WO2016085279A2 - 세포 투과 펩타이드-면역조절제 접합체 및 이를 포함하는 면역질환 치료용 조성물 - Google Patents

세포 투과 펩타이드-면역조절제 접합체 및 이를 포함하는 면역질환 치료용 조성물 Download PDF

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WO2016085279A2
WO2016085279A2 PCT/KR2015/012806 KR2015012806W WO2016085279A2 WO 2016085279 A2 WO2016085279 A2 WO 2016085279A2 KR 2015012806 W KR2015012806 W KR 2015012806W WO 2016085279 A2 WO2016085279 A2 WO 2016085279A2
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conjugate
mtx
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amino acid
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유재훈
현순실
장상목
이연
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서울대학교산학협력단
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates

Definitions

  • the present invention relates to a cell-penetrating peptide-immune modulator conjugate and a composition for treating an immunological disease comprising the same.
  • a peptide-immune comprising a peptide multimer comprising a plurality of double-sided peptides and an immunomodulator coupled to the peptide.
  • Modulator conjugates and compositions for treating immunological diseases comprising the same.
  • the immune system is building a defense system composed of various cells to protect the human body from internal and external pathogenic substances, which is achieved through the specific function of each cell and signal transmission between each cell.
  • the body's immune system can be broadly divided into immune tolerance, which suppresses and regulates immunity, and immune response, which promotes immunity.
  • the two immune functions are balanced to achieve immunological homeostasis. You lose. However, immune disorders occur when the balance of immunity is broken and the immune response is more advanced than immune tolerance.
  • Immunosuppressants for the prevention or treatment of immune diseases include specific and nonspecific inhibitors that inhibit only the response. Immunosuppressants inhibit immunosuppression by inhibiting several processes, such as phagocytosis of macrophages, antigen recognition by lymphocytes, cell division, T-cell and B-cell division, and antibody production. May cause. In some cases, antitumor activity may be prevented because cell division is inhibited through DNA disruption or DNA synthesis inhibition.
  • Methotrexate is designed to mimic folic acid, an intermediate of the synthesis of purine and pyrimidine, the bases of DNA, and has a structure very similar to folic acid.
  • the compound binds to folate-reducing reductase (dihydrofolate reductase) in a competitive composition with folic acid, and thus can be used for inhibiting biosynthesis of bases.
  • folate-reducing reductase dihydrofolate reductase
  • MTX has a nucleic acid base synthesis inhibitory function as described above, administration of high concentration can greatly increase side effects such as cell death.
  • MTX has a nucleic acid base synthesis inhibitory function as described above, administration of high concentration can greatly increase side effects such as cell death.
  • less than 15 mg is used in rheumatoid arthritis patients without using high concentrations of MTX of 20-25 mg or more per week administered to cancer patients. Since this concentration is not so low, more efforts are needed to minimize side effects by administering drugs at lower concentrations.
  • Cell-penetrating peptides have been known since the 1980s, and representative examples thereof include TAT peptides found in the hiv-1 virus, artificial R8 linking eight arginines, and penetratin peptides, which are part of the translocation domain in nature. There is this. These three cell penetrating peptides are characterized by a lot of arginine and enter into the cells by the endocytosis mechanism.
  • the inventors of the present application have prepared a peptide multimer comprising a covalent linkage site at two or more specific amino acid positions of a bilateral alpha helix peptide including hydrophilic and hydrophobic amino acids.
  • a peptide containing a covalent linkage at a specific amino acid position is prepared as a dimer and maximized the alpha helix, the cell permeability is remarkably improved, and it has been confirmed that it can be delivered to 100% cells even at nanomolar concentrations ( PCT / KR2014 / 009778).
  • the inventors of the present application have confirmed that the peptide-immunomodulator conjugate including the cell-penetrating peptide multimer and the immunomodulator can solve the problems of the conventional immunomodulator, and completed the present invention.
  • Cell-penetrating peptide multimers comprising a plurality of isotypes or heterophagy alpha-helix bilateral peptides; And it provides a conjugate (conjugate) comprising an immunomodulator bound to the peptide.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating immunological diseases comprising the conjugate.
  • MTX methotrexate
  • Figure 2 is a schematic diagram showing the manufacturing process of the conjugate of the MTX and cell penetrating peptides according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a graph showing the results of HPLC confirmation for the dimer of the conjugate of the MTX and cell penetrating peptides according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is a graph showing the result of confirming the mass of the peptide monomer conjugate of MTX MALDI-TOF according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of confirming the mass of the peptide dimer conjugate (LK3-MTX) of MTX according to an embodiment of the present invention by MALDI-TOF.
  • Figure 6a is a result of the concentration of the cell survival rate for the MDA MB 231 cell line of the conjugate (LK3-MTX) with the peptide dimer of MTX and MTX according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6b is a result of the concentration of the cell survival rate for the MCF7 cell line of the conjugate (LK3-MTX) with the peptide dimer of MTX and MTX according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6c is a result of the cell survival rate by concentration of the RAW 264.7 cell line of the conjugate (LK3-MTX) with the peptide dimer of MTX and MTX according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7a is a graph showing the results of TNF-alpha release amount according to the peptide dimer conjugate (LK3-MTX) treatment of MTX according to an embodiment of the present invention in RAW264.7 cells that are macrophages.
  • LK3-MTX peptide dimer conjugate
  • Figure 7b is a graph showing the results of TNF-alpha release amount according to the peptide monomer conjugate (LK1-MTX) treatment of MTX in RAW264.7 cells that are macrophages.
  • Figure 7c is a graph showing the results of TNF-alpha release amount according to the treatment of MTX in macrophage RAW264.7 cells.
  • FIG. 8 is a representative animal photos and graphs showing the arthritis-releasing effect of the MTX and MTX-CPP (LK3-MTX) treatment for the K / BxN serum transfer-induced RA model.
  • the present invention provides a cell-penetrating peptide multimer comprising a plurality of homo- or hetero-type alpha-helix bilateral peptides; And it relates to a conjugate comprising an immunomodulator bound to the peptide.
  • the peptide-immunomodulator conjugate according to the present invention has excellent cell permeability at low concentrations, and in particular, it was confirmed that cytokine expression suppression effect may be exhibited even at a very low concentration compared to the concentration treated with the immunomodulator alone.
  • immunomodulators can be prepared with much less side effects that can be caused by high doses.
  • the immunomodulatory agent can be, for example, a chemotherapeutic agent.
  • the chemotherapeutic agent is a chemical compound useful for the treatment of an overactive immune response, and is not particularly limited as long as it is an immunomodulator in the form of a compound capable of suppressing an overactive immune response.
  • methotrexate, azathioprine, cyclophosphamide, and cyclo Group consisting of sporin, mycophenolate mofetil, tacrolimus, myzoribin, rapamycin, leflunomide, deoxyspergualin, brequinar, malonitroramid, steroid, corticosteroid and tofacitinib It may be one or more selected from.
  • methotrexate MTX is an excellent drug for rheumatoid arthritis, but in fact, only about 30% of patients have rheumatoid arthritis.
  • the causes of this low therapeutic effect can be summarized in two.
  • MTX or other rheumatoid arthritis drugs are devised to enter the targeted cells as soon as possible and increase their efficacy, the efficacy is likely to decrease in vivo.
  • MTX is known to bind folic acid receptors on the cell surface and to be delivered into cells because of the similarity to folic acid.
  • folic acid receptors can be used as cancer cell-specific markers because many of them are present on the cell surface where metabolism is actively progressing, such as cancer cells.
  • MTX can be delivered well to normal cells or immune cells, which are the final target cells of MTX, and it is necessary to provide a means to deliver low molecular weight MTX into cells in a more aggressive manner.
  • the peptide multimer refers to the invention filed through PCT / KR2014 / 009778, and the peptide multimer comprising a plurality of homo- or hetero-helical alpha-helix double-sided peptides according to the present invention is provided with a plurality of bilateral peptides for improving alpha-helix.
  • the linkage may be located at one or more amino acid positions selected from the group consisting of i, i + 3, i + 4, i + 7, i + 8, i + 10 and i + 11 (i is an integer). have.
  • the linking portion may be preferably linked to two or more amino acid positions selected from the group consisting of i, i + 3, i + 4, i + 7, i + 8, i + 10 and i + 11 (i is an integer).
  • each bilateral peptide is inverted in which a plurality of peptides are connected in parallel while maintaining the C-terminal direction at the N-terminal, or some of the plurality of peptides are connected in the N-terminal to the C-terminal direction, and other portions are C-terminal to the N-terminal direction. Can be connected in parallel.
  • the amino acid constituting the peptide is not limited to the kind as long as it can maintain the alpha-helical structure while showing both sides, for example, the hydrophilic amino acid may be one or more selected from the group consisting of arginine, lysine and histidine
  • the hydrophobic amino acid may be at least one selected from the group consisting of leucine, valine, tryptophan, phenylalanine, tyrosine and isoleucine.
  • the peptide may comprise, for example, 5-150 amino acids, preferably 10-60, more preferably 7-23 amino acids, thereby forming an alpha helical structure that is a stable secondary structure.
  • Peptides according to the present invention shows a length dependence on the cell permeability, for example, peptides containing less than seven amino acids are very low penetration, whereas peptides containing more than seven amino acids are very penetrating ability only at a nanomolar concentration In particular, peptides including 16 or more and up to 23 amino acids may show cell permeability at concentrations of 10 nM or less.
  • one to three hydrophilic amino acids may be alternately arranged, and the remaining sequence may be one to three hydrophobic amino acids.
  • each of the hydrophilic and hydrophobic amino acids is arranged one to three, so that at least one amino acid having an amino acid having the same polarity as the i position at least in the i + 3 or i + 4 position of the double-sided peptide It may include.
