CN103343153A - 一种酶水解制备林蛙油肽的方法和林蛙油肽 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酶水解制备林蛙油肽的方法和林蛙油肽，其中，方法包括下列步骤：1)林蛙油原料预处理步骤；2)内肽酶酶解步骤；3)林蛙油肽后处理步骤；其中，步骤2)中，内肽酶是碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶和风味蛋白酶中一种酶、两种酶或两种以上的酶的复合。本发明采取了上述方案以后，由于采用酶法对林蛙蛋白进行水解，既改善了林蛙油的溶解性和流动性，又使其分解成低分子量的肽类物质。

Description

一种酶水解制备林蛙油肽的方法和林蛙油肽

技术领域

本发明属于生物技术酶工程技术领域，具体涉及一种酶水解制备林蛙油肽的方法。

背景技术

中国林蛙俗称田鸡、哈什蟆，广泛分布于东北三省，是一种珍贵的两栖类经济和药用动物。

林蛙油是雌性林蛙输卵管，中药研究认为，蛙油补脑、益智，补肾益精、养阴润肺、养颜美容、抗衰防老。因此，丽人丸、蛙油精、活性蛙油、冰塔王高级饮料在市场上颇受欢迎。日本、韩国、港澳地区、东南亚一些国家亦争相从中国内地进口蛙油。蛙油国内市场价为2000～3000元/公斤，国外市场价为1500美元/公斤。现代医学研究表明，林蛙油水分含量为11.92％，粗蛋白55.93％，粗脂肪4.26％，灰分4.68％，睾酮含量约为169.13pg/g，雌二醇含量约为291.81pg/g。含钙、磷、钾、钠、铁等13种以上无机元素，氨基酸种类在18种以上，其中人体所需的8种氨基酸含量较高，尤其是限制性氨基酸如但氨酸达11.52(mg/g)，赖氨酸达23.09(mg/g)。蛙油蛋白质营养结构合理：必需氨基酸配比很高(51.28％)，E/N达1.05，超过WHO/FAO提出的E/(E+N)应为40％左右，E/N应在0.6以上的参考蛋白模式标准。其中的多种营养成分如高级复合蛋白、不饱和脂肪酸、微量元素和维生素有增加机体免疫力、抗疲劳、抑菌消炎、降血脂、治疗心脑疾病的功能。目前，国内外天然药品、保健品的开发已形成热点，而林蛙系列医疗保健品的开发较少，现有的林蛙保健品大多以复合蛋白作为主要功能成分。国内生产林蛙油产品的的企业主要有：通化兴华药业有限责任公司、敦化环宇制药有限公司长春兴达饮品有限公司、吉林雪哈开发有限公司，采用的工艺主要是干燥、粉碎等简单加工工艺，存在生物利用率低、医疗保健效果不高、没有独特疗效等缺点。原因是蛋白质属于大分子物质，遇水膨胀后黏稠度很大，不便于制备、利用，为更好地开发利用林蛙油的营养成分，本研究采用酶法对林蛙蛋白进行水解，这样既改善了林蛙油的溶解性和流动性，又使其分解成低分子量的肽类物质，由于肽类物质是由多个氨基酸分子聚合成的小分子物质，比蛋白质更易被人体消化和吸收，而且还含有特殊功能的多肽，因而开发林蛙油蛋白水解物和分离物是林蛙油深加工的一个良好途径。

近三十年来，随着生物医学的发展和分离、检测水平的提高，对于多肽研究取得突飞猛进的进展。生物活性肽是蛋白质中20个天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的不同肽类的总称，是源于蛋白质的多功能化合物，是蛋白质经酸法或酶法水解后分离、精制而得到的多肽混合物。现代营养学研究发现，人类摄食蛋白质经消化道的酶作用后，大多是以低肽形式消化吸收的，以游离氨基酸形式吸收的比例很小。进一步的试验又揭示肽的生物效价和营养价值比游离氨基酸更高。活性肽具有多种人体代谢和生理调节功能，易消化吸收，有促进免疫、抗菌、抗病毒、降血压、降血糖等作用，食用安全性极高，是当前极具发展前景的功能因子。此外，肽的吸收具有速度快、耗能低、吸收率大等优势。目前，许多畜产蛋白已被成功的加以水解，例如：脱脂牛肉经酶解制得牛肉肽，含较高支链氨基酸和肉毒碱，是低热量蛋白质补充剂；新鲜猪肝经酶解、脱色、脱臭、超滤精制可以得到肝肽，可作促铁吸收剂，用于婴儿食品、饮料、糕点等；猪血经酶解制得血球蛋白肽，可用于各类食品等。以俄罗斯科学院生物有机化学研究所和圣彼得堡肿瘤科研所为主的多家研究机构，经过多年实验，在合成脑肽的基础上研制出一种能够抑制细胞氧化、阻止肿瘤形成的抗衰老药物，并在老鼠的实验中获得了成功。

