CN114214366B - 一种预防和治疗贫血的小肽粉和血红素之肽红复方药物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种预防和治疗贫血的小肽粉和血红素之肽红复方药物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于医药技术领域，具体公开了一种由小肽粉和血红素制成的肽红复方制剂的制备方法及其在制备预防和治疗失血性贫血的药物中的应用。将来源于动物血制品的小肽粉和血红素混合后制成肽红复方制剂，实验证明其具有较好的柔润肠腑、滋阴养血等功效，可明显提升失血性贫血模型动物的血红蛋白、促红细胞生成素以及红细胞数量，对枯草芽孢杆菌、酵母菌等益生菌类具有明显的增菌效果和促进生长的作用，有助于维护肠道菌群微生态，达到治疗贫血的效果。本发明的治疗贫血制剂的有效组分明确、疗效确定，其价格低廉，且涉及的提取方法易于实施，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及的是一种基于“柔润肠腑、滋阴养血”而发挥预防和治疗贫血的小肽粉和血红素之肽红复方药物及其制备方法和应用。
背景技术
贫血是指人体外周血红细胞容量减少，低于正常范围下限并出现头晕、乏力、困倦、面色发白等临床症状。贫血是炎症性肠病常见并发症之一，发生率在6.2％～73.7％之间。有研究发现：炎症性肠病门诊患者中贫血的患病率为16％，而住院患者高达68％。再有，科学家们曾认为血细胞是一群特殊的造血干细胞在骨骼中专门产生的。然而，在一项来自美国哥伦比亚大学瓦格洛斯内外科医生学会的最新研究中，研究人员发现人体肠道可能利用它自身的造血干细胞库提供高达10％的用于人体循环的血细胞。相关研究结果于2018年10月29日在线发表在Cell Stem Cell期刊上，论文标题为“Human Intestinal AllograftsContain Functional Hematopoietic Stem and Progenitor Cells that AreMaintained by a Circulating Pool”。
这些研究表明，贫血的发生是由多种因素综合所致，其发生机理十分复杂，但与肠的功能失衡密不可分。那为什么炎症性肠病患者会发生贫血？究其原因，可有以下因素：(1)含铁丰富的食物摄入减少；(2)常因有肠道粘膜溃烂，这不仅造成水和电解质丢失，也会导致红细胞及血浆成分渗出；(3)炎症状态下影响铁的代谢，导致功能性铁缺乏；(4)引发自身炎性免疫性疾病，进而影响造血系统，抑制肾脏分泌促红细胞生成素。
目前，临床上针对肠炎所引发的贫血，多采用口服(葡萄糖酸亚铁、血红素铁、多糖铁(Ⅲ)、多肽铁(Ⅱ)复合物等)、静脉(蔗糖铁、羧基麦芽糖铁、葡萄糖酸亚铁、低分子右旋糖酐铁等)两种途径进行补铁。然而，单纯补铁的疗效有限，还可能引发潜在的毒副作用(比如，口服铁剂有加重肠道炎性反应和黏膜损伤的风险。而且有研究表明患者饮食铁摄入量与结肠癌的发生率呈正相关；静脉给予铁剂渗漏至输液处局部组织，可引起疼痛、炎症反应、局部褐色变，严重时发生坏死。同时，静脉铁剂容易引起铁过载，其产生的羟基自由基是持续加重肝脏损伤的重要因素)。因此，基于安全且有效的角度，考虑通过食物提供的铁元素，其来源可分为两种类型：(1)来自于动物性食物(全血、肝脏和肉类等)的有机铁，其通常不受食物中其他物质的干扰，容易被人体吸收(约在20％)，补血效果不错。(2)来自于植物食物的无机铁，其容易受食物中的植酸、草酸和膳食纤维等干扰，吸收率偏低(约在10％以下)。
故本发明旨在从“食药同源”之原材料中，探寻一种科学组方，制成防治贫血的佳品，保证在患者长期使用期间，达到既舒缓患者病症，又安全可靠的效果。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种“食药同源”且有效预防和治疗失血性贫血的小肽粉和血红素之复方药物(简称为肽红复方制剂)。