  • the bilateral peptide may comprise one or more of seven amino acid sequences in which one or two hydrophilic and hydrophobic amino acids are alternately arranged, wherein i is a hydrophilic amino acid, i + 3 and i + 4 At least one of the positions must be a hydrophilic amino acid, and if i is a hydrophobic amino acid, at least one of the i + 3 or i + 4 positions must be a hydrophobic amino acid.
  • a sequence having the above seven amino acids may include, for example, one or more of the amino acid sequences represented by the following formula:
  • X is a hydrophilic amino acid and Y is a hydrophobic amino acid.
  • At least 25% of one or more residues selected from the group consisting of amino acids capable of exhibiting the maximum hydrophobicity among the hydrophobic amino acids of the bilateral peptide for example, leucine, tryptophan, valine, phenylalanine, tyrosine and isoleucine
  • the peptide may penetrate the cell by hydrophobicity formed through the hydrophobicity.
  • the hydrophilic amino acid of the bilateral peptide may include at least 33% of one or more residues selected from the group consisting of positively charged arginine, lysine and histidine. In the case of having a positive charge of 33% or more, it is possible to secure a desired cell penetration ability overall.
  • the positively charged lysines (K) peptides containing hydrophilic amino acids having a positive charge of 33% or less by substituting lysine (K) 1 and 3 with glutamic acid (E) have a desired degree even at a concentration of 100 nM. Although it did not show the effect of cell penetration, dimerization can improve the penetration ability close to 100 times.
  • the double-sided peptide may comprise a sequence represented by SEQ ID NO: 11 below:
  • the amino acid of (LK) n or (LK) m at the front end of SEQ ID NO: 11 may be further bonded, and n or m may each independently be an integer of 0-2.
  • the bilateral peptide may be the amino acid sequence LKKLLKLLKKLLKL represented by SEQ ID NO: 12 or the amino acid sequence KLLKLLKKLLKLLK represented by SEQ ID NO: 13.
  • the linkage may include, for example, any form of linkage between the peptides to exhibit desired properties according to the invention, but may include, for example, covalent bonds.
  • the covalent bond is not particularly limited as long as it does not inhibit the function of the peptide and is a form of covalent bond capable of improving alpha helix, but for example, disulfide bonds, maleimide bonds, ester bonds, and thioethers between cysteines. It may be one or more selected from the group consisting of binding by click and click reaction.
  • the alpha helix may be improved by using such a linker compound, but the linker compound and the peptide form a more stable bond, and thus have a disadvantage in that they are not easily degraded under normal cellular conditions. If the alpha helix is not broken, cytotoxicity can be strong, so the technique of increasing the alpha helix should be excluded.
  • the peptide multimers connecting the double-sided alpha helix peptides by two or more disulfide bonds can form strong alpha sub-molecular bonds to shRNA while having an alpha helix shape close to 100%. It was confirmed. This is compared with the low alpha helix of the monomeric peptide (about 10% in water), and the binding force is as high as 100-1000 times that of the monomer. This high alpha helix can not only improve cell permeability, but also can be strongly bound to hairpin RNAi or shRNA, which can be a breakthrough structure for delivering RNAi into cells.
  • an artificially synthesized linker compound is used to improve alpha helix, but in the present invention, by using a disulfide bond obtained from cysteine, alpha helix can be improved as well as cytotoxicity. It can be minimized.
  • the inventors of the present application show that the multimers linked through disulfide bonds by hydrophobic amino acids at positions i and i + 7 in the peptide are substituted with cysteines, and exhibit high alpha helix, as well as nanomolar kd values for hairpin RNA targets. It was confirmed that it represents a strong affinity corresponding to.
  • the disulfide bonds may be linked via disulfide bonds between cysteines, for example by including cysteines between amino acids of the bilateral peptide.
  • the peptide may have one or more of the amino acid sequence represented by the following formula:
  • the peptide may have one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 10 described in Table 1 below.
  • the peptide according to the present invention may have an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 8, for example.
  • the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 8 includes a hydrophobic amino acid leucine and a hydrophilic amino acid lysine or arginine, respectively, and these hydrophilic and hydrophobic amino acids indicate that the peptide is bilateral, Has cell permeability.
  • the peptide may include histidine to increase the efficiency of intracellular delivery. Histidine may act in the endosomal escape after intracellular delivery.
  • the histidine may be included, for example, three at the lysine position in the peptide. When included in one or more than one lysine position, the intracellular delivery efficiency of the peptide may be improved.
  • the peptide may further comprise cysteine at the N-terminus or C-terminus.
  • the delivery efficiency for the material to be delivered may vary. For example, this may vary depending on the nature of the material to be delivered.
  • the cysteine may be located at the N-terminus to increase the alpha helix of the peptide, thereby increasing the delivery efficiency of the material.
  • the delivery material is an electrically positive material, the cysteine may be located at the C-terminus, thereby increasing the alpha helix of the peptide, thereby increasing the delivery efficiency.
  • a separate linker may be introduced between the peptide and cysteine added at the N- or C-terminus.
  • the linker may be in the form of a plurality of for example one to three glycine or alanine.
  • the physical properties or delivery efficiency of the peptides may vary depending on the length or type of the linker, and the physical properties or delivery efficiency of the peptides depending on the length of the linker may vary depending on the material to be delivered.
  • the peptide multimer includes an isotype or heteromorphic alpha-helix peptide, which connects a plurality of isotype alpha-helix peptides to form a homopeptide multimer, as well as a carrier peptide having excellent intracellular delivery ability and a ligand of an intracellular target. It may be in the form of a hetero peptide multimer containing a heterologous peptide.
  • the multimer may be in the form of a combination of peptides that play a plurality of roles as necessary while maintaining the function of the desired peptide, but may be, for example, dimers, terpolymers, tetrapolymers or olefins, preferably dimers. Can be.
  • the peptide multimer may be linked with an immunomodulator by noncovalent or covalent bonds.
  • the non-covalent bond may be, for example, one or more selected from the group consisting of hydrogen bonds, electrostatic interactions, hydrophobic interactions, van der Waals interactions, pi-pi interactions and cation-pi interactions.
  • the covalent bonds may be degradable or non-degradable bonds, the degradable bonds may be disulfide bonds, acid decomposable bonds, ester bonds, anhydride bonds, biodegradable bonds or enzymatic bonds, and non-degradable bonds are amide bonds. Or a phosphate bond, but is not limited thereto.
  • the peptide multimer may be linked to and linked with an immunomodulator and a linker, and the linker may be cleavable or non-cleavable.
  • the linker may be, but is not limited to, a hydrocarbon linker or a peptide linker capable of binding to the amine of the N-terminal or C-terminal lysine residue of the peptide.
  • hydrazone linkers bound to degrade in acidic compartments in the cytoplasm peptide linkers to be hydrolyzed by lysosomal proteases, disulfide linkers that can be cleaved through disulfide exchange with intracellular thiols such as glutathione Non-reducing thioether linkers designed for intracellular proteolysis, hydrophilic linkers designed to enhance activity against multi-drug resistance, DNA alkylating agents designed for DNA specific binding, and the like can be used as linkers.
  • the linker may be selected from a linker comprising an aryl halide and derivatives thereof, including azide, alkyl halides containing haloacetyl functional groups, maleimide, aziridine, acryloyl, fluorobenzene and the like.
  • the derivative may be, for example, a disulfide interchange reactor including an alkylation reactor, an arylation reactor, a maleimide group, an azide group, an aziridine group, an acryloyl group, or a pyridyl disulfide, thionitrobenzoic acid, and the like. Can be.
  • the linker linking the residue and the immunomodulator in the peptide multimer may be carried out through alkylation, disulfide interchange method or transthioesterification reaction.
  • the peptide multimer may include a reactive side chain at the N-terminus or C-terminus of each peptide for binding to an immunomodulator.
  • the reactive side chain may be C 1-7 alkylcarbonyl, hydrazine, thiol, alkyne, azido, alcohol, or acid. Side chains) used for bioconjugation.
  • the C 1-7 alkylcarbonyl may be, for example, acetyl, propionyl, valeroyl, pentanoyl, hexanoyl, heptanoyl or isobutaroyl.
  • the present invention relates to a composition for treating immunological diseases comprising the conjugate.
  • Toxicity to cancer cells of cell penetrating peptides and MTX conjugates had LD50 values of low micromolar levels. This may be because MTX permeates well into the cell by the cell penetrating peptide, thereby inhibiting the enzyme involved in DNA synthesis.
  • the toxicity of the MTX and cell penetrating peptides and the MTX conjugates to the immune cells was not very significant.
  • macrophages which are immune cells, did not die at the concentration of nanomolar or low micromolar, which is a concentration at which the conjugates (LK3-MTX, LK1-MTX) release TNF-a (FIG. 6C). Therefore, it can be proved that the effect of inhibiting TNF-a of LK3-MTX is irrelevant to the role of MTX in inhibiting the synthesis of DNA by inhibiting the dehydrofolate reductase enzyme of MTX.
  • Immune disease refers to a disease caused by an excessive reaction of the immune system in the human body, and it is meant to encompass an inflammatory disease caused by an inflammatory response caused by the reaction of the immune system in vivo.
  • Immune diseases treatable through the conjugate include, for example, rheumatoid arthritis, psoriasis, Crohn's disease, multiple sclerosis, insulin dependent diabetes mellitus, autoimmune hepatitis, ulcerative colitis, autoimmune myocarditis, psoriasis, scleroderma, myasthenia gravis, May be one or more selected from the group consisting of multiple myositis / skin myositis, Hashimoto's disease, autoimmune erythrocytosis, aplastic anemia, Sjogren's syndrome, vasculitis syndrome, graft versus host disease caused by systemic lupus erythematosus It is not limited.