具有生理活性的多肽，特别是短肽的发现和研究已成为多肽类药物和功能性食品开发和研究的热点。近年来，多肽类药物的研究一直是药物研究中的一个活跃领域，如何从天然动物、植物、微生物中发现活性多肽物质，使之成为新药研究中的先导化合物一直是肽类研究中的一个方向。近几年虽然分子生物学的发展、基因工程技术、多肽合成技术的兴起，使人们根据自己的意志合成或表达出各种蛋白、多肽物质，但其中真正成药的还是那些首先在天然产物中发现的活性成分，经上述技术重新合成或表达的产物。因此，这更加促进人们不断从大自然的天然宝库中去寻找新的活性多肽来丰富我们的药物宝库。已经有很多具有生理活性的多肽通过蛋白质消化而被辨认出来。生物活性肽就是对动物具有生理功能或生理作用的肽类。伴随着分子生物学、生物化学技术的飞速发展，多肽的研究取得了惊人的划时代的进展。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新的制备林蛙油肽的方法，此外，还伴随地公开了一种根据上述制备方法而制备而成的林蛙油肽。

本发明解决上述技术问题所采取的技术方案如下：

一种酶水解制备林蛙油肽的方法，包括下列步骤：1)林蛙油原料预处理步骤；2)内肽酶酶解步骤；3)林蛙油肽后处理步骤；

其中，步骤2)中，内肽酶是碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶和风味蛋白酶中一种酶、两种酶或两种以上的酶的复合。

进一步地，优选的方法是，所述步骤1)中，包括：

选取新鲜林蛙油或林蛙油干制品；加水并经发制、打浆、均质过程，获取混悬液。

进一步地，优选的方法是，步骤1)中，进一步包括：

选取新鲜林蛙油加2～10倍的水，打浆、均质，95～121℃下处理15min得混悬液，冷却。

进一步地，优选的方法是，步骤1)中，进一步包括：

选取林蛙油干制品并用10～200倍体积的水发制，打浆、均质，95～121℃下处理15min得混悬液，冷却。

进一步地，优选的方法是，步骤2)中，进一步包括：

将步骤1)中获取到的混悬液控制温度为30℃～70℃，pH在4.5～8.5，按林蛙油重量的0.5％～15％加入内肽酶酶解2～10小时，酶解过程中缓慢搅拌，100℃灭酶10min，冷却至室温得内肽酶酶解液。

进一步地，优选的方法是，所述步骤3)，具体包括：

将所述内肽酶酶解液进行离心、真空浓缩、喷雾干燥和粉碎处理。

进一步地，优选的方法是，步骤3)中，离心步骤包括：

将内肽酶酶解液进行3000～10000r/min的速度离心10min，取上清液，再进行130℃～140℃条件下2～6s超高温瞬时杀菌，得杀菌液。

进一步地，优选的方法是，步骤3)中，真空浓缩步骤包括：

将所述离心步骤中获取到的所述杀菌液经过真空浓缩装置，减压至-0.8MPa～-0.9MPa，在60℃～70℃条件下蒸发浓缩，使固形物含量达10％～30％，得浓缩液。

进一步地，优选的方法是，步骤3)中，喷雾干燥步骤包括：

将所述喷雾步骤中获取到的浓缩液在压力0.07MPa～0.15MPa，进口温度130℃～150℃，塔内温度为100℃～120℃，出口温度70℃～90℃条件下，在干燥塔内进行喷雾干燥并最终获取得到林蛙油肽粉末。

一种根据上述方法制备而成的林蛙油肽。

本发明采取了上述方案以后，由于采用酶法对林蛙蛋白进行水解，既改善了林蛙油的溶解性和流动性，又使其分解成低分子量的肽类物质。

由于肽类物质是由多个氨基酸分子聚合成的小分子物质，比蛋白质更易被人体消化和吸收，而且还含有特殊功能的多肽。并且随着水解程度的加深，具有活性成分的游离雌二醇的含量逐渐增加；并且，本发明工艺设备投入少，操作简单易行，生产成本低，利于工业化生产。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在所写的说明书、权利要求书、以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

