KR102095284B1 - 메토트렉세이트와 펩타이드의 결합체 - Google Patents

메토트렉세이트와 펩타이드의 결합체 Download PDF

Info

Publication number
KR102095284B1
KR102095284B1 KR1020170058867A KR20170058867A KR102095284B1 KR 102095284 B1 KR102095284 B1 KR 102095284B1 KR 1020170058867 A KR1020170058867 A KR 1020170058867A KR 20170058867 A KR20170058867 A KR 20170058867A KR 102095284 B1 KR102095284 B1 KR 102095284B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
peptide
compound
methotrexate
present
side chain
Prior art date
Application number
KR1020170058867A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180124412A (ko
Inventor
정용지
김은미
김선수
Original Assignee
(주)케어젠
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)케어젠 filed Critical (주)케어젠
Priority to KR1020170058867A priority Critical patent/KR102095284B1/ko
Priority to JP2019561985A priority patent/JP7018075B2/ja
Priority to BR112019023587-6A priority patent/BR112019023587A2/pt
Priority to EP18798236.8A priority patent/EP3613437A4/en
Priority to CN201880031177.4A priority patent/CN110621349B/zh
Priority to PCT/KR2018/005448 priority patent/WO2018208125A1/ko
Priority to US16/612,162 priority patent/US11253604B2/en
Publication of KR20180124412A publication Critical patent/KR20180124412A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102095284B1 publication Critical patent/KR102095284B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1617—Organic compounds, e.g. phospholipids, fats
    • A61K9/1623—Sugars or sugar alcohols, e.g. lactose; Derivatives thereof; Homeopathic globules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1652—Polysaccharides, e.g. alginate, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1664—Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2013—Organic compounds, e.g. phospholipids, fats
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2013—Organic compounds, e.g. phospholipids, fats
    • A61K9/2018—Sugars, or sugar alcohols, e.g. lactose, mannitol; Derivatives thereof, e.g. polysorbates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2022—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/205—Polysaccharides, e.g. alginate, gums; Cyclodextrin
    • A61K9/2059—Starch, including chemically or physically modified derivatives; Amylose; Amylopectin; Dextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/4841—Filling excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/4858—Organic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/4841—Filling excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/4866—Organic macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

본 발명은 항암 또는 항염증용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 메토트렉세이트와 펩타이드가 공유결합으로 연결된 구조를 갖는 화합물 및 이를 포함하는 항암 또는 항염증용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 메토트렉세이트와 펩타이드가 공유결합으로 연결된 구조를 갖는 화합물은 항암 또는 항염증 작용과 같은 생리활성이 우수할 뿐만 아니라 세포에 대한 독성이 현저하게 감소되므로, 의약품과 같은 다양한 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