  • composition according to the invention may be prepared further comprising one or more pharmaceutically acceptable carriers.
  • Pharmaceutically acceptable carriers must be compatible with the active ingredients of the present invention and include saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these ingredients. It can mix and use, and if needed, other conventional additives, such as antioxidant, buffer, and bacteriostatic agent, can be added.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may be additionally added to formulate injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • a formulation in the form of a lyophilized form it is desirable to formulate and provide a formulation in the form of a lyophilized form.
  • Methods commonly known in the art may be used for the preparation of lyophilized formulations, and stabilizers for lyophilization may be added.
  • it may be preferably formulated according to each disease or component by a suitable method in the art or using a method disclosed in Remington's pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA.
  • compositions according to the present invention may be determined by a person of ordinary skill in the art based on the symptoms and severity of the disease of a typical patient. It may also be formulated in a variety of forms, including solutions, injections, and the like, and may also be provided in unit-dose or multi-dose containers, such as sealed ampoules and bottles.
  • compositions according to the invention can be administered orally or parenterally.
  • Routes of administration of the compositions according to the invention are not limited to, for example, oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intradural, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intestinal, sublingual Or topical administration is possible.
  • the dosage of the composition according to the present invention may vary in the range depending on the weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method, placement rate, or severity of the disease of the patient, and is easily available to those skilled in the art. Can decide.
  • the compositions of the present invention can be formulated into suitable formulations using known techniques for clinical administration.
  • the composition comprises an effective amount of the conjugate such that a suitable dosage is achieved.
  • the amount of conjugate is at least about 0.01% of the weight of the composition.
  • the amount of conjugate may vary from about 0.1% to about 80% by weight of the composition.
  • the oral composition may comprise the conjugate in about 4% to about 50% by weight of the composition.
  • Compositions of the present invention can be prepared such that the parenteral dosage unit contains from about 0.01% to about 50% by weight of the conjugate.
  • the composition may comprise from about 0.01 to about 100 mg, preferably 1 to 100 mg, more preferably 0.1 to 25 mg of the conjugate per kg of body weight.
  • the dosage of the conjugate administered to a patient is typically from about 0.01 mg / kg to about 2000 mg per kg of body weight of the animal.
  • the composition can be administered via any convenient route, for example by infusion or bolus injection, by absorption through the epithelial or mucosal skin (eg, oral mucosa, rectal and small intestinal mucosa, etc.).
  • composition comprising the conjugate according to the present invention can inhibit cytokine secretion from immune cells to alleviate the symptoms of immune diseases, all or temporarily alleviate all direct or indirect pathological consequences of immune diseases, and improve prognosis. have.
  • a composition comprising a conjugate according to the invention can be used to deliver a drug or drug unit to immune cells, or the conjugate can be absorbed into immune cells via receptor-mediated endocytosis.
  • the drug or (non-cleavable) linker-drug is released from the peptide multimer, the released drug or drug-linker compound induces cytotoxic activity or cytostatic activity in the cell, or an immunomodulator is an immune cell.
  • the drug or drug-linker compound may be in the form of infiltrating the cells after being separated from the conjugate from the outside.
  • Patients to be administered the composition according to the present invention may include all cases that have not been found to be responsive to the treatment of immunological diseases using immunomodulators or have been found.
  • an effective amount of additional therapy necessary for a patient may be used, for example, an immunomodulator such as a chemotherapeutic agent other than an immunomodulator included in a conjugate, or a biopharmaceutical used for treating an immune disease, for example, an anti- TNF ⁇ antibodies can be used in combination.
  • an immunomodulator such as a chemotherapeutic agent other than an immunomodulator included in a conjugate
  • a biopharmaceutical used for treating an immune disease for example, an anti- TNF ⁇ antibodies can be used in combination.
  • N, N, N ′, N′-Tetramethyl-O- (1H-benzotriazol-1-yl) uronium hexafluorophosphate (HBTU, 10 mg, 3) on Resin bound N-terminal Fmoc deprotected monomer (LK1, 15 mg, 8.9 ⁇ mol) eq), hydroxybenzotriazole (HOBt, 1.8 mg, 1.5 eq), methotrexate (12 mg, 3 eq), diisopropylethylamine (9.3 ⁇ L, 3 eq) and dimethylformaide (DMF, 500 ⁇ L) were added and stirred at room temperature for 2 hours.
  • HOBt hydroxybenzotriazole
  • methotrexate (12 mg, 3 eq
  • diisopropylethylamine (9.3 ⁇ L, 3 eq
  • DMF dimethylformaide
  • MTX-dimeric peptide conjugate (LK3-MTX) was obtained as above.
  • Figure 3 shows the HPLC trace, each peak was confirmed by MALDI-TOF MS.
  • MTX monomer conjugate (LK1-MTX): MS [M + H] < + >: 2235.3 (calcd) 2237.4 (obsd) ( Figure 4).
  • MTX dimer conjugate (LK3-MTX): MS [M + H] +: 4465.7 (calcd) 4469.7 (obsd) (FIG. 5).
  • MDA MB 231 cells and MCF7 cells which are cancer cells
  • macrophages RAW 264.7 cell
  • IC 50 value of 0.17 ⁇ M the IC 50 value is not measurable in the MCF7 cell, but the relative cell viability is confirmed to be low in LK3-MTX).
  • TNF-a Tumor Necrosis Factor-alpha
  • the toxicity of immune conjugates to MTX and cell-penetrating peptides was not very significant, especially nanomolar or low micromolar concentrations, at which the conjugates (LK3-MTX, LK1-MTX) release TNF-a. Macrophage, an immune cell, was found not to die at all (FIG. 6C). Therefore, it was found that the effect of inhibiting TNF-a of LK3-MTX was not related to inhibiting DNA synthesis by inhibiting the dihydrofolate reductase enzyme of MTX.
  • mice In order to know how much the MTX-peptide dimer conjugate (LK3-MTX) synthesized against arthritis model mice has an anti-inflammatory effect compared to the control group treated with MTX alone (MTX), the degree of swelling of the joint was examined to determine the anti-inflammatory effect. It was confirmed as (Fig. 8).
  • Three 8-week old C57BL / 6J male mice were prepared in groups. It contains autoantibodies in the blood that can recognize epitopes of glucose-6 phosphate isomerase (GPI), an autoantigen, resulting in the production of autoantibody induced arthritis.
  • the serum of K / BxN mice can be used to induce arthritis (Rheumatoid arthritis).
  • K / BxN mice were obtained by crossing NOD mice with transgenic mice that overexpress KRN T cell receptors (TCRs). These mice are spontaneously induced by arthritis. Same as the content. In addition, due to severe autoimmune disease, the reproductive capacity is not available, can be obtained only by cross-linking KRN overexpression mouse and NOD mouse.
  • K / BxN mouse serum is injected 80 ⁇ l by intraperitoneal injection (i.p) on day 0 and day 2, respectively.
  • MTX Metalhotrexate
  • CPP (LK-3) and MTX-CPP (LK3-MTX) were also quantified at the same concentration (molarity) as injected MTX and injected intraperitoneally (i.p injection) on day 3, day 5 and day 7, respectively.
  • Score 2 If the foot is square in shape by swollen to the side of the toe more in the V shape
  • Score 3 Severe swollen, thicker on the ankle than on the toe.
  • the PBS-injected group and the CPP-injected group did not show the alleviation effect.
  • the MTX-injected group showed significant relief from the clinical score.
  • the MTX-CPP injection group was observed to be more inflammatory than the MTX-only group.
  • Peptide-immunomodulator conjugates according to the present invention through cell-penetrating peptide multimers that are delivered with high efficiency into immune cells even at concentrations of nanomolar, not only show an excellent immunosuppressive effect compared with the use of immunomodulators alone, but also Even at low concentrations, it can be effective in treating immune diseases.

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Abstract

본 발명은 세포 투과 펩타이드-면역조절제 접합체 및 이를 포함하는 면역질환 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 복수개의 양면성 펩타이드를 포함하는 펩타이드 다합체와 상기 펩타이드에 결합된 면역조절제를 포함하는 펩타이드-면역조절제 접합체 및 이를 포함하는 면역질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

세포 투과 펩타이드-면역조절제 접합체 및 이를 포함하는 면역질환 치료용 조성물
본 발명은 세포 투과 펩타이드-면역조절제 접합체 및 이를 포함하는 면역질환 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 복수개의 양면성 펩타이드를 포함하는 펩타이드 다합체와 상기 펩타이드에 결합된 면역조절제를 포함하는 펩타이드-면역조절제 접합체 및 이를 포함하는 면역질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
면역시스템은 내부 및 외부의 병원성 물질로부터 인체를 보호하기 위해 다양한 세포로 구성된 방어 체계를 구축하고 있으며, 이는 각각의 세포가 가진 특이적 기능 및 각 세포간의 신호 전달을 통해 이루어진다. 인체의 면역계는 면역을 억제하고 조절하는 면역 관용(tolerance)와 면역을 촉진하는 면역반응(immunity)로 크게 나눠 볼 수 있는데 이 두 가지 면역 작용이 서로 균형을 이뤄 면역학적 항상성(immunological homeostasis)이 이루어지게 된다. 그러나, 면역의 균형이 깨져 면역반응이 면역 관용보다 항진되어 있을 경우 면역 질환이 발생한다.
