CN116617264A - 一种用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂及其制备方法 - Google Patents

一种用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂及其制备方法，属于医药技术领域。将传代的人脐带血间充质干细胞加入保存液中，得到干细胞保存液；从葡萄皮中提取得到葡萄萃取液，然后发酵得到葡萄发酵液，合并后经过分子蒸馏得到葡萄黄酮醇类物质，与孕酮、孕烯醇酮、二十八烷醇包埋在丙交酯‑聚乙二醇聚合物微球中，并加入干细胞保存液，制得用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂，能护脐血中间充质干细胞的结构完整性和功能，促进其生长和传代，有效的延缓了其衰老，并将对AD症、抗衰老、抗氧化等有明显的改善作用的物质，制得的用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂对于AD症的改善和延缓有明显的的作用，具有广阔的应用前景。

Description

一种用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂及其制备方法。
背景技术
阿兹海默症(Alzheimer's disease，简称AD)又称老人痴呆症，是一种持续性神经功能障碍。最显著的早期症状为健忘，通常表现为逐渐增加的短期记忆缺失，随着病情的加重，病人的语言能力，空间辨别能力，认知能力会逐步衰退。由于阿兹海默症对老年人之生活会造成非常多的不便，且会使子女在精神上与经济上造成很大的负担，对于研究开发用于抗阿兹海默症药物具有重要的意义。
目前，已有一些核准上市用于预防和治疗阿兹海默症的药物：乙酰胆碱酶抑制剂(Ach-I)如Cognex(Tacrine)(1993)、Aricept(Donepezil)爱忆欣(1996)；Exelon(Rivastigmine)忆思能(2000)及Reminyl(Galantamine)利忆灵(2001)。麸胺酸受体桔抗剂则有Memantine(Ebixa忆必佳，Witgen威智)。这些药物可以延缓记忆的丧失，并且有助于患者执行日常起居所需的动作。但很重要的一点是这些药物并不能治愈阿兹海默症，它们只能减轻阿兹海默症的症状。此外，这些药物大多是化学合成的，会对患者造成一些副作用，如恶心、头疼、腹泻、失眠、疼痛、幻觉或晕眩等，因此它们并非实用的阿兹海默症治疗药物。
脐带间充质干细胞(UC-MSC)，主要指从新生儿脐带组织中提取的一种叫做间充质干细胞的细胞。间充质干细胞是一种多能干细胞，在不同的诱导条件下，可分化为多种组织细胞，如肌腱、血管、神经、脂肪、骨骼等多种组织分化，使其成为再生医学、组织器官损伤退行性疾病治疗领域的研究热点。间充质干细胞临床应用方面包括：①在骨关节炎方面，可以改善膝关节炎的预后；②在心血管疾病方面，衍生的外泌体已被证明具有改善缺血损伤、促进血管生成和保护心脏作用；③在糖尿病方面，可抑制刺激淋巴细胞的功能和传授胰岛素生产细胞分化潜力设定的低免疫原性，从而提供一种1型糖尿病疗法等。对于间充质干细胞，目前也应用于阿兹海默症，具体应用如下。
WO2016135295A1涉及一种遗传修饰的间充质干细胞(MSC)，所述干细胞包含外源核酸，所述外源核酸包含与启动子或启动子/增强子组合可操作连接的Klotho编码区。其涉及所述MSC用于治疗癌症、器官纤维化、肾功能衰竭、器官或器官系统的年龄相关变化、动脉硬化、神经变性疾病，例如阿尔茨海默病(AD)、多发性硬化症(MS)、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、帕金森病和/或精神分裂症，脓毒症和自身免疫性疾病以及自身免疫性相关疾病。
发明内容
本发明的目的在于提出一种用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂及其制备方法，能护脐血中间充质干细胞的结构完整性和功能，促进其生长和传代，有效的延缓了其衰老，从而使得其能够产生更多的有益物质，并将对AD症、抗衰老、抗氧化等有明显的改善作用的葡萄黄酮醇类物质、孕酮、孕烯醇酮、二十八烷醇包埋于相容性很好的聚合物微球中，制得的用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂对于AD症的改善和延缓有明显的的作用，具有广阔的应用前景。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂的制备方法，配制含有人血白蛋白、低分子肝素钙、茶多酚、牛磺酸和电解质注射液的保存液，并将传代的人脐带血间充质干细胞加入保存液中，得到干细胞保存液；从葡萄皮中溶剂提取得到葡萄萃取液，然后发酵得到葡萄发酵液，两者合并后经过分子蒸馏得到葡萄黄酮醇类物质，与孕酮、孕烯醇酮、二十八烷醇一同包埋在丙交酯-聚乙二醇聚合物微球中，并加入干细胞保存液，超声分散均匀，制得用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂。
作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：
S1.保存液的制备：配制含有人血白蛋白、低分子肝素钙、茶多酚、牛磺酸和复方电解质注射液的保存液；
S2.干细胞培养：将人脐带血间充质干细胞进行传代培养，待细胞长至75-80％融合时，用无菌PBS洗涤，加入步骤S1制得的保存液中，得到干细胞保存液；
S3.葡萄萃取液的制备：收集葡萄皮，干燥，粉碎，加入乙醇-乙酸的水溶液中，加热搅拌提取，过滤，重复2-3次，合并滤液，乙酸乙酯萃取，得到葡萄萃取液；
S4.葡萄发酵液的制备：将步骤S3中过滤得到的固体和碳源、氮源混合，加入无菌水中，灭菌，得到培养基，接种活化的白参菌菌种种子液，发酵培养，过滤，得到葡萄发酵液；
S5.葡萄黄酮醇类物质的分离：将步骤S3中葡萄萃取液和步骤S4中葡萄发酵液合并，加入分子蒸馏装置中，加热至第一温度蒸馏，去除一级蒸馏产物，提高至第二温度蒸馏，收集二级蒸馏产物，为葡萄黄酮醇类物质；
