％。根据本发明的另一优选实施方案，所述水溶性肽中具有疏水性侧链的氨基酸为5个或更少、优选4个或更少、更优选3个或更少、更优选2个或更少、更优选1个或更少、最优选根本没有。

根据本发明的另一实施方案，所述肽可为由SEQ ID NO:1的氨基酸序列构成的肽，但是不限于此。另外，本发明提供一种抗癌或抗炎药物组合物，其包含以上所述的化合物中的任意一者。

根据本发明的一个实施方案，所述药物组合物可配制成口服制剂的形式使用，例如为粉剂、颗粒、片剂、胶囊、悬浮液、乳剂、糖浆、外用制剂、栓剂和无菌注射液，但是不限于此。

有益效果

本发明所述的具有甲氨蝶呤和肽通过共价键相连的结构的化合物具有优异的生理活性，例如抗癌或抗炎作用，并且对细胞的毒性显著降低，因此可有利地用于各种领域，例如用于医药和医疗用品。

附图说明

图1A和1B是示出根据本发明的化合物和甲氨蝶呤对成纤维细胞和角质形成细胞的细胞增殖的影响的图。

图2和3是RT-PCR电泳照片，其示出了根据本发明的化合物和甲氨蝶呤对脾细胞和角质形成细胞中炎症相关基因的表达的影响。

图4A和4B是流式细胞术(FACS)的图，其示出了根据本发明的化合物和甲氨蝶呤对脾细胞中IL-17阳性细胞群的影响。

图5A和5B是流式细胞术(FACS)的图，其示出了根据本发明的化合物和甲氨蝶呤对巨噬细胞系中TNF-α阳性细胞群的影响。

图6是流式细胞术(FACS)的图，其示出了根据本发明的化合物和甲氨蝶呤对脾细胞中的活化免疫和APC阳性细胞群的影响。

图7是示出本发明的化合物和甲氨蝶呤对脾细胞中炎性细胞因子的表达的影响的图表。

图8是示出本发明的化合物和甲氨蝶呤对角质形成细胞系中基质金属蛋白酶(MMP)活性的影响的电泳照片和图。

具体实施方式

甲氨蝶呤表示式C₂₀H₂₂N₈O₅的化合物，其具有由以下化学式表示的化学结构：

[化学式]

如本文所用，术语“肽”是指氨基酸通过肽键相互连接而形成的线性分子。可以根据本领域已知的常规生物或化学合成方法、特别是固相合成技术来制备肽(参见文献：Merrifield,J.Amer.Chem.Soc.,85:2149-54(1963)；Stewart et al.,Solid PhasePeptide Synthesis,2nd ed.,Pierce Chem.Co.Rockford,111(1984))。

所述肽优选(但不限于)水溶性肽。根据本发明的一个实施方案，肽由2-30、优选5-20、更优选8-15、更优选10-12个氨基酸组成。根据本发明的优选实施方案，优选的是，所述肽中具有亲水性侧链的氨基酸的比例高达50％或更高、优选60％或更高、更优选70％或更高、更优选80％或更高、更优选90％或更高、最优选100％。另一方面，优选的是，所述肽中具有疏水性侧链的氨基酸的比例低至小于50％、优选40％或更少、更优选30％或更少、更优选20％或更少、更优选10％或更少、最优选0％。如本文所用，术语“具有亲水性侧链的氨基酸”表示(但不限于)精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、半胱氨酸(Cys)、硒代半胱氨酸(Sec)、甘氨酸(Gly)和脯氨酸(Pro)；术语“具有疏水性侧链的氨基酸”表示(但不限于)丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)；而且，除了上述存在于自然界中的氨基酸以外，还可以不受限制地使用其修饰物。根据本发明的优选实施方案，所述肽中具有疏水性侧链的氨基酸为5个或更少、优选4个或更少、更优选3个或更少、更优选2个或更少、更优选1个或更少、最优选根本没有。根据本发明的一个实施方案，所述肽优选(但不限于)由SEQ ID NOs:1-4的氨基酸序列构成的肽。