메토트렉세이트와 펩타이드의 결합체{CONJUGATE OF METHOTREXATE AND PEPTIDE}
본 발명은 메토트렉세이트와 펩타이드가 공유결합으로 연결된 구조를 갖는 화합물 및 그의 용도에 관한 것이다.
메토트렉세이트(methotrexate, MTX)는 급성 림프모구성 백혈병, 골육종, 비호지킨 림프종을 포함한 다양한 소아암 치료에 가장 보편적으로 사용하는 약제로서, 급성 림프모구성 백혈병에서는 공고와 유지요법에서 중요한 약제로 사용된다. 메토트렉세이트는 대사 길항제(antimetabolites)로 디히드로폴레이트(dihydrofolate, FH2)가 테트라히드로폴레이트(tetrahydrofolate, FH4)로 되는데 필수 효소인 디히드로폴레이트 리덕타아제와 결합하여 FH4 생성을 억제하여 DNA, RNA, 단백질 합성을 저해함으로써 항증식성 세포독성 효과를 나타내는 약제이다. 고용량 투여 시 투여량의 90%가 소변으로 배출되므로, 메토트렉세이트의 배설은 신장 기능과 밀접한 관련이 있다. 메토트렉세이트 투여 후 배설이 지연되면 약물의 축적으로 인한 부작용이 발생할 가능성이 높아지므로 투여 후 약물 농도 모니터링이 매우 중요하다. 메토트렉세이트 투여 후 발생할 수 있는 흔한 부작용으로는 간독성, 신장 독성, 혈액학적 독성, 구내염, 신경학적 증상들이 있으며, 독성으로 인한 사망률이 약 5-6%로 보고되었다. 메토트렉세이트는 세포내에서는 엽산과 같은 폴리글루탐산과 결합한 형태로 존재한다(비특허문헌 1).
또한, 메토트렉세이트는 염증 질환의 치료에서 유용한 것으로 알려져 있는데, 이와 관련하여 특허문헌 1에서는 염증성 자가면역 질환의 치료를 메토크렉세이트 용액 사용을 개시하고 있으며, 특허문헌 2에서는 유효량의 메토트렉세이트 및 A3 아데노신 수용체 아고니스트(A3AR 아고니스트)의 배합물을 투여하여 염증을 치료하는 방법에 대한 내용을 개시하고 있고, 특허문헌 3에서는 메토트렉세이트와 PTD(protein transduction domain)의 결합체 및 부형제를 함유하는 자가면역질환을 치료하기 위한 경피전달 약제 조성물을 개시하고 있으며, 특허문헌 4에서는 메토크렉세이트를 유효성분으로 함유하는 관절염 치료를 위한 경피투여용 조성물을 개시하고 있다(특허문헌 5).
그러나, 이와 같은 메토트렉세이트를 사용하면 뼈 골수의 파괴, 과다 출혈로 인한 플라크 파괴, 소화기관에서의 출혈, 위장 천공, 탈모, 간과 신장 기능의 장애 등과 같은 부작용이 생길 수 있음이 알려져 있다.
따라서, 상기와 같은 특성을 가진 메토크렉세이트의 부작용을 감소시키면서 생리학적 효능도 추가로 강화시킬 수 있는 신규한 화합물의 개발이 요구되고 있다.
대한민국 공개특허공보 제10-2009-0079876호 대한민국 공개특허공보 제10-2007-0100261호 대한민국 공개특허공보 제10-2007-0083862호 대한민국 공개특허공보 제10-2002-0032079호 대한민국 공개특허공보 제10-2012-0129121호
최선희 등, 종양간호연구지, 2014년, 제14권제2호, pp93-99
본 발명은 상기와 같은 종래 메토트렉세이트가 갖고 있는 문제점들을 개선하기 위한 것으로서, 자연형의 메토트렉세이트와 비교하여 동일하거나 더 뛰어난 생리학적 활성을 나타내면서도 부작용이 감소된 신규한 메토트렉세이트 유래의 화합물을 제공하는 것을 기술적 과제로 한다.
상기 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 메토트렉세이트와 펩타이드가 공유결합으로 연결된 구조를 갖는 화합물을 제공한다.
본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 펩타이드는 2 내지 30개, 바람직하게는 5 내지 20개, 더욱 바람직하게는 8 내지 15개, 더욱 바람직하게는 10 내지 12개의 아미노산 서열로 이루어질 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 펩타이드는 수용성 펩타이드인 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 수용성 펩타이드는 친수성 측쇄를 갖는 아미노산의 비율이 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 100%로 높은 것이 바람직하다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 수용성 펩타이드는 소수성 측쇄를 갖는 아미노산이 5개 이하, 바람직하게는 4개 이하, 보다 바람직하게는 3개 이하, 보다 바람직하게는 2개 이하, 보다 바람직하게는 1개 이하로 존재하며, 존재하지 않는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명은 상기에서 개시된 어느 한 화합물을 함유하는 항암 또는 항염증용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 메토트렉세이트와 펩타이드가 공유결합으로 연결된 구조를 갖는 화합물은 항암 또는 항염증 작용과 같은 생리활성이 우수할 뿐만 아니라 세포에 대한 독성이 현저하게 감소되므로, 의약품과 같은 다양한 분야에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 본 발명의 화합물 및 메토트렉세이트가 섬유아세포 및 각질세포에서 세포의 증식에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 2 및 도 3은 본 발명의 화합물 및 메토트렉세이트가 비장세포 및 각질세포에서 염증과 관련된 유전자들의 발현에 미치는 영향을 보여주는 RT-PCR 전기영동 사진이다.
도 4는 본 발명의 화합물 및 메토트렉세이트가 비장세포에서 IL-17 양성 세포의 집단(population)에 미치는 영향을 보여주는 유세포 분석(Flow Cytometry, FACS) 그래프이다.
도 5는 본 발명의 화합물 및 메토트렉세이트가 대식세포주에서 TNF-α 양성 세포의 집단에 미치는 영향을 보여주는 유세포 분석(FACS) 그래프이다.
도 6은 본 발명의 화합물 및 메토트렉세이트가 비장세포에서 활성화된 면역 및 APC 양성 세포의 집단에 미치는 영향을 보여주는 유세포 분석(FACS) 그래프이다.
도 7은 본 발명의 화합물 및 메토트렉세이트가 비장세포에서 염증성 사이토카인의 발현에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 화합물 및 메토트렉세이트가 각질세포주에서 MMP(matrix metalloproteinase)의 활성에 미치는 영향을 보여주는 전기영동 사진 및 그래프이다.
상기 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 메토트렉세이트와 펩타이드가 공유결합으로 연결된 구조를 갖는 화합물을 제공한다.
상기 메토트렉세이트는 화학식 C20H22N8O5의 화합물을 나타내는 것으로서, 하기 식으로 표시되는 화학적 구조를 갖는다.
Figure 112017044962940-pat00001
본 명세서에 있어서, "펩타이드"란 용어는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 상기 펩타이드는 본 기술분야에 공지된 통상의 생물학적 또는 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).