S6.包埋微球的制备：将经过重结晶的丙交酯、聚乙二醇混合，加入催化剂，惰性气体保护下加热搅拌反应，用乙酸乙酯溶解产物，沉淀，洗涤，干燥，产物与步骤S5制得的葡萄黄酮醇类物质、孕酮、孕烯醇酮、二十八烷醇一同溶于食用油中，搅拌混合均匀，加入含有乳化剂的去离子水中，乳化，透析除去食用油，冷冻干燥，得到包埋微球；
S7.用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂的制备：将步骤S6制得的包埋微球加入步骤S2制得的干细胞保存液中，超声分散均匀，灭菌，制得用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述保存液中人血白蛋白的含量为2-3wt％、低分子肝素钙的含量为60-70IU/mL、1-2wt％茶多酚、1.2-1.7wt％牛磺酸和复方电解质注射液余量。
作为本发明的进一步改进，步骤S2中所述培养的温度为35-38℃，CO2含量为4-6％、O2含量为27-30％，余量为氮气，其中％为体积百分比，所述干细胞保存液中干细胞浓度为105-106cells/mL。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中所述乙醇-乙酸的水溶液中乙醇、乙酸、水的体积比为3-5:2-4:5-7，所述加热搅拌提取的温度为60-70℃，时间为1-2h。
作为本发明的进一步改进，步骤S4中所述固体、碳源、氮源和无菌水的质量比为7-10:5-7:3-5:40-70，所述碳源选自葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、淀粉中的至少一种，所述氮源选自氨水、尿素、鱼粉、硝酸铵、氯化铵、硝酸钠中的至少一种，所述活化的白参菌菌种种子液的制备方法为将白参菌接种至高氏培养基中，38-42℃，50-70r/min，活化培养12-18h，制得含菌量为108-109cfu/mL的菌种种子液，所述活化的白参菌菌种种子液的接种量为2-3％，所述发酵培养的条件为38-42℃，50-70r/min，发酵培养36-48h。
作为本发明的进一步改进，步骤S5中所述葡萄萃取液和葡萄发酵液的质量比为10-12:15-25，所述第一温度为70-90℃，所述第二温度为150-170℃，所述蒸馏冷凝温度为2-5℃，刮膜转速为150-250r/min，进料流量为3-5mL/min，系统真空度为50-70Pa。
作为本发明的进一步改进，步骤S6中所述催化剂为辛酸亚锡、四甲基亚锡、三(三甲基硅基)亚锡、氧化亚锡、乙酰丙酮亚锡中的至少一种，所述丙交酯、聚乙二醇、催化剂的质量比为20-40:30-45:0.2-0.4，所述加热搅拌反应的温度为120-140℃，时间为10-12h，所述沉淀的方法为加入环己烷和丙酮的混合物沉淀，所述产物、葡萄黄酮醇类物质、孕酮、孕烯醇酮、二十八烷醇和食用油的质量比为12-15:2-3:0.3-0.5:0.1-0.2:1-2:70-100，所述食用油选自菜籽油、花生油、玉米油、橄榄油、亚麻籽油、大豆油、芝麻油、鱼油中的至少一种，所述含有乳化剂的去离子水中乳化剂含量为3-5wt％，所述乳化剂选自磷脂、赖氨酸、角蛋白、黄原胶中的至少一种，所述乳化的条件为12000-15000r/min乳化12-15min。
优选地，重结晶的丙交酯的制备方法为将丙交酯用乙酸乙酯重结晶2-3次；重结晶的聚乙二醇的制备方法为将聚乙二醇用乙醇重结晶2-3次。
作为本发明的进一步改进，步骤S7中所述包埋微球、干细胞保存液的质量比为5-7:30-50，所述超声分散的功率为1000-1200W，时间为20-30min。
本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂。
本发明具有如下有益效果：
人脐带血是胎儿出生时脐带内及胎盘内近胎儿侧血管内的血液，含有丰富的造血干细胞和间充质干细胞。脐血中的间充质干细胞是来源于中胚层的一类非造血干细胞，具有高度自我更新能力和多向分化潜能，在适宜条件下可分化为多种组织细胞，且来源丰富，同时，人脐带血间充质干细胞具有旁分泌作用，能分泌各种细胞因子、神经生长因子、胶质源性神经营养因子等，在疾病的治疗中发挥重要作用。但是，由于脐血中间充质干细胞数量少，生长周期缓慢，原代细胞培养时间较长，传代培养代次有限，易出现细胞“老化”等，使得其应用受到障碍。本发明在经过茶多酚和牛磺酸的协同作用下，降低自由基对细胞膜、细胞核和线粒体等的氧化损伤，减少代谢废物产生和对有害物质的吸收，保护脐血中间充质干细胞的结构完整性和功能，促进其生长和传代，有效的延缓了其衰老，从而使得其能够产生更多的细胞因子、神经生长因子、胶质源性神经营养因子等，促进造血激素分泌，从而刺激神经系统再生、修复和功能重建，减轻AD患者神经炎症反应，降低异常蛋白质沉积量，改善神经细胞发育和功能，降低AD患者体内自由基水平，提高机体抗氧化能力，减轻细胞氧化损伤和畸变，对于AD症的改善有明显的的作用。
二十八烷醇因为被证明安全性高，且对于神经系统具有一定保护、滋养作用，在防治阿兹海默病等疾病中的细胞损失方面具有良好的效果。二十八烷醇显著阻断了6-OHDA诱导的proNGFp75NTR一分拣蛋白死亡信号复合物及其下游效应蛋白的过多表达。同时，二十八烷醇阻止细胞存活引导因子NGF，以及其受体TrkA和p-Akt水平的降低，从而证实二十八烷醇对帕金森病症的治疗可能是通过调节体内proNGF：NGF和各自的受体p75NTR：TrkA的比率来改善神经微环境，以达到治疗的目的。
黄酮醇是一种生物活性化合物，存在于葡萄以及其他果蔬中，可促发有益的抗氧化剂和抗炎活性。葡萄皮中富含天然黄酮醇，包括山奈酚、杨梅素、槲皮素和异鼠李素，大量摄入黄酮醇可以降低患阿兹海默症的风险。本发明通过乙醇-乙酸水溶液提取黄酮醇类物质，进一步将提取后的固体采用白参菌进行发酵，白参菌能产生多种酶，催化基质中纤维素产生黄酮醇类物质，从而提高黄酮醇的产量。