根据本发明的一个实施方案，本发明的化合物与用作阳性对照组的甲氨蝶呤相比，表现出显著较低的细胞毒性(见图1)，并且还能显著降低细胞内炎症反应相关基因的表达(见图2和图3)。根据本发明的另一实施方案，本发明的化合物能显著降低IL-17、TNF-α、活化免疫和APC阳性细胞群的数目(见图4-6)。根据本发明的另一实施方案，本发明的化合物不仅能够显著减少炎性细胞因子IFN-γ和IL-17A的分泌(见图7)，而且还能显著降低MMP基因的表达(见图8)。

本发明的化合物本身具有优异的稳定性，但是可通过对构成键合于该化合物的肽的任何氨基酸进行修饰来进一步提高稳定性。根据本发明的一个实施方案，肽的N端可与选自由乙酰基、芴基甲氧基羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蔻基、硬脂基和聚乙二醇(PEG)组成的组中的保护基团结合，以进一步提高稳定性。根据本发明的另一实施方案，肽可与选自由乙酰基、芴基甲氧基羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蔻基、硬脂基和聚乙二醇(PEG)组成的组中的保护基团结合，以进一步提高稳定性。

如上所述的氨基酸修饰起到使本发明化合物的稳定性大大提高的作用。如本文所用，术语“稳定性”的含义不仅包括“体内”稳定性，而且包括“体外”稳定性，例如储存稳定性(例如室温储存稳定性)。此外，上述保护基团起到保护本发明的化合物在体内和体外免受蛋白质裂解酶攻击的作用。

另外，本发明提供一种抗癌或抗炎组合物，其包含所述化合物作为活性成分。在本发明中，该组合物可以为药物组合物的形式，但是不限于此。

由于本发明的组合物包含如上文所述的本发明的化合物作为活性成分，所以此处省略了二者之间共同的那些内容，以免本说明书过度复杂化。

根据本发明的优选实施方案，本发明的组合物为药物组合物，其包含：(a)药学有效量的上述本发明的化合物；和(b)药学可接受的载体。

如本文所用，术语“药学有效量”表示足以达到上述本发明化合物的效力或活性的量。

在本发明的一个实施方案中，癌的含义包括(但不限于)血液恶性肿瘤例如急性淋巴细胞白血病、骨肉瘤和非霍奇金淋巴瘤，还包括实体癌例如胃癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤、乳腺癌和子宫癌。此外，在本发明的另一实施方案中，本发明的药物组合物可用于预防或治疗与炎症反应相关的自身免疫性疾病。与炎症反应相关的自身免疫性疾病包括(但不限于)类风湿性关节炎、白塞病(Behcet’s disease)、克罗恩病、鼻炎、哮喘等。

本发明的药物组合物中所含的药学可接受的载体为制剂中常规使用的那些，其包括(但不限于)：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、金合欢胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。除上述成分以外，本发明的药物组合物还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。合适的药学可接受的载体和试剂的详细描述见《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences(1995年第19版))。

本发明的药物组合物可按照本领域技术人员容易实施的方法通过将本发明的化合物与药学可接受的载体和/或辅料相配而制成单位剂量的形式，或者通过将其加入多剂量容器中来制备。其中，制剂可以为油或含水介质中的溶液、悬浮液或乳液的形式，或者为提取物、粉剂、颗粒、片剂、胶囊或凝胶(例如水凝胶)的形式，并且还可以包含分散剂和/或稳定剂。

在临床施用时本发明的药物组合物可以口服施用或肠胃外施用，并且可以以一般药物制剂的形式使用。也就是说，在实际临床施用时本发明的药物组合物可以以各种口服制剂和肠胃外制剂的形式施用，并且在配药时采用通常所用的稀释剂或辅料(例如填料、增量剂、粘结剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂)来制备。用于口服施用的固体制剂包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒、胶囊等，这类固体制剂是通过将至少一种辅料(例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶)与草本提取物或草本发酵产物混合而制备的。除了简单的辅料以外，还使用润滑剂，例如硬脂酸镁和滑石粉。用于口服施用的液体制剂包括悬浮液、内用溶液、乳剂和糖浆等，除了含有常用的简单稀释剂(例如水和液体石蜡)以外，还可包含各种辅料，例如润湿剂、甜味剂、调味剂、防腐剂等。肠胃外给药的制剂包括无菌水溶液、非水溶液、悬浮液、乳剂、冻干制剂和栓剂。作为非水溶剂和悬浮液溶剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)、可注射的酯类(例如油酸乙酯)等。作为栓剂的基质，可使用合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇(macrogol)、吐温61、可可油酯、月桂酸甘油酯、甘油、明胶等。