附图说明

下面结合附图对本发明进行详细的描述，以使得本发明的上述优点更加明确。其中，

图1是本发明酶水解制备林蛙油肽的方法的流程示意图。

具体实施方式

以下将结合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。需要说明的是，只要不构成冲突，本发明中的各个实施例以及各实施例中的各个特征可以相互结合，所形成的技术方案均在本发明的保护范围之内。

具体来说，本发明的目的是提供一种利用内肽酶水解制备林蛙油肽的方法，其主要实施步骤包括以下的主要步骤：

1)林蛙油原料预处理步骤；2)内肽酶酶解步骤；3)林蛙油肽后处理步骤；其中，步骤2)中，内肽酶是碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶和风味蛋白酶中一种酶、两种酶或两种以上的酶的复合。

也就是说，由于采用酶法对林蛙蛋白进行水解，既改善了林蛙油的溶解性和流动性，又使其分解成低分子量的肽类物质。

其中，在步骤1)中，林蛙油原料为新鲜林蛙油或林蛙油干制品，本发明地并不进行限定，只是针对新鲜林蛙油或者干制品分别采取以下的处理工艺：

新鲜林蛙油加2～10倍的水，林蛙油干制品需用10～200倍体积的水发制，打浆、均质，95～121℃下处理15min得混悬液，冷却。

其中，在步骤2)中，选取碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶和风味蛋白酶中一种酶、两种酶或两种以上的酶的复合的内肽酶对混悬液进行水解。

在一个优选的实施例中，需要将将混悬液控制温度为30℃～70℃，pH在4.5～8.5，按林蛙油重量的0.5％～15％加入内肽酶酶解2～10小时，酶解过程中缓慢搅拌，100℃灭酶10min，冷却至室温得内肽酶酶解液。

其中，由于肽类物质是由多个氨基酸分子聚合成的小分子物质，比蛋白质更易被人体消化和吸收，而且还含有特殊功能的多肽。并且随着水解程度的加深，具有活性成分的游离雌二醇的含量逐渐增加；并且，本发明工艺设备投入少，操作简单易行，生产成本低，利于工业化生产。

此外，在本优选的实施例中，还需要进行步骤3)，即对制备而成的内肽酶酶解液进行后处理以制备干燥的粉末。

其中，林蛙油肽后处理工艺主要包括离心、真空浓缩、喷雾干燥和粉碎步骤。

其中，在离心步骤中，主要包括：

将内肽酶酶解液进行3000～10000r/min的速度离心10min，取上清液，再进行130℃～140℃条件下2～6s超高温瞬时杀菌，得杀菌液。

在真空浓缩步骤中，主要包括：

将上述杀菌液经过真空浓缩装置，减压至-0.8MPa～-0.9MPa，在60℃～70℃条件下蒸发浓缩，使固形物含量达10％～30％，得浓缩液。

在喷雾干燥步骤中，主要包括：

将浓缩液在压力0.07MPa～0.15MPa，进口温度130℃～150℃，塔内温度为100℃～120℃，出口温度70℃～90℃条件下，在干燥塔内进行喷雾干燥得林蛙油肽粉末。

其中，结合以下几个具体的实施例进行说明。

实施例1：胰蛋白酶水解制备林蛙油肽

取500g林蛙油干制品，用100倍体积的水发制，胶体磨磨浆、均质后在121℃下处理15min，冷却，将混悬液控制温度为40℃，用NaCO3调节pH8.0，按林蛙油重量的1.5％加入胰蛋白酶酶解3.0小时，并100℃灭酶10min。冷却并于4000r/min离心10min，取上清液，杀菌，经过真空浓缩、喷雾干燥得林蛙油肽粉末。

实施例2：菠萝蛋白酶水解制备林蛙油肽

取500g林蛙油干制品，用100倍体积的水发制，胶体磨磨浆、均质后在100℃下处理15min，冷却，将混悬液控制温度为53℃，用NaCO3调节pH7.0，按林蛙油重量的1.0％加入胰蛋白酶酶解4.0小时，并100℃灭酶10min。冷却并于4000r/min速度离心10min，取上清液，杀菌，经过真空浓缩、喷雾干燥得林蛙油肽粉末。