进一步，本发明利用分子蒸馏分离葡萄黄酮醇类物质，利用不同物质分子平均自由程及挥发性的差别而实现高效分离，在高真空远低于沸点的温度下进行的，物料受热时间短且分离效果好，与普通真空蒸馏相比，分子蒸馏能避免热分解，精准精馏，减少了重要成分的损失，极大的保留了原活性物质的分子结构不被分解。在第一蒸馏温度下，溶剂和杂质大部分被蒸馏出来，然后再第二蒸馏温度下，分子蒸馏技术截取了葡萄黄酮醇类物质，包括山奈酚、杨梅素、槲皮素和异鼠李素，促进了这些活性组分在底物中的分离。
雌激素和孕激素都有各自的受体，它们通过受体直接或间接作用于基因或非基因因素影响多种神经递质系统，如5-羟色胺和γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid，GABA)递质系统。其中，典型的孕烯醇酮主要通过改变GABA的A型受体(GABA A受体)的表达或敏感性影响情绪与认知。在成人神经甾体激素水平包括孕烯醇酮的水平随着年龄的增长逐渐下降。而在AD的症状前期和轻度认知损害阶段，外周血和脑皮质的孕烯醇酮水平显著下降与AD的发生密切相关。人体在应激或损伤情况下，孕酮及孕烯醇酮通常会发生适应性的增加。外源性的孕酮可以改善炎性反应，增加海马锥体细胞的存活并改善海马CA1区注射β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)引起的认知损害，孕烯醇酮则可以通过促进神经前体细胞的增生逆转阿兹海默模型鼠的病理改变并改善其记忆能力。同时，少量的孕酮和孕烯醇酮对人体几乎没有影响，在预防和治疗AD症状(包括诱导神经元发生和神经祖细胞的增殖、抗神经元凋亡、调控GABA A受体等作用)的同时，还可以起到较好的抗氧化、抗炎的作用，对机体也有一定的好处。
聚乳酸和聚乙二醇分子都具有良好的生物相容性和血液相容性，降解后可通过肾排出体外，因此，以聚乳酸和聚乙二醇的嵌段共聚物为载体，负载葡萄黄酮醇类物质、孕酮、孕烯醇酮、二十八烷醇，能够实现有效包埋，并且有很好的释放药物的效果，很好的保持了组分的稳定性，具有缓释效果，与干细胞保存液混合后，提高了混合液的稳定性。
本发明用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂能护脐血中间充质干细胞的结构完整性和功能，促进其生长和传代，有效的延缓了其衰老，从而使得其能够产生更多的有益物质，并将对AD症、抗衰老、抗氧化等有明显的改善作用的葡萄黄酮醇类物质、孕酮、孕烯醇酮、二十八烷醇包埋于相容性很好的聚合物微球中，制得的用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂对于AD症的改善和延缓有明显的的作用，具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中干细胞保存液放大100倍后的照片；
图2为测试例1中各组释药率对比图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
低分子肝素钙为低分子肝素钙注射液(速碧林)，购于葛兰素史克(天津)有限公司；复方电解质注射液为复方电解质注射液(佳美纳)，购于河北天成药业股份有限公司；人脐带血间充质干细胞，货号CP-H165，购于武汉普诺赛生命科技有限公司；丙交酯，纯度大于98％，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；聚乙二醇，为聚乙二醇2000，购于默克公司。
重结晶的丙交酯的制备方法为将丙交酯用乙酸乙酯重结晶3次；重结晶的聚乙二醇的制备方法为将聚乙二醇用乙醇重结晶3次。
实施例1
本实施例提供一种用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.保存液的制备：配制含有2wt％人血白蛋白、60IU/mL低分子肝素钙、1wt％茶多酚、1.2wt％牛磺酸和余量为复方电解质注射液的保存液；
S2.干细胞培养：将人脐带血间充质干细胞进行传代培养，待细胞长至75％融合时，用无菌PBS洗涤，加入步骤S1制得的保存液中，得到干细胞保存液，干细胞浓度为105cells/mL；图1为干细胞保存液放大100倍后的照片，可见大量成纤维样细胞堆集，生长旺盛，细胞呈梭形，透明，细胞边缘不整齐，细胞增殖能力极强。
所述培养的温度为35℃，CO2含量为4％、O2含量为27％，余量为氮气，其中％为体积百分比；
S3.葡萄萃取液的制备：收集葡萄皮，干燥，粉碎，加入乙醇-乙酸的水溶液(乙醇、乙酸、水的体积比为3:2:5)中，固液比为1:5g/mL，加热至60℃，搅拌提取1h，过滤，重复2次，合并滤液，乙酸乙酯萃取，得到葡萄萃取液；
S4.葡萄发酵液的制备：将7重量份步骤S3中过滤得到的固体和5重量份碳葡萄糖、3重量份尿素混合，加入40重量份无菌水中，紫外线灭菌，得到培养基，接种活化的白参菌菌种种子液，接种量为2％，38℃，50r/min，发酵培养36h，过滤，得到葡萄发酵液；
所述活化的白参菌菌种种子液的制备方法为将白参菌接种至高氏培养基中，38℃，50r/min，活化培养12h，制得含菌量为108cfu/mL的菌种种子液；
S5.葡萄黄酮醇类物质的分离：将10重量份步骤S3中葡萄萃取液和15重量份步骤S4中葡萄发酵液合并，加入分子蒸馏装置中，加热至70℃蒸馏，去除一级蒸馏产物，提高至150℃蒸馏，收集二级蒸馏产物，为葡萄黄酮醇类物质；
所述分子蒸馏时，所述蒸馏冷凝温度为2℃，刮膜转速为150r/min，进料流量为3mL/min，系统真空度为50Pa；
S6.包埋微球的制备：将经过重结晶的20重量份丙交酯、30重量份聚乙二醇混合，加入50重量份含有0.2重量份四甲基亚锡的二氯甲烷溶液，氮气保护下，加热至120℃，搅拌反应10h，减压除去二氯甲烷，用乙酸乙酯溶解产物，环己烷和丙酮的混合液(体积比为5：2)沉淀，去离子水洗涤，干燥，将12重量份产物与2重量份步骤S5制得的葡萄黄酮醇类物质、0.3重量份孕酮、0.1重量份孕烯醇酮、1重量份二十八烷醇溶于70重量份玉米油中，搅拌混合均匀，加入200重量份含有3wt％赖氨酸的去离子水溶液中，12000r/min乳化12min，透析除去玉米油，冷冻干燥，得到包埋微球；