剂量单位可以包含(例如)单次剂量的1、2、3或4倍、或者1/2、1/3或1/4倍。单次剂量包含一次施用的活性药物的量，通常对应于全部每日剂量、或者每日剂量的1/2、1/3或1/4倍。

本发明的药物组合物可按照本领域技术人员容易实施的方法通过将本发明的化合物与药学可接受的载体和/或辅料相配而制成单位剂量的形式，或者通过将其加入多剂量容器中来制备。其中，该制剂可以为油中或含水介质中的溶液、悬浮液或乳液的形式，或者为提取物、粉剂、颗粒、片剂、胶囊或凝胶(例如水凝胶)的形式，并且还可以包含分散剂和/或稳定剂。

例子

以下将通过例子对本发明进行详细描述。

但是以下例子仅用于说明本发明，本发明的内容并不限于以下例子。

实施例1.本发明化合物的合成

<1-1>SEQ ID NO:1肽的合成

将700mg氯三苯甲基氯树脂(CTL树脂；Nova biochem[0064]货号01-64-0021)置于反应容器中，然后将10ml亚甲基氯(MC)加入其中并搅拌3分钟。除去溶液后，将10ml二甲基甲酰胺(DMF)加入其中并搅拌3分钟，然后再次除去溶剂。将10ml二氯甲烷溶液置于反应器中，随后将200mmol的Fmoc-Trp-OH(Bachem，瑞士)和400mmol二异丙基乙胺(DIEA)加入其中并搅拌至充分溶解，然后在搅拌条件下反应1小时。在反应结束后，进行洗涤，并将甲醇和DIEA(2:1)溶于二氯甲烷(DCM)中，反应10分钟，然后用过量的DCM/DMF(1:1)进行洗涤。然后，除去溶液，将10ml二甲基甲酰胺(DMF)加入其中并搅拌3分钟，然后再次除去溶剂。将10ml脱保护溶液(20％哌啶/DMF)置于反应容器中，并在室温下搅拌10分钟，然后除去溶液。之后，将相同量的脱保护溶液加入其中使反应再维持10分钟，然后除去溶液，分别用DMF洗涤两次、用MC洗涤一次、用DMF洗涤一次，时间为3分钟，制成Trp-CTL树脂。

将10ml的DMF溶液置于新的反应器中，并将200mmol Fmoc-Leu-OH(Bachem，瑞士)、200mmol HoBt、200mmol Bop加入其中，然后搅拌至充分溶解。将400mmol DIEA分两次加入反应器中并搅拌至少5分钟，直到所有的固体都溶解。将溶解的氨基酸混合物溶液置于容纳有脱保护的树脂的反应容器中，在室温下搅拌反应1小时。除去反应溶液，并与DMF溶液一起搅拌三次，每次5分钟，然后除去。取少量反应后的树脂，采用Kaiser检测(茚三酮检测)来检查反应程度。与脱保护溶液按上述方式进行两次脱保护反应，制成Leu-Trp-CTL树脂。用DMF和MC对该树脂进行充分的洗涤，并再次进行Kaiser检测，以与上述相同的方式进行下面的氨基酸附接实验。