면역 질환의 예방 또는 치료를 위한 면역억제제는 그 반응만을 억제하는 특이적 억제제와 비특이적 억제제가 있다. 면역억제제는 항원자극에서 항체생성에 이르는 과정 중 대식세포에 의한 항원의 탐식, 림프구 등에 의한 항원 인식, 세포분역, T-세포와 B-세포의 분열, 항체 생성 등 몇 가지 과정을 저해시킴으로써 면역억제를 야기할 수 있다. DNA 장애, DNA 합성 저해 등을 매개로 하여 세포분열을 저지하기 때문에 항종양 활성을 가진 경우도 있다.
특히, Methotrexate (MTX)는 DNA를 구성하는 염기인 퓨린 (purine) 및 피리미딘 (pyrimidine) 합성의 중간체인 염산 (folic acid)을 모방하여 설계되었으므로, 엽산과 매우 유사한 구조를 가지고 있다. 따라서, 이 화합물은 엽산을 환원하는 환원효소에 (dihydrofolate reductase) 엽산과 경쟁적인 구도로 결합하기 때문에, 염기의 생합성을 저해하는 용도로 사용될 수 있다. 이와 같은 사실에 근거하여, MTX는 종양세포의 염기합성을 저해할 수 있는 항암제로 사용하기 시작하였으며, 그 쓰임은 현재까지도 여러 암 종에 대해 지속되고 있다.
1951년 MTX의 류마티스성 관절염에 대한 약효가 최초로 보고된 이후, 현재 관절염 치료제로서 가장 널리 사용되는 치료제가 되었다. MTX가 류마티스성 관절염을 치료하는 기전은 종양을 치료하는 기전과는 달라, dihydrofolate reductase의 저해제로서 작용하는 것은 아님이 밝혀졌다. 그러나, 아직 MTX의 류마티스성 관절염을 어떻게 치료하게 되는 확실한 기전은 밝혀지지 않고 있으며, 약물 기전에 관한 몇 가지 가설이 제시되고 있을 뿐이다.
임상적으로 저농도로 MTX를 투여하여 (주 12.5 mg 이하) 약효가 없는 류마티스성 관절염 환자 (약 70%)에 대해, 치료 효과를 높이기 위해 실제로 MTX의 용량을 증가시키는 방법을 고려할 수 있다. 그러나, MTX는 위에 기술한 바와 같이 핵산 염기합성 억제 기능을 가지고 있으므로, 고농도의 투여는 세포 사멸 등 부작용을 크게 증가시킬 수 있다. 통상, 류마티스성 관절염 환자에게는 암환자에게 투여하는 주당 20∼25 mg 이상의 고농도의 MTX를 사용하지 않고 15 mg 미만을 사용하고 있다. 이 농도 또한 그리 낮은 농도가 아니므로 좀 더 낮은 농도로 약제를 투여하여 부작용을 최소화하는 노력들이 더 필요한 실정이다.
류마티스성관절염을 악화시키는 것으로 알려진 사이토카인의 분비에 대해 항체 등의 대체 약물을 사용하거나, 비스테로이드성 항염증제와 낮은 농도의 MTX의 동시 투약 방법이 새롭게 제안된 방법들이다. 그러나, MTX와 다른 약제와의 병용이 MTX의 약효에 어떻게 영향을 미칠 수 있는가에 대한 모니터링 방법이 잘 정착되어있지 못한 이유로, 병행투여 효과가 있다는 직접적인 증거는 아직 없다.
한편, 현대 신약개발의 여러 기법/기술 중에, 약물이 작용하는 세포에 조속하게 약물을 전달할 수 있는 방법은 크게 두 가지가 있으며, 리포좀 등의 나노입자를 형성하여 세포 내 전달을 돕는 방법과 세포 투과성 펩타이드를 이용하는 방법이 있다. 본 출원의 발명자들은 특히 후자의 방법인 세포 투과 펩타이드 를 이용한 방법에 주목하여 왔다.
세포 투과 펩타이드는 1980년대부터 알려지기 시작했으며, 이중 대표적인 예로는 hiv-1 바이러스에서 발견되는 TAT 펩타이드 및 알지닌을 8개를 이어붙인 인공적인 R8, 자연계에 존재하는 trans location domain의 일부인 penetratin 펩타이드 등이 있다. 이러한 세가지 세포 투과 펩타이드의 특징은 알지닌을 많이 가지고 있으며, endocytosis 기전에 의해 세포 내로 들어가는 특징을 가지고 있다.
최근, 본 출원의 발명자들은 친수성 및 소수성 아미노산을 포함하는 양면성 알파나선 펩타이드의 두 개 이상의 특정 아미노산 위치에 공유결합 연결부위를 포함하는 펩타이드 다합체를 제조한 바 있다. 특히, 특정 아미노산 위치에 공유결합 연결부위를 포함하는 펩타이드를 이합체로 제조하고 알파나선을 극대화시키면, 세포 투과성이 현저하게 향상되어 나노몰 농도에서도 100% 세포 내로 전달될 수 있다는 사실을 확인한 바 있다 (PCT/KR2014/009778).
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 세포 투과성 펩타이드 다합체 및 면역조절제를 포함하는 펩타이드-면역조절제 접합체를 통해, 종래 면역조절제가 가지는 문제점을 해결할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 생체 내 약효가 개선되면서도, 낮은 농도에서도 면역세포 내로 우수한 전달 효율을 보이는 펩타이드-면역조절제 접합체 및 이를 포함하는 조성물을 제공하는 데 있다.
동형 또는 이형의 알파나선형 양면성 펩타이드를 복수개 포함하는 세포 투과성 펩타이드 다합체; 및 상기 펩타이드에 결합된 면역조절제를 포함하는 접합체 (conjugate)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 접합체를 포함하는 면역질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.
도 1은 methotrexate (MTX)와 dihydrofolic acid의 구조식이다.
도 2은 본 발명의 일 실시예에 따른 MTX와 세포 투과 펩타이드의 접합체의 제조 과정을 나타내는 모식도이다.
도 3는 본 발명의 일 실시예에 따른 MTX와 세포 투과 펩타이드의 접합체의 이량체에 대한 HPLC 확인 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4은 본 발명의 일 실시예에 따른 MTX의 펩타이드 단량체 접합체의 질량을 MALDI-TOF로 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5은 본 발명의 일 실시예에 따른 MTX의 펩타이드 이합체 접합체 (LK3-MTX)의 질량을 MALDI-TOF로 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 MTX 및 MTX의 펩타이드 이합체와의 접합체(LK3-MTX)의 MDA MB 231 세포주에 대한 농도별 세포 생존율을 도식화한 결과이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 MTX 및 MTX의 펩타이드 이합체와의 접합체(LK3-MTX)의 MCF7 세포주에 대한 농도별 세포 생존율을 도식화한 결과이다.
도 6c는 본 발명의 일 실시예에 따른 MTX 및 MTX의 펩타이드 이합체와의 접합체(LK3-MTX)의 RAW 264.7 세포주에 대한 농도별 세포 생존율을 도식화한 결과이다.
도 7a는 마크로파지인 RAW264.7 세포에서 본 발명의 일 실시예에 따른 MTX의 펩타이드 이합체 접합체 (LK3-MTX) 처리에 따른 TNF?alpha 방출량의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7b는 마크로파지인 RAW264.7 세포에서 MTX의 펩타이드 단량체 접합체 (LK1-MTX) 처리에 따른 TNF-alpha 방출량의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7c는 마크로파지인 RAW264.7 세포에서 MTX의 처리에 따른 TNF-alpha 방출량의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 관절염 모델 동물은 K/BxN serum transfer-induced RA model에 대한 MTX 및 MTX-CPP (LK3-MTX)의 처리에 따른 염증완화 효과를 나타낸 대표 동물 사진 및 그래프이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
일 관점에서, 본 발명은 동형 또는 이형의 알파나선형 양면성 펩타이드를 복수개 포함하는 세포 투과성 펩타이드 다합체; 및 상기 펩타이드에 결합된 면역조절제를 포함하는 접합체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 펩타이드-면역조절제 접합체는 낮은 농도에서도 우수한 세포 투과능력을 보유하고 있으며, 특히, 면역조절제 단독으로 처리한 농도에 비해 매우 낮은 농도에서도 사이토카인 발현 억제 효과가 나타날 수 있음을 확인하였다. 따라서, 고농도 투여에 의해 나타날 수 있는 부작용이 훨씬 적은 면역조절제를 제조할 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 면역조절제는 예를 들어, 화학요법제일 수 있다. 상기 화학요법제는 과민성 면역반응의 치료에 유용한 화학적 화합물로, 과민성 면역반응을 억제시킬 수 있는 화합물 형태의 면역조절제라면 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 메토트렉세이트, 아자티오프린, 시클로포스파미드, 시클로스포린, 미코페놀레이트 모페틸, 타크롤리무스, 미조리빈, 라파마이신, 레플루노마이드, 데옥시스페르구알린, 브레퀴나르, 말로니트롤라미드, 스테로이드, 코르티코스테로이드 및 토파시티닙으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
이 중, 메토트렉세이트 MTX는 류마티스성 관절염에 탁월한 효능을 가진 약이지만, 실제로 약 30% 정도의 류마티스성 관절염 환자에서만 치료효과를 보이고 있다. 이와 같은 낮은 치료효과의 원인을 두 가지로 요약할 수 있다. 첫 번째는, 혈중에 들어간 MTX의 안정성이 좋지 못하기 때문이다. 즉, 혈중에 들어간 MTX는 실제로 24 시간 내에 90%가 소변으로 배출되는 것이 확인되었다. 둘째로, 약물이 약효를 나타낼 수 있는 세포나 조직에 조속하게 들어가지 못하기 때문이다. 이렇게 조속하게 세포로 들어가지 못한 약물들은 계속 혈액내에서 부유하다 간에 의해 파괴되어 오줌으로 배설된다. 따라서, MTX 또는 다른 류마티스성 관절염 약이 조속하게 표적이 되는 세포에 들어가 효능을 높일 수 있는 방법이 고안되지 않으면, 생체 내에선 약효가 감소될 가능성이 높다.