S7.用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂的制备：将5重量份步骤S6制得的包埋微球加入30重量份步骤S2制得的干细胞保存液中，1000W超声分散20min，紫外线灭菌，制得用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂。
实施例2
本实施例提供一种用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.保存液的制备：配制含有3wt％人血白蛋白、70IU/mL低分子肝素钙、2wt％茶多酚、1.7wt％牛磺酸和余量为复方电解质注射液的保存液；
S2.干细胞培养：将人脐带血间充质干细胞进行传代培养，待细胞长至80％融合时，用无菌PBS洗涤，加入步骤S1制得的保存液中，得到干细胞保存液，干细胞浓度为106cells/mL；
所述培养的温度为38℃，CO2含量为6％、O2含量为30％，余量为氮气，其中％为体积百分比；
S3.葡萄萃取液的制备：收集葡萄皮，干燥，粉碎，加入乙醇-乙酸的水溶液(乙醇、乙酸、水的体积比为5:4:7)中，固液比为1:5g/mL，加热至70℃，搅拌提取2h，过滤，重复3次，合并滤液，乙酸乙酯萃取，得到葡萄萃取液；
S4.葡萄发酵液的制备：将10重量份步骤S3中过滤得到的固体和7重量份麦芽糖、5重量份氯化铵混合，加入70重量份无菌水中，紫外线灭菌，得到培养基，接种活化的白参菌菌种种子液，接种量为3％，42℃，70r/min，发酵培养48h，过滤，得到葡萄发酵液；
所述活化的白参菌菌种种子液的制备方法为将白参菌接种至高氏培养基中，42℃，70r/min，活化培养18h，制得含菌量为109cfu/mL的菌种种子液；
S5.葡萄黄酮醇类物质的分离：将12重量份步骤S3中葡萄萃取液和25重量份步骤S4中葡萄发酵液合并，加入分子蒸馏装置中，加热至90℃蒸馏，去除一级蒸馏产物，提高至170℃蒸馏，收集二级蒸馏产物，为葡萄黄酮醇类物质；
所述分子蒸馏时，所述蒸馏冷凝温度为5℃，刮膜转速为250r/min，进料流量为5mL/min，系统真空度为70Pa；
S6.包埋微球的制备：将经过重结晶的40重量份丙交酯、45重量份聚乙二醇混合，加入50重量份含有0.4重量份三(三甲基硅基)亚锡的二氯甲烷溶液，氮气保护下，加热至140℃，搅拌反应12h，减压除去二氯甲烷，用乙酸乙酯溶解产物，环己烷和丙酮的混合液(体积比为5：2)沉淀，去离子水洗涤，干燥，将15重量份产物与3重量份步骤S5制得的葡萄黄酮醇类物质、0.5重量份孕酮、0.2重量份孕烯醇酮、2重量份二十八烷醇溶于100重量份大豆油中，搅拌混合均匀，加入200重量份含有5wt％磷脂的去离子水溶液中，15000r/min乳化15min，透析除去大豆油，冷冻干燥，得到包埋微球；
S7.用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂的制备：将7重量份步骤S6制得的包埋微球加入50重量份步骤S2制得的干细胞保存液中，1200W超声分散30min，紫外线灭菌，制得用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂。
实施例3
本实施例提供一种用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.保存液的制备：配制含有2.5wt％人血白蛋白、65IU/mL低分子肝素钙、1.5wt％茶多酚、1.5wt％牛磺酸和余量为复方电解质注射液的保存液；
S2.干细胞培养：将人脐带血间充质干细胞进行传代培养，待细胞长至77％融合时，用无菌PBS洗涤，加入步骤S1制得的保存液中，得到干细胞保存液，干细胞浓度为106cells/mL；
所述培养的温度为37℃，CO2含量为5％、O2含量为28％，余量为氮气，其中％为体积百分比；
S3.葡萄萃取液的制备：收集葡萄皮，干燥，粉碎，加入乙醇-乙酸的水溶液(乙醇、乙酸、水的体积比为4:3:6)中，固液比为1:5g/mL，加热至65℃，搅拌提取1.5h，过滤，重复3次，合并滤液，乙酸乙酯萃取，得到葡萄萃取液；
S4.葡萄发酵液的制备：将8.5重量份步骤S3中过滤得到的固体和4重量份葡萄糖、2重量份麦芽糖、4重量份硝酸铵混合，加入55重量份无菌水中，紫外线灭菌，得到培养基，接种活化的白参菌菌种种子液，接种量为2.5％，40℃，60r/min，发酵培养42h，过滤，得到葡萄发酵液；
所述活化的白参菌菌种种子液的制备方法为将白参菌接种至高氏培养基中，40℃，60r/min，活化培养16h，制得含菌量为109cfu/mL的菌种种子液；
S5.葡萄黄酮醇类物质的分离：将11重量份步骤S3中葡萄萃取液和20重量份步骤S4中葡萄发酵液合并，加入分子蒸馏装置中，加热至80℃蒸馏，去除一级蒸馏产物，提高至160℃蒸馏，收集二级蒸馏产物，为葡萄黄酮醇类物质；
所述分子蒸馏时，所述蒸馏冷凝温度为4℃，刮膜转速为200r/min，进料流量为4mL/min，系统真空度为60Pa；
S6.包埋微球的制备：将经过重结晶的30重量份丙交酯、37重量份聚乙二醇混合，加入50重量份含有0.3重量份辛酸亚锡的二氯甲烷溶液，氮气保护下，加热至130℃，搅拌反应11h，减压除去二氯甲烷，用乙酸乙酯溶解产物，环己烷和丙酮的混合液(体积比为5：2)沉淀，去离子水洗涤，干燥，将13.5重量份产物与2.5重量份步骤S5制得的葡萄黄酮醇类物质、0.4重量份孕酮、0.15重量份孕烯醇酮、1.5重量份二十八烷醇溶于8.5重量份鱼油中，搅拌混合均匀，加入200重量份含有4wt％黄原胶的去离子水溶液中，13500r/min乳化13min，透析除去鱼油，冷冻干燥，得到包埋微球；
S7.用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂的制备：将6重量份步骤S6制得的包埋微球加入40重量份步骤S2制得的干细胞保存液中，1100W超声分散25min，紫外线灭菌，制得用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂。