基于所选的氨基酸序列，以Fmoc-Asn(Trt)、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Asp(tBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Leu、Fmoc-Phe和Fmoc-Arg(Pbf)的顺序进行链反应。使Fmoc-保护基团与脱保护溶液反应两次，时间为10分钟，然后充分洗涤并除去。分别用DMF、MC和甲醇将制得的肽基树脂洗涤三次，并通过缓慢流动的氮气干燥，然后在P₂O₅上减压真空完全干燥，将30ml离去溶液(95％的三氟乙酸、2.5％的蒸馏水和2.5％的苯甲硫醚)加入其中，并在室温下偶尔摇动的条件下保持反应2小时。通过过滤将树脂滤出，并且用少量TFA溶液洗涤，然后与母液合并。采用减压蒸馏，使总体积剩下一半，将50ml冷醚加入其中以诱发沉淀，离心收集沉淀物，再用冷醚洗涤两次。除去母液并在氮气气氛下充分干燥后，合成了1.40g预纯化的肽RFLKRLDRNLW(SEQ ID NO:1)(收率：92.4％)。使用分子量测量仪进行测定，得到分子量为1516.7(理论值：1516.8)。

表1

<1-2>本发明化合物的合成

将肽基树脂(1mmol)和10ml的1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)置于肽反应器中，然后将270mg(2.0当量)的1-羟基苯并三唑(HOBt)、759mg(2.0当量)的N,N,N’,N’-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸酯、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯以及277mg(2.0当量)的甲氨蝶呤加入其中并且反应30分钟。将388mg(3当量)的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)加入其中并在室温下反应12-48小时，然后过滤，得到反应后的肽基树脂。在室温下将所得树脂使用裂解液反应2小时，然后除去树脂和保护基团，用10ml(10mmol)二乙醚进行重结晶，得到杂合肽。

实验例1.本发明化合物的细胞毒性试验

进行细胞增殖实验，来确认实施例<1-2>中合成的本发明的甲氨蝶呤-肽化合物对细胞毒性的影响。具体而言，将NIH3T3成纤维细胞系和HaCaT角质形成细胞系以1×10⁶个细胞/孔接种到96孔板中并进行培养，然后在第二天，分别用上述实施例<1-2>中制备的甲氨蝶呤-肽化合物和甲氨蝶呤以3.9-500μM的浓度进行处理。培养48小时后，通过采用Ez-cytox试剂盒(Daeillab/国内的)进行MTT分析，来确认化合物对细胞增殖的影响。

结果确认，作为阳性对照组的甲氨蝶呤对两个细胞系中的细胞增殖都产生抑制而表现出显著程度的细胞毒性，但是本发明的具有甲氨蝶呤和肽通过共价键相互连接的结构的化合物却没有表现出细胞毒性，其显示出与未处理的阴性对照组相似或更优的细胞增殖活性(图1A和1B)。

实验例2.本发明的化合物对炎症的抑制效果(1)

进行RT-PCR分析，来确认实施例<1-2>中合成的本发明的甲氨蝶呤-肽化合物对炎症反应的影响。具体而言，将6-7周龄的小鼠处死取出脾脏，用细胞过滤器将脾脏压碎，并与无血清RPMI-1640培养基一起离心。弃上清，用红细胞(RBC)裂解缓冲液两次去除红细胞。然后，用无血清RPMI-1640培养基进行洗涤，并向其中加入适量的无血清RPMI-1640培养基。测定细胞数，并将细胞接种于24孔板中(1×10⁷个细胞/皿)，然后在第二天，用实施例<1-2>中合成的本发明的甲氨蝶呤-肽化合物或甲氨蝶呤(5μM和50μM)，以及作为刺激剂的LPS(10nM)和IL-17(200ng/ml)进行处理。

在培养24小时后，采用RNA提取试剂盒(Qiagen RNeasy试剂盒)来提取总RNA，然后将3μg RNA、2μg随机六聚体和DEPC处理过的水加入其中，并在65℃下反应5分钟，以从RNA合成单链DNA。将5倍第一链缓冲液(5×first-strand buffer)、0.1M DTT、10mM dNTP和逆转录酶加入其中，使得总量为20ml，并在42℃下反应1小时。再在95℃下加热5分钟后，将20ml蒸馏水加入其中，制成最终为40ml的cDNA。如下表2所示，对于TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-17、IL-23、T-bet、GATA3和GAPDH基因，通过将各3μl的cDNA、10pmol引物、10×Tag缓冲液、10mMdNTP和i-Tag DNA聚合酶，从而进行聚合酶链反应(PCR)。PCR反应条件为94℃进行30秒、55℃至56℃进行30秒以及72℃进行30秒。在PCR结果能呈指数扩增的条件下，对循环数基因(cycle number genes)进行分析。使5ml所得的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，并且用溴化乙啶染色，以确认与炎症和自身免疫性疾病相关的TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-17、IL-23、T-bet、GATA3基因的mRNA水平。