상기 펩타이드는 수용성 펩타이드인 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 펩타이드는 2 내지 30개, 바람직하게는 5 내지 20개, 더욱 바람직하게는 8 내지 15개, 더욱 바람직하게는 10 내지 12개의 아미노산 서열로 이루어진다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 펩타이드는 친수성 측쇄를 갖는 아미노산의 비율이 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 100%로 높은 것이 바람직하다. 다른 한편으로, 상기 펩타이드는 소수성 측쇄를 갖는 아미노산의 비율이 50% 미만, 바람직하게는 40% 이하, 보다 바람직하게는 30% 이하, 보다 바람직하게는 20% 이하, 보다 바람직하게는 10% 이하, 가장 바람직하게는 0%로 낮은 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서, "친수성 측쇄를 갖는 아미노산"은 아르기닌(Arg), 히스티딘(His), 리신(Lys), 아스파라긴산(Asp), 글루탐산(Glu), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln), 시스테인(Cys), 셀레노시스테인(Sec), 글리신(Gly) 및 프롤린(Pro)을 나타내고, "소수성 측쇄를 갖는 아미노산"은 알라닌(Ala), 발린(Val), 이소루이신(Ile), 루이신(Leu), 메티오닌(Met), 페닐알라닌(Phe), 티로신(Tyr) 및 트립토판(Trp)을 나타내지만 이에 한정되는 것은 아니며, 상기와 같은 자연계에 존재하는 아미노산들 이외에도 이들의 변형체 등도 제한없이 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 상기 펩타이드 내에 5개 이하, 바람직하게는 4개 이하, 보다 바람직하게는 3개 이하, 보다 바람직하게는 2개 이하, 보다 바람직하게는 1개 이하로 존재하며, 존재하지 않는 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드인 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 한 구현예에 따르면, 본 발명의 화합물은 양성대조군으로 사용된 메톡트렉세이트와 비교하여 현저하게 낮은 세포 독성을 나타내고(도 1 참조), 또한 세포내 염증 반응과 관련된 유전자의 발현을 현저하게 감소시킬 수 있다(도 2 및 도 3 참조). 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 화합물은 IL-17, TNF-α, 활성화된 면역 및 APC 양성 세포 집단의 수를 현저하게 감소시킬 수 있다(도 4 내지 도 6 참조). 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 화합물은 염증성 사이토카인인 IFN-γ 및 IL-17A의 분비를 현저하게 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라(도 7 참조), MMP 유전자의 발현을 현저하게 감소시킬 수 있다(도 8 참조).
본 발명의 화합물은 그 자체로도 안정성이 우수하지만, 화합물에 결합된 펩타이드를 구성하는 임의의 아미노산을 변형시킴으로써 안정성이 더욱 향상될 수 있다. 본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 펩타이드의 N-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 보호기가 결합되어 안정성을 더욱 향상시킬 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 펩타이드는 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 보호기가 결합되어 안정성을 더욱 향상시킬 수 있다.
전술한 것과 같은 아미노산의 변형은 본 발명의 화합물의 안정성을 크게 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에 있어서, "안정성"이란 용어는 "생체내(in vivo)" 안정성뿐만 아니라 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)과 같은 "시험관내(in vitro)" 안정성도 포괄하는 의미로 사용된다. 또한, 전술한 보호기는 생체내 및 시험관내에서 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 화합물을 보호하는 작용을 한다.
또한, 본 발명은 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암 또는 항염증용 조성물을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 조성물은 약학적 조성물의 형태일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 전술한 본 발명의 화합물을 유효성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 전술한 본 발명의 화합물의 약학적 유효량; 및 (b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물이다.
본 명세서에 있어서, "약학적 유효량"이란 용어는 전술한 본 발명의 화합물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 한 구현예에서, 상기 암은 급성 림프모구성 백혈병, 골육종, 비호지킨 림프종과 같은 혈액암뿐만 아니라 위암, 간암, 폐암, 대장암, 전립선암, 악성 흑색종, 유방암, 자궁암과 같은 고형암을 비제한적으로 포함하는 의미로 사용된다. 또한, 본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 염증 반응과 연관된 자가면역 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 상기 염증 반응과 연관된 자가면역 질환으로는 류마티스 관절염, 베체트병, 크론병, 비염, 천식 등을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 실제 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 생약 추출물 또는 생약 발효물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배로 함유할 수 있다. 개별 투약량은 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 본 발명의 화합물의 합성
<1-1> 서열번호 1의 펩타이드의 합성
클로로트리틸클로라이드 수지(Chloro trityl chloride resin; CTL resin, Nova biochem [0064] Cat No. 01-64-0021) 700 ㎎을 반응 용기에 넣고 메틸렌클로라이드(MC) 10 ㎖를 가하여 3분간 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름아마이드(DMF) 10 ㎖를 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반응기에 10 ㎖의 디클로로메탄 용액을 넣고 Fmoc-Trp-OH (Bachem, Swiss) 200 mmole 및 디이소프로필 에틸아민(DIEA) 400 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고, 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2:1)를 DCM(dichloromethane)에 녹여 10분간 반응시키고 과량의 DCM/DMF(1:1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름아마이드(DMF)를 10 ㎖ 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액(20%의 피페리딘/DMF) 10 ㎖를 반응 용기에 넣고 10분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10분간 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 각각 3분씩 DMF로 2회, MC로 1회, DMF로 1회 세척하여 Trp-CTL 수지를 제조하였다.
새로운 반응기에 10 ㎖의 DMF 용액을 넣고 Fmoc-Leu-OH(Bachem, Swiss) 200 mmole, HoBt 200 mmole 및 Bop 200 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반응기에 400mmole DIEA를 분획으로 2번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5분간 교반하였다. 녹인 아미노산 혼합 용액을 탈보호된 수지가 있는 반응 용기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 DMF 용액으로 3회 5분씩 교반한 후 제거하였다. 반응 수지를 소량 취하여 카이저 테스트(Nihydrin Test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반응시켜 Leu-Trp-CTL 수지를 제조하였다. DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다.