本发明的第二个目的在于提供了一种上述预防和治疗失血性贫血的肽红复方药物的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供了上述预防和治疗失血性贫血的肽红复方药物的制药用途。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术措施：
一种从动物血制品中提取小肽粉和血红素并制成肽红复方制剂的方法，依次包括如下步骤：
(1)以来源于猪血、牛血或鸡血的血球蛋白粉为原料，通过复合蛋白酶酶解，等电点析出，离心分离得到①上清液和②血红素复合沉淀物，然后对其做进一步处理后分别分别得到小肽粉和血红素粗品粉。
(2)将步骤(1)的小肽粉和血红素粗品，按照一定的重量比混合均匀后，粉碎，得混合粉；
(3)向步骤(2)得到的混合粉中加入其重量倍数的、由淀粉与糊精组成的混合物，混匀后，再在搅拌下，以喷雾方式向其中加入乙醇水溶液，混合均匀后制成软材，然后制粒，得“小肽粉和血红素”的复合制剂，简称为肽红复方制剂。
进一步的，所述从动物血制品中提取小肽粉和血红素并制成肽红复方制剂的方法包括如下步骤：
(1)以血球蛋白粉为原料，通过复合蛋白酶酶解，等电点析出，离心分离得到①上清液和②血红素复合沉淀物。上清液经超滤分离得小分子肽，脱色后喷雾干燥获得小肽粉；血红素复合沉淀物与冰醋酸、氯化钠共热，再降温结晶得到血红素晶体混合物，依次进行多次水洗、醇洗，喷雾干燥得到血红素粗品粉(血红素含量≥50％)。
(2)将步骤(1)的小肽粉和血红素粗品，按照(100-300)：1的重量比混合均匀后，粉碎，得混合粉；
(3)向步骤(2)得到的混合粉中加入其重量1-2倍的、由淀粉与糊精组成的混合物，混匀后，再在搅拌下，以喷雾方式向其中加入乙醇水溶液，混合均匀后制成软材，然后制粒，得“小肽粉和血红素”的复合制剂，简称为肽红复方制剂。步骤(3)中所加的淀粉与糊精混合物中淀粉与糊精重量比为(3-6)：1。
更进一步的，一种从动物血制品中提取“小肽粉和血红素”的肽红之复合制剂的方法包括如下步骤：
(1)小肽粉的制备
取血球蛋白粉10kg，用碱性水溶液溶解，所得混合液中血球蛋白粉质量百分比浓度为5-8％，并调节酸碱度至pH10.0-11.0，接着在50℃条件下搅拌溶解一段时间。按原料血球蛋白粉重量的0.4％-0.8％加入复合蛋白酶(以1g:(8-12)mL的固液比例加50℃-55℃纯净水搅拌均匀后加入)，在50℃-55℃的温度下酶解2-6h；然后将其酸碱度调至pH3-4，再继续在同温度下酶解1-2h。随后将酶解液离心(3500-4000rpm，5-10min)，得上清液110-190L。接着采用1KDa超滤膜超滤得浓缩液18L-20L，再添加活性炭约1kg，然后80℃吸附脱色1h后过滤，最后将滤液喷雾干燥得到6.1kg-7.3kg血球蛋白酶解小肽粉(分子量小于1KDa；其中300-600Da的小肽含量超过80％)。在本申请中使用的复合蛋白酶配方为碱性蛋白酶：动物蛋白水解酶：中性蛋白酶：酸性蛋白酶质量比＝2：2：2：1。本复合酶的制备依据血球蛋白的组成特点、酶解过程蛋白的降解规律、不同生物酶的酶解特性等方面的因素科学配比而成，一次性加入，在酶解的不同阶段共同作用，具有酶解脱色彻底、蛋白收率高、酶解肽分子量小、类型多样、生物活性好的优势。
(2)血红素的制备
取血球蛋白粉10kg，用碱性水溶液溶解，所得混合液中血球蛋白粉质量百分比浓度为5-8％，并调节酸碱度至pH10.0-11.0，接着在50℃条件下搅拌溶解一段时间。按原料血球蛋白粉重量的0.4％-0.8％加入复合蛋白酶(以1g:(8-12)mL的固液比例加50℃-55℃纯净水搅拌均匀后加入)，在50℃-55℃的温度下酶解2-6h；然后将其酸碱度调至pH3-4，再继续在同温度下酶解1-2h。随后将酶解液离心(3500-4000rpm，5-10min)，得血红素富集沉淀(湿重：20kg-25kg)。然后在血红素富集沉淀中加入80kg-100kg的冰醋酸、30-35g氯化钠，加热至90℃-100℃并维持30-60min，随后自然冷却或自来水循环降温至室温，静置过夜。离心(3500-4000rpm，5-10min)得到血红素晶体沉淀，依次加80L-100L50℃水洗涤、加乙醇清洗，然后再离心得到血红素晶体，经过滤、喷雾干燥得180g-200g血红素粗品(血红素含量≥50％)。