表2

结果确认，与甲氨蝶呤相比，本发明的具有甲氨蝶呤和肽通过共价键相互连接的结构的化合物即使在低得多的浓度下，也能更显著地降低与炎症形成相关的基因的表达(图2)。

实验例3.本发明的化合物对炎症的抑制效果(2)

进行RT-PCR分析，来确认实施例<1-2>中合成的本发明的甲氨蝶呤-肽化合物对炎症反应的影响。为此，按照与以上实验例2相同的方式来进行RT-PCR，不同之处在于，采用HaCaT角质形成细胞系作为细胞系，并采用与银屑病发展相关的Keratin6A、Keratin16、Keratin5、Keratin14、S100A7、S100A8、S100A9和S100A12作为炎症相关基因，其中采用如下表3所示的引物作为基因特异性引物。

表3

结果确认，与甲氨蝶呤相比，本发明的具有甲氨蝶呤和肽通过共价键相互连接的结构的化合物不仅能够显著降低毒性，而且即使在低得多的浓度下，也能显著降低与银屑病发展相关的基因的表达，因此效果比甲氨蝶呤提高(图3)。

实验例4.本发明的化合物对IL-17A⁺/CD4⁺细胞群的影响

进行流式细胞术(FACS)，来确认实施例<1-2>中合成的本发明的甲氨蝶呤-肽化合物对IL-17A⁺/CD4⁺细胞群的影响。具体而言，如以上实验例2所述，从6-7周龄的小鼠分离出脾细胞，然后用实施例<1-2>中合成的本发明的甲氨蝶呤-肽化合物或甲氨蝶呤、作为刺激剂的LPS(2μg/mL)以及Th17促分化细胞因子TGF-α和IL-23(分别为20ng/mL)进行处理。24小时后，用特异于Th17分化标志物IL-17A和CD4的抗体处理细胞30分钟，然后用PBS洗涤两次，并进行FACS分析。

结果确认，与甲氨蝶呤相比，本发明的具有甲氨蝶呤和肽通过共价键相互连接的结构的化合物能够显著减小IL-17⁺/CD4⁺细胞群的数目(图4A和4B)。

实验例5.本发明的化合物对TNF-α⁺/CD4⁺细胞群的影响

进行流式细胞术(FACS)，以确认实施例<1-2>中合成的本发明的甲氨蝶呤-肽化合物对TNF-α⁺/CD4⁺细胞群的影响。具体而言，培养肥大细胞(Raw264.7)，然后用实施例<1-2>中合成的本发明的甲氨蝶呤-肽化合物或甲氨蝶呤，以及作为刺激剂的LPS(2μg/ml)进行处理。24小时后，用特异于肥大细胞活化标志物TNF-α和CD4的抗体将细胞处理30分钟，然后用PBS洗涤两次，并进行FACS分析。

结果确认，与甲氨蝶呤相比，本发明的具有甲氨蝶呤和肽通过共价键相互连接的结构的化合物能够显著减小TNF-α⁺/CD4⁺细胞群的数目(图5A和5B)。

实验例6.本发明的化合物对活化免疫和APC阳性细胞群的影响

进行流式细胞术(FACS)，来确认实施例<1-2>中合成的本发明的甲氨蝶呤-肽化合物对活化免疫和APC阳性细胞群的影响。具体而言，培养肥大细胞(Raw264.7)，然后用实施例<1-2>中合成的本发明的甲氨蝶呤-肽化合物或甲氨蝶呤、作为刺激剂的LPS(2μg/mL)以及Th17促分化细胞因子TGF-β和IL-23(分别为20ng/mL)进行处理。24小时后，用特异于肥大细胞分化标志物CD11b和CD86的抗体处理细胞30分钟，然后用PBS洗涤两次，并进行FACS分析。