MTX는 엽산과 비슷하게 생긴 이유로 세포 표면에 존재하는 엽산 수용체에 결합하여 세포 내로 잘 전달되는 것으로 알려져 있다. 특히 이와 같은 엽산 수용체에는 암세포와 같이 대사가 활발하게 진행되고 있는 세포 표면에 많이 존재하기 때문에, 암세포 특이적 마커로 사용될 수 있다. 그러나, 정상세포나 MTX의 최종 표적세포인 면역세포에 MTX가 잘 전달될 수 있을지는 미지수이며, 좀 더 적극적인 방법으로 저분자인 MTX를 세포 내로 전달될 수 있는 수단을 마련하는 것이 필요하다.
아직까지, 이와 같이 묽은 농도에서 MTX의 효능이 있다는 결과가 보고되고 있지 않았지만, 나노몰 농도에서도 약물이 작용하는 면역세포 내로 MTX가 100% 전달된다면 MTX-세포 투과 펩타이드의 효능이 MTX를 단독으로 사용한 경우와는 다를 것으로 기대된다. 또한, 기존의 연구에 비해 매우 낮은 농도에서도 MTX가 류마티스성 관절염의 치료효과를 보일 것으로 기대된다. 지금까지 사용하지 않았던 저농도에서 MTX의 약효가 입증된다면, 이는 부작용을 최소화 할 수 있는 MTX의 새로운 신약으로의 가능성을 여는 셈이다.
상기 펩타이드 다합체는 PCT/KR2014/009778을 통해 출원된 발명을 참조하며, 본 발명에 따른 동형 또는 이형의 알파나선형 양면성 펩타이드를 복수개 포함하는 펩타이드 다합체는 알파나선도를 향상시키기 위한 복수개의 양면성 펩타이드를 예를 들어, i, i+3, i+4, i+7, i+8, i+10 및 i+11 (i는 정수)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 위치에 연결부를 위치시킬 수 있다. 상기 연결부는 바람직하게, i, i+3, i+4, i+7, i+8, i+10 및 i+11 (i는 정수)로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산 위치에 연결될 수 있다. 이 때, 각 양면성 펩타이드는 복수의 펩타이드가 N 말단에서 C 말단 방향을 유지하며 평행하게 연결되거나 또는 복수의 펩타이드 중 일부는 N 말단에서 C 말단 방향, 다른 일부는 C 말단에서 N 말단 방향으로 연결된 역평행으로 연결될 수 있다.
상기 펩타이드를 구성하는 아미노산은 양면성을 나타내면서도 알파나선형 구조를 유지할 수 있도록 하는 것이면 그 종류가 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 상기 친수성 아미노산은 알지닌, 라이신 및 히스티딘으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있고, 상기 소수성 아미노산은 루신, 발린, 트립토판, 페닐알라닌, 타이로신 및 이소루신으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 펩타이드는 예를 들어, 5-150개의 아미노산, 바람직하게 10-60개, 더욱 바람직하게 7-23개의 아미노산을 포함할 수 있으며, 이를 통해 안정한 2차 구조인 알파나선 구조를 형성할 수 있다. 본 발명에 따른 펩타이드는 세포 투과능에 길이 의존성을 보이는데, 예를 들어 7개 미만의 아미노산을 포함하는 펩타이드는 침투능이 매우 적은데 비해, 7개 이상의 아미노산을 포함하는 펩타이드는 나노몰의 농도만으로도 침투능이 매우 향상됨을 확인할 수 있으며, 특히 16개 이상, 최대 23개의 아미노산을 포함하는 펩타이드는 10 nM 이하의 농도에서 모두 세포 투과능을 보일 수 있다.
친수성 아미노산의 아민기를 알파나선형 펩타이드의 한 면으로 모으기 위해, 친수성 아미노산이 한 개 내지 세 개씩 교대로 배열되어 있을 수 있으며, 나머지 서열은 소수성 아미노산이 한 개 내지 세 개씩 배열될 수 있다. 예를 들어, 상기 친수성 및 소수성 아미노산 각각이 한 개 내지 세 개씩 교대로 배열되어, 양면성 펩타이드 중 i+3 혹은 i+4 위치에 적어도 하나는 i 위치와 같은 극성을 지니는 아미노산을 가지는 7개 아미노산을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 양면성 펩타이드는 친수성 및 소수성 아미노산 각각이 한 개 내지 두개씩 교대로 배열되어 있는 7개 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있는데, 이 때 i가 친수성 아미노산이면, i+3 및 i+4 위치 중 적어도 하나는 친수성 아미노산이어야 하며, i가 소수성 아미노산이면, i+3 또는 i+4 위치 중 적어도 하나는 소수성 아미노산이어야 한다.
위 7개 아미노산을 가지는 서열은 예를 들어, 다음의 식으로 표시되는 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
XYXXYYX YXYYXXY
XYYXYYX YXXYXXY
XYYXXYX YXXYYXY
XYYXXYY YXXYYXX
XXYXXYY YYXYYXX
XXYYXYY YYXXYXX
XXYYXXY YYXXYYX
상기 식에서, X는 친수성 아미노산이고, Y는 소수성 아미노산이다.
이 때, 상기 양면성 펩타이드의 소수성 아미노산 중 최대의 소수성을 나타낼 수 있는 아미노산 예를 들어 루신, 트립토판, 발린, 페닐알라닌, 타이로신 및 이소루이신으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기를 25% 이상으로 포함할 수 있으며, 이를 통해 형성된 소수성 (hydrophobicity)에 의해 펩타이드가 세포를 투과할 수 있다.
또한, 상기 양면성 펩타이드의 친수성 아미노산 중 양전하를 띄는 알지닌, 라이신 및 히스티딘으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기를 33% 이상 포함할 수 있다. 33% 이상의 양전하를 가지는 경우 전반적으로 목적하는 세포 침투능을 확보할 수 있다. 양전하를 띠는 라이신(K)들 중 1,3번 라이신(K)를 글루탐산(E)으로 치환하여 33% 이하의 양전하를 띠는 친수성 아미노산을 포함하는 펩타이드가 100 nM의 농도에서도 목적하는 정도의 세포 침투 효과를 나타내지 못하였으나, 이를 이합체로 만들 경우 100배에 가까운 침투 능력을 향상시킬 수 있다.
상기 양면성 펩타이드는 다음의 서열번호 11로 표시되는 서열을 포함할 수 있다:
KLLKLLK (서열번호 11).
이 때, 상기 서열번호 11의 전단에 (LK)n 또는 후단에 (LK)m의 아미노산이 추가로 결합할 수 있으며, 상기 n 또는 m은 각각 독립적으로 0-2의 정수일 수 있다. 구체적으로, 상기 양면성 펩타이드는 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열 LKKLLKLLKKLLKL 또는 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열 KLLKLLKKLLKLLK일 수 있다.
상기 연결부는 예를 들어, 본 발명에 따라 목적하는 특성을 나타내도록 펩타이드 사이를 연결시키는 어떠한 형태의 결합도 포함될 수 있으나, 예를 들어 공유결합을 포함할 수 있다. 상기 공유결합은 펩타이드의 기능을 저해하지 않으면서, 알파나선도를 향상시킬 수 있는 형태의 공유결합이라면 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어, 시스테인 사이의 이황화 결합, 말레이미드 결합, 에스터 결합, 티오에테르 결합 및 클릭 반응에 의한 결합으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 펩타이드가 가진 안정적인 알파나선을 유지하기 위해 공유결합을 이용하여 펩타이드의 i-위치와 i+3, i+4, i+7, i+8, i+10 또는 i+11 위치를 묶는 것을 시도하였으며, 많은 종류의 링커 화합물들이 활용될 수 있다. 다만, 이와 같은 링커 화합물을 이용하여 알파나선도는 증진시킬 수 있었지만, 링커 화합물과 펩타이드는 보다 안정적인 결합을 형성하므로 보통의 세포질 조건에서 잘 분해되지 않는 단점을 가지고 있다. 알파나선이 깨지지 않으면 세포 독성이 강하게 나타날 수 있으므로 무작정 알파나선을 높이는 기술은 배제되어야 한다.
본 출원의 발명자들은 이를 고려하여, 양면성 알파나선 펩타이드를 두 개 이상의 다이설파이드 결합으로 연결한 펩타이드 다합체는 100%에 가까운 알파나선 모양을 하면서, shRNA에 대해 나노몰 이하의 강력한 결합을 할 수 있음을 확인하였다. 이는 단량체 펩타이드의 낮은 알파나선도 (물 속에서 10% 정도)와도 비교되며, 결합력도 단량체의 100-1000배 정도로 높다. 이러한 높은 알파나선도를 통해 세포투과능을 향상시킬 수 있을 뿐 아니라, 헤어핀 모양의 RNAi나 shRNA와 강력하게 결합할 수 있으므로, 이에 대한 RNAi를 세포 내로 전달하는 획기적인 구조가 될 수 있다.
종래, 인위적으로 합성한 링커 화합물을 사용하여 알파나선도를 향상시키는 방법을 사용하였으나, 본 발명에서는 시스테인으로부터 얻어질 수 있는 이황화 결합을 사용함으로써 알파나선도를 향상시킬 수 있음은 물론, 세포 독성 역시 최소화할 수 있다.
본 출원의 발명자들은 펩타이드 중 i 위치 및 i+7 위치의 소수성 아미노산이 시스테인으로 치환되어 이황화 결합을 통해 연결된 다합체는 높은 알파나선도를 나타낼 뿐 아니라, 헤어핀 RNA 타겟에 나노몰에 해당하는 kd 값에 상응하는 강한 친화도를 나타냄을 확인하였다.