(3)将步骤(1)得到的小肽粉、步骤(2)得到的血红素粉粗品，按照(100-300)∶1的重量比混合均匀后，粉碎，得混合粉；
(4)向步骤(3)得到的混合粉中加入其重量1-2倍的由淀粉与糊精组成的混合物，再在搅拌下，以喷雾方式向其中加入乙醇水溶液，混合均匀后制成软材，然后制粒，得到肽红复方制剂；
步骤(4)中所加的淀粉与糊精混合物中淀粉与糊精重量比(3-6)：1。
进一步的，本发明内容中所述粉碎均指粉碎至100-200目的粉末。
本发明还提供了上述制备方法得到的肽红之复合制剂在制备预防或治疗失血性贫血药物中的应用，经科学试验验证，效果显著，安全可靠。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：
(1)营养价值高，靶标明确，疗效明显。本申请涉及的肽红复方制剂的原料来源于动物血制品，内含20种天然的氨基酸，是一种优质的天然蛋白原料(蛋白含量高达90％)；能快速增殖益生菌，有助于改善身体内微生态平衡，发挥有益作用；还能明显提升失血性贫血模型动物的血红蛋白、促红细胞生成素以及红细胞数量，达到了治疗贫血的效果。
(2)肽红复方制剂所需原材料均取之于“食药同源”之佳品，其制备工艺简单，容易实施；其制备成本低，受众人群广大。
(3)本发明制备的肽红复方制剂集“柔润肠腑、滋阴养血”的功效成份，科学组方合力提升生血之力，从源头解除造成贫血之根。
附图说明
图1为实施例1制备的肽红复方制剂对模型大鼠血红蛋白(Hb)水平的影响图(Mean±SEM，n＝8)；
注：“***”为与对照组相比，两组数据间存在显著性差异(P<0.001)；“###”为与模型组相比，两组数据间存在显著性差异(P<0.001)。
图2为实施例1制备的肽红复方制剂对模型大鼠的促红细胞生成素(EPO)水平的影响图(Mean±SEM，n＝8)；
注：“**”为与对照组相比，两组数据间存在显著性差异(P<0.01)；“#”、“###”为与模型组相比，两组数据间存在显著性差异(P<0.05、0.001)。
图3为实施例1制备的肽红复方制剂对大鼠红细胞(RBC)的影响图(Mean±SEM，n＝8)；
注：“***”为与对照组相比，两组数据间存在显著性差异(P<0.001)；“##”、“###”为与模型组相比，两组数据间存在显著性差异(P<0.01、0.001)。
图4为实施例1制备的肽红复方制剂对益生菌类枯草芽孢杆菌的生长影响图；
从左至右分别为LB对照培养基处理组、添加小肽粉LB培养基处理组和添加肽红复方制剂LB培养基处理组。
图5为实施例2制备的肽红复方制剂对益生菌类酵母菌的生长影响图；
从左至右分别为沙氏对照培养基处理组、添加小肽粉沙氏液体培养基处理组和添加肽红制剂沙氏液体培养基处理组。
具体实施方式
下面申请人将结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明。应理解，以下内容不应以任何方式解释为对本发明的保护范围的限制。
申请人对肽红复方制剂治疗和预防贫血进行了系列、大量的科学实验验证，确认该复方可以明显提升失血性贫血模型动物的血红蛋白、促红细胞生成素以及红细胞数量，对益生菌类枯草芽孢杆菌、酵母菌具有明显的增菌效果和促进生长的作用，维护肠道菌群微生态，达到了治疗贫血的效果。
以下各实施例中，主要原料来源及规格介绍如下：
血球蛋白粉：襄阳维恩生物科技有限公司，蛋白质含量大于等于90％，为猪血球蛋白粉；
碱性蛋白酶：食品级，酶活力20万单位/克，网购自宁夏夏盛实业集团有限公司；