선정된 아미노산 서열에 의거하여 Fmoc-Asn(Trt), Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Asp(tBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Leu, Fmoc-Phe,및 Fmoc-Arg(Pbf) 순으로 연쇄반응을 시켰다. Fmoc-보호기를 탈보호 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 제거하였다. 제조된 펩티딜 수지를 DMF, MC 및 메탄올로 각각 3번을 세척하고, 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, P2O5 하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한뒤 탈루 용액[트리플루오로아세트산 95%, 증류수 2.5%, 티오아니졸(Thioanisole) 2.5%] 30 ㎖을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2시간 반응을 유지하였다. 필터링을 하여 수지를 여과하였고, 수지를 소량의 TFA 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 부피가 절반 정도 남도록 증류하고 50 ㎖의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전 RFLKRLDRNLW 펩타이드(서열번호 1)를 1.40 g 합성하였다(수율: 92.4%). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 분자량 1516.7(이론값: 1516.8)을 얻을 수 있었다
서열번호 아미노산 서열 분석값(질량분석기)
분석값 이론값
1 RFLKRLDRNLW 1516.7 1516.8
<1-2> 본 발명의 화합물의 합성
펩타이트 반응기에 펩타이딜 레진(1 mmol)과 1-메틸-2-피롤리돈(NMP) 10 ㎖를 넣고, 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt) 270 ㎎(2.0 equiv.)과 N,N,N',N'-테트라메틸-O-(1H-벤조트리아졸-1-일)우로니움 헥사플루오로포스페이트, O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트 759 ㎎(2.0 equiv.)과 메토트렉세이트 277 ㎎(2.0 equiv.) 첨가하고 30분간 반응시켰다. N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA) 388 ㎎(3 equiv.)을 첨가하여 상온에서 12∼48시간 동안 반응시키고, 여과하여 반응된 펩타이딜 수지를 수득하였다. 수득된 수지를 절단 용액(cleavage solution)을 사용하여 상온에서 2시간 반응하여 레진 및 보호기를 제거하였고, 디에틸에테르 10 ㎖(10 mmol)를 사용하여 재결정을 하여 하이브리드 펩타이드를 수득하였다.
실험예 1. 본 발명의 화합물의 세포 독성 테스트
실시예 <1-2>에서 합성된 본 발명의 메토트렉세이트-펩타이드 화합물이 세포 독성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 세포 증식 실험을 수행하였다. 구체적으로, NIH3T3 섬유아세포주와 HaCaT 각질세포주를 1×106 세포/웰로 96-웰 플레이트에 접종하여 배양하였고, 다음날에 상기 실시예 <1-2>에서 제조된 메토트렉세이트-펩타이드 화합물과 메토트렉세이트를 각각 3.9 내지 500 μM의 농도로 처리하였다. 48시간 동안 배양한 후 Ez-cytox 키트(대일랩/국내)를 이용한 MTT 분석을 통해 상기 화합물들이 세포의 증식에 미치는 영향을 확인하였다.
그 결과, 양성대조군으로 사용된 메톡트렉세이트는 양 세포주 모두에서 세포 증식을 억제하여 상당한 정도의 세포 독성을 보였으나, 본 발명의 메토트렉세이트와 펩타이드가 공유결합으로 연결된 구조를 갖는 화합물은 미처리 음성대조군과 유사하거나 오히려 이보다 더 뛰어난 세포 증식 활성을 보임으로써 세포 독성을 나타내지 않음을 확인하였다(도 1a 및 도 1b).
실험예 2. 본 발명의 화합물의 염증 억제 효과 (1)
실시예 <1-2>에서 합성된 본 발명의 메토트렉세이트-펩타이드 화합물이 염증 반응에 미치는 영향을 확인하기 위하여 RT-PCR 분석을 수행하였다. 구체적으로, 6-7 주령의 마우스를 희생하여 비장(spleen)을 얻고, 세포 여과기를 이용하여 비장을 으깨어 무혈청 RPMI-1640 배지와 함께 원심분리하였다. 상층은 버리고 적혈구(RBC)를 제거하기 위해 RBC 용해 버퍼를 2회 사용하였다. 이후, 무혈청 RPMI-1640 배지로 세척한 뒤, 적당량의 무혈청 RPMI-1640 배지를 첨가하였다. 세포 수를 측정하여 24-웰 플레이트(1×107 세포/디쉬)로 접종하였고, 이튿날 실시예 <1-2>에서 합성된 본 발명의 메토트렉세이트-펩타이드 화합물 또는 메토트렉세이트(5 및 50 μM) 및 자극제로 사용된 LPS(10nM) 와 IL-17(200ng/ml) 을 처리하였다.
배양 24시간 후 RNA 추출 키트(Qiagen RNeasy kit)를 이용해 전체 RNA를 추출하였고, RNA로부터 단일 가닥 DNA를 합성하기 위하여 3 ㎍ RNA, 랜덤 헥사머 2 ㎍과 DEPC를 처리한 물을 가하고 65℃에서 5분간 반응시켰다. 5× 1차 가닥 버퍼, 0.1 M DTT, 10 mM dNTP, 역전사효소를 넣어 총 20 ㎖가 되게 하였고, 42℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 95℃에서 5분간 가열한 후, 증류수 20 ㎖를 가하여 최종 40 ㎖의 cDNA를 만들었다. 중합효소 연쇄 반응(PCR)은 3 ㎕ cDNA, TNF-α, COX-2, IL-1β, IL-17, IL-23, T-bet, GATA3 및 GAPDH 각 유전자에 특이적인 하기 표 2에 나타낸 10 pmole의 프라이머, 10× Tag 버퍼, 10 mM dNTP 및 i-Tag DNA 중합효소를 혼합하여 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 30초, 55~56℃에서 30초, 72℃에서 30초로 반응시켰다. 사이클 수 유전자들은 PCR 결과가 지수적으로 증폭할 수 있는 조건에서 분석하였다. 5 ㎖의 PCR 산물을 얻어 1% 아가로즈 젤에 전기영동하였고, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 염증 및 자가면역 질환과 연관된 유전자인 TNF-α, COX-2, IL-1β, IL-17, IL-23, T-bet 및 GATA3의 mRNA 레벨을 확인하였다.
인자 프라이머 서열 서열번호
TNF-α 정방향 (5') AACATCCAACCTTCCCAAACG (3') 2
역방향 (5') GACCCTAAGCCCCCAATTCTC (3') 3
COX-2 정방향 (5') ATCATTCACCAGGCAAATTGC (3') 4
역방향 (5') GGCTTCAGCATAAAGCGTTTG (3') 5
IL-1β 정방향 (5') TTCGACACATGGGATAACGA (3') 6
역방향 (5') TCTTTCAACACGCAGGACAG (3') 7
IL-17 정방향 (5') GGTCAACCTCAAAGTCTTTAACTC (3') 8
역방향 (5') TTAAAAATGCAAGTAAGTTTGCTG (3') 9
IL-23 정방향 (5') AGCGGGACATATGAATCTACTAAGAGA (3') 10
역방향 (5') GTCCTAGTAGGGAGGTGTGAAGTTG (3') 11
T-bet 정방향 (5') CCTCTTCTATCCAACCAGTATC (3') 12
역방향 (5') CTCCGCTTCATAACTGTGT (3') 13
GATA3 정방향 (5') GAAGGCATCCAGACCCGAAAC (3') 14
역방향 (5') ACCCATGGCGGTGACCATGC (3') 15
GAPDH 정방향 (5') GAAGGCATCCAGACCCGAAAC (3') 16
역방향 (5') ACCCATGGCGGTGACCATGC (3') 17
그 결과, 본 발명의 메토트렉세이트와 펩타이드가 공유결합으로 연결된 구조를 갖는 화합물은 메토트렉세이트와 비교하여 훨씬 낮은 농도에서도 염증의 형성과 연관된 유전자의 발현을 보다 현저하게 감소시킬 수 있음을 확인하였다(도 2).
실험예 3. 본 발명의 화합물의 염증 억제 효과 (2)
실시예 <1-2>에서 합성된 본 발명의 메토트렉세이트-펩타이드 화합물이 염증 반응에 미치는 영향을 확인하기 위하여 RT-PCR 분석을 수행하였다. 이를 위하여, 사용한 세포주로서 HaCaT 각질세포주를 사용하고, 염증 관련 유전자로서 건선의 진행과 관련이 있는 Keratin6A, Keratin16, Keratin5, Keratin14, S100A7, S100A8, S100A9 및 S100A12를 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 2와 동일한 방식으로 RT-PCR을 수행하였으며, 이때 상기 유전자들에 특이적인 프라이머로는 하기 표 3에 나타낸 프라이머를 사용하였다.