상기 연결부가 이황화 결합을 통해 연결되는 경우, 이황화 결합은 예를 들어 양면성 펩타이드의 아미노산 사이에 시스테인을 포함시켜 시스테인 사이의 이황화 결합을 통해 연결될 수 있다.
이 때, 상기 펩타이드는 다음의 식으로 표시되는 아미노산 배열 중 하나 이상을 가질 수 있다:
CYYXXYXCYYXXYXZW (1)
XYYCXYXXYYCXYXZW (2)
XYYXCYXXYYXCYXZW (3)
XYYXXYCXYYXXYCZW (4); 및
XYYXXYXCYYXXYXCW (5)
(상기 식에서, X, Z 및 W는 소수성 아미노산, Y는 친수성 아미노산이며, C는 시스테인을 나타냄.)
구체적으로, 상기 펩타이드는 하기 표 1에 기재된 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 서열을 가질 수 있다.
Figure PCTKR2015012806-appb-T000001
위 식 (1)의 아미노산 배열을 만족하는 펩타이드 중, 본 발명에 따른 펩타이드는 예를 들어 서열번호 3 또는 8로 표시된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 서열번호 3 또는 8 로 표시된 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 소수성 아미노산인 루신 및 친수성 아미노산인 라이신 또는 알지닌이 각각 포함된 것으로, 이들 친수성 및 소수성 아미노산에 의해 펩타이드는 양면성을 나타내고, 알파나선 구조에 의해 세포 투과능을 가진다.
경우에 따라서, 상기 펩타이드는 세포 내 전달의 효율성을 높이기 위해서 히스티딘을 포함할 수 있다. 세포내 전달 후 세포 질로의 전달 과정 (endosomal escape)에 히스티딘이 작용할 수 있다. 상기 히스티딘은 펩타이드 중 라이신 위치에 예를 들어 3개 포함될 수 있다. 라이신 위치에 포함되거나, 1개 이상 포함되는 경우 펩타이드의 세포 내 전달 효율성이 향상될 수 있다.
또 다른 경우에 따라서, 상기 펩타이드는 N-말단 또는 C-말단에 시스테인을 추가로 포함할 수 있다. 상기 시스테인의 위치에 따라 전달하고자 하는 물질에 대한 전달 효율이 달라질 수 있다. 예를 들어, 이는 전달하고자 하는 물질의 특성에 따라 달라질 수 있다. 전달 물질이 전기적 음성을 가지는 물질인 경우 시스테인이 N-말단에 위치함으로써 펩타이드의 알파 나선도가 증가되고, 이에 따라 물질의 전달 효율이 증가할 수 있다. 전달 물질이 전기적 양성을 가지는 물질인 경우 시스테인이 C-말단에 위치함으로써 펩타이드의 알파 나선도 증가로 전달 효율이 증가할 수 있다.
추가적으로, N-말단 또는 C-말단에 추가된 시스테인과 펩타이드 사이에 별도의 링커를 도입할 수도 있다. 상기 링커의 형태는 복수개 예를 들어 하나 내지 세 개의 글리신 또는 알라닌을 포함하는 것일 수 있다. 링커의 길이 또는 종류에 따라 펩타이드의 물성 또는 전달 효율이 달라질 수 있으며, 링커의 길이에 따른 펩타이드의 물성 또는 전달 효율은 전달하고자 하는 물질에 따라 달라질 수 있다.
상기 펩타이드 다합체는 동형 또는 이형의 알파나선형 펩타이드를 포함하는데, 동형의 알파나선형 펩타이드를 복수개 연결하여 호모 펩타이드 다합체 형태일 뿐 아니라, 세포 내 전달력이 우수한 전달자 펩타이드와 세포 내 표적의 리간드로 작용할 수 있는 펩타이드가 이형으로 포함된 헤테로 펩타이드 다합체 형태일 수 있다.
상기 다합체는 목적하는 펩타이드의 기능을 유지하면서 필요에 따라 복수의 역할을 하는 펩타이드가 결합한 형태일 수 있으나, 예를 들어 이합체, 삼중합체, 사중합체 또는 오중합체일 수 있으며, 바람직하게는 이합체일 수 있다.
상기 펩타이드 다합체는 면역조절제와 비공유성 결합 또는 공유성 결합을 통해 결합될 수 있다. 상기 비공유성 결합은 예를 들어, 수소결합, 정전기적 상호작용, 소수성상호작용, 반데르 발스 상호작용, 파이-파이 상호작용 및 양이온-파이 상호작용으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 공유성 결합은 분해성 또는 비분해성 결합일 수 있으며, 상기 분해성 결합은 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 또는 효소 분해성 결합일 수 있고, 비분해성 결합은 아미드 결합 또는 포스페이트 결합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
경우에 따라서, 상기 펩타이드 다합체는 면역조절제와 링커를 통해 연결되어 결합될 수 있으며, 상기 링커는 절단성 (clevable) 또는 비절단성 (non-cleavable)일 수 있다. 예를 들어, 상기 링커로 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단 라이신 잔기의 아민에 결합 가능한, 탄화수소 링커 또는 펩타이드 링커를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 세포질 내 산성 구획에서 분해될 수 있도록 결합된 하이드라존 링커, 리소좀 프로테아제에 의해 가수분해될 수 있도록 하는 펩타이드 링커, 세포내 티올 예를 들어 글루타치온과 이황화 교환을 통해서 절단될 수 있는 이황화 링커, 세포내 단백질 가수분해할 수 있도록 디자인된 비환원성 티오에테르 링커, 다약제 내성에 대한 활성 향상시키기 위해 디자인된 친수성 링커, DNA 특이적 결합을 위해 디자인된 DNA 알킬화제 등이 링커로 사용될 수 있다.
또한, 상기 링커는 아자이드, 할로아세틸 기능기를 포함하는 알킬할라이드, 말레이미드, 아지리딘, 아크릴로일, 및 플루오로벤젠 등을 포함하는 아릴할라이드 및 이들의 유도체를 포함하는 링커로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 유도체는 예를 들어, 알킬화 반응기, 아릴화 반응기, 말레이미드기, 아자이드기, 아지리딘기, 아크릴로일기, 또는 피리딜 다이설파이드 및 티오니트로벤조익산 등을 포함하는 이황화 (disulfide) 상호교환 반응기일 수 있다.
상기 펩타이드 다합체 중 잔기와 면역조절제를 연결하는 링커의 결합은 알킬레이션, 이황화(disulfide) 상호교환 방법 또는 트랜스티오에스테르화 반응법 등을 통해 수행될 수 있다.
경우에 따라서, 상기 펩타이드 다합체는 면역조절제와의 결합을 위해 각 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 반응성 측쇄 (reactive side chain)를 포함할 수 있다. 이 때, 상기 반응성 측쇄는 C1-7 알킬카보닐 (alkylcarbonyl), 하이드라진(hydrazine), 싸이올 (thiol), 알킨 (alkyne), 아지도 (azido), 알코올 (alcohol), 또는 액시드 (acid) 등의 바이오 컨쥬게이션에 사용되는 측쇄일 수 있다. 상기 C1-7 알킬카보닐은 예를 들어, 아세틸, 프로피오닐, 발레로일, 펜타노일, 헥사노일, 헵타노일 또는 이소부타로일일 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 상기 접합체를 포함하는 면역질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
MTX-세포 투과 펩타이드를 면역세포에 처리함으로써, 면역세포에서 발현되는 사이토카인 종류의 하나인 TNF-α의 발현이 얼마나 줄어들었는지 여부를 확인하였다. 세포 투과 펩타이드에 연결되지 않은 MTX 및 펩타이드 모노머 세포 투과 펩타이드인 LK1과 MTX를 연결한 접합체 (LK1-MTX), 본 발명에 따른 LK3를 이용한 컨쥬게이트 (LK3-MTX)를 이용하였다. 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드인 LK3에 MTX 접합체 (LK3-MTX)를 세포에 처리한 경우에는 수백 나노몰 (IC50 = 130 nM)에서 TNF-α의 발현이 억제된 반면, 기존에 알려진 세포 투과 펩타이드를 이용한 MTX 접합체 (LK1-MTX)는 낮은 마이크로몰 (IC50 = ~1μM)에서 비슷한 정도의 사이토카인 발현 억제를 보였다. 특히, MTX 만을 처리한 대조구는 100 마이크로몰 이상의 농도에서만 (IC50 = ~14μM) 비슷한 사이토카인 발현 억제 양상을 보였다. 따라서, 본 발명에 따른 LK3-MTX 접합체는 MTX 단독 사용에 비해 약 1/100 묽은 농도에서도 면역반응 억제효과를 보이고 있음을 알 수 있다. 이 사실에 근거하여, MTX를 세포 투과 펩타이드에 연결하여 류마티스성 관절염 환자에 투여할 경우, 현재 사용 농도의 1/100 이하를 사용하여도 약효를 나타낼 수 있는 가능성이 있음을 시사한다. 이를 근거로, 세포 투과 펩타이드를 이용하여 부작용이 훨씬 적은 MTX신약을 제조할 수 있다.