结果确认，与甲氨蝶呤相比，本发明的具有甲氨蝶呤和肽通过共价键相互连接的结构的化合物能够显著减小CD11b⁺/CD86⁺细胞群的数目(图6)。

实验例7.本发明的化合物对炎性细胞因子表达的影响

进行酶联免疫吸附测定(ELISA)，来确认实施例<1-2>中合成的本发明的甲氨蝶呤-肽化合物对脾细胞中IL-17A和IFN-γ分泌的影响。具体而言，如以上实验例2所述，从6-7周龄的小鼠分离出脾细胞，然后用实施例<1-2>中合成的本发明的甲氨蝶呤-肽化合物或甲氨蝶呤、作为刺激剂的LPS(2μg/mL)以及Th17促分化细胞因子TGF-β和IL-23(分别为20ng/mL)进行处理。48小时后，采用特异于Th17分化后的分泌标志物IL-17A和IFN-γ的ELISA试剂盒(R&D)进行吸光度测定(Spectramax M2,Molecular Devices)。

结果确认，与甲氨蝶呤相比，本发明的具有甲氨蝶呤和肽通过共价键相互连接的结构的化合物能够显著减少炎性细胞因子IFN-γ和IL-17A的分泌(图7)。

实验例8.本发明的化合物对MMP活性的抑制效果

确认了实施例<1-2>中合成的本发明的甲氨蝶呤-肽化合物对TNF-α和IL-17诱导的MMP活性的影响。具体而言，培养HaCaT角质形成细胞，然后用5μM、10μM或100μM本发明的甲氨蝶呤-肽化合物或甲氨蝶呤对细胞进行预处理，30分钟后，用TNF-α和IL-17作为刺激剂进行处理。培养48小时后，收集培养液，并使培养液与酶谱缓冲液(4％SDS、0.01％溴酚蓝、20％甘油、0.125M Tris-Cl(pH6.8))(Sigma)按1:1的比例反应，然后使20μl反应液在8％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(10％明胶)上进行电泳。之后，在0.1％的Triton X-100(Daejung Chemicals&Metals Co.LTD)缓冲液中将凝胶洗涤三次，时间为10分钟，然后在TNCB(50mM Tris(pH7.5)、150mM NaCl、10mM CaCl₂/D.W)(Sigma-Aldrich)缓冲液中活化，并且用考马斯蓝(Coomassie blue)染色，然后测定条带的强度。

结果确认，与甲氨蝶呤相比，本发明的具有甲氨蝶呤和肽通过共价键相互连接的结构的化合物即使在低得多的浓度下，也能更显著地降低MMP-9和MMP-2基因的表达(图8)。