인자 프라이머 서열 서열번호
Keratin6A 정방향 (5') TGCCCACCTTTCCTCCCAGCAA (3') 18
역방향 (5') CCGGGTCTGACGGCTCGAAG (3') 19
Keratin16 정방향 (5') TGGACGTGAAGACGCGGCTGG (3') 20
역방향 (5') GATTTGGCGGCTGGAGGAGGTC (3') 21
Keratin5 정방향 (5') CTAAAGTGCGTCTGCTA (3') 22
역방향 (5') TGGGTGCTCAGATGGTATA (3') 23
Keratin14 정방향 (5') CTGCTGGAGGGCGAGGAATGC (3') 24
역방향 (5') CCACCGAGGCCACCGCCATA (3') 25
S100A7 정방향 (5') AGGTCCATAATAGGCATGAT (3') 26
역방향 (5') CAAGGACAGAAACTCAGAAA (3') 27
S100A8 정방향 (5') ATTTCCATGCCGTCTACAGG (3') 28
역방향 (5') GCCCAGTAACTCAGCTACTC (3') 29
S100A9 정방향 (5') GTCGCAGCTGGAACGCAACA (3') 30
역방향 (5') CCTGGCCTCCTGATTAGTGG (3') 31
S100A12 정방향 (5') CCTCTCTAAGGGTGAGCTGA (3') 32
역방향 (5') CTGGGTTTTGGTGAGGGAAA (3') 33
그 결과, 본 발명의 메토트렉세이트와 펩타이드가 공유결합으로 연결된 구조를 갖는 화합물은 메토트렉세이트와 비교하여 독성이 크게 완화되었을 뿐만 아니라, 훨씬 낮은 농도에서도 건선의 진행과 연관된 유전자의 발현을 보다 현저하게 감소시킬 수 있어, 메토트렉세이트보다도 효과가 오히려 증가되어 있음을 확인하였다(도 3).
실험예 4. 본 발명의 화합물이 IL-17A + /CD4 + 세포의 집단에 미치는 영향
실시예 <1-2>에서 합성된 본 발명의 메토트렉세이트-펩타이드 화합물이 IL-17A+/CD4+ 세포의 집단에 미치는 영향을 확인하기 위하여 유세포 분석(FACS)을 수행하였다. 구체적으로, 상기 실험예 2에 기재된 것과 같이 6-7 주령의 마우스로부터 비장세포를 분리한 후, 실시예 <1-2>에서 합성된 본 발명의 메토트렉세이트-펩타이드 화합물 또는 메토트렉세이트, 자극제로 사용된 LPS(2 ㎍/㎖) 및 Th17 분화 촉진 사이토카인인 TGF-β 및 IL-23(각각 20 ng/㎖)을 처리하였다. 24시간 후, Th17 분화 마커인 IL-17A 및 CD4에 특이적인 항체를 30분 동안 처리한 후 PBS로 2회 세척하였고, FACS 분석을 수행하였다.
그 결과, 본 발명의 메토트렉세이트와 펩타이드가 공유결합으로 연결된 구조를 갖는 화합물은 메토트렉세이트와 비교하여 IL-17+/CD4+ 세포 집단의 수를 현저하게 감소시킬 수 있음을 확인하였다(도 4).
실험예 5. 본 발명의 화합물이 TNF-α + /CD4 + 세포의 집단에 미치는 영향
실시예 <1-2>에서 합성된 본 발명의 메토트렉세이트-펩타이드 화합물이 TNF-α+/CD4+ 세포의 집단에 미치는 영향을 확인하기 위하여 유세포 분석(FACS)을 수행하였다. 구체적으로, 비만세포(Raw264.7)를 배양한 후, 실시예 <1-2>에서 합성된 본 발명의 메토트렉세이트-펩타이드 화합물 또는 메토트렉세이트및 자극제로 사용된 LPS(2 ㎍/㎖)를 처리하였다. 24시간 후, 비만세포 활성화 마커인 TNF-α 및 CD4에 특이적인 항체를 30분 동안 처리한 후 PBS로 2회 세척하였고, FACS 분석을 수행하였다.
그 결과, 본 발명의 메토트렉세이트와 펩타이드가 공유결합으로 연결된 구조를 갖는 화합물은 메토트렉세이트와 비교하여 TNF-α+/CD4+ 세포 집단의 수를 현저하게 감소시킬 수 있음을 확인하였다(도 5).
실험예 6. 본 발명의 화합물이 활성화된 면역 및 APC 양성 세포의 집단에 미치는 영향
실시예 <1-2>에서 합성된 본 발명의 메토트렉세이트-펩타이드 화합물이 활성화된 면역 및 APC 양성 세포의 집단에 미치는 영향을 확인하기 위하여 유세포 분석(FACS)을 수행하였다. 구체적으로, 비만세포(Raw264.7)를 배양한 후, 실시예 <1-2>에서 합성된 본 발명의 메토트렉세이트-펩타이드 화합물 또는 메토트렉세이트, 자극제로 사용된 LPS(2 ㎍/㎖) 및 Th17 분화 촉진 사이토카인인 TGF-β 및 IL-23(각각 20 ng/㎖)을 처리하였다. 24시간 후, 비만세포 분화 마커인 CD11b 및 CD86에 특이적인 항체를 30분 동안 처리한 후 PBS로 2회 세척하였고, FACS 분석을 수행하였다.
그 결과, 본 발명의 메토트렉세이트와 펩타이드가 공유결합으로 연결된 구조를 갖는 화합물은 메토트렉세이트와 비교하여 CD11b+/CD86+ 세포 집단의 수를 현저하게 감소시킬 수 있음을 확인하였다(도 6).
실험예 7. 본 발명의 화합물이 염증성 사이토카인의 발현에 미치는 영향
실시예 <1-2>에서 합성된 본 발명의 메토트렉세이트-펩타이드 화합물이 비장 세포에서의 IL-17A 및 IFN-γ 분비에 미치는 영향을 확인하기 위하여 효소면역측정법(ELISA)을 수행하였다. 구체적으로, 상기 실험예 2에 기재된 것과 같이 6-7 주령의 마우스로부터 비장세포를 분리한 후, 실시예 <1-2>에서 합성된 본 발명의 메토트렉세이트-펩타이드 화합물 또는 메토트렉세이트, 자극제로 사용된 LPS(2 ㎍/㎖) 및 Th17 분화 촉진 사이토카인인 TGF-β 및 IL-23(각각 20 ng/㎖)을 처리하였다. 48시간 후, Th17 분화시 분비 마커인 IL-17A 및 IFN-γ 에 특이적인 ELISA 키트(R&D사)를 사용하여 흡광도 측정(Spectramax M2, Molecular Devices사)을 수행하였다.
그 결과, 본 발명의 메토트렉세이트와 펩타이드가 공유결합으로 연결된 구조를 갖는 화합물은 메토트렉세이트와 비교하여 염증성 사이토카인인 IFN-γ 및 IL-17A의 분비를 현저하게 감소시킬 수 있음을 확인하였다(도 7).
실험예 8. 본 발명의 화합물의 MMP 활성 억제 효과
실시예 <1-2>에서 합성된 본 발명의 메토트렉세이트-펩타이드 화합물이 TNF-α 및 IL-17에 의해 유도되는 MMP의 활성에 미치는 영향을 확인하였다. 구체적으로, HaCaT 각질세포를 배양 후 5, 10 또는 100 μM의 본 발명의 메토트렉세이트-펩타이드 화합물 또는 메토트렉세이트를 세포에 전처리하였고, 30분 후에 자극제인 TNF-α 및 IL-17을 처리하였다. 48시간 배양한 후 배양액을 수거하였고, 상기 배양액과 자이모그래피(zymography) 버퍼(4% SDS, 0.01% bromophenolblue, 20% glycerol, 0.125 M Tris-Cl (pH 6.8))(Sigma)를 1:1로 반응시킨 후, 20 ㎕의 반응액을 8% SDS-PAGE(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)(10% gelatin)에 전기영동하였다. 그 후 겔을 0.1% Triton X-100(대정화금) 버퍼에 10분 동안 3회 세척하였고 TNCB (50mM Tris (pH7.5), 150mM NaCl, 10mM CaCl2/D.W)(Sigma-Aldrich) 버퍼에 활성화시켰으며, 쿠마시 블루 염색한 후, 밴드의 강도를 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 메토트렉세이트와 펩타이드가 공유결합으로 연결된 구조를 갖는 화합물은 메토트렉세이트와 비교하여 훨씬 낮은 농도에서도 MMP-9 및 MMP-2 유전자의 발현을 보다 현저하게 감소시킬 수 있음을 확인하였다(도 8).
제조예 1. 약학적 조성물의 제조
<1-1> 산제의 제조
본 발명의 메토트렉세이트 펩타이드 ·········2 g
유당························1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<1-2> 정제의 제조
본 발명의 메토트렉세이트 펩타이드 ········100 ㎎
옥수수 전분 ···················100 ㎎
유당·······················100 ㎎
스테아린산 마그네슘 ················2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<1-3> 캡슐제의 제조
본 발명의 메토트렉세이트 펩타이드 ········100 ㎎