세포 투과 펩타이드와 MTX 접합체들의 암세포에 대한 독성은 낮은 마이크로몰 정도의 LD50 값을 가졌다. 이는 세포 투과 펩타이드에 의해 MTX가 세포 내로 잘 투과하여, DNA합성에 관여하는 효소를 억제하였기 때문으로 사료된다. 그러나, MTX 및 세포 투과 펩타이드와 MTX 접합체들의 면역세포에 대한 독성은 그리 크게 나타나지 않았다. 특히, 접합체 (LK3-MTX, LK1-MTX)가 TNF-a를 방출 억제하는 농도인 나노몰이나 낮은 마이크로몰의 농도에선 면역세포인 마크로파지는 전혀 죽지 않았음을 알 수 있었다 (도 6c). 따라서, LK3-MTX의 TNF-a를 억제하는 약효는 MTX의 dehydrofolate reductase 효소를 억제하여 DNA의 합성을 저해하는 MTX의 역할과는 무관함을 증명할 수 있다.
본 발명에 따른 면역질환은 인체 내 면역체계의 과도한 반응으로 일어나는 질환을 의미하며, 생체 내 면역체계의 반응으로 인해 일어나게 되는 염증 반응에 의한 염증질환을 포괄하는 의미이다. 상기 접합체를 통해 치료 가능한 면역질환은 예를 들어, 류마티스성 관절염, 건선, 크론병, 다발성 경화증, 인슐린 의존성 당뇨병, 자가면역성 간염, 궤양성 대장염, 자가면역성 심근염, 건선, 피부경화증, 중증근육무력증, 다발성 근육염/피부 근육염, 하시모토병, 자가면역 적혈구무형성증, 재생 불량성 빈혈, 쇼그렌 증후군, 혈관염 증후군, 전신홍반루푸스 골수(조혈모세포)이식에 의한 이식편대숙주병로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물은 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 한 성분 또는 둘 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다. 특히, 동결건조(lyophilized)된 형태의 제형으로 제제화하여 제공하는 것이 바람직하다. 동결건조 제형 제조를 위해서 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려져 있는 방법이 사용될 수 있으며, 동결건조를 위한 안정화제가 추가될 수도 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍톤 약학 과학(Remington's pharmaceutical Science, Mack Publishing company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질병에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물에 포함되는 유효성분 등의 함량 및 투여방법은 통상의 환자의 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한, 액제, 주사제 등의 다양한 형태로 제제화 할 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공될 수도 있다.
본 발명에 따른 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설비율 또는 질병의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 임상 투여를 위해 공지의 기술을 이용하여 본 발명의 조성물을 적합한 제형으로 제제화할 수 있다.
상기 조성물은 적합한 투여량이 달성되도록 유효량의 접합체를 포함한다. 예를 들어, 접합체의 양은 조성물 중량의 약 0.01％ 이상이다. 경구 투여로 의도된 경우, 접합체의 양은 조성물의 약 0.1 중량％ 내지 약 80 중량％ 범위로 다양할 수 있다. 경구용 조성물은 조성물의 약 4 중량％ 내지 약 50 중량％로 접합체를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 비경구 투여 단위가 약 0.01 중량％ 내지 약 50 중량％의 접합체를 함유하도록 제조될 수 있다.
정맥내 투여의 경우, 조성물은 체중 1 kg 당 약 0.01~약 100 mg, 바람직하게 1~100 mg, 더욱 바람직하게 0.1~25 mg의 접합체를 포함할 수 있다. 일반적으로, 환자에게 투여되는 접합체의 투여량은 전형적으로 동물의 체중 1 kg 당 약 0.01 mg/kg 내지 약 2000 mg이다. 조성물은 임의의 편리한 경로를 통해, 예를 들어 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 (예를 들어, 경구 점막, 직장 및 소장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 접합체를 포함하는 조성물은 면역세포로부터 사이토카인 분비를 억제하여 면역질환의 증상을 완화시키며, 면역질환에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 또는 일시적 완화시키며, 예후를 개선시킬 수 있다.
본 발명에 따른 접합체를 포함하는 조성물은 면역세포에 약물 또는 약물 단위를 전달하는 데 이용되거나, 상기 접합체는 수용체-매개된 세포내이입을 통해 면역세포 내부로 흡수될 수 있다. 세포 내부에서는 펩타이드 다합체로부터 약물 또는 (비절단성) 링커-약물을 방출시킨 후, 방출된 약물 또는 약물-링커 화합물은 세포 내에서 세포독성 활성 또는 세포증식억제 활성을 유도하거나, 면역조절제는 면역세포 외부에서 접합체로부터 분리된 이후 약물 또는 약물-링커 화합물이 세포에 침투하는 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 투여 대상 환자는 면역조절제를 사용한 면역질환 치료에 반응성이라고 밝혀진 바 없거나, 밝혀진 바 있는 경우를 모두 포함할 수 있다.
경우에 따라서, 환자에 필요한 유효량의 추가 치료법 예를 들어, 접합체에 포함된 면역조절제 이외의 기타 화학요법제 등의 면역조절제를 적용하거나, 면역질환의 치료에 사용되는 바이오의약품, 예를 들어 항-TNFα 항체를 병용할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : Cell penetrating peptide의 제조
PCT/KR2014/009778의 실시예 1에 기재된 바와 같이 단량체 LK (LKKLLKLLKKLLKLAG), 시스테인이 두 개 들어간 단량체 A (CKKLLKLCKKLLKLAG), B (LKKCLKLLKKCLKLAG), C (LKKLCKLLKKLCKLAG), D (LKKLLKCLKKLLKCAG), E (LKKLLKLCKKLLKLCG), LK 아미노산 서열에서 모든 K를 R로 치환한 단량체 AR (LRRLLRLLRRLLRLAG), 시스테인이 두 개씩 들어간 단량체 RA (CRRLLRLCRRLLRLAG), RB (LRRCLRLLRRCLRLAG), RC (LRRLCRLLRRLCRLAG), RD (LRRLLRCLRRLLRCAG), RE (LRRLLRLCRRLLRLCG)등을 고체상 합성법과 Fmoc 화학을 이용하여 제조하였다. 세포 내로 투과하는 성질을 관측하기 위해 펩타이드의 N-말단에 FITC를 라벨링한 펩타이드도 제조하였다. 합성된 펩타이드들은 MALDI-TOF 질량 분석기에 의해 분자량을 다음과 같이 확인하였다.
LK - MS [M+H]+: 1861.3 (calcd.), 1862.3 (found), FITC-labeled LK - MS [M+H]+: 2208.4 (calcd.), 2208.0 (found), C - MS [M+H]+: 1841.2 (calcd.), 1840.8 (found), FITC-labeled C - MS [M+H]+: 2188.2 (calcd.), 2188.5 (found))
실시예 2: MTX conjugation with Cell penetrating peptide
Resin bound N-terminal Fmoc deprotected 단량체 (LK1, 15 mg, 8.9 μmol)에 N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU, 10 mg, 3 eq)와 hydroxybenzotriazole (HOBt, 1.8 mg, 1.5 eq), methotrexate (12 mg, 3 eq), diisopropylethylamine (9.3 μL, 3 eq)의 dimethylformaide (DMF, 500 μL) 용액을 넣어 상온에서 2 시간 교반하였다. 얻어진 methotrexate conjugated 단량체 펩타이드 (LK1-MTX)를 HPLC로 분리하고 이를 0.1 M ammonium bicarbonate (pH 8.3) 조건에서 교반하여 air oxidation을 하였다 (도 2). 그 결과, MTX-이합체 펩타이드 접합체 (LK3-MTX)를 위와 같이 얻었다. 도 3는 HPLC trace를 나타내며, 각 peak은 MALDI-TOF MS로 확인되었다. MTX 단량체 접합체 (LK1-MTX): MS [M+H]+: 2235.3 (calcd) 2237.4 (obsd) (도 4). MTX 이합체 접합체(LK3-MTX): MS [M+H]+: 4465.7 (calcd) 4469.7 (obsd) (도 5).
실시예 3 : 저농도에서 세포 내 전달 가능성 확인
본 발명에 따른 MTX-이합체 펩타이드 접합체 (LK3-MTX)의 경우 cell proliferation에 대한 영향을 확인하기 위해 암세포인 MDA MB 231 cell과 MCF7 cell, 면역세포인 마크로파지 (RAW 264.7 cell) (서울대 세포주 은행 KCLB #30026, #30022, #40071)을 이용하여 cell viability를 확인하였고, MTX 단독으로 약물을 처리하였을 때보다 낮은 IC50 값을 가짐을 확인하였다 (MDA MB 231 cell에서 MTX와 LK3-MTX의 경우 각각 1.6과 0.17 μM의 IC50 값을 나타내고 있음. MCF7 cell에서는 해당 조건에서 IC50 값이 측정 불가능하나 상대적인 cell viability는 LK3-MTX가 낮음이 확인됨).
상대적으로 마크로파지 세포는 암세포주에 비해 cell viability가 좋아 10 μM의 농도에서도 80%정도 살아있음을 확인하였다 (도 6c). 또한, 펩타이드 이합체 단독으로는 경우 해당 농도에서 독성을 나타내고 있지 않음을 확인하였다. 각 세포에 대해 5 x 10^3 cell/well 로 96 well plate에서 실험을 진행하였으며, MDA MB 231 세포는 48 시간 동안, MCF7 세포는 72 시간 동안, RAW 264.7 세포는 24 시간 동안 해당농도의 약물을 10% FBS를 포함한 normal media에서 처리한 결과이다 (도 6).