动物蛋白水解酶：食品级，酶活力30万单位/克，网购自陕西四海生物科技有限公司；
中性蛋白酶：食品级，酶活力20万单位/克，网购自上海利锦生物科技有限公司；
酸性蛋白酶：食品级，酶活力10万单位/克，网购自宁夏夏盛实业集团有限公司。
以下各实施例中，复合蛋白酶为上述四种酶按照碱性蛋白酶：动物蛋白水解酶：中性蛋白酶：酸性蛋白酶质量比＝2：2：2：1混合而得；
以下各实施例中，碱性水溶液为浓度0.4g/100mL的氢氧化钠溶液；调节酸碱度采用氢氧化钠溶液和/或盐酸，其加入量对所调对象体积的影响忽略不计。
实施例1、一种从动物血制品中提取肽红复方制剂的方法，包括如下步骤：
(1)小肽粉的制备
取血球蛋白粉10kg，用碱性水溶液溶解制成血球蛋白粉质量百分比浓度为5％的混合液，并调节酸碱度至pH10.0，接着在50℃条件下搅拌溶解1h。然后按原料血球蛋白粉重量的0.4％加入复合蛋白酶(具体是：将占血球蛋白粉重量0.4％的复合蛋白酶和50℃纯净水以固液比1g:10mL的比例混合，搅拌均匀后加入)，在50℃的温度下酶解2h；然后将其酸碱度调至pH3，再继续在50℃下酶解1h。随后将酶解液离心(3500rpm，5min)，得上清液110L和血红素富集沉淀(湿重：20kg)。接着对这110L上清液采用1KDa超滤膜超滤得浓缩液18L，再添加活性炭1kg，然后80℃吸附脱色1h后过滤，最后将滤液喷雾干燥得到6.1kg血球蛋白酶解小肽粉(分子量小于1KDa；其中300-600Da的小肽含量超过80％)，备用。
(2)血红素的制备
取步骤(1)得到的湿重为20kg的血红素富集沉淀，加入80kg的冰醋酸、32g氯化钠，混合，加热至90℃并维持30min，随后自然冷却至室温，静置过夜；离心(3500rpm，5min)得到血红素晶体沉淀，依次加80L 50℃水、80L 50℃乙醇进行搅拌、清洗各1h。然后再离心得到血红素晶体，经过滤、喷雾干燥得180g血红素粗品(血红素含量≥50％)，备用。
(3)取步骤(1)得到的小肽粉100g、步骤(2)得到的血红素粗品1g进行混合，混合均匀后粉碎成100目粉末，得混合粉；
(4)向步骤(3)得到的混合粉中加入其等重量的、由淀粉与糊精组成的混合物(混合物中淀粉与糊精重量比6∶1)，混匀后，在搅拌下，再以喷雾方式，向其中加入95％(v/v)乙醇水溶液，混合均匀制成软材，再采用压缩颗粒机制粒，并装盘入60℃烘箱中干燥24小时，得肽红复方颗粒剂，即肽红复方制剂。
实施例2、一种从动物血制品中提取肽红复方制剂的方法，包括如下步骤：
(1)小肽粉的制备
取血球蛋白粉10kg，用碱性水溶液溶解制成血球蛋白粉质量百分比浓度为8％的混合液，并调节酸碱度至pH11.0，接着在50℃条件下搅拌溶解1h。然后按原料血球蛋白粉重量的0.8％加入复合蛋白酶(具体是：将占血球蛋白粉重量0.8％的复合蛋白酶和55℃纯净水以固液比1g:10mL的比例混合，搅拌均匀后加入)，在55℃的温度下酶解6h；然后将其酸碱度调至pH4，再继续在55℃下酶解2h。随后将酶解液离心(4000rpm，10min)，得上清液190L和血红素富集沉淀(湿重：25kg)。接着对这190L上清液采用1KDa超滤膜超滤得浓缩液120L，再添加活性炭1kg，然后80℃吸附脱色1h后过滤，最后将滤液喷雾干燥得到7.3kg血球蛋白酶解小肽粉(分子量小于1KDa；其中300-600Da的小肽含量超过80％)，备用。
(2)血红素的制备
取步骤(1)得到的湿重为25kg的血红素富集沉淀，加入100kg的冰醋酸、32g氯化钠，混合，加热至100℃并维持60min，随后自来水循环降温至室温，静置过夜；离心(4000rpm，10min)得到血红素晶体沉淀，依次加100L 50℃水、100L 50℃乙醇进行搅拌、清洗各2h。然后再离心得到血红素晶体，经过滤、喷雾干燥得200g血红素粗品(血红素含量≥50％)，备用。
(3)取步骤(1)得到的小肽粉300g、步骤(2)得到的血红素粗品1g进行混合，混合均匀后粉碎成200目粉末，得混合粉。