옥수수 전분 ···················100 ㎎
유당·······················100 ㎎
스테아린산 마그네슘 ················2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<1-4> 환의 제조
본 발명의 메토트렉세이트 펩타이드 ·········1 g
유당·······················1.5 g
글리세린······················1 g
자일리톨·····················0.5 g
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
<1-5> 과립의 제조
본 발명의 메토트렉세이트 펩타이드 ········150 ㎎
대두추출물 ····················50 ㎎
포도당······················200 ㎎
전분·······················600 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
<1-6> 주사액제의 제조
본 발명의 메토트렉세이트 펩타이드·······10 ㎍/㎖
묽은 염산 BP ·················pH 3.5로 될 때까지
주사용 염화나트륨 BP ·············최대 1 ㎖
적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 본 발명의 TRPV1 억제 펩티드를 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절한 후, 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시켰으며, 120℃에서 15분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.
<110> CAREGEN CO., LTD. <120> CONJUGATE OF METHOTREXATE AND PEPTIDE <130> 2017-DPA-2210 <160> 33 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 1 <400> 1 Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp 1 5 10 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for TNF-alpha <400> 2 aacatccaac cttcccaaac g 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for TNF-alpha <400> 3 gaccctaagc ccccaattct c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for COX-2 <400> 4 atcattcacc aggcaaattg c 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for COX-2 <400> 5 ggcttcagca taaagcgttt g 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for IL-1beta <400> 6 ttcgacacat gggataacga 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for IL-1beta <400> 7 tctttcaaca cgcaggacag 20 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for IL-17 <400> 8 ggtcaacctc aaagtcttta actc 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for IL-17 <400> 9 ttaaaaatgc aagtaagttt gctg 24 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for IL-23 <400> 10 agcgggacat atgaatctac taagaga 27 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for IL-23 <400> 11 gtcctagtag ggaggtgtga agttg 25 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for T-bet <400> 12 cctcttctat ccaaccagta tc 22 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for T-bet <400> 13 ctccgcttca taactgtgt 19 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for GATA3 <400> 14 gaaggcatcc agacccgaaa c 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for GATA3 <400> 15 acccatggcg gtgaccatgc 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for GAPDH <400> 16 gaaggcatcc agacccgaaa c 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for GAPDH <400> 17 acccatggcg gtgaccatgc 20 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Keratin6A <400> 18 tgcccacctt tcctcccagc aa 22 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Keratin6A <400> 19 ccgggtctga cggctcgaag 20 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Keratin16 <400> 20 tggacgtgaa gacgcggctg g 21 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Keratin16 <400> 21 gatttggcgg ctggaggagg tc 22 <210> 22 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Keratin5 <400> 22 ctaaagtgcg tctgcta 17 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Keratin5 <400> 23 tgggtgctca gatggtata 19 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Keratin14 <400> 24 ctgctggagg gcgaggaatg c 21 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Keratin14 <400> 25 ccaccgaggc caccgccata 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for S100A7 <400> 26 aggtccataa taggcatgat 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for S100A7 <400> 27 caaggacaga aactcagaaa 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for S100A8 <400> 28 atttccatgc cgtctacagg 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for S100A8 <400> 29 gcccagtaac tcagctactc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for S100A9 <400> 30 gtcgcagctg gaacgcaaca 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for S100A9 <400> 31 cctggcctcc tgattagtgg 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for S100A12 <400> 32 cctctctaag ggtgagctga 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for S100A12 <400> 33 ctgggttttg gtgagggaaa 20