制备例1.药物组合物的制备

<1-1>粉剂的制备

本发明的甲氨蝶呤-肽········2g

乳糖··············· 1g

将上述成分混合，然后装入密封包装中，从而制得粉剂。

<1-2>片剂的制备

本发明的甲氨蝶呤-肽······ 100mg

玉米淀粉············100mg

乳糖··············100mg

硬脂酸镁············2mg

将上述成分混合，然后按常规的片剂制备方法压片，从而制得片剂。

<1-3>胶囊的制备

本发明的甲氨蝶呤-肽·······100mg

玉米淀粉············ 100mg

乳糖·············· 100mg

硬脂酸镁············ 2mg

将上述成分混合，然后按常规的胶囊生产方法将其填充到明胶胶囊中，从而制得胶囊。

<1-4>丸剂的制备

本发明的甲氨蝶呤-肽········1g

乳糖··············· 1.5g

甘油··············· 1g

木糖醇·············· 0.5g

将上述成分混合，然后按常规方法制成4g/丸，从而制得丸剂。

<1-5>颗粒的制备

本发明的甲氨蝶呤-肽·······150mg

大豆提取物··········· 50mg

葡萄糖············· 200mg

淀粉·············· 600mg

将上述成分混合，然后将100mg的30％乙醇加入其中，将所得的混合物在60℃干燥形成颗粒，然后将颗粒装入包装中。

<1-6>注射液的制备

本发明的甲氨蝶呤-肽··· 10μg/ml

稀盐酸BP·········直至达到pH 3.5

注射用氯化钠BP······最多1ml

将本发明的TRPV 1抑制肽溶于适量的注射用氯化钠BP中，用稀盐酸BP将所得溶液的pH调节到pH 3.5，然后用注射用氯化钠BP调节体积，并使溶液充分混合。将该溶液充入由透明玻璃制成的5ml I型安瓿中，在上部风栅下将玻璃熔化以使安瓿密封，然后将安瓿在120℃的高压釜中灭菌至少15分钟，从而制得注射液。

工业适用性

本发明所述的具有甲氨蝶呤和肽通过共价键相连的结构的化合物具有优异的生理活性，例如抗癌或抗炎作用，并且对细胞的毒性显著降低，因此可应用于各种工业领域，例如用于医药。

序列表正文

SEQ ID NO:1:Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp

SEQ ID NO:2:aacatccaac cttcccaaac g

SEQ ID NO:3:gaccctaagc ccccaattct c

SEQ ID NO:4:atcattcacc aggcaaattg c

SEQ ID NO:5:ggcttcagca taaagcgttt g

SEQ ID NO:6:ttcgacacat gggataacga

SEQ ID NO:7:tctttcaaca cgcaggacag

SEQ ID NO:8:ggtcaacctc aaagtcttta actc

SEQ ID NO:9:ttaaaaatgc aagtaagttt gctg

SEQ ID NO:10:agcgggacat atgaatctac taagaga

SEQ ID NO:11:gtcctagtag ggaggtgtga agttg

SEQ ID NO:12:cctcttctat ccaaccagta tc

SEQ ID NO:13:ctccgcttca taactgtgt

SEQ ID NO:14:gaaggcatcc agacccgaaa c

SEQ ID NO:15:acccatggcg gtgaccatgc

SEQ ID NO:16:gaaggcatcc agacccgaaa c

SEQ ID NO:17:acccatggcg gtgaccatgc

SEQ ID NO:18:tgcccacctt tcctcccagc aa

SEQ ID NO:19:ccgggtctga cggctcgaag

SEQ ID NO:20:tggacgtgaa gacgcggctg g

SEQ ID NO:21:gatttggcgg ctggaggagg tc

SEQ ID NO:22:ctaaagtgcg tctgcta

SEQ ID NO:23:tgggtgctca gatggtata

SEQ ID NO:24:ctgctggagg gcgaggaatg c

SEQ ID NO:25:ccaccgaggc caccgccata

SEQ ID NO:26:aggtccataa taggcatgat

SEQ ID NO:27:caaggacaga aactcagaaa

SEQ ID NO:28:atttccatgc cgtctacagg

SEQ ID NO:29:gcccagtaac tcagctactc

SEQ ID NO:30:gtcgcagctg gaacgcaaca

SEQ ID NO:31:cctggcctcc tgattagtgg

SEQ ID NO:32:cctctctaag ggtgagctga

SEQ ID NO:33:ctgggttttg gtgagggaaa

<110> 凯尔格恩有限公司

<120> 甲氨蝶呤和肽的偶联物

<130> 2018OPA1153

<160> 33

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽1

<400> 1

Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp

1 5 10

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> TNF-α的正向引物

<400> 2

aacatccaac cttcccaaac g 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> TNF-α的反向引物

<400> 3

gaccctaagc ccccaattct c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> COX-2的正向引物

<400> 4

atcattcacc aggcaaattg c 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> COX-2的反向引物

<400> 5

ggcttcagca taaagcgttt g 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> IL-1β的正向引物

<400> 6

ttcgacacat gggataacga 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> IL-1β的反向引物

<400> 7

tctttcaaca cgcaggacag 20

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> IL-17的正向引物

<400> 8

ggtcaacctc aaagtcttta actc 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> IL-17的反向引物