对比例1
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S1中未添加茶多酚。
具体如下：
S1.保存液的制备：配制含有2.5wt％人血白蛋白、65IU/mL低分子肝素钙、3wt％牛磺酸和余量为复方电解质注射液的保存液。
对比例2
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S1中未添加牛磺酸。
具体如下：
S1.保存液的制备：配制含有2.5wt％人血白蛋白、65IU/mL低分子肝素钙、3wt％茶多酚和余量为复方电解质注射液的保存液。
对比例3
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S1中未添加茶多酚和牛磺酸。
具体如下：
S1.保存液的制备：配制含有2.5wt％人血白蛋白、65IU/mL低分子肝素钙和余量为复方电解质注射液的保存液。
对比例4
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S3中未进行溶剂提取。
具体如下：
S3.葡萄萃取液的制备：收集葡萄皮，干燥，粉碎，得到葡萄皮粉，用于作为固体制备培养基。
对比例5
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S4。
具体如下：
S1.保存液的制备：配制含有2.5wt％人血白蛋白、65IU/mL低分子肝素钙、1.5wt％茶多酚、1.5wt％牛磺酸和余量为复方电解质注射液的保存液；
S2.干细胞培养：将人脐带血间充质干细胞进行传代培养，待细胞长至77％融合时，用无菌PBS洗涤，加入步骤S1制得的保存液中，得到干细胞保存液，干细胞浓度为106cells/mL；
所述培养的温度为37℃，CO2含量为5％、O2含量为28％，余量为氮气，其中％为体积百分比；
S3.葡萄萃取液的制备：收集葡萄皮，干燥，粉碎，加入乙醇-乙酸的水溶液(乙醇、乙酸、水的体积比为4:3:6)中，固液比为1:5g/mL，加热至65℃，搅拌提取1.5h，过滤，重复3次，合并滤液，乙酸乙酯萃取，得到葡萄萃取液；
S4.葡萄黄酮醇类物质的分离：将31重量份步骤S3中葡萄萃取液加入分子蒸馏装置中，加热至80℃蒸馏，去除一级蒸馏产物，提高至160℃蒸馏，收集二级蒸馏产物，为葡萄黄酮醇类物质；
所述分子蒸馏时，所述蒸馏冷凝温度为4℃，刮膜转速为200r/min，进料流量为4mL/min，系统真空度为60Pa；
S5.包埋微球的制备：将经过重结晶的30重量份丙交酯、37重量份聚乙二醇混合，加入50重量份含有0.3重量份辛酸亚锡的二氯甲烷溶液，氮气保护下，加热至130℃，搅拌反应11h，减压除去二氯甲烷，用乙酸乙酯溶解产物，环己烷和丙酮的混合液(体积比为5：2)沉淀，去离子水洗涤，干燥，将13.5重量份产物与2.5重量份步骤S4制得的葡萄黄酮醇类物质、0.4重量份孕酮、0.15重量份孕烯醇酮、1.5重量份二十八烷醇溶于8.5重量份鱼油中，搅拌混合均匀，加入200重量份含有4wt％黄原胶的去离子水溶液中，13500r/min乳化13min，透析除去鱼油，冷冻干燥，得到包埋微球；
S6.用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂的制备：将6重量份步骤S5制得的包埋微球加入40重量份步骤S2制得的干细胞保存液中，1100W超声分散25min，紫外线灭菌，制得用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂。
对比例6
与实施例3相比，不同之处在于，未进行S3至S5。
具体如下：
S1.保存液的制备：配制含有2.5wt％人血白蛋白、65IU/mL低分子肝素钙、1.5wt％茶多酚、1.5wt％牛磺酸和余量为复方电解质注射液的保存液；
S2.干细胞培养：将人脐带血间充质干细胞进行传代培养，待细胞长至77％融合时，用无菌PBS洗涤，加入步骤S1制得的保存液中，得到干细胞保存液，干细胞浓度为106cells/mL；
所述培养的温度为37℃，CO2含量为5％、O2含量为28％，余量为氮气，其中％为体积百分比；
S3.包埋微球的制备：将经过重结晶的30重量份丙交酯、37重量份聚乙二醇混合，加入50重量份含有0.3重量份辛酸亚锡的二氯甲烷溶液，氮气保护下，加热至130℃，搅拌反应11h，减压除去二氯甲烷，用乙酸乙酯溶解产物，环己烷和丙酮的混合液(体积比为5：2)沉淀，去离子水洗涤，干燥，将13.5重量份产物与0.4重量份孕酮、0.15重量份孕烯醇酮、1.5重量份二十八烷醇溶于8.5重量份鱼油中，搅拌混合均匀，加入200重量份含有4wt％黄原胶的去离子水溶液中，13500r/min乳化13min，透析除去鱼油，冷冻干燥，得到包埋微球；
S4.用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂的制备：将6重量份步骤S3制得的包埋微球加入40重量份步骤S2制得的干细胞保存液中，1100W超声分散25min，紫外线灭菌，制得用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂。
对比例7
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S6。
具体如下：
S1.保存液的制备：配制含有2.5wt％人血白蛋白、65IU/mL低分子肝素钙、1.5wt％茶多酚、1.5wt％牛磺酸和余量为复方电解质注射液的保存液；
S2.干细胞培养：将人脐带血间充质干细胞进行传代培养，待细胞长至77％融合时，用无菌PBS洗涤，加入步骤S1制得的保存液中，得到干细胞保存液，干细胞浓度为106cells/mL；
所述培养的温度为37℃，CO2含量为5％、O2含量为28％，余量为氮气，其中％为体积百分比；
S3.葡萄萃取液的制备：收集葡萄皮，干燥，粉碎，加入乙醇-乙酸的水溶液(乙醇、乙酸、水的体积比为4:3:6)中，固液比为1:5g/mL，加热至65℃，搅拌提取1.5h，过滤，重复3次，合并滤液，乙酸乙酯萃取，得到葡萄萃取液；