실시예 4: 합성된 MTX-CPP (LK1-MTX & LK3-MTX)의 염증억제 효과
합성된 MTX-펩타이드 이합체 접합체(LK3-MTX)가 MTX 단독으로 처리한 대조군(MTX) 및 MTX의 펩타이드 단량체 접합체(LK1-MTX)에 비해 염증 억제 효과가 얼마나 있는지를 알기 위해 면역세포 중 하나인 마우스 마크로파지 세포주의 하나인 RAW264.7 세포를 대상으로 염증 반응시에 방출되는 싸이토카인 중에 하나인 Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-a)의 방출 억제 효과를 측정하는 실험을 수행하였다. TNF-a가 RAW264.7 세포와 같은 면역세포에서 LPS와 같은 외부 자극에 의해 생성되기 때문이다. TNF-a의 방출 측정은 LPS를 사용하여 면역반응을 유도 한 후, 다양한 농도의 MTX의 펩타이드 단량체 (LK1-MTX), 이합체 접합체 (LK3-MTX), MTX 등을 처리한 후, 억제 양상을 ELISA방법 (효소면역측정법)를 이용하여 측정하였다. 그 결과, LK3-MTX의 경우 134 nM의 IC50 값을 가진 반면, LK1-MTX (IC50=~1M), MTX (IC50=~14M)의 값을 가졌다. 따라서 LK3-MTX가 LK1-MTX에 비해 10배, MTX에 비해 100배의 TNF-a 방출 저해 효과를 가짐을 알 수 있었다 (도 7).
MTX 및 세포 투과 펩타이드와의 접합체들의 면역세포에 대한 독성은 그리 크게 나타나지 않았으며, 특히 접합체 (LK3-MTX, LK1-MTX)가 TNF-a를 방출 억제하는 농도인 나노몰이나 낮은 마이크로몰의 농도에선 면역세포인 마크로파지는 전혀 죽지 않았음을 알 수 있었다(도 6c). 따라서, LK3-MTX의 TNF-a를 억제하는 약효는 MTX의 dihydrofolate reductase 효소를 억제하여 DNA의 합성을 저해하는 것과 무관함을 알 수 있었다.
실시예 5: 합성된 MTX-CPP (LK3-MTX)의 in vivo 염증억제 효과
관절염 모델 마우스에 대해서 합성된 MTX-펩타이드 이합체 접합체(LK3-MTX)가 MTX 단독으로 처리한 대조군 (MTX)에 비해 염증 억제 효과가 얼마나 있는 지 알기 위해 관절이 붓는 정도를 확인하여 항염증 효과를 다음과 같이 확인하였다 (도 8). 8주령의 C57BL/6J 수컷 마우스를 그룹별로 3 마리를 준비하였다. 이는 자가항원(Self antigen)인 glucose-6 phosphate isomerase(GPI)의 에피토프(epitope)를 인식할 수 있는 자가항체(autoantibody)가 혈액 내에 포함되어 있어, 자가항체 유도-관절염(Autoantibody induced arthritis)이 생성되는 K/BxN mouse의 serum을 사용하여 관절염(Rheumatoid arthritis)을 유도할 수 있다.
K/BxN 마우스의 경우 KRN T세포 수용체(TCR;T cell receptor)를 과발현하는 마우스(transgenic mouse)와 NOD 마우스를 교배하여 얻었고, 이 마우스는 자발적으로 관절염이 유도되는 마우스로 그 기전은 위에서 서술된 내용과 같다. 또한, 심한 자가면역질환에 의해서 생식능력이 없기 때문에 KRN 과발현 마우스와 NOD 마우스 교배를 통해서만 얻을 수 있다. K/BxN mouse serum을 day 0와 day 2에 각각 복강내 주사(i.p; intraperitoneal injection)를 통하여 80 μl씩 주사한다.
관절염 치료제로 알려진 MTX(Methotrexate)를 suboptimal condition인 0.5mg/kg의 용량으로 관절염 유도 마우스에 day 3, day 5, day 7에 각각 복강내 주사(i.p injection)하였다.
CPP(LK-3)와 MTX-CPP (LK3-MTX)도 injection한 MTX와 같은 농도(molarity)으로 정량하여 day 3, day 5, day 7에 각각 복강내 주사(i.p injection)하였다.
관절염을 유도한 후 day 0부터 day 10까지 매일 관절염 병증을 관찰하고, 관절염 유도 후 관절이 붓는 정도를 발목(ankle)의 두께를 caliper를 이용하여 잰다 (ankle관절이 thickness).
붓는 정도에 따라 병증 점수(Clinical score)를 다음과 같은 기준으로 모든 발목에 대해 점수를 매긴 후 각 점수를 합하여 0-12점으로 점수로 염증정도를 관찰하였다. 그 점수는 다음과 같다.
점수 0 : 붓지 않음.
점수 1 : 약하게 부은 정도, 정상 V자 형태의 발 상태를 유지함(발가락 쪽이 더 두꺼움)
점수 2 : V자 형태에서 더 부어서 발가락 쪽만큼 부어서 전체적으로 발이 사각형 모양인 경우
점수 3 : 심하게 부은 정도, 발가락 쪽보다 발목 쪽이 더 두꺼움.
그 결과 PBS 주입한 그룹, CPP만을 주입한 그룹은 염증완화 효과가 관찰되지 않았으며, MTX를 주입한 그룹은 염증완화 효과가 clinical score 부분에서 유의미하게 관찰되었다. 반면, MTX-CPP를 주입한 그룹은 MTX만을 주입한 그룹에 비해 더욱 염증완화 효과가 관찰되었다.
따라서 염증완화 약제로 사용되는 MTX에 CPP들 tagging하여 사용할 경우 염증완화 효과가 강화되는 것을 알 수 있었다.
본 발명에 따른 펩타이드-면역조절제 접합체는 나노몰의 농도에서도 면역세포 내로 우수한 효율로 전달되는 세포 투과성 펩타이드 다합체를 통해, 면역조절제 단독으로 사용한 경우와 비교하여 우수한 면역 억제 효과를 나타낼 뿐 아니라, 매우 낮은 농도에서도 면역질환 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (23)

  1. 동형 또는 이형의 알파나선형 양면성 펩타이드를 복수개 포함하는 세포 투과성 펩타이드 다합체; 및 상기 펩타이드에 결합된 면역조절제를 포함하는 접합체 (conjugate).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 면역조절제는 메토트렉세이트, 아자티오프린, 시클로포스파미드, 시클로스포린, 미코페놀레이트 모페틸, 타크롤리무스, 미조리빈, 라파마이신, 레플루노마이드, 데옥시스페르구알린, 브레퀴나르, 말로니트롤라미드, 스테로이드, 코르티코스테로이드 및 토파시티닙으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 접합체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 면역조절제와 비공유성 결합 또는 공유성 결합을 통해 연결되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 면역조절제와 링커를 통해 연결되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 i, i+3, i+4, i+7, i+8, i+10 및 i+11 (i는 정수)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 위치에 연결부를 포함하는 것을 특징으로 하는 접합체.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 펩타이드는 i, i+3, i+4, i+7, i+8, i+10 및 i+11 (i는 정수)로 이루어진 군에서 선택된 두 개 이상의 아미노산 위치에 존재하는 것을 특징으로 하는 접합체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 알지닌, 라이신 및 히스티딘으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 친수성 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 접합체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 루신, 발린, 트립토판, 페닐알라닌, 타이로신 및 이소루신으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 소수성 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 접합체.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 5-50개의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 접합체.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 7-23개의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 접합체.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드 중 친수성 및 소수성 아미노산 각각이 한 개 내지 세 개씩 교대로 배열되어 있는 것을 특징으로 하는 접합체.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 양면성 펩타이드는 다음의 식으로 표시되는 7개 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 접합체:
    XYXXYYX YXYYXXY
    XYYXYYX YXXYXXY
    XYYXXYX YXXYYXY
    XYYXXYY YXXYYXX
    XXYXXYY YYXYYXX
    XXYYXYY YYXXYXX
    XXYYXXY YYXXYYX
    상기 식에서, X는 친수성 아미노산이고, Y는 소수성 아미노산임.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드의 친수성 아미노산 중 양전하를 띄는 알지닌, 라이신 및 히스티딘으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기를 33% 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 접합체.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드의 소수성 아미노산 중 루신, 트립토판, 발린, 페닐알라닌, 타이로신 및 이소루이신으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기를 25% 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 접합체.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 다음의 서열번호 11로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 접합체:
    KLLKLLK (서열번호 11).
  16. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 다음의 식으로 표시되는 아미노산 배열 중 하나 이상을 가지는 것을 특징으로 하는 접합체:
    CYYXXYXCYYXXYXZW (1)
    XYYCXYXXYYCXYXZW (2)
    XYYXCYXXYYXCYXZW (3)
    XYYXXYCXYYXXYCZW (4); 및
    XYYXXYXCYYXXYXCW (5)
    상기 식에서, X, Z 및 W는 소수성 아미노산, Y는 친수성 아미노산이며, C는 시스테인을 나타냄.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 접합체.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드의 알파 나선도는 트리플루오로에탄올 (Trifluoroethanol) 및 버퍼가 1:1로 혼합된 세포막 조건에서 80% 이상인 것을 특징으로 하는 접합체.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 연결부는 펩타이드 사이의 공유결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 접합체.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 공유결합은 시스테인 사이의 이황화 결합, 말레이미드 결합, 에스터 결합, 티오에테르 결합 및 클릭 반응(click reaction)에 의한 결합으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 접합체.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 다합체는 이합체, 삼중합체 또는 사중합체인 것을 특징으로 하는 접합체.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 접합체를 포함하는 면역질환 치료용 약학 조성물.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 면역질환은 류마티스성 관절염, 건선, 크론병, 다발성 경화증, 인슐린 의존성 당뇨병, 자가면역성 간염, 궤양성 대장염, 자가면역성 심근염, 건선, 피부경화증, 중증근육무력증, 다발성 근육염/피부 근육염, 하시모토병, 자가면역 적혈구무형성증, 재생 불량성 빈혈, 쇼그렌 증후군, 혈관염 증후군, 전신홍반루푸스 골수(조혈모세포)이식에 의한 이식편대숙주병로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
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