<400> 9

ttaaaaatgc aagtaagttt gctg 24

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> IL-23的正向引物

<400> 10

agcgggacat atgaatctac taagaga 27

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> IL-23的反向引物

<400> 11

gtcctagtag ggaggtgtga agttg 25

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> T-bet的正向引物

<400> 12

cctcttctat ccaaccagta tc 22

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> T-bet的反向引物

<400> 13

ctccgcttca taactgtgt 19

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> GATA3的正向引物

<400> 14

gaaggcatcc agacccgaaa c 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> GATA3的反向引物

<400> 15

acccatggcg gtgaccatgc 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> GAPDH的正向引物

<400> 16

gaaggcatcc agacccgaaa c 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> GAPDH的反向引物

<400> 17

acccatggcg gtgaccatgc 20

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Keratin6A的正向引物

<400> 18

tgcccacctt tcctcccagc aa 22

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Keratin6A的反向引物

<400> 19

ccgggtctga cggctcgaag 20

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Keratin16的正向引物

<400> 20

tggacgtgaa gacgcggctg g 21

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Keratin16的反向引物

<400> 21

gatttggcgg ctggaggagg tc 22

<210> 22

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Keratin5的正向引物

<400> 22

ctaaagtgcg tctgcta 17

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Keratin5的反向引物

<400> 23

tgggtgctca gatggtata 19

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Keratin14的正向引物

<400> 24

ctgctggagg gcgaggaatg c 21

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Keratin14的反向引物

<400> 25

ccaccgaggc caccgccata 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> S100A7的正向引物

<400> 26

aggtccataa taggcatgat 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> S100A7的反向引物

<400> 27

caaggacaga aactcagaaa 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> S100A8的正向引物

<400> 28

atttccatgc cgtctacagg 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> S100A8的反向引物

<400> 29

gcccagtaac tcagctactc 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> S100A9的正向引物

<400> 30

gtcgcagctg gaacgcaaca 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> S100A9的反向引物

<400> 31

cctggcctcc tgattagtgg 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> S100A12的正向引物

<400> 32

cctctctaag ggtgagctga 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> S100A12的反向引物

<400> 33

ctgggttttg gtgagggaaa 20

Claims

1.一种化合物，所述化合物具有甲氨蝶呤和肽通过共价键相连的结构。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述肽由2个至30个氨基酸的序列组成。

3.根据权利要求2所述的化合物，其中所述肽由8个至15个氨基酸的序列组成。

4.根据权利要求1所述的化合物，其中所述肽为水溶性肽。

5.根据权利要求4所述的化合物，其中所述水溶性肽中具有亲水性侧链的氨基酸的比例为50％或更高。

6.根据权利要求5所述的化合物，其中所述水溶性肽中具有亲水性侧链的氨基酸的比例为70％或更高。

7.根据权利要求6所述的化合物，其中所述水溶性肽中具有亲水性侧链的氨基酸的比例为90％或更高。

8.根据权利要求5所述的化合物，其中所述具有亲水性侧链的氨基酸选自由精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、半胱氨酸(Cys)、硒代半胱氨酸(Sec)、甘氨酸(Gly)和脯氨酸(Pro)组成的组。

9.根据权利要求4所述的化合物，其中所述水溶性肽中具有疏水性侧链的氨基酸为5个或更少。

10.根据权利要求9所述的化合物，其中所述水溶性肽中具有疏水性侧链的氨基酸为3个或更少。

11.根据权利要求9所述的化合物，其中所述具有疏水性侧链的氨基酸选自由丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、以及色氨酸(Trp)组成的组。

12.根据权利要求1所述的化合物，其中所述肽为具有由SEQ ID NO:1构成的氨基酸序列的肽。

13.一种抗癌或抗炎药物组合物，包含权利要求1至12中任一项所述的化合物。

14.根据权利要求13所述的药物组合物，该药物组合物具有选自由粉剂、颗粒、片剂、胶囊、悬浮液、乳剂、糖浆、外用制剂、栓剂和无菌注射液组成的组中的剂型。