S4.葡萄发酵液的制备：将8.5重量份步骤S3中过滤得到的固体和4重量份葡萄糖、2重量份麦芽糖、4重量份硝酸铵混合，加入55重量份无菌水中，紫外线灭菌，得到培养基，接种活化的白参菌菌种种子液，接种量为2.5％，40℃，60r/min，发酵培养42h，过滤，得到葡萄发酵液；
所述活化的白参菌菌种种子液的制备方法为将白参菌接种至高氏培养基中，40℃，60r/min，活化培养16h，制得含菌量为109cfu/mL的菌种种子液；
S5.葡萄黄酮醇类物质的分离：将11重量份步骤S3中葡萄萃取液和20重量份步骤S4中葡萄发酵液合并，加入分子蒸馏装置中，加热至80℃蒸馏，去除一级蒸馏产物，提高至160℃蒸馏，收集二级蒸馏产物，为葡萄黄酮醇类物质；
所述分子蒸馏时，所述蒸馏冷凝温度为4℃，刮膜转速为200r/min，进料流量为4mL/min，系统真空度为60Pa；
S6.混合物的制备：将2.5重量份步骤S5制得的葡萄黄酮醇类物质、0.4重量份孕酮、0.15重量份孕烯醇酮、1.5重量份二十八烷醇混合均匀，得到混合物；
S7.用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂的制备：将6重量份步骤S6制得的混合物加入40重量份步骤S2制得的干细胞保存液中，1100W超声分散25min，紫外线灭菌，制得用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂。
对比例8
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S6中未添加孕酮。
具体如下：
S6.包埋微球的制备：将经过重结晶的30重量份丙交酯、37重量份聚乙二醇混合，加入50重量份含有0.3重量份辛酸亚锡的二氯甲烷溶液，氮气保护下，加热至130℃，搅拌反应11h，减压除去二氯甲烷，用乙酸乙酯溶解产物，环己烷和丙酮的混合液(体积比为5：2)沉淀，去离子水洗涤，干燥，将13.5重量份产物与2.5重量份步骤S5制得的葡萄黄酮醇类物质、0.55重量份孕烯醇酮、1.5重量份二十八烷醇溶于8.5重量份鱼油中，搅拌混合均匀，加入200重量份含有4wt％黄原胶的去离子水溶液中，13500r/min乳化13min，透析除去鱼油，冷冻干燥，得到包埋微球。
对比例9
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S6中未添加孕烯醇酮。
具体如下：
S6.包埋微球的制备：将经过重结晶的30重量份丙交酯、37重量份聚乙二醇混合，加入50重量份含有0.3重量份辛酸亚锡的二氯甲烷溶液，氮气保护下，加热至130℃，搅拌反应11h，减压除去二氯甲烷，用乙酸乙酯溶解产物，环己烷和丙酮的混合液(体积比为5：2)沉淀，去离子水洗涤，干燥，将13.5重量份产物与2.5重量份步骤S5制得的葡萄黄酮醇类物质、0.55重量份孕酮、1.5重量份二十八烷醇溶于8.5重量份鱼油中，搅拌混合均匀，加入200重量份含有4wt％黄原胶的去离子水溶液中，13500r/min乳化13min，透析除去鱼油，冷冻干燥，得到包埋微球。
对比例10
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S6中未添加孕酮和孕烯醇酮。
具体如下：
S6.包埋微球的制备：将经过重结晶的30重量份丙交酯、37重量份聚乙二醇混合，加入50重量份含有0.3重量份辛酸亚锡的二氯甲烷溶液，氮气保护下，加热至130℃，搅拌反应11h，减压除去二氯甲烷，用乙酸乙酯溶解产物，环己烷和丙酮的混合液(体积比为5：2)沉淀，去离子水洗涤，干燥，将13.5重量份产物与2.5重量份步骤S5制得的葡萄黄酮醇类物质、1.5重量份二十八烷醇溶于8.5重量份鱼油中，搅拌混合均匀，加入200重量份含有4wt％黄原胶的去离子水溶液中，13500r/min乳化13min，透析除去鱼油，冷冻干燥，得到包埋微球。
对比例11
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S6中未添加二十八烷醇。
具体如下：
S6.包埋微球的制备：将经过重结晶的30重量份丙交酯、37重量份聚乙二醇混合，加入50重量份含有0.3重量份辛酸亚锡的二氯甲烷溶液，氮气保护下，加热至130℃，搅拌反应11h，减压除去二氯甲烷，用乙酸乙酯溶解产物，环己烷和丙酮的混合液(体积比为5：2)沉淀，去离子水洗涤，干燥，将13.5重量份产物与2.5重量份步骤S5制得的葡萄黄酮醇类物质、0.4重量份孕酮、0.15重量份孕烯醇酮溶于8.5重量份鱼油中，搅拌混合均匀，加入200重量份含有4wt％黄原胶的去离子水溶液中，13500r/min乳化13min，透析除去鱼油，冷冻干燥，得到包埋微球。
对比例12
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S7中未添加包埋微球。
具体如下：
S7.用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂的制备：将40重量份步骤S2制得的干细胞保存液，紫外线灭菌，制得用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂。
测试例1包埋微球的体外释药
实施例1-3制得的包埋微球1g分别装入透析袋中，置于盛有磷酸缓冲溶液的250mL具塞量瓶中，放入(37±1)℃水浴恒温振荡器中，在不同时间间隔收集微球，干燥，称重，计算包埋微球的体外释药特点。
释药率(％)＝(透析后的微球质量-包埋微球初期质量)/包埋微球初期质量×100％
结果见图2。
由图可知，该包埋微球在90h释药接近80％，5d基本释药结束。
测试例2对衰老细胞增殖变化
模型建立：将人脐带血间充质干细胞传代培养至第5代，消化、制成细胞悬液，按细胞密度5×106cells/mL接种，分组处理，对照组采用基础培养基(原10％FBS的OHUCMSC培养基)传代培养，衰老组和实施例1-3、对比例1-3组应用D-半乳糖8g/L+基础培养基培养至第7代，取对数生长期细胞进行以下试验。