(4)向步骤(3)得到的混合粉中加入其重量2倍的、由淀粉与糊精组成的混合物(混合物中淀粉与糊精重量比3∶1)，混匀后，在搅拌下，再以喷雾方式，向其中加入95％(v/v)乙醇水溶液，混合均匀制成软材，再采用压缩颗粒机制粒，并装盘入60℃烘箱中干燥24小时，得肽红复方颗粒剂，即肽红复方制剂。
实施例3、实施例1制备的肽红复方制剂对模型大鼠血红蛋白(Hb)水平的影响
受试动物为SPF级SD(6周龄)大鼠40只(由辽宁长生生物技术股份有限公司提供)。自由饮水饮食，饲养间温度保持在25±1℃，明暗周期为12小时。
(1)分组与给药
将40只大鼠均分为5组：空白对照组(简称“空白组”)、模型组、小肽粉(由实施例1步骤(1)制备)组、血红素(由实施例1步骤(2)制备的血红素粗品并以粗品计剂量，下同，不赘述)组及肽红复方制剂组。各组大鼠从实验第1天开始给药，空白对照组给予生理盐水灌胃，小肽粉组给予小肽粉(0.206g/kg/d)溶液灌胃，血红素组给予血红素(2.056mg/kg/d)溶液灌胃，肽红复方制剂组给予肽红复方制剂(内含小肽粉0.206g/kg/d；内含血红素2.056mg/kg/d，以血红素粗品计剂量，下同，不赘述)溶液灌胃，给药体积均为1mL/100g，连续给药12天。除空白组外，各组造模大鼠每天给药1h后尾端静脉放血1.5-2.0mL一次，于实验第8天开始放血，连续5天。受试药物均用生理盐水分散后给药，实验第1天开始给药(造模期给药1h后放血)，1次/天，连续12天。
(2)大鼠血红蛋白(Hb)含量测定
最后一次给药30min后，在大鼠尾部的1/3-2/3处使用手术刀割尾取15μL静脉血，使用血红蛋白仪测定血红蛋白，记录读数。
(3)实验结果
连续12天给药后，对实验大鼠的血红蛋白(Hb)水平进行测定。结果如图1所示，与空白组相比，模型组大鼠血红蛋白水平下降近30％，而给予受试药物处置后，相应组大鼠血红蛋白水平均有回升，其中，肽红复方制剂处置的模型大鼠血红蛋白水平最高，接近正常水平。
实施例4、实施例1制备的肽红复方制剂对模型大鼠的促红细胞生成素(EPO)水平的影响
受试动物为SPF级SD(6周龄)大鼠40只(由辽宁长生生物技术股份有限公司提供)。自由饮水饮食，饲养间温度保持在25±1℃，明暗周期为12小时。
(1)分组与给药
将40只大鼠均分为5组：空白对照组(简称“空白组”)、模型组、小肽粉(由实施例1步骤(1)制备)组、血红素(由实施例1步骤(2)制备的血红素粗品)组及肽红复方制剂组。各组大鼠从实验第1天开始给药，空白对照组给予生理盐水灌胃，小肽粉组给予小肽粉(0.206g/kg/d)溶液灌胃，血红素组给予血红素(2.056mg/kg/d)溶液灌胃，肽红复方制剂组给予肽红复方制剂(内含小肽粉0.206g/kg/d；内含血红素2.056mg/kg/d)溶液灌胃，给药体积均为1mL/100g，连续给药12天。除空白组外，各组造模大鼠每天给药1h后尾端静脉放血1.5-2.0mL一次，于实验第8天开始放血，连续5天。受试药物均用生理盐水分散后给药，实验第1天开始给药(造模期给药1h后放血)，1次/天，连续12天。
(2)大鼠血清促红细胞生成素(EPO)水平测定
最后一次给药30min后，在大鼠尾部的1/3-2/3处使用手术刀割尾取0.5mL静脉血，使用低温离心机1000rpm离心5min，取上层血清。使用酶联免疫分析法，按照试剂盒说明书测定大鼠血清促红细胞生成素(EPO)水平。
(3)实验结果
连续12天给药后，对实验大鼠的血清促红细胞生成素(EPO)水平进行测定。结果如图2所示，与空白组相比，各受试药物处置的模型大鼠血清促红细胞生成素水平均有增高，其中以肽红复方制剂组的大鼠血清促红细胞生成素(EPO)为最高。
实施例5、实施例1制备的肽红复方制剂对大鼠红细胞(RBC)的影响
受试动物为SPF级SD(6周龄)大鼠40只(由辽宁长生生物技术股份有限公司提供)。自由饮水饮食，饲养间温度保持在25±1℃，明暗周期为12小时。