Claims (14)

  1. 메토트렉세이트와 단일 펩타이드가 공유결합으로 연결된 구조를 갖는 화합물로서,
    상기 펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자이고, 상기 펩타이드는 2 내지 30개의 아미노산 서열로 이루어지는 수용성 펩타이드이며, 상기 수용성 펩타이드는 친수성 측쇄를 갖는 아미노산의 비율이 50% 이상 100% 이하이고, 소수성 측쇄를 갖는 아미노산의 비율이 0% 이상 50% 미만인 펩타이드이며, 상기 친수성 측쇄를 갖는 아미노산은 아르기닌(Arg), 히스티딘(His), 리신(Lys), 아스파라긴산(Asp), 글루탐산(Glu), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln), 시스테인(Cys), 셀레노시스테인(Sec), 글리신(Gly) 및 프롤린(Pro)으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 알라닌(Ala), 발린(Val), 이소루이신(Ile), 루이신(Leu), 메티오닌(Met), 페닐알라닌(Phe), 티로신(Tyr) 및 트립토판(Trp)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 펩타이드는 8 내지 15개의 아미노산 서열로 이루어지는 수용성 펩타이드인 화합물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 수용성 펩타이드는 친수성 측쇄를 갖는 아미노산의 비율이 70% 이상 100% 이하인 화합물.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 수용성 펩타이드는 친수성 측쇄를 갖는 아미노산의 비율이 90% 이상 100% 이하인 화합물.
  8. 삭제
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 수용성 펩타이드는 소수성 측쇄를 갖는 아미노산이 0개 이상 5개 이하인 화합물.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 수용성 펩타이드는 소수성 측쇄를 갖는 아미노산이 0개 이상 3개 이하인 화합물.
  11. 삭제
  12. 청구항 1에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열번호 1로 구성되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드인 화합물.
  13. 청구항 1, 청구항 3, 청구항 6, 청구항 7, 청구항 9, 청구항 10 및 청구항 12 중 어느 한 항의 화합물을 함유하는 항염증용 약학적 조성물.
  14. 청구항 13에 있어서,
    산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 항염증용 약학적 조성물.
KR1020170058867A 2017-05-11 2017-05-11 메토트렉세이트와 펩타이드의 결합체 KR102095284B1 (ko)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170058867A KR102095284B1 (ko) 2017-05-11 2017-05-11 메토트렉세이트와 펩타이드의 결합체
JP2019561985A JP7018075B2 (ja) 2017-05-11 2018-05-11 メトトレキサートとペプチドの結合体
BR112019023587-6A BR112019023587A2 (pt) 2017-05-11 2018-05-11 Conjugado de metotrexato e peptídeo
EP18798236.8A EP3613437A4 (en) 2017-05-11 2018-05-11 METHOTREXATE-PEPTIDE BINDER
CN201880031177.4A CN110621349B (zh) 2017-05-11 2018-05-11 甲氨蝶呤和肽的偶联物
PCT/KR2018/005448 WO2018208125A1 (ko) 2017-05-11 2018-05-11 메토트렉세이트와 펩타이드의 결합체
US16/612,162 US11253604B2 (en) 2017-05-11 2018-05-11 Conjugate of methotrexate and peptide