取生长状态良好的生长期细胞，0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA溶液消化后，OHUCMSC培养基制备细胞悬液，调细胞密度至2×104cells/mL，接种于96孔板中，每孔200μL，每组设置4个复孔，分组加入实施例1-3及对比例1-3制得的保存液中，处理3d，每天取一块96孔板，每孔加入MTT溶液(5mg/m1)20μL，孵育4h后，吸去上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜，振荡混匀10min，用酶标仪于570m处测OD值。
实施例1-3组明显提高了OD值，其对衰老细胞有明显的的促进增殖的效果，在经过茶多酚和牛磺酸的协同作用下，降低自由基对细胞膜、细胞核和线粒体等的氧化损伤，减少代谢废物产生和对有害物质的吸收，保护脐血中间充质干细胞的结构完整性和功能，促进其生长和传代，有效的延缓了其衰老。
测试例3
采用用雄性5xFAD小鼠160只，WT小鼠各10只，5xFAD小鼠随机分成16组，实施例1-3组、对比例1-12组、5xFAD组，每组10只。实施例1-3组、对比例1-12组注射实施例1-3或对比例1-12制得的用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂2mL/kg。对照组小鼠注射等量生理盐水，在12h/12h的光暗周期下，保持恒温25±2℃，相对湿度50±5％，单笼饲养小鼠进行试验，提供自由饮食标准饲料及饮水。给药周期为3周，每天给药一次，给药方式为腹腔注射给药。
采用Morris水迷宫进行测试。分别于每天进行定位巡航实验，平台露出水面1cm，将实验小鼠分别从3个象限放入水池(除平台所在象限)，每次独立实验时间为1min，1min内小鼠若找不到平台，成功逃逸潜伏期记录为1min，若能找到，则记为所花费的时间。在第三周最后一天，将平台隐藏于水面以下1cm，并用白色食品级染料将清水染成白色，进行空间探索实验，将实验小鼠分别从4个象限放入水池，记录各组小鼠找到平台的时间，为成功逃逸潜伏期。
结果见表1。
表1
注释：与WT组相比，*为P<0.05；与5xFAD组相比，#为P<0.05。
由上表可知，本发明实施例1-3组小鼠能明显缩短成功逃逸潜伏期。
实验结束后，采用断颈椎法牺牲小鼠，解剖，精确称取脑皮层组织，加入动物组织裂解液(含1％ PMSF)裂解组织，匀浆，4℃离心后收集上清液，采用丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒测定小鼠脑皮层组织中MDA、GSH水平及T-SOD活力。
结果见表2。
表2
注释：与WT组相比，*为P<0.05；与5xFAD组相比，#为P<0.05。
由上表可知，本发明实施例1-3组小鼠丙二醛含量明显降低，谷胱甘肽含量提高。
对比例1、2与实施例3相比，步骤S1中未添加茶多酚或牛磺酸。对比例3与实施例3相比，步骤S1中未添加茶多酚和牛磺酸。对衰老细胞有明显的的促进增殖的效果下降，成功逃逸潜伏期延长，丙二醛含量提高，谷胱甘肽含量下降。本发明在经过茶多酚和牛磺酸的协同作用下，降低自由基对细胞膜、细胞核和线粒体等的氧化损伤，减少代谢废物产生和对有害物质的吸收，保护脐血中间充质干细胞的结构完整性和功能，促进其生长和传代，有效的延缓了其衰老，从而使得其能够产生更多的细胞因子、神经生长因子、胶质源性神经营养因子等，促进造血激素分泌，从而刺激神经系统再生、修复和功能重建，减轻AD患者神经炎症反应，降低异常蛋白质沉积量，改善神经细胞发育和功能，降低AD患者体内自由基水平，提高机体抗氧化能力，减轻细胞氧化损伤和畸变，对于AD症的改善有明显的的作用。
对比例4与实施例3相比，步骤S3中未进行溶剂提取。对比例5与实施例3相比，未进行步骤S4。对比例6与实施例3相比，未进行S3至S5。成功逃逸潜伏期延长，丙二醛含量提高，谷胱甘肽含量下降。黄酮醇是一种生物活性化合物，存在于葡萄以及其他果蔬中，可促发有益的抗氧化剂和抗炎活性。葡萄皮中富含天然黄酮醇，包括山奈酚、杨梅素、槲皮素和异鼠李素，大量摄入黄酮醇可以降低患阿兹海默症的风险。本发明通过乙醇-乙酸水溶液提取黄酮醇类物质，进一步将提取后的固体采用白参菌进行发酵，白参菌能产生多种酶，催化基质中纤维素产生黄酮醇类物质，从而提高黄酮醇的产量。
对比例8、9与实施例3相比，步骤S6中未添加孕酮或孕烯醇酮。对比例10与实施例3相比，步骤S6中未添加孕酮和孕烯醇酮。成功逃逸潜伏期延长，丙二醛含量提高，谷胱甘肽含量下降。人体在应激或损伤情况下，孕酮及孕烯醇酮通常会发生适应性的增加。外源性的孕酮可以改善炎性反应，增加海马锥体细胞的存活并改善海马CA1区注射β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)引起的认知损害，孕烯醇酮则可以通过促进神经前体细胞的增生逆转阿兹海默模型鼠的病理改变并改善其记忆能力。同时，少量的孕酮和孕烯醇酮对人体几乎没有影响，在预防和治疗AD症状(包括诱导神经元发生和神经祖细胞的增殖、抗神经元凋亡、调控GABA A受体等作用)的同时，还可以起到较好的抗氧化、抗炎的作用，对机体也有一定的好处。
对比例11与实施例3相比，步骤S6中未添加二十八烷醇。成功逃逸潜伏期延长。二十八烷醇因为被证明安全性高，且对于神经系统具有一定保护、滋养作用，在防治阿兹海默病等疾病中的细胞损失方面具有良好的效果。二十八烷醇显著阻断了6-OHDA诱导的proNGFp75NTR一分拣蛋白死亡信号复合物及其下游效应蛋白的过多表达。同时，二十八烷醇阻止细胞存活引导因子NGF，以及其受体TrkA和p-Akt水平的降低，从而证实二十八烷醇对帕金森病症的治疗可能是通过调节体内proNGF：NGF和各自的受体p75NTR：TrkA的比率来改善神经微环境，以达到治疗的目的。