(1)分组与给药
将40只大鼠均分为5组：空白对照组(简称“空白组”)、模型组、小肽粉(由实施例1步骤(1)制备)组、血红素(由实施例1步骤(2)制备的血红素粗品)组及肽红复方制剂组。各组大鼠从实验第1天开始给药，空白对照组给予生理盐水灌胃，小肽粉组给予小肽粉(0.206g/kg/d)溶液灌胃，血红素组给予血红素(2.056mg/kg/d)溶液灌胃，肽红复方制剂组给予肽红复方制剂(内含小肽粉0.206g/kg/d；内含血红素2.056mg/kg/d)溶液灌胃，给药体积均为1mL/100g，连续给药12天。除空白组外，各组造模大鼠每天给药1h后尾端静脉放血1.5-2.0mL一次，于实验第8天开始放血，连续5天。受试药物均用生理盐水分散后给药，实验第1天开始给药(造模期给药1h后放血)，1次/天，连续12天。
(2)大鼠红细胞(RBC)含量测定
最后一次给药30min后，在大鼠尾部的1/3-2/3处使用手术刀割尾取10μL静脉血，加入2mL枸橼酸钠缓冲液稀释，混匀后，用移液枪(装入20μL的枪头)吸取10μL的红细胞悬液，将红细胞悬液充入计数池，一次性充满计数室，防止产生气泡，充入量以不超过计数室台面与盖玻片之间的矩形边缘为宜。充池后静置2-3min后计数。先在低倍镜下找到计数室所在位置后再转换高倍镜下观察。依次计数中央大方格内四角和正中共5个中方格内的红细胞数，对压线细胞按“数上不数下、数左不数右”的原则进行计数(计算红细胞数/L＝5个中方格内红细胞数×5×10×106×200式中：×5为5个中方格换算成1个大方格；×10为1个大方格容积为0.1μL，换算成1.0μL；×200为血液的稀释倍数为200倍)。
(3)实验结果
连续12天给药后，对实验大鼠的红细胞(RBC)水平进行测定。结果如图3所示，与空白组相比，模型组大鼠红细胞水平下降至正常的一半左右，而小肽粉、血红素及肽红复方制剂处置的模型大鼠红细胞水平有所回升，其中肽红复方制剂处置的效果最好。
实施例6、实施例1制备的肽红复方制剂对益生菌类—枯草芽孢杆菌的生长影响
分别在4mL的LB液体培养基、添加小肽粉(4g/L)的LB液体培养基、添加肽红复方制剂(4g/L)的LB液体培养基中接入100μL枯草芽孢杆菌液(菌液制备方法：将活化后的菌种接种至4mL MH培养基，再180rpm、37℃振荡培养4h后，再用生理盐水稀释10万倍)，180rpm、37℃振荡培养4h后，分别取培养稀释2万倍后的100μL枯草芽孢杆菌液涂布在MH平板，37℃培养16h。然后对各平板CFU进行计数，并观察菌落形态和大小(图4)。实验结果为LB对照培养基、添加小肽粉、肽红复方制剂的LB液体培养基处理组的平板CFU平均数分别为71、74、133个/皿；其菌落直径分别为4、4、4.5mm。与LB对照培养基相比较，肽红复方制剂具有明显的增菌效果，其作用机制可能与肽红复方制剂对损伤、衰老细胞具有修复或改善作用有关。
实施例7、实施例2制备的肽红复方制剂对益生菌类—酵母菌的生长影响
分别在4mL的沙氏液体培养基、添加小肽粉(4g/L)的沙氏液体培养基、添加肽红复方制剂(4g/L)的沙氏液体培养基中接入100μL酵母菌液(菌液制备方法：将活化后的菌种接种至4mL沙氏液体培养基中，以180rpm、28℃振荡培养16h后用生理盐水稀释10倍)，180rpm、28℃振荡培养21h后，分别取培养并稀释5万倍后的100μL酵母菌液涂布在沙氏平板，28℃培养48h。然后对各平板的CFU进行计数，并观察菌落形态和大小(图5)。实验结果为沙氏对照培养基、添加小肽粉、肽红复方制剂的LB液体培养基处理组的平板CFU平均数分别为38、68、124个；菌落直径分别为1.5、1.5、2.0mm。与沙氏对照培养基相比较，肽红复方制剂具有明显的增菌和促进生长的效果，其作用机制可能与肽红复方制剂对损伤、衰老的酵母细胞具有修复或改善作用有关。
Claims (8)