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170058867A KR102095284B1 (ko) 2017-05-11 2017-05-11 메토트렉세이트와 펩타이드의 결합체

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180140049A Division KR20180125420A (ko) 2018-11-14 2018-11-14 메토트렉세이트와 펩타이드의 결합체

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180124412A KR20180124412A (ko) 2018-11-21
KR102095284B1 true KR102095284B1 (ko) 2020-04-01

Family

ID=64105529

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170058867A KR102095284B1 (ko) 2017-05-11 2017-05-11 메토트렉세이트와 펩타이드의 결합체

Country Status (7)

Country Link
US (1) US11253604B2 (ko)
EP (1) EP3613437A4 (ko)
JP (1) JP7018075B2 (ko)
KR (1) KR102095284B1 (ko)
CN (1) CN110621349B (ko)
BR (1) BR112019023587A2 (ko)
WO (1) WO2018208125A1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112094321B (zh) * 2019-06-18 2022-04-22 首都医科大学 His-Gly-Glu修饰的甲氨蝶呤,其合成,抗转移活性和应用
CN112094322B (zh) * 2019-06-18 2022-04-22 首都医科大学 His-Gly-Lys修饰的甲氨蝶呤,其合成,抗肿瘤活性和应用
CN112094317B (zh) * 2019-06-18 2022-04-22 首都医科大学 His-Gly-Lys修饰的甲氨蝶呤,其合成,抗转移活性和应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1098664T3 (da) 1998-07-22 2003-11-17 Osprey Pharmaceuticals Ltd Sammensætninger og deres anvendelser til at behandle sekundær vævsskade og andre inflammatoriske tilstande og forstyrrelser
WO2000064486A2 (en) * 1999-04-28 2000-11-02 Vectramed, Inc. Enzymatically activated polymeric drug conjugates
KR100439204B1 (ko) 2000-10-25 2004-07-07 주식회사 삼양사 메토트렉세이트를 유효성분으로 함유하는 경피투여용 조성물
SE0201863D0 (en) 2002-06-18 2002-06-18 Cepep Ab Cell penetrating peptides
EP1809291A4 (en) 2004-11-03 2012-04-04 Forhumantech Co Ltd PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR TRANSDERMAL LEVY
EP1817079B1 (en) 2004-12-02 2008-07-30 Can-Fite Biopharma Ltd. Treatment of inflammation
DE102006033837A1 (de) 2006-07-21 2008-01-31 Medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate m.b.H Konzentrierte Methotrexat-Lösungen
JP5750373B2 (ja) * 2008-11-17 2015-07-22 コーベンハブンス ウニベルシテト 慢性炎症性応答の調節および自己免疫疾患の処置のためのｉｌ−４由来ペプチド
EP2576594B1 (en) * 2010-05-30 2016-07-13 The Governing Council Of The University Of Toronto Mitochondrial penetrating peptides as carriers for antimicrobials
KR101828607B1 (ko) 2011-05-19 2018-02-14 가톨릭대학교 산학협력단 세포 현탁액 및 메토트렉세이트를 포함하는 나노좀 형태의 면역치료제
WO2016085279A2 (ko) * 2014-11-28 2016-06-02 서울대학교산학협력단 세포 투과 펩타이드-면역조절제 접합체 및 이를 포함하는 면역질환 치료용 조성물
KR20160064726A (ko) * 2014-11-28 2016-06-08 서울대학교산학협력단 세포 투과 펩타이드-항암제 접합체 및 이를 포함하는 암 치료용 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
US11253604B2 (en) 2022-02-22
EP3613437A4 (en) 2020-05-27
WO2018208125A1 (ko) 2018-11-15
JP2020519623A (ja) 2020-07-02
CN110621349B (zh) 2023-05-16
BR112019023587A2 (pt) 2020-05-26
CN110621349A (zh) 2019-12-27
US20210236648A1 (en) 2021-08-05
JP7018075B2 (ja) 2022-02-09
KR20180124412A (ko) 2018-11-21
EP3613437A1 (en) 2020-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109513010B (zh) 肿瘤细胞特异性响应的自组装药物纳米缀合物
KR101479148B1 (ko) 주형 고정된 펩타이드 모방체
EP2875824A1 (en) Composition for preventing or treating cachexia
US11253604B2 (en) Conjugate of methotrexate and peptide
TW202116793A (zh) 介白素-23受體之肽抑制劑及其於治療發炎疾病的用途
CN114341161A (zh) 白细胞介素-23受体的肽抑制剂及其用于治疗炎症性疾病的用途
KR102211985B1 (ko) 신규한 올리고펩티드 및 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
ES2745544T3 (es) Péptido para inhibir la diferenciación de osteoclastos y uso del mismo
CN101443352A (zh) 从Gaegurin 5合成和制备的抗菌和抗癌多肽的新型类似物
JP4813720B2 (ja) ヒト循環ウイルス阻害ペプチド（ｖｉｒｉｐ）及びその使用
CN116693622A (zh) 基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物、制备方法及应用
WO2017113444A1 (zh) 用于肿瘤的Her-2多肽、组合物及制备方法和应用
KR20180125420A (ko) 메토트렉세이트와 펩타이드의 결합체
CN108295244B (zh) 用于治疗乳腺肿瘤的多肽
KR102266613B1 (ko) 항염증 활성을 갖는 신규한 펩티드 및 이의 용도
JP2003500334A (ja) 抗ｈｉｖ作用を有するｒａｎｔｅｓ由来ペプチド
CN110551179B (zh) 一种经修饰的抗hiv多肽及其制备方法和用途
CN110950929B (zh) 具有血栓溶解活性的多肽
CN111788217A (zh) 白介素-15活性的拮抗剂肽
JP2004002251A (ja) 生理活性複合体
CN100389125C (zh) 无指盘臭蛙丙精肽、基因和变异体
CN110612125B (zh) 异维a酸和肽的偶联物
WO2008050830A1 (fr) Agent anti-vih
JP3547504B2 (ja) 新規なポリペプチド及びその用途
BR112021008797A2 (pt) Polipeptídeos para o tratamento de síndromes de estresse, imunorreação e derrame

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
X091 Application refused [patent]
AMND Amendment
A107 Divisional application of patent
J201 Request for trial against refusal decision
J301 Trial decision

Free format text: TRIAL NUMBER: 2018101004640; TRIAL DECISION FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20181114

Effective date: 20200320

GRNO Decision to grant (after opposition)
GRNT Written decision to grant