对比例7与实施例3相比，未进行步骤S6。对比例12与实施例3相比，步骤S7中未添加包埋微球。成功逃逸潜伏期延长，丙二醛含量提高，谷胱甘肽含量下降。聚乳酸和聚乙二醇分子都具有良好的生物相容性和血液相容性，降解后可通过肾排出体外，因此，以聚乳酸和聚乙二醇的嵌段共聚物为载体，负载葡萄黄酮醇类物质、孕酮、孕烯醇酮、二十八烷醇，能够实现有效包埋，并且有很好的释放药物的效果，很好的保持了组分的稳定性，具有缓释效果，与干细胞保存液混合后，提高了混合液的稳定性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂的制备方法，其特征在于，配制含有人血白蛋白、低分子肝素钙、茶多酚、牛磺酸和电解质注射液的保存液，并将传代的人脐带血间充质干细胞加入保存液中，得到干细胞保存液；从葡萄皮中溶剂提取得到葡萄萃取液，然后发酵得到葡萄发酵液，两者合并后经过分子蒸馏得到葡萄黄酮醇类物质，与孕酮、孕烯醇酮、二十八烷醇一同包埋在丙交酯-聚乙二醇聚合物微球中，并加入干细胞保存液，超声分散均匀，制得用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.保存液的制备：配制含有人血白蛋白、低分子肝素钙、茶多酚、牛磺酸和复方电解质注射液的保存液；
S2.干细胞培养：将人脐带血间充质干细胞进行传代培养，待细胞长至75-80%融合时，用无菌PBS洗涤，加入步骤S1制得的保存液中，得到干细胞保存液；
S3.葡萄萃取液的制备：收集葡萄皮，干燥，粉碎，加入乙醇-乙酸的水溶液中，加热搅拌提取，过滤，重复2-3次，合并滤液，乙酸乙酯萃取，得到葡萄萃取液；
S4.葡萄发酵液的制备：将步骤S3中过滤得到的固体和碳源、氮源混合，加入无菌水中，灭菌，得到培养基，接种活化的白参菌菌种种子液，发酵培养，过滤，得到葡萄发酵液；
S5.葡萄黄酮醇类物质的分离：将步骤S3中葡萄萃取液和步骤S4中葡萄发酵液合并，加入分子蒸馏装置中，加热至第一温度蒸馏，去除一级蒸馏产物，提高至第二温度蒸馏，收集二级蒸馏产物，为葡萄黄酮醇类物质；
S6.包埋微球的制备：将经过重结晶的丙交酯、聚乙二醇混合，加入催化剂，惰性气体保护下加热搅拌反应，用乙酸乙酯溶解产物，沉淀，洗涤，干燥，产物与步骤S5制得的葡萄黄酮醇类物质、孕酮、孕烯醇酮、二十八烷醇一同溶于食用油中，搅拌混合均匀，加入含有乳化剂的去离子水中，乳化，透析除去食用油，冷冻干燥，得到包埋微球；
S7.用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂的制备：将步骤S6制得的包埋微球加入步骤S2制得的干细胞保存液中，超声分散均匀，灭菌，制得用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述保存液中人血白蛋白的含量为2-3wt%、低分子肝素钙的含量为60-70IU/mL、1-2wt%茶多酚、1.2-1.7wt%牛磺酸和复方电解质注射液余量。
4.据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述培养的温度为35-38℃，CO2含量为4-6%、O2含量为27-30%，余量为氮气，其中%为体积百分比，所述干细胞保存液中干细胞浓度为105-106cells/mL。
5.据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述乙醇-乙酸的水溶液中乙醇、乙酸、水的体积比为3-5:2-4:5-7，所述加热搅拌提取的温度为60-70℃，时间为1-2h。
6.据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述固体、碳源、氮源和无菌水的质量比为7-10:5-7:3-5:40-70，所述碳源选自葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、淀粉中的至少一种，所述氮源选自氨水、尿素、鱼粉、硝酸铵、氯化铵、硝酸钠中的至少一种，所述活化的白参菌菌种种子液的制备方法为将白参菌接种至高氏培养基中，38-42℃，50-70r/min，活化培养12-18h，制得含菌量为108-109cfu/mL的菌种种子液，所述活化的白参菌菌种种子液的接种量为2-3%，所述发酵培养的条件为38-42℃，50-70r/min，发酵培养36-48h。
7.据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S5中所述葡萄萃取液和葡萄发酵液的质量比为10-12:15-25，所述第一温度为70-90℃，所述第二温度为150-170℃，所述蒸馏冷凝温度为2-5℃，刮膜转速为150-250r/min，进料流量为3-5mL/min，系统真空度为50-70Pa。
8.据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S6中所述催化剂为辛酸亚锡、四甲基亚锡、三(三甲基硅基)亚锡、氧化亚锡、乙酰丙酮亚锡中的至少一种，所述丙交酯、聚乙二醇、催化剂的质量比为20-40:30-45:0.2-0.4，所述加热搅拌反应的温度为120-140℃，时间为10-12h，所述沉淀的方法为加入环己烷和丙酮的混合物沉淀，所述产物、葡萄黄酮醇类物质、孕酮、孕烯醇酮、二十八烷醇和食用油的质量比为12-15:2-3:0.3-0.5:0.1-0.2:1-2:70-100，所述食用油选自菜籽油、花生油、玉米油、橄榄油、亚麻籽油、大豆油、芝麻油、鱼油中的至少一种，所述含有乳化剂的去离子水中乳化剂含量为3-5wt%，所述乳化剂选自磷脂、赖氨酸、角蛋白、黄原胶中的至少一种，所述乳化的条件为12000-15000r/min乳化12-15min。
9.据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S7中所述包埋微球、干细胞保存液的质量比为5-7:30-50，所述超声分散的功率为1000-1200W，时间为20-30min。
10.一种如权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的用于抗阿兹海默症的间充质干细胞制剂。
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