实施例3：复合蛋白酶水解制备林蛙油肽

取500g林蛙油，用100倍体积的水发制，胶体磨磨浆、均质后在100℃下处理10min，冷却，将混悬液控制温度为50℃，用NaCO3调节pH值为8.0，按林蛙油重量的5％加入碱性蛋白酶酶解3h。100℃灭酶10min。温度冷却至60℃，用1NHCl调整pH值为6.0，按林蛙油重量的10％加木瓜蛋白酶，酶水解时间3.5h，冷却并于4000r/min速度离心10min，取上清液，杀菌，经过真空浓缩、喷雾干燥得林蛙油肽粉末。

本发明提供的方法优势如下：

1.本发明采用酶法对林蛙蛋白进行水解，既改善了林蛙油的溶解性和流动性，又使其分解成低分子量的肽类物质，由于肽类物质是由多个氨基酸分子聚合成的小分子物质，比蛋白质更易被人体消化和吸收，而且还含有特殊功能的多肽。并且随着水解程度的加深，具有活性成分的游离雌二醇的含量逐渐增加。

2.本发明工艺设备投入少，操作简单易行，生产成本低，利于工业化生产。

需要说明的是，对于上述方法实施例而言，为了简单描述，故将其都表述为一系列的动作组合，但是本领域技术人员应该知悉，本申请并不受所描述的动作顺序的限制，因为依据本申请，某些步骤可以采用其他顺序或者同时进行。其次，本领域技术人员也应该知悉，说明书中所描述的实施例均属于优选实施例，所涉及的动作和模块并不一定是本申请所必须的。

且以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种酶水解制备林蛙油肽的方法，其特征在于，包括下列步骤：1)林蛙油原料预处理步骤；2)内肽酶酶解步骤；3)林蛙油肽后处理步骤；

其中，步骤2)中，内肽酶是碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶和风味蛋白酶中一种酶、两种酶或两种以上的酶的复合。

2.根据权利要求1所述的酶水解制备林蛙油肽的方法，其特征在于，所述步骤1)中，包括：

选取新鲜林蛙油或林蛙油干制品；加水并经发制、打浆、均质过程，获取混悬液。

3.根据权利要求2所述的酶水解制备林蛙油肽的方法，其特征在于，步骤1)中，进一步包括：

选取新鲜林蛙油加2～10倍的水，打浆、均质，95～121℃下处理15min得混悬液，冷却。

4.根据权利要求2所述的酶水解制备林蛙油肽的方法，其特征在于，步骤1)中，进一步包括：

选取林蛙油干制品并用10～200倍体积的水发制，打浆、均质，95～121℃下处理15min得混悬液，冷却。

5.根据权利要求2或3或4所述的酶水解制备林蛙油肽的方法，其特征在于，步骤2)中，进一步包括：

将步骤1)中获取到的混悬液控制温度为30℃～70℃，pH在4.5～8.5，按林蛙油重量的0.5％～15％加入内肽酶酶解2～10小时，酶解过程中缓慢搅拌，100℃灭酶10min，冷却至室温得内肽酶酶解液。

6.根据权利要求5所述的酶水解制备林蛙油肽的方法，其特征在于，所述步骤3)，具体包括：

将所述内肽酶酶解液进行离心、真空浓缩、喷雾干燥和粉碎处理。

7.根据权利要求6所述的酶水解制备林蛙油肽的方法，其特征在于，步骤3)中，离心步骤包括：

将内肽酶酶解液进行3000～10000r/min的速度离心10min，取上清液，再进行130℃～140℃条件下2～6s超高温瞬时杀菌，得杀菌液。

8.根据权利要求7所述的酶水解制备林蛙油肽的方法，其特征在于，步骤3)中，真空浓缩步骤包括：

将所述离心步骤中获取到的所述杀菌液经过真空浓缩装置，减压至-0.8MPa～-0.9MPa，在60℃～70℃条件下蒸发浓缩，使固形物含量达10％～30％，得浓缩液。

9.根据权利要求8所述的酶水解制备林蛙油肽的方法，其特征在于，步骤3)中，喷雾干燥包括：

将所述喷雾步骤中获取到的浓缩液在压力0.07MPa～0.15MPa，进口温度130℃～150℃，塔内温度为100℃～120℃，出口温度70℃～90℃条件下，在干燥塔内进行喷雾干燥并最终获取得到林蛙油肽粉末。

10.一种根据权利要求1～9任一种方法制备而成的林蛙油肽。

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