1.一种由从猪血球蛋白粉中提取的小肽粉和血红素制成的肽红复方制剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：
步骤（1）、小肽粉的制备
取血球蛋白粉，用碱性水溶液溶解制成血球蛋白粉质量百分比浓度为5-8%的混合液，并调节酸碱度至pH10.0-11.0，接着在45-55℃条件下搅拌溶解一段时间；其中，所述血球蛋白粉的蛋白质含量大于等于90%；
然后按原料血球蛋白粉重量的0.4%-0.8%加入复合蛋白酶，所述复合蛋白酶以固液比1g:（8-12）mL的比例加50℃-55℃纯净水搅拌均匀后的水溶液形式加入，在50℃-55℃的温度下酶解2-6 h，然后将其酸碱度调至pH3-4，再继续在同温度下酶解1-2 h，随后将酶解液离心，得上清液和血红素富集沉淀；其中，所述复合蛋白酶配方为：碱性蛋白酶：动物蛋白水解酶：中性蛋白酶：酸性蛋白酶的质量比是2：2：2：1，所述碱性蛋白酶的酶活力20-150万单位/克；所述动物蛋白水解酶的酶活力10-100万单位/克；所述中性蛋白酶的酶活力5-40万单位/克；所述酸性蛋白酶的酶活力5-80万单位/克；
接着将上清液采用1 KDa超滤膜超滤得浓缩液，再添加活性炭吸附脱色后过滤，最后将滤液喷雾干燥得到小肽粉；所述小肽粉的分子量小于1 KDa，其中300-600 Da的小肽含量超过80%；
步骤（2）、血红素的制备
向步骤（1）得到的血红素富集沉淀中加入冰醋酸和氯化钠，血红素富集沉淀：冰醋酸：氯化钠用量比例为（20 kg- 25 kg）：（80 kg- 100 kg）：（30-35）g，三者混合，加热至90℃-100℃并维持30-60 min，随后自然冷却或自来水循环降温至室温，静置过夜；离心得到血红素晶体沉淀，依次用水洗、乙醇洗，然后再离心得到血红素晶体，经过滤、喷雾干燥得血红素粗品；
步骤（3）、将步骤（1）得到的小肽粉、步骤（2）得到的血红素粗品按照（100-300）：1的质量比混合均匀后，粉碎，得混合粉；
步骤（4）、向步骤（3）得到的混合粉中加入淀粉与糊精，再在搅拌下，以喷雾方式加入乙醇水溶液，制成软材，然后制粒，并装盘入60℃烘箱中干燥24小时，得肽红复方颗粒剂，即肽红复方制剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所加的淀粉与糊精中淀粉与糊精重量比为（3-6）：1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）为：向步骤（3）得到的混合粉中加入其重量1-2倍的、由淀粉与糊精组成的混合物，混匀后，再在搅拌下，以喷雾方式向其中加入90-95 v/v%乙醇水溶液，混合均匀后制成软材，然后制粒，并装盘入60℃烘箱中干燥24小时，得肽红复方颗粒剂，即肽红复方制剂。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
所述碱性蛋白酶的酶活力20万单位/克；
所述动物蛋白水解酶的酶活力30万单位/克；
所述中性蛋白酶的酶活力20万单位/克；
所述酸性蛋白酶的酶活力10万单位/克。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述碱性水溶液为浓度(0.4-4)g/100mL的氢氧化钠溶液；调节酸碱度采用氢氧化钠溶液和/或盐酸。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述粉碎指粉碎成100目-200目的粉末。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的制备方法制备得到的肽红复方制剂在制备预防或治疗贫血的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述贫血为失血性贫血。
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